JP7694656B2

JP7694656B2 - 生物由来材料の製造方法

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Publication number: JP7694656B2
Application number: JP2023528805A
Authority: JP
Inventors: 壮輔今村; 和宏高谷
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp; NTT Inc USA
Current assignee: NTT Inc; NTT Inc USA
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2025-06-18
Anticipated expiration: 2041-06-15
Also published as: WO2022264266A1; US20240263128A1; JPWO2022264266A1

Description

本発明は、生物由来材料の製造方法に関する。

藻類の多くは、栄養素、例えば窒素が欠乏している環境下で、油脂及びデンプンなどの糖質の蓄積量を増加させる（非特許文献１）。藻類が産生する油脂は、例えば、バイオ燃料の原料として利用可能である。また、藻類が産生する糖質は、例えば、燃料添加剤、医薬品、化粧品及びプラスチック製品の原料として利用可能である。

藻類による油脂及び糖質の蓄積は、環境中の窒素を欠乏させなくても促進することができる。例えば、真核藻類である微細藻類が有しているＴＯＲ（target of rapamycin）キナーゼの活性を特異的に阻害するＴＯＲ阻害剤を使用することにより、藻類による油脂及び糖質の蓄積を促進することができる（非特許文献２及び３）。

Primitive red alga Cyanidioschyzon merolae accumulates storage glucan and triacylglycerol under nitrogen depletion. Mari Takusagawa, Yohei Nakajima, Takafumi Saito, Osami Misumi. J Gen Appl Microbiol. 2016 Jul 14;62(3):111-7. The target of rapamycin kinase affects biomass accumulation and cell cycle progression by altering carbon/nitrogen balance in synchronized Chlamydomonas reinhardtii cells. Jessica Juppner, Umarah Mubeen, Andrea Leisse, Camila Caldana, Andrew Wiszniewski, Dirk Steinhauser, Patrick Giavalisco. Plant J. 2018 Jan;93(2):355-376. TOR (target of rapamycin) is a key regulator of triacylglycerol accumulation in microalgae. Sousuke Imamura, Yasuko Kawase, Ikki Kobayashi, Mie Shimojima, Hiroyuki Ohta, Kan Tanaka. Plant Signal Behav. 2016;11(3):e1149285.

本発明は、光合成微生物を利用した生物由来材料の製造を低コストで実現可能とする技術を提供することを目的とする。

本発明の第１側面によると、ジメチル２－オキソグルタル酸を含んだ培地中で光合成微生物を培養することと、その後、前記光合成微生物が産生又は蓄積した物質を回収することとを含んだ生物由来材料の製造方法が提供される。

本発明の第２側面によると、培地中で光合成微生物を培養することと、その後、前記培地へジメチル２－オキソグルタル酸を添加して、この培地中で前記光合成微生物の培養を継続することと、その後、前記光合成微生物が産生又は蓄積した物質を回収することとを含んだ生物由来材料の製造方法が提供される。

本発明の第３側面によると、ジメチル２－オキソグルタル酸を含んだ、光合成微生物による物質の蓄積を促進するために使用する促進剤が提供される。

本発明によると、光合成微生物を利用した生物由来材料の製造を低コストで実現可能とする技術が提供される。

図１は、培地に促進剤を添加して培養した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した明視野画像。図２は、培地に促進剤を添加して培養し、油脂を染色した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した蛍光観察画像。図３は、培地に促進剤を添加せずに培養した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した明視野画像。図４は、培地に促進剤を添加せずに培養し、油脂を染色した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した蛍光観察画像。図５は、促進剤の添加がデンプンの蓄積量へ及ぼす影響の一例を示すグラフ。

以下に、本発明の実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、上記側面の何れかをより具体化したものである。以下に記載する事項は、単独で又は複数を組み合わせて、上記側面の各々に組み入れることができる。

本発明の一実施形態に係る生物由来材料の製造方法では、先ず、培地中で光合成微生物を培養する。この培養では、例えば二酸化炭素の存在下で、光合成微生物へ光を照射する。例えば、大気雰囲気下で光合成微生物へ太陽光を照射する。これにより、光合成微生物において光合成を生じさせるともに、光合成微生物を増殖させる。

