JP7682451B2 - 新規化合物、ｎｏ産生抑制剤、抗炎症剤および化合物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規化合物、ＮＯ産生抑制剤、抗炎症剤および化合物の製造方法に関する。より詳細には、化２に示す新規化合物またはその塩に関する。また、化１に示す化合物、化２に示す化合物もしくはそれらの塩、または、それらを含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする、生体における一酸化窒素（ＮＯ）の産生抑制剤に関する。また、化１に示す化合物、化２に示す化合物もしくはそれらの塩、または、それらを含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする、抗炎症剤に関する。また、化１に示す化合物および化２に示す化合物の製造方法に関する。

ＮＯは、大気中では雷放電などによる高温環境や化石燃料の燃焼に伴い発生するが、生体内でも産生されている。生体内では、ＮＯ合成酵素により、血管内皮細胞や神経細胞、マクロファージなどの免疫系細胞で産生される。血管内皮細胞から産生されるＮＯは、血管平滑筋の弛緩を介して血圧の調節に関与し、神経細胞から産生されるＮＯは、ニューロン間の情報伝達に関与している。一方、免疫系細胞から産生されるＮＯは、病原微生物の殺菌等の炎症反応を亢進することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。

ここで、炎症は、生体に加わる有害刺激に対する生体防御反応であり、恒常性を維持するために必須の生理反応である。しかし、これが過度ないし過剰に長期にわたる場合は、組織障害や疾病の原因となることが知られており、炎症を抑制する技術が求められている。この点、特に産生量の多い免疫系細胞のＮＯ産生を制御することは、炎症を制御することに有効と考えられる。

松本明郎、一酸化窒素（ＮＯ）による生理機能調節とその破綻、基礎老化研究、第３８巻、第３号、第１１－１８頁、２０１４年 青木玲二、４）マクロファージを用いたＮＯ産生の簡易評価、平成１９年度農林水産省補助事業（食料産業クラスター展開事業）食品機能性評価マニュアル集第ＩＩ集、社団法人日本食品科学工学会、第１１８－１２３頁

本発明は、係る課題を解決するためになされたものであって、生体におけるＮＯ産生抑制活性を有する新規化合物、ＮＯ産生抑制剤、抗炎症剤、および、ＮＯ産生抑制活性を有する化合物を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、キンセンカ属（Calendula）に、化１に示す化合物、および、化２に示す新規化合物が含まれることを見出した。また、当該化合物が生体におけるＮＯ産生を抑制できることを見出した。そこで、これらの知見に基づいて下記の各発明を完成した。

（１）本発明に係る新規化合物は、化２に示す化合物またはその塩である。

（２）本発明に係る生体におけるＮＯの産生抑制剤の第１の態様は、化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする。

（３）本発明に係る生体におけるＮＯの産生抑制剤の第２の態様は、化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする。

（４）本発明に係る抗炎症剤の第１の態様は、化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする。

（５）本発明に係る抗炎症剤の第２の態様は、化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする。

（６）本発明において、キンセンカ属の植物はトウキンセンカ（Calendula officinalis）であってもよい。

（７）本発明に係る化１に示す化合物またはその塩の製造方法は、キンセンカ属から化１に示す化合物またはその塩を抽出する工程を有する。

（８）本発明に係る化２に示す化合物またはその塩の製造方法は、キンセンカ属から化２に示す化合物またはその塩を抽出する工程を有する。

化１に示す化合物や化２に示す化合物またはそれらの塩は、生体におけるＮＯの産生を抑制できる活性を有する。本発明によれば、係る有用な化合物を得ることができる。

本発明のＮＯ産生抑制剤や抗炎症剤は、生体におけるＮＯの産生を抑制することができる。すなわち、炎症メディエイターであるＮＯの産生を抑制できることから、炎症反応を抑制することができ、よって、過剰な炎症反応や慢性炎症による組織障害や疾病の発症、疾病の悪化の抑制に寄与することができる。

