JP7690264B2 - A method for visualizing tight junctions in a three-dimensional skin model - Google Patents
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Description
本発明は、三次元皮膚モデルの表面からタイトジャンクションを観察可能にするタイトジャンクションの可視化方法に関する。また、本発明は、当該タイトジャンクションの可視化方法を利用した、被験物質のタイトジャンクション形成能を評価する方法、及びタイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for visualizing tight junctions that enables observation of tight junctions from the surface of a three-dimensional skin model. The present invention also relates to a method for evaluating the tight junction formation ability of a test substance, and a method for screening a substance that affects the tight junction formation ability, using the tight junction visualization method.
皮膚は生体の最外層に位置する組織であり、常に乾燥や外来から異物侵入等のストレスに曝露されている。これらのストレスから生体を防御するために皮膚はバリア機能を発達させている。細胞間接着構造の一つであるタイトジャンクションは、角層直下の顆粒層に局在し、角層と共に皮膚バリア機能を担っている。タイトジャンクションの構成タンパク質の一つであるクローディン１を欠損したマウスでは経表皮水分蒸散量の増加により出生後致死となることが報告されており、タイトジャンクションは、外界からのバリア機能だけではなく、生体内の水分流出の防御にも働いていると考えられている。更に、タイトジャンクションの構成タンパク質の減少はアトピー性皮膚炎の発症の要因の一つになっていることも提唱されている。そのため、タイトジャンクションの形成を促進させることは、皮膚の健全化のために有用であると考えられている。 The skin is the outermost tissue of the body and is constantly exposed to stresses such as dryness and the invasion of foreign substances from the outside world. To protect the body from these stresses, the skin has developed a barrier function. Tight junctions, which are one of the intercellular adhesion structures, are localized in the granular layer just below the stratum corneum and, together with the stratum corneum, play a role in the skin barrier function. It has been reported that mice lacking claudin-1, one of the proteins that constitute the tight junctions, become lethal after birth due to increased transepidermal water loss, and it is believed that tight junctions not only function as a barrier against the outside world, but also act to prevent water loss from within the body. Furthermore, it has been proposed that a decrease in the proteins that constitute the tight junctions is one of the factors that lead to the development of atopic dermatitis. Therefore, it is believed that promoting the formation of tight junctions is useful for improving the health of the skin.
従来、入手が困難なヒト皮膚又は実験動物の代替として三次元皮膚モデルが評価試験に汎用されている。三次元皮膚モデルは、ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行うことにより作製される組織モデルであり、基底層、有棘層、顆粒層、及び角層が順に積層された擬似表皮組織が形成されている。従来、タイトジャンクションの形成評価は、三次元皮膚モデルが使用されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、タイトジャンクションは角層下の顆粒層に局在しているため、角層が最表面に存在している従来の三次元皮膚モデルでは、タイトジャンクションを免疫染色によって可視化しても、角層が形成されている三次元皮膚モデルの表面からはタイトジャンクションを観察することができないため、三次元皮膚モデルの断面からタイトジャンクションを観察しているのが現状である。このように三次元皮膚モデルの断面からタイトジャンクションを観察したとしても、当該断面において点状又は線状でしかタイトジャンクションを観察できず、タイトジャンクションの発達度を正確に評価できないという欠点がある。 Conventionally, three-dimensional skin models have been widely used in evaluation tests as an alternative to human skin or experimental animals, which are difficult to obtain. The three-dimensional skin model is a tissue model prepared by culturing keratinocytes at an air-liquid interface and inducing differentiation, and a pseudo-epidermal tissue is formed in which the basal layer, spinous layer, granular layer, and stratum corneum are laminated in order. Conventionally, three-dimensional skin models have been used to evaluate the formation of tight junctions (see, for example, Patent Document 1). However, since tight junctions are localized in the granular layer below the stratum corneum, in conventional three-dimensional skin models in which the stratum corneum is present at the top surface, even if tight junctions are visualized by immunostaining, tight junctions cannot be observed from the surface of the three-dimensional skin model where the stratum corneum is formed, so that the current situation is that tight junctions are observed from the cross section of the three-dimensional skin model. Even if tight junctions are observed from the cross section of the three-dimensional skin model in this way, there is a disadvantage that the tight junctions can only be observed as dots or lines on the cross section, and the development degree of tight junctions cannot be accurately evaluated.
本発明の目的は、三次元皮膚モデルの表面からタイトジャンクションを観察可能にするタイトジャンクションの可視化方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、当該タイトジャンクションの可視化方法を利用した、被験物質のタイトジャンクション形成能に及ぼす影響を評価する方法、及びタイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法を提供することである。 The object of the present invention is to provide a method for visualizing tight junctions that enables observation of tight junctions from the surface of a three-dimensional skin model. Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the effect of a test substance on the ability to form tight junctions, and a method for screening substances that affect the ability to form tight junctions, using the method for visualizing tight junctions.
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止させた三次元皮膚モデルは、表面（三次元皮膚モデルの平面）においてタイトジャンクションの網目構造（タイトジャンクションストランドのネットワーク）を可視化できることを見出した。更に、当該手法を利用することにより、被験物質のタイトジャンクション形成能の評価や、タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質のスクリーニングが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 The inventors conducted extensive research to solve the above problems and found that a three-dimensional skin model in which keratinocytes were cultured at an air-liquid interface to induce differentiation and the differentiation induction was stopped at the stage when the basal layer, spinous layer, and granular layer were formed could visualize the mesh structure of tight junctions (a network of tight junction strands) on the surface (flat surface of the three-dimensional skin model). Furthermore, the inventors found that by using this method, it is possible to evaluate the tight junction formation ability of a test substance and to screen for substances that affect the tight junction formation ability. The present invention was completed through further research based on these findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 三次元皮膚モデルにおいてタイトジャンクションを可視化する方法であって、
ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１工程、及び
前記第１工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２工程を含む、前記可視化方法。
項２． 前記第２工程におけるタイトジャンクションの構成タンパク質の可視化が、当該構成タンパク質に対する免疫染色によって行われる、項１に記載の可視化方法。
項３． 被験試料のタイトジャンクション形成能に及ぼす影響を評価する方法であって、
被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ａ工程、及び
前記第１Ａ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ａ工程を含み、
被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、被験試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較する、前記評価方法。
項４． タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法であって、
候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ｂ工程、及び
前記第１Ｂ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ｂ工程を含み、
候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、候補試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較する、前記スクリーニング方法。
That is, the present invention provides the following aspects.
