JP7687572B2 - マルチパラメータサイトメトリーに基づく白血球サブセット化の為の手段及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、診断学、特に診断免疫学、の分野に関する。対象の免疫状態のモニタリングの為に、及び／又は免疫調節処置の効果のモニタリングの為に、有利に使用されるマルチパラメータサイトメトリーに基づく白血球サブセット化の為の手段及び方法が提供される。

該免疫状態、及び免疫細胞に及ぼす革新的な免疫調節処置の効果、の詳細なモニタリングは、極めて重要である。これは、幾つかの理由によるものであり、例えば免疫系の複雑度が高く、誤った仮説を立てる関連リスクがあること、該免疫系が変更される又は関係している疾患の数が増えつつあること、新規免疫療法を前進させる為の規制当局からの必要条件の増加、該免疫系のベースライン状態の個体間不均一性、処置前の疾患カテゴリー及び疾患ステージの差、異なる処置応答を有する異なる患者における処置の異なる効果、その結果として、投薬量の増加であれ、投薬量の減少であれ、若しくは即時の処置中止であれ、処置を適合させる必要性、及び／又は将来の臨床試験における処置の正しい組み合わせを選択する必要性、である。

上記は、全ての免疫調節障害状態、及び免疫調節処置による介入を有する疾患にとって必須であり、ここで、該免疫調節処置は、古典的な免疫抑制処置（コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等）；細胞処置、例えば遺伝子療法；幹細胞移植；ＣＡＲ－Ｔ細胞処置；チェックポイント阻害剤；多くの異なる抗体処置（多くの異なる抗体－エフェクター機能を有する）；及び外部作用剤（微生物、昆虫毒素、アレルゲン等）又は腫瘍抗原に対するワクチン接種、を含む。

処置のモニタリングに加えて、同様に免疫調節障害状態を有する個体の古典的な「様子見」（wait-and-see）の経過観察においてまた、免疫モニタリングは、転帰（outcome）を予測する為にも、処置を適切に開始（ｉｎｓｔａｌｌ）、改変、又は中止する為にもますます重要となっている。

多くの白血球／免疫細胞サブセットが血液中で同定されているが、多くの他の免疫細胞サブセットは、それらが特定のタスク及びエフェクター機能を有する組織において排他的に又は主に検出可能であると推定される。それにもかかわらず、該免疫系は、全ての臓器又は臓器系への遊走を介して全身に到達する独自の能力を有する。該免疫細胞のそのような全身への遊走及びホーミングは、血流、及びその後リンパ系を介することによってのみ達成されることができる。これは、該血流が、標的化される免疫応答を探索する為の、全身を通しての移動、組織を破片のない状態に維持するスキャベンジャーのタスク、又は不適切な事象、例えば組織損傷、微生物の浸潤、若しくは初期の新生物形質転換に関する全身の走査、及び局所組織修復、を可能にする該免疫系の通り道（ｈｉｇｈｗａｙ）として見なされることができることを意味する。

その結果、原則として、全て又は実質的に全ての免疫細胞又はそれらの前駆細胞（precursors）が、該血流において見出されうるが、該細胞は、低い又は非常に低い頻度で、独自の成熟段階として生じることがあり、部分的に該免疫細胞応答のタイミングに強く依存しうる。このことは、適切な時点で評価される為には、血中白血球の十分な数、最も可能性が高いのは少なくとも１００万個、最大５００万個～１０００万個又はそれより多い、が必要であることを意味する。

全ての免疫細胞は、造血幹細胞区画に由来し、そこから該免疫細胞は、リンパ系及び骨髄系の発達が２つの主な経路である複数の系列の免疫細胞へと分化する。該リンパ系細胞は、多くの異なる抗原の非常に特異的な認識を可能にする、広く多様な抗原特異的受容体、すなわちＢ細胞の多くの異なる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の広いレパートリー、及びＴ細胞の多くの異なるＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の広いレパートリー、の産生を伴う適応免疫系の基礎を形成する。Ｂ細胞は、骨髄においてＢ細胞前駆細胞から未成熟Ｂ細胞へと発達し、未成熟Ｂ細胞及び主にナイーブＢ細胞として血流に達し、それらは抗原と接触すると、Ｉｇ分泌形質細胞及びメモリーＢ細胞へと更に分化することができる。該メモリーＢ細胞は、同じ抗原が再度遭遇される可能性があると、体内のいずれの場所でも効率よく且つ迅速に応答し、その後、更なるメモリーＢ細胞及び特には、増強されたＩｇ産生の為の形質細胞、を形成し、これは、異なるクラスのＩｇ分子、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ、並びにＩｇＧ及びＩｇＡサブクラス、の産生を含む。全ての関連する未成熟及びナイーブＢ細胞サブセット、メモリーＢ細胞サブセット、及び形質芽球／形質細胞サブセットは、該体の中を循環して、有効な免疫応答を生成する為にそれらの標的組織へと到達する。それ故に、これらのサブセットは、該血流において検出可能であるが、一部のＢ細胞サブセットは、１０個／μＬ以下の比較的低い頻度で生じる。十分な細胞（好ましくは、１００万～５００万個以上の血中白血球）が評価されている場合、該未成熟及びナイーブＢ細胞サブセット、クラススイッチされていない及びクラススイッチされた該メモリーＢ細胞サブセット、並びに形質芽球／形質細胞サブセットは、その全てが血液中で検出可能である完全なＢ細胞経路を形成する。

Ｔ細胞は胸腺において発達し、ここで、Ｔ細胞は、ＴｃＲγδ、並びにＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ＴｃＲαβ Ｔ細胞亜集団を伴うＴｃＲαβ Ｔ細胞へと段階的に分化する。これらのＴ細胞集団は、該血流において主なＴ細胞集団を形成する。２０年前に既に、該主なＴ細胞集団において、胸腺移出細胞及びナイーブＴ細胞から、セントラルメモリーＴ細胞、トランジショナルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、及びターミナルエフェクターＴ細胞への複数の成熟段階が発見された。加えて、ＣＤ４ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞及びＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の機能的サブセット化がまた可能であるように思われた。

自然免疫細胞は又、異なる関連する系列：顆粒球細胞、例えば好中球、好塩基球及び好酸球；単球、例えば古典的単球、中間単球、非古典的単球及びＦｃＥＲＩ^＋単球；樹状細胞（ＤＣ）、例えば骨髄系ＤＣ、形質細胞様ＤＣ；ＮＫ細胞及び他の自然リンパ球等、へと細分されることができる。

フローサイトメトリーによる血中白血球サブセット化に関して利用可能な、多くの提案が為されているが、本発明者等は、以下の問題がこれまで可能ではなかったことを認識した：
１：様々な単球サブセット及び他の骨髄系細胞にも関連付けて、１回の測定で血液中のＤＣを効率よく且つ同時にサブセット化する方法；
２：好ましくは、様々な細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞のサブセット化と結びつけて、単一の抗体の組み合わせを使用して、多くの他のＴ細胞サブセット及び成熟段階にも関連付けて、ＣＤ４ヘルパーＴサブセット、濾胞ヘルパーＴ（follicular helper T）（Ｔｆｈ）細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を定義する為に複雑な細胞内サイトカインプロファイルを含まない、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をサブセット化する方法。
３：様々なＢ細胞サブセット及びそれらのＩｇＨサブクラス発現にも関連付けて、形質芽球／形質細胞区画内の成熟及び機能的サブセット化を区別する方法。

それ故に、本発明は、特にサイトメトリーによる血中白血球サブセット化を可能にする新規試薬組成物及び方法を提供することによって、上記の問題のうちの１以上に取り組むことを狙いとする。好ましくは、該試薬は、現在４０色を超えて増加している、多くの異なる蛍光色素を使用して、古典的なマルチパラメータフローサイトメトリー技術において適用されることができる。代替的には、異なる４０「色」（金属）を超えて現在増加している、金属にコンジュゲーションされた抗体は、マスサイトメトリーにおける分析の為に使用されることができる。

第１の観点において、本発明は、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ：ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、及びＣＤ１４に対して向けられたものであり、該ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物は、本明細書において、「ＤＣ－単球チューブ」とも云われる。

第２の観点において、本発明は、試薬組成物、すなわち白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物、であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ：ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ１０、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）、及びＣＤ４に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物は、本明細書において「ＣＤ４ Ｔ細胞チューブ」とも云われる。

第３の観点において、本発明は、試薬組成物、すなわち白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物が、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、任意的にＣＤ１９と組み合わせられた、下記のマーカーの組み合わせ：ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１３８に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。そのような試薬組成物はまた、本明細書において「形質細胞／Ｂ細胞チューブ」と云われる。

本発明はまた、本明細書に開示されている２以上の試薬組成物を含む試薬セットに関する。

更なる観点は、本発明に従う１以上の試薬組成物又は試薬組成物のセットを、任意的に使用の為の指示書、バッファ、及び／又は対照サンプルと一緒に含んでいてもよい、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットに関する。

本発明に従う診断キットの、例えば古典的な免疫抑制処置（コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等）；細胞処置、例えば遺伝子療法、幹細胞移植、ＣＡＲ Ｔ細胞処置；チェックポイント阻害剤；多くの異なる抗体処置（多くの異なる抗体－エフェクター機能を有する）；及び外部作用剤（external agents）（微生物、昆虫毒素、アレルゲン等）又は腫瘍抗原に対するワクチン接種からなる群から選択される、免疫調節処置の効果のモニタリングすることにおける使用がまた提供される。

更なる実施態様において、本発明は、対象の免疫状態及び／又は免疫調節処置の効果のモニタリングする為のサイトメトリー方法であって、
（ａ）該対象から得られた白血球を含む生物サンプルの１以上のアリコートを、本発明に従う試薬組成物と接触させること；
（ｂ）（フロー又はマス）サイトメーターにおいて上記１以上のアリコート中の白血球を分析すること；及び
（ｃ）得られたデータを保存し、且つ評価すること
の工程を含む、上記方法を提供する。