トウキンセンカ根部５０％（ｖ／ｖ）エタノール抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 化合物１の存在下で培養したマクロファージ様細胞におけるＮＯ量率および細胞生存率を示すグラフである。 化合物２の存在下で培養したマクロファージ様細胞におけるＮＯ量率および細胞生存率を示すグラフである。 クルクミン、化合物１および化合物２のラジカル捕捉率を示す棒グラフである。 化合物２の存在下で培養したヒト線維芽細胞における細胞生存率を示す棒グラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明に係るＮＯ産生抑制剤は、生体におけるＮＯの産生を抑制する剤である。ここで、生体におけるＮＯの産生を抑制するとは、生体内のいずれかの細胞で産生されるＮＯの量を小さくすることをいう。ＮＯは反応性が極めて高く、短時間で消失するため、生体内におけるＮＯの産生が抑制されたか否かを直接確認することは困難である。よって、ＮＯの産生を抑制するか否かは、後述する実施例で示すように、培養細胞にて確認することができる。すなわち、ＮＯ産生能を有する培養細胞に被験物質を投与した後、グリース試薬を用いた比色法でＮＯ量（亜硝酸の量）を測定する。被験物質の投与によりＮＯ量が減少すれば、生体におけるＮＯの産生抑制活性を有すると判断することができる。

本発明に係るＮＯ産生抑制剤には、下記の第１および第２の態様がある。
第１の態様；化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする。
第２の態様；化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする。

ＮＯは、上述のとおり、組織障害や殺菌といった炎症反応を亢進する炎性メディエイターである。よって、生体におけるＮＯの産生を抑制することにより、炎症反応を抑制できるといえる。このことから、本発明は、ＮＯ産生抑制剤と同じ物質を有効成分とする抗炎症剤も提供する。すなわち、本発明に係る抗炎症剤には、下記の第１および第２の態様がある。
第１の態様；化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする。
第２の態様；化１に示す化合物、化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属の抽出物を有効成分とする。

キンセンカ属は、キク科キンセンカ属に属する植物をいう。キンセンカ属としては、例えば、トウキンセンカ（Calendula officinalis、ポットマリーゴールド、カレンデュラ）や、ヒメキンセンカ（Calendula arvensis、ホンキンセンカ、フユシラズ、フユザキキンセンカ）などを例示することができる。

化１に示す化合物（化合物１）およびその塩、ならびに化２に示す化合物（化合物２）およびその塩（以下、化合物１、化合物１の塩、化合物２および化合物２の塩をまとめて、またはいずれかを指して、「本化合物」という場合がある。）は、後述する実施例で示すように高いＮＯ産生抑制活性を有する。よって、少なくともこの点で有用な物質であり、本化合物は生体におけるＮＯ産生抑制剤あるいは抗炎症剤として用いることができる。

なお、本化合物のうち化合物２はこれまでに報告のない新規化合物である。化合物２は、生体におけるＮＯ産生の抑制や炎症抑制に限らず、意義のあるすべての用途に用いることができる。

本化合物は、キンセンカ属に含まれる。よって、本化合物を含むキンセンカ属の抽出物もまた、生体におけるＮＯ産生抑制剤あるいは抗炎症剤として用いることができる。

化合物１および化合物２はその水酸基で塩を形成しうるが、本発明においては、これらの塩を用いてもよい。ここで、塩は、「薬理学的に許容される塩」を含み、広義に解釈される。例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等、各種の塩であってよい。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。

本化合物は、合成品を用いてもよく、市販の試薬を用いてもよい。または、本化合物を含む動植物等の天然物から抽出、精製等して用いることもでき、本化合物を化学的に合成して用いることもできる。

