JP7695877B2 - 最適化抗ｃｄ３二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

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本出願は、２０１６年９月２２日に作成され、２６４，４１８バイトを含むファイル１０１５１ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を、参照により組み込む。

本発明は、ＣＤ３抗原及び腫瘍関連抗原等のエフェクター抗原を標的化する二重特異性抗体、ならびに腫瘍死滅の方法に関する。本発明は、腫瘍組織量を低減または消失させ、腫瘍免疫治療に関連し得る毒性副作用を制御する方法に関する。本発明は、弱い親和性で、または検出可能な結合親和性を示さずにエフェクター抗原に結合するエフェクターアーム、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性結合アッセイにおいて約５００ｎＭ超のＫ_ＤでＣＤ３に結合する抗ＣＤ３抗原結合アームを含む二重特異性抗体を提供する。

特にがん免疫治療における治療的二重特異性抗体（ｂｓＡｂｓ）の将来性は、望ましくない標的保持細胞または生物に対するより安定な自然免疫反応を惹起するために、複数の抗原標的にわたることを目指している。

現在、再指向溶解を媒介するために、ｂｓＡｂは、標的細胞をＴ細胞等のエフェクター細胞上の誘発分子に直接クラスタ化しなければならないことが十分に確立されている。ｂｓＡｂ設計において、考慮しなければならない多くの因子があり、例えばサイズ及び組成は、生体内分布及びｉｎ ｖｉｖｏでの安定性に影響する（非特許文献１；非特許文献２）。区別可能な転帰は、反応するように誘発されているＴ細胞サブセット、及び刺激されているＴ細胞の状態に依存して、予測が困難である。ｂｓＡｂｓは、一貫した結果を示さないことが周知である（非特許文献３）。例えば、適切なサイトカイン産生がない場合、ＣＤ３架橋はＴ細胞におけるアポトーシス反応を誘引し得る（非特許文献４）。Ｔ細胞のサブセット及びそのような動員されたＴ細胞、例えばナイーブＴ細胞の分化状態は、有効性に重要であるが、これは、ナイーブＴ細胞が予備活性化（例えば、ＩＬ－２の存在下でのＴＣＲとの架橋）なしでは標的細胞を溶解することができないためである。

ある特定の二重特異性治療は成功しているが、多くのがん治療と同様に、代償を伴う。毒性は、がん治療のうちの失敗の主な原因である。いわゆる化学治療薬の毒性が、患者の副作用及び二次的弊害の主な原因であることは周知である。「細胞死滅」作用自体が、患者に対する問題を伴う。過剰の細胞毒性反応は、エフェクター細胞、例えばＴ細胞、及びがん標的細胞の活性化により誘引され得るが、腫瘍免疫治療においてどの種類の反応が最も有益であるかは今のところ不明である。有効性及び所望の薬物動態（ＰＫ）特性を維持しながら低減された副作用を有する、二重特異性治療における使用のための抗ＣＤ３抗体を特定する方法が有利となるだろう。

親和性成熟化等の技術が説明されており、これは、構造／活性関係（ＳＡＲ）に基づいて、出発抗体と比較して標的抗原に対する増加及び改善された結合特異性または親和性を有するように抗体を最適化するために、突然変異生成を利用する（例えば、２０１１年５月１２日に公開された特許文献１を参照されたい）。様々な程度でＣＤ３に結合及びそれと相互作用しながら、それでも中程度から高程度のＴ細胞活性化を示すことができる改質ＯＫＴ３抗体が説明されている（特許文献２）。しかしながら、抗体分子の結合親和性を結合の検出レベル付近またはそれを超えるレベルまで低減する方法は説明されておらず、また腫瘍減少または抑制に必要な有効性が示されていない。

したがって、制御された細胞毒性及びより良好なＰＫ特性を有する代替の二重特異性抗原結合分子が必要とされている。そのようながん治療は、治療の現場において極めて有用となるだろう。

ＷＯ２０１１／０５６９９７ ＵＳ７８２０１６６

Ｓｅｇａｌ，ＤＭ，Ｗｅｉｎｅｒ，ＧＪ，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，ＬＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１１：５５８－５６２ Ｃｈａｍｅｓ，Ｐ．ａｎｄ Ｂａｔｙ，Ｄ．ＭＡｂｓ．２００９，１（６）：５３９－５４７ Ｍａｎｚｋｅ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９７，４５：１９８－２０２ Ｎｏｅｌ ＰＪ，Ｂｏｉｓｅ ＬＨ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＴＬＡ４．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９６，４０６：２０９－２１７

第１の態様において、本発明は、ヒト及び／またはカニクイザルＣＤ３に対する弱い親和性を有する、または検出可能な親和性を有しない、ヒトＣＤ３に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。本発明のこの態様による抗体は、なかでも、例えばＴ細胞媒介死滅が有益または望ましい状況下でのＣＤ３を発現するＴ細胞の標的化、及びＴ細胞活性化の刺激に有用である。本発明の抗ＣＤ３抗体、またはその抗原結合部分は、ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を腫瘍細胞等の特定の細胞型または感染因子に指向させる二重特異性抗体の一部として含まれてもよい。

本発明の例示的な抗ＣＤ３抗体は、本明細書の表２及び３に列挙されている。表２は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を記載している。表３は、例示的抗ＣＤ３抗体のＨＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域をコードする核酸分子の配列識別子を記載している。表４及び５は、例示的抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、ならびに相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を記載している。

本発明は、表２に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表４に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列、あるいは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる既知の、もしくは公知の軽鎖可変領域から得られる、共通の軽鎖のいずれかと対形成された表２に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を
含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表４に列挙された例示的軽鎖可変領域と対形成された表２に列挙された例示的抗ＣＤ３抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号：１０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２）；１８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３）；２６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ４）；３４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）；４２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ８）；５０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ９）；５８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１０）；６６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１１）；７４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１２）；８２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１３）；９０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１４）；９８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１５）；１０６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１６）；１１４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１７）；１２２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１８）；１３０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１９）；１３８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０）；及び１４６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２１）からなる群から選択される。

本発明はまた、表２に列挙されるＨＣＶＲ１アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、配列番号１７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表２に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、配列番号１７９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表２に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、配列番号１８０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列、または少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明はまた、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明はまた、表４に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成された表２に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表２に列挙された例示的抗ＣＤ３抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号：１６／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２）；２４／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３）；３２／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ４）；４０／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）；４８／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ８）；５６／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ９）；６４／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１０）；７２／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１１）；８０／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１２）；８８／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１３）；９６／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１４）；１０４／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１５）；１１２／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１６）；１２０／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１７）；１２８／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１８）；１３６／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１９）；１４４／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０）；及び１５２／１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２１）からなる群から選択される。

本発明はまた、表２及び４に列挙された例示的抗ＣＤ３抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号：１２－１４－１６－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２）；２０－２２－２４－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３）；２８－３０－３２－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ４）；３６－３８－４０－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）；４４－４６－４８－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ８）；５２－５４－５６－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ９）；６０－６２－６４－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１０）；６８－７０－７２－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１１）；７６－７８－８０－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１２）；８４－８６－８８－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１３）；９２－９４－９６－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１４）；１００－１０２－１０４－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１５）；１０８－１１０－１１２－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１６）；１１６－１１８－１２０－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１７）；１２４－１２６－１２８－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１８）；１３２－１３４－１３６－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１９）；１４０－１４２－１４４－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０）；及び１４８－１５０－１５２－１６４－１６６－１６８（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２１）からなる群から選択される。

関連する実施形態において、本発明は、表２及び４に列挙された例示的抗ＣＤ３抗体の
いずれかにより定義されるようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有される６つのＣＤＲの組（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号：１０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２）；１８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３）；２６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ４）；３４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）；４２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ８）；５０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ９）；５８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１０）；６６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１１）；７４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１２）；８２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１３）；９０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１４）；９８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１５）；１０６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１６）；１１４／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１７）；１２２／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１８）；１３０／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１９）；１３８／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０）；及び１４６／１６２（例えばＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２１）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合断片を含む。

ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法及び技術は、当技術分野において周知であり、本明細書において開示される特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を特定するために使用され得る例示的な規則は、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、及びＡｂＭの定義を含む。一般的には、Ｋａｂａｔの定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の場所に基づき、ＡｂＭの定義は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの手法の間の折衷方式である。例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を特定するために、公開データベースもまた利用可能である。

本発明はまた、抗ＣＤ３抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表３に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態において、核酸分子は、表３に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列；あるいは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られるＬＣＶＲのいずれかをコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、核酸分子は、表５に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表２に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態において、核酸分子は、表３に列挙されたＨＣＤＲ１核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから
選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表２に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態において、核酸分子は、表３に列挙されたＨＣＤＲ２核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表２に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態において、核酸分子は、表３に列挙されたＨＣＤＲ３核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列；あるいは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られるＬＣＤＲ１のいずれかをコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、核酸分子は、表５に列挙されたＬＣＤＲ１核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列；あるいは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られるＬＣＤＲ２のいずれかをコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、核酸分子は、表５に列挙されたＬＣＤＲ２核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、表４に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列；あるいは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られるＬＣＤＲ３のいずれかをコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、核酸分子は、表５に列挙されたＬＣＤＲ３核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表２に列挙された例示的抗ＣＤ３抗体のいずれかにより定義される通りである。

本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわちＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表４に記載の例示的な普遍的軽鎖抗体のいずれかにより定義される通りであり；または、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３は、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる。

本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、表２に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表４に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み；または、ＬＣＶＲは、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られる、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる。ある特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、及び、表５に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列、またはそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子は、完全ヒト配列であるか、またはヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる。

本発明はまた、抗ＣＤ３抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち表２または４に記載のようなＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。また、そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに、抗体または抗体断片の生成を許容する条件下で宿主細胞を培養し、そのようにして生成された抗体及び抗体断片を回収することにより抗体またはその一部を生成する方法が、本発明の範囲内に含まれる。

本発明は、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＴＡＡ抗体、ならびに改質されたグリコシル化パターンを有する二重特異性抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ抗体を含む。いくつかの実施形態において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改質、または、例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分欠失抗体が有用となり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２） ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の用途において、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改質するために、ガラクトシル化の改質が行われてもよい。

一態様において、本発明は、ｉ）エフェクター細胞に特異的に結合することができない、及びｉｉ）標的腫瘍細胞に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む細胞毒性組成物を提供し、特異的結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて測定される。ある特定の実施形態において、本発明は、エフェクター細胞に対する検出可能な結合を示さない、及び測定可能な結合親和性で標的腫瘍細胞に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む細胞毒性組成物を提供し、結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて測定される。

他の実施形態において、本発明は、ｉ）ＣＤ３に対する検出可能な結合を示さない第１の抗原結合断片（Ｆａｂ１）、及びｉｉ）測定可能な結合親和性で標的腫瘍細胞に特異的に結合する第２の高原結合断片（Ｆａｂ２）を含む二重特異性抗原結合分子を含む細胞毒性組成物を提供し、結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて測定される。いくつかの場合において、結合親和性は、一価結合親和性である（例えば二重特異性抗体コンストラクトにおいて）。

別の態様において、本発明は、弱い結合親和性でエフェクター細胞に特異的に結合する、例えば約１００ｎＭの、または約１００ｎＭ超のＥＣ_５０値を示す、及び、認識可能なＥＣ_５０値、または５０ｎＭ未満等の高親和性ＥＣ_５０値で標的腫瘍細胞に特異的に結合
する、二重特異性抗原結合分子を含む細胞毒性組成物を提供し、ＥＣ_５０結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイにおいて測定される。ある特定の実施形態において、本発明は、約５００ｎＭ超のＥＣ_５０値でエフェクター細胞に特異的に結合する、及び、認識可能なＥＣ_５０値、または５０ｎＭ未満等の高親和性ＥＣ_５０値で標的腫瘍細胞に特異的に結合する、二重特異性抗原結合分子を含む細胞毒性組成物を提供し、ＥＣ_５０結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイにおいて測定される。

いくつかの例において、二重特異性抗原結合分子は、約４０ｎＭ超、または約１００ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約３００ｎＭ超、約４００ｎＭ超、約５００ｎＭ超、または約１μＭ超（例えば一価結合に関連して）のＥＣ_５０値でヒトＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ１を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、高い親和性で、例えば約５０ｎＭ未満未満、約４０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満または約６ｎＭ未満（例えば一価結合に関連して）のＥＣ_５０値で標的腫瘍細胞に特異的に結合する第２の抗体から得られるＦａｂ２を含む。いくつかの場合において、Ｆａｂ１は、約４０ｎＭ超、または約１００ｎＭ超、約２００ｎＭ超、または約１μＭ超のＥＣ_５０値で、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３のそれぞれに特異的に結合する。いくつかの場合において、Ｆａｂ１は、弱い親和性で、または測定可能な親和性を示さずに、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３のそれぞれに特異的に結合する。

いくつかの実施形態において、標的腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ１（または二重特異性抗原結合分子）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイにおいて測定されるように、約１．３ｎＭ未満のＥＣ_５０値でのＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅を誘引する。

いくつかの用途において、Ｆａｂ１または二重特異性抗原結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて測定されるように、約１１ｎＭ超のＫ_Ｄ値でヒトＣＤ３に特異的に結合する。他の場合において、Ｆａｂ１または二重特異性抗原結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて測定されるように、約１５ｎＭ超、または約３０ｎＭ超、約６０ｎＭ超、約１２０ｎＭ超、または約３００ｎＭ超のＫ_Ｄ値でヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３のそれぞれに特異的に結合する。さらにいくつかの用途において、Ｆａｂ１または二重特異性抗原結合分子は、ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイ及びＦＡＣＳ結合アッセイのそれぞれにおいて測定されるように、ヒトＣＤ３に対する検出可能な結合を示さず、またｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイにおいて測定されるように、Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅を誘引する。

いくつかの用途において、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２または２０に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域を含む第１の重鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１の重鎖は、配列番号１４または５４に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域を含む。他の実施形態において、第１の重鎖は、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２８、配列番号１３６、配列番号１４４、または配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域を含む。他の用途において、第１の重鎖は、配列番号１７８－１７９－１８０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲを含む。他の実施形態において、第１の重鎖は、配列番号１７８のアミノ酸残基１～７を含むＣＤＲ１、配列番号１７９のアミノ酸残基１～７を含むＣＤＲ２、配列番号１８０のアミノ酸残基４～１１を含むＣＤＲ３を含む。

さらなる実施形態において、第１の重鎖は、ＦＲ１（配列番号１７４）、ＦＲ２（配列
番号１７５）、ＦＲ３（配列番号１７６）、及びＦＲ４（配列番号１７７）から選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインフレームワーク領域を含む。

本発明は、配列番号１０／１６２；１８／１６２；２６／１６２；３４／１６２；４２／１６２；５０／１６２；５８／１６２；６６／１６２；７４／１６２；８２／１６２；９０／１６２；９８／１６２；１０６／１６２；１１４／１６２；１２２／１６２；１３０／１６２；１３８／１６２；１４６／１６２からなる群から選択されるＦａｂ１ ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。