ＤＣ－単球チューブの為のゲート設定戦略。このゲート設定戦略は、７種のマーカー（ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３）の「バックボーン」（backbone）に対して向けられた抗体を使用して、１０個の自然骨髄系集団を同定する為に使用され、該抗体は、６つの別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。パネルＡは、シングレットの選択を表し、該シングレットは以降のパネルにおいて更に分析されている。パネルＢ～Ｄは、好中球及び好酸球を同定する為の戦略を示し、パネルＥ～Ｍは、主要な単球集団、すなわち古典的単球（classical monocytes）（ｃＭｏ）、中間単球（intermediate monocytes）（ｉＭｏ）、及び非古典的単球（non-classical monocytes）（ｎｃＭｏ）、を同定する為のゲート設定アプローチを例証する。パネルＮ～Ｑ及びＲ～Ｖはそれぞれ、骨髄樹状細胞（ＣＤ１４１^＋、ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－、及びＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ）並びにＡｘｌ^＋及び形質細胞様樹状細胞を同定する為の分析順序を表す。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞。 ＤＣ－単球チューブの為のゲート設定戦略。このゲート設定戦略は、７種のマーカー（ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３）の「バックボーン」に対して向けられた抗体を使用して、１０個の自然骨髄系集団を同定する為に使用され、該抗体は、６つの別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。パネルＡは、シングレットの選択を表し、該シングレットは以降のパネルにおいて更に分析されている。パネルＢ～Ｄは、好中球及び好酸球を同定する為の戦略を示し、パネルＥ～Ｍは、主要な単球集団、すなわち古典的単球（ｃＭｏ）、中間単球（ｉＭｏ）、及び非古典的単球（ｎｃＭｏ）を同定する為のゲート設定アプローチを例証する。パネルＮ～Ｑ及びＲ～Ｖはそれぞれ、骨髄樹状細胞（ＣＤ１４１^＋、ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－、及びＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ）並びにＡｘｌ^＋及び形質細胞様樹状細胞を同定する為の分析順序を表す。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞。 ＤＣ－単球チューブの為のゲート設定戦略。このゲート設定戦略は、７種のマーカー（ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３）の「バックボーン」に対して向けられた抗体を使用して、１０個の自然骨髄系集団を同定する為に使用され、該抗体は、６つの別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。パネルＡは、シングレットの選択を表し、該シングレットは以降のパネルにおいて更に分析されている。パネルＢ～Ｄは、好中球及び好酸球を同定する為の戦略を示し、パネルＥ～Ｍは、主要な単球集団、すなわち古典的単球（ｃＭｏ）、中間単球（ｉＭｏ）、及び非古典的単球（ｎｃＭｏ）を同定する為のゲート設定アプローチを例証する。パネルＮ～Ｑ及びＲ～Ｖはそれぞれ、骨髄樹状細胞（ＣＤ１４１^＋、ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－、及びＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ）並びにＡｘｌ^＋及び形質細胞様樹状細胞を同定する為の分析順序を表す。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞。 ＤＣ－単球チューブの為のゲート設定戦略。このゲート設定戦略は、７種のマーカー（ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３）の「バックボーン」に対して向けられた抗体を使用して、１０個の自然骨髄系集団を同定する為に使用され、該抗体は、６つの別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。パネルＡは、シングレットの選択を表し、該シングレットは以降のパネルにおいて更に分析されている。パネルＢ～Ｄは、好中球及び好酸球を同定する為の戦略を示し、パネルＥ～Ｍは、主要な単球集団、すなわち古典的単球（ｃＭｏ）、中間単球（ｉＭｏ）、及び非古典的単球（ｎｃＭｏ）を同定する為のゲート設定アプローチを例証する。パネルＮ～Ｑ及びＲ～Ｖはそれぞれ、骨髄樹状細胞（ＣＤ１４１^＋、ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－、及びＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ）並びにＡｘｌ^＋及び形質細胞様樹状細胞を同定する為の分析順序を表す。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞。 末梢血の分析の為の、ＤＣ－単球チューブを使用して同定された別個の集団の多次元提示（主成分分析）。パネルＡ～Ｃは、６つの標識付けによってコンジュゲーションされた、７種のマーカーのバックボーンを使用して検出された、１０個の集団を表す（図１を参照）。パネルＤは、前樹状細胞（ＤＣ）ＣＤ１００^＋の同定及び骨髄系ＤＣの更なるサブセット化に対するＣＤ５及びＣＤ３４の寄与を示す。ＣＤ３６及びＳｌａｎ並びに／又はＣＤ６２Ｌ及びＦｃＥＲＩを使用する単球細胞の更なるサブセット化は、パネルＥ及びＦにおいて実証され、好酸球、未成熟好中球、及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）を同定する為の、ＣＤ４５及びＣＤ６２Ｌの付加価値がパネルＧに表される。パネルＨ～Ｊは、２３個の別個の自然細胞サブセットを同時に同定する為の、１３個の異なる検出可能な標識にコンジュゲーションされた、新規の１５抗体の組み合わせの総合的な成績を示す。ＰＣ、主成分；ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞性樹状細胞；ＨＰＣ、造血前駆細胞；Ｍ－ＭＤＳＣ、単球性骨髄由来サプレッサー細胞；ｐｒｅＤＣ、前樹状細胞ＣＤ１００^＋。 末梢血の分析の為の、ＤＣ－単球チューブを使用して同定された別個の集団の多次元提示（主成分分析）。パネルＡ～Ｃは、６つの標識付けによってコンジュゲーションされた、７種のマーカーのバックボーンを使用して検出された、１０個の集団を表す（図１を参照）。パネルＤは、前樹状細胞（ＤＣ）ＣＤ１００^＋の同定及び骨髄系ＤＣの更なるサブセット化に対するＣＤ５及びＣＤ３４の寄与を示す。ＣＤ３６及びＳｌａｎ並びに／又はＣＤ６２Ｌ及びＦｃＥＲＩを使用する単球細胞の更なるサブセット化は、パネルＥ及びＦにおいて実証され、好酸球、未成熟好中球（immature neutrophils）、及び造血前駆細胞（hematopoietic precursor cells）（ＨＰＣ）を同定する為の、ＣＤ４５及びＣＤ６２Ｌの付加価値がパネルＧに表される。パネルＨ～Ｊは、２３個の別個の自然細胞サブセットを同時に同定する為の、１３個の異なる検出可能な標識にコンジュゲーションされた、新規の１５抗体の組み合わせの総合的な成績を示す。ＰＣ、主成分；ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞性樹状細胞；ＨＰＣ、造血前駆細胞；Ｍ－ＭＤＳＣ、単球性骨髄由来サプレッサー細胞；ｐｒｅＤＣ、前樹状細胞ＣＤ１００^＋。 ＤＣ－単球チューブの集団ツリー。パネルＡ。血液解析の為の集団ツリー（１４種のマーカー）は、２３個のサブセットへの詳細なサブセット化を可能にする。^＊、異なる戦略を使用して同定された同じ集団。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞；ＨＰＣ、造血前駆細胞；Ｍ－ＭＤＳＣ、単球系骨髄由来サプレッサー細胞。 ＤＣ－単球チューブの集団ツリー。パネルＢ。骨髄分析の為の集団ツリー（１６種のマーカー）は、１９個の骨髄サブセットへの詳細なサブセット化を可能にする。^＊、異なる戦略を使用して同定された同じ集団。ｃＭｏ、古典的単球；ｉＭｏ、中間単球；ｎｃＭｏ、非古典的単球；ｍｙＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞；ＨＰＣ、造血前駆細胞；Ｍ－ＭＤＳＣ、単球系骨髄由来サプレッサー細胞。 ＣＤ４ Ｔ細胞チューブによって同定された主要なヘルパーＴ、Ｔｒｅｇ、及びＴｆｈ集団。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ１２７及びＣＤ１８５を使用して、全古典的ヘルパーＣＤ４^＋Ｔ細胞（ａ）、Ｔｒｅｇ（ｂ）、及びＴｆｈ細胞（ｃ）を同定する為に使用される連続的戦略。各主要な集団内で、異なるＴｈ及びＴｈ－様（ｌｉｋｅ）サブセットは、古典的Ｔｈ細胞、Ｔｒｅｇ、及びＴｆｈ細胞に関してそれぞれ、パネルｄ、ｅ、及びｆに示されているように、ＣＤ１８３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６及びＣＣＲ１０の発現に基づいて同定されることができ、標準的な多変量解析（ＣＡ）が実施された。最後に、各Ｔｈサブセットにおいて、別個の成熟段階がＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ６２Ｌに関するそれらの発現プロファイルに基づいて同定され、これは二次元自動集団セパレーター（ＡＰＳ）の画面で、パネルｇ～ｋにおいて、古典的Ｔｈ細胞に関する主成分（ＰＣ）１対ＰＣ２により表示される。Ｔｈ、ヘルパーＴ細胞；Ｔｒｅｇ、制御性Ｔ細胞；Ｔｆｈ、濾胞性ヘルパーＴ細胞。 ＣＤ４ Ｔ細胞チューブによって同定された主要なヘルパーＴ、Ｔｒｅｇ、及びＴｆｈ集団。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ１２７及びＣＤ１８５を使用して、全古典的ヘルパーＣＤ４^＋Ｔ細胞（ａ）、Ｔｒｅｇ（ｂ）、及びＴｆｈ細胞（ｃ）を同定する為に使用される連続的戦略。各主要な集団内で、異なるＴｈ及びＴｈ－様（ｌｉｋｅ）サブセットは、古典的Ｔｈ細胞、Ｔｒｅｇ、及びＴｆｈ細胞に関してそれぞれ、パネルｄ、ｅ、及びｆに示されているように、ＣＤ１８３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６及びＣＣＲ１０の発現に基づいて同定されることができ、標準的な多変量解析（ＣＡ）が実施された。最後に、各Ｔｈサブセットにおいて、別個の成熟段階がＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ６２Ｌに関するそれらの発現プロファイルに基づいて同定され、これは二次元自動集団セパレーター（ＡＰＳ）の画面で、パネルｇ～ｋにおいて、古典的Ｔｈ細胞に関する主成分（ＰＣ）１対ＰＣ２により表示される。Ｔｈ、ヘルパーＴ細胞；Ｔｒｅｇ、制御性Ｔ細胞；Ｔｆｈ、濾胞性ヘルパーＴ細胞。 ＣＤ４ Ｔ細胞チューブの集団ツリー。 ＣＤ４ Ｔ細胞チューブの集団ツリー。 形質芽球及び形質細胞の同定及び特徴付けの為の抗体組み合わせによる末梢血中の、循環している形質芽球及び形質細胞の免疫表現型決定パターン。マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１３８に対して向けられた抗体を組み合わされた、循環している形質芽球及び形質細胞の別個の成熟パターンの精査は、ワクチン接種前（パネルＡ）及びワクチン接種の７日後（パネルＢ）の健康な個体における成熟ダイアグラム上で表される。色つきの線は、各成熟段階に対応するマーカーの発現レベルを表す。灰色の線は、各成熟段階における事象のパーセンテージを表す。２０の成熟段階が、各細胞系列の成熟経路に沿って平滑化されたグラフ表示のデフォルトによって定義された。ＩｇＨクラス及びサブクラスの発現に従う２０の形質芽球／形質細胞成熟段階の精査は、ワクチン接種前（パネルＣ）及びワクチン接種の７日後（パネルＤ）の健康な個体において表される。色つきの線は、成熟段階毎の全形質芽球／形質細胞のうちの各ＩｇＨクラス及びサブクラスを発現する形質芽球／形質細胞のパーセンテージを表す。 形質芽球及び形質細胞の同定及び特徴付けの為の抗体組み合わせによる末梢血中の、循環している形質芽球及び形質細胞の免疫表現型決定パターン。マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１３８に対して向けられた抗体を組み合わされた、循環している形質芽球及び形質細胞の別個の成熟パターンの精査は、ワクチン接種前（パネルＡ）及びワクチン接種の７日後（パネルＢ）の健康な個体における成熟ダイアグラム上で表される。色つきの線は、各成熟段階に対応するマーカーの発現レベルを表す。灰色の線は、各成熟段階における事象のパーセンテージを表す。２０の成熟段階が、各細胞系列の成熟経路に沿って平滑化されたグラフ表示のデフォルトによって定義された。ＩｇＨクラス及びサブクラスの発現に従う２０の形質芽球／形質細胞成熟段階の精査は、ワクチン接種前（パネルＣ）及びワクチン接種の７日後（パネルＤ）の健康な個体において表される。色つきの線は、成熟段階毎の全形質芽球／形質細胞のうちの各ＩｇＨクラス及びサブクラスを発現する形質芽球／形質細胞のパーセンテージを表す。 形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブの集団ツリー。 形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブの集団ツリー。

本発明は、一部の実施態様において、改善された有利な試薬組成物、並びにそれを含むキットに関する。語「試薬組成物」（又は「サイトメトリーパネル」）は、本明細書で使用される場合、検出可能な標識に（直接的に又は間接的に）コンジュゲーションされた抗体（又は他の特異的抗原結合剤）のカクテルに関する。

抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって互いに連結された、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各軽鎖は「Ｙ」字形状の構成でジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に連結されている。軽鎖及び重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成している。該重鎖のアイソタイプ（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン又はミュー）は、免疫グロブリンのクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を決定する。語「抗体」又は「複数の抗体」が使用されている場合、これは、インタクト抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、並びにそのタンパク質分解断片、例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２ 断片、を含むと意図されることが理解されるべきである。更に、キメラ抗体、組み換え抗体及び操作された抗体、並びにその断片、並びに抗体の少なくとも抗原結合部位を含む（抗原結合能を保持している）他の分子が、本発明の範囲内にある。好ましい実施態様において、該組成物は、コンジュゲートモノクローナル抗体のパネルを含む。表記されたマーカーに対する（モノクローナル）抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｄａｋｏ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＹＴＯＧＮＯＳ、Ｃａｌｔａｇ、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｅｘｂｉｏ、Ｓａｎｑｕｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等、を含む、様々な企業から購入することによって得られることができる。

本発明において使用する為の抗体は、サイトメトリー、例えばフロー又はマスサイトメトリー、によって検出可能である標識にコンジュゲーションされている。検出可能な標識の好適なタイプは、蛍光色素（フルオロフォア）、量子ドット、及び金属同位体標識を含む。理解されるように、同時の検出を容易にする為に、本発明の試薬組成物に存在する全ての抗体は、同じタイプの検出可能な標識にコンジュゲーションされており、例えば、全てが蛍光色素にコンジュゲーションされているか、又は全てが同位体標識されている。加えて、フローサイトメトリーは、物理的特性の同定又は定量的測定の為に細胞又は粒子から散乱された光の特性を使用している。

一つの実施態様において、該抗体は、蛍光色素にコンジュゲーションされている。蛍光色素（又は「フルオロフォア」）は、励起源（レーザービーム）からのエネルギーを吸収して、より長い波長（蛍光）で光子を放出することができる化学物質であり、該光子がフローサイトメーターの光学的検出器によって捕捉される。抗体をコンジュゲーションする為に好適な蛍光色素は、当技術分野で既知である。各フルオロフォアは、特徴的なピーク励起波長及び放出波長を有し、該放出スペクトルは重複することが多い。その結果、使用されることができる標識の組み合わせは、該蛍光色素を励起する為に使用される１以上の光源又は１以上のレーザーの波長及び利用可能な検出器に依存する。該蛍光色素は好ましくは、輝度、スペクトルの重複が限定的であること、及び補正の必要が限定的であること、安定性等、に関して選択される。

広範囲の蛍光色素が、フローサイトメトリーにおける標識として使用されることができる。本発明に従う試薬組成物において特に有用な蛍光色素は、ブリリアントバイオレット（Brilliant Violet）（ＢＶ）シリーズの蛍光色素、例えばＢＶ４２１又はその機能的等価物、ＢＶ５１０又はその機能的等価物、ＢＶ６０５又はその機能的等価物、ＢＶ６５０又はその機能的等価物、ＢＶ７１１又はその機能的等価物、ＢＶ７８６又はその機能的等価物；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はその機能的等価物（例えば、ＢＢ５１５）、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５又はその機能的等価物、フィコエリスリン（ＰＥ）又はその機能的等価物、フィコエリスリン／ＣＦ５９４（ＰＥ ＣＦ５９４）又はその機能的等価物、フィコエリスリン／シアニン５（ＰＥ－Ｃｙ５）又はその機能的等価物 フィコエリスリン／シアニン７（ＰＥ－Ｃｙ７）又はその機能的等価物、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はその機能的等価物（Ａｌｅｘａ６４７）、ＡＦ７００又はその機能的等価物、及びアロフィコシアニン／Ｈ７（ＡＰＣ－Ｈ７）又はその機能的等価物、を含む。

下記のパネルの蛍光色素は、本発明に従う１２色の試薬組成物において特に有用である：（１）ＢＶ４２１又はその機能的等価物、（２）ＢＶ５１０又はその機能的等価物、（３）ＢＶ６０５又はその機能的等価物；（４）ＢＶ７１１又はその機能的等価物、（５）ＢＶ７８６又はその機能的等価物、（６）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はその機能的等価物（例えば、ＢＢ５１５）、（７）ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５又はその機能的等価物、（８）フィコエリスリン（ＰＥ）又はその機能的等価物、（９）フィコエリスリン／シアニン７（ＰＥ－Ｃｙ７）又はその機能的等価物、（１０）アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はその機能的等価物（Ａｌｅｘａ６４７）、（１１）ＡＦ７００又はその機能的等価物、例えば、ＡＰＣ－Ｒ７００、（１２）アロフィコシアニン／Ｈ７（ＡＰＣ－Ｈ７）又はその機能的等価物、例えば、ＡＰＣ－Ｃｙ７。

下記のパネルの蛍光色素は、本発明に従う１４色の試薬組成物において特に有用である：（１）ＢＶ４２１又はその機能的等価物、（２）ＢＶ５１０又はその機能的等価物、（３）ＢＶ６０５又はその機能的等価物；（４）ＢＶ６５０又はその機能的等価物、（５）ＢＶ７１１又はその機能的等価物、（６）ＢＶ７８６又はその機能的等価物、（７）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はその機能的等価物（ＢＢ５１５）、（８）ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５又はその機能的等価物、（９）フィコエリスリン（ＰＥ）又はその機能的等価物、（１０）フィコエリスリン／ＣＦ５９４（ＰＥ ＣＦ５９４）又はその機能的等価物、（１１）フィコエリスリン／シアニン５（ＰＥ－Ｃｙ５）又はその機能的等価物（１２）フィコエリスリン／シアニン７（ＰＥ－Ｃｙ７）又はその機能的等価物、（１３）アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はその機能的等価物（Ａｌｅｘａ６４７）、（１４）ＡＦ７００又はその機能的等価物、（１５）アロフィコシアニン／Ｈ７（ＡＰＣ－Ｈ７）又はその機能的等価物。

