JP7696293B2

JP7696293B2 - 不活性化ａｐｘｉａ、ａｐｘｉｉａおよびａｐｘｉｉｉａ毒素

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Publication number: JP7696293B2
Application number: JP2021543459A
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Inventors: フローリアン，フォルカー; ピッド，ヘイコ; ステンゼル，セバスチャン; デウツケンス，ファビアン
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Description

本発明は、不活性化ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡ毒素、該不活性化毒素を含むワクチン、ならびに哺乳動物の免疫化および防御のためのそれらの使用に関する。

Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＰＰ）は、グラム陰性細菌であり、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバーである。ＡＰＰは、世界中のブタの生産において大きな経済的損失をもたらす、ブタの重篤な肺疾患であるブタ胸膜肺炎の病因である。この疾患は、出血性、線維性および壊死性の肺病変を特徴とする。この疾患を生き残ったブタは、多くの場合、ＡＰＰの無症状キャリアとなり、細菌を拡散させる主な原因となる。

これまで、莢膜多糖類（ＣＰＳ）の抗原特性に基づき、また遺伝子型分析の結果、１８種類の血清型が同定されている。ＡＰＰの主な毒性因子は、外毒素、ＣＰＳ、リポ多糖（ＬＰＳ）および膜タンパク質である。最も重要な毒性因子は、膜孔形成ＲＴＸ（ｒｅｐｅａｔｓｉｎｔｏｘｉｎ）ファミリーに属するＡｐｘ外毒素である。この毒素は、非常に免疫原性が高いことが知られており、ＡＰＰ関連の胸膜肺炎に対する防御免疫を得るために非常に重要である。ＡＰＰにより、ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ、ＡｐｘＩＩＩおよびＡｐｘＩＶと称される、少なくとも４つの異なるＡｐｘ毒素が産生される。ＡｐｘＩは強い溶血活性を示し、ＡｐｘＩＩは低い溶血活性を示す。いずれも細胞傷害性であり、様々な宿主種の広範囲な細胞に対して活性を示す。ＡｐｘＩＩＩは溶血活性を示さないが、主要な標的として、ブタ肺胞マクロファージおよび好中球に対して強力な細胞傷害性を有する。ＡｐｘＩＶは、細胞毒性を示さず、弱い溶血活性のみを示す。ＡＰＰの血清型のうち、４つのＡｐｘ毒素の全てを産生するものは存在しない。大部分の血清型は、３つのＡｐｘ毒素を産生する。Ａｐｘ毒素産生のパターンは、毒性と関連し、ＡｐｘＩおよびＡｐｘＩＩを産生する血清型１、５、９および１１は最も毒性が高い。

活性Ａｐｘ毒素の産生および分泌には、少なくとも４つの遺伝子が関与する。遺伝子Ａは毒素の構造部分をコードし、遺伝子Ｃは毒素の翻訳後活性化に必須のアシルトランスフェラーゼをコードする。遺伝子ＢおよびＤは、成熟型毒素の分泌に必要な２つの膜タンパク質をコードする。Ａｐｘ遺伝子はオペロンとして組織化されている。ＡｐｘＩおよびＡｐｘＩＩＩ毒素のオペロンはＣＡＢＤ遺伝子からなる一方、ＡｐｘＩＩオペロンはＣＡ遺伝子のみを含む。したがって、ＡｐｘＩＩＡの分泌は、ＡｐｘＩオペロンの遺伝子ＢおよびＤの活性に依存する。

現在、ブタのＡＰＰ感染に起因する胸膜肺炎の治療は通常、抗生物質により行われている。しかしながら、ＡＰＰはしばしば、ＡＰＰ感染の治療に一般的に用いられる抗生物質の少なくとも１つに対する抗生物質耐性を示すことが見出されている。

ＡＰＰに対するワクチン接種は、胸膜肺炎を予防するための有望な予防ストラテジーである。いくつかのワクチンがこれまで市販されている。市販のワクチンは、化学的に不活性された全細胞ワクチンまたはサブユニットワクチンのいずれかであるか、またはその両方の組み合わせである。全細胞ワクチンでワクチンを接種された動物の免疫学的応答は、主にＣＰＳおよびＬＰＳなどの表面構造に対するものである。免疫原性が高く、防御において不可欠であることが知られている、Ａｐｘ毒素などの分泌タンパク質が存在しないため、その防御能は細菌で限定的に観察されるのみである。さらに、ＡＰＰ全細胞ワクチンは、ワクチンの調製に用いられる血清型と同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）防御能しか付与しない。

市販のサブユニットワクチン（欧州特許第ＥＰ０４５３０２４（Ｂ１）号）は、化学的に不活性化されたＡｐｘＡ毒素と外膜タンパク質とを含む。ホルムアルデヒドなどの変性物質よるＡｐｘＡ毒素の不活性化は、トキソイドの免疫原性の低下につながり得る。かかるワクチンの欠点としては、変性した毒素による不十分な防御、ならびにＡｐｘＡ毒素の不完全な不活性化に起因する、おそらく残存毒性による、付随する重篤な副作用が挙げられる。その上、不活性化後の免疫原性の低下により毒素の使用料を増加させる必要が生じる結果、ワクチン中に混入するＬＰＳの量が増加する。高いＬＰＳ含有量は、市販のＡＰＰサブユニットワクチンの場合に見られるような副作用を生じさせ得る。

結論として、現在市販されているワクチンは、ＡＰＰ感染症に対する満足のいく安全性および／または有効性プロファイルを有さないといえる。

さらに、ＡＰＰワクチンに関する他の実験的アプローチがいくつか存在する。

国際特許出願第ＷＯ２００４／０４５６３９（Ａ１）号は、ＡｐｘＩＡおよびＡｐｘＩＩＡ毒素をコードする遺伝子の膜貫通ドメインが修飾されたＡＰＰ株を含む、ブタ胸膜肺炎に対する生の弱毒化ワクチンを開示している。弱毒化の程度を試験するため、３月齢のブタに修飾された生のＡＰＰ株を接種した。接種の７日後、動物をと殺し、呼吸器官の肉眼的病変を記録した。全ての動物は、剖検時に、行動変化および肺病変を示した。かかる生ワクチンの効力は試験されていない。

欧州特許出願第ＥＰ０８１０２８３（Ａ２）号および欧州特許第ＥＰ０８６１３１９（Ｂ１）号は、ＡｐｘＡの活性化因子である遺伝子ＡｐｘＣを欠失する生の弱毒化ＡＰＰ株を記載している。修飾されたＡＰＰ株は、機能的形態では活性化タンパク質ＡｐｘＣを産生せず、したがって、毒素ＡｐｘＩＡおよびＡｐｘＩＩＡはアシル化により活性化されないものであった。マウスにΔａｐｘＣ株をワクチン接種し、毒性型のＡＰＰ野生株を曝露させた。接種されたマウスは、同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）曝露から防御され、異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）曝露からは部分的に防御された。ブタにおける１つの試験が実施された。ワクチン接種されたブタ６匹のうち１匹は、異種曝露および剖検後に肺病変を有していた。これらの弱毒化された生ワクチンは有効と考えられるが、このワクチンには安全性面でのリスクが存在する。ワクチン株が産生するＡｐｘ毒素は、ＡｐｘＣを欠失するため、アシル化による活性化を受けない。しかしながら、これらの毒素は毒性を有するＡｐｘＡのアミノ酸配列をそのままの形で有する。異種のアシルトランスフェラーゼがＡｐｘＡをアシル化してＡｐｘＡを活性な毒性形態に変換し得ることは、十分に考えられる。世界中の大多数のブタの飼育施設では、毒性ＡＰＰ株の無症状キャリア、ならびに低毒性ＡＰＰ株に感染したブタが存在する。かかるブタをΔａｐｘＣワクチン株でワクチン接種した場合、ワクチン株の非活性化ＡｐｘＡ毒素は、野生株の機能的ＡｐｘＣタンパク質により活性化され得る。さらに、機能的ａｐｘＣ遺伝子の取り込みにより、ａｐｘＣ欠失が補完される可能性もある。弱毒化された株が病原性を回復し、接種された動物において疾患を発症させる可能性もある。

今日まで、弱毒化生ワクチンは市販されていない。

したがって、安全性が高く、またブタおよび／または仔ブタにおいて全ての関連する血清型に対する交差的防御を誘導し得る、ＡＰＰに対する改善されたワクチンに対するニーズが存在する。

したがって、本発明の課題は、不活性ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡ毒素、ならびに、これらのトキソイドの安全かつ有効なサブユニットおよび生ワクチンの、ブタの胸膜肺炎に対する使用を提供することである。

