JP7679054B2 - 一酸化窒素産生促進剤及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、特定の植物を原料として使用した一酸化窒素（ＮＯ）産生促進剤及びその利用に関するものである。より詳細には、フトモモ科ギョリュウバイ属に属するマヌカの葉の抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする血管内皮細胞でのＮＯ産生促進剤、及び、該剤を含有してなることを特徴とする血管内皮機能を改善するための経口組成物に関する。

血管内皮は血管の拡張及び／又は収縮、血管平滑筋細胞の増殖及び／又は抗増殖、血液凝固及び／又は抗凝固、血管の炎症及び／又は抗炎症、酸化及び／又は抗酸化等の様々な機能に影響を及ぼすことが知られている。そのため、血管内皮機能の低下は、糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満等の原因となり、動脈硬化の初期症状とされている。更に、血管内皮機能の低下は、運動不足、塩分の過剰摂、喫煙取等によっても引き起こされるため、日常生活における血管内皮機能の維持・改善が重要である。

ＮＯは、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）によりアルギニンから産生される。ＮＯＳには、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及び血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の異なる３種のアイソフォームが存在する（非特許文献１）。ｎＮＯＳは、カルシウム依存性の酵素であり、脳においてシナプス可塑性の調節に関与している。ｉＮＯＳは、カルシウム非依存性の酵素であり、炎症やストレスにより強く誘導され、主に免疫機能に関与している。ｉＮＯＳによる過剰なＮＯ産生は、敗血症や関節リウマチの原因となる。ｅＮＯＳは、カルシウム依存性の酵素であり、血管拡張や血栓形成の抑制に関与している。

血管内皮細胞におけるＮＯ産生の低下は、骨格筋でのエネルギー消費を抑制し、肥満や糖尿病の進行を誘導することが報告されている（非特許文献２）。ＮＯによる血管拡張以外の作用は、血管壁への単球・マクロファージの結合の抑制、血小板凝集抑制作用、血小板の接着・凝集の阻害による血栓形成の抑制等がある。血管内皮細胞から放出される他の血管拡張因子として、内皮由来血管過分極因子、プロスタグランジンＩ２等があり、血管収縮因子として、エンドセリン、トロンボキサンＡ２、アンジオテンシンＩＩ等の様々な生理活性物質が産生・分泌されることが明らかとなっている。これらの因子のバランスにより血管機能を調節・維持している。

後述するマヌカについては次のようなことが知られている。すなわち、マヌカは古くからニュージーランドの先住民マオリ族によって珍重されてきた薬木であり、その種子、樹皮、葉などは生薬として多岐にわたり利用されてきた（非特許文献３）。又、マヌカの花の蜜から採取されたマヌカハニーには、メチルグリオキサールが含まれ、抗菌作用があることが報告されている（非特許文献４）。その他に、歯周炎治療用剤（特許文献１）が提案されている。しかしながら、マヌカの葉に含まれる成分を経口的に摂取することにより、血管内皮細胞におけるＮＯ産生を促進する知見は見当たらない。

特開２００７－２７７２１０

松本明郎、一酸化窒素（ＮＯ）による生理機能調節とその破綻、２０１４年、基礎老化研究、第３８巻、第１１頁～第１８頁 Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｍ等、"Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐ５３ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｏｂｅｓｉｔｙ"（アメリカ）、２０１４年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、第７巻、第２号、第１６９１頁～第１７０３頁 Ｓｔａｎｌｅｙ Ｂｒｏｏｋｅｒ等、"Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔｓ"（ニュージーランド）、１９９７年、Ｒａｕｐｏ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ；３ｒｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ版 Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｍ等、"Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍａｎｕｋａ ｈｏｎｅｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ"（アメリカ）、２０１８年、ＡＩＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第４巻、第４号、第６５５頁～第６６４頁

かかる現状に鑑み、本発明は、血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進するための、安全かつ安定な新規素材を開発するとともに、これを産業上有効活用できる態様の組成物を提供することを課題とした。

前記課題を解決するために、本発明者らは、血管内皮細胞におけるＮＯ産生を促進するための素材について鋭意検討を重ねた結果、意外にもマヌカの葉が極めて有効であり、これらの植物にはヒトや動物のＮＯ産生を顕著に促進し得る成分が含まれており、これらの併用はより一層顕著に血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進すること、更に、これを飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野において有効利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、フトモモ科ギョリュウバイ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ）に属するマヌカ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）の葉の抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とするＮＯ産生促進剤が提供される。この水性成分は、前記マヌカの葉を水及び／又は低級アルコールで抽出処理して得られる抽出物であることが望ましい。

