JP7690737B2

JP7690737B2 - 成熟軟骨細胞の製造方法

Info

Publication number: JP7690737B2
Application number: JP2021006928A
Authority: JP
Inventors: 博子矢永; 茄津矢永
Original assignee: Regenesis Science Co Ltd
Current assignee: Regenesis Science Co Ltd
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2025-06-11
Anticipated expiration: 2041-01-20
Also published as: CA3206324A1; JP2025124675A; AU2021421584A1; CN116323919A; EP4282953A4; AU2021421584A9; JP2022111482A; WO2022158152A1; US20240368550A1; EP4282953A1

Description

この発明は成熟軟骨細胞の製造方法に関する。

外科領域の手術では，骨・軟骨移植による再建術は数多く行われている。ドナーとして使用される部位は，頭蓋骨・肋骨・肋軟骨・腸骨などが使用されてきた。しかしながら，軟骨を大量に採取すればドナーの採骨後の機能的問題や変形が生じる可能性について拒むことはできない。複数回の再建手術を要する症例では，多くの採骨部の犠牲を伴う事が多い。また，採取量にも限界がある。

そこで，Vacantiらは動物の軟骨組織を酵素処理して得られた限られた数の軟骨細胞から軟骨を再生させるtissue engineering法を発明した。この方法は，軟骨細胞を人工的に合成された分解性ポリマーで作られた網の目構造の足場(scaffold)に播種し，足場に細胞が付着増殖して軟骨組織が再生されるという発明である[1,2]。しかし，軟骨組織が足場の中に軟骨が均一に生成されなかったため，臨床的に適用できる結果はいまだ得られていない。さらに，足場の合成ポリマーは，生体内で吸収されると炎症を誘発し，再生軟骨の吸収を引き起こすことがわかった[3-4]。後にVacantiらによって報告されたように，大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった。

Vacanti CA, Langer R, Schloo B, Vacanti JP. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg. 1991; 88:753－759 Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, Upton J, Vacanti CA. Transplantation of Chondrocytes Utilizing a Polymer-Cell Construct to Produce Tissue-Engineered Cartilage in the Shape of a Human Ear. Plast Reconstr Surg. 1997; 100: 297－302 Santavirta S, Konttinen YT, Saito T, et al. Immune response to polyglycolic acid implants. J Bone Joint Surg Br.1990; 72:597－600. Neidel J, Zeidler U. Independent effects of interleukin 1 on proteoglycan synthesis and proteoglycan breakdown of bovine articular cartilage in vitro. Agents Actions. 1993; 39:82－90. Vacanti CA. The history of tissue engineering. J Cell Mol Med 2006; 10: 569－576. Yanaga H., Imai K., Koga M., Yanaga K. Cell-engineered human elastic chondrocytes regenerate natural scaffold in vitro and neocartilage with neo-perichondrium in the human body post-transplantation. Tissue Eng. Part A. 2012; 18:2020－2029 Yanaga H., Imai K., Fujimoto T., Yanaga K. Generating ears from cultured autologous auricular chondrocytes by using two-stage implantation in treatment of microtia. Plast Reconstr Surg. 2009; 124:817－825

これまで培養軟骨細胞を移植しても，十分な量の大きさが得られないため，臨床応用することが難しかった。この発明は，移植に適した成熟軟骨細胞の製造方法を提供することを目的とする。

この明細書に記載される最初の発明は，成熟軟骨細胞の製造方法に関する。この成熟軟骨細胞は，例えば後述するように軟骨再生術などに用いることができる。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。

軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨（微小軟骨）であってもよい。

軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，自己血清およびＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。

この明細書に記載される上記とは別の発明は，成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法に関する。
この方法は，
第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
成熟軟骨細胞と，軟骨養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。

軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨であってもよい。

軟骨培養工程は，例えば，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において軟骨を培養する工程を含む。軟骨培養工程は，初代培養と継代培養とで別の培地を用いてもよい。例えば，初代培養には，自己血清及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。また，例えば一定期間，軟骨又は成熟軟骨細胞を凍結保存後に培養する場合は，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地を用いてもよい。