本発明は、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡ毒素のアシル化部位を修飾して、不活性であるが完全な免疫原性を有する、これらのタンパク質のトキソイド形態を作製することを開示する。２つのアシル化部位のアミノ酸がいずれも別のアミノ酸により置換されることで、それらのアシル化が防止される。それにより、これらの修飾Ａｐｘ毒素は、標的細胞膜への結合を開始することができず、細胞毒性または溶血活性を有さなくなる。これらの毒素は化学的に不活性化される必要はないため、非常に免疫原性の高いタンパク質が得られる。有効なサブユニットワクチンを産生するために必要となるこれらのタンパク質の量は比較的少なくなる。したがって、混入するＬＰＳの含有量も比較的少なくなり、嘔吐および無気力などの副作用の軽減がもたらされる。化学的に不活性化されたＡｐｘサブユニットと比較し優れた免疫原性を有するため、本発明によるサブユニットワクチンは、より優れた安全性プロファイルとなる。

さらに、本発明は、２つのアミノ酸の置換がＡｐｘＡ遺伝子の遺伝子組換えに基づくため、生ワクチンにて用いることもできる。すなわち、それをＡＰＰ株に導入することにより、次に、不活性化された免疫原性の高いＡｐｘタンパク質を産生することができる。これらの株は、ＡｐｘＡトキソイドおよび広範囲な他のＡＰＰタンパク質を産生する生ワクチンとして用いることができる。これらのワクチンは、複雑な免疫応答および広範囲なＡＰＰの血清型に対する交差防御を誘導する。ＡｐｘＡ遺伝子の遺伝子改変により、産生されたＡｐｘトキソイドは、異種アシルトランスフェラーゼにより活性化され得ない。ＡＰＰ株の生ワクチンを用いる場合、多くの利点が得られる。生ワクチンを用いる場合、親抗体のワクチンへの影響は、高免疫原性の抗原からなるサブユニットワクチンと比較し低くなることが予想される。したがって、このワクチンは、６週齢前のブタにおいて用いることができ、また利用可能なワクチンの既存の免疫学的ギャップを回避できる可能性が高い。さらに、遺伝子ノックアウトを用いることで、さらに弱毒化したワクチン株を得ることができ、また、例えばａｐｘＩＶＡ遺伝子の欠失による遺伝子ノックアウトを、感染動物をワクチン接種動物と区別する（ＤＩＶＡ）ためのマーカーとして用いることができる。したがって、本発明は、既知のあらゆるワクチン接種アプローチよりも優れた安全性および有効性プロファイルを提供する。ＡＰＰはブタに対して強く適応するため、弱毒化したＡＰＰワクチン株は、ブタに関連する他の病原体の抗原のベクターとして用いることもできる。

本発明は、添付の特許請求の範囲により定義される。

本願では、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドであって、
ａ．
ｉ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５６０およびＫ６８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５５７およびＮ６８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉｉ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５７１およびＫ７０２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
かつ、少なくとも１つのアミノ酸が、アシル化感受性のないアミノ酸により置き換えられている、ものであるか、または、
ｂ．ａ．で定義される修飾アミノ酸配列の、アナログもしくは断片であって、ａ．で定義される修飾アミノ酸配列と少なくとも９０％相同であり、断片が、ａ．で定義される修飾アミノ酸配列の連続的なアミノ酸の少なくとも５０％を含み、アナログまたは断片が、ａ．で定義されるアシル化感受性のないアミノ酸を含む、アナログもしくは断片であるか、または、
ｃ．
ｉ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５６０およびＫ６８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含み、
ｉｉ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５５７およびＮ６８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含み、
ｉｉｉ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５７１およびＫ７０２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含み、
欠失が、野生型アミノ酸配列の５０％を超えて欠失されない、ものであるか、
ｄ．ｃ．で定義される欠失を含むアミノ酸配列のアナログであって、ｃ．で定義される欠失を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％相同である、アナログである、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドが開示される。

以下の見出しは、本開示を単に整理するものに過ぎず、本開示中のある１つのセクションを、本開示中の別のセクションから区別するものとみなすべきではない。各セクションの特徴は、別のセクションの特徴と組み合わせることができる。

一般的定義
本明細書で使用される「断片またはアナログ」という用語は、以下のように定義される：
「アナログ」とは、元のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％のレベルの相同性を示すアミノ酸配列とみなすことができる。相同性とは、本明細書で用いる場合には、同一性を意味する。したがって、それらの配列は、保存的置換、欠失または挿入に基づき相互に異なり得る。

同一性の程度は、例えば以下のようなデフォルトパラメータによるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて、タンパク質ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる：期待閾値（Ｅｘｐｅｃｔｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）１０、ワードサイズ（Ｗｏｒｄｓｉｚｅ）：３、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＭＳＵＭ６２、ギャップコスト（ＧａｐＣｏｓｔｓ）：存在（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１、伸張：１、および構成調整（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ）：条件付き組成スコアマトリックス調整（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｓｃｏｒｅｍａｔｒｉｘａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）（ＢＬＡＳＴは国立医学図書館（ＮａｔｉｏｎａｌＬｉｂｒａｒｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）の登録商標である）。プログラムを使用して、タンパク質クエリを用いてタンパク質データベースを検索することができる。整列されたクエリとデータベース配列との間の正確な一致が、同一性として出力される。

好ましくは、保存的なアミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似する構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換した結果であり、すなわち保存的アミノ酸置換のことである。アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づき行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ、正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ、負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

「挿入」または「欠失」は、典型的には、約１、２または３つのアミノ酸の範囲でなされる。許容される改変は、組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質中にアミノ酸の挿入または欠失を体系的に導入し、得られる組換え改変体の活性をアッセイすることにより、実験的に決定され得る。これは、当業者のルーチン実験の域を出るものではない。

ポリペプチドの「断片」は、元のポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９７％を含む。これらの断片は、本発明によるワクチンにおける排他的な活性成分として用いられ得る。

ＡＰＰ「毒素」は、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡのアミノ酸配列（例えば配列番号１～３に示される）からなり、細胞傷害性および／または溶血活性を示すポリペプチドである。本開示における「トキソイド」とは、「毒素」の修飾形態であるポリペプチドのことであり、この修飾は、ＡＰＰにおいてインビボでのアシル化感受性を有するアミノ酸の置換または欠失により実施され、それにより細胞傷害性または溶血活性を示さない。

ワクチン組成物の前後関係において本明細書で用いられる「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、さらなる活性または免疫原性成分が存在し得ることを意味する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」とは、さらなる成分が存在しないことを意味し、「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」とは、特定のさらなる成分、すなわちワクチンの本質的な特徴に実質的に影響を及ぼさない成分（すなわち不活性または非免疫原性の成分）が存在することができることを意味する。

Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属には、グラム陰性の、非胞子形成性の、また呼吸器および泌尿生殖器の粘膜表面にコロニー形成する、主に莢膜を有する細菌種が含まれる。獣医学的に関連のある種は、例えば、本開示の好ましいＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌であるＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａ．ｓｕｉｓ、Ａ．ｅｑｕｕｌｉおよびＡ．ｌｉｇｎｉｅｒｅｓｉｉである。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌は通常、強い宿主特異性を示す。好ましいＡＰＰの血清型は、血清型１、５、７、８、９および１１である。

ポリペプチド
本開示は、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチド（以下、簡潔化のため、交換可能にＡｐｘＡポリペプチドと称する）に関し、そこにおいて、野生型ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドが、野生型ポリペプチド中のアシル化感受性を有するアミノ酸位置において、アミノ酸の置換または欠失による修飾を受けている。アミノ酸置換とは、アシル化感受性を有さないアミノ酸を導入することである。上記の方法で修飾されたＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドは、驚くべきことに、もはや溶血活性および／または細胞傷害活性を示さない。したがって、それらを用いることで、哺乳動物にワクチン接種したときの副作用を低く抑えつつ、ＡＰＰに対する免疫的防御能を付与することができる。したがって、それらは不活性化毒素、すなわちトキソイドとみなすことができる。ゆえに、本開示のポリペプチドは、対象動物、特に哺乳動物のＡＰＰ感染に対する免疫化を行うためのワクチンにおいて安全に使用することができる。

野生型ポリペプチド内のアシル化感受性を有するアミノ酸位置に置換を含むポリペプチド
特に、本開示は、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドに関し、そこにおいて、
ａ．
ｉ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列は、Ｋ５６０およびＫ６８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列は、Ｋ５５７およびＮ６８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉｉ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列は、Ｋ５７１およびＫ７０２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
少なくとも１つのアミノ酸は、アシル化感受性を有さないアミノ酸で置き換えられている。

ポリペプチドは、哺乳動物、特にブタにおいて、該哺乳動物に投与されたとき、ＡＰＰの１つ以上の血清型に対する体液性または／および細胞性の免疫応答を誘導することができる。ポリペプチドは、哺乳動物、特にブタにおいて、該哺乳動物に投与されたとき、ＡＰＰの１つの株、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の株のＡＰＰに対する体液性または／または細胞性の免疫学的応答を誘導することができる。好ましくは、ポリペプチドは、ＡＰＰ、ＡＰＰ株またはＡＰＰ血清型に対する無菌免疫を誘導する。

ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩｌＩＡの各々は、アシル化感受性を有する２つのアミノ酸を含む。その修飾は、該アミノ酸の一方または両方に影響を及ぼすことができる。