Item 1. A method for visualizing tight junctions in a three-dimensional skin model, comprising:
The visualization method includes a first step of culturing keratinocytes at an air-liquid interface to induce differentiation, and stopping the differentiation induction at a stage when a basal layer, a spinous layer, and a granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model; and a second step of visualizing constituent proteins of tight junctions in the three-dimensional skin model produced in the first step.
Item 2. The visualization method according to Item 1, wherein the visualization of a constituent protein of a tight junction in the second step is carried out by immunostaining for the constituent protein.
Item 3. A method for evaluating the effect of a test sample on the ability to form tight junctions, comprising:
The method includes a step 1A of inducing differentiation of keratinocytes by air-liquid interface culture in the presence of a test sample, and stopping the differentiation induction at a stage when a basal layer, a spinous layer, and a granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model; and a step 2A of visualizing a constituent protein of a tight junction in the three-dimensional skin model produced in the step 1A,
The evaluation method comprises comparing the degree of development of the visualized tight junction meshwork structure between keratinocytes cultured at an air-liquid interface in the presence of a test sample and keratinocytes cultured at an air-liquid interface in the absence of a test sample.
Item 4. A method for screening a substance that affects tight junction formation ability, comprising:
A step 1B of inducing differentiation of keratinocytes by air-liquid interface culture in the presence of a candidate sample, and terminating the differentiation induction at a stage when a basal layer, a spinous layer, and a granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model; and a step 2B of visualizing a constituent protein of a tight junction in the three-dimensional skin model produced in the step 1B,
The screening method comprises comparing the degree of development of the visualized tight junction meshwork structure when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of a candidate sample and when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the candidate sample.
本発明によれば、三次元皮膚モデルの表面からタイトジャンクションの網目構造（タイトジャンクションストランドのネットワーク）を可視化でき、タイトジャンクションの発達度をより正確に評価できるので、被験物質のタイトジャンクション形成能に及ぼす影響の評価や、タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質のスクリーニングを効率的に行うことが可能になる。 According to the present invention, it is possible to visualize the mesh structure of tight junctions (network of tight junction strands) from the surface of a three-dimensional skin model, and the degree of development of tight junctions can be evaluated more accurately, making it possible to efficiently evaluate the effect of a test substance on the ability to form tight junctions and to efficiently screen substances that affect the ability to form tight junctions.
１．タイトジャンクションの可視化方法
本発明のタイトジャンクションの可視化方法は、三次元皮膚モデルにおいてタイトジャンクションを可視化する方法であって、ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１工程、及び前記第１工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のタイトジャンクションの可視化方法について詳述する。
1. Method for visualizing tight junctions The method for visualizing tight junctions of the present invention is a method for visualizing tight junctions in a three-dimensional skin model, and is characterized by comprising a first step of culturing keratinocytes at an air-liquid interface to induce differentiation, and stopping the differentiation induction at the stage when the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed to prepare a three-dimensional skin model, and a second step of visualizing the constituent proteins of the tight junctions in the three-dimensional skin model prepared in the first step. The method for visualizing tight junctions of the present invention will be described in detail below.
［第１工程］
第１工程では、ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する。即ち、第１工程では、最表面に顆粒層が形成されている三次元皮膚モデルが作製される。
[First step]
In the first step, keratinocytes are cultured at an air-liquid interface to induce differentiation, and differentiation induction is stopped at the stage where the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model. That is, in the first step, a three-dimensional skin model in which the granular layer is formed on the outermost surface is produced.
第１工程で使用するケラチノサイトの由来については、特に制限されず、ヒト、マウス、ラット、サル等のいずれに由来するものであってもよいが、ヒト皮膚に近い三次元皮膚モデルにするという観点からヒト由来であることが好ましい。 The origin of the keratinocytes used in the first step is not particularly limited and may be from humans, mice, rats, monkeys, etc., but from the viewpoint of creating a three-dimensional skin model close to human skin, it is preferable that the keratinocytes are from humans.
また、第１工程で使用するケラチノサイトは、基底層、有棘層、及び顆粒層に分化可能である限り、遺伝子改変や薬剤処理等が施されたものであってもよい。 The keratinocytes used in the first step may be genetically modified or treated with a drug, as long as they are capable of differentiating into the basal layer, spinous layer, and granular layer.
第１工程においてケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導するために、先ず、液透過性膜上にケラチノサイトを播種してケラチノサイトを増殖させる。 In the first step, in order to culture keratinocytes at an air-liquid interface and induce their differentiation, the keratinocytes are first seeded on a liquid-permeable membrane and allowed to proliferate.
液透過性膜とは、培地を透過可能であり、且つケラチノサイトの支持体となり得る多孔質膜であればよく、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等の膜が挙げられる。また、液透過性膜には、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックスや、ポリＬ－リジン等の細胞の接着性を高める成分がコーティングされていてもよい。 The liquid-permeable membrane may be any porous membrane that is permeable to the medium and can serve as a support for keratinocytes, such as polycarbonate, polyethylene terephthalate, and polystyrene membranes. The liquid-permeable membrane may also be coated with an extracellular matrix such as collagen, laminin, or fibronectin, or with a component that enhances cell adhesion such as poly-L-lysine.
液透過性膜上でケラチノサイトを増殖させるには、底面に液透過性膜を有するカルチャー培養インサートを使用することが好ましい。 To grow keratinocytes on a liquid-permeable membrane, it is preferable to use a culture insert with a liquid-permeable membrane on the bottom surface.
液透過性膜上に播種するケラチノサイト数については、特に制限されないが、例えば、１×１０3～１×１０7細胞／ｃｍ2程度、好ましくは１×１０4～１×１０6細胞／ｃｍ2程度、より好ましくは１×１０5～２×１０5細胞／ｃｍ2程度が挙げられる。 The number of keratinocytes seeded on the liquid-permeable membrane is not particularly limited, but may be, for example , about 1 x 10 to 1 x 10 cells/cm, preferably about 1 x 10 to 1 x 10 cells / cm, and more preferably about 1 x 10 to 2 x 10 cells/cm.