本化合物は上述のとおりキンセンカ属に含まれるため、キンセンカ属から抽出することにより、本化合物を得ることができる。キンセンカ属における本化合物の含有量は、植物種や植物体の部位、採集時期、生育場所、採集後の処理法などにより変わりうるが、例えば、化合物２は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量分析したところ、トウキンセンカ根部乾燥物１ｇあたり約０．２ｍｇが含まれていたことが本発明者らにより確認されている。なお、後述する実施例では、トウキンセンカ根部乾燥物１３５ｇから２．３ｍｇの化合物２が単離された。この単離量がＨＰＬＣによる定量分析値と比して小さい理由としては、(i)抽出後の粗分画から化合物２を単離精製する過程でロスが生じたため、(ii)定量分析時と実施例の単離時とで、サンプルのスケールや抽出時間が異なるため、などが考えられた。

キンセンカ属からの本化合物の抽出は、例えば、抽出溶媒にキンセンカ属の植物体を浸漬することにより行うことができる。具体的には、以下の方法を例示することができる。
≪キンセンカ属の植物体≫
キンセンカ属の植物体は、葉、茎、花、根あるいはこれらを含む全部（全草）など、いずれの部位を用いてもよいが、根部を含むことが好ましい。また、生育地から採集したものをそのまま用いてもよく、乾燥させてから用いてもよい。また、葉、茎、花、根などの形態のものをそのまま用いてもよく、破片状や粉末状に砕いてから用いてもよい。
≪抽出溶媒≫
キンセンカ属から本化合物を抽出することができれば特に制限はなく、製品の最終用途に応じて適宜設定できる。例えば、溶媒は、低級アルコール類（エタノール、プロパノールなど）、酢酸エチル、グリコール類（グリセリン、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオールなど）、クロロホルム、これらの混液あるいはこれらと水との混液などの極性溶媒、油脂類（ヒマシ油、ツバキ油、オリーブ油、アプリコット油、コメ胚芽油、ダイズ油、アマニ油、米油、ゴマ油、コーン油、菜種油など）、液体ロウ類（ホホバ油、マッコウ鯨油など）、エステル類、高級アルコール類などを例示することができる。
≪抽出条件≫
抽出溶媒に植物体を浸漬し、温度１～３０℃あるいは室温で、２～２４時間、静置または攪拌しながら置いておく。

上記のように抽出操作を行った後の溶媒には、本化合物が含まれるため、これをそのまま用いてもよく、必要に応じて精製や濃縮あるいは希釈、殺菌などを行ってから用いてもよい。精製は、濾過や遠心分離による植物体残渣の除去や、液体クロマトグラフィーによる分画精製などを行うことができる。また、スプレードライや凍結乾燥などの方法により固体化してから用いてもよい。

例えば、トウキンセンカ根部の５０％（ｖ／ｖ）エタノール抽出物を下記条件のＨＰＬＣに供すれば、図１に示すクロマトグラムが得られる。図１において、保持時間２４分の画分を分取すれば化合物１を、保持時間２７分の画分を分取すれば化合物２を、それぞれ得ることができる。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEDO CAPCELL PAK C18 UG120 (5μm,φ4.6×250 mm)
溶媒：(A)H₂O(0.1 %(v/v) TFA) (B)アセトニトリル(MeCN)(0.1 %(v/v) TFA)
勾配：(B)0 %(v/v)(0分)→(B)100 %(40分）
流速：1.0 mL／分
検出：吸光光度検出器（210 nm）
注入量：10μL

本化合物、ＮＯ産生抑制剤および抗炎症剤は、任意の形態ないし任意の用途で用いることができる。例えば、皮膚において効果を発揮させる目的で用いることができ、そのような場合には、経皮的に用いられる医薬品や医薬部外品（湿布や軟膏など）、化粧品（パックや化粧水、乳液、ジェル、クリーム、リップクリームなど）の形態、またはこれらに配合して使用される原料ないし添加物とすることができる。また、例えば、体内で効果を発揮させる目的で用いることができ、そのような場合には、経口摂取で用いられる医薬品や医薬部外品、健康食品、食品、飲料、飼料の形態、またはこれらに配合して使用される原料ないし添加物とすることができる。いずれの形態であっても、本化合物を配合した上で、常法により製造することができる。製品における有効成分の配合量または生体への投与量も、当該製品の用途や安全性、他の原材料などに応じて適宜設定することができる。