本開示はまた、上記で定義される修飾アミノ酸配列の、アナログまたは／および断片であって、上記で定義される修飾アミノ酸配列と少なくとも９０％相同であり、断片が、上記で定義される修飾アミノ酸配列の連続的なアミノ酸の少なくとも５０％を含み、上記で定義されるアシル化感受性を有さないアミノ酸を含む、アナログまたは／および断片に関する。

上記で定義されるように、アナログは、欠失または保存的置換により、野生型と異なることができる。しかしながら、アナログは、アシル化感受性を有するアミノ酸を置き換えるアミノ酸を常に含む。

修飾されたポリペプチドは、アシル化感受性を有するアミノ酸を含まないため、修飾されポリペプチドをアシル化することができない。このようにして修飾されたポリペプチドは、いかなる内因性または外因性のアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡｐｘＣ）によってもアシル化することができない。以下に実験的に示されるように、これらの修飾ポリペプチドは、もはや実質的な病理学的効果を示さず、したがって、ワクチン組成物において安全に使用することができる。たとえ、アシルトランスフェラーゼが、天然に存在するＡＰＰ株から、または他の何らかのアシルトランスフェラーゼの供給源のいずれかから、インビボで外因的に提供されたとしても、それらが病理学的効果を示すため、これらの修飾ポリペプチドは、アシルトランスフェラーゼＡｐｘＣが欠失しているワクチンよりも、ワクチン組成物への使用において安全性が高い。同様の考慮は、ＡＰＰの１つまたは２つのアシル化感受性を有するアミノ酸が欠失している以下のポリペプチドにも適用される。

野生型ポリペプチド内のアシル化感受性を有するアミノ酸位置に欠失を含むポリペプチド
野生型ポリペプチドにおいてアシル化感受性を有するアミノ酸を置換する代わりに、アミノ酸を欠失させて、野生型ポリペプチドの病理学的効果を解消することもできる。

したがって、本開示はまた、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドに関し、そこにおいて、
ｉ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５６０およびＫ６８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含み、
ｉｉ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５５７およびＮ６８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含み、
ｉｉｉ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５７１およびＫ７０２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む欠失を含む。

ポリペプチドは、哺乳動物、特にブタにおいて、該哺乳動物に投与されたとき、ＡＰＰの１つ以上の血清型に対する体液性または／および細胞性の免疫応答を誘導することができる。ポリペプチドは、哺乳動物、特にブタにおいて、該哺乳動物に投与されたとき、ＡＰＰの１つの株、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の株のＡＰＰに対する体液性または／および細胞性の免疫学的応答を誘導することができる。好ましくは、ポリペプチドは、ＡＰＰ、ＡＰＰ血清型、ＡＰＰ株またはＡＰＰ血清型に対する無菌免疫を誘導する。

上記のように、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡの各々は、アシル化感受性を有する２つのアミノ酸を含む。該アミノ酸の欠失には、当該アミノ酸の一方または両方を含めることができる。

したがって、欠失には、各野生型配列におけるアシル化感受性を有する１つのみまたは２つのアミノ酸を欠失する点欠失を含めることができる。また、欠失としては、アシル化感受性を有する１つまたは２つのアミノ酸に隣接する領域のアミノ酸における欠失も開示される。すなわち、欠失においてアシル化感受性を有する２つのアミノ酸のうちの１つを含む限り、それぞれの欠失は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、３５０、４００個のアミノ酸を含み得る。アシル化感受性を有する各アミノ酸における欠失のサイズは各々独立であり、同じサイズを有することもできる。アシル化感受性を有する２つのアミノ酸間の連続するアミノ酸の連続部分をカバーする欠失もまた開示される。

欠失は、野生型アミノ酸配列の５０％を超えて欠失するしない。

本開示はまた、上記で定義される修飾アミノ酸配列と少なくとも９０％相同であり、上記で定義されるアシル化感受性を有さないアミノ酸を含まない、上記で定義される修飾アミノ酸配列のアナログに関する。かかるアナログは、一般的定義に関連するセクションで定義されるような保存的置換および欠失を含むことができる。したがって、該ポリペプチドは、アシル化感受性を有する１つまたは２つのアミノ酸を含む欠失領域の外側にさらなる欠失を含み得るが、これらの欠失は、１、２、３つのアミノ酸のみを欠失させるものとなろう。

アシル化感受性を有さないアミノ酸
アシル化感受性を有するアミノ酸は、天然に発生するアミノ酸、例えばリジンおよび／またはアスパラギンである。アシル化感受性を有さないアミノ酸は、当業者に既知であり、アシル化感受性を有するアミノ酸の一方または両方を置換するために用いることができる。例えば、アシル化感受性を有さないアミノ酸は、独立して、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸、システイン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびグルタミン酸からなる群から選択され得る。特に、アシル化感受性を有さないアミノ酸は、独立して、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン、イソロイシン、およびロイシンからなる群から選択することができる。
さらに、アシル化感受性を有さないアミノ酸は、独立して、アラニン、グリシン、およびセリンからなる群から選択することができる。アシル化感受性を有さない最も好ましいアミノ酸アミノ酸は、アラニンである。

２つの修飾されたアミノ酸を有するＡＰＸＩＡ、ＡＰＸＩＩＡまたはＡＰＸＩＩＩＡポリペプチド
好ましくは、アシル化感受性を有する２つのアミノ酸は、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡのそれぞれにおいて修飾される。

すなわち、配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型配列は、Ｋ５６０およびＫ６８６で修飾される。すなわち、配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型配列は、Ｋ５５７およびＮ６８７で修飾される。すなわち、配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型配列は、Ｋ５７１およびＫ７０２で修飾される。

また、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡのそれぞれにおいてアシル化感受性を有する該２つのアミノ酸がアラニンに修飾されることも開示されている。

すなわち、開示される修飾されたポリペプチドは、配列番号４、５または６に示される配列を有するか、または上記で定義されるそれらのアナログまたは断片であることができる。

核酸
上記のポリペプチドをコードすることができる核酸配列を含む核酸もまた開示される。開示される核酸は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）であることができる。「核酸配列」という用語は、これらのヌクレオチドの配列を有するヌクレオチドのヘテロポリマーを指す。核酸は、配列番号１０、１１または１２に記載の核酸を含むことができる。

核酸は、本開示における核酸のクローニングまたは発現に好適なベクターに含まれることができる。例示的なベクターは、ｐＥＸ－Ａ２５８（配列番号１９）、ｐＱＥ－８０Ｌ（配列番号２０）またはｐＱＥ－６０（配列番号２１）である。核酸またはベクターは、誘導性または非誘導性のプロモーター、オペレーター（例えば、ｌａｃ－オペレーター）または他のＡＰタンパク質をコードする核酸などの、さらなる調節性の非コードエレメントを含むことができる。さらに、本発明によるワクチン組成物は、ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドによって、さらに特徴付けられることが好ましく、ポリヌクレオチドは、ベクターの発現制御領域に作動可能に連結される。すなわち、発現ベクター中に、好ましくは、改変形態のＡｐｘＡをコードする核酸配列に加えて、１つ以上の調節配列を含む、発現ベクターもまた開示される。「発現ベクター」という用語は、通常、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現するための、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現を調節する役割を有する１つまたは複数の遺伝的エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列と、（３）適切な転写開始および終結配列と、のアセンブリを含む転写単位を含むことができる。酵母または真核生物発現系での使用を意図した構造単位は、好ましくは、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列を有さずに発現される場合、それはＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は次に、発現した組換えタンパク質から切断されて最終生成物となってもよく、そうでなくともよい。

微生物
上記で開示される核酸または／およびベクターを含む微生物もまた開示される。微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えばＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０Ｆ’株などのＥ．ｃｏｌｉ菌株、またはＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、例えば、ＳＴ２（例えばＡＰＰ２３）、ＳＴ２（例えば０７／０７）、ＳＴ５（例えばＤＺＹ４７）、ＳＴ７（例えばＤＺＹ３３）、またはＳＴ８（例えばＤＺＹ４９）などのＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株であってもよい。微生物はまた、他の遺伝子をコードする核酸または／およびベクターを含む。

ワクチン組成物
また、上記で定義される修飾されたＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドの少なくとも１つ、上記で定義される核酸分子、または上記で定義されるベクター、または上記で定義される微生物を含むワクチン組成物も開示される。ワクチン組成物は、少なくとも薬学的担体、希釈剤、または／およびアジュバントを含んでもよい。

本発明によるワクチン組成物の調製は、当技術分野で既知であり、当業者に既知のハンドブックに記載されている。本発明によるワクチン組成物の製造の際、限定されないが、薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントとしては、鉱塩アジュバント（例えばアルミ、カルシウム、鉄、ジルコニウム系）、テンソアクティブアジュバント（例えばＱｕｉｌＡ、ＱＳ－２１、他のサポニン類）、細菌由来のアジュバント（例えばＮ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、ＤＮＡ、ＣｐＧ、細菌毒素）、アジュバントエマルジョン（例えばＦＩＡ、モンタニド、アジュバント６５、リポバント）、リポソームアジュバント、高分子アジュバントおよび担体、サイトカイン（例えば顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）、炭水化物系アジュバント、生抗原送達系（例えば細菌、特に改変ＡＰＰ）が挙げられる。さらに、担体としてはまた、チタンまたはポリマーから製造されたコーティングパッチなどの乾燥製剤も挙げられる。また、本願のワクチンの製剤化および投与のための技術については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ」（第２２版）に記載されている。