抗体、及び抗原結合断片、ならびにその二重特異性抗体は、生殖細胞系列配列と親抗体配列との間の差に基づいて親のアミノ酸残基を段階的に置き換えることにより作製された。本発明は、細胞毒性組成物を作製する方法であって、（ａ）高い親和性でＣＤ３に特異的に結合する、例えば約４０ｎＭ未満の結合親和性ＥＣ_５０値を示す第１の抗体から得られる第１の重鎖のアミノ酸配列を特定することと、（ｂ）第１の抗体の重鎖可変領域内の選択されたアミノ酸残基を改質して、改質抗体を生成することと、（ｃ）改質抗体を、標的腫瘍抗原に特異的に結合する第２の抗体から得られる第２の重鎖と対形成して、二重特異性抗体を生成することと、（ｄ）二重特異性抗体を結合親和性アッセイにおいて試験することと、ＣＤ３に対する結合親和性が約４０ｎＭ超、もしくは１００ｎＭ超、もしくは３００ｎＭ超、もしくは５００ｎＭ超のＥＣ_５０値を有する、または検出可能な結合がない場合、（ｅ）二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を調製することとを含む方法を提供する。選択された抗体の重鎖可変領域を改質して、弱い親和性を有する、または親和性を有しない抗原結合アームを設計しながらもエフェクター細胞を特異的に標的化することに加えて、本発明は、本明細書において、各結合アームの重鎖定常領域（例えばＣ_Ｈ３ドメイン）を改質して二重特異性抗体を調製及び単離する方法を提供する。

例示的な方法は、細胞毒性二重特異性抗体を生成する方法であって、（ａ）複数の種から、エフェクター細胞抗原と相互作用する第１のヒト抗体またはその抗原結合断片を特定することと；（ｂ）ヒト抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の生殖細胞系列アミノ酸残基を特定することと；（ｃ）第１のヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列を、対応する生殖細胞系列ＨＣＶＲのアミノ酸配列と比較することと；（ｄ）第１の抗体のＨＣＶＲの改質領域内のアミノ酸を特定することであって、第１の抗体内の改質領域は、生殖細胞系列ＨＣＶＲ内の同じ領域と比較して、単一アミノ酸残基の置換、欠失または付加による少なくとも１つのアミノ酸改質を示す、特定することと；（ｅ）それぞれＨＣＶＲの少なくとも１つの改質領域を含む複数の改質抗体を生成することと；（ｆ）複数の改質抗体のそれぞれを、エフェクター細胞抗原に対する一価親和性に関してスクリーニングすることと；（ｇ）第１の抗体と比較してエフェクター細胞抗原へのより弱い結合親和性を示す、または検出可能な結合親和性を示さない改質抗体を選択することと；（ｈ）選択された第１の抗体を腫瘍関連抗原と相互作用する第２の抗体と対形成し、細胞毒性二重特異性抗体を生成することとを含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する組み換えヒト二重特異性抗体またはその断片、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＣＤ３抗体及び第２の治療薬剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態において、第２の治療薬剤は、抗ＣＤ３抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＤ３抗体と有利に組み合わされ得る例示的な薬剤は、限定されることなく、ＣＤ３に結合する、及び／もしくはＣＤ３シグナル伝達を活性化する他の薬剤（他の抗体もしくはその抗原結合断片等を含む）、ならびに／またはＣＤ３に直接結合しないにもかかわらず、免疫細胞を活性化する、もしくは免疫細胞活性化を刺激する薬
剤を含む。本発明の抗ＣＤ３抗体を含む追加的な組み合わせ治療及び配合製剤は、本明細書の別の箇所で開示される。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ３抗体または抗体の抗原結合部分を使用してＴ細胞活性化を刺激するための治療方法を提供し、治療方法は、本発明の二重特異性抗体、またはその抗原結合断片を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。処置される障害は、腫瘍関連抗原に標的化された細胞毒性治療により改善、寛解、阻害または予防される任意の疾患または状態、例えばがんである。

別の態様によれば、本発明は、ＣＤ３及び標的抗原、特に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。

本発明はまた、ＴＡＡ発現に関連する、またはそれにより引き起こされる疾患または障害の処置のための医薬の製造における、本発明の抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子の使用を含む。本発明はまた、ＴＡＡ発現に関連する、またはそれにより引き起こされる疾患または障害の処置のための医薬の製造における、ＣＤ３発現エフェクター細胞に対する高い親和性を示す抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子と比較してＣＤ３発現エフェクター細胞に対する弱い親和性及び低減されたクリアランスを示す抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。

他の実施形態は、続く発明を実施するための形態を考察することにより明らかとなるだろう。

以下の抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のアミノ酸の列を示す図である：生殖細胞系列ｈＩｇＨＶ（配列番号１８１）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｐ（配列番号１５４）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ（配列番号２）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２（配列番号１０）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３（配列番号１８）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ４（配列番号２６）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５（配列番号３４）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ８（配列番号４２）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ９（配列番号５０）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１０（配列番号５８）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１１（配列番号６６）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１２（配列番号７４）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１３（配列番号８２）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１４（配列番号９０）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１５（配列番号９８）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１６（配列番号１０６）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１７（配列番号１１４）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１８（配列番号１２２）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ１９（配列番号１３０）；ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０（配列番号１３８）；及びＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２１（配列番号１４６）。各誘導ＨＣＶＲは、親抗体及び生殖細胞系列アミノ酸残基と比較され、四角形のボックスはＣＤＲ内の突然変異を指す。 図１－１の続き。 野生型マウス（図２Ａ）、ヒト化ＣＤ３マウス（図２Ｂ）及びヒト化ＭＵＣ１６×ＣＤ３マウス（図２Ｃ）における、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照抗体の単回０．４ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射後の血清中の全ＩｇＧの平均濃度を示す図である。 野生型マウス（図２Ａ）、ヒト化ＣＤ３マウス（図２Ｂ）及びヒト化ＭＵＣ１６×ＣＤ３マウス（図２Ｃ）における、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照抗体の単回０．４ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射後の血清中の全ＩｇＧの平均濃度を示す図である。 野生型マウス（図２Ａ）、ヒト化ＣＤ３マウス（図２Ｂ）及びヒト化ＭＵＣ１６×ＣＤ３マウス（図２Ｃ）における、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照抗体の単回０．４ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射後の血清中の全ＩｇＧの平均濃度を示す図である。

本発明を説明する前に、本発明は説明される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって方法及び条件は変動し得ることが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけを目的とし、限定を意図しないことが理解されるべきである。

別段に定義されていない限り、本明細書において使用されている技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において使用されるように、「約」という用語は、特定の列挙された数値を参照して使用される場合、その値が列挙された値から１％以内で変動し得ることを意味する。例えば、本明細書において使用される場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。

本明細書において説明されているのと同様または同等のいかなる方法及び材料も、本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料がここで説明される。

定義
「ＣＤ３」という表現は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞上に発現し、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－ゼータ、及びＣＤ３－ガンマの４つの受容体鎖のうちの２つの会合から形成されるホモ二量体またはヘテロ二量体からなる抗原を指す。ヒトＣＤ３－イプシロン（ｈＣＤ３ε）は、配列番号１６９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０７７６６．２）に記載のようなアミノ酸配列を含む。ヒトＣＤ３－デルタ（ｈＣＤ３δ）は、配列番号１７０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０４２３４．１）に記載のようなアミノ酸配列を含む。本明細書において、タンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種からのものであることが明示的に指定されない限り、各タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図する。したがって、「ＣＤ３」という表現は、非ヒト種からのもの、例えば「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」等であることが指定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。

「ＣＤ３に結合する抗体」または「抗ＣＤ３抗体」という語句は、単一ＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマまたはゼータ）を特異的に認識及びそれに会合する抗体及びその抗原結合断片、ならびに、２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、イプシロン／デルタ、イプシロン／ガンマ、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を特異的に認識及びそれに会合する抗体及びその抗原結合断片を含む。本発明の抗体及び抗原結合断片は、可溶性ＣＤ３、結合ＣＤ３及び／または細胞表面発現ＣＤ３に結合し得る。可溶性ＣＤ３は、天然ＣＤ３タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを有しないまたは別様に細胞膜に関連していない組み換えＣＤ３タンパク質変異体、例えば単量体及び二量体ＣＤ３コンストラクト等を含む。本発明は、弱い結合親和性で、または検出可能な結合親和性を示さずに、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に結合及びそれらを活性化する抗体を提供する。「検出可能な結合親和性を示さずにＣＤ３に結合する」とは、抗体及びまたは抗原結合断片のＣＤ３標的との相互作用が、既知の検出アッセイ、例えば本明細書に記載のようなＦＡＣＳ（細胞ベース）結合アッセイまたは本明細書に記載のような当技術分野において周知の表面プラズモン共鳴結合アッセイにより測定可能または検出可能でなくてもよいことを意味する。他の結合アッセイは、当技術分野において周知である。抗体及び
または抗原結合断片は、非常に弱いタンパク質－タンパク質生化学的相互作用によりＣＤ３標的を認識し得るが、相互作用がアッセイの検出限界を超えている、例えば測定値が決定され得ないため、特定のＫＤまたはＥＣ５０値の決定は測定され得ない。別の場合において、「検出可能な結合親和性を示さない」とは、Ｋ_Ｄ値に対応する抗体の親和性が、非特異性抗原、例えばＢＳＡ、カゼイン等の１０分の１以下である場合に決定される。「弱い結合親和性でＣＤ３に結合する」とは、結合親和性測定値が、アッセイの検出限界値である、もしくはそれより若干大きい、または、非特異性抗原に対する結合親和性に等しい相互作用を含む。

「細胞表面発現ＣＤ３」という表現は、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に曝露され、抗体の抗原結合部分に到達可能であるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞の表面上に発現する１つ以上のＣＤ３タンパク質を意味する。「細胞表面発現ＣＤ３」は、細胞の膜内の機能性Ｔ細胞受容体に関連して含有されるＣＤ３タンパク質を含む。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、デルタ／イプシロン、ガンマ／イプシロン、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）の一部として発現したＣＤ３タンパク質を含む。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現はまた、細胞の表面上に他のＣＤ３鎖型なしで単独で発現するＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロンまたはＣＤ３－ガンマ）を含む。「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常ＣＤ３タンパク質を発現する細胞の表面上に発現したＣＤ３タンパク質を含む、またはそれからなってもよい。代替として、「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常はその表面上にヒトＣＤ３を発現しないが、その表面上にＣＤ３を発現するように人工的に改変された細胞の表面上に発現したＣＤ３を含む、またはそれからなってもよい。

エフェクター細胞は、エフェクターＴ細胞（Ｔリンパ球）、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含む。エフェクター細胞はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球、形質細胞、またはＢ細胞（リンパ球）を含み得る。治療は、エフェクター細胞表面受容体、例えばＣＤ３（Ｔ細胞表面受容体）、ＣＤ２８（Ｔ細胞）、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）（ＮＫ細胞、活性化マクロファージ等）とのＩｇ相互作用により、過剰の細胞媒介免疫反応、またはエフェクター機能を媒介し得ることが理解される。続いて、これらの相互作用により、エフェクター機能、例えば細胞死滅、補体活性化、食作用及びオプソニン作用が誘発される。エフェクター細胞及び腫瘍標的細胞への結合は、腫瘍細胞死滅を伝播し、腫瘍またはがんと闘う内因性免疫機能を誘引する、価値のある効果的な免疫治療設計を可能にする。

「抗ＣＤ３抗体」という表現は、単一の特異性を有する一価抗体、ならびにＣＤ３に結合する第１のアーム及び第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗ＣＤ３アームは、本明細書における表２、３、４及び／または５に記載のようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＣＤ３二重特異性抗体の例は、本明細書の別の箇所で説明される。「抗原結合分子」という用語は、例えば二重特異性抗体を含む抗体及び抗体の抗原結合断片を含む。

「抗体」という用語は、特定の抗原（例えばＣＤ３）に特異的に結合する、またはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域
は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域と共に散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列した３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。本発明の異なる実施形態において、抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよく、または自然もしくは人工的に改質されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて決定され得る。

「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等という用語は、本明細書において使用される場合、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、任意の自然発生的な、酵素的に得られた、合成的な、または遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、任意の好適な標準的技術、例えばタンパク分解、または、抗体可変及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子改変技術を使用して、例えば完全抗体分子から得ることができる。そのようなＤＮＡは既知であり、及び／または例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えばファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であり、または合成されてもよい。例えば、１つ以上の可変及び／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置させるために、またはコドンを導入する、システイン残基を形成する、アミノ酸を改質、付加もしくは欠失させる等のため、ＤＮＡが配列決定されてもよく、また化学的にまたは分子生物学技術により操作されてもよい。

抗原結合断片の限定されない例は、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ´）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）または制限ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。他の改変された分子、例えばドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、本明細書において使用されるような「抗原結合断片」という表現に包含される。

抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であってもよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接する、またはインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_Ｌドメインに会合したＶ_Ｈドメインを有する抗原結合断片において、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、任意の好適な配置で互いに相対的に位置してもよい。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含有してもよい。代替として、抗体の抗原結合断片は、単量体Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを含有してもよい。

ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有してもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見ることができる可変及び定常ドメインの限定されない例示的構成は、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；及び（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌを含む。上で列挙された例示的構成のいずれかを含む可変及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変及び定常
ドメインは、互いに直接結合してもよく、または完全もしくは部分ヒンジもしくはリンカー領域により結合してもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子内の隣接する可変及び／または定常ドメイン間の柔軟性または半柔軟性の連結をもたらす、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれ超）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いに、及び／または１つ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインと非共有結合的に会合した（例えばジスルフィド結合（複数可）により）、上で列挙された可変及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。

完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書において開示される例示的な二重特異性抗体形式を含む任意の多重特異性抗体形式が、当技術分野において利用可能な慣例的技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片に関連した使用に適合され得る。

本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、それにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当技術分野において周知及び利用可能なアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び米国特許第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
９５：６５２－６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、補体を修復して細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択され得る。

本発明のある特定の実施形態において、本発明の抗ＣＤ３抗体（単一特異性または二重特異性）は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウス等の別の哺乳動物種の生殖細胞系列から得られたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことを意図しない。

「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段により調製、発現、形成または単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞内にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下でさらに説明される）、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（以下でさらに説明される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に導入される、動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、形成もしくは単離された抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態において
、そのような組み換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異生成（または、ヒトＩｇ配列に導入される動物が使用される場合は、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異生成）に供され、したがって、組み換え抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列から得られる、及びそれに関連するものの、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に必ずしも自然に存在するとは限らない配列である。

ヒト抗体は、ヒンジ異質性に関連する２つの形態で存在し得る。１つの形態において、免疫グロブリン分子は、約１５０～１６０ｋＤａの安定な４つの鎖コンストラクトを含み、二量体は、鎖間重鎖ジスルフィド結合により互いに保持されている。第２の形態において、二量体は、鎖間ジスルフィド結合により連結せず、共有結合した軽鎖及び重鎖で構成された約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後であっても分離が極めて困難であった。

様々な無傷ＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、これに限定されないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的な差に起因する。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで著しく低減し得る（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、例えば生成において所望の抗体形態の収率を改善するために望ましくなり得る、ヒンジＣ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域において１つ以上の突然変異を有する抗体を包含する。

本発明の抗体は、単離された抗体であってもよい。「単離された抗体」は、本明細書において使用される場合、その自然環境の少なくとも１つの成分から特定及び分離、ならびに／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が自然に存在する、もしくは自然に生成される組織もしくは細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的において「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組み換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