液透過性膜上でのケラチノサイトの増殖は、ケラチノサイトを増殖用培地中に浸漬させた状態で培養すればよい。カルチャーインサートを使用する場合には、カルチャーインサート内及び外に増殖用培地を添加した状態にしてカルチャーインサート内でケラチノサイトを培養すればよい。 Keratinocytes can be grown on a liquid-permeable membrane by culturing the keratinocytes while immersed in a growth medium. When using a culture insert, the keratinocytes can be cultured in the culture insert with the growth medium added inside and outside the culture insert.
増殖用培地としては、ケラチノサイトが増殖可能であることを限度として特に制限されず、ケラチノサイトの増殖に使用されている従来の培地を使用すればよいが、低カルシウム濃度で無血清培地であることが好ましい。また、前記増殖用培地には、エピネフリン、トランスフェリン、ビタミン類、アミノ酸類、インターロイキン、インスリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲンフィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、増殖因子としてケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、肝細胞増殖因子(ＳＣＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、抗生物質等が含有されてもよい。分化誘導用培地としては、例えば、KGMTM、KGMTM-2、KGM-GoldTM、KGM-CDTM（以上、ロンザ株式会社製）等の市販品を使用することができる。 The growth medium is not particularly limited as long as it is capable of growing keratinocytes. Conventional media used for the growth of keratinocytes may be used, but a serum-free medium with a low calcium concentration is preferable. The growth medium may contain epinephrine, transferrin, vitamins, amino acids, interleukins, insulin, heparin, heparan sulfate, collagen fibronectin, progesterone, selenite, and growth factors such as keratinocyte growth factor (KGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), leukocyte migration inhibitory factor (LIF), hepatocyte growth factor (SCF), epidermal growth factor (EGF), tumor necrosis factor (TNF), and antibiotics. As the differentiation-inducing medium, for example, commercially available products such as KGMTM, KGMTM-2, KGM-GoldTM, and KGM-CDTM (all manufactured by Lonza Co., Ltd.) may be used.
液透過性膜上でのケラチノサイトの増殖は、ケラチノサイトがコンフルエントになるまで行えばよく、培養時間は、使用するケラチノサイトの種類や状態に応じて適宜設定されるが、例えば、２４～１６８時間、好ましくは４８～１２０時間、より好ましくは７２～９６時間が挙げられる。また、液透過性膜上でのケラチノサイトの増殖は、ＣＯ2インキュベーター内で、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３７℃で行えばよい。 The proliferation of keratinocytes on the liquid-permeable membrane may be continued until the keratinocytes become confluent, and the culture time may be appropriately set depending on the type and state of the keratinocytes used, for example, 24 to 168 hours, preferably 48 to 120 hours, and more preferably 72 to 96 hours. The proliferation of keratinocytes on the liquid-permeable membrane may be carried out in a CO2 incubator at 25 to 40°C, preferably 36 to 38°C, and more preferably 37°C.
液透過性膜上でケラチノサイトを増殖させた後に、気液界面培養に先立って、分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させた状態で培養してもよい。このように、気液界面培養前に分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させて培養することにより、ケラチノサイトを効率的に、基底層、有棘層、及び顆粒層に分化させることができる。カルチャーインサートを使用する場合であれば、分化誘導用培地中に浸漬させてケラチノサイトを培養するには、ケラチノサイトを増殖させた後に、カルチャーインサート内及び外の増殖用培地を分化誘導用培地に置換して培養すればよい。 After the keratinocytes are grown on the liquid-permeable membrane, they may be cultured in a state where they are immersed in a differentiation-inducing medium prior to air-liquid interface culture. In this way, by culturing the keratinocytes immersed in a differentiation-inducing medium prior to air-liquid interface culture, the keratinocytes can be efficiently differentiated into the basal layer, spinous layer, and granular layer. When using a culture insert, in order to culture the keratinocytes immersed in a differentiation-inducing medium, the growth medium inside and outside the culture insert may be replaced with the differentiation-inducing medium after the keratinocytes are grown, and then the culture may be performed.
分化誘導用培地としては、コンフルエントになったケラチノサイトを基底層、有棘層、及び顆粒層に分化誘導できることを限度として特に制限されず、ケラチノサイトの分化誘導に使用されている従来の培地を使用すればよいが、カルシウム濃度が１ｍＭ以上、好ましくは１．２～１．８ｍＭ程度の無血清培地であることが好ましい。分化誘導用培地としては、例えば、CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium（CELLnTEC社製）等の市販品を使用することができる。 The differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it can induce differentiation of confluent keratinocytes into the basal layer, spinous layer, and granular layer. Conventional media used for inducing differentiation of keratinocytes may be used, but it is preferable to use a serum-free medium with a calcium concentration of 1 mM or more, preferably about 1.2 to 1.8 mM. As the differentiation-inducing medium, for example, a commercially available product such as CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium (manufactured by CELLnTEC) can be used.
分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させた状態で培養する際の培養時間については、使用するケラチノサイトの種類や状態に応じて適宜設定されるが、例えば、６～７２時間、好ましくは１２～４８時間、より好ましくは１８～２７時間が挙げられる。また、当該培養は、ＣＯ2インキュベーター内で、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３７℃で行えばよい。 The culture time when keratinocytes are cultured in a differentiation-inducing medium while immersed therein is appropriately set depending on the type and state of the keratinocytes used, and may be, for example, 6 to 72 hours, preferably 12 to 48 hours, and more preferably 18 to 27 hours. The culture may be performed in a CO2 incubator at 25 to 40°C, preferably 36 to 38°C, and more preferably 37°C.
また、ケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導するには、液透過性膜のケラチノサイトが存在する側を気相（大気）に晒し、液透過性膜のケラチノサイトが存在しない側は分化誘導用培地を接触させた状態で培養すればよい。カルチャーインサートを使用する場合には、カルチャーインサート内には分化誘導用培地が含まれず、及びカルチャーインサート外に増殖用培地が含まれる状態にしてケラチノサイトを培養すればよい。 To induce differentiation of keratinocytes by culturing them at an air-liquid interface, the side of the liquid-permeable membrane where the keratinocytes are present can be exposed to the air phase (atmosphere), and the side of the liquid-permeable membrane where the keratinocytes are not present can be cultured in contact with a differentiation-inducing medium. When using a culture insert, the keratinocytes can be cultured in a state where the culture insert does not contain a differentiation-inducing medium, and the culture insert contains a proliferation medium outside.