単位投与組成物としてのワクチン組成物は、０．０１～２．０ｍｇのタンパク質、０．０１～２．０ｍｇの核酸、または０．５～２００ｍｇ（または１×１０^４ＣＦＵ～１×１０^１０ＣＦＵ、コロニー形成単位）の微生物を含んでもよい。必要となるタンパク質、核酸または微生物のアクティブ量は、当業者が、例えばブタまたは仔ブタに対するルーチン試験により決定することができる。

上記の少なくとも１つのＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドを含むワクチン組成物は、サブユニットワクチンであってもよい。サブユニットワクチンは、さらなるＡＰＰポリペプチドを含んでもよい。

また、ワクチンは、実質的に核酸またはベクターのみを含有する、例えばＤＮＡワクチンであることも企図される。ＤＮＡワクチンは第三世代ワクチンである。核酸またはＤＮＡワクチンは、ＡＰＰ由来の特定のタンパク質（ＡｐｘＡ）をコードするＤＮＡ／核酸を含む。ＤＮＡ／核酸は、哺乳動物の体内に注射され、細胞により取り込まれ、細胞の通常の代謝プロセスにおいて、それらが取り込んだ核酸内の遺伝的コードに基づきタンパク質を合成する。これらのタンパク質は、ＡＰＰに特徴的なアミノ酸配列の領域を含むため、それらは外来物として認識され、宿主細胞により処理され、それらの表面に提示されると、免疫系がアラートされ、次いで免疫応答が誘発される。

あるいは、核酸は、細胞内へのエントリーを容易にするために、タンパク質に封入されてもよい。このカプシドタンパク質が核酸に含まれる場合、得られるワクチンは、毒性復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）のリスクなく、生ワクチンの効力を組み合わせることができる。

ワクチン組成物中の上記の微生物は、例えばＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓなどのＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、例えばＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓなどのＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の株、または特定のＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の株の血清型であってもよい。ワクチン組成物は、少なくとも１種、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種または７種のＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の株または血清型を含んでもよい。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、株または血清型の各々は、上記で定義される少なくとも１つのポリペプチドをコードし得る。

ワクチン組成物中の上記の微生物は、開示される修飾されたＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドとは異なるＡＰＰタンパク質をコードするＡＰＰ核酸を含まない場合がある。例えば、微生物は、ａｐｘＩＶ遺伝子または／およびｓｘｙ遺伝子の欠失を含む場合がある。

加えて、ワクチン組成物中のＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの少なくとも１つは、以下の修飾のうちの１つまたは少なくとも２つ（例えば単一または複数の欠失）を含んでもよい：ΔｔｂｐＡ、ΔｔｏｎＢ２、ΔｓｏｄＣ、ΔｄｓｂＡ、Δｆｕｒ、ΔｍｌｃＡ、ΔｍｇｌＡ、ΔｅｘｂＢ、ΔｕｒｅＣ、ΔｅｘｂＢ ΔｕｒｅＣ二重変異体、ΔｆｈｕＡ、ΔｈｌｙＸ、ΔａｐｘＩＣおよびΔａｐｘＩＩＣ二重変異体、ΔａｐｘＩＣ ΔａｐｘＩＩＣ Δｏｒｆ１三重変異体、ΔａｐｘＩＩＡ ΔｕｒｅＣ ΔｄｍｓＡ ΔｈｙｂＢ ΔａｓｐＡ Δｆｕｒ六重変異体、ΔａｐｘＩＩＩＢ ΔａｐｘＩＩＩＤ二重変異体、ΔｃＩｐＰおよびΔａｐｘＩＩＣ二重変異体、ΔｚｎｕＡ、ΔａｐｆＡ、ΔａｐｘＩＩＡおよびΔｕｒｅＣ二重変異体、ΔａｐｘＩＣ ΔａｐｘＩＩＣ Δｏｒｆ１ ΔｃｐｘＡＲ ΔａｒｃＡ五重変異体、ΔａｐｘＩＣ ΔｏｍｐＰ２二重変異体、ΔａｐｘＩＩＣ ΔａｐｘＩＶＡ二重変異体、不活性ａｐｘＩＩＣ、不活性ａｐｘＩＣ、Δｌｉｐ４０、ΔｃｐｘＡ／ｃｐｘＲ、ΔｐｏｔＤ２、ΔｔｏｌＣ２、ΔｓａｐＡまたはΔＰｄｘＳ／ＰｄｘＴ。

上記で開示されるＡｐｘＩＡのトキソイド形態ならびに少なくとも１つのＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドを含むワクチン組成物は、顕著に増強された免疫原性および防御効果を示す。上記で開示されるＡｐｘＩＡのトキソイド形態ならびに少なくとも１つのＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドを含むワクチン組成物は、細胞毒性効果を示さず、溶血作用を示さず、従来の免疫化後に生じ得る免疫化後の顕著な体温上昇を引き起こさない。