本発明はまた、ＣＤ３に結合する単一アーム抗体を含む。「単一アーム抗体」という語句は、単一抗体重鎖及び単一抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明の単一アーム抗体は、本明細書における表２に記載のようなＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定因子を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なるエリアに結合し得、また異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体構造または直線状であってもよい。立体構造エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸により生成される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基により生成されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含んでもよい。

「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、別の核酸（またはその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入または欠失と共に最適に整列された際に、以下で議論されるようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等の配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定されるように、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、及びより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子との実質的な同
一性を有する核酸分子は、ある特定の場合において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。

ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に同様」という用語は、２つのペプチド配列が、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムにより初期ギャップ重みを使用して最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。同様の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテート及びグルタメート、ならびに（７）硫黄含有側鎖であるシステイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタメート－アスパルテート、及びアスパラギン－グルタミンである。代替として、保存的な置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：１４４３－１４４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的」な置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。

配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改質に割り当てられた類似性の尺度を使用して、同様の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同性ポリペプチド等の密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するために初期パラメータと共に使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ
６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラムである、初期または推奨パラメータを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索配列との間の最善重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、上記参照）。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、初期パラメータを使用したコンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

生殖細胞系列突然変異
本明細書において開示される抗ＣＤ３抗体は、抗体が得られた対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域における１つ
以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含む。

本発明はまた、本明細書において開示されるアミノ酸配列のいずれかから得られる抗体及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が得られた生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に突然変異し（そのような配列変化は、本明細書において、集合的に「生殖細胞系列突然変異」と呼ばれる）、ＣＤ３抗原に対する弱い結合を有するか、または検出可能な結合を有しない。ＣＤ３を認識するいくつかのそのような例示的抗体は、本明細書の表２に記載されている。

さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系列突然変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異し、一方、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異する。一旦得られたら、１つ以上の生殖細胞系列突然変異を含有する抗体及び抗原結合断片は、１つ以上の所望の特性、例えば改善された結合特異性、弱いまたは低減された結合親和性、改善または向上した薬物動態特性、低減された免疫原性等に関して試験され得る。本開示の指針を考慮してこの一般的な様式で得られた抗体及び抗原結合断片は、本発明に包含される。

本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＣＤ３抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表２に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３抗体を含む。本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが得られた対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含む一方で、ＣＤ３抗原に対する所望の弱い結合から検出不可能な結合を維持または改善する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させず、すなわち、アミノ酸置換は、抗ＣＤ３結合分子の場合、所望の弱い結合親和性から検出不可能な結合親和性を維持または改善する。同様の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテート及びグルタメート、ならびに（７）硫黄含有側鎖であるシステイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタメート－アスパルテート、及びアスパラギン－グルタミンである。代替として、保存的な置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：１４４３－１４４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的」な置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。

本発明はまた、本明細書において開示されるＨＣＶＲ及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一のＨＣＶＲ及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合
ドメインを含む一方で、ＣＤ３抗原に対する所望の弱い親和性を維持または改善する抗原結合分子を含む。アミノ酸配列に言及する場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、２つのアミノ酸配列が、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムにより初期ギャップ重みを使用して最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。

配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改質に割り当てられた類似性の尺度を使用して、同様の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同性ポリペプチド等の密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するために初期パラメータと共に使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ
６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラムである、初期または推奨パラメータを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索配列との間の最善重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、上記参照）。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、初期パラメータを使用したコンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

一旦得られたら、１つ以上の生殖細胞系列突然変異を含有する抗原結合ドメインは、１つ以上のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを利用して、減少した結合親和性に関して試験された。特定の抗原を認識する抗体は、典型的には、抗原に対する高い（すなわち強い）結合親和性に関して試験することにより、その目的のためにスクリーニングされるが、本発明の抗体は、弱い結合を示すか、または検出可能な結合を示さない。この一般的な様式で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子もまた本発明に包含され、親和力駆動型腫瘍治療として有利であることが判明している。

予想外の利益、例えば改善された薬物動態特性及び患者への低い毒性が、本明細書に記載の方法から実現され得る。

抗体の結合特性
本明細書において使用される場合、抗体、免疫グロブリン、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質の、例えば所定の抗原、例えば細胞表面タンパク質またはその断片のいずれかへの結合に関連する「結合」という用語は、典型的には、最低２つの実体または分子構造間の相互作用または会合、例えば抗体－抗原相互作用を指す。

例えば、結合親和性は、典型的には、例えばＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により、リガンドとしての抗原、及び検体（もしくは抗リガンド）としての抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質を使用して決定される場合、約１０^－７Ｍ以下、例えば約１０^－８Ｍ以下、例えば約１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ
値に対応する。細胞ベース結合戦略、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイもまた慣例的に使用され、ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合及びＳＰＲ等の他の方法と良く相関している（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３－３１；Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１－２）：６８－７７）。

したがって、本発明の抗体または抗原結合タンパク質は、非特異性抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）に対する結合の親和性の少なくとも１０分の１であるＫ_Ｄ値に対応する親和性を有する、所定の抗原または細胞表面分子（ＣＤ３等の受容体）に結合し得る。本発明によれば、Ｋ_Ｄ値に対応する抗体の親和性が、非特異性抗原の１０分の１以下である場合、これは、検出不可能な結合とみなされ得るが、そのような抗体は、本発明の二重特異性抗体の生成のために第２の抗原結合アームと対形成されてもよい。

「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に結合する抗体もしくは抗体結合断片の解離平衡定数を指す。Ｋ_Ｄと結合親和性との間には反比例関係があり、したがって、Ｋ_Ｄ値がより小さいほど、親和性がより高い、すなわちより強い。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、したがってより小さいＫ_Ｄ値に関連し、逆に、「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、したがってより大きいＫ_Ｄ値に関連する。いくつかの状況において、特定の分子（例えば抗体）の別の相互作用パートナー分子（例えば抗原Ｙ）に対する結合親和性と比較した、その分子（例えば抗体）の相互作用パートナー分子（例えば抗原Ｘ）に対するより高い結合親和性（またはＫ_Ｄ）は、より大きいＫ_Ｄ値（より低い、またはより弱い親和性）をより小さいＫ_Ｄ（より高い、またはより強い親和性）で除すことにより決定される結合比として表現され得、例えば場合によっては５倍または１０倍大きい結合親和性として表現される。例えば、「低い親和性」は、より弱い結合相互作用を指す。いくつかの実施形態において、低い結合親和性は、約１ｎＭ超のＫ_Ｄ、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５超、または約４０ｎＭ超のＫ_Ｄに対応し、そのようなＫ_Ｄ結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイ、または同等の生体分子相互作用検知アッセイにおいて測定される。いくつかの実施形態において、低い結合親和性は、約１０ｎＭ超のＥＣ_５０、約１５ｎＭ超のＥＣ_５０、２０ｎＭのＥＣ_５０、約２５ｎＭ超のＥＣ_５０、３０ｎＭのＥＣ_５０、約３５ｎＭ超のＥＣ_５０、または約４０ｎＭ超のＥＣ_５０に対応し、そのようなＥＣ_５０結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイ、または同等の細胞ベース結合アッセイにおいて測定される。「弱い親和性」は、弱い結合相互作用を指す。いくつかの実施形態において、弱い結合親和性は、約１００ｎＭ超のＫ_ＤまたはＥＣ５０、約２００超、３００、または約５００ｎＭ超のＫ_ＤまたはＥＣ５０に対応し、そのようなＫ_Ｄ結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ表面プラズモン共鳴結合アッセイ、または同等の生体分子相互作用検知アッセイにおいて測定され、そのようなＥＣ５０結合親和性値は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＡＣＳ結合アッセイ、または一価結合を検出するための同等の細胞ベース相互作用検出アッセイにおいて測定される。検出可能な結合を示さないとは、２つの生体分子間、例えば、特に一価抗体結合アームとその標的抗原との間の親和性が、使用されているアッセイの検出限界を超えていることを意味する。

「ｋ_ｄ」（ｓｅｃ－１または１／ｓ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数、または抗体もしくは抗体結合断片の解離速度定数を指す。前記値はまた、ｋ_ｏｆｆ値とも呼ばれる。

「ｋ_ａ」（Ｍ－１×ｓｅｃ－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度定数、または抗体もしくは抗体結合断片の会合速度定数を指す。

「ｋ_Ａ」（Ｍ－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合平衡定数、または抗体もしくは抗体結合断片の会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋ_ａをｋ_ｄで除すことにより得られる。

「ＥＣ５０」または「ＥＣ_５０」という用語は、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の半分の反応を誘引する抗体の濃度を含む、最大半量有効濃度を指す。ＥＣ_５０は、本質的に、その最大効果の５０％が観察される抗体の濃度を表す。ある特定の実施形態において、ＥＣ_５０値は、例えばＦＡＣＳ結合アッセイにより決定されるように、ＣＤ３または腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する最大半量の結合を示す本発明の抗体の濃度に等しい。したがって、増加したＥＣ_５０値または最大半量有効濃度値では、低減された、またはより弱い結合が観察され、したがって、５００ｎＭのＥＣ_５０は、５０ｎＭのＥＣ_５０よりも弱い結合親和性を示す。

一実施形態において、減少した結合は、増加したＥＣ_５０抗体濃度として定義され得、これは、標的細胞の最大半量に対する結合を可能にする。

他の実験測定において、ＥＣ_５０値は、Ｔ細胞の細胞傷害活性による標的細胞の最大半量枯渇を惹起する本発明の抗体の濃度を表す。したがって、増加した細胞傷害活性（例えば、Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅）は、減少したＥＣ_５０、または最大半量有効濃度値で観察される。

二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、二重特異性または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープと組み合わせた１つのエフェクター分子、例えばＣＤ３に特異的であってもよく、または、２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ３抗体は、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質に結合してもよく、またはそれと共発現してもよい。例えば、抗体またはその断片が、１つ以上の他の分子実体、例えば別の抗体または抗体断片に機能的に結合し（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他により）、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生成し得る。

本明細書における「抗ＣＤ３抗体」という表現の使用は、単一特異性抗ＣＤ３抗体、ならびにＣＤ３結合アーム及び標的抗原に結合する第２のアームを含む二重特異性抗体の両方を含むことを意図する。したがって、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＣＤ３に結合し、免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に特異的である二重特異的抗体を含む。ＣＤ３二重特異性抗体の他方のアームが結合する標的抗原は、それに対して標的化免疫反応が望まれる細胞、組織、器官、微生物またはウイルスの上またはその付近に発現する任意の抗原であってもよい。ＣＤ３結合アームは、本明細書の表２に記載のようなＨＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。ある特定の実施形態において、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、ヒトＴ細胞活性化を誘引する。他の実施形態において、ＣＤ３結合アームは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、二重特異性または多重特異性抗体に関連して腫瘍関連抗原発現細胞死滅を誘引する。他の実施形態において、ＣＤ３結合アームは、ヒト及びカニクイザル（サル）ＣＤ３に弱く結合または会合するが、結合相互作用は、当技術分野において知られているｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより検出可能ではない。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ３結合アームは、ヒト及びカニクイザル（サル）ＣＤ３に結合または会合しないが、二重特異性分子はまだ腫瘍
関連細胞死滅を惹起する。

抗体の１つのアームがＣＤ３に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異性抗体に関連して、標的抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。特定の腫瘍関連抗原の限定されない例は、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えばＧＡＧＥ－１、－２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えばＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、及び－１２）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ならびにウロプラキン－３を含む。

本発明者は、本発明が、本発明に従って作製された弱い抗ＣＤ３結合アームを有する二重特異性抗体の数々の例を含むことを想定している。

ある特定の例示的実施形態によれば、本発明は、ＣＤ３及びＰＳＭＡに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書において、「抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ」、または「抗ＣＤ３×ＰＳＭＡ」、または「ＣＤ３×ＰＳＭＡ」二重特異性分子等と呼ばれ得る。「ＰＳＭＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、非ヒト種からのもの（例えば「マウスＰＳＭＡ」、「サルＰＳＭＡ」等）であることが指定されない限り、ヒトＰＳＭＡタンパク質を指す。

「ＰＳＭＡ」という用語は、葉酸加水分解酵素１（ＦＯＬＨ１）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ．Ｎｏ．Ｑ０４６０９；配列番号１７１）としても知られる前立腺特異的膜抗原を指す。ＰＳＭＡは、前立腺上皮細胞において高度に発現し、前立腺がんの細胞表面マーカーである内在性非剥離膜糖タンパク質である。

他の例示的実施形態によれば、本発明は、ＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書において、「抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ」、または「抗ＣＤ３×ＥＧＦＲｖＩＩＩ」、または「ＣＤ３×ＥＧＦＲｖＩＩＩ」二重特異性分子等と呼ばれ得る。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」という用語は、非ヒト種からのもの（例えば「マウスＥＧＦＲｖＩＩＩ」、「サルＥＧＦＲｖＩＩＩ」等）であることが指定されない限り、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を指す。

「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」という用語は、上皮成長因子受容体のクラスＩＩＩ変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ；配列番号１７２）を指し、これは膠芽腫において最も頻繁に見られるＥＧＦＲ変異体である（Ｂｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：８０１７－８０２２；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４２０７－４２１１；Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ
ａｌ．，１９９０，Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８１：７７３－７７９；Ｅｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４３０９－４３１３；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０－３１４８；及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１３８３－１３８７）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２～７の欠失を特徴とし、コード領域の８０１塩基対のインフレーム欠失、すなわち６～２７３アミノ酸残基の欠失（成熟ＥＧＦＲの残基数に基づく；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ００５３３を参照されたい）、及び融合接合部における新たなグリシンの生成をもたらす（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２３１－２２３８；Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０、上記参照，）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、非リガンド依存性の、弱いが構成的に活性なキナーゼ活性、及び向上した腫瘍原性を有することが示されている（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ９１：７７２７－７７３１；及びＢａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６：１２５１－１２５９）。膠芽腫に加えて、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、乳管及び乳管内癌（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０－３１４８）、非小細胞肺癌（Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ５３：３２１７－３２２０）、卵巣癌（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５５３６－５５３９）、前立腺がん（Ｏｌａｐａｄｅ－Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ
８２：１８６－１９４）、ならびに頭頸部の扁平上皮癌（Ｔｉｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７（１５）：５１９７－５２０４）において検出されている。

さらに他の例示的実施形態において、本発明は、ＣＤ３及びＭＵＣ１６に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書において、「抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６」、または「抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６」、または「ＣＤ３×ＭＵＣ１６」二重特異性分子等と呼ばれ得る。「ＭＵＣ１６」という用語は、非ヒト種からのもの（例えば「マウスＭＵＣ１６」、「サルＭＵＣ１６」等）であることが指定されない限り、ヒトＭＵＣ１６タンパク質を指す。