ケラチノサイトの気液界面培養は、１～４日に１回、好ましくは２～３日に１回の頻度で分化誘導用培地を新鮮なものに交換しながら行えばよい。また、気液界面培養は、ＣＯ2インキュベーター内で、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３７℃で行えばよい。 The air-liquid interface culture of keratinocytes may be performed by replacing the differentiation-inducing medium with a fresh one once every 1 to 4 days, preferably once every 2 to 3 days, in a CO2 incubator at 25 to 40°C, preferably 36 to 38°C, more preferably 37°C.
気液界面培養を行うことにより、ケラチノサイトが分化誘導されて、基底層、有棘層、及び顆粒層をこの順で形成して重層化する。第１工程では、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で気液界面培養を停止する。本発明において、「基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階」とは、可視化されたタイトジャンクションの構成タンパク質を表面から直接視認できる程度に、顆粒層が表面側に位置している状態になっている時点を指し、顆粒層の形成終了後且つ角層の形成が開始される前の時点だけでなく、タイトジャンクションの形成が認められる限り、顆粒層の形成途中の時点であってもよく、更に、可視化されたタイトジャンクションの視認性に悪影響を及ぼさない程度の僅かな角層が顆粒層上に形成された状態になっている時点であってもよい。即ち、第１工程では、顆粒層の形成途中から、顆粒層に僅かな角層が形成されるまでの間に、気液界面培養を終了する。 By carrying out the air-liquid interface culture, keratinocytes are induced to differentiate, forming the basal layer, spinous layer, and granular layer in this order, resulting in stratification. In the first step, the air-liquid interface culture is stopped at the stage where the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed. In the present invention, the "stage where the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed" refers to the time when the granular layer is located on the surface side to such an extent that the constituent proteins of the visualized tight junctions can be directly seen from the surface, and may be not only the time when the formation of the granular layer is completed and before the formation of the stratum corneum is started, but also the time when the formation of the granular layer is in the middle of its formation, as long as the formation of the tight junctions is observed, and further, may be the time when a small amount of stratum corneum is formed on the granular layer to such an extent that it does not adversely affect the visibility of the visualized tight junctions. That is, in the first step, the air-liquid interface culture is stopped between the time when the formation of the granular layer is completed and the time when a small amount of stratum corneum is formed on the granular layer.
気液界面培養の培養時間については、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で終了するように、使用するケラチノサイトの種類や状態に応じて設定すればよい。通常、気液界面培養の培養時間が２４０時間を超えると、最表層において角層の形成が開始され、培養時間が２７０時間を超えると、十分な角層の形成によりタイトジャンクションの可視化ができなくなる傾向が現れるので、気液界面培養の培養時間は、通常９６～２７０時間、好ましくは１７０～２４０時間、より好ましくは１９０～２４０時間にすればよい。 The culture time for air-liquid interface culture may be set according to the type and condition of the keratinocytes used, so that the culture time is terminated when the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed. Normally, when the culture time for air-liquid interface culture exceeds 240 hours, the formation of a stratum corneum begins in the outermost layer, and when the culture time exceeds 270 hours, there is a tendency for the tight junctions to become impossible to visualize due to sufficient formation of the stratum corneum, so the culture time for air-liquid interface culture may normally be 96 to 270 hours, preferably 170 to 240 hours, and more preferably 190 to 240 hours.
斯くして、第１工程を行うことにより、最表面に顆粒層が形成されている三次元皮膚モデルが作製される。 Thus, by carrying out the first step, a three-dimensional skin model is produced in which a granular layer is formed on the outermost surface.
［第２工程］
第２工程では、前記第１工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する。
[Second step]
In the second step, the constituent proteins of tight junctions are visualized in the three-dimensional skin model prepared in the first step.
タイトジャンクションの構成タンパク質としては、ＯＺ－１、オクルーディン、クローディン１、トリセルリン、ＥＲＭ、ＪＡＭ等が挙げられる。 Component proteins of tight junctions include OZ-1, occludin, claudin 1, tricellulin, ERM, JAM, etc.
三次元皮膚モデルのタイトジャンクションの構成タンパク質を可視化するには、当該三次元皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの構成タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色を行えばよい。免疫染色は、公知のホールマウント免疫染色によって行うことができる。 To visualize the constituent proteins of the tight junctions in a three-dimensional skin model, the three-dimensional skin model can be immunostained using an antibody against the constituent proteins of the tight junctions. The immunostaining can be performed by known whole-mount immunostaining.
また、タイトジャンクションの構成タンパク質を免疫染色する際は、メタノール等を用いて、前記第１工程で作製された三次元皮膚モデルを固定化しておくことが好ましい。 When immunostaining the constituent proteins of tight junctions, it is preferable to fix the three-dimensional skin model prepared in the first step using methanol or the like.
更に、タイトジャンクションの構成タンパク質を効率的に免疫染色するために、固定化後の三次元皮膚モデルに対して界面活性剤処理を行うことが好ましい。界面活性剤処理は、具体的には、界面活性剤を含む緩衝剤に固定化後の三次元皮膚モデルを浸漬させる方法、界面活性剤を含む緩衝剤で固定化後の三次元皮膚モデルを洗浄する方法等によって行うことができる。使用される界面活性剤の種類としては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（トリトンＸ－１００）等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。また、界面活性剤を含む緩衝剤における界面活性剤の含有量としては、例えば、０．０５～１．０重量％、好ましくは０．１～０．５重量％が挙げられる。 Furthermore, in order to efficiently immunostain the constituent proteins of tight junctions, it is preferable to subject the immobilized three-dimensional skin model to a surfactant treatment. Specifically, the surfactant treatment can be performed by immersing the immobilized three-dimensional skin model in a buffer containing a surfactant, or by washing the immobilized three-dimensional skin model with a buffer containing a surfactant. Examples of the type of surfactant used include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether (Triton X-100). The content of the surfactant in the buffer containing the surfactant is, for example, 0.05 to 1.0% by weight, preferably 0.1 to 0.5% by weight.