馴化培地は，例えば，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦを含む。

成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物である。
成熟軟骨細胞含有組成物は，耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である。

この明細書に記載される上記とは別の発明は，血管再生促進剤の製造方法に関する。
血管再生促進剤は，管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含む。
そして，この方法は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む。

この発明によれば，移植に適した成熟軟骨細胞の製造方法を提供することができる。例えば，培養軟骨細胞と馴化培地（例えば成熟軟骨細胞の上清液）を移植時に同時に加えて移植することにより，軟骨周囲の血管再生を上げて，軟骨細胞移植の生着率を向上させ，移植軟骨の大きさを拡大し長期生存を可能にすることができる。このことにより移植された再生軟骨は血液と栄養素の供給が十分行われることにより，細胞死と壊死を抑制し，その後，形状と機能が保たれる。また，軟骨に栄養が供給されるため，大量の軟骨細胞が生着し，軟骨吸収が抑制され，これまで得られなかった大きな再生軟骨が得られるようになった。

培養軟骨細胞とその細胞が産生する上清液を移植時に同時に加えて，軟骨形成を促進し再生軟骨を大きく増大させて，移植を成功させることができる。軟骨細胞と上清液（condition medium）と共に移植すると軟骨周囲に血管新生が起こり高い移植率が達成できた。そこで，培養細胞からどんな因子があるかを確認したところ，幾つかの高濃度の血管誘導を起こすサイトカイン/ケモカインが特異的に見出された。成熟軟骨細胞とその成熟軟骨細胞が産生する血管形成を促進する特異的なサイトカイン/ケモカインの中で特にGRO,IL8, MCP-1,VEGFを含む上清液（CM: conditioned medium）を軟骨細胞に添加し，移植後の吸収を抑制し生着率を向上させることができる。

図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。図２は，培養成熟軟骨細胞を培養した際に得られた馴化培地（Conditioned Medium）に含まれるサイトカイン及びケモカインの分析結果を示す図面に代わるグラフである。図３は，移植1年後，腹部から採取された再生軟骨を示す図面に代わる写真である。図４は，病理組織学的解析の結果を示す図面に代わる写真である。図５は，継代における培養軟骨細胞のＶＥＧＦＲ２の変化を示す図面に代わる写真である。図６は，軟骨細胞の継代可能数とＰＤＬを示す図面に代わるグラフである。図７は，２０歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。図８は，６３歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。図９は，３７歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。図１０は，２９歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。

以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。

この明細書に記載される最初の発明は，成熟軟骨細胞の製造方法に関する。この成熟軟骨細胞は，例えば後述するように軟骨再生術などに用いることができる。
この成熟軟骨細胞の製造方法は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程を含む。
そして，第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。この培地は，自己血清およびＦＢＳのいずれか又は両方を含んでもよい。

軟骨の例は耳介軟骨である。軟骨は細断された軟骨（微小軟骨）であってもよい。軟骨を細断し，洗浄後，血液成分を除去されたものであってもよい。

この明細書に記載される上記とは別の発明は，成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法に関する。成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物である。成熟軟骨細胞含有組成物は，耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である。

軟骨培養工程
軟骨培養工程は，第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得るための工程である。軟骨培養工程は，採取した軟骨を（洗浄後）そのまま培養してもよい。また，軟骨培養工程は，裁断した微小軟骨を培養する工程であってもよいし，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程であってもよい。以下，細断ろ過した微小軟骨を培養する工程に基づいて説明する。

第１の培養用培地は，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である。この培地は，自己血清およびＦＢＳのいずれか又は両方を含んでもよい。第１の培養用培地は，自己血清，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地であるか，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地であることが好ましい。