別の実施態様において、該抗体は、量子ドットにコンジュゲーションされている。時に、量子ドットが、それらの狭い放出ピークの為に従来の蛍光色素の代わりに使用されている。

なお別の実施態様において、該抗体はまた、金属同位体にコンジュゲーションされており、飛行時間型サイトメトリー（cytometry by time-of-flight）（ＣｙＴＯＦ）と呼ばれる、マスサイトメトリーによる検出を可能にする。単細胞マスサイトメトリーにおける進歩は、免疫細胞の不均一性の高度に多次元の特徴付けをますます改善している。イムノアッセイの多重化能は、安定な重金属同位体によって標識されたモノクローナル抗体に依存する。

マスサイトメトリーは、抗体に結合したランタニド同位体を利用することによって、該蛍光標識の限界を克服する。この方法は、理論的には、４０～６０の識別可能な標識又はそれより多くの標識の使用を可能にすることができる。マスサイトメトリーは、フローサイトメトリーとは根本的に異なり、細胞は、プラズマに導入され、電離され、関連する同位体が、飛行時間型質量分析法を介して定量される。この方法は、多数の標識の使用を可能にするが、現在のところ、フローサイトメトリーより低いスループット能力を有する。該方法は又、分析された細胞を破壊し、選別によってそれらを回収することができない。最後に、細胞の主要な分画は、測定の為のコーンに到達する前に失われる。

今日まで、多様な希土類元素及び貴金属及び貧金属が、マスサイトメトリーにおいて使用されている。例えば、Han et al．(2018，Nature Protocols volume 13，pages 2121-2148)は、モノクローナルＩｇＧ抗体を４８個の高純度重金属同位体、すなわち（ｉ）ランタニドの３８個の同位体、インジウムの２つの同位体、及びイットリウムの１つの同位体；（ｉｉ）パラジウムの６つの同位体；並びに（ｉｉｉ）ビスマスの１つの同位体、にコンジュゲーションさせる為のプロトコールを開示している。

一つの実施態様において、本発明の試薬組成物は、異なる質量の金属、特に金属の同位体、好ましくは、Ｐｒ、Ｂｉ、Ｙ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｉｒ、Ｐｔ及びＰｄからなる群から選択される、金属の同位体にコンジュゲーションされている、抗体のパネルを含む。特定の例は、１０３Ｒｈ、１０６Ｃｄ、１１０Ｃｄ、１１１Ｃｄ、１１２Ｃｄ、１１３Ｃｄ、１１４Ｃｄ、１１５Ｉｎ、１１６Ｃｄ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９１Ｉｒ、１９３Ｉｒ、１９４Ｐｔ、１９８Ｐｔ及び２０９Ｂｉを包含する。

細胞のマスサイトメトリー分析の為のサンプル調製の、典型的な方法において、細胞は、目的の抗原（マーカー）を標的とする金属をタグ付けされた抗体のパネルと共にインキュベート（又は「染色」）される。ＤＮＡインターカレート剤は、該パネルに組み込まれることができ、それによって有核細胞を非有核細胞から決定することを可能にする。細胞は、休止条件又は刺激条件の下で染色され、固定された後に解析される。該サンプルは、洗浄されて非結合抗体及び塩が除去され、適切な細胞濃度に希釈される。次に、細胞は、単細胞懸濁物中でネブライザーまで通過され、該ネブライザーは、該細胞を、該マスサイトメーターに導入する為の液滴へとエアロゾル化する。該機器に入ると、細胞は、７０００°Ｋのアルゴンプラズマの中を移動し、該アルゴンプラズマは、該細胞及び該結合された抗体を、単一原子イオンのクラウドの中で完全に蒸気にしてイオン化する。該クラウドのサイズは、ガス膨張速度論によって主に促進され、該細胞サイズとは比較的無関係である。該イオンクラウドは、四極子によって濾過され、約７５Ｄａ未満の質量を有する一般的な生物学的要素が除去され、目的のマーカーセットに対する該染色抗体に結合された重金属イオンのみが残される。該クラウド内の該イオンは、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器において、その質量と電荷との比によって分離される。イオンシグナルは、細胞毎に積分され、分析の為の単細胞測定をもたらす。

本明細書に提供されている試薬組成物における該抗体のパネルは、一部の実施態様において、細胞含有生物サンプル（懸濁物中）を同時に標識する為に使用されうる。言い換えれば、該サンプルは、典型的に及び有利に、本明細書に開示されている全サイトメトリーパネルと共にインキュベートされており、このように、該サンプルからの単細胞における抗原同時発現パターンのマルチパラメトリック解析（「多重化」）を使用して、単一の測定工程において複数の細胞集団の特徴付けを可能にする。従って、パネル内での分離が望ましい別個の細胞標的（「マーカー」）に対して向けられた抗体は、別個の（非等価物の）検出可能な標識によって標識され、これらは、本明細書において別個のコンジュゲーションされた抗体と云われる。該マーカーは、細胞表面上（細胞表面マーカー）又は細胞質（細胞質マーカー；ｃｙマーカー）において発現されるタンパク質であることができる。典型的に、本発明のマーカーは、ヒトマーカーである。「ＣＤ」は、クラスターの名称を意味し、モノクローナル抗体によって定義される特定の（ヒト）細胞表面抗原の同定の為の命名法である。

一部の実施態様において、試薬組成物は、異なるマーカーに対して向けられた抗体を含むが、サブセット、例えばこれらの抗体の２つ又は３つが、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。例えば、各々が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体を含む、表１の試薬を参照されたい。該試薬組成物は、そのような抗体対の２以上を含みうるが、ここで、該対のいずれか１つにおける抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされているが、該標識は異なる対の間では識別可能である。例えば、第１の対の両方の抗体が、蛍光色素Ａにコンジュゲーションされており、第２の対の両方の抗体が、蛍光色素Ｂにコンジュゲーションされている。このように、各対において、該蛍光色素は同じである。例えば、各々が蛍光色素「Ｆ９」にコンジュゲーションされている、ＳＬＡＮ及びＦｃＥＲＩに対して向けられた抗体、並びに各々が蛍光色素「Ｆ１２」にコンジュゲーションされている、ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体を含む試薬を開示している、表１を参照されたい。

該試薬組成物はまた、同じ標的（マーカー）に対する複数のコンジュゲーションされた抗体を含むことが可能であり、各抗体は、別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされている。例えば、第１の抗体が蛍光色素「Ｆ８」にコンジュゲーションされており、第２の抗体が蛍光色素「Ｆ１２」にコンジュゲーションされている、ＩｇＡ１に対する２つの抗体；第１の抗体が蛍光色素「Ｆ７」にコンジュゲーションされており、第２の抗体が、蛍光色素「Ｆ９」にコンジュゲーションされている、ＩｇＧ２に対する２つの抗体；及び第１の抗体が、蛍光色素「Ｆ７」にコンジュゲーションされており、第２の抗体が蛍光色素「Ｆ１２」にコンジュゲーションされている、ＩｇＤに対する２つの抗体、を含む試薬を開示している、表７を参照されたい。

語「キット」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの、典型的に複数の本発明の試薬組成物を含み、任意的に更なる試薬、例えば細胞の解離、精製、透過処理の為の試薬、対照サンプル若しくは抗体、又はフローサイトメトリーにおいて使用する為の他の試薬、を含む、製品に関する。該キットは更に、本発明の方法における該少なくとも１つの試薬組成物を使用する為の説明書、例えば、本明細書で詳述されているマルチパラメトリック解析を使用して測定される結果を解析する為の説明書を含有しうる。一つの実施態様において、本発明は、本明細書に開示されている１以上の１２色試薬組成物を含む１２色診断キットを提供する。

対象の該免疫状態、及び／又は該免疫調節処置の効果をモニタリングする為のサイトメトリー方法は、典型的に（ａ）該対象から得られた白血球を含む生物サンプルのアリコートを、本明細書に開示されている試薬組成物と接触させること；（ｂ）検出可能な標識のタイプ、フローサイトメーター又はマスサイトメーターに応じて、上記アリコート中の白血球を分析すること；及び（ｃ）得られたデータを保存し、且つ評価することの工程を含む。

白血球を含有することが既知であるか又は疑われる任意のタイプのサンプルは、直接、又は非有核赤血球の溶解後、若しくは密度勾配遠心分離後、若しくは細胞選別手順後に使用されうる。例えば、該サンプルは、末梢血、骨髄、組織サンプル、例えばリンパ節、アデノイド、脾臓、若しくは肝臓、又は他のタイプの体液、例えば脳脊髄液、硝子体液、滑液、胸膜滲出液、若しくは腹水、である。末梢血（Peripheral blood）（ＰＢ）又は骨髄（bone marrow）（ＢＭ）が好ましい。

好ましくは、本明細書に提供されている方法の工程（ｃ）は、サンプルの１つのアリコートからの個々の細胞が、それらのマーカー及び散乱プロファイルに従って、同じサンプルの別のアリコートからの対応する個々の細胞と一致する、いわゆる最近傍法の計算に従って、複数のチューブからの２以上の選択された細胞集団の免疫表現型情報を組み合わせることを含む。有利には、該方法は、フローサイトメトリーファイルのデータ統合及び多次元解析の為にソフトウェアの使用を含み、好ましくは、上記ソフトウェアはＩＮＦＩＮＩＣＹＴ（商標）である。

下記のＡ～Ｅの節において、本発明の特に好ましい実施態様が表されている。これらの実施態様のいずれも、単独で、又は互いに組み合わせて使用されることができる。示されている該実施態様は、検出可能な標識として蛍光色素にコンジュゲーションされている抗体に関するが、他のタイプの検出可能な標識、例えば金属同位体、を含む変形形態の実施態様がまた、包含されることが理解され且つ認識される。本明細書で使用される場合、試薬組成物に関連付けて考察される表現「マーカーの組み合わせ」は、該組成物が、上記マーカーの組み合わせの各マーカーに対するコンジュゲーションされた抗体を含むことを意味する。

Ａ．血液及びＢＭ試験の為のＤＣ－単球チューブ
樹状細胞（ＤＣ）が最初に発見されて以降、複数のサブセットが段階的に同定されている。一部のＤＣサブセットは、組織において排他的に見出されているが、他のＤＣサブセットがまた血液中で見出されている。これらの血中ＤＣは、古典的に定義された形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）及び骨髄系ＤＣ（ｍｙＤＣ）、並びにそれらのサブセット、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５^－、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５^＋及びｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋、それに加えて、最近記載されたＡｘｌ^＋ＤＣ及びＣＤ１００^＋ＤＣ前駆細胞（ｐｒｅ－ＤＣ）（Villani，Satija et al．2017、Yin，Yu et al．2017、Collin and Bigley 2018）を含む。一部の樹状細胞集団に関して、幾つかの代替的なマーカーが、その正確な同定の為に使用されることができ、例えば、ｐＤＣの同定の為にＣＤ１２３^ｈｉｇｈ、ＣＤ３０３及びＣＤ３０４、ｍｙＤＣの為にＣＤ１１ｃ及びＣＤ３３、並びにＣＤ１４１^＋ｍｙＤＣの為にＣＤ１４１又はＣＬＥＣ９Ａ、が使用されることができる（Bachem，Guttler et al．2010、Heinze，Elze et al．2013、Fromm，Kupresanin et al．2016、Alcantara-Hernandez，Leylek et al．2017、Dutertre et al．2017、Villani，Satija et al．2017、Collin and Bigley 2018を参照）。これに対し、他のサブセットは、文献において単一のマーカーに基づいて定義されており、例えばＡｘｌ^＋ＤＣは、Ａｘｌの発現（ＳＩＧＬＥＣ６も組み合わせて）に基づいて、ＣＤ１００^＋ｍｙＤＣ前駆細胞は、ＣＤ１００とＣＤ３４の組み合わせに基づいて、ＣＤ１ｃ^＋ｍｙＤＣは、ＣＤ１ｃに基づいて同定されている（Villani，Satija et al．2017、Collin and Bigley 2018）。

ＤＣ集団を同定する為のフローサイトメトリーパネルを設計する為の、幾つかの試みが行われているが（Autissier，Soulas et al．2010，Hasan，Beitz et al．2015，Fromm，Kupresanin et al．2016，Draxler，Madondo et al．2017）、現在まで、他の自然細胞、例えば単球サブセット、顆粒球サブセット及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、に加えて、限定数のマーカーによって、単一チューブアプローチで血液中の上記ＤＣ集団（新たに記載されたサブセットを含む）の全てを同時に同定する方法を、当業者は教示又は示唆していない。

本発明者等は、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む該試薬組成物を提供することによって、この問題を解決し、該コンジュゲーションされた抗体は、下記のマーカー：ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３及びＣＤ１４の組み合わせに対して向けられたものであり、該ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされうる。

Ａ．１ 血液分析の為のＤＣ－単球チューブ
新規ＤＣ／単球試薬は、６又は７つの別個の標識にコンジュゲーションされた７つの「バックボーン」マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＨＬＡ－ＤＲ）の革新的パネルに対するコンジュゲーションされた抗体を含む（ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３は、同じ標識付けで組み合わせられることができる；表１、チューブＢＢ１）。この７種のマーカーの組み合わせにおいて、該マーカーＣＤ３００ｅは、その発現プロファイルが単球と別個のＤＣ（それぞれ、陽性／ｈｉｇｈ対陰性／ｌｏｗ）とを識別することから、極めて重要である。該マーカーＣＤ１４１及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体はそれぞれ、ＣＤ１４１^＋ｍｙＤＣ及びｐＤＣの認識にとって必須である。これにより、本発明の抗体パネルは、中でもＣＤ３３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３０３及びＣＤ１４１に対して向けられた抗体を含むが、必須の抗ＣＤ３００ｅ抗体を欠如する、サイトメトリーパネルを開示する、国際公開第２０１７／０９４００８号パンフレットを含む、当技術分野で既知の試薬組成物と比較して予想外の利点を提供する。