以下、本発明について、各実施例に基づいて説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。本実施例において、単位に用いられるＭはmol/Lを表す。

＜実施例１＞化合物の同定
（１）トウキンセンカ根エタノール抽出物の調製
北海道白老町にて採集したトウキンセンカの根を水で洗い、４５℃の恒温槽に２日間置くことにより、乾燥させた。これをハサミで細かく切断した後、ミキサーを用いて粉末状にした。得られた根の乾燥粉末１３５ｇに５０％（ｖ／ｖ）エタノール１Ｌを加え、スターラーを用いて５００回転／分（ｒｐｍ）、室温にて７２時間攪拌し、抽出液を得て上清（１回目）を回収した。残渣に５０％（ｖ／ｖ）エタノール１Ｌを加えてスターラーを用いて５００回転／分（ｒｐｍ）、室温にて７２時間攪拌し、抽出液を得て上清（２回目）を回収した。１回目と２回目の上清をそれぞれ吸引濾過して濾液を回収し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、濃縮液を得た。続いて、１回目と２回目の濃縮液を併せて２４時間凍結乾燥し、固体状のトウキンセンカ根エタノール抽出物２４．０ｇを得た。

（２）化合物の単離
トウキンセンカ根エタノール抽出物２４．０ｇを超純水（MilliQ水）に溶解させて全量を５００ｍＬとした。ヘキサン５００ｍＬを添加し、水層とヘキサン層とに分画して水層５００ｍＬを回収した。ここに酢酸エチル２０００ｍＬを添加し、水層と酢酸エチル層とに分画して酢酸エチル層を回収し、濃縮乾固して酢酸エチル画分０．８２ｇを得た。これを下記条件のシリカゲルクロマトグラフィーに供した。溶媒［４］のヘキサン：酢酸エチル＝３：２で溶出した画分を分取して乾燥させ、２７．９ｍｇの粗精製物を得た。
《シリカゲルクロマトグラフィーの条件》
カラム：Glass column（φ50×280 mm）
固定相：Silica gel 60 N
勾配：［１］ヘキサン：酢酸エチル＝９：１（３００ｍＬ）
［２］ヘキサン：酢酸エチル＝４：１（４００ｍＬ）
［３］ヘキサン：酢酸エチル＝７：３（５００ｍＬ）
［４］ヘキサン：酢酸エチル＝３：２（５００ｍＬ）
［５］ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（５００ｍＬ）
［６］ヘキサン：酢酸エチル＝０：１（６００ｍＬ）
［７］メタノール（６００ｍＬ）

粗精製物（乾燥重量２７．９ｍｇ）を下記条件のＨＰＬＣに供し、保持時間３４分の第１画分（乾燥重量０．２ｍｇ）および保持時間５５分の第２画分（乾燥重量２．３ｍｇ）を分取した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELLPAK UG120 (5μm,φ20×250 mm)
溶媒：H₂O : アセトニトリル（MeCN）=65 : 35(v:v)(0.1%(v/v) TFA)
流速：9.6 mL／分
検出：吸光光度検出器（210 nm）

（３）第１画分の化合物の同定
第１画分（保持時間３４分、乾燥重量０．２ｍｇ）について、核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：NMR）装置および液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）を用いて構造解析を行った結果、化１に示す化合物（(E)-4-(3-acetyl-2,6-dihydroxyphenyl)-2-methylbut-2-enal、分子式Ｃ_１３Ｈ_１４Ｏ_４、分子量２３４．２５、本発明において「化合物１」という場合がある。）であることが明らかになった。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

＜化１のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100 MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm) 1.97 [d, 3H, J = 1.3 Hz], 2.53 [s, 3H], 3.50 [d, 2H, J =7.4 Hz], 6.43 [d, 1H, J = 8.8 Hz], 6.63 [tq, 1H, J = 1.3, 7.4 Hz], 7.66 [d, 1H, J = 8.8 Hz], 9.32 [s, 1H];
¹³C NMR: δ(ppm) 9.1 [CH₃], 23.5 [CH₂], 26.2 [CH₃], 108.2 [CH], 112.8 [C], 114.3 [C], 132.5 [CH], 140.2 [C], 154.8 [CH], 164.0 [C], 197.5 [CH], 204.5 [C].
HR-ESIMS : m/z = 233.0815([M-H]^-)