培地には，基本培地に適宜必要な要素を添加すればよい。基本培地の例は，α－ＭＥＭ培地，イーグル基礎培地，及びＤＭＥＭである。試薬は，培地に用いる公知のものを適宜添加すればよい。試薬の例は，ウシ胎児血清（ＦＢＳ），ＨＣ（ヒドロコルチゾン），ＦＧＦ２，ＩＧＦ（インスリン様増殖因子），インスリン，ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ），ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン），ＬＩＦ（白血病阻害因子），ＴＧＦβ，ＢＭＰ，ステロイド，軟骨酸，大豆トリプシン阻害剤，アスコルビン酸，ヒアルロン酸，プロリン，デキサメタゾン，インスリン，トランスフェリン，亜セレン酸である。アスコルビン酸などを培地に添加する場合，２－リン酸塩など塩の形のものを添加してもよい。それぞれ培地に０．１ｎｇ／ｍＬ以上２０μｇ／ｍＬ以下（又は０．２ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下）となるように添加すればよい。これらは精製の程度や必要量に応じて適宜調整して添加すればよい。ＦＢＳにかえて，自己血清を添加してもよい。また，無血清培地をもちいてもよい。いずれにせよ培地には，ＨＣ（ヒドロコルチゾン），及びＦＧＦ－２を添加することが好ましい。

培養用培地の例はα－ＭＥＭ培地に１～１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）, ２０ｎｇ/ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下のヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, ５ｎｇ／ｍｌ以上２０ｎｇ／ｍｌ（又は５０ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものである。１～１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに又はこれと代えて，１～１０％自己血清を添加してもよい。これらの量は適宜調整してもよい。例えば，ＦＢＳ及び自己血清は，培地に０．１％～２０％含ませてもよい。

微小軟骨を通常の培養条件で培養・増殖させてもよい。細胞量は１０％前後から１００％コンフルエントな状態まで可能であり，また，１００％コンフルエントを超えるような高密度，重層状態での培養も可能である。移植後すぐに，あるいはしばらく静置した後，低酸素状態に移行させてもよい。低酸素培養は，例えば市販の窒素ガスなどを混合し，酸素分圧を低下させるタイプの低酸素インキュベーターを用いることもできるし，適当な空間に窒素ガスなどを吹き込んで酸素分圧を下げるなどして培養してもよい。

成熟軟骨細胞含有組成物取得工程
成熟軟骨細胞含有組成物取得工程は，成熟軟骨細胞と，軟骨培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞含有組成物を得るための工程である。成熟軟骨細胞含有組成物は，成熟軟骨細胞と培養上清を含むものであってもよい。

成熟軟骨細胞の好ましい例は，ケモカイン／サイトカインであるインターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦを，それぞれＩＬ－６よりも４倍以上発現する細胞である。ＩＬ－８，ＧＲＯ及びＭＣＰ－１のいずれか又は２種以上をＩＬ－６よりも１０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ－６よりも２０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ－６よりも２０倍以上発現するものであってもよい。このように血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，成熟軟骨細胞含有組成物は，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，移植に適している。この成熟軟骨細胞含有組成物は，特に移植を行う患者から採取した軟骨を含む物が好ましい。

成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＴＮＦ－αに比べて１０倍以上発現するものであり，ＴＮＦ－αに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ－αに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ－αに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。

成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＩＬ－１－βに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＬ－１－βに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ－１－βに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ－１－βに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。

成熟軟骨細胞の好ましい例は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１）,及びＶＥＧＦのいずれか又は２種以上を，ＩＮＦ－γに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＮＦ－γに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ－γに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ－γに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。

成熟軟骨細胞含有組成物は，目的に応じて適切な量の成熟軟骨細胞や馴化培地（又は培養上清）を含めばよい。また，この組成物は，通常の組成物と同様に必要な容器に収容し，必要に応じて利用できるようにすればよい。成熟軟骨細胞の量は，例えば，１回用途当たり１×１０^４細胞以上１×１０^１０細胞でもよいし，１回用途当たり１×１０^５細胞以上１×１０^８細胞でもよい。

培養上清を有効成分として含む剤は，例えば，特開２０１３－１８７５６号公報，特許第５１３９２９４号，及び特許第５５２６３２０号公報に開示されるとおり公知である。したがって，馴化培地を含む組成物を，公知の方法を用いて製造することができる。