上記の修飾は、以下に記載されている：
Ｂａｌｔｅｓ，Ｎｉｎａ；Ｈｅｎｎｉｇ－Ｐａｕｋａ，Ｉｓａｂｅｌ；Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｇｅｒａｌｄ－Ｆ（２００２）：“ＢｏｔｈｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｉｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｅｒｏｔｙｐｅ７ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”ＩｎＦＥＭＳｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ２０９（２），ｐｐ．２８３－２８７、
Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｊ．；Ｂｏｓｓｅ，Ｊ．Ｔ．；Ｂｅｄｄｅｋ，Ａ．Ｊ．；Ｒｙｃｒｏｆｔ，Ａ．Ｎ．；Ｋｒｏｌｌ，Ｊ．Ｓ．；Ｌａｎｇｆｏｒｄ，Ｐ．Ｒ．（２００３）：“ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＧｅｎｅｓＩｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒＳｕｒｖｉｖａｌｄｕｒｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＩｔｓＮａｔｕｒａｌＨｏｓｔ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ７１（７），ｐｐ．３９６０－３９７０．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＩＡＩ．７１．７．３９６０－３９７０．２００３、
Ｂａｌｔｅｓ，Ｎ．；Ｔｏｎｐｉｔａｋ，Ｗ．；Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｇ．Ｆ．；Ｈｅｎｎｉｇ－Ｐａｕｋａ，Ｉ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｍｏｕｊａｈｉｄ，Ａ．；Ｇａｎｔｅｒ，Ｍ．；Ｒｏｔｈｋｏｔｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．（２００１）：“Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｒｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｕｒｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌｖｉｒｕｌｅｎｃｅａｎｄｈｏｓｔｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．“ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ６９（１），ｐｐ．４７２－４７８．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＩＡＩ．６９．１．４７２－４７８．２００１、
Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｍａｒｉｏ（２００４）：“Ｓｕｒｆａｃｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｉｒｏｎ－ｕｐｔａｋｅｓｙｓｔｅｍｓｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＩｎＣａｎａｄｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｒｅｓｅａｒｃｈ＝Ｒｅｖｕｅｃａｎａｄｉｅｎｎｅｄｅｒｅｃｈｅｒｃｈｅｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ６８（２），ｐｐ．８１－８５、
Ｂａｌｔｅｓ，Ｎｉｎａ；Ｎ’ｄｉａｙｅ，Ｍｏｈａｍｅｄ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ，ＩｌｓｅＤ．；Ｍａａｓ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ；Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，ＦａｌｋＦ．Ｒ．；Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｇｅｒａｌｄ－Ｆ（２００５）：“ＤｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒＨｌｙＸｃａｕｓｅｓｒｅｄｕｃｅｄｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｎｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ７３（８），ｐｐ．４６１４－４６１９．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＩＡＩ．７３．８．４６１４－４６１９．２００５、
Ｌｉｎ，Ｌｉｗｅｎ；Ｂｅｉ，Ｗｅｉｃｈｅｎｇ；Ｓｈａ，Ｙｏｎｇｇａｎｇ；Ｌｉｕ，Ｊｉｎｌｉｎ；Ｇｕｏ，Ｙｉ；Ｌｉｕ，Ｗｅｉｈｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）：“ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｃｉｔｙｏｆａＤｅｌｔａａｐｘＩＣ／ＤｅｌｔａａｐｘＩＩＣｄｏｕｂｌｅｍｕｔａｎｔｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｅｒｏｖａｒ１．”ＩｎＦＥＭＳｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ２７４（１），ｐｐ．５５－６２．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１５７４－６９６８．２００７．００８１３．ｘ、
Ｙｕａｎ，Ｆａｎｇｙａｎ；Ｌｉｕ，Ｊｉｎｌｉｎ；Ｇｕｏ，Ｙｉ；Ｔａｎ，Ｃｈｅｎ；Ｆｕ，Ｓｈｕｌｉｎ；Ｚｈａｏ，Ｊｉｎｅｔａｌ．（２０１１）：“ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆＯＲＦ１ｏｎｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＩｎＣｕｒｒｅｎｔｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６３（６），ｐｐ．５７４－５８０．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２８４－０１１－００１６－０、
Ｍａａｓ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ；Ｊａｃｏｂｓｅｎ，ＩｌｓｅＤ．；Ｍｅｅｎｓ，Ｊｏｃｈｅｎ；Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｇｅｒａｌｄ－Ｆ（２００６）：“ＵｓｅｏｆａｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｍｕｌｔｉｐｌｅｍｕｔａｎｔａｓａｖａｃｃｉｎｅｔｈａｔａｌｌｏｗｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｎｄｉｎｆｅｃｔｅｄａｎｉｍａｌｓ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ７４（７），ｐｐ．４１２４－４１３２．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＩＡＩ．００１３３－０６、
Ｐａｒｋ，Ｃｈａｎｇｂｏ；Ｈａ，Ｙｏｏｎｃｈｅｏｌ；Ｋｉｍ，Ｓｏｏｈｅｅ；Ｃｈａｅ，Ｃｈａｎｈｅｅ；Ｒｙｕ，Ｄｏｕｇ－Ｙｏｕｎｇ（２００９）：“ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｅｒｏｔｙｐｅ２ｍｕｔａｎｔｌａｃｋｉｎｇｔｈｅＡｐｘｔｏｘｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓａｐｘＩＩＩＢａｎｄａｐｘＩＩＩＤ．”ＩｎＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ７１（１０），ｐｐ．１３１７－１３２３、
Ｘｉｅ，Ｆａｎｇ；Ｌｉ，Ｇａｎｇ；Ｚｈｏｕ，Ｌｏｎｇ；Ｚｈａｎｇ，Ｙａｎｈｅ；Ｃｕｉ，Ｎｉｎｇ；Ｌｉｕ，Ｓｉｇｕｏ；Ｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｌａｉ（２０１７）：“ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｄｏｕｂｌｅ－ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔＳ－８ΔｃｌｐＰ／ａｐｘＩＩＣｃｏｎｆｅｒｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｓｔｒａｉｎｃｈａｌｌｅｎｇｅ．”ＩｎＢＭＣｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｒｅｓｅａｒｃｈ１３（１），ｐ．１４．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２９１７－０１６－０９２８－９、
Ｙｕａｎ，Ｆａｎｇｙａｎ；Ｌｉａｏ，Ｙｏｎｇｈｏｎｇ；Ｙｏｕ，Ｗｕｊｉｎ；Ｌｉｕ，Ｚｅｗｅｎ；Ｔａｎ，Ｙｏｎｇｑｉａｎｇ；Ｚｈｅｎｇ，Ｃｈｅｎｇｋｕｎｅｔａｌ．（２０１４）：“ＤｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅｚｎｕＡｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒａｔｔｅｎｕａｔｅｓＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄｃｏｎｆｅｒｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｓｔｒａｉｎｃｈａｌｌｅｎｇｅ．”ＩｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１７４（３－４），ｐｐ．５３１－５３９．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖｅｔｍｉｃ．２０１４．１０．０１６、
Ｚｈｏｕ，Ｙａｎｇ；Ｌｉ，Ｌｕ；Ｃｈｅｎ，Ｚｈａｏｈｕｉ；Ｙｕａｎ，Ｈｏｎｇ；Ｃｈｅｎ，Ｈｕａｎｃｈｕｎ；Ｚｈｏｕ，Ｒｕｉ（２０１３）：“ＡｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＡｐｆＡｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”ＩｎＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＣＶＩ２０（２），ｐｐ．２８７－２９４．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＣＶＩ．００６１６－１２、
Ｔｏｎｐｉｔａｋ，Ｗａｌａｉｐｏｒｎ；Ｂａｌｔｅｓ，Ｎｉｎａ；Ｈｅｎｎｉｇ－Ｐａｕｋａ，Ｉｓａｂｅｌ；Ｇｅｒｌａｃｈ，ＧｅｒａｌｄＦ．（２００２）：“ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｅｒｏｔｙｐｅ２ｐｒｏｔｏｔｙｐｅｌｉｖｅｎｅｇａｔｉｖｅ－ｍａｒｋｅｒｖａｃｃｉｎｅ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ７０（１２），ｐｐ．７１２０－７１２５、
Ｙｕａｎ，Ｆａｎｇｙａｎ；Ｌｉｕ，Ｊｉｎｌｉｎ；Ｙｏｕ，Ｗｕｊｉｎ；Ｂｅｉ，Ｗｅｉｃｈｅｎｇ；Ｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｌａｉ；Ｚｈａｏ，Ｊｉｎｅｔａｌ．（２０１８）：“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｑｕｉｎｔｕｐｌｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔＳＬＷ０７（ΔａｐｘＩＣ ΔａｐｘＩＩＣ Δｏｒｆ１ ΔｃｐｘＡＲ ΔａｒｃＡ）．”ＩｎＶａｃｃｉｎｅ３６（１４），ｐｐ．１８３０－１８３６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１８．０２．０８３、
Ｌｉｕ，Ｑｉｏｎｇ；Ｇｏｎｇ，Ｙｕｈｅｎｇ；Ｃａｏ，Ｙｕｑｉｎ；Ｗｅｎ，Ｘｉｎｔｉａｎ；Ｈｕａｎｇ，Ｘｉａｏｂｏ；Ｙａｎ，Ｑｉｇｕｉｅｔａｌ．（２０１３）：“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａ ΔａｐｘＩＣ／ｏｍｐＰ２ｍｕｔａｎｔｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ．”ＴｈｅＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｒｅｓｅａｒｃｈ８０（１），ｐ．５１９．ＤＯＩ：１０．４１０２／ｏｊｖｒ．ｖ８０ｉ１．５１９、
Ｌｉｕ，Ｊｉｎｌｉｎ；Ｃｈｅｎ，Ｘｉａ；Ｌｉｎ，Ｌｉｗｅｎ；Ｔａｎ，Ｃｈｅｎ；Ｃｈｅｎ，Ｙａｎ；Ｇｕｏ，Ｙｉｅｔａｌ．（２００７）：“ＰｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅａｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｄｏｕｂｌｅｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎＤｅｌｔａａｐｘＩＩＣＤｅｌｔａａｐｘＩＶＡａｓｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｈａｔａｌｌｏｗｓｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｎｄｉｎｆｅｃｔｅｄａｎｉｍａｌｓ．”Ｖａｃｃｉｎｅ２５（４４），ｐｐ．７６９６－７７０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００７．０７．０５３、
Ｂｅｉ，Ｗｅｉｃｈｅｎｇ；Ｈｅ，Ｑｉｇａｉ；Ｙａｎ，Ｌｉｎ；Ｆａｎｇ，Ｌｉｕｒｏｎｇ；Ｔａｎ，Ｙａｄｉ；Ｘｉａｏ，Ｓｈａｏｂｏｅｔａｌ．（２００５）：“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄａｐｘＩＩＣＡｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌａｃｋｉｎｇａｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍａｒｋｅｒ．”ＩｎＦＥＭＳｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ２４３（１），ｐｐ．２１－２７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｍｓｌｅ．２００４．１１．０３３、
Ｘｕ，Ｆｕ－Ｚｈｏｕ；Ｓｈｉ，Ａｉ－Ｈｕａ；Ｃｈｅｎ，Ｘｉａｏ－Ｌｉｎｇ；Ｙａｎｇ，Ｂｉｎｇ；Ｗａｎｇ，Ｊｉｎ－Ｌｕｏ（２００７）：“ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄｍｕｔａｎｔｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｂｙｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｐｘＩＣ．”ＷｅｉＳｈｅｎｇｗｕｘｕｅｂａｏ＝ＡｃｔａｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ４７（５），ｐｐ．９２３－９２７、
Ｐｒｉｄｅａｕｘ，Ｃ．Ｔ．；Ｌｅｎｇｈａｕｓ，Ｃ．；Ｋｒｙｗｕｌｔ，Ｊ．；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ａ．Ｌ．（１９９９）：“ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｉｇｓａｇａｉｎｓｔｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｗｉｔｈａｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅＡｐｘＩＩｏｐｅｒｏｎ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ６７（４），ｐｐ．１９６２－１９６６、
Ｌｉｕ，２０１８ “ＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＬｉｐ４０ＭｏｄｕｌａｔｅｓＡｄｈｅｒｅｎｃｅ，Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＶｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１８Ｊｕｌ３；９：１４７２．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１８．０１４７２、
Ｌｉ，２０１８ “ＴｈｅＣｐｘＡ／ＣｐｘＲＴｗｏ－ＣｏｍｐｏｎｅｎｔＳｙｓｔｅｍＡｆｆｅｃｔｓＢｉｏｆｉｌｍＦｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＶｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＦｒｏｎｔＣｅｌｌＩｎｆｅｃｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１８Ｍａｒ２０；８：７２．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｃｉｍｂ．２０１８．０００７２、
Ｚｈｕ２０１７ “Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＰｏｔＤ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．２０１７Ｄｅｃ；１１０（１２）：１６４７－１６５７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０４８２－０１７－０９１４－７、
Ｌｉ２０１７ “ＴｏｌＣ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７Ｊｕｌ３１．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｊｍｍ．０．０００５４４、
Ｘｉｅ２０１７ “ＴｈｅＳａｐＡＰｒｏｔｅｉｎＩｓＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅＰＲ－３９ａｎｄＶｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７Ｍａｙ１０；８：８１１．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．００８１１、および
Ｘｉｅ２０１７ “ＰｙｒｉｄｏｘａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｓＰｄｘＳ／ＰｄｘＴａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．”ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１７Ａｐｒ２７；１２（４）：ｅ０１７６３７４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７６３７４。