（４）第２画分の化合物の単離・同定
第２画分（保持時間５５分、乾燥重量２．３ｍｇ）について、ＮＭＲ装置およびＬＣ－ＭＳを用いて構造解析を行った結果、化２に示す化合物（methyl (E)-4-(3-acetyl-2,6-dihydroxyphenyl)-2-methylbut-2-enoate、分子式Ｃ_１４Ｈ_１６Ｏ_５、分子量２６４．２８、本発明において「化合物２」という場合がある。）であることが明らかになった。化合物２は、これまでに報告の無い新規の物質である。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

＜化２のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100 MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm)1.97 [d, 3H, J = 1.4 Hz], 2.53 [s, 3H], 3.50 [d, 2H, J =7.5 Hz], 3.87 [s, 3H], 6.42 [d, 1H, J = 8.8 Hz], 6.77 [tq, 1H, J = 1.4, 7.5 Hz], 7.63 [d, 1H, J = 8.8 Hz];
¹³C NMR: δ(ppm)12.5 [CH₃], 23.1 [CH₂], 26.2 [CH₃], 52.2 [CH₃], 108.2 [CH], 113.4[C], 114.2 [C], 128.2 [C], 132.3[CH], 142.0 [CH], 163.9 [C], 170.6 [C], 204.5 [C].
HR-ESIMS: m/z = 265.1069([M+H]⁺)

＜実施例２＞ＮＯ量率の評価
（１）被験物質の調製
培地はＲＰＭＩ１６４０培地に、ＮＯ産生刺激物質として大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）を０．１％（ｖ／ｖ）となるよう添加したものを用いた。化合物１および化合物２を、それぞれ１０ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これを、化合物の濃度（細胞培養時の最終濃度）が１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭとなるよう培地に添加して、被験物質とした。

（２）ＮＯ量率の測定
下記ア）～カ）の手順により一酸化窒素（ＮＯ）量率を測定した。
ア）マウス由来マクロファージ様細胞（Ｊ７７４．１細胞、ＲＣＢ０４３４、理化学研究所 バイオリソース研究センター 細胞材料開発室）を、約１．０×１０^５個／ウェルの密度になるように１００μＬずつ９６穴プレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日間培養した。
イ）各ウェルの培地に被験物質１００μＬを添加し、同条件下で２４時間培養した（評価試料）。被験物質を添加せず同量の培地のみ添加したウェルも設定し、同様に培養した（対照試料）。
ウ）リン酸０．５ｍＬを脱イオン水１９．５ｍＬに加え、スルファニルアミド２００ｍｇとＮ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩２０ｍｇとを溶解させることにより、グリース試薬 (１％スルファニルアミド、０．１％Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン、２．５％リン酸) を調製した。
エ）９６穴プレート各ウェルの上清１００μＬを新しい９６穴プレートへ移した後、そのプレートの各ウェルにグリース試薬を１００μＬずつ添加して、室温で３０分静置した。
オ）マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。ブランク試料として、培地１００μＬとグリース試薬１００μＬとを入れたウェルも設定し、同様に測定した。
カ）下記の式１によりＮＯ量率を算出し、５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を求めた。
式１：ＮＯ量率（%）＝｛（評価試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）／（対照試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）｝×１００