成熟軟骨細胞の培養上清の例は，遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分である培養上清を，凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物，エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物，限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物，又はフィルターを用いて培養上清を固液分離して得られる処理物，もしくは，上述のような処理をする前の培養上清の原液である。また，例えば，本発明の成熟軟骨細胞を培養した上澄みを,遠心分離（例えば，１，０００×ｇ，１０分）した後，硫安（例えば，６５％飽和硫安）で分画し，沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い,シリンジフィルター（例えば，０．２μｍ）で濾過し，無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を，そのまま用いても，また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて，取り扱いやすい液量となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに,感染性病原体リスクの対策として,培養上清をウイルスクリアランスフィルターや紫外線照射により処理してもよい。成熟軟骨細胞含有組成物は，培養上清を１投与単位として１ｍＬ以上１，０００ｍＬ以下含むことが好ましく，さらに好ましくは，３０ｍＬ以上３００ｍＬ以下である。

培養軟骨細胞と馴化培地（例えば成熟軟骨細胞の上清液）を移植時に同時に加えて移植することにより，軟骨周囲の血管再生を上げて，軟骨細胞移植の生着率を向上させることにより再生軟骨を大きく増大させて，移植を成功させることができる。この組成物は，例えば，耳介形成，鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，漏斗胸の硬組織陥凹形成術に用いられる。

この明細書に記載される上記とは別の発明は，血管再生促進剤に関する。この血管再生促進剤は，例えば，上記したいずれかの成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法によって得られた成熟軟骨細胞含有組成物を含む。つまりこの血管再生促進剤は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物と同様である。血管再生促進剤は，例えば注射剤であってもよい。注射器内に，上記した成熟軟骨細胞含有組成物を含有させておき，必要に応じて患者の組織と混合し，患者の必要個所に移植すればよい。血管再生促進剤は，管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を含む。そして，この方法は，上記した成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含む。

１平方センチメートルの耳介軟骨を患者の耳の残骸から採取した。破片を細かく刻み，抗生物質を補充したリン酸緩衝生理食塩水（Ca-）でリンスした。次に，それらを0.3％コラゲナーゼ（Worthington Biochemical，Freehold，NJ）/ PBSで処理し，スターラーで37℃,4～6時間回転させた後，軟骨細胞を単離した。初代培養では軟骨細胞を1×10³ cells / cm²の細胞密度で播種し，10％自家血清，FGF－2（5～10ng / ml，FIBRAST（登録商標），Kaken Pharmaceuticals，東京）を添加したDMEM培地で初代培養した。継代培養では，軟骨細胞を175cm²培養フラスコあたり1×10³ cells / cm²で播種した。つぎに継代培養細胞を播種し，軟骨細胞およびCMを含む移植材料を最終産物(1 × 10⁷ cells / 1 cc CM)として得た。培地はHigh glucose-DME培地に５％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml Hydrocortisone, 10ng/ml Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した。培養条件は，5～10％炭酸ガス下で行った。初代培養12日目に2～3×10⁶ cellsの培養細胞を回収した．この細胞の一部を凍結し，他の細胞を4～5x10⁴/cm²の密度で播種し，14日間培養した．15日後にPBS(-)で３回洗浄し，2日間上記の培地成分からＦＢＳを除いた培地にて培養した。この培地を馴化培地（Conditioned Medium）として分析に用いた。

培地組成
培地はHigh glucose-DME培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した。培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った。図1は，実施例1の軟骨細胞の位相差顕微鏡写真を示す図面に代わる写真である。