本明細書に開示される修飾ポリペプチドと、上記で列挙される、さらなる既知の修飾との組み合わせは、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの相乗的な弱毒化をもたらすことが予想される。

医学的使用または方法
開示されるワクチン組成物は、対象における、肺炎、胸膜炎または胸膜肺炎、特にＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされる肺炎、胸膜炎または胸膜肺炎の、予防的、メタフィラキシー的または治療的処置において使用することができる。処置される対象は、哺乳動物、特にブタであり得る。ワクチン組成物は、筋肉内、皮内、静脈内、皮下、または粘膜投与（例えば鼻腔内投与）により投与することができる。

ワクチン組成物は、上記の単位投与組成物を用いて、少なくとも１回、例えば１回または２回の投与により投与することができる。具体的には、組成物は、対象の出生日、出生から３日、１週間、２週間、４週間、６週間、８週間、１０週間または１２週間以内に、初めて投与することができる。したがって、ワクチンは、哺乳動物の早い時点において投与するのが有効であり得る。しかしながら、ワクチンを哺乳動物の生涯のうちの任意の時点で投与できることも開示される。

ワクチン組成物は、第２の時間に投与することもでき、２回の投与間の期間は、１～４週間、１～３週間または１～２週間であり得る。好ましくは、微生物を含むワクチン組成物は１回のみ投与される。

ＢＬ－３細胞およびＡＰＰ上清から単離されたＡｐｘＡ毒素を用いた細胞傷害アッセイの確立を図示する。ＢＬ－３細胞と、遺伝子組換えＡｐｘＩＡおよび野生型ＡｐｘＩＡ毒素（Ａ）、ならびに遺伝子組換えＡｐｘＩＩＩＡおよび野生型ＡｐｘＩＩＩＡ毒素（Ｂ）と、を用いた細胞傷害アッセイを図示する。ヒツジの血液およびＡＰＰ上清から単離されたＡｐｘＡ毒素を用いた溶血アッセイの確立を図示する。ヒツジの血液と、遺伝子組換えＡｐｘＩＡおよび野生型ＡｐｘＩＡ毒素と、用いた溶血アッセイを図示する。第１のワクチン接種（Ａ）および第２のワクチン接種（Ｂ）から６時間後の直腸体温。各点は、個々の動物の直腸体温を表す。バーは、９５％信頼区間の中央値を表す。Ｄｕｎｎの多重比較検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。ブタの血清におけるＡｐｘＩＡ－、ＡｐｘＩＩＡ－およびＡｐｘＩＩＩＡ特異的ＩｇＧの定量。それぞれの抗原に対するＩｇＧ結合を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ワクチン接種前（ｄ０）、第１のワクチン接種の２週間後（ｄ１４）、および第２のワクチン接種の２週間後（ｄ２８）の異なる群のブタ由来の血清を解析した。各時点で定量されたＩｇＧの群平均値を、群１の対応する時点と比較した。Ｄｕｎｎの多重比較検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。バーは中央値を表す。ＡＵ：任意単位。６μｇの活性ＡｐｘＩＡ毒素および第２のワクチン接種の２週間後のブタから得た血清を用いた血清中和アッセイ。代謝活性を有する細胞によるＷＳＴ－１の代謝を利用して、細胞の生存率を評価した。凡例では、動物番号、および括弧内にＡｐｘＩＡ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡデータを示す（Ａ）。非線形回帰曲線により、Ｙｍａｘ／２のＸ値（血清濃度）を算出した（Ｂ）。Ｄｕｎｎの多重比較検定、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。バーは中央値を表す。ＡＵ：任意単位。「ワクチン１」（群１）、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰ（群２）またはプラセボ（群３）を受けた３つの群の、ＡＰＰ血清型（ｓｅｒｏｖａｒ）９による曝露後の累積臨床スコア。累積臨床スコアを、群３の対応する臨床スコアと比較した。Ｄｕｎｎの多重比較検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。バーは中央値を表す。「ワクチン１」（群１）、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰ（群２）またはプラセボ（群３）を受けた３つの群の、ＡＰＰ血清型９による曝露後のブタの生存率。第１群および第２群の生存率は１００％であるが、第３群の動物の３７．５％は、ＡＰＰによって引き起こされた重篤な症状により死亡したか、または動物愛護上の理由により安楽死させなければならなかった。「ワクチン１」（群１）、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰ（群２）またはプラセボ（群３）を受けた３つの群の、ＡＰＰ血清型９による曝露後の肺病変スコア。第１群および第２群の肺病変スコアを、対応する対照群（３群）の肺病変スコアと比較した。Ｄｕｎｎの多重比較検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。バーは中央値を表す。

以下の実施例は、本発明を説明する実験データを提供するものであり、本発明を例示するものとしてのみ理解されるべきである。特に、実施例に開示される各々の具体的特徴は、先行する詳細な説明の部分に記載の特徴と組み合わせることができることが企図される。

実施例１：ＰＥＸ－Ａ２５８における、野生型および修飾型のＡＰＸＩＡ、ＡＰＸＩＩＡまたはＡＰＸＩＩＩＡのクローニング
野生型のＡｐｘＩＡ～ＡｐｘＩＩＩＡのタンパク質の配列は、データベースＵｎｉｐｒｏｔからから得た、すなわちＡｐｘＩＡＡｐｐＳＴ５ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｎ２９２）、ＡｐｘＩＩＡＡＰＰＳＴ３（ＵｎｉｐｒｏｔＢ０ＢＰＰ０、修飾Ｓ１４８Ｇを伴う）、およびＡｐｘＩＩＩＡＳＴ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ５５１３１）。

加えて、以下の修飾を含むタンパク質配列を提供した。

核酸は、タンパク質配列に由来するものとし、この核酸配列をコドン最適化し、開始コドンを含めず合成により製造した（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ）。各核酸配列は、５’末端の制限部位ＢａｍＨＩおよび３’末端のＳａｃＩに挟まれるよう、プラスミドｐＥＸ－Ａ２５８（配列番号１９）内に挿入した。

実施例２：ＰＱＥ－８０Ｌにおける野生型および修飾型のＡｐｘＩＡ～ＡｐｘＩＩＩＡのクローニングおよび発現（配列番号２０）
ＡｐｘＩＡ～ＡｐｘＩＩＩＡをそれぞれ含むｐＥＸ－Ａ２５８１μｇを、製造元の指示書に従い、ＢａｍＨＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳａｃｌＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で制限し、１％アガロースゲルで分離させた。適切なサイズの核酸断片をアガロースゲル（ＱＵＩＡＥＸ－ＩＩ）から抽出した。製造元の指示書に従い、ｐＱＥ－８０ＬをＢａｍＨＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳａｃｌＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で制限した。ｐＱＥ－８０Ｌおよび各核酸断片の１：５の比率で、Ｔ４－ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、室温で一晩ライゲーションを行った。ライゲーションされたＤＮＡを大腸菌Ｔｏｐｆ１０Ｆ‘にエレクトロポレーションし、野生型および修飾型形態のＡｐｘＩＡ～ＡｐｘＩＩＩＡのクローニングの成否を、制限解析およびシークエンシングにより確認した。ｐＱＥ－８０Ｌは、アンピシリン耐性を含む。

実施例３：ＰＱＥ－６０におけるＡｐｘＩＣ、ＡｐｘＩＩＣ、およびＡｐｘＩＩＩＣ遺伝子のクローニング
表２に示すプライマーを用いて、ａｐｘＩＣ～ＩＩＩＣ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＡＰＰ－ＤＮＡから増幅し、次に精製した。

それぞれの製造業者の指示に従い、それぞれのａｐｘＩＣ～ＩＩＩＣの核酸を含むＰＣＲ断片およびｐＱＥ－６０を、以下の表２に示される制限酵素で制限し、１％のアガロースゲルで分離させた。

適切なサイズの核酸断片を、アガロースゲル（ＱＵＩＡＥＸ－ＩＩ）から抽出した。ｐＱＥ－６０およびそれぞれの核酸断片の１：５の比率で、Ｔ４－ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、室温で一晩ライゲーションを行った。