他にがん抗原１２５（ＣＡ－１２５）として知られるムチン１６（ＭＵＣ１６；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０７８９６６．２、配列番号１７３）は、ヒトにおけるＭＵＣ１６遺伝子によりコードされるムチンである。ムチンタンパク質のファミリーは、細胞外ドメインにおけるオリゴ糖への病原体結合による感染から体を保護し、細胞表面に到達する病原体形態を予防することが知られている。長年の間、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５の過剰発現が、卵巣がんの予後及び診断マーカーとして使用されている（Ｙｉｎ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２９），２７３７１－２７３７５；Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，ＴＪ，ｅｔ ａｌ，２００１，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２２（６），３４８－３６６；Ｌｅｇｇｉｅｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．３５（４），４３８－４４１）。ＭＵＣ１６は、ガレクチン－１（免疫抑制タンパク質）に結合し得るその高度にグリコシル化されたタンデム反復ドメインにより、腫瘍細胞を免疫系から保護することが示されている（Ｓｅｅｌｅｎｍｅｙｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１６（Ｐｔ ７）：１３０５－１８；Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，ＴＪ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２３（３），１５４－１６９）。ナチュラルキラー細胞及び単球は、高レベルのＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞を攻撃することができない。その通常の生理学的役割において、ＭＵＣ１６－ガラクチン相互作用は、細菌及びウイルス感染に対するバリアとして機能するが、ＭＵＣ１６は、腫瘍細胞に関連して免疫防御的であり、それによりがん細胞の細胞溶解
を防止すると考えられている（Ｆｅｌｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，１３：１２９）。したがって、ＭＵＣ１６は、免疫エフェクター細胞を活性化することにより卵巣がんを処置するために投与された免疫治療二重特異性抗体分子の望ましい標的である。

さらに他の例示的実施形態において、本発明は、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ２に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は、本明細書において、「抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２」、または「抗ＣＤ３×ＳＴＥＡＰ２」、または「ＣＤ３×ＳＴＥＡＰ２」二重特異性分子等と呼ばれ得る。「ＳＴＥＡＰ２」という用語は、非ヒト種からのもの（例えば「マウスＳＴＥＡＰ２」、「サルＳＴＥＡＰ２」等）であることが指定されない限り、ヒトＳＴＥＡＰ２タンパク質を指す。前立腺の６回膜貫通上皮抗原２（ＳＴＥＡＰ２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＮＦＴ２．３）は、ヒトの染色体領域７ｑ２１に位置するＳＴＥＡＰ２遺伝子によりコードされる４９０－アミノ酸タンパク質である。

腫瘍関連抗原に特異的に結合する上述の二重特異性抗原結合分子は、弱い結合親和性で、または検出可能な結合親和性を示さずにＣＤ３に結合する、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性結合アッセイにより測定されるように約１００ｎＭ、３００ｎＭまたは５００ｎＭ超のＫ_Ｄを示す抗ＣＤ３抗原結合分子を含む。

本明細書において使用される場合、「抗原結合分子」という表現は、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲ及び／もしくはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、またはそれらからなるタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。ある特定の実施形態において、抗原結合分子は、抗体または抗体の断片であり、それらの用語は本明細書の別の箇所で定義されている。

本明細書において使用される場合、「二重特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結語具ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１つ以上の追加のＣＤＲ及び／もしくはＦＲと組み合わせて特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明に関連して、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（例えばＣＤ３）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の異なる抗原（例えばＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＳＴＥＡＰ２）に特異的に結合する。

本発明のある特定の例示的実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１及び第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば二重特異性抗体）に関連して、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲには接頭辞「Ａ１」が付されてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲには接頭辞「Ａ２」が付されてもよい。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＡ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＡ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよい。

第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に接続されて、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成してもよい。代替として、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれ別個の多量体化ドメインに接続されてもよい。１つの多量体化ドメインの別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原
結合ドメイン間の会合を促進し、それにより二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書において使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同じまたは同様の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化成分の限定されない例は、免疫グロブリン（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む）のＦｃ部分、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。

本発明の二重特異性結合分子は、典型的には、それぞれ個々に別個の抗体重鎖の一部である２つの多量体化ドメイン、例えば２つのＦｃドメインを含む。第１及び第２の多量体化ドメインは、同じＩｇＧアイソタイプのもの、例えばＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４等であってもよい。代替として、第１及び第２の多量体化ドメインは、異なるＩｇＧアイソタイプのもの、例えばＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４等であってもよい。

ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含有するＦｃ断片、または長さが１～約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。他の実施形態において、多量体化ドメインは、システイン残基、または短鎖システイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインは、ロイシンジッパー、螺旋ループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含む、またはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドを含む。

本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために、任意の二重特異性抗体形式または技術が使用され得る。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはその断片が、１つ以上の他の分子実体、例えば第２の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体断片に機能的に結合し（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他により）、二重特異性抗原結合分子を生成し得る。本発明に関連して使用され得る特定の例示的二重特異性形式は、限定されることなく、例えば、ｓｃＦｖベースまたはジアボディ二重特異性形式、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブイントゥーホールを有する共通の軽鎖等）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）体、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ^２二重特異性形式を含む（上記形式を考察するには、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、及びそこで引用されている参考文献を参照されたい）。

本発明の二重特異性抗原結合分子に関連して、多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインは、野生型の自然発生的バージョンのＦｃドメインと比較して１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の改質された結合相互作用（例えば向上した、または低下した）を有する改質Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメインに１つ以上の改質を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、Ｃ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に改質を含み、改質は、酸性環境において（例えばｐＨが約５．５から約６．０の範囲であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのようなＦｃ改質の限定されない例は、例えば、２５０位（例えばＥもしくはＱ）；２５０及び４２８位（例えばＬもしくはＦ）；２５２位（例えばＬ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えばＳもしくはＴ）及び２５６位（例えばＳ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における改質；あるいは４２８及び／もしくは４３３位（例えばＬ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）ならびに／または４３４位（例えばＨ／ＦもしくはＹ）における改質；あるいは２５０及び
／または４２８位における改質；あるいは３０７または３０８位（例えば３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）及び４３４位における改質を含む。一実施形態において、改質は、４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）改質；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えばＶ２５９Ｉ）及び３０８Ｆ（例えばＶ３０８Ｆ）改質；４３３Ｋ（例えばＨ４３３Ｋ）及び４３４（例えば４３４Ｙ）改質；２５２、２５４、及び２５６（例えば２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）改質；２５０Ｑ及び４２８Ｌ改質（例えばＴ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７及び／または３０８改質（例えば３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

本発明はまた、第１のＣ_Ｈ３ドメイン及び第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１及び第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差は、アミノ酸の差を有しない二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａに対する二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態において、第１のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改質（ＩＭＧＴエクソン付番による；ＥＵ付番によるＨ４３５Ｒ）等のタンパク質Ａ結合を低減または無効化する突然変異を含有する。第２のＣ_Ｈ３は、さらにＹ９６Ｆ改質（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第２のＣ_Ｈ３内に見出すことができるさらなる改質は、ＩｇＧ１抗体の場合Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）を含む。

ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプから得られるキメラの組み合わせＦｃ配列であってもよい。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ２領域から得られるＣ_Ｈ２配列の一部または全て、ならびにヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のＣ_Ｈ３配列の一部または全てを含んでもよい。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含有してもよい。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から得られる「下部ヒンジ」配列と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から得られる「上部ヒンジ」配列を含んでもよい。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの具体例は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって、［ＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ ＣＨ３］を含む。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって、［ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらの、及び他の例は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年８月７日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１２１０８７Ａ１号に記載されている。これらの一般構造配置を有するキメラＦｃドメイン及びその変異体は、変更されたＦｃ受容体結合を有し得、これは一方でＦｃエフェクター機能に影響する。

ある特定の実施形態において、本発明は、重鎖定常領域（ＣＨ）領域が配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０または配列番号１９１のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖を提供する。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域（ＣＨ）領域は、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

他の実施形態において、本発明は、Ｆｃドメインが配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００または配列番号２０１のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖を提供する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

他のＦｃ変異体
本発明のある特定の実施形態によれば、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体結合を向上させる、または低下させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に突然変異を含む抗体を含み、突然変異（複数可）は、酸性環境において（例えばｐＨが約５．５から約６．０の範囲であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与された場合、抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ改質の限定されない例は、例えば、２５０位（例えばＥもしくはＱ）；２５０及び４２８位（例えばＬもしくはＦ）；２５２位（例えばＬ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えばＳもしくはＴ）及び２５６位（例えばＳ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における改質；あるいは４２８及び／もしくは４３３位（例えばＨ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）ならびに／または４３４位（例えばＨ／ＦもしくはＹ）における改質；あるいは２５０及び／または４２８位における改質；あるいは３０７または３０８位（例えば３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）及び４３４位における改質を含む。一実施形態において、改質は、４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）改質；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えばＶ２５９Ｉ）及び３０８Ｆ（例えばＶ３０８Ｆ）改質；４３３Ｋ（例えばＨ４３３Ｋ）及び４３４（例えば４３４Ｙ）改質；２５２、２５４、及び２５６（例えば２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）改質；２５０Ｑ及び４２８Ｌ改質（例えばＴ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７及び／または３０８改質（例えば３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

例えば、本発明は、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えばＴ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えばＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えばＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される突然変異の１つ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子を含む。上記のＦｃドメイン突然変異、及び本明細書において開示される抗体可変ドメイン内の他の突然変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内に企図される。

抗体及び二重特異性抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、ヒトＣＤ３及びヒトＴＡＡに同時に結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば二重特異性抗体）を含む。ある特定の実施形態によれば、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＭＵＣ１６等のＣＤ３及び／またはＴＡＡを発現する細胞と特異的に相互作用する。ＣＤ３を発現する細胞と相互作用す
る結合アームは、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて測定されるように、弱い結合から検出不可能な結合を有し得る。二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３及び／またはＴＡＡを発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例４に示されるように、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により評価され得る。

例えば、本発明は、ＣＤ３を発現するがＴＡＡを発現しないヒトＴ細胞株（例えばＪｕｒｋａｔ）、霊長類Ｔ細胞（例えばカニクイザル末梢血単核細胞［ＰＢＭＣ］）、及び／またはＴＡＡ発現細胞に特異的に結合する抗体、抗原結合断片、及びその二重特異性抗体を含む。本発明は、実施例４に記載のようなＦＡＣＳ結合アッセイまたは実質的に同様のアッセイを使用して決定されるように、約１．８×１０^－８（１８ｎＭ）から約２．１×１０^－７（２１０ｎＭ）以上のＥＣ_５０値（すなわちより弱い親和性）で上述のＴ細胞及びＴ細胞株のいずれかに結合する二重特異性抗原結合分子を含み、またＥＣ_５０が検出不能である二重特異性抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体、抗原結合断片、及び二重特異性抗体は、例えば本明細書の実施例４において定義されるようなアッセイ形式を使用したＦＡＣＳ結合により、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約３０ｎＭ超、約４０ｎＭ超、約４５ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約５５ｎＭ超、約６０ｎＭ超、約６５ｎＭ超、約７０ｎＭ超、約７５ｎＭ超、少なくとも８０ｎＭ、約９０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約１１０ｎＭ超、少なくとも１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ超、約１４０ｎＭ超、約１５０ｎＭ、少なくとも１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ超、約１８０ｎＭ超、約１９０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、約３００ｎＭ超、約５００ｎＭ超、約１μＭ超、約２μＭ超、もしくは約３μＭ超のＥＣ_５０で、または検出可能な結合親和性を示さずにＣＤ３に結合する。

本発明はまた、実施例４に記載のようなＦＡＣＳ結合アッセイ、または実質的に同様の細胞ベースアッセイを使用して決定されるように、約１００ｎＭ未満、または結合に必要なさらにより低い濃度（すなわちより強い親和性）で、例えば５．６ｎＭ（５．６×１０^－９）未満のＥＣ_５０値で、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＳＴＥＡＰ２及びＭＵＣ１６発現細胞株等のＴＡＡ発現細胞及び細胞株に結合する抗体、抗原結合断片、及びその二重特異性抗体を含む。本発明は、例えば上述のアッセイを使用して、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＥＣ_５０値で上述の腫瘍細胞株のいずれかに結合する二重特異性抗原結合分子を含む。

本発明は、低い親和性で、弱い親和性で、またはさらに検出可能な親和性を示さずにヒトＣＤ３に結合する、抗体、抗原結合断片、及びその二重特異性抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本発明は、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴により測定されるように、（約３７℃において）約１１ｎＭ超のＫ_ＤでヒトＣＤ３に結合する抗体及び抗体の抗原結合断片を含み、約１００ｎＭまたは５００ｎＭ超のＫ_ＤでＣＤ３に結合する抗体を含み、また検出可能な結合親和性有しない抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式（例えばｍＡｂ捕捉もしくは抗原捕捉形式）を使用した表面プラズモン共鳴により、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１５ｎＭ超、約２０ｎＭ超、約２５ｎＭ超、約３０ｎＭ超、約３５ｎＭ超、約４０ｎＭ超、約４５ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約５５ｎＭ超、約６０ｎＭ超、約６５ｎＭ超、約７０ｎＭ超、約７５ｎＭ超、少なくとも８０ｎＭ、約９０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約１１０ｎＭ超、少なくとも１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ超、約１４０ｎＭ超、約１５０ｎＭ、少なくとも１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ超、約１８０ｎＭ超、約１９０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、約３００ｎＭ超、約１μＭ超、約２μＭ超、もしくは約３μＭ超のＫ_Ｄで、または検出可能な親和性を示さずにＣＤ３に
結合する。

本発明は、低い親和性で、弱い親和性で、またはさらに検出可能な親和性を示さずにサル（すなわちカニクイザル）ＣＤ３に結合する、抗体、抗原結合断片、及びその二重特異性抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、本発明は、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴により測定されるように、（約３７℃において）約１０ｎＭ超のＫ_ＤでヒトＣＤ３に結合する抗体、抗原結合断片及びその二重特異性抗体を含み、約１００ｎＭまたは５００ｎＭ超のＫ_ＤでＣＤ３に結合する抗体を含み、また検出可能な結合親和性有しない抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式（例えばｍＡｂ捕捉もしくは抗原捕捉形式）を使用した表面プラズモン共鳴により、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１５ｎＭ超、約２０ｎＭ超、約２５ｎＭ超、約３０ｎＭ超、約３５ｎＭ超、約４０ｎＭ超、約４５ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約５５ｎＭ超、約６０ｎＭ超、約６５ｎＭ超、約７０ｎＭ超、約７５ｎＭ超、少なくとも８０ｎＭ、約９０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約１１０ｎＭ超、少なくとも１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ超、約１４０ｎＭ超、約１５０ｎＭ、少なくとも１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ超、約１８０ｎＭ超、約１９０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、約３００ｎＭ超、約１μＭ超、約２μＭ超、もしくは約３μＭ超のＫ_Ｄで、または検出可能な親和性を示さずにＣＤ３に結合する。

本発明は、ヒトＣＤ３に結合してＴ細胞活性化を誘引する、抗体、抗原結合断片、及びその二重特異性抗体を含む。例えば、本発明は、例えば本明細書の実施例６において定義されるようなアッセイ形式を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ［例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下での全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）からのパーセント活性化（ＣＤ６９＋）細胞の評価］、またはその活性化状態におけるＴ細胞を評価する実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１１３ｐＭ未満のＥＣ_５０値でヒトＴ細胞活性化を誘引する抗ＣＤ３抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書の実施例６において定義されるようなアッセイ形式を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１９ｐＭ未満、約１８ｐＭ未満、約１７ｐＭ未満、約１６ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１４ｐＭ未満、約１３ｐＭ未満、約１２ｐＭ未満、約１１ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約９ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約７ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＥＣ_５０値でヒトＴ細胞活性化［例えばパーセント活性化（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞］を誘引する。ＣＤ３への弱い結合を有する、または検出可能な結合を有しない抗ＣＤ３抗体は、本明細書の実施例６において例示されるように、ＣＤ３への弱い結合親和性を有する、または検出可能な結合親和性を有しないにもかかわらず、高い効力（すなわちｐＭ範囲）でＴ細胞活性化を誘引する能力を有する。