抗体固体化磁気ビーズ法（Antibody－Immobilized Magnetic Beads法）で培養成熟軟骨細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った。馴化培地（Conditioned Medium）サンプルを１３，０００ G，4℃で5分間遠心して得られた上清を測定に使用した。馴化培地（Conditioned Medium）内の４０の標的タンパク質の濃度を，Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを使用して測定した。前処理されたサンプルをウェルあたり２５μLで使用し，測定を3回行った。標準液をマニュアルに基づいて1点追加し，5倍希釈系列を7点用意し，3回測定した。対象タンパク質40品目は，EGF，FGF－2，エオタキシン，TGF－α，G－CSF，Flt－3L，GM－CSF，フラクタルカイン，IFNα2, IFNγ, GRO, IL－10, MCP－3, IL－ 12P40, MDC, IL－12P70, PDGF－AA, IL－13, PDGF－AB ／ BB, IL－15, sCD40L, IL－17A, IL－1RA, IL－1α, IL－9, IL－1β, IL－2, IL－3, IL－4, IL－5, IL－6, IL－7, IL－8, IP－10, MCP－1, MIP－1α, MIP－1β, RANTES, TNFα, TNFβ, 及びVEGFであった。

Antibody-Immobilized Magnetic Beads法で培養成熟軟骨細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った．その結果を図２に示す。図２は，培養成熟軟骨細胞を培養した際に得られた馴化培地（Conditioned Medium）に含まれるサイトカイン及びケモカインの分析結果を示す図面に代わるグラフである。図２に示される通り，血管再生能の高いサイトカインであるIL-８,GRO, MCP-1が多量（ng/ml）に産生していることが証明された．一方，炎症を起こすTNF-αや炎症惹起力の強いIL-1-β，INF-γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された．

ヒトへの軟骨細胞移植（耳介再建のための軟骨形成）
[症例 1]：22歳男性両側小耳症（外耳がない）および頬骨低形成のために培養軟骨による再建治療を行った。右遺残耳介軟骨より軟骨組織を15mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った培地はHigh glucose-DME培地に自家血清および５％ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン，ＦＧＦ２ 2を添加したものを使用した．初代培養11日目に4.3×10⁶cells ，初代培養13日目に2.2×10^7 cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150cm^2のフラスコ30枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を総量230cc (1 X 10⁷ cells / 1 cc CM)準備した。両側下腹部に培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物を注入移植し，移植後1年後に採取した再生軟骨を利用して両側耳介と頬骨を再建した。
図３は，移植1年後，腹部から採取された再生軟骨を示す図面に代わる写真である。図３において，再生軟骨の大きさは80x200x8mmであった。軟骨の割面は全層性に白い軟骨組織であった。

次に，軟骨が再生されたことを証明するために病理組織学的解析を行った。その結果を図４に示す。図４は，病理組織学的解析の結果を示す図面に代わる写真である。図４ＡはＨＥ染色の結果を示す。図４Ｂはトルイジンブルー染色の結果を示す。図４Ｃはアルシアンブルー染色の結果を示す。図４Ｄはエラスティカファンギーソン染色の結果を示す。図４Ａに示される通り，軟骨の周囲に軟骨膜が形成され，その中には血管腔が多数認められる。これは軟骨膜から軟骨へ栄養が供給されることが示されている。また,図４Ｂ～図４Ｄから，軟骨を特異的に染色する色素にそれぞれ染色されているので，軟骨が形成されていることがわかる。図４に示される通り，成熟した再生軟骨と再生軟骨膜が移植後に形成され，耳介起源由来弾性軟骨組織の形質と特性が維持されていることがわかる。

ヒトへの軟骨細胞移植：漏斗胸胸部陥凹再建
18歳男性に対し，漏斗胸術後胸部陥凹（正中剣状突起周辺～季肋部）残存を認めた。左耳介より軟骨組織を10mm×7mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養21日目に4.2×10⁶cells，初代培養23日目に3.3×10⁶cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ^２のフラスコ15枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は84mL1X10⁷ cells / 1ccCM）であった。移植後2年，軟骨は吸収されず，胸部の外貌形態は良好であった。