ライゲーションされたＤＮＡを大腸菌Ｔｏｐｆ１０Ｆ‘にエレクトロポレーションし、クローニングの成否を、制限解析およびシークエンシングにより確認した。

実施例４：ＰＡＣＹＣ１８４におけるＡＰＸＩＣ、ＡＰＸＩＩＣおよびＡＰＸＩＩＩＣ遺伝子のクローニングおよび発現
ａｐｘＩＣ、ａｐｘＩＩＣおよびａｐｘＩＩＩＣ遺伝子をそれぞれ、以下の表３に示されるプライマーを用いて、実施例２の各ｐＱＥ－６０ベクターから増幅した。

このようにして、さらにプロモーター／ｌａｃ－オペレーターおよびリボソーム結合部位をアンプリコンに含めた（配列番号１６、１７および１８）。

それぞれのＰＣＲ産物を、表３に示す制限酵素を用いて制限し、制限酵素部位ＸｂａＩおよびＮｒｕＩ（ａｐｘＩＣおよびａｐｘＩＩＩＣ）またはＣｌａＩ／ＢｓｃＩおよびＮｒｕＩ（ａｐｘＩＩＣ）により、上記と同様の方法および条件を用いてｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ｐＡＣＹＣ１８４は、クロラムフェニコール耐性を含む。

ライゲーションされたＤＮＡを大腸菌Ｔｏｐｆ１０Ｆ’にエレクトロポレーションし、制限解析およびシークエンシングにより、クローニングの成否を確認した。

実施例５：ＡｐｘＩＣ、ＡｐｘＩＩＣまたはＡｐｘＩＩＩＣ遺伝子を含むｐＡＣＹＣ１８４と、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡまたはＡｐｘＩＩＩＡを含むｐＱＥ－８０Ｌとの同時トランスフォーメーション
ＡｐｘＡ毒素の活性化には、ＡｐｘＣが必要である。したがって、実施例４で得られたａｐｘＩＣ、ａｐｘＩＩＣまたはａｐｘＩＩＩＣ遺伝子をそれぞれ含むｐＡＣＹＣ１８４を、ａｐｘＩＡ、ａｐｘＩＩＡまたはａｐｘＩＩＩＡ遺伝子をそれぞれ含むｐＱＥ－８０Ｌとともに大腸菌Ｔｏｐｆ１０Ｆ’と同時トランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で、同時トランスフォーメーションに成功したものを選抜した。トランスフォーメーションの成否を制限解析により確認した。

実施例６：ＡｐｘＡ、特にＡｐｘＩＡ、毒素およびトキソイドの発現および単離
実施例５で得られ、ＡｐｘＡおよびＡｐｘＣ遺伝子をそれぞれコードするｐＡＣＹＣ１８４およびｐＱＥ－８０Ｌを含む大腸菌コロニーを用い、４０ｍｌのＬＢ培地中（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）に接種した。培養液を３０℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、一晩培養液を、４００ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）中に、０．１の光学密度（６００ｎｍでの光学密度＝ＯＤ６００）となるよう接種した。得られた培養液を、ＯＤ６００が０．５となるまで振盪しながらインキュベートした。組換えタンパク質の発現を誘導するため、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した。培養液を３０℃で振盪しながらさらに４時間インキュベートした。次に、培養液を７０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、１ｇの細菌ペレット当たり５ｍｌのＬＥＷ緩衝液となるよう、ＬＥＷ緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、蒸留水中、ｐＨ８．０）中に細菌ペレットを再懸濁し、－２０℃で保存した。

１ｍｌの１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、５μｌのＢｅｎｚｏａｓｅ（２５Ｕ／μｌ、Ｎｏｖａｇｅｎ）および１０ｍｇのリゾチームを１０ｍｌの再懸濁後の細菌ペレットに添加した。得られた懸濁液を室温で２０分間穏やかに回転させた。４℃および１５０００ｇで６０分間遠心分離した後、ペレットをＬＥＷ緩衝液（１ｍｇのペレット当たり１０ｍＬのＬＥＷ緩衝液）で洗浄し、遠心分離（４℃、１５０００ｇ、６０分）した。洗浄したペレットを、ペレット１ｇ当たり２ｍＬの変性可溶化緩衝液（ＬＥＷ緩衝液中８Ｍ尿素、ｐＨ＝８．０）中に再懸濁し、次に再懸濁したペレット１０ｍＬ当たり１ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。懸濁液を４℃で１時間インキュベートし、その後遠心分離（４℃、１８０００ｇ、１５分）した。タンパク質を含有する上清を、カラムによるタンパク質精製のための次の工程に利用した。

製造業者の指示に従い、カラム（ＰｒｏｔｉｎｏＮｉ－ＩＤＡ２０００カラム、Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を４ｍＬの平衡化緩衝液（ＬＥＷ緩衝液中８Ｍの尿素、ｐＨ＝８．０）で平衡化した。次に、カラムにタンパク質を含有する上清の半分をロードし、平衡化緩衝液４ｍｌで２回（合計８ｍｌの緩衝液）洗浄した。タンパク質を３ｍｌの溶出緩衝液で２回（２５０ｍＭのイミダゾールを含む平衡化緩衝液、合計６ｍｌの緩衝液）溶出した。この手順を、タンパク質を含有する上清の残り半分で繰り返した。タンパク質含有溶出液をプールし、１Ｍの尿素を含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中、４℃で一晩透析した。透析緩衝液を、０．５Ｍ尿素を含むＰＢＳ（ｐＨ８．０）で交換し、さらに４時間透析を続けた。次に、緩衝液を、尿素を含まないＰＢＳ（ｐＨ８．０）で交換し、さらに４時間透析した。製造元の指示書に従い、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタンパク質濃度を測定した。タンパク質は、使用まで－８０℃で保存した。

実施例７：ＡｐｘＡ毒素のＡＰＰからの単離
溶液ＡＰＶＸは、１ｇのＤ（＋）－グルコース、一水和物、０．１ｇのＬ－グルタミン、０．３６２ｇのＬ－システイン塩酸塩一水和物、および１０ｍＬのヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏを含有する。ＡＰＰ単離物を、ＩｓｏｖｉｔａｌｅＸを含むチョコレート寒天上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。３つのＡＰＰコロニーを組み合わせ、それを用いて３ｍＬのＣｏｌｕｍｂｉａ培地（１０ｍＭのＣａ^２＋、０．２ｍｇ／ｍＬのＮＡＤ、１％のＡＰＰＶＸ）に接種し、得られた培養液を３７℃で５時間振盪してインキュベートした。次に、培養液を３２００ｇおよび４℃で２０分間遠心分離した。透明な上清を新しいチューブに移し、硫酸アンモニア４４．０５ｇを徐々に添加し、硫酸アンモニアが完全に溶解するまで混合した。次に、溶液を４℃で一晩インキュベートした。沈殿したタンパク質を３２００ｇおよび４℃で３時間遠心分離し、上清を除去した。タンパク質ペレットを空気乾燥させ、次に６Ｍの尿素を含む１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁させた。得られたタンパク質溶液を、ＰＤＭｉｄｉＴｒａｐＧ２５カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるゲル濾過により精製し、残留緩衝液を除去した。６Ｍの尿を含むＰＢＳ中に１ｍｌのタンパク質溶液を平衡化した後、ゲル濾過カラムにロードし、次に６Ｍの尿素を含む１．５ｍｌのＰＢＳで溶出した。次に、溶出したタンパク質を－２０℃で保存した。溶出したタンパク質の同一性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。

実施例８：細胞傷害アッセイの確立
組換えＡｐｘＡタンパク質（野生型およびトキソイド形態）の細胞毒性活性を解析するため、ＢＬ３細胞（ＢＬ３．１ＣＲＬ－２３０６）を標的細胞として用いる細胞毒性アッセイを行う。ＢＬ３細胞はウシＢ細胞から得られるが、それらはＡｐｘＡ毒素により溶解され得ることが知られている（Ｔｕ，Ａ．Ｈ．；Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｃ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．；Ｓｔｒｕｃｋ，Ｄ．Ｋ．（１９９４）：“ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃａｎｄｈｅｍｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅＡｐｘＩＩＡｔｏｘｉｎｆｒｏｍＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”ＩｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ６２（５），ｐｐ．２１１９－２１２１）。実施例７で得られたＡｐｘＡ毒素を陽性対照として用い、６Ｍ尿素を含むＰＢＳを陰性対照として用いた。

ＢＬ３細胞を培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０％ＦＣＳおよび１×非必須アミノ酸、を含有するＤＭＥＭ）中、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。培地２５ｍｌを有するＴ７５フラスコを培養に使用した。新しいフラスコを用い、５０，０００細胞／ｃｍ^２のＢＬ３細胞を毎週播種し、継代培養した。

細胞傷害アッセイでの利用のため、５０μｌのＢＬ３細胞／培地を９６ウェルプレートのウェルに移した。組換えタンパク質および対照をＤＭＥＭ中に希釈した。細胞を含む各ウェルに５０μｌの希釈した組換えタンパク質および対照を添加した。次に、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。細胞形態を顕微鏡で評価した後、ＷＳＴ－１（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）１０μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で、さらに２４時間インキュベートした。