一つの実施態様において、標識を効率的に使用するという理由から、本発明の抗体パネルにおけるＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対する該抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。これは、該ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３マーカーが相互に排他的マーカーであり、すなわち、それらが同じ単球及びＤＣサブセット上には存在しないことから、可能である。ＣＤ３００ｅは、ＣＤ３００ｅが陰性であるか、又は僅かに発現されている一部のＤＣサブセット上より高い強度で、全ての血中単球サブセット上で発現されるが、ＣＤ３０３は、典型的にｐＤＣ及びＡｘｌ^＋ＤＣにおいて発現される。

単独で、本明細書に提供されている７種のマーカーのバックボーン試薬組成物は、下記を含む、全体で１０個の自然細胞サブセットに関して、５つのＤＣサブセットの同定（図１；図２Ａ）、及び３つの単球サブセットの同定（図１；図２Ｂ）、それに加えて好中球及び好酸球（図１；図２Ｃ）の同定を既に可能にしている（完全なゲート設定戦略による図１）：
ｐＤＣ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１４１^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^＋、ＳＳＣ^ｌｏｗ
ｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ１４１^＋＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｌｏｗ
ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^－：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ１４１^ｌｏｗ、ＣＤ３００ｅ^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｌｏｗ
ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^ｌｏｗ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^ｌｏｗ、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ１４１^ｌｏｗ、ＣＤ３００ｅ^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｌｏｗ
Ａｘｌ^＋ＤＣ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^{ｌｏｗ／＋}、ＳＳＣ^ｌｏｗ
古典的単球（ｃＭｏ）：ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ１４１^ｌｏｗ、ＣＤ３００ｅ^＋、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｉｎｔ
中間単球（ｉＭｏ）：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ１４１^ｌｏｗ、ＣＤ３００ｅ^＋＋、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｉｎｔ
非古典的単球（ｎｃＭｏ）：ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１４^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^ｌｏｗ、ＣＤ３００ｅ^＋＋、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｉｎｔ
好中球：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^＋＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｈｉｇｈ
好酸球：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^ｌｏｗ、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｈｉｇｈ

ＣＤ５に対して向けられた抗体を、上記バックボーンの組み合わせ（７つの標識付けと組み合わされた、全体で８種のマーカー；表１、チューブＢＢ２Ａ）に加えることは、ＣＤ１ｃ^＋ｍｙＤＣの、ＣＤ５^－及びＣＤ５^＋サブセットへの更なるサブセット化を可能にする（図２Ｄ；図３Ａ）。同様に、ＣＤ３４を、６つの標識付けと組み合わされた７種のマーカーのバックボーン組み合わせ（表１、チューブＢＢ２Ｂ）に加えることも、造血前駆細胞（ＨＬＡ－ＤＲ^＋／＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－／＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－／＋、ＣＤ３４^{ｌｏｗ／＋}、ＳＳＣ^ｌｏｗ）並びにＣＤ１００^＋ＤＣ前駆細胞（ｐｒｅＤＣ、ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＣＤ３４^ｌｏｗ、ＳＳＣ^ｌｏｗとして定義される）の明確な同定を提供する（図２Ｄ；図３Ａ）。ＣＤ５及びＣＤ３４に対して向けられた抗体を、ＣＤ４５の非存在下で上記のバックボーンに同時に加えることは、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５－をｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５^＋並びにＣＤ１００^＋ＤＣ前駆細胞及びＣＤ３４^＋造血前駆細胞から判別することを可能にし、それ故に、全体で１３個の細胞サブセットの同定を可能にする（図２Ｄ；図３Ａ）。ＣＤ４５に対して向けられた抗体を加えることは、好塩基球（ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－／＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＣＤ３４^－、ＣＤ５^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＳＳＣ^ｌｏｗ）（１４個の自然細胞サブセット）の同定を更に可能にする。

単球を更にサブセット化する為に、マーカーのＣＤ３６プラスＳＬＡＮ対及び／又はＣＤ６２ＬプラスＦｃＥＲＩ対は、ｃＭｏ及びｎｃＭｏのサブセットの更なる同定の為に、上記の組み合わせのいずれかに加えられることができ、ここで、該対は、ｎｃＭｏ ＣＤ３６^＋／ＳＬＡＮ^－、ｎｃＭｏ ＣＤ３６^＋／ＳＬＡＮ^＋、ｎｃＭｏ ＣＤ３６^－／ＳＬＡＮ^－、ｎｃＭｏ ＣＤ３６^－／ＳＬＡＮ^＋（図２Ｅ；図３Ａ）、並びにｃＭｏ ＣＤ６２Ｌ^＋／ＦｃＥＲＩ^－、ｃＭｏ ＣＤ６２Ｌ^＋／ＦｃＥＲＩ^＋、ｃＭｏ ＣＤ６２Ｌ^－／ＦｃＥＲＩ^－、ｃＭｏ ＣＤ６２Ｌ^－／ＦｃＥＲＩ^＋（図２Ｆ；図３Ａ）を含む。これらの後者の４種のマーカーが共に加えられると、ＳＬＡＮ及びＦｃＥＲＩに対して向けられた抗体はいずれも、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができるが、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ３６に対して向けられた抗体は、各々が異なる標識付けによってコンジュゲーションされる（表１を参照）。注目すべきは、ＦｃＥＲＩ及びＣＤ６２Ｌ抗体を上記で言及されたバックボーン抗体に加えることがまた、好塩基球（ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－／＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈ、ＦｃＥＲＩ ^＋、ＳＳＣ^ｌｏｗ）の更なる同定を可能にする（表１、チューブＢＢ３Ｂ；図３Ａ）。

別の実施態様において、抗ＣＤ４５抗体のみが上記の７種のマーカーのバックボーンの組み合わせに加えられ、これは全体で１２個の自然細胞集団に関して、血液中の好塩基球（ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－／＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＳＳＣ^ｌｏｗ；表１、チューブＢＢ２Ｃ）及び造血前駆細胞（ＨＬＡ－ＤＲ^＋／＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ１４１^－／＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＳＳＣ^ｌｏｗ）の同定を更に可能にする（図２Ｇ；図３Ａ）。

ＣＤ３６プラスＣＤ１９２及び／又はＣＤ６２ＬプラスＣＤ４５抗体を、６又は７つの標識付けと組み合わされた、７種マーカーのバックボーン又はマーカーの上記の組み合わせのいずれかに加えることは、単球性（Ｍ）－ＭＤＳＣ（図２Ｆ；図３Ａ）、及び／又は未成熟好中球の２つの集団［多形核（ＰＭＮ）－ＭＤＳＣと表現型が適合性である］の同定をそれぞれ、可能にする（図２Ｇ；図３Ａ）：
Ｍ－ＭＤＳＣ：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３６^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１９２（ＣＣＲ２）^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＳＳＣ^ｉｎｔ
未成熟好中球ＣＤ６２Ｌ^－：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＣＤ６２Ｌ^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１９２（ＣＣＲ２）^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^＋、ＳＳＣ^ｈｉ
未成熟好中球ＣＤ６２Ｌ^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^ｌｏｗ、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１９２（ＣＣＲ２）－、ＣＤ３００ｅ^－、ＳＳＣ^ｈｉ

ここで、提唱される１５抗体の組み合わせ（表１Ａ）は、血液１ｍＬ中に少なくとも２３個の別個の自然細胞サブセットの同時同定を可能にし、ここで、該サブセットはｐＤＣ、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^ｌｏｗ、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５－、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋／ＣＤ１４^－／ＣＤ５^＋、ｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋、Ａｘｌ^＋ＤＣ、ｐｒｅ－ＤＣ（ＣＤ１００^＋）、古典的単球（ｃＭｏ）の４つのサブセット［ＣＤ６２Ｌ^＋／ＦｃＥＲＩ ^－、ＣＤ６２Ｌ^＋／ＦｃＥＲＩ ^＋、ＣＤ６２Ｌ^－／ＦｃＥＲＩ ^－及びＣＤ６２Ｌ^－／ＦｃＥＲＩ ^＋］、中間単球（ｉＭｏ）、非古典的単球（ｎｃＭｏ）の４つの集団［ＣＤ３６^＋／Ｓｌａｎ－、ＣＤ３６^－／Ｓｌａｎ－、ＣＤ３６^＋／Ｓｌａｎ^＋、ＣＤ３６^－／Ｓｌａｎ^＋］、並びに好塩基球、好中球の３つの集団（成熟好中球、未成熟好中球ＣＤ６２Ｌ^－及びＣＤ６２Ｌ^＋）、好酸球、単球、骨髄由来サプレッサー細胞（Ｍ－ＭＤＳＣ）、及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）（図１及び２；図３Ａ）を含む。ＣＤ１ｃ、Ａｘｌ及び／又はＣＤ１００抗体を１６番目、１７番目及び／又は１８番目の抗体として加えることは、上記自然細胞サブセットの定義を更に確認する（表１Ａ）。３種全てのマーカーに対して向けられた抗体が加えられる場合、ＣＤ１４及びＣＤ３４抗体は、これらの２種のマーカーがＤＣ単球経路において同じ細胞上で同時発現されないことから、同じ標識にコンジュゲーションされることができる（表１Ａ）。

Ａ．２ 骨髄（ＢＭ）解析の為のＤＣ－単球チューブ
別の実施態様において、６又は７つの標識付けと組み合わされた７種のマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＨＬＡ－ＤＲ）の上記ＤＣ－単球バックボーンの組み合わせは、４種のマーカー、すなわちＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ１１７、を補充されることができ（表１Ｂ）、これは骨髄の試験、特に単球性前駆細胞及び成熟細胞（単芽球ＣＤ３４^＋／ＣＤ１１７^＋、単芽球ＣＤ３４^－／ＣＤ１１７^＋、前単球ＣＤ１４^－、前単球ＣＤ１４^＋、ｃＭｏ、ｉＭｏ及びｎｃＭｏ）、ｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋、ｐＤＣ、成熟好塩基球及び肥満細胞、の同定及び基本的サブセット化を可能にする（図３Ｂ）：
単芽球ＣＤ３４^＋／ＣＤ１１７^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
単芽球ＣＤ３４^－／ＣＤ１１７^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
前単球ＣＤ１４^{－／ｌｏｗ}：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
前単球ＣＤ１４^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
ｃＭｏ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^＋、ＣＤ３０３^－
ｉＭｏ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３３^＋，ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^＋、ＣＤ３０３^－
ｎｃＭｏ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^＋、ＣＤ３０３^－
ｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１４１^＋＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
ｐＤＣ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^＋
成熟好塩基球：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
肥満細胞：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－／＋、ＣＤ１１７^＋＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－

ＣＤ３６を、１０又は１１個の標識付けと組み合わされた１１種のマーカーの組み合わせに加えることは、ｐＤＣ前駆細胞（ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－／＋、ＣＤ３６^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－／＋、ＣＤ１４１^－／＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－／＋）、ｍｙＤＣ前駆細胞（ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－／＋、ＣＤ３６^ｌｏｗ、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－／＋、ＣＤ１１７^－／＋、ＣＤ１４１^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－）、有核赤血球前駆細胞（nucleated erythroid precursors）（ＨＬＡ－ＤＲ^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^－、ＣＤ３４^－／＋、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^＋、ＣＤ４５^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－／＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－）の評価、並びに前単球の、前単球ＣＤ１４^{－／ｌｏｗ}ＣＤ３６^－及び前単球ＣＤ１４^{－／ｌｏｗ}ＣＤ３６^＋への更なるサブセット化（表１Ｂ；図３Ｂ）を更に可能にする。

上記の組み合わせ（１１又は１２個の標識付けと組み合わされた１２種のマーカー）を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３及びＣＤ３５を含めることによって拡大することは（表１Ｂ、図３Ｂ）、前単球の更に詳細なサブセット化、並びに間葉幹細胞、好酸球、及び好中球－顆粒球系列の異なる成熟段階の同定を可能にする：
前単球（Promonocytes）ＣＤ１４^－／ＣＤ１１ｂ^－／ＣＤ３６^－／ＣＤ３５^－：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
前単球（Promonocytes）ＣＤ１４^－／ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ３６^＋／ＣＤ３５^－：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
前単球（Promonocytes）ＣＤ１４^ｌｏｗ／ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ３６^＋／ＣＤ３５^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１３^＋、ＣＤ１４^ｌｏｗ、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^＋、ＣＤ３６^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
間葉幹細胞（Mesenchymal stem cells）：ＨＬＡ－ＤＲ^－／＋、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^＋＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^－、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^－、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
好酸球（Eosinophils）：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１３^－／＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^ｌｏｗ、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－／＋、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋＋、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
単芽球（Myeloblast）：ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^＋、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
前単球（Promyelocyte）：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^{＋／ｌｏｗ}、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
単球（Myelocyte）：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ１３^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^－、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
後骨髄球（Metamyelocyte）：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１３^－、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^ｌｏｗ、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－
桿状核／分葉核好中球（Band/segmented neutrophils）：ＨＬＡ－ＤＲ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１３^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^＋＋、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ３５^＋、ＣＤ３６^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^ｌｏｗ、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－

別の実施態様において、前単球ＣＤ１４^＋の、前単球ＣＤ１４^＋ＣＤ１６３^－及び前単球ＣＤ１４^＋ＣＤ１６３^－への更なる分割を可能にする為に、ＣＤ１６３のみが１１種のマーカーの組み合わせに加えられる。

ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ１１７（１０又は１１個の標識付けと組み合わされた１１種のマーカー）を補充されたバックボーンの組み合わせ（６又は７つの標識付けと組み合わされた７種のマーカー）は、ＦｃＥＲＩ及びＣＤ１６３を含めることによって更に延長されることができる。この組み合わせは、上記で記載されている前単球ＣＤ１４^＋のサブセット化、並びに成熟ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋及び好塩基球前駆細胞の同定及びサブセット化を可能にする（図３Ｂ）：
前単球ＣＤ１４^＋／ＣＤ１６３^－：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^－
前単球ＣＤ１４^＋／ＣＤ１６３^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^＋、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^－
ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^ｌｏｗ：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^ｌｏｗ、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^{ｌｏｗ／＋}、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^＋
ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^－ＣＤ１６３^＋：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^{ｌｏｗ／＋}、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^＋、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^＋
ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^－ＣＤ１６３^－：ＨＬＡ－ＤＲ^＋＋、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋＋、ＣＤ３４^－、ＣＤ４５^＋、ＣＤ６４^{ｌｏｗ／＋}、ＣＤ１１７^－、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^＋
好塩基球前駆細胞：ＨＬＡ－ＤＲ^{－／ｌｏｗ}、ＣＤ１４^－、ＣＤ１６^－、ＣＤ３３^＋、ＣＤ３４^＋、ＣＤ４５^ｌｏｗ、ＣＤ６４^－、ＣＤ１１７^＋、ＣＤ１４１^－、ＣＤ１６３^－、ＣＤ３００ｅ^－、ＣＤ３０３^－、ＦｃＥＲＩ ^ｌｏｗ