ヒトへの軟骨細胞移植：鼻部変形，頭蓋の陥凹変形
20歳女性，鞍鼻，短鼻，前額部の陥凹変形を認めたために前額部と鼻部に培養軟骨による再建治療を行った。左耳介より軟骨組織を10mm×15mm採取し，除菌して播種培養を行った。培地はHigh glucose-DME培地に自家血清, Hydrocortisone, Fibroblast Growth Factor 2を添加してものを使用した．初代培養18日目に1.1×10⁷ cellsの培養細胞を回収した。この培養細胞を一旦凍結保存した。移植前に，解凍した細胞を，底面積150ｃｍ^２のフラスコ7枚に40日間培養した。培養成熟軟骨細胞とcondition mediumの移植総量は27.3mL（1X10⁷ cells / 1ccCM）であった。移植後3年，軟骨は吸収されず，外貌形態は良好であった。

継代における培養軟骨細胞のVEGFR2 の変化
VEGFR2は，血管内皮細胞とその前駆細胞にしか発現しない。このためVEGFR2が初戦すれば，培養成熟軟骨細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を含む組成物は，血管を造成することがわかる。移植に用いたのはP2からP4の細胞である。VEGFR2はP1からP４まで全てにVEGFR2を発現する細胞が存在していた。このchondrocyteの培養系では，P1からP4まで全てにendothelium 系の細胞が含まれていることが明らかになった。したがって，この細胞系を移植すれば，軟骨組織と共に血管内皮細胞が出現し，その結果軟骨組織の周囲に血管網が構築され，移植後の軟骨組織の維持が期待できる。図５は，継代における培養軟骨細胞のVEGFR2 の変化を示す図面に代わる写真である。

次に，培養軟骨細胞の継代可能数を調べる目的で，軟骨細胞の継代可能数とPDLを計測した。腫瘍化した細胞では増殖が停止しないで，増殖し続けるという特性がある。今回作成した培養軟骨細胞の安全性を確認する目的で軟骨細胞のAgingの検査を行った。細胞を培養し，継代し続けて増殖が停止するかどうかをみる検査である。
４名の耳介軟骨細胞を３か月間培養して増殖停止するまでのPDL(CPD)を計測した。（何回分裂したかの意味）。その結果を図６に示す。図６は，軟骨細胞の継代可能数とPDLを示す図面に代わるグラフである。図６に示されるように，Agingによる増殖停止が起こっていることが確認された。
P14=total 84 day culture:縦軸CDL(=PDL). A(20歳,B（37歳,C（29歳,D（63歳）

細胞が老化すると老化関連β－ガラクトシダーゼ（SA－β－gal）の陽性染色を示すことから，細胞の老化を調べる４名の継代P13,P14の耳介軟骨細胞の老化関連酵素Senescence-associate galactosidae活性染色を行った結果, それぞれの段階で，Senescence-associate galactosidae活性染色を行ったその結果，増殖停止の前に上記酵素活性が出現したので，Agingによる増殖停止が起こっていることが確認された。Senescence-associate galactosidae活性染色にはSA X－ Gal staining Cellular Senescence Kit : OZBIOSCIENCES (Catalog Number:GXS0003)を使用した

図７は，20歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。
A. 20歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.8952 (P-12:2.5x10^5⇒4.65x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 92%陽性

図８は，６３歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１３）を示す図面に代わる写真である。
D.63歳女性軟骨細胞 (P-13にて増殖停止）
PDL=0.2388 (P-12:2.5x10^5⇒2.95x10^5/dish)
Total PDL: 27.6676 SA X- Gal: 95%陽性

図９は，３７歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。
B.37歳女性軟骨細胞
PDL=0.5109 (P-14:1x10^5⇒1.425x10^5/dish)
Total PDL: 44.0962 SA X- Gal: 100%陽性

図１０は，２９歳女性の培養成熟軟骨細胞（Ｐ＝１４）を示す図面に代わる写真である。
C.29歳女性軟骨細胞
PDL=0.2013 (P-14:1x10^5⇒1.15x10^5/dish)
Total PDL: 47.1421 SA X- Gal: 100%陽性