（３）細胞生存率の測定
下記ア）～カ）の手順により細胞生存率を測定した。
ア）Ｊ７７４．１細胞を、約１．０×１０^５個／ウェルの密度になるように１００μＬずつ９６穴プレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日間培養した。
イ）各ウェルの培地に被験物質１００μＬを添加し、同条件下で２４時間培養した（評価試料）。被験物質を添加せず同量の培地添加のみ行ったウェルも設定し、同様に培養した（対照試料）。
ウ）９６穴プレートから上清を取り除いて3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide（ＭＴＴ）試薬５μＬを添加し、同条件下で３時間呈色反応させた。
エ）各ウェルの上清を除去し、ＤＭＳＯ２００μＬを添加し、３分間振とう撹拌した。
オ）マイクロプレートリーダーで５３５ｎｍの吸光度を測定した。ブランク試料として、ＤＭＳＯ２００μＬを入れたウェルも設定し、同様に測定した。
カ）下記の式２により細胞生存率を算出した。
式２：細胞生存率（%）＝｛（評価試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）／（対照試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）｝×１００

（４）結果
被験物質として化合物１を用いた場合のＮＯ量率および細胞生存率を図２に示す。図２に示すように、ＮＯ量率は、化合物１の濃度が高いほど小さかった。また、化合物１のＩＣ_５０は５７．４μＭであった。この値は、ＮＯ産生酵素阻害物質として知られているN^G-monomethyl-L-arginine（Ｌ－ＮＭＭＡ）のＩＣ_５０（１１６．２μＭ）よりも顕著に小さいことから、化合物１のＮＯ量阻害活性は顕著に強いと言える。一方、細胞生存率はいずれの濃度においても低下は見られなかった。すなわち、細胞毒性は無いにもかかわらず、化合物１の濃度依存的にＮＯ量率が低下した。この結果から、化合物１は細胞におけるＮＯの産生ないし存在を抑制できることが明らかになった。

また、被験物質として化合物２を用いた場合のＮＯ量率および細胞生存率を図３に示す。図３に示すように、ＮＯ量率は、化合物２の濃度が高いほど小さかった。また、化合物２のＩＣ_５０は６９．２μＭであった。この値は、Ｌ－ＮＭＭＡのＩＣ_５０（１１６．２μＭ）よりも顕著に小さいことから、化合物２のＮＯ量阻害活性は顕著に強いと言える。一方、細胞生存率はいずれの濃度においても低下は見られなかった。すなわち、細胞毒性は無いにもかかわらず、化合物２の濃度依存的にＮＯ量率が低下した。この結果から、化合物２は細胞からのＮＯの産生ないし存在を抑制できることが明らかになった。

＜実施例３＞ＮＯラジカル捕捉活性の評価
液体に溶解させることによりＮＯラジカルを発生するニトロプルシド（ＳＮＰ）を用いて、化合物のＮＯラジカル捕捉活性を検討した。陽性対照としてＮＯラジカル捕捉物質として知られているクルクミンを用いた。すなわち、被験物質は化合物１、化合物２およびクルクミンとした。

まず、ＳＮＰをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４、ＰＢＳ） に溶解させ、１０ｍＭのＳＮＰ－ＰＢＳ溶液を調製した。クルクミン、化合物１および化合物２を、それぞれ濃度が２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭとなるようエタノールに溶解させ、被験物質－エタノール溶液を調製した。被験物質－エタノール溶液を５０μＬずつ９６穴プレートに添加した後、ＳＮＰ－ＰＢＳ溶液を５０μＬずつ添加して、１５０分室温で静置した（被験物質の最終濃度が１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭ）。ＳＮＰ－ＰＢＳ溶液５０μＬとエタノール５０μＬとを入れたウェルも設定し、同様に静置した（対照試料）。続いて、実施例２（２）ウ）に記載のとおり調製したグリース試薬を各ウェルに１００μＬずつ添加し、マイクロプレートリーダーで５４６ｎｍの吸光度を測定した。ブランク試料として、ＰＢＳ５０μＬとエタノール５０μＬとを入れたウェルも設定し、同様に測定した。測定結果に基づき下記の式３によりＮＯラジカル捕捉率 (%) を算出した。その結果を図４に示す。
式３：ＮＯラジカル捕捉率（%）＝［１－｛（評価試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）／（対照試料の吸光度－ブランク試料の吸光度）｝］×１００