本発明はまた、ヒトＣＤ３に結合して腫瘍抗原発現細胞のＴ細胞媒介死滅を誘引する、抗体、抗原結合断片、及び二重特異性抗体を含む。例えば、本発明は、例えば本明細書の実施例６において定義されるようなアッセイ形式を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイ（例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下での、ヒトＰＢＭＣによる腫瘍抗原発現細胞、例えばＰＳＭＡ発現、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現もしくはＭＵＣ１６発現細胞死滅の評価）、または実質的に同様のアッセイにおいて測定されるように、約１．３ｎＭ未満のＥＣ_５０で腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を誘引する抗ＣＤ３抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例６において定義されるようなアッセイ形式を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイ、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１ｎＭ未満、約４００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未
満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約９ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約７ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、約２ｐＭ、または約１ｐＭ未満のＥＣ_５０値でＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅（例えばＯＶＣＡＲ３細胞のＰＢＭＣ媒介死滅）を誘引する。

本発明はまた、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式を使用した２５℃もしくは３７℃での表面プラズモン共鳴、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約１０分未満の解離半減期（ｔ１／２）でＣＤ３に結合する抗体、抗原結合断片、及び二重特異性抗体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例５において定義されるようなアッセイ形式（例えばｍＡｂ捕捉もしくは抗原捕捉形式）を使用した２５℃もしくは３７℃での表面プラズモン共鳴、または実質的に同様のアッセイにより測定されるように、約９分未満、約８分未満、約７分未満、約６分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満、約１．９分未満、または約１．８分未満のｔ１／２でＣＤ３に結合するか、または、非常に弱い結合を示す、もしくは検出可能な結合を示さない。

本発明の抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子は、追加的に、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＢＭＣ増殖を誘引すること；（ｂ）ヒト全血においてＩＦＮ－ガンマ放出及びＣＤ２５上方制御を誘引することによりＴ細胞を活性化すること；ならびに（ｃ）抗ＴＡＡ抵抗性細胞株に対するＴ細胞媒介細胞傷害を誘引することからなる群から選択される１つ以上の特徴を示し得る。

本発明は、対象における腫瘍抗原発現細胞を枯渇させることができる抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子を含む（例えば実施例７を参照されたい）。例えば、ある特定の実施形態によれば、対象への１μｇ、または１０μｇ、または１００μｇの二重特異性抗原結合分子の単回投与（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満の用量）が、対象における腫瘍抗原発現細胞の数の検出可能レベル未満への低減をもたらす（例えば、対象における腫瘍成長が抑制または阻害される）、抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６、または抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗原結合分子が提供される。ある特定の実施形態において、約０．４ｍｇ／ｋｇの用量での抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子の単回投与は、対象への二重特異性抗原結合分子の投与から約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日または約１日後までに、対象における腫瘍成長の検出可能レベル未満への低減をもたらす。ある特定の実施形態によれば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量での本発明の抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子の単回投与は、投与後少なくとも約７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、またはそれ超まで、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞の数を検出可能レベル未満に維持させる。本明細書において使用される場合、「検出可能レベル未満」という表現は、例えば本明細書の実施例７に記載のような標準的ノギス測定法を使用して、対象において皮下で成長する腫瘍細胞が直接的または間接的に検出され得ないことを意味する。ある特定の実施形態において、約１０μｇの用量での抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子の単回投与は、対象への二重特異性抗原結合分子の投与後約６日目に対象における腫瘍成長の抑制をもたらし、また少なくとも２６日目まで腫瘍抑制を維持する。腫瘍移植から少なくとも７日後に約１０μｇの用量で抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子の単回投与を受けた患者において、二重特異性抗原結合分子は、対象における腫瘍移植から約２６日目において、対象における樹立された腫瘍のさらなる成長を抑制する上で有効性を示す。ある特定の実施形態によれば、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇの用量での本発明の抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗原結合分子の単回投与は、二重特異性分子の投与後少なくとも約７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１
７日、１８日、１９日、２０日、またはそれ超の間、ＭＵＣ１６発現腫瘍細胞の成長を阻害する。例えば、実施例８を参照されたい。

ある特定の実施形態において、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．０１ｍｇ／ｋｇの用量での抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗原結合分子の単回投与は、対象への二重特異性抗原結合分子及び腫瘍の投与後少なくとも４６日目まで、腫瘍成長の抑制を維持する。ある特定の実施形態によれば、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、またはそれ未満の用量での本発明の抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗原結合分子の単回投与は、二重特異性分子の投与後少なくとも約２０日、３０日、３５日、４０日、４５日またはそれ超の間、ＳＴＥＡＰ２発現腫瘍細胞の成長を阻害する。例えば、実施例１０を参照されたい。

他の実施形態において、エフェクター細胞への弱い結合親和性を有するＣＤ３標的化結合アームを有する抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態試験において投与された同じ抗ＴＡＡ結合アーム及び強いＣＤ３結合アームを含む二重特異性抗体と比較して、低減された薬物消失速度を示す。結果は、より弱い結合のＣＤ３標的化アームを含む二重特異性分子が、有益な薬物曝露レベル（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）及び薬物消失プロファイル（抗体クリアランス）を示し得ることを示唆している。例えば、実施例９を参照されたい。

本発明は、（ａ）ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫障害マウスにおける腫瘍成の阻害；（ｂ）ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫正常マウスにおける腫瘍成長の阻害；（ｃ）ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫障害マウスにおける樹立腫瘍の腫瘍成長の抑制；及び（ｄ）ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫正常マウスにおける樹立腫瘍の腫瘍成長の低減からなる群から選択される１つ以上の特徴を示す、抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６及び抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗原結合分子（すなわち、抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子）を提供する（例えば、実施例７、８及び１０を参照されたい）。本発明はまた、エフェクターＴ細胞（すなわちＣＤ３）に指向された第１の重鎖、及びｉｉ）標的腫瘍細胞に指向された第２の重鎖を含む、抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６及び抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ２二重特異性抗体（すなわち抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗体）を提供し、二重特異性抗体は、エフェクター細胞に対する弱い結合を示す、または検出可能な結合を示さず、またエフェクター細胞に対する強い結合を示す二重特異性抗体と比較して、腫瘍成長抑制、及び体からの低減された抗体クリアランス（すなわち消失）を示す。

エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ３上のエピトープは、ＣＤ３タンパク質の３個以上（例えば３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ超）のアミノ酸の単一連続配列からなってもよい。代替として、エピトープは、ＣＤ３の複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなってもよい。本発明の抗体は、単一ＣＤ３鎖（例えばＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－デルタもしくはＣＤ３－ガンマ）内に含有されるアミノ酸と相互作用してもよく、または２つ以上の異なるＣＤ３鎖上のアミノ酸と相互作用してもよい。「エピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定因子を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なるエリアに結合し得、また異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体構造または直線状であってもよい。立体構造エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸により生成される。直線状エピト
ープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基により生成されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含んでもよい。

抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために、当技術分野において当業者に知られている様々な技術が使用され得る。例示的な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載のもの等の慣例的な交差遮断アッセイ、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、及びペプチド切断分析を含む。さらに、エピトープ切断、エピトープ抽出及び抗原の化学的改質が使用されてもよい（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために使用され得る別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的に、水素／重水素交換法は、対象となるタンパク質の重水素標識化に続く、重水素標識化タンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体は、抗体により保護された残基（重水素標識化が維持される）を除く全ての残基において水素－重水素交換を生じさせるために水に移される。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断及び質量スペクトル分析に供され、それによって、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識化残基が明らかとなる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。抗原／抗体複合体のＸ線結晶学もまた、エピトープマッピング目的に使用され得る。

本発明は、さらに、本明細書に記載の特定の例示的抗体（例えば、本明細書の表６に記載のようなアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＳＭＡ抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載の特定の例示的抗体（例えば、本明細書の表６に記載のようなアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＰＳＭＡへの結合に関して競合する抗ＰＳＭＡ抗体を含む。米国特許出願公開第１５／２２３，４３４号において開示される抗ＰＳＭＡ抗体は、本明細書において参照することにより本出願に組み込まれる。

本発明はまた、低い、または検出可能な結合親和性でヒトＣＤ３及び／またはカニクイザルＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的ＣＤ３特異性抗原結合ドメインのいずれかと同じＣＤ３上のエピトープに結合する。

同様に、本発明はまた、低い、または検出可能な結合親和性でヒトＣＤ３及び／またはカニクイザルＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の特定の例示的ＣＤ３特異性抗原結合ドメインのいずれかと、ＣＤ３への結合に関して競合する。

特定の抗原結合分子（例えば抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する、またはそれとの結合に関して競合するかどうかは、当技術分野において知られている慣例的方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じＣＤ３（またはＴＡＡ）上のエピトープに結合するかどうかを決定するためには、参照二重特異性分
子をまずＣＤ３タンパク質（またはＴＡＡタンパク質）に結合させる。次に、ＣＤ３分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合後にＣＤ３（またはＴＡＡ）に結合することができる場合、試験抗体は、参照二重特異性抗原結合分子とは異なるＣＤ３（またはＴＡＡ）のエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合後にＣＤ３（またはＴＡＡ）分子に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照二重特異性抗原結合分子により結合されるエピトープと同じＣＤ３（またはＴＡＡ）のエピトープと結合することができる。次いで、試験抗体の観察された結合の喪失が、実際に参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合によるものであるのか、または立体障害的なブロック（もしくは別の現象）が、観察された結合の喪失の原因となるのかを確認するために、追加の慣例的実験（例えば、ペプチド突然変異及び結合分析）を行うことができる。参照抗体が、本明細書において例示されるように測定可能な結合を有しないものである場合、エピトープ相互作用を比較すること、またはその結合特性を本明細書に記載のような試験抗体と比較することを目的としてＣＤ３に対する結合を決定するために、参照抗体を生殖細胞系列配列に突然変異させることができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、競合結合アッセイにおいて測定されるように、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の１つの抗原結合タンパク質が、他方の結合を少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質が同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。代替として、１つの抗原結合タンパク質の結合を低減または消失させる、抗原内の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低減または消失させる場合、２つの抗原結合タンパク質が同じエピトープに結合するとみなされる。１つの抗原結合タンパク質の結合を低減または消失させるアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の結合を低減または消失させる場合、２つの抗原結合タンパク質は、「重複エピトープ」を有するとみなされる。

抗体またはその抗原結合ドメインが参照抗原結合分子との結合に関して競合するかどうかを決定するためには、上述の結合方法が２つの方向で行われる。第１の方向では、参照抗原結合分子を飽和条件下でＣＤ３タンパク質（またはＴＡＡタンパク質）に結合させ、続いてＣＤ３（またはＴＡＡ）分子に対する試験抗体の結合を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でＣＤ３（またはＴＡＡ）分子に結合させ、続いてＣＤ３（またはＴＡＡ）分子に対する参照抗原結合分子の結合を評価する。両方の方向で第１の（飽和）抗原結合分子のみがＣＤ３（またはＴＡＡ）分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗原結合分子はＣＤ３（またはＴＡＡ）への結合に関して競合すると結論付けられる。当業者により理解されるように、参照抗原結合分子と結合に関して競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合するとは限らない可能性があるが、重複または隣接エピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体障害的にブロックする可能性がある。参照抗体が、本明細書において例示されるように測定可能な結合を有しないものである場合、エピトープ相互作用を比較すること、またはその結合特性もしくはブロック相互作用を本明細書に記載のような試験抗体と比較することを目的としてＣＤ３に対する結合を決定するために、参照抗体を生殖細胞系列配列に突然変異させることができる。

抗原結合ドメインの調製及び二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当技術分野において知られている任意の抗体生成技術により調製され得る。得られたら、２つの異なる抗原（例えばＣＤ３及びＴＡＡ）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインは、慣例的な方法を使用して本発明の二重
特異性抗原結合分子を生成するために互いに対して適切に配置され得る。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用され得る例示的な二重特異性抗体形式の議論は、本明細書の別の箇所に記載される。）ある特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗原結合分子の個々の成分（例えば重鎖及び軽鎖）の１つ以上が、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体から得られる。そのような抗体を作製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の重鎖及び／または軽鎖の１つ以上が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製され得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、特定の抗原（例えばＣＤ３またはＴＡＡ）に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。抗体は、親和性、選択性、エピトープ等を含む所望の特徴のために特性決定及び選択される。本発明の二重特異性抗原結合分子内に組み込むことができる完全ヒト重鎖及び／または軽鎖を生成するために、マウス定常領域は所望のヒト定常領域と置き換えられる。

ヒト二重特異性抗原結合分子を作製するために、遺伝子改変動物が使用され得る。例えば、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再配列及び発現することができない遺伝子操作マウスが使用されてもよく、マウスは、内因性マウスカッパ（κ）遺伝子座におけるマウスカッパ（κ）定常遺伝子に作用可能に連結したヒト免疫グロブリン配列によりコードされた、１つまたは２つのみのヒト軽鎖可変ドメインを発現する。そのような遺伝子操作マウスは、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子断片の１つから得られる可変ドメインを含む同一軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト二重特異性抗原結合分子を生成するために使用され得る。（二重特異性抗原結合分子を生成するためのそのような改変マウス及びその使用の詳細な議論については、例えばＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい。）本発明の抗体は、共通軽鎖に会合した免疫グロブリン重鎖を含んでもよい。共通軽鎖は、抗ＴＡＡ重鎖の同種軽鎖から得られてもよく、または広範な非同種重鎖と対形成する無差別性もしくは能力を示す軽鎖、すなわち普遍的もしくは共通軽鎖から得られる既知の、もしくは公知の軽鎖可変領域から得られてもよい。本発明の抗体は、単一の再配列軽鎖に会合した免疫グロブリン重鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ヒトＶκ１－３９遺伝子断片またはＶκ３－２０遺伝子断片から得られる可変ドメインを含む。他の実施形態において、軽鎖は、ヒトＪκ５もしくはヒトＪκ１遺伝子断片と再配列されたヒトＶκ１－３９遺伝子断片、またはヒトＪκ１遺伝子断片と再配列されたＶκ３－２０遺伝子断片、またはヒトＪκ１遺伝子断片と再配列されたＶκ１－３９遺伝子断片から得られる可変ドメインを含む。

生物学的均等物
本発明は、本明細書において開示される例示的分子のものとは異なるが、ＣＤ３及び／またはＴＡＡと結合または相互作用する能力を維持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのような変異体分子は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明される二重特異性抗原結合分子のものと本質的に均等である生物活性を示し得る。

本発明は、本明細書に記載の例示的抗原結合分子のいずれかと生物学的に均等である抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが、吸収の速度及び程度が同様の実験条件下で単回投与であるかまたは複数回投与であるかを問わず同じモル用量で投与された場合大きな差を示さない薬学的均等物または薬学的代替物である場合、生物学的に均等であるとみなされる。いくつかの抗原結合タンパク質は、それらがその吸収の程度において均等であるが吸収速度において均等ではない場合、均等物または薬学的代替物とみなされるが、そのような吸収速度の差は意図的かつ標識化において反映され、例えば慢性使用時の有効体内薬物濃度の達成に必須ではなく、また研究されている特定の製剤に対して医学的に重要でないとみなされるため、生物学的に均等であるとみ
なされ得る。