光合成微生物は、例えば、酸素発生型の光合成を行う微生物である。光合成微生物は、例えば、真核藻類などの藻類である。藻類は、微細藻類であることが好ましい。ここで、「微細藻類」は、例えば、光合成真核生物であって、単細胞生物又はその群体である。微細藻類は、例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtti）及びボトリオコッカス（Botryococcus）などの単細胞緑藻、シアニディオシゾン（Cyanidioschyzon merolae）などの単細胞紅藻、又は、それらの群体である。光合成微生物は、真核生物でなくてもよい。光合成微生物は、原核生物、例えば、シアノバクテリアなどのバクテリアであってもよい。原核生物は、アーキアであってもよい。

培地には、光合成微生物の増殖及び光合成等に必要な全ての栄養素を十分な濃度で含んだものを使用する。培地は、例えば、液体培地である。

上記の培養は、例えば、懸濁培養である。上記の培養は、他の培養、例えば、担持体培養であってもよい。なお、担持体培養では、担持体上に光合成微生物のバイオフィルムを形成し、このバイオフィルムと培地とを接触させた状態で培養を行う。

次に、上記の培地へ、光合成微生物による物質の蓄積を促進するための促進剤を添加する。そして、この培地中で光合成微生物の培養を継続する。即ち、例えば二酸化炭素の存在下で、光合成微生物へ光を照射する。例えば、大気雰囲気下で光合成微生物へ太陽光を照射する。

上記の促進剤は、下記化学式（１）に示すジメチル２－オキソグルタル酸を含んでいる。ジメチル２－オキソグルタル酸は、光合成微生物の細胞増殖を停滞させ、これにより、光合成微生物が産生した物質の蓄積を促進する。

促進剤は、溶媒を更に含むことができる。この溶媒としては、例えば、光合成微生物の培養に使用する培地と同じ又はほぼ同様の組成を有する液体を用いることができる。ジメチル２－オキソグルタル酸を溶媒で希釈すると、例えば、ジメチル２－オキソグルタル酸を光合成微生物に対して均一に供給することが容易になる。

なお、ここで光合成微生物が産生及び蓄積する物質は、油脂、糖質、炭化水素、及びアミノ酸など様々である。光合成微生物が産生及び蓄積する物質は、光合成微生物の種類に応じて異なる。油脂は、例えば、トリアシルグリセロールなどの中性脂質である。炭化水素は、例えば、ボトリオコッセンである。また、糖質は、例えば、デンプン、又は、デンプンと他の１以上の糖質成分との組み合わせである。

促進剤を添加するタイミングは、例えば、光合成微生物と培地とを含んだ分散液の光透過率及び濁度、体積当たりの細胞数、光合成微生物の比増殖速度、及びそれらの変化率の何れかに基づいて決定する。一例によれば、促進剤を添加するタイミングは、分散液の光透過率及び濁度、体積当たりの細胞数、光合成微生物の比増殖速度、及びそれらの変化率の何れかと、予め定めておいた閾値とを対比することにより決定する。

培地への促進剤の添加は、促進剤を添加する直前における、体積当たりの光合成微生物の細胞数が１０００００乃至１００００００００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内となるように行うことが好ましく、体積当たりの光合成微生物の細胞数が１０００００００乃至１００００００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内となるように行うことがより好ましい。ここで、体積当たりの光合成微生物の細胞数は、光合成微生物と培地との合計体積に対する光合成微生物の細胞数の比である。

生物由来材料を効率的に製造するうえでは、光合成微生物の細胞数は或る程度多いことが望ましい。但し、光合成微生物が過剰に増殖すると、光が深部へ到達し難くなる。

促進剤は、培地と光合成微生物と促進剤とを含んだ混合液のジメチル２－オキソグルタル酸濃度が、０．００１乃至１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内となるように添加することが好ましく、０．５乃至５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内となるように添加することがより好ましい。この濃度を低くすると、光合成微生物における物質の蓄積を促進する効果が小さくなる。この濃度を高くすると、高コストになる。

促進剤を添加した後の培養期間は、光合成微生物の種類に応じて異なる。一般に、この培養期間は、３時間乃至１４日の範囲内とすることが好ましく、１２時間乃至７２時間の範囲内とすることがより好ましい。