全体として、骨髄系前駆細胞及び成熟パターンを評価することを狙いとする試験に関して、７種のマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１４１、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＨＬＡ－ＤＲ）で構成されるＤＣ－単球バックボーンは、１０種の更なるマーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１６３及びＦｃＥＲＩ）を補充されることができ、組み合わせにおいてＣＤ１４及びＣＤ３４は、該マーカーＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３と同様に、同じ標識によって評価されることができる（表１Ｂ）。１５～１７個の別個の検出可能な標識にコンジュゲーションされたこの１７個の抗体のパネルは、骨髄に存在する２８個の細胞集団の同定を可能にし（図３Ｂ）、ここで、該細胞集団は、成熟及び未成熟ｐＤＣ、ｍｙＤＣ前駆細胞及び成熟ｍｙＤＣ ＣＤ１４１^＋及びｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋（ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^ｌｏｗ、ｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^－ＣＤ１６３^＋及びｍｙＤＣ ＣＤ１ｃ^＋ＣＤ１４^－ＣＤ１６３^－サブセットを含む）、成熟単球（ｃＭｏ、ｉＭｏ及びｎｃＭｏ）、並びにその前駆細胞（単芽球ＣＤ３４^＋／ＣＤ１１７^＋及びＣＤ３４^－／ＣＤ１１７^＋、前単球ＣＤ１４^－／ＣＤ１１ｂ^－／ＣＤ３６^－／ＣＤ３５^－、ＣＤ１４^－／ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ３６^＋／ＣＤ３５^－、ＣＤ１４^ｌｏｗ／ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ３６^＋／ＣＤ３５^＋、－ＣＤ１４^＋／ＣＤ１６３^－及びＣＤ１４^＋／ＣＤ１６３^＋）を含む。更に、成熟及び未成熟好中球（骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、及び桿状核／分葉核好中球）、成熟好塩基球及びその前駆細胞、好酸球、肥満細胞、有核赤血球前駆細胞及び間葉幹細胞の５つの集団がまた、上記で言及された組み合わせを使用して同定されることができる。

Ａ．３ 単球性及び樹状細胞急性白血病の診断、（細）分類及びモニタリング
血液及びＢＭ試験の為の上記ＤＣ－単球チューブの組成物は、成熟（例えば、末梢血）及び未成熟骨髄系細胞集団（例えば、骨髄）の同定、並びにこれらの細胞、特には単球及び樹状細胞系列、の成熟経路の評価を可能にする。

これらの独自の抗体の組み合わせによって提供される情報は、例えば、感染症、ワクチン接種又は免疫療法に対する応答、の免疫モニタリングの為に使用されることができるのみならず、それらが、対応する正常な造血経路並びにこれらの正常な経路からの白血病による逸脱を精査することから、単球及びＤＣ起源の急性白血病の診断及び（細）分類の為に、特に好適でもある。その上、これらのチューブは又、処置の有効性を評価する為に、処置の間及び処置後に小さい単球性及びＤＣ白血病性細胞集団のモニタリングも可能にする。

Ｂ．１ ＣＤ４ Ｔ細胞チューブ
以前の試験は、これらの細胞の一部のサブセットを含む、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞を認識する為のマーカーの組み合わせを提唱している。これと平行して、他の研究者等は、細胞内染色を行わずにＴｒｅｇを同定する方法、並びに細胞内サイトカイン発現及び表面膜マーカーの両方に基づいて、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｈ１／１７、ヘルパーＴ細胞サブセットを定義する可能性を教示している（Streitz et al.，2013；Mahnke et al.，2013a；Wingender et al.，2015；Finak et al.，2016）。しかしながら、特には特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセット、例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞、の最適な同定にとって極めて重要である膜マーカーに関して得られた抗原発現プロファイルに影響を及ぼしうる細胞内染色手順を行うことなく、単一の抗体パネルチューブにおいて、その成熟段階に関連して、Ｔｒｅｇ、Ｔｆｈ及び他のＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞内の上記ヘルパーＴ細胞サブセットを同時に同定することを当業者はできていない。それ故に、本発明に従って、ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセット化の為の細胞内マーカーを染色する必要はない。

血中Ｔｆｈ細胞は、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）及びＣＤ４の同時発現によって定義されている。加えて、これらの細胞の更なる特徴付けは、特には血液とは異なる組織中のＴｆｈ細胞の場合、ＣＤ１０、ＣＤ８４、ＣＤ２７２、ＣＤ２７８及び／又はＣＤ２７９の組み合わせに基づいている（Tangye et al.，2013）。

文献における血中Ｔｒｅｇの初期の定義は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ４及び細胞内ＦｏｘＰ３の同時発現に基づいていた。その後の研究は、ＣＤ１２７の低レベルの非存在又は存在下でのＣＤ２５^ｈｉｇｈの同時発現が、ＣＤ４陽性の血中Ｔｒｅｇに関する代用表現型であると定義した（Miyara et al.，2009）。ＣＤ１５ｓ及びＣＤ３９に基づくＴｒｅｇの更なるサブセット化は、以前に提唱されている。

これと平行して、代用細胞表面表現型がまた、下記の同定の為に提唱されている：
１．インターフェロンガンマ産生Ｔｈ１細胞；
２．ＩＬ４及びＩＬ５産生Ｔｈ２細胞；
３．ＩＬ１７産生Ｔｈ１７細胞；
４．ＩＬ２２産生Ｔｈ２２細胞；
５．インターフェロンガンマプラスＩＬ１７産生Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞

これらの細胞の代用表現型は、４種のマーカー：ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）及びＣＣＲ１０の組み合わせに基づいている：
１．Ｔｈ１に関してＣＤ１８３^＋ＣＤ１９４^－ＣＤ１９６^－ＣＣＲ１０^－；
２．Ｔｈ２に関してＣＤ１８３^－ＣＤ１９４^＋ＣＤ１９６^－ＣＣＲ１０^－；
３．Ｔｈ１７に関してＣＤ１８３^－ＣＤ１９４^＋ＣＤ１９６^＋ＣＣＲ１０^－；
４．Ｔｈ１／Ｔｈ１７に関してＣＤ１８３^＋ＣＤ１９４^－ＣＤ１９６^＋ＣＣＲ１０^－；
５．Ｔｈ２２に関してＣＤ１８３^－ＣＤ１９４^＋ＣＤ１９６^＋ＣＣＲ１０^＋

Wingender et al．(2015)のみが、上記細胞集団において従来型のＣＤ４陽性Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｈ１／Ｔｈ１７ Ｔ細胞と、ＣＤ４陽性Ｔｈ１様、Ｔｈ２様、Ｔｈ１７様、Ｔｈ２２様、Ｔｈ１／Ｔｈ１７様Ｔｒｅｇ及びＴｆｈ Ｔ細胞とを識別する方法を教示している。しかしながら、彼は、これらの機能的ＣＤ４ Ｔ細胞集団を成熟段階、特にはトランジショナルメモリー細胞及びエフェクターメモリー細胞、へと正確に分類することができなかった。

本発明者等は、マーカーＣＤ２７及びＣＤ６２ＬをＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯと組み合わせて含めることによって、この問題の克服に成功し、これは以前に提唱されたＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１９７のマーカーの組み合わせより適切であるように思われた（Mahnke et al.，2013a；Wingender et al.，2015）。

従って、本発明は、一つの実施態様において、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーの組み合わせ：ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ１０、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）及びＣＤ４に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。この試薬組成物は、Ｔｒｅｇ、Ｔｆｈ及び他のＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の以前に定義された全てのサブセットの同定を可能にする。加えて、これらの集団の新規サブセットは、提唱される該抗体の組み合わせによって同定されている。

^＊ 該提唱されるチューブは、胸腺移出Ｔ細胞（Recent thymic emigrant）（ＲＴＥ）の検出の為のＣＤ３１、及び／又はＣＤ９５^ｈｉ幹細胞メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の検出の為のＣＤ９５によって更に拡大されることができる。
^＊＊ 該提唱されるチューブは、活性化マーカーＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ１）及び／又はＨＬＡ－ＤＲによって更に拡大されることができ、該マーカーは活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞区画のより良好な定義に寄与することができる。
^＊＊＊ 該提唱されるチューブは、ＴｃＲ－Ｖβ及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインに対して向けられた抗体（表６）プラス抗ＴｃＲγδ抗体；又はＴｃＲ－Ｖδ及び／又はＴｃＲ－Ｖγドメインに対して向けられた抗体プラス抗ＴｃＲαβ抗体によって更に拡大されることができる。
^＊＊＊＊ 該提唱されるチューブ１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ及び２Ｃ、は、細胞傷害性関連マーカー（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ５７及び／又はグランザイムＢ）と共に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞以外（すなわち、ＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＴＣＲγδ）の細胞傷害性細胞集団に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる。
＃６ ^{＊＊＊＊＊} 該提唱されるチューブは、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞区画、特にはＴｃＲ－Ｖβ及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインに対して向けられた抗体によって認識されないＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞における、多様性を検出する為に、相互に排他的なＴｃＲ－Ｃβ１及びＴｃＲ－Ｃβ２エピトープ、例えばＪＯＶＩ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって認識されるエピトープ、に対する該抗体によって更に拡大されることができる（表６）。

本明細書において、ＣＤ８及び／又はＣＤ４５に対するコンジュゲーションされた抗体が加えられうる、１２種の細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６、ＣＣＲ１０、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ）に対するコンジュゲーションされた抗体の独自の組み合わせが提供される（表２）。この試薬は、通常の血液２００μＬ中に、前例がないほど多数のＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも８９個の十分に定義されたサブセットを同定し（表３）、該サブセットは全て、従来型のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｈ１／Ｔｈ１７ Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔｈ１－様、Ｔｈ２－様、Ｔｈ１７－様、Ｔｈ２２－様、Ｔｈ１／Ｔｈ１７－様 Ｔｒｅｇ及びＴｆｈ Ｔ細胞の以前に定義された機能的サブセットを含み、該サブセットは、ナイーブ（naive）、セントラルメモリー（central memory）、トランジショナルメモリー（transitional memory）、エフェクターメモリー（effector memory）及びターミナルエフェクター（terminal effector）ＣＤ４ Ｔ細胞、の５つの成熟段階に再分類されている。

図４は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの認識戦略を例証する。８９個のＣＤ４陽性Ｔ細胞サブセット並びにその機能的相関物の各々を定義する為の特定の免疫表現型決定基準、及び血中ＣＤ４陽性Ｔ細胞区画内のその相対頻度が、表３に要約されている。加えて、図５における「集団ツリー」は、これらのＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットがどのように連鎖されているかを示している。注目すべきは、上記の１２種のマーカーの組み合わせは、血液１００～２００μＬ中に少なくとも８９個のサブセットを再現よく同定する。分析される血液量が更に増加されると、より多数の１６１個のＣＤ４陽性Ｔ細胞サブセットが同定される（頻度０．１個／μＬ未満）（表４）。

上記の１２種のマーカーの組み合わせ（ＣＤ４５及び／又はＣＤ８の存在下又は非存在下）は、胸腺移出細胞（ＲＴＥ）をより正確に検出する為にＣＤ３１（Kohler et al.，2009）、及び／又はＣＤ９５^ｈｉｇｈ幹細胞メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞をより正確に検出する為にＣＤ９５（Gattinoni et al.，2011）、によって更に拡大されることができる。従って、該試薬組成物は、ＣＤ３１及び／又はＣＤ９５に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含みうる。

更に、上記のマーカーの組み合わせは、ＣＤ６９、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ１）及び／又はＨＬＡ－ＤＲ活性化マーカー（Mahnke et al.，2013b；McAdam et al.，2001）によって更に拡大されることができ、該マーカーは感染性疾患、ワクチン接種試験及び活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞区画を有する他の状況における活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞区画の、より良好な定義に寄与することができる。

細胞傷害性集団及びそれらの異なる成熟関連細胞サブセットを同時に試験する場合、更なる細胞傷害性サブセットを同定することを狙いとする抗体のパネルは好ましくは、細胞傷害性関連マーカー（すなわち、ＣＤ２８、ＣＤ５７及び／又はグランザイムＢに対して向けられた抗体）と共に、ＴＣＲγδを同定する抗体（抗ＴＣＲγδ）及びＮＫ細胞を同定する抗体（すなわち、ＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＣＤ３３５抗体）で構成されている。

ＣＤ４及び細胞傷害性Ｔ細胞に関する上記の抗体パネルは、抗原特異的染色を可能にする試薬を補充されることができる。例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞試薬組成物は、１以上の抗原特異的ペプチド又はペプチドプールを含み、該ペプチドは、微生物、アレルゲン、自己抗原、ワクチン、又は免疫療法成分に由来しうる。該抗原特異的Ｔ細胞を染色する為の、そのようなペプチド又はペプチドプールは好ましくは、ＭＨＣ分子を介して、例えば四量体システム若しくは当技術分野で既知である他のシステムを介して、提示されているか、又はそれらは、１以上のレポーター化合物を有する標識に結合されうる。本発明に従う試薬組成物は、抗原特異的Ｔ細胞の検出及び計数の為に、ＭＨＣ分子において１以上の抗原特異的ペプチドを含みうるが、該ＭＨＣ分子は、検出可能な標識に直接又は間接的にコンジュゲーションされうる多量体構築物に含まれる。一つの実施態様において、該組成物は、Ｋｌｉｃｋｍｅｒ又はＤｅｘｔｒａｍｅｒシステム（Ｉｍｍｕｄｅｘ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を介して該適切なＭＨＣ分子において提示されている、少なくとも１つのペプチドを含む。

一つの実施態様において、表２に示されているマーカーセットに対して向けられた抗体を含む試薬組成物のいずれも、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞区画、特にはＴｃＲ－Ｖβ及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインに対する該抗体によって認識されないＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞における多様性を検出する為に、相互に排他的なＴｃＲ－Ｃβ１及びＴｃＲ－Ｃβ２エピトープ、例えばＪＯＶＩ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、によって認識されるエピトープ、に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる（表６を参照）。従って、同様に本明細書において、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞における、多様性対クローン性を検出する為の試薬組成物であって、ＣＤ８及び／又はＣＤ４５に対するコンジュゲーションされた抗体が加えられうる、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６、ＣＣＲ１０、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯに対するコンジュゲーションされた抗体を含み、相互に排他的なＴｃＲ－Ｃβ１及び／又はＴｃＲ－Ｃβ２エピトープに対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、上記試薬組成物が提供される。