一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度及び効力において臨床的に重要な差がない場合、生物学的に均等である。

一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、参照生成物と生物学的生成物との間の切り替えなしでの継続治療と比較して、患者が免疫原性の臨床的に重要な変化、または低下した有効性を含む副作用のリスクの予測される増加なしに参照生成物と生物学的生成物との間で１回以上切り替えられ得る場合、生物学的に均等である。

一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、共に使用条件（複数可）に対する共通の作用機序（複数可）により作用する場合、そのような機序が知られている限り、生物学的に均等である。

生物学的均等性は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ法により実証され得る。生物学的均等性の手段は、例えば、（ａ）血液、血漿、血清または他の生体液中の抗体またはその代謝産物の濃度が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトｉｎ ｖｉｖｏバイオアベイラビリティデータに相関しており、またそれを合理的に予測するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理作用が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；及び（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティもしくは生物学的均等性を確立する十分に制御された臨床試験を含む。

本明細書に記載の例示的二重特異性抗原結合分子の生物学的に均等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要ではない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることにより構築され得る。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生後の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸と置換されてもよい。他の状況において、生物学的に均等な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を改質するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を消失または除去する突然変異を含む、本明細書に記載の例示的二重特異性抗原結合分子の変異体を含んでもよい。

種選択性及び種交差反応性
本発明のある特定の実施形態によれば、ヒトＣＤ３との弱い相互作用を示す、または相互作用を示さない、及びカニクイザルＣＤ３等の他の種からのＣＤ３との弱い相互作用を示す、または相互作用を示さない抗原結合分子が提供される。また、ヒトＴＡＡには結合するが他の種からのＴＡＡには結合しない抗原結合分子が提供される。本発明はまた、ヒトＣＤ３及び１種以上の非ヒト種からのＣＤ３に結合する抗原結合分子；ならびに／またはヒトＴＡＡ及び１種以上の非ヒト種からのＴＡＡに結合する抗原結合分子を含む。

本発明のある特定の例示的実施形態によれば、ヒトＣＤ３及び／またはＴＡＡに弱く結合し、また場合によって、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーＣＤ３及び／またはＴＡＡの１つ以上に結合してもよい、または結合しなくてもよい抗原結合分子が提供される。例えば、ある特定の例示的実施形態において、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に弱く結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒトＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＳＴＥＡＰ２に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。

免疫抱合体
本発明は、細胞毒素、化学治療薬、免疫抑制剤または放射性同位体等の治療部分（「免疫抱合体」）に複合化した抗原結合分子を包含する。細胞毒性薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。免疫抱合体を形成するための好適な細胞毒性薬剤及び化学療法剤の例は、当技術分野において知られている（例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい）。

治療製剤及び投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、及び改善された移動、送達、耐性等を提供する他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出すことができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ（１９９８） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１もまた参照されたい。

患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路等に依存して変動し得る。好ましい用量は、典型的には、体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者における治療目的で使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２から約７、約０．０３から約５、または約０．０５から約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内投与することが有利となり得る。状態の重症度に依存して、処置の頻度及び期間が調節され得る。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効用量及びスケジュールは、実験的に決定され得、例えば定期評価により患者の経過が監視され、それに従って用量が調節される。さらに、当技術分野における周知の方法を使用して、用量の種間増減が行われてもよい（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

様々な送達システム、例えばリポソーム内へのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）が知られており、また本発明の薬学的組成物を投与するために使用され得る。導入方法は、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む。組成物は、任意の便利な経路により、例えば注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜内膜（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を介した吸収により投与され得、また他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。投与は、全身性または局所性であってもよい。

本発明の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下または静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスが、本発明の薬学的組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン送達デバイスは、再使用可能であってもよく、または使い捨てであってもよい。再使用可能なペン送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含有する交換式カートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物の全てが投与され、カートリッジが空となったら、空のカートリッジは、容易に廃棄され、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換され得る。次いで、ペン送達デバイスは、再使用され
得る。使い捨てペン送達デバイスには、交換式カートリッジが存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスには、デバイス内の容器内に保持される薬学的組成物で充填されている。容器から薬学的組成物がなくなったら、デバイス全体が廃棄される。

多くの再使用可能なペン及び自動注入器送達デバイスが、本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される。その例をいくつか挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される使い捨てペン送達デバイスの例をいくつか挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の状況において、薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達され得る。一実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的に近接して設置されてもよく、したがって全身用量のごく一部のみを必要とし得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記参照、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３によるレビュー内で議論されている。

注射製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴等のための剤形を含み得る。これらの注射製剤は、公知の方法により調製され得る。例えば、注射製剤は、例えば上述の抗体またはその塩を従来注射に使用される無菌水性媒体または油性媒体に溶解、懸濁または乳化させることにより調製され得る。注射用の水性媒体としては、例えば、アルコール（例えばエタノール）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水添ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加体）］等の適切な可溶化剤と組み合わされて使用され得る、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶等がある。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の可溶化剤と組み合わされて使用され得る、ゴマ油、大豆油等が使用される。このようにして調製された注射剤は、好ましくは、適切なアンプル内に充填される。

有利には、上述の経口的または非経口的使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量に合うように適合する単位用量の剤形に調製される。単位用量でのそのような剤形は、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射（アンプル）、坐剤等を含む。含有される上述の抗体の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約５から約５００ｍｇであり；特に注射形態では、上述の抗体は約５から約１００ｍｇで含有されることが好ましく、他の剤形では約１０から約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。

抗原結合分子の治療用途
本発明は、抗腫瘍抗体もしくはその抗原結合断片、またはＣＤ３に弱く特異的に結合する、もしくはそれに対する検出可能な結合を有さず、腫瘍関連抗原に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書において開示されるような抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、がんの１つ以上の症状もしくは兆候を示す（例えば、腫瘍を発現している、もしくは本明細書において以下で言及されるがんのいずれかに罹患している対象）、あるいは別様に、腫瘍活性の阻害もしくは低減、または腫瘍細胞（例えばＰＳＭＡ＋＋前立腺がん細胞）の枯渇から利益を得るヒトまたは非ヒト動物を意味する。

本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子（ならびにそれを含む治療組成物）は、なかでも、免疫反応の刺激、活性化及び／または標的化が有益となる任意の疾患または障害の処置に有用である。特に、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＴＡＡを発現する細胞、例えば、ＰＳＭＡ発現もしくは活性またはＰＳＭＡ＋細胞の増殖に関連する、またはそれにより媒介される任意の疾患または障害の処置、予防及び／または寛解に使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、エフェクター細胞の存在下での、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用、またはこれらの機序の２つ以上の組み合わせによる腫瘍関連抗原を発現する細胞の死滅を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害または死滅され得る、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ２またはＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍関連抗原を発現する細胞は、例えば、前立腺腫瘍細胞を含む。

本発明の抗原結合分子は、例えば、脳及び髄膜、頭頸部、中咽頭、肺及び気管支樹、胃腸管、男性及び女性生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、腎臓、膀胱ならびに／または特殊感覚器官、例えば目に生じる原発及び／または転移腫瘍を処置するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、以下のがん：膵臓癌、頭頸部がん、前立腺がん、悪性膠芽腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えばＭＥＴ増幅による胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がん、黒色腫神経膠腫、乳がん（例えば乳管もしくは乳管内癌、扁平上皮癌、食道がん、明細胞腎細胞癌、嫌色素細胞性腎癌、（腎）膨大細胞腫、（腎）移行上皮癌、尿路上皮癌、（膀胱）腺癌、または（膀胱）小細胞癌の１つ以上の処置に使用されるが、これらに限定されない。本発明のある特定の実施形態によれば、二重特異性抗体は、難治性または処置耐性がん、例えば去勢耐性前立腺がんに罹患した患者の処置に有用である。本発明の例示的実施形態によれば、本明細書において開示されるような抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子、去勢耐性前立腺がんに罹患した患者に投与することを含む方法が提供される。患者が去勢耐性の腫瘍を有するかどうかを確認するために、例えば腫瘍精査等の当技術分野において知られている分析／診断方法が使用され得る。

本発明はまた、対象における残存がんを処置するための方法を含む。本明細書において使用される場合、「残存がん」という用語は、抗がん治療、例えば一次治療または標準治
療による処置後の対象における１つ以上のがん細胞の存在または残留を意味する。

ある特定の態様によれば、本発明は、ＴＡＡ発現に関連したがん（例えば、ＰＳＭＡ発現もしくはＳＴＥＡＰ２発現に関連した前立腺がん、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現に関連した膠芽腫、またはＭＵＣ１６発現に関連した卵巣がん）を処置するための方法であって、対象ががんを有すると決定された後に、本明細書の別の箇所に記載される二重特異性抗原結合分子の１つ以上を対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本発明は、前立腺がんを処置するための方法であって、対象が以前の治療を受けてから１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、２ヵ月後、４ヵ月後、６ヵ月後、８ヶ月後、１年後、またはそれ以後に、抗ＣＤ３／抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子を患者に投与することを含む方法を含む。

複合治療及び製剤
本発明は、１種以上の追加の治療薬剤と組み合わせて本明細書に記載の例示的抗体及び二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と組み合わされ得る、またはそれと組み合わせて投与され得る例示的な追加の治療薬剤は、例えば、抗プログラム細胞死１抗体（例えば米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載のような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載のような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＥＧＦＲ拮抗剤（例えば抗ＥＧＦＲ抗体［例えばセツキシマブもしくはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えばゲフィチニブもしくはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４等の別のＥＧＦＲファミリーメンバーの拮抗剤（例えば抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩの拮抗剤（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴ拮抗剤（例えば抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒ拮抗剤（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えばベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－α阻害剤（例えば抗ＰＤＧＦＲ－α抗体）、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤（例えば抗ＰＤＧＦＲ－β抗体）、ＶＥＧＦ拮抗剤（例えばＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えばＵＳ７，０８７，４１１を参照されたい（本明細書において「ＶＥＧＦ－阻害融合タンパク質」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えばスニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４拮抗剤（例えばＵＳ２００９／０１４２３５４において開示されている抗ＤＬＬ４抗体、例えばＲＥＧＮ４２１）、Ａｎｇ２拮抗剤（例えばＵＳ２０１１／００２７２８６において開示されている抗Ａｎｇ２抗体、例えばＨ１Ｈ６８５Ｐ）、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）拮抗剤、ＰＲＬＲ拮抗剤（例えば抗ＰＲＬＲ抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２拮抗剤（例えば抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２拮抗剤（例えば抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮ拮抗剤（例えば抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９拮抗剤（例えば抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキン拮抗剤（例えば抗ウロプラキン抗体）等を含む。本発明の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤は、小分子サイトカイン阻害剤、及びＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８等のサイトカインに、またはそれらの各受容体に結合する抗体を含む、サイトカイン阻害剤を含む。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書において開示されるような抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えばＩｆｅｘ（登録商標））、カルボプラチン（例えばＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、エトポシド（例えばＥｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）；「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えばＤｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、シタラビン（例えばＣｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標）、シトシンアラビノシド、ａｒａ－Ｃ）、シスプラチン（例えばＰｌａｔｉｎｏ
ｌ（登録商標）－ＡＱ）；及び「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えばＥｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ＶＰ－１６）、メチルプレドニゾロン（例えばＭｅｄｒｏｌ（登録商標））、高用量シタラビン、シスプラチン（例えばＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）から選択される１種以上の治療的組み合わせを含む、治療計画の一部として投与されてもよい。

本発明はまた、本明細書において言及される抗原結合分子のいずれか、及びＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、または上述のサイトカインのいずれかの１つ以上の阻害剤を含む薬学的組成物を含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体断片（例えばＦａｂ断片；Ｆ（ａｂ´）_２断片；Ｆｄ断片；Ｆｖ断片；ｓｃＦｖ；ｄＡｂ断片；または他の改変分子、例えばジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び最小認識単位）である。本発明の抗原結合分子はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド及び／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／または配合製剤化されてもよい。本発明の抗原結合分子はまた、放射線処置及び／または従来の化学治療も含む処置計画の一部として投与されてもよい。

追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗原結合分子の投与の直前に、それと同時に、またはその直後に投与されてもよい（本開示の目的において、そのような投与計画は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗原結合分子の投与とみなされる）。

本発明は、本発明の抗原結合分子が本明細書の別の箇所に記載されるような追加の治療活性成分（複数可）の１つ以上と配合製剤化された薬学的組成物を含む。

投与計画
本発明のある特定の実施形態によれば、複数用量の二重特異性抗原結合分子（例えば抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子）が、定義された時間的経過にわたり対象に投与されてもよい。本発明のこの態様による方法は、複数用量の本発明の抗原結合分子を対象に逐次投与することを含む。本明細書において使用される場合、「逐次投与する」とは、抗原結合分子の各用量が、異なる時点で、例えば所定間隔（例えば時間、日、週または月）だけ隔てられた異なる日に対象に投与されることを意味する。本発明は、患者に単回初期用量の抗原結合分子を、続いて１回以上の二次用量の抗原結合分子を、続いて任意選択で１回以上の三次用量の抗原結合分子を逐次投与することを含む方法を含む。

「初期用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。したがって、「初期用量」は、処置計画の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」は、初期用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、及び三次用量は、全て同じ量の抗原結合分子を含有してもよいが、一般に、投与の頻度に関して互いに異なってもよい。しかしながら、ある特定の実施形態において、初期、二次及び／または三次用量に含有される抗原結合分子の量は、処置の過程で互いに異なる（例えば、適宜上方または下方調節される）。ある特定の実施形態において、２回以上（例えば２回、３回、４回または５回）の用量が、処置計画の開始時に「負荷用量」として投与され、続いて、その後の用量がより低頻度で投与される（例えば「維持用量」）。

本発明の１つの例示的実施形態において、二次及び／または三次用量はそれぞれ、直前の用量から１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、
４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ超）週間後に投与される。「直前の用量」という語句は、本明細書において使用される場合、複数投与の順番において、介在する用量なしに、順番におけるまさに次の用量の投与の前に患者に投与される抗原結合分子の用量を意味する。

本発明のこの態様による方法は、抗原結合分子（例えば抗ＴＡＡ二重特異性抗原結合分子）の任意の数の二次及び／または三次用量を患者に投与することを含んでもよい。例えば、ある特定の実施形態において、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ超）の二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ超）の三次用量が患者に投与される。

複数の二次用量が関与する実施形態において、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各二次用量は、直前の用量から１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量が関与する実施形態において、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量から２～４週間後に患者に投与されてもよい。代替として、二次及び／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置計画にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床試験後の個々の患者の必要性に依存して、処置の過程で医師により調節されてもよい。

以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、本発明者が自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば量、温度等）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段に指定されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近くである。