その後、光合成微生物が産生又は蓄積した物質を回収する。光合成微生物が細胞内に蓄積した物質を回収する場合は、例えば、光合成微生物から疎水性物質を抽出して、疎水性物質を含んだ抽出物と、親水性物質を含んだ残渣とを得る。或いは、光合成微生物から親水性物質を抽出して、親水性物質を含んだ抽出物と、疎水性物質を含んだ残渣とを得る。光合成微生物が産生した物質のうち、細胞外へ放出したものを回収する場合は、この物質は、例えば培地から回収する。ここでは、一例として、光合成微生物から油脂又は糖質を取得する方法について説明する。

例えば、先ず、光合成微生物を培地から分離する。懸濁培養を行った場合は、例えば、遠心分離や圧搾によって、光合成微生物と培地との混合液から培地の少なくとも一部を除去する。これにより、先の混合液と比較して光合成微生物をより高い濃度で含んだ濃縮物を得る。次に、濃縮物を乾燥させて、光合成微生物からなる乾燥物を得る。

次に、光合成微生物からなる乾燥物から、油脂を抽出する。油脂の抽出には、抽出媒体として有機溶剤を使用する。これにより、油脂を含んだ抽出物を得るとともに、糖質を含んだ残渣を得る。

油脂を製造する場合は、その後、必要に応じて、抽出物に対して精製を行う。この精製物は、改質してもよい。以上のようにして、光合成微生物から油脂を得る。このようにして得られた油脂は、例えば、バイオ燃料又はその原料として利用可能である。

糖質を製造する場合は、例えば、上記の残渣から糖質を抽出する。デンプンなどの多糖類を抽出する場合には、抽出媒体として、例えば水を使用する。次に、必要に応じて、この抽出物に対して精製を行う。この精製物は、改質してもよい。以上のようにして、光合成微生物から糖質を得る。この糖質は、例えば、燃料添加剤、医薬品、化粧品及びプラスチック製品の原料として利用可能である。

例えば、このような方法により、油脂、糖質、又はその精製物若しくは改質物を得ることができる。また、これと同様の方法により、光合成微生物に蓄積された、炭化水素及びアミノ酸などの他の物質、又はその精製物若しくは改質物を得ることができる。

なお、このようにして取得した、光合成微生物が産生若しくは蓄積した物質、この物質に対して精製及び改質等の後処理を行うことによって得られた物質、又は、それらを原料として得られた物質は、生物由来材料である。生物由来材料は、例えば、バイオ燃料、燃料添加剤、医薬品、サプリメント、生理活性物質、食品、化粧品、及びプラスチック製品などの物品である。或いは、生物由来材料は、上記物品の１以上の成分又は原料である。

上記の通り、光合成微生物による物質の蓄積は、環境中の窒素を欠乏させることにより促進することができる。しかしながら、全ての栄養素が十分に存在している環境から、特定の栄養素が欠乏している環境へ変化させるには、例えば、光合成微生物の培養に使用する培地を、全ての栄養素が十分に存在しているものから、特定の栄養素が欠乏しているものへ交換する必要がある。光合成微生物の培養に使用する培地を交換するには、遠心分離装置などを用いて光合成微生物を回収する必要がある。それ故、光合成微生物を用いた生物由来材料の生産をラージスケールで行うには、多くのエネルギー、時間、及び手間が必要である。

ＴＯＲ阻害剤を使用した場合、全ての栄養素が十分に存在している環境から特定の栄養素が欠乏している環境へ変化させるための培地交換は不要である。しかしながら、ＴＯＲ阻害剤は高価である。

上述した方法では、培地へ促進剤を添加することにより、光合成微生物の細胞増殖を停滞させ、これにより、光合成微生物における物質の蓄積を促進する。即ち、この方法では、全ての栄養素が十分に存在している環境から、特定の栄養素が欠乏している環境へ変化させるための培地交換は不要である。

また、この方法で使用する促進剤は、有効成分としてジメチル２－オキソグルタル酸を含んでいる。ジメチル２－オキソグルタル酸は、ＴＯＲ阻害剤と比較して遥かに安価である。

従って、この方法によると、光合成微生物を利用した生物由来材料の製造を低コストで実現することができる。

また、ＴＯＲ阻害剤は、あらゆる光合成微生物に対して効果を奏する訳ではない。これに対し、ジメチル２－オキソグルタル酸は、下記化学式（２）に示す２－オキソグルタル酸の派生物である。２－オキソグルタル酸は、全ての生物に共通する代謝物である。それ故、ジメチル２－オキソグルタル酸を含んだ促進剤の添加について上述した効果は、あらゆる光合成微生物で奏し得る。