特定の実施態様において、好ましくは、ＣＤ８及びＣＤ４５を補充された該ＣＤ４ Ｔ細胞チューブ（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６、ＣＣＲ１０、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ；表２、チューブ１Ｃ又は２Ｃを参照）の結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット（表２における太字）として、該７種のマーカー、すなわちＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、を使用して、ＥｕｒｏＦｌｏｗガイドライン（Kalina et al．2012）（www.EuroFlow.org）に従って、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。この細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞チューブは、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ３３５、ＴｃＲγδ及び／又はグランザイムＢを更に含む（表２のチューブ１Ｄ又は２Ｄを参照）。

従って、本発明は又、（ｉ）本明細書において上記で言及されているＣＤ４ Ｔ細胞試薬組成物のいずれか；及び（ｉｉ）任意的にマーカーＣＤ３３５及び／又はグランザイムＢに対するコンジュゲーションされた抗体を補充された、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＴＣＲγδに対するコンジュゲーションされた抗体を含む試薬組成物、を含む試薬組成物のセットも提供する。例示的な試薬セットは、表２に示されているように、チューブ１Ｃ及び１Ｄ、又はチューブ２Ｃ及び２Ｄを含む。

^＊ 該提唱されるチューブは、ＴｃＲ－Ｖβ及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインに対して向けられた抗体（表６）プラス抗ＴｃＲγδ抗体、又はＴｃＲ－Ｖδ及び／又はＴｃＲ－Ｖγドメインに対して向けられた抗体プラス抗ＴｃＲαβ抗体によって更に拡大されることができる。

^＊＊ 該提唱されるチューブは、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞悪性疾患のクローン性を評価する為に、相互に排他的なＴｃＲ－Ｃβ１及びＴｃＲ－Ｃβ２エピトープ、例えばＪＯＶＩ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって認識されるエピトープ、に対して向けられた抗体によって更に拡大されることができる。

Ｂ．２ 成熟Ｔ細胞悪性疾患の診断及び分類の為の基礎としてのＣＤ４ Ｔ細胞チューブ
別の実施態様において、上記の１２種のマーカーの組み合わせ（ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ４５ＲＡの両方の存在下、並びにＣＤ４５及び／又はＣＤ８の存在下若しくは非存在下）は、ＣＤ４陽性成熟Ｔ細胞悪性疾患の診断及び分類の為に、任意的にＨＬＡ－ＤＲ及び／又はｃｙＴＣＬ１と組み合わされた、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ２７９の古典的なＥｕｒｏＦｌｏｗ抗体の組み合わせを補充されることができる（Van Dongen et al. 2012）（表５）。それ故に、本発明は又、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ１０、ＣＤ１８３、ＣＤ１９６、ＣＤ１９４、ＣＤ１８５、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ２７９、ＣＤ７、ＣＤ２６及びＣＤ２８、に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にＣＤ８、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、及び／又はｃｙＴＣＬ１に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、試薬組成物も提供する。

この抗体パネルは、従来型のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｈ１／Ｔｈ１７ Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔｈ１－様、Ｔｈ２－様、Ｔｈ１７－様、Ｔｈ２２－様、Ｔｈ１／Ｔｈ１７－様 Ｔｒｅｇ及びＴｆｈ Ｔ細胞の、そのＴ細胞機能的サブセットに従う、ＣＤ４陽性Ｔ細胞悪性疾患の異なるタイプの細分類を、ナイーブ、セントラルメモリー、トランジショナルメモリー、エフェクターメモリー及びターミナルエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の５つの成熟段階への更なる細分類と共に可能にする。

このＣＤ４^＋Ｔ細胞悪性疾患チューブの結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット（表５における太字）として、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞マーカーＣＤ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＴｃＲγδ、並びに任意的にグランザイムＢ及び／又はパーフォリン、（表５）を補充された、マーカーＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４５及び／又はＣＤ４、を使用して、ＥｕｒｏＦｌｏｗガイドライン（Kalina et al.，2012）に従って、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞悪性疾患の診断及び分類に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。従って、（ｉ）ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ１０、ＣＤ１８３、ＣＤ１９６、ＣＤ１９４、ＣＤ１８５、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ２７９、ＣＤ７、ＣＤ２６及びＣＤ２８に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にＣＤ８、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ及び／又はｃｙＴＣＬ１に対するコンジュゲーションされた抗体を更に含む、試薬組成物；並びに（ｉｉ）マーカーＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９４、ＣＤ５、ＴｃＲγδに対するコンジュゲーションされた抗体を含み、任意的にグランザイムＢ及び／又はパーフォリンに対するコンジュゲーションされた抗体を補充された、試薬組成物（表５を参照）、を含む、試薬組成物のセットも提供される。好ましくは、試薬のセットにおいて、両方の試薬組成物に存在する該抗体は、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされている。

Ｂ．３ ＴｃＲαβ細胞集団及びＴｃＲγδ細胞集団におけるＴｃＲレパートリー試験
ＴｃＲαβ細胞におけるＴｃＲ分子の多様性レパートリーを試験する為に、上記のマーカーの組み合わせ（節Ｂ．１を参照）は、ＴｃＲ－Ｖβドメインの様々なファミリー及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインの幾つかのファミリーに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス非ＴｃＲαβ細胞を認識する為の抗ＴｃＲγδ抗体、によって更に拡大されることができる。

同様に、ＴｃＲγδ細胞におけるＴｃＲ分子の多様性を試験する為に、上記のマーカーの組み合わせは、ＴｃＲ－Ｖδ及び／又はＴｃＲ－Ｖγドメインに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス非ＴｃＲγδ細胞を認識する抗ＴｃＲαβ抗体によって更に拡大されることができる。ＴｃＲ－Ｖβドメインの様々なファミリー及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインの幾つかのファミリー、該ＴｃＲγδ、該ＴｃＲ－Ｖδ及び／又はＴｃＲ－Ｖγドメインに対するコンジュゲーションされた抗体、プラス抗ＴｃＲαβ抗体を含む抗体カクテルを使用することがまた、想像される。

ＴｃＲ－Ｖβ及びＴｃＲαドメインに対して最も必要とされる抗体は、市販されており、例えばＶβファミリードメインに対する２４個の抗体を有するＩＯＴｅｓｔ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、である（表６をまた参照されたい）。ごく少数の抗Ｖα抗体が、利用可能であり、例えば抗ＴｃＲ－Ｖα２（Ｂ２０．１）、ＴｃＲ－Ｖα３．２（ＲＲ３－１６）、ＴｃＲ－Ｖα７．２（３Ｃ１０）、ＴｃＲ－Ｖα１１（ＲＲ８－１）、ＴｃＲ－Ｖα１２．１（６Ｄ６．６）及びＴｃＲ－Ｖα２４－Ｊα１８（６ｂ１１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；及びＡｂｃａｍ）である（表６）。

ＴｃＲ－Ｖδ及び／又はＴｃＲ－Ｖγドメインの発現を調べる為に、コンジュゲーションされた抗体のパネルは、Ｖδ１（Ｒ９１２及びｄＴＣＳ１）、Ｖδ２（ＩＭＭＵ３８９及びＢＢ３）、Ｖδ３（Ｐ１１．５Ｂ）、及び非Ｖδ１（ＩＭＭＵ５１５）に対する特異性、並びにＶγ２／３／４（２３Ｄ１２）、Ｖγ４（４Ａ１１）、Ｖγ３／５（５６．３；この抗体は、Ｖγ５ドメイン及び一部のＶγ３ドメインを認識する）、Ｖγ８（Ｒ４．５）、及びＶγ９（ＩＭＭＵ３６０及びＴｉ－ｇＡ）に対する特異性で構成されることができる。Ｍａｂ ４Ａ１１は、Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能であり、ｄＴＣＳ１はＴ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能であり；Ｍａｂ ２３Ｄ１２、Ｒ４．５、ＩＭＭＵ３６０、Ｒ９１２、ＩＭＭＵ３８９、Ｐ１１．５Ｂ、及びＩＭＭＵ５１５は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈから得られた。Ｔｉ－ｇＡ、ＢＢ３、及び５６．３ Ｍａｂはそれぞれ、Ｄｒ．Ｔ Ｈｅｒｃｅｎｄ（Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｄｒ．Ｌ Ｍｏｒｅｔｔａ（Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙ）、及びＤｒ．Ｄ Ｋａｂｅｌｉｔｚ（Ｋｉｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの寄贈であった。

上記の実施態様において、該異なるＴｃＲ－Ｖβ、ＴｃＲ－Ｖα、ＴｃＲ－Ｖγ、及びＴｃＲ－Ｖδファミリードメインに対する各抗体は、濃縮された数の蛍光又は金属同位体検出器において、全てのＴｃｒ－Ｖ特異性の測定を可能にする為に、単一の検出可能な標識（すなわち、蛍光色素又は金属同位体）又は２以上（最大９）の別個の標識（すなわち、互いに個別の放出を有する、蛍光色素又は金属同位体）にコンジュゲーションされ得、例えば３０個の抗体は、表６に例示されているように、全体で、ＴｃＲ－Ｖβ抗体に関して別個の放出を有する少なくとも５個の検出可能な標識及びＴｃＲ－Ｖα抗体に関する３個の標識と組み合わされた。

成熟Ｔ細胞悪性疾患の診断及び分類の為に、上記の抗ＴｃＲ－Ｖ抗体を上記で言及された試薬組成物に加えることは、関係するＴ細胞悪性疾患のクローン性の評価を可能にする（Langerak et al.，1999；Langerak et al.，2001；Lima et al．2001；Almeida et al．2003、Sandberg et al．2006）。そのようなクローン性マーカーは、処置の有効性を評価する為に、処置の間及び処置後にＴ細胞悪性疾患のモニタリングを更に支持することができる。

* Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＡｂｃａｍから入手可能な、Ｖβ及びＶαドメインに対して向けられた抗体

Ｂ．４ Ｔ細胞集団におけるクローン性に関する代用マーカーとしての、ＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２発現パターン
何十年もの間、個々のＢ細胞による、Ｉｇκ及びＩｇλタンパク質の排他的発現は、Ｂ細胞集団におけるクローン性を検出する為の代用マーカーとして使用されており、それによってクローン性のＢ細胞増大を同定し、その後、骨髄腫を含む成熟Ｂ細胞悪性疾患の診断を支持している。Ｂ細胞が、Ｉｇκタンパク質（２番染色体上の機能的に再構成されたＩＧＫ座に由来する）又はＩｇλタンパク質（２２番染色体上の機能的に再構成されたＩＧＬ遺伝子に由来する）のいずれかと会合することができる抗体を産生している場合、Ｔ細胞は、２つの異なる遺伝子のそのような相互に排他的な使用を有しない。

しかしながら、ＴｃＲ－Ｃβドメイン（ＴｃＲβ鎖の定常ドメイン）は、発現されたＴＣＲＢ再構成がＪβ１遺伝子セグメント又はＪβ２遺伝子セグメントを伴うかに応じて、ＴＣＲＢＣ１エクソン又はＴＣＲＢＣ２エクソンに由来することができる。ＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２タンパク質ドメインのこの代替的な（相互に排他的な）使用は、実際に、正常及び悪性Ｔ細胞集団の両方において同定されているが、この代替的なＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２発現が、Ｔ細胞集団レベルで全く安定であり、４０％～６０％に変化するにもかかわらず、クローン性試験の為の潜在的供給源としては決して見なされてこなかった。

興味深いことに、ＴＣＲＢ座における２つのＤ－Ｊ－Ｃ遺伝子セットは進化的複製であり、それ故に高度に相同性であるが、少数の明確な差が、該ＴＣＲＢＣ１エクソン対該ＴＣＲＢＣ２エクソンにおいて同定されている。アミノ酸位置４及び５では、ＴｃＲ－Ｃβ１ドメインのＮ及びＫアミノ酸が、ＴｃＲ－Ｃβ２ドメインにおけるＫ及びＮアミノ酸に置換されており、該ＴｃＲ－Ｃβ１ドメインにおける３７位のＦアミノ酸が、該ＴｃＲ－Ｃβ２ドメインにおけるＹアミノ酸に置換されている。更なるアミノ酸の差は、膜近位配列に存在し、ここでは該ＴｃＲ－Ｃβ２ドメインにおいて、Ｖアミノ酸がＥアミノ酸に置換され、Ｆアミノ酸がＳアミノ酸に置換されている。最初の２つのアミノ酸の差（４～５位及び３７位）は、フォールディングされたＴｃＲβ鎖にしっかりと連結され、それによってそれらは、抗体による示差的認識にとっておそらく好適な独自のエピトープを形成する。これまで、そのような異なるＴｃＲ－Ｃβ１及びＴｃＲ－Ｃβ２エピトープの両方に対する特異的抗体は設計されていない。しかしながら、組み合わせられた、再構成された、ヒトＴＣＲ－Ｖβ３－Ｃβ１鎖に対するＪＯＶＩ－１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の反応性は、ＴｃＲ－Ｃβ１ドメインを発現するＴ細胞に、主に限定されているように思われる。それ故に、本発明は、ＪＯＶＩ－１陽性とＪＯＶＩ－１陰性Ｔ細胞との比が、代替的なＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２ドメイン発現の為の代用マーカーとして有利に使用され、それによってＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞におけるクローン性の検出の為の代用マーカーとして有利に使用される、という洞察を提供する。その結果、そのような代替的なＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２ドメイン発現は、クローン性のＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞増大を同定する為に、及びその後、成熟ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞悪性疾患の診断を支持する為に、使用されることができる。この代替的なＴｃＲ－Ｃβ１対ＴｃＲ－Ｃβ２ドメイン発現は、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞区画、特にはＴｃＲ－Ｖβ及び／又はＴｃＲ－Ｖαドメインに対して向けられた抗体によって認識されないＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞における、多様性（例えば、「正常な」ＴｃＲ－Ｃβ１／ＴｃＲ－Ｃβ２比）を定義する為に適用されることができる。