前述のように処理して得られる抽出物は、量的な差はあるものの多種多様な成分を含有する複雑な組成物であり、レプトスペリン、β－ｔｒｉｋｅｔｏｎｅ、ｔｅｒｐｉｎｅｎ－４－ｏｌ、１，８－ｃｉｎｅｏｌｅ、ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ、３，６，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｕｍａｚｉｎｅ、ポリフェノール類、各種水溶性成分（多糖、オリゴ糖、単糖、蛋白、ペプチド、アミノ酸、これらの複合体など）を含んでいる。

本発明の前記ＮＯ産生促進剤は、血管内皮細胞においてＮＯ産生を促進するものであることを特徴とする。

本発明の他の特徴は、前記のＮＯ産生促進剤を含有してなる経口組成物が提供される点にある。この経口組成物の態様は飲食品であることが望ましい。

又、本発明によれば、前記ＮＯ産生促進剤を含有してなることを特徴とする抗疲労のための経口組成物あるいは飲食品が提供される。

本発明のさらなる他の特徴は、フトモモ科ギョリュウバイ属に属するマヌカの葉を水及び／又は低級アルコールで抽出したエキスを有効成分として含有せしめるＮＯ産生促進剤の製造方法にある。

本発明のさらなる他の特徴は、血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進するために前記ＮＯ産生促進剤あるいは経口組成物を経口投与又は摂取する方法にある。

本発明に係るマヌカの葉の抽出物は、品質安定性に優れ、血管内皮細胞におけるＮＯ産生を促進することにより、レイノー症、動脈硬化症、バージャー病、高血圧症、脳血栓、脳梗塞、心筋梗塞、充血、鬱血、出血、貧血、認知症、免疫力の低下、脱毛症、倦怠感、疲労、筋肉痛、疲れ目、むくみ、肩こり、腰痛、皮膚のかゆみ、くま、くすみ、しもやけ、凍傷、シワ、肌の弾力低下、歯周病等の血管機能の障害により引き起される症状を予防及び／又は改善する効果、及び、発毛、育毛、養毛、滋養強壮、美肌等の効果を奏する。かかる効果は、前記加工物を有効成分として含有してなるＮＯ産生促進剤を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。したがって、本発明によれば、マヌカの葉の抽出物を有効成分として含有してなる経口用組成物が提供され、これを血管内皮細胞でのＮＯ産生の低下により引き起こされる諸症状を予防及び／又は改善するための飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等として有効利用することができる。

以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明のＮＯ産生促進剤は、ヒトや動物の血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進する機能を有するものであり、フトモモ科ギョリュウバイ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ）に属するマヌカ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）の葉の抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする。

前記マヌカの葉の抽出物は任意の方法で製造することができるが、水及び／又は低級アルコールを用いて抽出処理するのが好ましい。低級アルコールは、その炭素数が大きくなると脱脂粕中の油性物質が抽出される傾向が大きくなるため、炭素数が５程度までのものが望ましく、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、ノルマルブタノール、イソブタノール等を例示できる。炭素数が大きい低級アルコールを使用する場合は、脱脂粕中の油性成分の抽出を抑制するために含水率を高めるのがよい。例えば、ｎ－プロパノールの場合の含水率は約２０質量％～約５０質量％とし、ｎ－ブタノールの場合の含水率は約４０質量％～約７０質量％とする。望ましい抽出溶媒は水、メタノール及びエタノール、及び、これらの含水アルコール（含水率：０～１００質量％）である。

マヌカの葉を抽出するには、マヌカの葉１質量部に対して前記抽出溶媒を約１質量倍～約３０質量倍加え、常圧下又は１～５気圧の加圧下、常温ないしは約１２０℃で、約１０分～約３時間、必要に応じて撹拌して混合後、常温に冷却して濾過し、濾液を減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等の適当な手段により濃縮、乾燥する。尚、乾燥物は適宜に粉砕処理してもよい。このようにして本発明に係るマヌカの葉の抽出物である淡黄色ないし黄赤色の固体を得ることができる。前記抽出方法は、一旦抽出処理した抽出残渣を繰り返し抽出処理したり、１～３気圧の加圧下、約１００℃～約１３０℃で行うことが望ましい。これにより本発明に係る抽出物の収量が増える。この抽出物はポリフェノール、サポニン等を含む。