斯くして、前記第１工程で作製された三次元皮膚モデルのタイトジャンクションの構成タンパク質を可視化することにより、三次元皮膚モデルの表面において、タイトジャンクションの網目構造（タイトジャンクションストランドのネットワーク）が観察可能になる。 Thus, by visualizing the constituent proteins of the tight junctions in the three-dimensional skin model created in the first step, it becomes possible to observe the mesh structure of the tight junctions (network of tight junction strands) on the surface of the three-dimensional skin model.
２．タイトジャンクション形成能に及ぼす影響の評価方法
本発明の評価方法は、被験試料のタイトジャンクション形成能に及ぼす影響を評価する方法であって、被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層を形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ａ工程、及び前記第１Ａ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ａ工程を含み、被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、被験試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較することを特徴とする。
2. Method for evaluating the effect on tight junction formation ability The evaluation method of the present invention is a method for evaluating the effect of a test sample on the tight junction formation ability, which includes a step 1A of culturing keratinocytes at an air-liquid interface in the presence of the test sample to induce differentiation, and stopping the differentiation induction at the stage when the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed to prepare a three-dimensional skin model, and a step 2A of visualizing the constituent proteins of the tight junction in the three-dimensional skin model prepared in the step 1A, characterized in that the degree of development of the visualized mesh structure of the tight junction is compared between the case where keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the test sample and the case where keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the test sample.
本発明のタイトジャンクション形成能の評価方法は、被験試料が有するタイトジャンクション形成能を評価する方法である。タイトジャンクション形成能とは、タイトジャンクションの形成を促進する能力、又はタイトジャンクションの形成を抑制又は阻害する能力を指しており、本発明の評価方法では、被験試料がタイトジャンクションの形成に及ぼす作用の有無及び強弱を判定することができる。 The method for evaluating the tight junction formation ability of the present invention is a method for evaluating the tight junction formation ability of a test sample. The tight junction formation ability refers to the ability to promote the formation of tight junctions or the ability to suppress or inhibit the formation of tight junctions, and the evaluation method of the present invention can determine the presence or absence and the strength of the effect of the test sample on the formation of tight junctions.
被験試料とは、タイトジャンクション形成能の有無及び強弱の評価対象となる試料であり、単一化合物であってもよく、また、２以上の成分が含まれる混合物であってもよい。 The test sample is a sample that is to be evaluated for the presence or absence and strength of tight junction formation ability, and may be a single compound or a mixture containing two or more components.
本発明の評価方法における第１Ａ工程は、ケラチノサイトから三次元皮膚モデルを作製する際に、被験物質存在下で気液界面培養を行うこと以外は、前記タイトジャンクションの可視化方法における第１工程と同じである。 Step 1A in the evaluation method of the present invention is the same as step 1 in the above-mentioned tight junction visualization method, except that when preparing a three-dimensional skin model from keratinocytes, air-liquid interface culture is performed in the presence of the test substance.
第１Ａ工程において、被験物質存在下でケラチノサイトを気液界面培養するには、気液界面培養に使用する分化誘導用培地に被験物質を添加することが好ましいが、ケラチノサイトに対して被験物質を直接添加してもよい。 In step 1A, to culture keratinocytes at the air-liquid interface in the presence of a test substance, it is preferable to add the test substance to the differentiation-inducing medium used for the air-liquid interface culture, but the test substance may also be added directly to the keratinocytes.
また、第１Ａ工程では、ケラチノサイトの分化誘導中のいずれの段階で被験物質とケラチノサイトを共存させてもよく、例えば、(1)被験物質の存在下で最初から最後まで気液界面培養を行う、(2)被験物質の非存在下で気液界面培養を開始し、途中から被験物質の存在下で気液界面培養を行う、(3)被験物質非存在下で気液界面培養を開始し、途中から被験物質存在下で気液界面培養を行う、等の方法によって実施することができる。 In step 1A, the test substance and keratinocytes may be allowed to coexist at any stage during the induction of keratinocyte differentiation. For example, the method may be as follows: (1) air-liquid interface culture is performed from start to finish in the presence of the test substance; (2) air-liquid interface culture is started in the absence of the test substance, and then air-liquid interface culture is performed in the presence of the test substance; or (3) air-liquid interface culture is started in the absence of the test substance, and then air-liquid interface culture is performed in the presence of the test substance.
第２Ａ工程は、前記タイトジャンクションの可視化方法における第１工程と同じである。 Step 2A is the same as step 1 in the method for visualizing tight junctions.
第２Ａ工程で可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度が、被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合の方が、被験試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合に比べて高い場合には、当該被験物質は、タイトジャンクションの形成を促進する作用があると判定される。また、第２Ａ工程で可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度が、被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合の方が、被験試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合に比べて低い場合には、当該被験物質は、タイトジャンクションの形成を抑制又は阻害する作用があると判定される。 If the degree of development of the mesh structure of tight junctions visualized in step 2A is higher when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the test sample than when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the test sample, the test substance is determined to have an effect of promoting the formation of tight junctions. Also, if the degree of development of the mesh structure of tight junctions visualized in step 2A is lower when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the test sample than when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the test sample, the test substance is determined to have an effect of suppressing or inhibiting the formation of tight junctions.
３．タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法であって、候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層を形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ｂ工程、及び前記第１Ｂ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ｂ工程を含み、候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、候補試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較することを特徴とする。
3. Screening method for substances that affect the ability to form tight junctions The screening method of the present invention is a screening method for substances that affect the ability to form tight junctions, and includes a step 1B of culturing keratinocytes at an air-liquid interface in the presence of a candidate sample to induce differentiation, and stopping the differentiation induction at the stage when the basal layer, spinous layer, and granular layer are formed to prepare a three-dimensional skin model, and a step 2B of visualizing the constituent proteins of tight junctions in the three-dimensional skin model prepared in the step 1B, and is characterized in that the degree of development of the visualized mesh structure of tight junctions is compared between a case in which keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the candidate sample and a case in which keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the candidate sample.
タイトジャンクション形成能とは、タイトジャンクションの形成を促進する能力、又はタイトジャンクションの形成を抑制又は阻害する能力を指しており、本発明のスクリーニング方法では、候補物質の中からタイトジャンクション形成能に影響し得るものを選択することができる。 The ability to form tight junctions refers to the ability to promote the formation of tight junctions or the ability to suppress or inhibit the formation of tight junctions, and the screening method of the present invention makes it possible to select from among candidate substances those that can affect the ability to form tight junctions.