［試験］
以下に、本発明者らが行った試験について記載する。
（試験１）
明条件下で単細胞紅藻を懸濁培養し、これに促進剤を添加した。培地としては、ＭＡ２培地を使用した。単細胞紅藻としては、シアニディオシゾン（Cyanidioschyzon merolae）を使用した。促進剤としては、ジメチル２－オキソグルタル酸を使用した。促進剤は、ジメチル２－オキソグルタル酸の終濃度が２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。

促進剤の添加後、培養を更に２４時間継続した。その後、この培養後の単細胞紅藻について、顕微鏡を用いて明視野画像を取得した。また、この単細胞紅藻の油脂を、コスモ・バイオ社から市販されているＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色した。そして、油脂を染色した単細胞紅藻について、蛍光顕微鏡を用いて蛍光観察画像を取得した。

また、促進剤を添加しなかったこと以外は上記と同様の培養を行った。そして、この培養後の単細胞紅藻についても、明視野画像の取得と、油脂の染色及び蛍光観察画像の取得とを行った。

図１は、培地に促進剤を添加して培養した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した明視野画像である。図２は、培地に促進剤を添加して培養し、油脂を染色した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した蛍光観察画像である。図３は、培地に促進剤を添加せずに培養した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した明視野画像である。図４は、培地に促進剤を添加せずに培養し、油脂を染色した単細胞紅藻について顕微鏡を用いて取得した蛍光観察画像である。

促進剤を添加せずに培養した単細胞紅藻については、図４に示すように、染色による蛍光は殆ど確認できなかった。これに対し、促進剤を添加して培養した単細胞紅藻については、図２に示すように、染色によって強く蛍光を発している領域（矢印で示す領域）を確認できた。即ち、促進剤の添加により、油脂の蓄積が大幅に促進されることを確認できた。

（試験２）
試験１と同様の培養を行い、培養後の単細胞紅藻が含んでいるデンプンの量を測定した。結果を図５に示す。

図５は、促進剤の添加がデンプンの蓄積量へ及ぼす影響の一例を示すグラフである。図５には、３回の独立した試験結果の平均値と、標準偏差とを示している。また、図５において、「コントロール」は、培地に促進剤を添加せずに培養した単細胞紅藻について得られた結果を示している。そして、「ジメチル２－ＯＧ」は、培地に促進剤を添加して培養した単細胞紅藻について得られた結果を示している。

図５に示すように、促進剤を添加して培養した単細胞紅藻では、促進剤を添加せずに培養した単細胞紅藻と比較して、デンプンの蓄積量が有意に多い。この結果から、促進剤の添加により、デンプンの蓄積が大幅に促進されることを確認できた。

Claims

ジメチル２－オキソグルタル酸を含んだ培地中で光合成微生物を培養することと、
その後、前記光合成微生物が産生又は蓄積した物質を回収することと
を含み、前記光合成微生物は単細胞紅藻を含み、前記物質は油脂及びデンプンの少なくとも一方を含んだ生物由来材料の製造方法。
培地中で光合成微生物を培養することと、
その後、前記培地へジメチル２－オキソグルタル酸を添加して、この培地中で前記光合成微生物の培養を継続することと、
その後、前記光合成微生物が産生又は蓄積した物質を回収することと
を含み、前記光合成微生物は単細胞紅藻を含み、前記物質は油脂及びデンプンの少なくとも一方を含んだ生物由来材料の製造方法。
前記培地へジメチル２－オキソグルタル酸を添加する直前における、体積当たりの前記光合成微生物の細胞数を１０００００乃至１００００００００００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内とする請求項２に記載の生物由来材料の製造方法。
ジメチル２－オキソグルタル酸濃度を０．００１乃至１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の生物由来材料の製造方法。
前記物質を回収することは、前記光合成微生物から疎水性物質及び親水性物質の一方を抽出して、抽出物と残渣とを得ることを含んだ請求項１乃至４の何れか１項に記載の生物由来材料の製造方法。
ジメチル２－オキソグルタル酸を含んだ、光合成微生物による物質の蓄積を促進するために使用する促進剤であって、前記光合成微生物は単細胞紅藻を含み、前記物質は油脂及びデンプンを含んだ促進剤。