本発明のＮＯ産生促進剤は、その有効成分としての前記抽出物を固体状、ペースト状又は液体状の形態となし、これをそのままＮＯ産生促進剤としてよいが、必要に応じて本発明のＮＯ産生促進剤が利用される用途における公知の添加物を併用して、常法により含有せしめて組成物として調製することもできる。ここで、公知の添加物は経口摂取するために通常利用されるものが望ましく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物質を使用でき、又、ＮＯ産生促進効果を有する既知成分やその含有素材を併用してもよい。

血管内皮細胞でのＮＯ産生促進作用が既知の成分や素材としては、前記のもののほか黒酢、グルタチオン、イチョウ葉エキス、ヘスペリジン、シトルリン、ルチン、ショウガ、黒ショウガ、ヒハツ、ブドウ茎抽出物、ブドウ果皮抽出物、トランスレスベラトロール、リンゴ果皮抽出物、黒大豆ポリフェノール、ココアポリフェノール、ピクノジェノール、フラバンジェノール、ケイヒ、高麗人参、卵白ペプチド、鶏、豚又は魚由来のコラーゲンペプチド、ツバキ種子抽出物、アカショウマ根茎抽出物等を例示できる。尚、本発明はこれらの例示によって何ら限定されるものではない。

本発明においては、前述したＮＯ産生促進剤をそのままの形態で飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料、その他産業分野の様々な製品として利用することができ、あるいは該各種製品の配合原料の一部として使用する態様でも利用できる。とりわけＮＯ産生を促進するための経口組成物となすことが好ましく、この経口組成物の最も好適な態様は飲食品である。この例を以下に述べるが、本発明はこれにより限定されるものではない。

本発明のＮＯ産生促進剤を経口組成物とする場合の形態は、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤となすことが可能である。かかる製剤組成物における前記のマヌカの葉由来抽出物の含有量は、併用原料の種類や含有量等により一律に規定し難いが、各々概ね０．００１質量％～９０質量％程度、より望ましくは約０．０１質量％～約７０質量％である。前記含有量が約０．００１質量％を下回ると本発明の所望効果が認められなくなり、約９０質量％を超えると実用的な製剤組成物を調製することが難しくなる。本発明のＮＯ産生促進剤は、これを望ましくは経口的に摂取又は投与する態様で使用する。経口摂取又は投与する場合の本発明のＮＯ産生促進剤の好適な量の目安は、該剤に含まれる前記水性成分ベースあるいは前記抽出物ベースで、ヒト成人１日あたり約１０ｍｇ～約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ～約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ～約３００ｍｇである。

本発明のＮＯ産生促進剤は、これ自体を飲食品、医薬品、飼料その他産業分野の様々な形態の製品とすることができ、あるいは、かかる製品の配合原料の一部とする態様でも利用することができる。実用的な用途としては飲食品がよい。

飲食品の具体例として、野菜ジュース、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料類、即席麺、スープ、ゼリー、プリン、ヨーグルト、ケーキプレミックス製品、菓子類、ふりかけ、味噌、醤油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、植物性クリーム、焼肉用たれや麺つゆ等の調味料、麺類、うどん、蕎麦、スパゲッティ、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ハンバーグ、コロッケ、ふりかけ、佃煮、ジャム、牛乳、クリーム、バター、スプレッドやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム、ゼリー等の各種一般加工食品のほか、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、機能性表示食品、健康食品、濃厚流動食や嚥下障害用食品の治療食等を挙げることができる。

尚、本発明の飲食品においては、これがマヌカの葉の抽出物を有効成分として含有してなる旨、血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進するためのものである旨のうち少なくとも１つの表示を付した態様とすることができる。