実施例１：抗ＣＤ３抗体の生成
以下の手順は、抗原としてのＣＤ３（Ｔ細胞共受容体）を特異的に認識する抗体を特定することを目指した。

遺伝子操作マウスを免疫化することにより、抗ＣＤ３抗体のプールを得た。簡潔に説明すると、単一再配列軽鎖（例えばＶκ１－３９／ＪまたはＶκ３－２０／Ｊ）に会合した逆キメラ（ヒト可変、マウス定常）及び免疫グロブリン重鎖を発現するように遺伝子改変されたマウスを、ＣＤ３抗原で免疫化し、高親和性抗原特異性抗体の多様なレパートリーを発現するために、多様なヒトＶＨ再配列を含むＢ細胞を生成した。本出願において説明されるある特定の例示された抗体は、組み換えにより作製されており、Ｖκ１－３９ＪＫ５の同じ軽鎖配列（配列番号１６２に記載のＬＣＶＲ）を発現し、一方組み換えにより作製された他の抗体は、重鎖アーム（例えば腫瘍標的アーム）の１つの同種軽鎖を発現する。

生成された抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてヒト及びカニクイザルＣＤ３抗原に対する親和性について試験し、例えば、いくつかの他の抗体の中からＣＤ３－Ｖ
Ｈ－Ｐ（配列番号１５４に記載のＨＣＶＲ）で記号表示される１つのＣＤ３抗体を特定したが、それらは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３の両方に結合し、それぞれＪｕｒｋａｔ細胞及びカニクイザルＴ細胞のＦＡＣＳ滴定において決定されるように、１から４０ｎＭの間の親和性（＋＋＋）のＥＣ_５０を有することが判明した。例えば、本明細書における以下の実施例４に概説されるＦＡＣＳ結合実験を参照されたい。

その後、ＣＤ３－ＶＨ－Ｐの生殖細胞系列アミノ酸残基を特定し、「ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ」で記号表示される抗体を、生殖細胞系列フレームワークのみを含有するように改変した。周知の分子クローニング技術により他の抗体誘導体を改変し、生殖細胞系列配列とＣＤ３－ＶＨ－Ｐ配列との間の差に基づいて段階的にアミノ酸残基を置き換えた。各抗体誘導体には、「ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ」という数字記号表示が付される。表１及び図１を参照されたい。

その記号表示及び説明が表１に示される改変抗ＣＤ３抗体から得られる第１の結合アームと、抗ＴＡＡ抗体から得られる第２の結合アームとを含む二重特異性抗体を調製し、ＦＡＣＳアッセイ（実施例４に記載の通り）においてＣＤ３保持細胞に対する一価親和性について試験した。これらの二重特異性抗体の一価結合親和性の結果を、表１の右側の２つの列に示す。具体例において、それぞれ「ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ」、「ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５」及び「ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２０」で記号表示されるＴＡＡ結合アーム及びＣＤ３結合アームを有する二重特異性抗体は、それぞれ２．７Ｅ－０８のＥＣ_５０、検出可能な結合なし、及び５．５Ｅ－０７のＥＣ_５０でＪｕｒｋａｔ細胞に結合した。

ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ及びいくつかの他の改変抗体は、ＦＡＣＳアッセイにおいて見られるようにその結合親和性を維持したが、いくつかの抗ＣＤ３抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで弱い（＋／－）親和性から測定不能（－）の親和性でヒトまたはカニクイザルＣＤ３に結合した。その後、この実施例の方法に従って生成された例示的抗ＣＤ３抗体を含む二重特異
性抗体に対して、細胞毒性及び薬物動態（ｐＫ）プロファイルを解明するための結合親和性、結合反応速度、及び他の生物学的特性を調査したが、これを以下に記載の実施例において詳細に説明する。

実施例２：重鎖及び軽鎖可変領域（ＣＤＲのアミノ酸及び核酸配列）
各抗体重鎖配列に対してアミノ酸及び核酸配列を決定した。生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ３－９＊０１／Ｄ５－１２＊０１／Ｊ６＊０２（配列番号１８１）の誘導体としての各抗体重鎖に、一貫した命名のために「Ｇ」数字記号表示を割り当てた。表２は、本発明の改変抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載している。対応する核酸配列識別子を、表３に記載する。また、各組み換え抗体を構築するための軽鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸及び核酸配列識別子は、それぞれ以下の表４及び５において特定される。

「ＣＤ３－Ｌ２Ｋ」で記号表示される対照１抗体は、既知の抗ＣＤ３抗体（すなわちＷＯ２００４／１０６３８０に記載のような抗ＣＤ３抗体「Ｌ２Ｋ」）に基づいて構築された。

本明細書の以下の実施例において言及されるアイソタイプ対照抗体は、無関係の抗原、すなわちＦｅｌＤ１抗原と相互作用するアイソタイプ一致（改質ＩｇＧ４）抗体である。

実施例３：ＣＤ３及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するＵＬＣ二重特異性抗体の生成
ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１６またはＳＴＥＡＰ２等の抗ＣＤ３特異性結合ドメイン及び抗ＴＡＡ特異性結合ドメインを含む二重特異性抗体を、本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体からの重鎖、抗ＴＡＡ抗体からの重鎖、及び共通軽鎖または普遍的軽鎖（ＵＬＣ）を利用した標準的分子生物学的方法を使用して構築した。本発明の二重特異性抗体を構築するために使用された抗ＴＡＡ抗体は、遺伝子操作マウスを免疫化することにより得られた。

この実施例に従って作製される様々な二重特異性抗体の抗原結合ドメインの構成部分の概要は、以下の表６、７及び８に記載される。２０１４年８月２８日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０２４３５０４Ａ１号に記載のように、改質（キメラ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有する全ての二重特異性抗体を製造した。例示的なＥＧＦＲｖＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書において議論される抗ＣＤ３抗体のいずれかの可変領域またはＣＤＲと組み合わせて、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１５０２５９４２３号において議論されているＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかの重鎖及び軽鎖可変領域（またはＣＤＲ）のいずれかを使用して調製され得る。

例示的な二重特異性抗体のそれぞれを、本明細書の以下で説明されるような様々なバイオアッセイにおいて試験した。

実施例４：ＦＡＣＳ分析により測定されるような例示的二重特異性抗体の結合親和性
この例では、ヒト及びカニクイザルＣＤ３発現細胞株に結合するＣＤ３×ＴＡＡ二重特異性抗体の能力を、ＦＡＣＳにより決定した。さらに、標的特異性（ＴＡＡ特異性）細胞株に結合するこれらの二重特異性抗体の能力もまた確認した。上述のように、本発明の様々な二重特異性抗体は、抗ＣＤ３結合アーム（上述の実施例１及び２を参照されたい）のパネルの１つと対形成した単一のＴＡＡ特異的結合アーム（ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１６、またはＳＴＥＡＰ２；実施例３、表６、７及び８を参照されたい）、ならびに共通軽鎖を利用した。また、実施例５にも示されるように、ＣＤ３×ＴＡＡ二重特異性抗体は、表面プラズモン共鳴により、ヒト可溶性ヘテロ二量体ｈＣＤ３ε／δ．ｍＦｃタンパク質に対するある範囲の親和性を示した。

簡潔に説明すると、２×１０^５細胞／ウェルのヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ、カニクイザルＴまたはＴＡＡ特異的発現細胞を、二重特異性抗体を連続希釈して４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ヤギＦ（ａｂ´）_２抗ヒトＦｃγＰＥ標識化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）を、さらに３０分間細胞に添加した。次に、細胞を洗浄し、冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーにより分析した。

ＦＡＣＳ分析のために、単一イベント選択に対して前方散乱高さ対前方散乱面積により、続いて側方及び前方散乱により細胞をゲーティングした。細胞結合滴定のＥＣ_５０は、ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して決定した。値は、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。

表１０Ａに示されるように、各ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗体のＣＤ３結合アームは、Ｊｕｒｋａｔ細胞を発現するヒトＣＤ３に対するある範囲の細胞結合親和性を示した（１５～３００ｎＭのＥＣ_５０範囲）。重要なことに、表面プラズモン共鳴によりヒトＣＤ３ヘテロ二量体タンパク質に対する弱い結合を示すものから結合を示さないＣＤ３アーム（本明細書における以下の表１１を参照されたい）はまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞（すなわち、ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ２、ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ３、ＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）に対する弱い結合から観察不能な結合に相関した。ＦＡＣＳアッセイまたは同等のアッセイにおける検出不能な結合、または検出可能な結合がないことは、抗体とその標的抗原との間の親和性がアッセイの検出限界を超える（例えば＞１μＭ）ことを意味する。いくつかのＣＤ３結合アームはまた、カニクイザルＴ細胞に対する交差反応性を示した。全ての試験された二重特異性抗体は、各ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＭＵＣ１６発現細胞株に対して同様の細胞結合を示し、個々のＣＤ３アームとの二重特異性対形成はＴＡＡ特異性結合に影響またはそれを低下させないことが確認された（ＴＡＡ特異性結合は、試験された全ての例において５．６ｎＭ以下（高親和性）であった）。

ヒトＣＤ３に対する弱い結合から検出不可能な結合を示すと共に、カニクイザルＣＤ３に対する弱い結合を示すものから結合を示さない抗体は、本発明による親和力駆動型二重特異性対形成に有利であるとみなされ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて細胞毒性についてさらに試験された。

実施例５：表面プラズモン共鳴結合アッセイにより測定されるような例示された抗体の結合親和性
可溶性ヘテロ二量体ｈＣＤ３ε／δ．ｍＦｃタンパク質（ｈＣＤ３ε＝ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０７７６６．２；配列番号１６９；ｈＣＤ３δ＝ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０４２３４．１、配列番号１７０）に対する抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性及び速度定数を、抗原捕捉形式（表１１）または抗体捕捉形式（データは示さず）のいずれかを使用して、表面プラズモン共鳴によ
り３７℃で決定した。この例において、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体を利用したが、これは、これらの対形成がＣＤ３結合アームの抗体のより広いパネルの使用を示したためである。測定は、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＭＡＳＳ－１機器で行った。

抗原捕捉形式において、ＭＡＳＳ－１高密度アミンセンサ表面を、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で誘導体化した。可溶性ヘテロ二量体ＣＤ３タンパク質が捕捉され、各抗体が捕捉された抗原上に射出された。

ＭＡＳＳ－１ ＡｎａｌｙｓｅｒＲ２曲線フィッティングソフトウェアを使用してデータを処理し、１：１結合モデルにフィッティングすることにより、動力学的会合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）及び解離半減期（ｔ_１／２）は、以下のように動力学的速度定数から計算された：Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；及びｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０＊ｋ_ｄ）。

表１１において示されるように、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特性抗体は、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、可溶性ＣＤ３に対する非常に弱い結合を維持し、例えば１１ｎＭ超から最大３３４ｎＭまでのＫ_Ｄ値を有したが、これは、生殖細胞系列フレームワークから得られた二重特異性抗ＣＤ３アーム、ＣＤ３－ＶＨ－Ｇの値よりも弱い。

いくつかの二重特異性抗体は、５０ｎＭ超のＫ_Ｄ値を示し、またいくつかは１００ｎＭ超（＞１×１０^－７）のＫ_Ｄ値（すなわちＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－９００、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－１０００、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－１９００）、３００ｎＭ超（＞３×１０^－７）のＫ_Ｄ値（すなわちＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００５）、またさらにはアッセイの検出限界を超え（＞５００ｎＭ；＞５×１０^－７）、すなわち可溶性ヒトＣＤ３に対する検出可能な結合を示さなかった（すなわちＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－２００、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－３００、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－４００、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００４及びＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－１８００）。

実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるような本発明の二重特異性抗体により示されるＴ細胞活性化及び腫瘍特異性細胞毒性
この例では、ＣＤ３系二重特異性抗体の存在下でのＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＭＵＣ１６発現ＴＡＡ標的細胞の特異的死滅を、フローサイトメトリーにより監視した。以前に報告されたように、二重特異性抗体は、ＣＤ３タンパク質及びＣＤ３発現細胞株に対するある範囲の親和性を示した（すなわち、弱い、中程度及び強い結合）。この二重特異性抗体の同じパネルを、ナイーブヒトＴ細胞に標的発現細胞に対する死滅を再誘導させる能力について試験した。

簡潔に説明すると、ＰＳＭＡ発現（Ｃ４－２、２２Ｒｖ１及びＴＲＡＭＰＣ２＿ＰＳＭＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現（Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）またはＭＵＣ１６発現（ＯＶＣＡＲ３）細胞株を、１μＭの蛍光追跡用色素Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで標識化した。標識化後、細胞を３７℃で一晩播種した。別個に、ヒトＰＢＭＣを添加ＲＰＭＩ培地中に１×１０^６細胞／ｍＬで播種し、接着マクロファージ、樹状細胞、及びいくつかの単球を枯渇させることによりリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、接着細胞枯渇ナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞比４：１）及び連続希釈した関連二重特異性抗体またはアイソタイプ対照（濃度範囲：６６．７ｎＭから０．２５ｐＭ）と、３７℃で４８時間共インキュベートした。酵素不含細胞解離緩衝剤を使用して細胞を細胞培養プレートから取り出し、ＦＡＣＳにより分析した。

ＦＡＣＳ分析のために、細胞を死／生遠赤色細胞追跡物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳ分析の直前に、５×１０^５の計数ビーズを各ウェルに追加した。各試料に対して１×１０^４のビーズを収集した。死滅の特異性を評価するために、生Ｖｉｏｌｅｔ標識化集団に対して細胞をゲーティングした。生集団のパーセントを記録し、正規化生存率の計算に使用した。

細胞をＣＤ２及びＣＤ６９への直接共役抗体とインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうちの活性化（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞のパーセントを報告することにより、Ｔ細胞活性化を評価した。

表１２Ａ～１２Ｃにおける結果が示すように、抗ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体によりＴＡＡ発現細胞の枯渇が観察された。試験した二重特異性抗体のほとんどは、ヒトＴ細胞を活性化し、ピコモル範囲内のＥＣ_５０で標的細胞を枯渇するように誘導した。さらに、観察された標的細胞溶解（枯渇）は、ＣＤ２＋Ｔ細胞に対するＣＤ６９細胞の上方制御に関連し、ピコモル（ｐＭ）のＥＣ_５０であった。

重要なことに、この例の結果は、ＣＤ３タンパク質またはＣＤ３発現細胞に対する弱い結合から観察不能な結合を示すＣＤ３結合アーム（すなわちＣＤ３－ＶＨ－Ｇ５）を利用したいくつかの二重特異性抗体が、まだＴ細胞を活性化する能力を保持し、腫瘍抗原発現
細胞の強力な細胞毒性を示したことを実証している。

実施例７：抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍効果を示す
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対する弱い結合親和性を有する、または検出可能な結合親和性を有しないことが特定された例示的抗ＰＳＭＡ／抗－ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ
ｖｉｖｏ有効性を決定するために、ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫障害マウスにおいて試験を行った。ヒトＰＳＭＡを発現するように改変されたマウス前立腺がん異種移植片を保持する免疫正常マウスにおいても、追加的な試験を行った。

ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効性
ヒト腫瘍異種移植片試験における抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するために、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、内生的にＰＳＭＡを発現する２２Ｒｖ１またはＣ４－２ヒト前立腺腫瘍細胞と共に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を共移植した。

簡潔に説明すると、４×１０^６の２２Ｒｖ１または５×１０^６のＣ４－２細胞（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＴＸ）細胞を、５０：５０ミックスのマトリゲルマトリックス（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の１×１０^６のヒトＰＢＭＣ（ＲｅａｃｈＢｉｏ，ＬＬＣ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）と共に、雄ＮＳＧマウスの右脇腹にｓ．ｃ．で共移植した。Ｃ４－２試験では、腫瘍移植後０日目、４日目及び７日目に、０．１ｍｇ／ｋｇのＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００３またはＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００５でマウスをｉ．ｐ．で処理した。