Ｃ．１ 形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブ
循環している形質芽球は現在、マーカーＣＤ３８単独、又はＣＤ１９及び／若しくはＣＤ２７との組み合わせに基づいて定義されている（Medina et al，2002；Odendahl et al，2005；Clutterbuck et al，Immunology 2006；Mei et al，2009；Caraux et al，2010；Perez-Andres et al，2010；Quian et al，2010；Maecker et al，2012；Roederer et al.，2015；Blanco，2017；Blanco et al，2018；Blanco et al，2019；Liechti et al，2019）。

しかしながら、これらのマーカーの組み合わせは共に、子供において全ての血中形質芽球の同定を可能にしない。血中形質芽球は、ＣＤ２０、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１３８の不均一な発現を有し、これらのマーカーの陰性及び陽性の両方が存在することが示されている。ＣＤ２０とＣＤ１３８との組み合わせは、血中形質芽球の３つの成熟サブセット：ＣＤ２０^＋／ＣＤ１３８^－、ＣＤ２０^－、ＣＤ１３８^－、及びＣＤ２０^－／ＣＤ１３８^＋、を定義している（Perez-Andres et al，2010）。加えて、ＣＤ６２Ｌは又、血中形質芽球の２つの成熟サブセットも明らかにした（Mei et al，2009）。しかしながら、ＣＤ２０、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１３８によって定義されているこれらの形質芽球サブセットの関係を確立する為に、３つのマーカーを当業者は組み合わせたことがない。

該マーカーＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１３８を、任意的にＣＤ１９と組み合わせることによって（表７）、本発明者等は、上記で言及された形質芽球サブセットが、不連続なサブセットではなく、ＣＤ１９^＋ＣＤ２０^＋ＣＤ３８^＋ＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ１３８^－から成熟形質細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ２０^－ＣＤ３８^＋＋ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１３８^＋）への完全な連続する成熟経路を共に形成することを初めて観察した（図６）。これは、全ての異なるアイソタイプに対して同一の分布であると推定される。

従って、一つの実施態様において、本発明は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体を含む、白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該コンジュゲーションされた抗体が、任意的にＣＤ１９と組み合わせられた、下記のマーカーの組み合わせ：ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１３８に対して向けられたものである、上記試薬組成物を提供する。

最近、本発明者等は、Ｂ系列細胞が、Ｉｇカッパ／Ｉｇラムダ（Ｉｇκ及びＩｇλ）軽鎖と組み合わせられた、又は組み合わせられていない、ＩｇＨクラス及びサブクラス（アイソタイプ）の発現に従って細分類されることができることを示している（Blanco，2017；Blanco et al，2018；Blanco et al，2019）。血液中又は他の組織における形質芽球／形質細胞成熟経路全体を通しての、個々のＩｇＨアイソタイプの分布の差を調べる方法を、当業者は教示したことがない（表７；図７における集団ツリーをまた参照されたい）。

ＩｇＨクラス及びサブクラスの評価と組み合わされた該４マーカーに基づく（ＣＤ１９の存在下又は非存在下）形質芽球／形質細胞経路の試薬組成物は、体全体の組織における、進行中のＢ細胞応答を血中モニタリングする為の新規ツールであり、成人及び子供の両方の血液中の、全ての形質芽球／形質細胞の正確で明確な同定を初めて可能にする。図６Ｂ及びＤに例示されているように、これは、個々の微生物叢、進行中の感染症、アレルギー応答、自己免疫、ワクチン及び免疫療法に対するＢ細胞応答の詳細な精査を更に可能にする。

一つの実施態様において、形質芽球／形質細胞及びＢ細胞に関する上記の抗体パネルのいずれも、抗原特異的形質芽球／形質細胞及びＢ細胞、例えば、微生物特異的、アレルゲン特異的、自己抗原特異的、及びワクチン特異的形質芽球／形質細胞及びＢ細胞、並びに免疫療法の状況においては、抗原特異的形質芽球／形質細胞及びＢ細胞の検出を可能にする試薬を補充される。抗原特異的形質芽球／形質細胞及びＢ細胞を染色する為のそのような抗原は、標識と直接コンジュゲーションされることができ、第２の工程の標識された試薬によって間接的に検出されることができ、又は当技術分野で既知である標識された多量体システム、例えばＫｌｉｃｋｍｅｒ及びＤｅｘｔｒａｍｅｒシステム（Ｉｍｍｕｄｅｘ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に連結されることができる。

ＩｇＨ区画あたりの形質芽球／形質細胞成熟経路解析の為のマーカーの組み合わせは、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ１３８、プラスＩｇＭ、ＣＤ１９の存在下又は非存在下の組み合わせからなる。加えて、同じ標識付けを有する、又は２つの異なる標識付け、すなわち１つはＩｇＡの為であり、他方はＩｇＧの為である標識付けを有するＩｇＡプラスＩｇＧが加えられることができる。

別の実施態様において、ＩｇＧ及びＩｇＡに対して向けられた抗体と同じ標識付けを有する、又はＩｇＡ及びＩｇＧの両方の抗体に異なる標識付けを有する、ＩｇＤに対するコンジュゲーションされた抗体が加えられることができる。代替的には、ＩｇＤ、ＩｇＧ及びＩｇＡに対して向けられた抗体は、３つの試薬のうちの１つが２つの標識付けによって同時にコンジュゲーションされ、他の２つの試薬は、それらの２つの標識付けそれぞれのうちの１つのみと組み合わせられる。

上記で引用された、該抗体の組み合わせの別のバージョンにおいて、ＩｇＡ及びＩｇＧ及びＩｇＤ抗体は、いずれも同じ標識又は各々に個別の標識にコンジュゲーションされている、Ｉｇκ及びＩｇλ試薬に置換されている。

別の実施態様において、ＩｇＭの存在下又は非存在下及びＣＤ１９の存在下又は非存在下での該ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２０、ＣＤ１３８バックボーン抗体は、Ｉｇκ及びＩｇλに関する細胞表面染色及び細胞内染色の両方と組み合わせられることができ、好ましくは、異なる標識付けは、細胞表面膜及び細胞内試薬の為に使用され、特には子供における、血中形質芽球／形質細胞の正確な同定を可能にする為に、Ｉｇκ及びＩｇδ試薬に関して同じ標識付け又は異なる標識付けが使用される（表７）。加えて、上記で言及された抗体の組み合わせは、ＢＢ０バックボーンに関して上記のように、異なるＩｇＨアイソタイプ及びＩｇＡ及び／又はＩｇＧサブクラスに対して向けられた抗体を補充されることができる（表７の脚注を参照）。別の実施態様において、１つ又は同時に２つの標識付けによってコンジュゲーションされたＩｇＥ抗体は、上記の抗体の組み合わせの各々に加えられうる（表７）。

これらのマーカーの組み合わせのいずれも、直接又は間接的に標識された微生物抗原、自己抗原、ワクチン抗原、アレルゲン、又は免疫療法関連成分を補充されることができる。

^＊ チューブＢＢ３以降、Ｉｇカッパ及びＩｇラムダ抗体は、個別の標識付け位置で加えられることができる。代替的には、ＢＢ０Ｂ及びＢＢ０Ｃは、ｃｙＩｇＭ並びにＢＢ２及びＢＢ２Ａを除く、バックボーンＢＢ１～ＢＢ５Ａに含有される、更なる試薬と組み合わせられることができる。
^＊＊ 全ての以前のチューブの免疫グロブリン染色は、細胞内のみ、表面膜のみ、又は細胞内と表面膜の両方で行われることができる。後者は、同じ標識付け位置又は個別の標識付け位置上で該マーカーについて行われることができる。

Ｄ：ＤＣ－単球、ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセット、及び／又は形質芽球／形質細胞及びＢ細胞の組み合わせられた検出の為の、抗体の混合物
本発明は又、細胞系列及び成熟区画あたりの主な亜集団を定義する、本発明の２つ又は３つのバックボーン（ＢＢ）マーカーの組み合わせの混合物（すなわち、カクテル）を使用して、進歩した白血球／免疫細胞サブセット化の為の手段及び方法も提供する。

例えば、４０個より多くの異なる（蛍光色素の）色によるフローサイトメトリー、及び４０個より多くの異なる（金属の）色によるマスサイトメトリー、の進歩に基づいて、今では、ＤＣ－単球チューブの上記で言及された１５個のＢＢマーカーの組み合わせと、ＣＤ４ Ｔ細胞チューブの１２個のＢＢマーカー及び／又は形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブの５つのＢＢマーカーとの組み合わせを含む単一の試薬組成物を使用することが可能となった：
ＤＣ－単球ＢＢ（１５種のマーカー）：ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１４１、ＣＤ１９２、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＦｃＥＲＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＳＬＡＮ；
ＣＤ４^＋Ｔ細胞ＢＢ（１２種のマーカー）：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６、及びＣＣＲ１０（ＣＤ４５の存在下又は非存在下）
形質芽球／形質細胞及びＢ細胞ＢＢ（５種のマーカー）：ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３８、及びＩｇＭ又はＩｇｋプラスＩｇλ（ＣＤ１９の存在下又は非存在下）。

これら３つのＢＢマーカーセットは、それらの重複が非常に限定的（ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５のみ）で非常に相補的であることから新規であるのみならず、独自でもあり、２つ（ＤＣ－単球ＢＢ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞ＢＢ、又はＤＣ－単球ＢＢ及び形質芽球／形質細胞及びＢ細胞ＢＢ、又はＣＤ４^＋Ｔ細胞ＢＢ及び形質芽球／形質細胞及びＢ細胞ＢＢ）又は更には３つ（ＤＣ－単球ＢＢ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞ＢＢ及び形質芽球／形質細胞及びＢ細胞ＢＢ）のＢＢマーカーセットは、組み合わせられて、新規の独自の（拡張性の）マーカーの組み合わせを作製することができることを意味している。

該３つのＢＢセットは、非常に情報に富む新規抗体組み合わせを提供し、これは進歩した多系列の白血球／免疫細胞サブセット化を可能にする。そのような３０種のマーカー（２８色）抗体の組み合わせ（ＣＤ１９の存在下又は非存在下）を使用するデータ収集は、現在幾つかのタイプのサイトメーター、例えばＳｙｍｐｈｏｎｙ－Ａ５（≧３５色／蛍光色素；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、Ａｕｒｏｒａ－５Ｌ（≧３５色／蛍光色素；Ｃｙｔｅｋ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、及びＣｙＴＯＦ Ｈｅｌｉｏｓ（≧４０色／金属；Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）について実現可能である。

これらのＢＢ抗体混合物は、個々の白血球／免疫細胞系列の更なる精査の為に、上記で定義された余分のマーカーによって更に拡大されることができる。例えば、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＴＣＲγδに対して向けられた抗体、及びＩｇＨアイソタイプ（ＩｇＨクラス又はサブクラス）を加えることは、単一のチューブにおいて血中白血球の３５０個より多くのサブセットを検出及び定量する可能性をもたらす。

別の実施態様において、該バックボーンマーカーのセット又はバックボーンマーカーの組み合わせのいずれも、悪性疾患及び他のタイプのがんの両方における血液中の循環している腫瘍細胞又は骨髄における最小残留疾患を検出する為の専用マーカー、並びに／又は遺伝子改変免疫細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ若しくはＣＡＲ ＮＫ細胞、例えばＣＡＲ－ＣＤ１９、ＣＡＲ－ＢＣＭＡ、ＣＡＲ－ＣＤ３０、ＣＡＲ－ＣＤ２０、ＣＡＲ－ＥＧＦＲ等、を含む、ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＮＫ細胞をモニターする為の専用マーカー、と組み合わせられる。

Ｄ． 該抗体パネルのＤＣ－単球、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及び形質芽球／形質細胞及びＢ細胞を解析する為の１２色チューブへの濃縮
進歩した≧２５色のフローサイトメーターは、多くの研究及び臨床検査室でますます利用されているが、多くの診断検査室はなおも、ルーチンの診断患者ケアに８～１２色の染色を使用している。それ故に、上記で提示された試薬組成物は、好ましくは、世界中で患者のケアの為に利用可能ともなるべきである。そのような世界全体での施与性を達成する為に、上記の抗体パネルの幾つかは、１２色試薬組成物へと適合されている。そのようにする為に、相互に排他的である、すなわち同じ細胞において決して発現されず、それによって該対応する抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、マーカー（細胞標的）の組み合わせが同定されている。

例えば、ＣＤ３４及びＣＤ１４は、同じ正常なＤＣ－単球細胞集団において決して同時に発現されていない。それ故に、ＣＤ３４及びＣＤ１４に対して向けられた抗体は、同じ蛍光色素にコンジュゲーションされることができ、このことは該ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１４１、ＣＤ１９２、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＦｃＥＲＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＳＬＡＮ抗体の組み合わせが、１２色、１５抗体のＤＣ－単球チューブに「濃縮」されることができることを意味する（表８）。

それ故に、本発明は、ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＳＬＡＮ、ＣＤ６２Ｌ、ＦｃＥＲＩ及びＣＤ１９２（ＣＣＲ２）、に対するコンジュゲーションされた抗体を含む１２色試薬組成物であって、該マーカーセットＳＬＡＮ／ＦｃＥＲＩ、ＣＤ３００ｅ／ＣＤ３０３、及びＣＤ１４／ＣＤ３４内の該抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされ、ここで、異なるマーカーセットの間で、該標識が識別可能である、上記試薬組成物を提供する。

代替的には、明らかに異なる発現レベル及び異なる染色パターンを有するマーカーは、組み合わせられることができ、該対応する抗体は、同じ標識にコンジュゲーションされることができる。例えば、ＣＤ４及びＣＤ４５は発現パターン及び発現レベルが有意に異なり、それ故に、ＣＤ４ Ｔ細胞チューブにおいて、同じ標識位置で組み合わせられることができ、これは該ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９４、ＣＤ１９６、ＣＣＲ１０、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯマーカーが、１２色、１３抗体の組み合わせをもたらすことを意味する（表８）。

それ故に、本発明は、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ１０、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）、ＣＤ４、ＣＤ４５、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯに対するコンジュゲーションされた抗体を含む１２色試薬組成物であって、該ＣＤ４及びＣＤ４５に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされている（１２色ＣＤ４ Ｔ細胞チューブ）、上記試薬組成物を提供する。