これらの飲食品を製造するには、本発明のＮＯ産生促進剤と公知の原材料を用い、あるいは公知の原材料の一部を前記のＮＯ産生促進剤で置き換え、常法によって製造すればよい。例えば、本発明のＮＯ産生促進剤を、必要に応じてグルコース（ブドウ糖）、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工物、セルロース粉末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白（動植物や酵母由来の蛋白質、その加水分解物等を含む）、糖質、色素、香料、酸化防止剤、界面活性剤、その他の食用添加物、各種栄養機能成分を含む粉末やエキス類等の食用素材とともに混合して粉末、顆粒、ペレット、錠剤等の形状に加工したり、常法により前記例の一般加工食品に加工処理したり、これらを混合した液状物をゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース等の被覆剤で被覆してカプセルに成形したり、飲料（ドリンク類）の形態に加工して、栄養補助食品や健康食品として利用することは好適である。とりわけ錠剤、カプセル剤やドリンク剤が望ましい。

かかる飲食品に配合する本発明のＮＯ産生促進剤の比率は、飲食品の形態、本発明のＮＯ産生促進剤中の前記抽出物（マヌカの葉の抽出物）の含量、他の配合原料の種類や成分や配合量等の違いにより一律に規定しがたいが、飲食品中の前記抽出物の含量が約０．０１質量％～約９０質量％、より望ましくは約１質量％～約５０質量％となるように、本発明のＮＯ産生促進剤をその他の飲食品製造用公知原料と適宜に組み合わせて処方を設計し、常法に従い目的とする飲食品を調製すればよい。本発明の飲食品は、ヒト成人の場合１日あたりの前記水性成分の摂取量の目安を約１０ｍｇ～約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ～約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ～約３００ｍｇとして任意の方法、例えば、食事の摂取と同時又は前後に、経口摂取、経管投与等の方法で体内に取り込むことができる。

本発明のＮＯ産生促進剤を用いる医薬品は、前記のＮＯ産生促進剤に本発明の趣旨に反しない公知の賦形剤や添加物を適宜に加え、常法により加工して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等の製剤となすことができる。経口あるいは経腸投与して、ＮＯ産生の促進あるいは前記諸症状の予防又は治療のために適用する。本発明のＮＯ産生促進剤の配合量はその形態や前記医薬製剤の種類、形態、用法及び用量等により一律に設定し難いが、前記抽出物の含量として概ね０．００１質量％～５０質量％である。経口投与する場合の摂取量はとくに限定されるものではないが、例えば、前記抽出物をベースにして、ヒト成人１日あたり約０．１ｍｇ～約１，０００ｍｇ、望ましくは約１ｍｇ～約５００ｍｇ、更に望ましくは約１０ｍｇ～約３００ｍｇである。

又、本発明のＮＯ産生促進剤をペットフードや家畜用飼料に適用するには、前記飲食品の場合と同様に、公知の各種飼料や飲用水に配合したり、公知の原材料、添加物とともに錠剤状、顆粒状、カプセル状等の製剤形態のものに加工することができる。これらの場合、本発明のＮＯ産生促進剤の配合量及び摂取量は、前記抽出物の含量として約０．０１質量％～約９０質量％、より望ましくは約１質量％～約５０質量％であり、１日あたりの摂取量の目安は、前記抽出物を基準として、適用動物の体重（ｋｇ）あたり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、より望ましくは約０．５ｍｇ～約５０ｍｇである。

製造例１
ニュージーランド産マヌカ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）の乾燥葉を粗粉砕した。このマヌカ乾燥葉１Ｋｇをステンレス製抽出釜に仕込み、水９Ｌを加え、適宜に撹拌しながら７０℃で６時間抽出処理した。この後、不溶の残渣を濾別してエキス液を採取し、該エキス液を減圧濃縮、凍結乾燥及び粉砕処理に供して茶褐色のエキス末（試料Ｍ－１）を得た。

製造例２
製造例１に記載の方法で得た乾燥葉１００ｇに含水エタノール（含水率５０％）２５０ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度含水エタノール（含水率５０％）２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、茶褐色のエキス末（試料Ｍ－２）を得た。

製造例３
製造例１に記載の方法で得た乾燥葉１Ｋｇをステンレス製抽出釜に仕込み、エタノール９Ｌを加え、適宜に撹拌しながら７０℃で６時間抽出処理した。この後、不溶の残渣を濾別してエキス液を採取し、該エキス液を減圧濃縮、凍結乾燥及び粉砕処理に供して茶褐色のエキス末（試料Ｍ－３）を得た。