追加的な異種移植モデルにおいて、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞を植え付けられたマウスで試験した。簡潔に説明すると、新生仔ＳＩＲ
Ｐα ＢＡＬＢ／ｃ－Ｒａｇ２－ＩＬ２ｒγ－（ＢＲＧ）に、ｈＣＤ３４＋胎児肝臓細胞を植え付けた。３～６ヵ月後、ｈＣＤ３４が植え付けられたＳＩＲＰα ＢＲＧマウスに、Ｃ４－２細胞（マトリゲル中５×１０^６ ｓ．ｃ．）を移植した。８日後、マウスを１０μｇのＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００４またはアイソタイプ対照抗体で処置し、続いて２回／週の投薬を試験の間中行った。

全ての試験において、ノギスを使用して腫瘍サイズを２回／週測定し、腫瘍体積を体積＝（長さ×幅^２）／２として計算した。

表１３における結果が示すように、上述の異種移植モデルにおいて試験された二重特異性抗体は全て、アイソタイプ対照での処置と比較して腫瘍成長の抑制に効果的であった。

免疫正常腫瘍モデルにおける抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効性
さらに、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、免疫正常モデル（２０１４年１１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，６５３号）における抗腫瘍活性について評価した。ＣＤ３の３つの鎖（δγε）に対してヒト化したマウスを、ＰＳＭＡに対してもヒト化し、ヒトＰＳＭＡでトランスフェクトした変異マウス前立腺がん細胞株ＴＲＡＭＰ－Ｃ２を移植した。

試験開始の前に、腫瘍原性細胞株変異ＴＲＡＭＰ－Ｃ２＿ｈＰＳＭＡｖ＃１を生成した。簡潔に説明すると、７．５×１０^６のＴＲＡＭＰ－Ｃ２＿ｈＰＳＭＡ細胞を、ＣＤ３及びＰＳＭＡに対してヒト化した雄マウスの右脇腹にｓ．ｃ．で移植した。腫瘍を切除し、３ｍｍ断片に切断し、その後新たな雄ヒト化マウスの右脇腹に移植した。次いで、移植された腫瘍断片から生じた腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に分散させた。次いで、これらの細胞（ＴＲＡＭＰ－Ｃ２＿ｈＰＳＭＡｖ＃１）をＧ４１８選択下でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。次いで、二重特異性抗体の有効性試験のために、この変異細胞株の４×１０^６の細胞を、雄ＰＳＭＡ／ＣＤ３ヒト化マウスの右脇腹に移植した。

ＴＲＡＭＰＣ２＿ｈＰＳＭＡｖ＃１が移植されたヒト化ＰＳＭＡ／ＣＤ３マウスを、１００μｇまたは１０μｇの抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００４またはアイソタイプ対象で、腫瘍移植の日から開始して２回／週で処置した。脾臓Ｔ細胞レベルと共に、注射から４時間後の血清サイトカインレベルも試験した。２７日目に試験を終了した。

表１４における結果が示すように、試験された抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性分子、ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００４は、処置群にわたり腫瘍成長の大幅な遅延において有効性を示した。ＢＳＰＳＭＡ／ＣＤ３－００４の投与後に、おそらくは抗ＣＤ３の弱い結合に起因して、最小のサイトカイン放出が観察された。試験した抗体は共に、脾臓内のＴ細胞を枯渇させることなく抗腫瘍効果を示した。

要約すると、本発明の抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３抗原に対する低
い結合から検出不可能な結合を有するにもかかわらず、免疫障害及び免疫正常腫瘍モデルの両方において強力な抗腫瘍効果を示す。

実施例８：抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体はｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍効果を示す
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対する弱い結合親和性を有する、または検出可能な結合親和性を有しないことが特定された例示的抗ＭＵＣ１６／抗－ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を決定するために、ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫障害マウスにおいて試験を行った。選択された二重特異性抗体の有効性を、即時処置及び治療的処置投薬モデルの両方において試験した。

ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効性
ヒト腫瘍異種移植片試験における抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するために、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；ＲｅａｃｈＢｉｏ ＬＬＣ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を事前に移植し、次いでルシフェラーゼで形質導入されたヒト卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ－３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ）からの腹水細胞を与えた。ＯＶＣＡＲ－３細胞は、内生的にＭＵＣ－１６を発現する。

簡潔に説明すると、ＮＳＧマウスに、５．０×１０^６のヒトＰＢＭＣを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。８日後、事前にｉｎ ｖｉｖｏで継代されたＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞株からの１．５×１０^６の腹水細胞を、ＰＢＭＣが植え付けられたＮＳＧマウスにｉ．ｐ．投与した。即時処置群では、ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞移植の日に、マウスをＭＵＣ１６／ＣＤ３二重特異性抗体ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１もしくはＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５、またはアイソタイプ対照で１０ｕｇ／マウス（Ｎ＝５マウス／処置群）の用量でｉ．ｐ．処置した。治療的用量モデルでは、腫瘍移植から７日後に、マウスを上述のＭＵＣ１６／ＣＤ３二重特異性または対照抗体で１０ｕｇ／マウス（Ｎ＝５／処置群）の用量でｉ．ｐ．処置した。

全ての試験において、腫瘍成長を生物発光画像化（ＢＬＩ）により監視した。マウスに、ＰＢＳ中に懸濁させたルシフェラーゼ基質Ｄルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射し、１０分後にイソフルラン麻酔下で画像化した。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用してＢＬＩを行い、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してＢＬＩ信号を抽出した。各細胞集団の周りの対象となる領域を描き、光子強度を、光子（ｐ）／秒（ｓ）／ｃｍ^２／ステラジアン（ｓｒ）として記録した。即時処置群では、データは、腫瘍移植から２６日後のＢＬＩレベルとして示される（表１５）。治療処置群では、データは、６日目（処置の１日前）と試験終了時点（腫瘍移植から２６日後；表１６）との間のＢＬＩの倍率変化として示される。

結果が示すように、即時投薬モデルにおいてＢＬＩが２６日目で測定された場合、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１及びＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５の両方が、アイソタイプ対照と比較して腫瘍成長の抑制において同様の有効性を示した。また、両方の抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、対照と比較して、腫瘍移植から７日後に投与された場合樹立された腫瘍の成長を抑制した。要約すると、本発明の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体は、いくつかのモデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示す。

実施例９：抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の薬物動態学的評価
抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１及びＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５、ならびにアイソタイプ対照の薬物動態の評価を、ヒト化ＭＵＣ１６×ＣＤ３マウス（ヒトＭＵＣ１６及びＣＤ３発現のためのホモ接合マウス、ＭＵＣ１６^{ｈｕ／ｈｕ}×ＣＤ３^{ｈｕ／ｈｕ}）、ＣＤ３ヒト化マウス（ヒトＣＤ３発現のためのホモ接合マウス、ＣＤ３^{ｈｕ／ｈｕ}）及び株一致（７５％Ｃ５７ＢＬ、２５％１２９Ｓｖ）野生型（ＷＴ）マウスにおいて行った。コホートは、試験抗体当たり、及びマウス株当たり４～５匹のマウスを含有した。全てのマウスは、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）０．４ｍｇ／ｋｇ投薬を受けた。血液試料を投薬から３及び６時間後、１、３、７、１４及び２８日後に回収した。血液を血清中に処理し、分析まで－８０℃で凍結した。

循環抗体濃度を、ＧｙｒｏＬａｂ ｘＰｌｏｒｅ（商標）（Ｇｙｒｏｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して全ヒトＩｇＧ抗体分析により決定した。簡潔に説明すると、血清中に存在するヒトＩｇＧを捕捉するために、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクロ
ーナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ）でストレプトアビジンコーティングビーズ上に捕捉した。親和性カラム捕捉後に、試料中の結合ヒトＩｇＧ抗体を、Ａｌｅｘａ－６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。カラム上の蛍光信号により、結合ＩｇＧの検出が可能となり、機器により反応単位（ＲＵ）が読み出された。試料濃度は、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した５パラメータ対数曲線フィッティングを用いてフィッティングされた標準曲線からの補間により決定された。

ＰＫパラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ、Ｌ．Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）及び血管外投薬モデルを使用した非コンパートメント分析（ＮＣＡ）により決定された。各抗体に対して各平均濃度値を使用して、観察された血清中最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、観察された推定半減期（ｔ_１／２）、及び最後の測定可能濃度までの時間に対する濃度曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）を含む全てのＰＫパラメータを、線形補間及び均一加重による線形台形規則を用いて決定した。

ＷＴマウスにおけるｉ．ｐ．投与後、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照の全ＩｇＧ濃度－時間プロファイルは全て同様であり、まず短時間の薬物分布と、それに続く試験の残り全体にわたる単一薬物消失段階を特徴とした。３つの抗体の最大血清濃度（Ｃ_ｍａｘ）及び計算薬物曝露（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）は同等であった（互いに１．３倍以内）。
ＣＤ３^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける抗体のｉ．ｐ．投与後、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照は、同等のＣ_ｍａｘ濃度（それぞれ４．６、３．６及び４．１μｇ／ｍＬ）を有していた。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照は、同様の薬物消失曲線を示し、一方ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、その両方よりも急な薬物消失を示し、ヒトＣＤ３標的結合がクリアランスを駆動することを示唆していた。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の最終抗体濃度は０．０３μｇ／ｍＬであったが、これはアイソタイプ対照に対して決定された最終抗体濃度（０．８５μｇ／ｍＬ）の約２８分の１であり、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５（０．６６μｇ／ｍＬ）血清濃度の２２分の１である。

ＭＵＣ１６^{ｈｕ／ｈｕ}×ＣＤ３^{ｈｕ／ｈｕ}二重ヒト化マウスにおいて、Ｍｕｃ１６×ＣＤ３二重特異性及びアイソタイプ対照抗体は、同等のＣ_ｍａｘ濃度（Ｃ_ｍａｘ範囲：４．５～６．９μｇ／ｍＬ）を有していた。両方の二重特異性抗体が、アイソタイプ対照よりも急な薬物消失を示し、標的媒介効果を示唆していた。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１及びＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５に対する最終抗体濃度は、アイソタイプ対照に対して決定された最終抗体濃度（０．８６μｇ／ｍＬ）のそれぞれ約２９分の１及び２．９分の１であった。

全抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体及びアイソタイプ対照抗体濃度のデータの要約は、表１７にまとめられている。平均ＰＫパラメータは、表１８Ａ及び１８Ｂに記載されている。時間に対する平均全抗体濃度は、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに示されている。結論として、ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体は、ＷＴマウスにおいて同様のＣ_ｍａｘ及び薬物消失曲線を示したが、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、ＣＤ３単一ヒト化マウス及びＭＵＣ１６／ＣＤ３二重ヒト化マウスにおいて、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５及びアイソタイプ対照よりも急な消失速度を示した。このＰＫ試験において投与された二重特異性抗体は、同じ抗ＭＵＣ１６結合アームで構成されているため、結果は、ＣＤ３標的化アームの結合強度が、薬物曝露レベル（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）及び薬物消失速度において役割を担い得ることを示唆している。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１及びＢＳＭＵＣ１６／
ＣＤ３－００５のいずれも、マウスＭＵＣ１６またはマウスＣＤ３に結合しない。

実施例１０：抗ＳＴＥＡＰ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体はｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍効果を示す
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対する弱い結合親和性を有する、または検出可能な結合親和性を有しないことが特定された例示的抗ＳＴＥＡＰ２／抗－ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を決定するために、ヒト前立腺がん異種移植片を保持する免疫障害マウスにおいて試験を行った。

ヒト腫瘍異種移植片試験における抗ＳＴＥＡＰ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するために、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、内生的にＳＴＥＡＰ２を発現するヒト前立腺がんＣ４－２細胞（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸ）と共に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；ＲｅａｃｈＢｉｏ ＬＬＣ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を共移植した。

簡潔に説明すると、５．０×１０^６のＣ４－２細胞を、５０：５０ミックスのマトリゲルマトリックス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中の１．２５×１０^６のヒトＰＢＭＣと共に、雄ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）で共移植した。移植の日に（即時処置モデル）、マウスを抗ＳＴＥＡＰ２／抗ＣＤ３二重特異性抗
体ＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００１、ＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００２もしくはＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００３、またはアイソタイプ対照（Ｃ４－２腫瘍細胞に結合しない）で０．１または０．０１ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝５マウス／群）の用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。

ノギスを使用して腫瘍サイズを２回／週測定し、腫瘍体積を体積＝（長さ×幅^２）／２として計算した。データは、試験終了時点、腫瘍移植から４６日後での腫瘍サイズ（ｍｍ^３）として示されている（表１９）。

表１９における結果が示すように、ＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００１、ＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００２及びＢＳＳＴＥＡＰ２／ＣＤ３－００３は、腫瘍サイズが試験終了時点で測定された場合、アイソタイプ対照と比較して腫瘍成長を大幅に抑制した。重要なことに、抗ＳＴＥＡＰ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇの最低用量であってもＣ４－２腫瘍成長の抑制において有効であった。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載のものに加え、本発明の様々な修正が、上記説明及び添付の図面から当業者に明らかとなる。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (13)

1. 対象におけるがんを処置する方法において使用するための、細胞毒性二重特異性抗体を含む薬学的組成物であって、該二重特異性抗体が、ヒトＣＤ３およびカニクイザルＣＤ３に対して弱い結合から検出不可能な結合を示す第１の抗原結合アームおよび腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合アームを含み、第１の抗原結合アームが配列番号３４または配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む重鎖および軽鎖を含み、軽鎖が第１の抗原結合アームおよび第２の抗原結合アームの両方に共通であり、該軽鎖が腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合アームの同族軽鎖である、薬学的組成物。
2. 前記二重特異性抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞活性化を示す、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記腫瘍関連抗原がヒト腫瘍細胞上で発現される、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
4. 前記二重特異性抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイにおいて測定されるように、１．３ｎＭ未満のＥＣ₅₀値でのＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅を誘引する、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
5. 前記腫瘍関連抗原が、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕ
   ｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ならびにウロプラキン－３からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
6. 前記腫瘍関連抗原が、ＥＧＦＲｖＩＩＩである、請求項５に記載の薬学的組成物。
7. 前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＭＡである、請求項５に記載の薬学的組成物。
8. 前記腫瘍関連抗原が、ＭＵＣ１６である、請求項５に記載の薬学的組成物。
9. 前記腫瘍関連抗原が、ＳＴＥＡＰ２である、請求項５に記載の薬学的組成物。
10. 前記二重特異性抗体が、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
11. 前記二重特異性抗体が、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
12. 前記がんが、膵臓がん、黒色腫、膠芽腫、頭頸部がん、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がん、黒色腫神経膠腫、乳がん、扁平上皮癌、食道がん、明細胞腎細胞癌、嫌色素細胞性腎癌、腎膨大細胞腫、腎移行上皮癌、尿路上皮癌、腺癌、小細胞癌または免疫系の原発もしくは転移腫瘍からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
13. 前記がんが、神経膠腫、前立腺癌、または卵巣がんである、請求項６から１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

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