考察
再生軟骨の形成とその吸収を抑制するためには軟骨膜の形成が必要とされる。大量の細胞を含む人工軟骨構造は，通常，その成長と増殖のために高酸素環境を必要とする。したがって，軟骨が構造の中心まで形成されない場合，軟骨膜は形成されない [5]。したがって，それらの血液と栄養素の供給はかなり制限された。これは，細胞死と人工構築物の不可避の壊死を引き起こし，その後，形状と機能が失われることがわかった[6-8]。
他方，成熟軟骨細胞含有組成物は，血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，再生軟骨周囲に再生軟骨膜が形成されるので再生軟骨の移植に適している。軟骨の馴化培地はVEGFがIL6の7倍，GROがIL6の20倍，IL8はIL6の80倍，MCP-1はIL6の100倍を含む。TNF－αや炎症惹起力の強いIL－1－β，INF－γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された。また、Aging試験では増殖停止が起こることが確認されたので腫瘍化した細胞ではないことが確認され、安全であることも示された。

ＩＬ－８の血管形成能も文献（Ｍｉｋｕｌａ－Pietrasik J Kuczmarska A, Kucin´ska M. Muriaset M. al. Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL-8/CXCL8. Angiogenesis 2012; 15:361-376及び上記Keglowich1ら）で示されている。

ＭＣＰ－１は血管新生ケモカインとして報告され血管形成能も他の１つの文献（6.Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, and Kolattukudy PE.Monocyte Chemotactic Protein (MCP)-1 Promotes Angiogenesis via a Novel Transcription Factor, MCP-1-induced Protein (MCPIP). J Biol Chem2008 May 23;283(21): 14542-51.doi: 10.1074/jbc.M802139200）で示されている。また，ＭＣＰ－１がVEGFの血管形成能にmediateすることが文献（3.Hong KH, Ryu J, Han KH. Monocyte Chemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by Vascular Endothelial Growth factor-A. Blood 2005; 105:1405-1407 DOI:10,1182/blood-2004-08-3178）で示されている。血管形成にはマクロファージの出動が必須であり，ＭＣＰ－１がそれを行う必須因子である。

したがって，実施例における培養軟骨細胞が分泌する馴化培地の中にあるものの４種のサイトカイン（ＭＣＰ－１, ＩＬ－８, ＧＲＯ,VEGF）全てに血管形成能があることが示された。

この発明は，医療機器の分野などで利用されうる。

Claims

第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
前記成熟軟骨細胞と，前記軟骨培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む，
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
第１の培養用培地は，
ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって、
前記成熟軟骨細胞含有組成物は，軟骨再生の為の移植に用いられる組成物であるか，
耳介形成，外耳道形成,鼻形成，下顎形成，頬骨の硬組織陥凹形成術，頭蓋の硬組織陥凹形成術，気管,漏斗胸などの硬組織陥凹形成術に用いられる組成物である，方法。
請求項１に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記軟骨培養工程は，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において前記軟骨を培養する工程を含む，
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法。
請求項１に記載の成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
前記馴化培地は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１），及びＶＥＧＦを含む，方法。
血管再生促進剤の製造方法であって，
第１の培養用培地を用いて軟骨を培養し，成熟軟骨細胞を得る軟骨培養工程と，
前記成熟軟骨細胞と，前記軟骨培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟軟骨細胞を含む組成物を得る成熟軟骨細胞含有組成物取得工程とを含む，
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法であって，
第１の培養用培地は，
ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ－２を含む培地である
成熟軟骨細胞含有組成物の製造方法により、
血管誘導因子と，ＶＥＧＦＲ２陽性細胞とを含む，成熟軟骨細胞含有組成物を製造する工程を含み、
前記血管再生促進剤は，前記成熟軟骨細胞含有組成物を含む，
方法。
請求項４に記載の方法であって，
前記軟骨培養工程は，２％以上１５％以下の炭酸ガス及び１％以上１０％以下の酸素ガスの環境下において前記軟骨を培養する工程を含む，
方法。
請求項４に記載の方法であって，
前記馴化培地は，インターロイキン８（ＩＬ－８），成長関連遺伝子（ＧＲＯ），単球走化性因子－１（ＭＣＰ－１），及びＶＥＧＦを含む，方法。