試験例
前記製造例で得た各試料のＮＯ産生促進作用について以下に述べる方法で調べた。

試験例１：マヌカの葉由来抽出物によるウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）のＮＯ産生促進作用
動物細胞でのＮＯ産生促進作用を調べるため、ＢＡＥＣを使用した。ＢＡＥＣを９６ｗｅｌｌプレートに１×１０^４個／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃で１日間培養した。その後、ＮＯ検出用蛍光プローブであるＤＡＦ－ＦＭ ＤＡを細胞に取り込ませ、試料Ｍ－１、Ｍ－２及びＭ－３を１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。培養終了後、励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍの蛍光強度を測定し、試料無添加の場合のＮＯ産生量を１としたときの相対値（活性）として、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表わした（表１）。

この結果を表１に示す。同表のデータから、本発明に係るマヌカの葉由来抽出物は濃度依存的にウシ大動脈内皮細胞のＮＯ産生促進作用を有することを確認した。

試験例２：マヌカの葉由来抽出物によるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＮＯ産生促進作用
ヒト細胞でのＮＯ産生促進作用を調べるため、ＨＵＶＥＣを用いた。ＨＵＶＥＣを９６ｗｅｌｌプレートに１×１０^４個／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃で１日間培養した。その後、ＮＯ検出用蛍光プローブであるＤＡＦ－ＦＭ ＤＡを細胞に取り込ませ、試料Ｍ－１、Ｍ－２及びＭ－３を１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。培養終了後、励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍの蛍光強度を測定し、試料無添加の場合のＮＯ産生量を１としたときの相対値（活性）として、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表わした（表２）。

この結果を表２に示す。同表のデータから、本発明に係るマヌカの葉由来抽出物はヒト臍帯静脈内皮細胞においても濃度依存的にＮＯ産生促進作用を有することを確認した。

試験例３：他の植物由来抽出物によるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＮＯ産生促進作用
本試験において、本発明のマヌカの葉由来抽出物と比較するＮＯ産生促進物として、ヒハツエキスパウダー（Ｔｉｅ２ヒハツエキスパウダーＭＦ、丸善製薬社製）（比較試料１とする。）、カシスポリフェノール（明治カシスポリフェノール（ＡＣ１０）、明治フードマテリア社製）（比較試料２とする。）及びヘスペリジン（αＧヘスペリジンＰＡ－Ｔ、東洋精糖社製）（比較試料３とする。）を用いた。ＮＯ産生量の測定は試験例２と同様の方法を用いて行い、試料を添加しない場合のＮＯ産生量を１としたときの相対値（活性）として、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表わした（表３）。

この結果を表３に示す。同表のデータから、本発明に係るマヌカの葉由来抽出物はヒト臍帯静脈内皮細胞において他のＮＯ産生促進剤よりも顕著なＮＯ産生促進作用を有することを確認した。

試験例４：マウスにおけるＮＯ産生促進試験及び抗疲労試験
ＮＯ産生促進作用及び抗疲労作用を以下の方法で調べた。すなわち、６週齢ｄｄｙ系雄マウス（三協ラボサービス（株））を１週間予備飼育した後、１群６匹とし、蒸留水を投与する対照群及び試料Ｍ－１投与群に群分けした。共通飼料（日本クレア株式会社製、商品名ＣＥ－２）を自由摂取させて、それぞれの試料２００ｍｇ／ｋｇ体重／日を毎日経口投与し、全てのマウスに１週間３回の遊泳運動を実施させて４週間飼育した。飼育２週目にマウスの尾に２ｇの錘をつけ、水槽で遊泳させ、疲労困憊してマウスの頭頂部が水面下に沈み込むような遊泳運動が継続不能になるまでの時間（限界遊泳時間）を測定した。また、飼育終了後にマウスの血液を採取し、遠心分離して得た血漿中のＮＯをＮＯ２／ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－Ｃ ＩＩ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）～Ｇｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ～（同仁化学研究所製）を用いて測定した。血中ＮＯ濃度は対照群の値を１００としたときの相対値として、平均値±標準偏差で表わした（表４）。