候補物質は、タイトジャンクション形成能に影響を及ぼす作用の有無が判定される試料であり、単一化合物であってもよく、また、２以上の成分が含まれる混合物であってもよい。 A candidate substance is a sample that is to be assessed for the presence or absence of an effect that affects the ability to form tight junctions, and may be a single compound or a mixture containing two or more components.
本発明のスクリーニング方法における第１Ｂ工程は、ケラチノサイトから三次元皮膚モデルを作製する際に、候補物質存在下で気液界面培養を行うこと以外は、前記タイトジャンクションの可視化方法における第１工程と同じである。 Step 1B in the screening method of the present invention is the same as step 1 in the method for visualizing tight junctions, except that when preparing a three-dimensional skin model from keratinocytes, air-liquid interface culture is performed in the presence of a candidate substance.
第１Ｂ工程において、候補物質存在下でケラチノサイトを気液界面培養するには、気液界面培養に使用する分化誘導用培地に被験物質を添加することが好ましいが、ケラチノサイトに対して候補物質を直接添加してもよい。 In step 1B, to culture keratinocytes at the air-liquid interface in the presence of a candidate substance, it is preferable to add the test substance to the differentiation-inducing medium used for the air-liquid interface culture, but the candidate substance may also be added directly to the keratinocytes.
また、第１Ｂ工程では、ケラチノサイトの分化誘導中のいずれの段階で候補物質とケラチノサイトを共存させればよく、例えば、(1)候補物質の存在下で最初から最後まで気液界面培養を行う、(2)候補物質の非存在下で気液界面培養を開始し、途中から候補物質の存在下で気液界面培養を行う、(3)候補物質非存在下で気液界面培養を開始し、途中から候補物質存在下で気液界面培養を行う、等の方法によって実施することができる。 In step 1B, the candidate substance and keratinocytes may be allowed to coexist at any stage during the differentiation induction of keratinocytes. For example, this can be achieved by (1) performing air-liquid interface culture from start to finish in the presence of the candidate substance, (2) starting air-liquid interface culture in the absence of the candidate substance and then performing air-liquid interface culture in the presence of the candidate substance halfway through, or (3) starting air-liquid interface culture in the absence of the candidate substance and then performing air-liquid interface culture in the presence of the candidate substance halfway through.
第２Ｂ工程は、前記タイトジャンクションの可視化方法における第１工程と同じである。 Step 2B is the same as step 1 in the method for visualizing tight junctions.
第２Ａ工程で可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度が、候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合の方が、候補試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合に比べて高い場合には、当該候補物質は、タイトジャンクションの形成を促進する作用を有するものとして選択される。また、第２Ａ工程で可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度が、候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合の方が、候補試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合に比べて低い場合には、当該候補物質は、タイトジャンクションの形成を抑制又は阻害する作用を有するものとして選択される。 If the degree of development of the mesh structure of tight junctions visualized in step 2A is higher when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the candidate sample than when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the candidate sample, the candidate substance is selected as having an effect of promoting the formation of tight junctions. Also, if the degree of development of the mesh structure of tight junctions visualized in step 2A is lower when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of the candidate sample than when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the candidate sample, the candidate substance is selected as having an effect of suppressing or inhibiting the formation of tight junctions.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these.
試験例１：三次元皮膚モデルにおけるタイトジャンクションの可視化
１．タイトジャンクション構成タンパク質を免疫染色した三次元皮膚モデルの作製
（１）ケラチノサイトの増殖
ヒト新生児包皮由来のケラチノサイト（ロンザ株式会社）を1.0×105 cells/mlとなるように増殖用培地（KGM-GOLD培地、ロンザ株式会社）で調整した細胞懸濁液1 mlをセルカルチャーインサート（Falconカルチャーインサート（353180, 12ウェル用，ポアサイズ 0.4 μm, 培養面積0.9cm2；コーニング社）内に播種した。カルチャーインサートを静置した12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）には1.5 ml/wellで増殖用培地（KGM-GOLD培地、ロンザ株式会社）を添加した。播種後、37℃でＣＯ2インキュベーター内で3日間培養した。
Test Example 1: Visualization of tight junctions in a three-dimensional skin model
1. Preparation of a three-dimensional skin model immunostained for tight junction proteins (1) Keratinocyte proliferation Human neonatal foreskin-derived keratinocytes (Lonza) were adjusted in proliferation medium (KGM-GOLD medium, Lonza) to a cell density of 1.0 x 105 cells/ml, and 1 ml of the cell suspension was seeded into a cell culture insert (Falcon culture insert (353180, for 12 wells, pore size 0.4 μm, culture area 0.9 cm2 ; Corning). 1.5 ml/well of proliferation medium (KGM-GOLD medium, Lonza) was added to the 12-well plate (outside the culture insert) in which the culture insert was placed. After seeding, the cells were cultured at 37°C in a CO2 incubator for 3 days.
（２）分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させた状態での培養
前記（１）の培養後に、カルチャーインサート内及び12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）の培地を、分化誘導用培地（CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium、CELLnTEC社）に交換し、37℃でＣＯ2インキュベーター内で1日間培養した。
(2) Cultivation of keratinocytes immersed in differentiation-inducing medium After the culturing in (1) above, the medium in the culture insert and in the 12-well plate (outside the culture insert) was replaced with differentiation-inducing medium (CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium, CELLnTEC), and the cells were cultured at 37°C in a CO2 incubator for 1 day.
（３）ケラチノサイトの分化誘導
前記（２）の培養後に、カルチャーインサート内の培地をアスピレーターで除去し、37℃でＣＯ2インキュベーター内で気液界面培養を10日間行った。気液界面培養中は、2日に1回、12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）の培地を新鮮な分化誘導用培地に交換した。なお、10日間の気液界面培養により、ケラチノサイトが分化誘導されて基底層、有棘層、及び顆粒層が形成されているが、角層の形成前の状態になっている。
(3) Induction of differentiation of keratinocytes After the culture in (2) above, the medium in the culture insert was removed with an aspirator, and air-liquid interface culture was performed for 10 days in a CO2 incubator at 37°C. During the air-liquid interface culture, the medium in the 12-well plate (outside the culture insert) was replaced with fresh differentiation-inducing medium once every two days. Note that, by the air-liquid interface culture for 10 days, the keratinocytes were induced to differentiate and the basal layer, spinous layer, and granular layer were formed, but the state was before the formation of the stratum corneum.