この１２色ＣＤ４ Ｔ細胞チューブの結果は、典型的に、バックボーンマーカーセット（表８における太字）として、該６種のマーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ４５、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯを使用して、ＥｕｒｏＦｌｏｗガイドライン（Kalina et al.，2012）（www.EuroFlow.org）に従って、細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞に関する、対応する「姉妹チューブ」の結果と統合及び計算されることができる。この細胞傷害性Ｔ及びＮＫ細胞チューブは、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＴｃＲγδ、及びグランザイムＢ（表８）に対して向けられた抗体を更に含む。従って、（ｉ）該１２色ＣＤ４ Ｔ細胞チューブに関して定義された該試薬組成物；並びに（ｉｉ）該マーカーＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ又はＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＴｃＲγδ、及びグランザイムＢに対するコンジュゲーションされた抗体を含む、１２色試薬組成物、を含む、１２色試薬組成物のセットであって、該ＣＤ４及びＣＤ４５に対して向けられた抗体が同じ標識にコンジュゲーションされている、上記試薬組成物のセットがまた提供される。試薬セットにおいて、各組成物は、ＣＤ４５ＲＯ又はＣＤ４５ＲＡのいずれかに対して向けられた抗体を含有しなければならない。

最後に、本発明は、該バックボーンマーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１３８で構成され、ＣＤ２７、ＣＤ２１、ＣＤ４５、ＩｇＭ及びＩｇＤを補充された、形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブを提供する。この抗体組成物は、Ｉｇκ及びＩｇλに対して向けられた抗体、又はＩｇＧ及びＩｇＡに対して向けられた抗体、を更に補充され得、それは、該成熟Ｂ系列区画の詳細な免疫モニタリングを可能にする１２色試薬組成物をもたらす（表８）。

ＩｇＭ及びＩｇＤを除き、全ての他のＩｇＨアイソタイプは、同じＢ系列の細胞によって同時に発現されず、このことは、同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされた対応する抗体の、幾つかの組み合わせが作製されることができることを意味する。その結果、別の実施態様において、形質芽球／形質細胞及びＢ細胞試薬組成物は、１４個の異なる抗体を含有し、そのうちの１つは、２つの異なる蛍光色素コンジュゲーション（抗ＩｇＤ、抗ＩｇＧ、又は抗ＩｇＡ）の形態で存在するが、Ｉｇκ及び抗Ｉｇλは、同じ蛍光色素に配置され、このことは、１５個の異なる抗体コンジュゲーションがこの１２色チューブに存在することを意味する。なお別の実施態様において、１２色の形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブは、１６個の異なる抗体で構成され、そのうちの３つは２つの異なる蛍光色素コンジュゲーション（例えば、抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２、及び抗ＩｇＡ１）に存在するが、別の抗ＩｇＨ抗体（例えば、抗ＩｇＤ）は、３つの異なるコンジュゲーションの形態で存在し、このことは、２１個の異なる抗体コンジュゲーションがこの１２色チューブに存在することを意味している（表８）。

［実施例］
上記の本明細書に記載されている試薬組成物の各々は、サンプル調製及びサイトメトリー分析の為の、ルーチンの手順及びプロトコールで適用されることができることは、当業者によって認識されるであろう。

本実施例は単に、例示的な試薬組成物が、生物サンプル中の細胞の別個の集団の解析の為に、どのように使用されることができるかを例証する。

全てのマルチパラメータフローサイトメトリーによる免疫表現型決定試験に関して、新鮮なサンプル、例えば新鮮な血液、骨髄（ＢＭ）、リンパ節、及び脾臓標本が使用された。これらのサンプルは、収集後２４時間以内に染色及び処理された。血液及びＢＭサンプルに関して、直接免疫蛍光染色及びその後の溶解技術が使用される（Kalina et al．2012）、ＣＤ４ Ｔ細胞免疫染色チューブを除き、染色前に非有核赤血球を溶解する為に、ＮＨ_４Ｃｌに基づくＥｕｒｏＦｌｏｗバルク溶解標準操作手順書（ＳＯＰ）が使用された（Flores Montero et al 2017）。リンパ節及び脾臓サンプルは、染色前に単細胞懸濁物へと機械的に解離された。その後、少なくとも５×１０^６個の白血球／サンプルアリコート（又は、該ＣＤ４ Ｔ細胞免疫染色チューブに関しては、少なくとも細胞３×１０^５個／チューブ）が、適切なシリーズの（モノクローナル）抗体試薬によって染色された。

該染色されたサンプルの獲得は、免疫染色後、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０フローサイトメーター（ＢＤ）において、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ）を使用して、直ちに実施された。機器の設定、較正、及びモニタリングに関して、１４色測定に関するＥｕｒｏＦｌｏｗ機器の設定及び補正プロトコールが使用された。データ解析に関して、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔ（商標）ソフトウェア（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ Ｓ．Ｌ）が使用された。各血液サンプルに関して、目的の主要細胞集団及び各特定の細胞サブセットに関して、相対的及び絶対（二重プラットフォーム）細胞数が計算され、記録された。ＢＭ、リンパ節、及び脾臓サンプルにおいて、相対的細胞数のみが誘導された。

図１を参照して、樹状細胞（ＤＣ）－単球免疫染色チューブのうちの１つにおいて、下記の１５個のＭａｂ試薬が使用された：ＣＤ１４１（１Ａ４）－ブリリアントバイオレット（ＢＶ）４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５（ＵＣＨＴ２）－ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９２（ＬＳ１３２．１Ｄ９）－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ－５６）－ＢＶ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＨＬＡ－ＤＲ（Ｇ４６－６）－ＢＶ７１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１６（３Ｇ８）－ＢＶ７８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３６（ＣＬＢ－ＩＶＣ７）－ペリジニンクロロフィルタンパク質－シアニン５．５（ＰｅｒＣＰＣｙ５．５）（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ）、抗ＳＬＡＮ（ＤＤ－１）－フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＦｃＥＲＩ（ＡＥＲ－３７）－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＣＤ３４（５８１）－ＰＥＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３３（Ｐ６７．６）－ＰＥＣｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３００ｅ（ＵＰ－Ｈ２）－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ）、ＣＤ３０３（ＡＣ１４４）－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ４５（ＨＩ３０）－ＡＦ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＣＤ１４（ＭφＰ９）－ＡＰＣＨ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。該抗ＳＬＡＮ及び抗ＦｃＥＲＩ抗体は、単球サブセットにおける該ＳＬＡＮ及びＦｃＥＲＩの発現が相互に排他的であることから、いずれもＰＥにコンジュゲーションされることができる。ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３の発現が相互に排他的であることから、ＡＰＣにコンジュゲーションされたＣＤ３００ｅ（ＩＲＥＭ２）及びＡＰＣにコンジュゲーションされたＣＤ３０３抗体についても同じことが当てはまる。これは、１４個の異なる検出可能な標識を使用して、１６個の異なる抗体の適用を可能にする。図４を参照して、及び別個の例として、該ＣＤ４ Ｔ細胞免疫染色チューブのうちの１つにおいて、下記の１４個のＭａｂ試薬が使用された：ＣＤ２７（Ｍ－Ｔ２７１）－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（ＳＫ１）－ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ－５６）－ＢＶ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１２７（ＨＩＬ７ＲＭ２１）－ＢＶ７１１）ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３（ＳＫ７）－ＢＶ７８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（４Ｅ３）－ＶｉｏＢｒｉｇｈｔフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＣＲ１０（１Ｂ５）－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１８３－ＣＸＣＲ３（１Ｃ６／ＣＸＣＲ３）－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９６－ＣＣＲ６（１１Ａ９）－ＰＥＣＦ５９４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９４－ＣＣＲ４（Ｌ２９１Ｈ４）－ＰＥＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１８５－ＣＸＣＲ５（ＲＥＡ１０３）－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ４５（ＨＩ３０）－ＡＦ７００、及びＣＤ４（ＳＫ３）－ＡＰＣＨ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

^＊ 該形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブは、１４個の異なる抗体を含有することができ、そのうちの１つは、２つの異なる蛍光色素コンジュゲーション（抗ＩｇＤ、抗ＩｇＧ、又は抗ＩｇＡ）の形態で存在するが、Ｉｇκ及び抗Ｉｇλは、同じ蛍光色素に位置され、１５個の異なる抗体コンジュゲートが、この１２色チューブに存在することを意味している。
^＊＊ 該形質芽球／形質細胞及びＢ細胞チューブは、１６個の異なる抗体を含有することができ、そのうちの３つは、２つの異なる蛍光色素コンジュゲート（抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２、及び抗ＩｇＡ１）に存在し、抗ＩｇＤは、３つの異なるコンジュゲートの形態で存在し、２１個の異なる抗体コンジュゲートが、この１２色チューブに存在することを意味している。

引用文献

Claims (21)

1. 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の試薬組成物であって、該試薬組成物は、検出可能な標識にコンジュゲーションされた抗体の混合物を含み、ここで、該コンジュゲーションされた抗体が、下記のマーカーセット：ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３及びＣＤ１４に対して向けられたものであり、ここで、該マーカーＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６及びＣＤ３３に対する抗体は、異なる検出可能なラベルにコンジュゲーションされており、該ＣＤ３００ｅ及びＣＤ３０３に対して向けられた抗体が、同じ標識にコンジュゲーションされうる、前記試薬組成物。
2. ＣＤ５、ＣＤ３４及びＣＤ４５の１以上に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項１に記載の試薬組成物。
3. マーカーセットＣＤ３６及びＳＬＡＮ、及び／又はマーカーセットＣＤ６２Ｌ及びＦｃＥＲＩに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項１又は２に記載の試薬組成物。
4. マーカーセットＣＤ３６及びＣＤ１９２（ＣＣＲ２）、及び／又はマーカーセットＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項１に記載の試薬組成物。
5. ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＳＬＡＮ、ＣＤ６２Ｌ、ＦｃＥＲＩ及びＣＤ１９２（ＣＣＲ２）に対するコンジュゲーションされた抗体を含み、ここで、マーカーセットＳＬＡＮ／ＦｃＥＲＩ及びマーカーセットＣＤ３００ｅ／ＣＤ３０３内の前記抗体が同じ標識にコンジュゲーションされることができ、ここで、異なるマーカーセットの間で、該標識が識別可能である、請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬組成物。
6. ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０３、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＳＬＡＮ、ＣＤ６２Ｌ、ＦｃＥＲＩ及びＣＤ１９２（ＣＣＲ２）に対するコンジュゲーションされた抗体を含む１２色試薬組成物であり、マーカーセットＳＬＡＮ／ＦｃＥＲＩ、ＣＤ３００ｅ／ＣＤ３０３及びＣＤ１４／ＣＤ３４内の該抗体が同じ標識にコンジュゲーションされ、ここで、異なるマーカーセットの間で、該標識識別可能である、請求項５に記載の試薬組成物。
7. ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４及びＣＤ１１７に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、マーカーセットＣＤ３４及びＣＤ１４についての抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項１に記載の試薬組成物。
8. ＣＤ３６に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項７に記載の試薬組成物。
9. ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３及びＣＤ３５に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項１、７又は８に記載の試薬組成物。
10. ＣＤ１６３に対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の試薬組成物。
11. ＣＤ１６３及びＦｃＥＲＩに対するコンジュゲーションされた抗体をさらに含み、ここで、マーカーセットＣＤ３４及びＣＤ１４についての抗体が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項１～７のいずれか１項に記載の試薬組成物。
12. ＣＤ３６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ３５、ＣＤ１６３、ＦｃＥＲＩからなるマーカーの群からの少なくとも２つに対してコンジュゲーションされた抗体で補充されており、ここで、存在すれば、マーカーセットＣＤ３４及びＣＤ１４が同じ検出可能な標識にコンジュゲーションされることができる、請求項７に記載の試薬組成物。
13. 前記抗体が、蛍光色素にコンジュゲーションされている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の試薬組成物。
14. 前記抗体が、金属同位体にコンジュゲーションされている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の試薬組成物。
15. 急性白血病、より特には単球性又はＤＣ起源の白血病、の診断、分類及び／又はモニタリングの為の、請求項１～１４のいずれか１項に記載の試薬組成物の使用方法。
16. 白血球のサイトメトリーによる免疫表現型決定の為の診断キットであって、該診断キットは、請求項１～１４のいずれか１項に記載の試薬組成物又は試薬組成物のキットを含み、任意的に、使用の為の指示書、バッファ、及び／又は対照サンプルを一緒に含んでいてもよい、前記診断キット。
17. 古典的な免疫抑制処置（コルチコステロイド類、シクロスポリン、メトトレキサート等）；細胞処置、例えば遺伝子療法、幹細胞移植、ＣＡＲ Ｔ細胞処置；チェックポイント阻害剤；多くの異なる抗体処置（多くの異なる抗体エフェクター機能を有する）；及び外部作用剤（微生物、昆虫毒素、アレルゲン等）、又は腫瘍抗原に対するワクチン接種からなる群から選択される免疫調節処置の効果をモニタリングする為の方法において、請求項１６に記載の診断キットを使用する方法。
18. 対象の免疫状態及び／又は免疫調節処置の効果のモニタリングする為のサイトメトリー方法であって、
    （ａ）該対象から得られた白血球を含む生物サンプルのアリコートを、請求項１～１４のいずれか１項に従う試薬組成物又は試薬組成物のセットと接触させること；
    （ｂ）フローサイトメーター又はマスサイトメーターにおいて前記アリコート中の白血球を分析すること；及び
    （ｃ）得られたデータを保存し、且つ評価すること
    の工程を含む、前記方法。
19. 前記サンプルが、末梢血、骨髄、臍帯血、組織サンプル、例えばリンパ節、アデノイド、脾臓、若しくは肝臓、又は他のタイプの体液、例えば脳脊髄液、硝子体液、滑膜液、細針吸引液、胸膜滲出液、若しくは腹水、である、請求項１８に記載の方法。
20. 工程（c）は、サンプルの１つのアリコートからの個々の細胞が、それらのマーカー及び散乱プロファイルに従って、同じサンプルの別のアリコートからの対応する個々の細胞と一致する、いわゆる最近傍法の計算に従って、複数のチューブからの選択された細胞集団の免疫表現型情報を組み合わせることを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. フローサイトメトリーファイルのデータ統合及び多次元分析の為のソフトウェアを使用することを含み、好ましくは前記ソフトウェアがＩＮＦＩＮＩＣＹＴ（商標）である、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。