この結果を表４に示す。同表のデータから、本発明に係るマヌカの葉由来抽出物は血中のＮＯ濃度を顕著に増加させること及び限界遊泳時間も著しく延長することを確認した。

試験例５：ヒトにおける抗疲労試験
試験に参加することに同意が得られた、日常的に運動を行う健常男性２０名（２１歳～３０歳、平均年齢：２４．８歳）を、１群１０名で２群に分け、それぞれの群にプラセボ（マルトデキストリン）又は試料Ｍ－１を２００ｍｇ充填したゼラチンカプセルを１日１カプセル摂取してもらい、これを４週間続けた。被験者は、普段の生活通りに運動も継続的に実施し、疲労の評価として、Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇ Ｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）アンケート（「抗疲労臨床評価ガイドライン」、日本疲労学会、２０１１年）を実施した。データは、平均値±標準偏差で表わした（表５）。

この結果を表５に示す。ＶＡＳ値は数値が低いほど疲労感が軽減されたことを示している。表５のデータから、本発明に係るマヌカの葉由来抽出物は、疲労感を低減させることが明らかとなった。

試作例１
本発明のＮＯ産生促進剤としての試料Ｍ－１～３のいずれか１種をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が２００ｍｇのゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。これらのカプセル製剤は経口摂取が可能な栄養補助食品、医薬品等として使用することができる。

試作例２
本発明のＮＯ産生促進剤として試料Ｍ－１～３のいずれか１種：１５０部（質量基準。以下同様）、ミツロウ：４０部及び月見草油（英国エファモール社製）：８０部を約５０℃に加熱混合して均質にした後、カプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が２００ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル製剤を試作した。これらのカプセル製剤は経口摂取可能な栄養補助食品として使用することができる。

試作例３
本発明のＮＯ産生促進剤として試料Ｍ－１～３のいずれか１種：３０部、緑茶抽出物（ビーエイチエヌ（株）製）：０．５部、コーンスターチ（日本コーンスターチ（株）製）：１０５部、リン酸三カルシウム（米山化学工業（株）製）：５０部及びリボフラビン（ＤＳＭニュートリション・ジャパン（株）製）：７部を混合機に仕込み、１０分間攪拌混合した。この混合物を直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、質量１５０ｍｇ／個の素錠を作成し、ついでコーティング機でシェラック被膜を形成させて錠剤形状の食品を試作した。

試作例４
市販の栄養ドリンク１００ｍＬに本発明のＮＯ産生促進剤として試料Ｍ－１～３のいずれか１種：２００ｍｇ加えて十分に混合し飲料を試作した。これは冷蔵庫で１年間保存しても外観及び風味に異状及び違和感は認められなかった。尚、本品は、血管内皮細胞でのＮＯ産生促進、持久力の向上、疲労防止のために使用することができる。

試作例５
即席麺の製造工程において、公知の原料に本発明のＮＯ産生促進剤として試料Ｍ－１～３のいずれか１種を３００ｍｇ加えて即席麺を試作した。これは常温で６ヵ月間保存しても外観及び風味に異状及び違和感は認められなかった。尚、本品は、血管内皮細胞でのＮＯ産生促進、持久力の向上、疲労防止のために使用することができる。

本発明の、フトモモ科ギョリュウバイ属に属するマヌカの葉の抽出物を有効成分として含有してなるＮＯ産生促進剤は、これを経口摂取することにより血管内皮細胞でのＮＯ産生を促進する作用を有するため、ＮＯ産生の促進及び／又は血管内皮細胞でのＮＯ産生の低下に起因する症状を改善するための飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に有効利用することができる。

Claims (8)

1. フトモモ科ギョリュウバイ属に属するマヌカの葉の抽出物の水性成分を有効成分として含有してなることを特徴とするＮＯ（一酸化窒素）産生促進剤。
2. 抽出物がマヌカの葉の水抽出物である請求項１に記載
   のＮＯ産生促進剤。
3. 血管内皮細胞におけるＮＯ産生促進である請求項１又は２に記載のＮＯ産生促進剤。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のＮＯ産生促進剤を含有してなる経口組成物。
5. 飲食品である請求項４に記載の経口組成物。
6. 持久力の向上又は疲労の防止のためのものである請求項４又は５に記載の経口組成物。
7. マヌカの葉の抽出物の水性成分を有効成分として含有せしめることを特徴とするＮＯ産生促進剤の製造方法。
8. 請求項７に記載の製造方法により得られるＮＯ産生促進剤を配合してなる持久力向上用組成物又は疲労防止用組成物。