（４）タイトジャンクションの可視化
前記（３）の気液界面培養後に、12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）の培地をアスピレーターで除去し、PBS(-)で2回洗浄した後、セルカルチャーインサート内及び12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）に冷メタノールを添加し（カルチャーインサート内は100 μl、12ウェルプレート内は1.5 ml），-20℃で10分間固定した。固定後、PBS(-)でセルカルチャーインサートを3回洗浄した。洗浄後、セルカルチャーインサート内に形成されている三次元皮膚モデルをメスを用いてメンブレンごと切り出した後、メンブレンを三次元皮膚モデルから取り除いた。
(4) Visualization of tight junctions After the air-liquid interface culture in (3) above, the medium in the 12-well plate (outside the culture insert) was removed with an aspirator, and the cells were washed twice with PBS(-), and then cold methanol was added to the cell culture insert and the 12-well plate (outside the culture insert) (100 μl in the culture insert, 1.5 ml in the 12-well plate), and the cells were fixed at -20°C for 10 minutes. After fixation, the cell culture insert was washed three times with PBS(-). After washing, the three-dimensional skin model formed in the cell culture insert was cut out together with the membrane using a scalpel, and the membrane was removed from the three-dimensional skin model.
切り出した三次元表皮モデルを0.5% トリトンX-100を含むPBSに浸漬させ、室温で1時間処理させた。処理後、PBS(-)で3回洗浄した後、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSを用いて、室温で30分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体として、ウサギ抗ZO-1ポリクローナルIgG（#61-7300、インビトロジェン社）、及びマウス抗オクルーディンモノクローナルIgG（OC-3F10、#33-1500、インビトロジェン社）を添加して、4℃で一晩反応させた。一次抗体の反応後にPBS(-)で洗浄した後に、二次抗体として、Alexa488標識ロバ抗ウサギIgGポリクローナル抗体（インビトロジェン社）、及びAlexa Fluor 568標識ヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体（インビトロジェン社）を用いて、DAPI（10236276001、シグマ社製）と共に室温で1時間反応させた。次いで、PBS(-)で3回洗浄し、タイトジャンクション構成タンパク質（ZO-1及びオクルーディン）を免疫染色した三次元皮膚モデルを得た。 The excised three-dimensional epidermis model was immersed in PBS containing 0.5% Triton X-100 and treated at room temperature for 1 hour. After treatment, it was washed three times with PBS(-) and then blocked for 30 minutes at room temperature using PBS containing 10% fetal bovine serum (FBS). Next, rabbit anti-ZO-1 polyclonal IgG (#61-7300, Invitrogen) and mouse anti-occludin monoclonal IgG (OC-3F10, #33-1500, Invitrogen) were added as primary antibodies and reacted overnight at 4°C. After washing with PBS(-) after the primary antibody reaction, it was reacted with Alexa488-labeled donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Invitrogen) and Alexa Fluor 568-labeled goat anti-mouse IgG polyclonal antibody (Invitrogen) as secondary antibodies together with DAPI (10236276001, Sigma) at room temperature for 1 hour. The skin was then washed three times with PBS(-) to obtain a three-dimensional skin model immunostained for tight junction component proteins (ZO-1 and occludin).
２．三次元皮膚モデルの観察
前記で得られた三次元皮膚モデルを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１に示す。この結果、得られた三次元皮膚モデルは、三次元皮膚モデルの表面（三次元皮膚モデルの平面）においてタイトジャンクションの網目構造（タイトジャンクションストランドのネットワーク）が明瞭に観察されることが確認された。即ち、本結果から、ケラチノサイトを分化誘導させて三次元皮膚モデルを作製する際に、顆粒層の形成後、且つ角層の形成前に、ケラチノサイトの分化誘導を停止させることにより、表面からタイトジャンクションの網目構造を観察可能な三次元皮膚モデルが得られることが明らかとなった。
2. Observation of the three-dimensional skin model The results of observing the three-dimensional skin model obtained above with a fluorescent microscope are shown in Figure 1. As a result, it was confirmed that the mesh structure of tight junctions (network of tight junction strands) was clearly observed on the surface of the three-dimensional skin model (flat surface of the three-dimensional skin model). That is, from this result, it was revealed that when producing a three-dimensional skin model by inducing differentiation of keratinocytes, by stopping the induction of differentiation of keratinocytes after the formation of the granular layer and before the formation of the stratum corneum, a three-dimensional skin model in which the mesh structure of tight junctions can be observed from the surface can be obtained.
試験例２：タイトジャンクションを可視化できる三次元皮膚モデルを用いた被験物質のタイトジャンクション形成能の評価
１．被験物質存在下での三次元皮膚モデルの作製
（１）ケラチノサイトの増殖
前記試験例１の「（１）ケラチノサイトの増殖」と同条件で、ケラチノサイトをカルチャーインサート内で増殖させた。
Test Example 2: Evaluation of the tight junction formation ability of a test substance using a three-dimensional skin model capable of visualizing tight junctions
1. Preparation of a three-dimensional skin model in the presence of a test substance (1) Keratinocyte proliferation Keratinocytes were proliferated in a culture insert under the same conditions as in "(1) Keratinocyte proliferation" of Test Example 1 above.
（２）分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させた状態での培養
前記試験例１の「（２）分化誘導用培地中にケラチノサイトを浸漬させた状態での培養」と同条件で、増殖させたケラチノサイトを分化誘導用培地中に浸漬させた状態で培養した。
(2) Cultivation of keratinocytes immersed in differentiation-inducing medium The proliferated keratinocytes were cultured immersed in differentiation-inducing medium under the same conditions as in "(2) Cultivation of keratinocytes immersed in differentiation-inducing medium" in Test Example 1 above.