図４に示すように、被験物質としてクルクミンを用いた場合のＮＯラジカル捕捉率は、濃度依存的に高くなった。これに対して、化合物１を用いた場合のＮＯラジカル捕捉率は、濃度が高いほど小さくなる傾向が見られた。化合物２を用いた場合のＮＯラジカル捕捉率は、濃度にかかわらず殆ど変化がなかった。これらの結果から、化合物１および化合物２は、ＮＯラジカルの捕捉活性を有さないことが明らかになった。

本実施例３の結果と、実施例２の結果とを考え合わせると、化合物１および化合物２によるＮＯ量率の抑制効果は、一旦産生したＮＯを捕捉した結果ではなく、細胞におけるＮＯの産生を抑制したためと考えられた。すなわち、化合物１および化合物２は、細胞からのＮＯの産生を抑制できることが明らかになった。

＜実施例４＞細胞毒性の評価
実施例２において化合物１および化合物２はマウス癌細胞由来マクロファージ様細胞（Ｊ７７４．１細胞）に対して細胞毒性が無いことが確認された。さらに、正常細胞に対する細胞毒性を確認するため、化合物２について、ヒト皮膚由来正常二倍体線維芽細胞（ＡＳＦ４－１、集団倍加数（PDL）＝４３、加治和彦氏から提供）を用いて下記ア）～カ）の手順により細胞生存率を測定した。培地はＭＥＭ培地を用いた。

ア）化合物２を１０ｍＭとなるようＤＭＳＯに溶解した後、培地で希釈して、被験物質とした。
イ）細胞を、約３．５×１０^３個／ウェルの密度になるように１００μＬずつ９６穴プレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養して細胞を接着させた。
ウ）化合物２の最終濃度が１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭとなるように、各ウェルに被験物質を添加して、同条件下で２４時間培養した（評価試料）。被験物質を添加しないウェルも設定し、同様に培養した（対照試料）。
エ）９６穴プレートから上清を取り除いてＭＴＴ試薬１０μＬを添加し、同条件下で４時間呈色反応させた。
オ）各ウェルの上清を除去し、ＤＭＳＯ２００μＬを添加してホルマザンを溶解した。 カ）マイクロプレートリーダーで５３５ｎｍの吸光度を測定した。ブランク試料として、ＤＭＳＯ２００μＬを入れたウェルも設定し、同様に測定した。実施例２（３）の式２により細胞生存率を算出した。その結果を図５に示す。

図５に示すように、化合物２の濃度にかかわらず細胞生存率はほぼ一定であった。すなわち、化合物２の濃度の上昇に伴う細胞生存率の低下は見られなかった。この結果から、化合物２は、癌細胞のみならず正常細胞に対しても目立った細胞毒性を有さないことが明らかになった。

Claims (9)

1. 下記の化２に示す化合物またはその塩。
   
2. 下記の化１に示す化合物、下記の化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする、生体における一酸化窒素（ＮＯ）の産生抑制剤。
   
3. 下記の化１に示す化合物、下記の化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属に属する植物の抽出物を有効成分とする、生体における一酸化窒素（ＮＯ）の産生抑制剤。
   
4. 下記の化１に示す化合物、下記の化２に示す化合物またはそれらの塩を有効成分とする、抗炎症剤。
   
5. 下記の化１に示す化合物、下記の化２に示す化合物またはそれらの塩を含むキンセンカ属に属する植物の抽出物を有効成分とする、抗炎症剤。
   
6. 前記キンセンカ属に属する植物が、トウキンセンカ（Calendula officinalis）である、請求項３または請求項５に記載の剤。
7. キンセンカ属に属する植物から下記の化１に示す化合物またはその塩を抽出する工程を有する、下記の化１に示す化合物またはその塩を製造する方法。
   
8. キンセンカ属に属する植物から下記の化２に示す化合物またはその塩を抽出する工程を有する、下記の化２に示す化合物またはその塩を製造する方法。
   
9. 前記キンセンカ属に属する植物が、トウキンセンカ（Calendula officinalis）である、請求項７または請求項８に記載の方法。