（３）被験物質の添加及びケラチノサイトの分化誘導
前記（２）の培養後に、カルチャーインサート内の培地をアスピレーターで除去し、2日に1回、12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）の培地を新鮮な分化誘導用培地（CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium、CELLnTEC社）に交換しながら、37℃でＣＯ2インキュベーター内で気液界面培養を7日間行った。7日間の気液界面培養後に、12ウェルプレート内（カルチャーインサートの外）の培地を、グリチルリチン酸ジカリウム（タイトジャンクション形成促進作用が知られている被験物質）を０．０００４重量％含む分化誘導用培地（CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium、CELLnTEC社）に置換して、更に37℃でＣＯ2インキュベーター内で気液界面培養を3日間行った。また、コントロールとして、グリチルリチン酸ジカリウムを添加していない分化誘導用培地を用いて、前記と同条件で気液界面培養を行った。なお、合計10日間の気液界面培養により、ケラチノサイトが分化誘導されて基底層、有棘層、及び顆粒層が形成されているが、角層の形成前の状態になっている。
(3) Addition of test substance and induction of differentiation of keratinocytes After the culture in (2) above, the medium in the culture insert was removed with an aspirator, and the medium in the 12-well plate (outside the culture insert) was replaced with fresh differentiation induction medium (CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium, CELLnTEC) once every two days, while performing air-liquid interface culture in a CO2 incubator at 37°C for 7 days. After 7 days of air-liquid interface culture, the medium in the 12-well plate (outside the culture insert) was replaced with a differentiation induction medium (CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium, CELLnTEC) containing 0.0004% by weight of dipotassium glycyrrhizinate (a test substance known to promote the formation of tight junctions), and air-liquid interface culture was performed for another 3 days at 37°C in a CO2 incubator. As a control, air-liquid interface culture was performed under the same conditions as above using a differentiation induction medium without dipotassium glycyrrhizinate. By the air-liquid interface culture for a total of 10 days, the keratinocytes were induced to differentiate and form a basal layer, a spinous layer, and a granular layer, but the stratum corneum was still in a state prior to formation of the stratum corneum.
（４）タイトジャンクションの可視化
前記試験例１の「４）タイトジャンクションの可視化」と同条件で、タイトジャンクション構成タンパク質を免疫染色した三次元皮膚モデルを得た。
(4) Visualization of tight junctions Under the same conditions as in "4) Visualization of tight junctions" in Test Example 1, a three-dimensional skin model was obtained in which tight junction-constituting proteins were immunostained.
２．三次元皮膚モデルの観察及び被験物質のタイトジャンクション形成能の評価
前記で得られた三次元皮膚モデルを蛍光顕微鏡で観察した結果を図２に示す。この結果、タイトジャンクション形成促進作用が知られているグリチルリチン酸ジカリウム存在下で気液界面培養を行うことにより得られた三次元皮膚モデルでは、コントロールに比べて、三次元皮膚モデルの表面で観察されるタイトジャンクションの網目構造（タイトジャンクションストランドのネットワーク）が発達していることが確認された。即ち、本結果から、顆粒層の形成後、且つ角層の形成前に、ケラチノサイトの分化誘導を停止させることにより作製された三次元皮膚モデルは、被験物質のタイトジャンクション形成能を正確に評価できることが分かった。
2. Observation of the three-dimensional skin model and evaluation of the tight junction formation ability of the test substance The results of observing the three-dimensional skin model obtained above with a fluorescent microscope are shown in Figure 2. As a result, it was confirmed that the mesh structure of the tight junctions (network of tight junction strands) observed on the surface of the three-dimensional skin model obtained by performing air-liquid interface culture in the presence of dipotassium glycyrrhizinate, which is known to promote the formation of tight junctions, was more developed than that of the control. In other words, from this result, it was found that the three-dimensional skin model prepared by stopping the differentiation induction of keratinocytes after the formation of the granular layer and before the formation of the stratum corneum can accurately evaluate the tight junction formation ability of the test substance.
Claims (2)
被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ａ工程、及び
前記第１Ａ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ａ工程を含み、
被験試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、被験試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較する、前記評価方法。 A method for evaluating an effect of a test sample on tight junction formation ability, comprising:
The method includes a step 1A of inducing differentiation of keratinocytes by air-liquid interface culture in the presence of a test sample, and stopping the differentiation induction at a stage when a basal layer, a spinous layer, and a granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model; and a step 2A of visualizing a constituent protein of a tight junction in the three-dimensional skin model produced in the step 1A,
The evaluation method comprises comparing the degree of development of the visualized tight junction meshwork structure between keratinocytes cultured at an air-liquid interface in the presence of a test sample and keratinocytes cultured at an air-liquid interface in the absence of a test sample.
候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養して分化誘導を行い、基底層、有棘層、及び顆粒層が形成された段階で分化誘導を停止して、三次元皮膚モデルを作製する第１Ｂ工程、及び
前記第１Ｂ工程で作製された三次元皮膚モデルにおいて、タイトジャンクションの構成タンパク質を可視化する第２Ｂ工程を含み、
候補試料の存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合と、候補試料の非存在下でケラチノサイトを気液界面培養した場合について、可視化されたタイトジャンクションの網目構造の発達度を比較する、前記スクリーニング方法。
A method for screening a substance that affects tight junction formation ability, comprising:
A step 1B of inducing differentiation of keratinocytes by air-liquid interface culture in the presence of a candidate sample, and terminating the differentiation induction at a stage when a basal layer, a spinous layer, and a granular layer are formed, thereby producing a three-dimensional skin model; and a step 2B of visualizing a constituent protein of a tight junction in the three-dimensional skin model produced in the step 1B,
The screening method comprises comparing the degree of development of the visualized tight junction meshwork structure when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the presence of a candidate sample and when keratinocytes are cultured at an air-liquid interface in the absence of the candidate sample.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| Bethany E. PEREZ WHITE et al.，"EphA2 proteomics in human keratinocytes reveals a novel association with afadin and epidermal tight junctions"，Journal of Cell Science，2016年01月01日，DOI: doi:10.1242/jcs.188169 |
| 瀬尾皓ら，"腫瘍関連抗原EpCAMは重層扁平上皮のタイト結合の形成・機能を制御するか？"，２０１８年度研究成果報告書，［2024年4月19日検索］，[online]，2020年03月20日，インターネット＜URL：https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-17H07304/17H07304seika.pdf＞ |
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