次に、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダーを用いて吸光度を測定する。ＷＳＴ－１は、生細胞の細胞表面上の複雑な細胞機構により切断され、可溶性のホルマザンを生じさせる。したがって、形成されたホルマザン色素の量と、ＥＬＩＳＡリーダーで測定される消滅とは、培養液中の代謝活性を有する細胞数と直接的に相関する。

実施例９：溶血アッセイの確立
組換えＡｐｘＡタンパク質（野生型およびトキソイド型）の溶血活性を解析するため、溶血アッセイを確立した。５％のヒツジ血液（ＢｅｃｔｉｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天を含む細胞培養プレートを用いた。細胞培養プレートに直径３ｍｍの孔をパンチした。１０μＬの組換えタンパク質および対照サンプルをそれぞれ孔に充填し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。実施例７で得られたＡｐｘＡ毒素を陽性対照として用い、６Ｍ尿素を含むＰＢＳを陰性対照として用いた。

ヒツジの血液寒天が脱色して白く見えるとき、溶血活性が存在するものとみなす。

実施例１０：ＡｐｘＡ毒素のＡＰＰからの単離
ＡＰＰのＳＴ２、ＳＴ５、ＳＴ７およびＳＴ８株を用い、実施例７に記載の発現および単離方法を用い、ＡｐｘＡ毒素を含む上清を単離した。上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ、ＡｐｘＩＩＩＡおよびＡｐｘＩＶＡに対応する予想分子量位置にバンドが現れた（データは示さず）。したがって、得られたＳＴ２、ＳＴ５、ＳＴ７およびＳＴ８株それぞれの上清は、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ、ＡｐｘＩＩＩＡおよびＡｐｘＩＶＡの混合物を含む。

実施例１１：ＢＬ－３細胞におけるＡＰＰ由来のＡｐｘＡによる細胞傷害性
実施例８の方法を用い、ＡＰＰから得られた実施例７のＡｐｘＡ毒素（ＡＰＰのＳＴ２、ＳＴ５、ＳＴ７およびＳＴ８株）５０μｌについて、ＤＭＥＭ中で段階希釈（１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６）して試験した。

ＡＰＰの上清の細胞傷害効果が観察され、また希釈率の増加とともに低下した（図１参照）。ＳＴ８から単離した毒素は最も高い細胞毒性を示し、ＳＴ７から単離した毒素は最も低い毒性を示した。ＡｐｘＡ調製物中のＬＰＳと細胞傷害性との相関は観察されなかった（データは示さず）。

実施例１２：ＢＬ－３細胞における組換え型ＡｐｘＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡの細胞毒性
実施例８に記載の方法を用いて、以下のサンプルを試験した。

各サンプル５０μｌを、ＤＭＥＭ中で連続希釈（１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２）で試験した。

ＰＢＳで希釈した細胞を用いた対照区を用いて、ＰＢＳの影響を評価した。効果は認められなかった（図２を参照）。結果を図２に示す。

図２Ａに図示されるように、細胞傷害アッセイでは、組換え野生型ＡｐｘＩＡがＢＬ３細胞を溶解し、したがって活性であることが実証された。１：６４（１３．１μｇ／ｍｌの野生型ＡｐｘＩＡ毒素）の希釈以降は、細胞生存率の値はＰＢＳ対照と同等であった。ＡｐｘＩＡトキソイド形態でインキュベートしたＢＬ３細胞の生存率は、ＰＢＳ対照の生存率と同等であった。このことは、細胞形態についても同様である（データ示さず）。

ＡｐｘＩＡのトキソイド形態は、細胞生存性および形態に関してＰＢＳ対照と同様の効果を有し、一方、野生型ＡｐｘＩＡ形態は、ＢＬ３細胞に対する強力な細胞傷害性効果を有していたことから、ＡｐｘＩＡのトキソイド形態は、細胞傷害性効果を有さないと結論付けることができる。同様の結果は、ＡｐｘＩＩＡ（データ示さず）およびＡｐｘＩＩＩＡのトキソイド形態（図２Ｂ）においても得られた。

実施例１３：ＡＰＰ由来のＡｐｘＡの溶血活性
実施例９の方法を用い、ＡＰＰ（ＡＰＰのＳＴ２、ＳＴ５およびＳＴ８株）から得られた実施例７のＡｐｘＡ毒素１０μｌを試験した。

結果を図３に示す。ＳＴ８株は強い溶血を示し、ＳＴ５株は中等度の溶血を示し、ＳＴ２株は図３の白色が左から右に減少していることから推測できるように、溶血を示さなかった。ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＡのそれぞれが赤血球を溶解できるわけではないことが知られている。株の違いにより、それぞれのＡｐｘＡの分泌量が異なるため、異なるＡｐｘＡ形態の混合物を含むそれぞれの株由来の上清は異なる溶血活性を示し得る。

まとめると、ＡｐｘＡ毒素の溶血活性は、実施例９に記載される５％のヒツジ血液を含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天を用いる方法で実証できることが明らかとなった。

実施例１４：組換え型ＡｐｘＩＡの溶血活性
実施例９に記載の方法を用いて、以下のサンプルを試験した。

結果を図４に示す。ＡｐｘＩＡ野生型は赤血球を溶解するが、ＡｐｘＩＡトキソイド型は赤血球を溶解しない。ＡｐｘＩＩＩＡ野生型は、文献にも記載されているように、溶血活性を示さなかった。

ＡｐｘＩＡのトキソイド形態は、ＰＢＳ対照と同様、すなわち溶血作用を示さず、一方、野生型ＡｐｘＩＡ形態は、ヒツジ赤血球に対して強い溶血作用を有していたことから、ＡｐｘＩＡのトキソイドは溶血作用を有さないと結論付けることができる。ＡｐｘＩＩＡのトキソイド形態に関しても同様の結果を得た（データ示さず）。

実施例１５：ブタにおける本発明のＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドの免疫原性
（１）抗原およびワクチン製剤の調製
大腸菌での発現用に最適化された修飾ＡｐｘＩＡ（配列番号４）、ＡｐｘＩＩＡ（配列番号５）およびＡｐｘＩＩＩＡ（配列番号６）コドンをコードする核酸を合成的に製造し（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ）、配列を、５’末端の制限酵素部位ＢａｍＨＩおよび３’末端のＳａｃＩで挟むよう、プラスミドｐＥＸ－Ａ２５８（配列番号１９）に導入した。説明書に従い、ＡｐｘＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡをそれぞれ含む１μｇのｐＥＸ－Ａ２５８を、ＢａｍＨＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳａｃｌＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で制限した。ＡｐｘＩＩＡの４３９～８０１のアミノ酸をコードするヌクレオチドを、ＡｐｘＩＩＡの遺伝子を含むｐＥＸ－Ａ２５８（配列番号１９）ならびに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｃＩ制限部位を導入するプライマー（フォワード：

_{およびリバース}

）を用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット２５０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、製造元の指示に従い、ＢａｍＨＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳａｃＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で制限した。制限されたＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ（切断型）およびＡｐｘＩＩＩＡを、１％アガロースゲルで分離させた。適切なサイズの核酸断片をアガロースゲル（ＱＵＩＡＥＸ－ＩＩ）から抽出し、製造元の指示書に従い、ｐＱＥ－８０ＬをＢａｍＨＩＦＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳａｃＩＦＤ１０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で制限した。Ｔ４－ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、ｐＱＥ－８０Ｌおよびそれぞれの核酸断片の１：５の比率でのライゲーションを室温で一晩行った。ライゲーションされたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＴｏｐｆ１０Ｆ’にエレクトロポレーションし、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ（切断型）またはＡｐｘＩＩＩＡの修飾形態のクローニングの成否を、制限解析およびシークエンシングにより確認した。ｐＱＥ－８０Ｌはアンピシリン耐性を含む。修飾ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ（切断型）またはＡｐｘＩＩＩＡのそれぞれをコードするｐＱＥ－８０Ｌを、実施例５に記載の方法に従い、実施例４に由来するａｐｘＩＣ、ａｐｘＩＩＣおよびａｐｘＩＩＩＣをコードするｐＡＣＹＣ１８４プラスミドとともに、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐｆ１０Ｆ’とともに用い、同時形質転換した。同時形質転換後、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐｆ１０Ｆ’を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で選抜した。以下：
－修飾ＡｐｘＩＡをコードするｐＱＥ－８０ＬおよびＡｐｘＩＣをコードするｐＡＣＹＣ１８４、
－切断されたＡｐｘＩＩＡ（切断型）をコードするｐＱＥ－８０ＬおよびＡｐｘＩＩＣをコードするｐＡＣＹＣ１８４、
－修飾ＡｐｘＩＩＩＡをコードするｐＱＥ－８０ＬおよびＡｐｘＩＩＩＣをコードするｐＡＣＹＣ１８４、
を含む得たままの大腸菌コロニーを用い、４０ｍｌのＬＢ培地中（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加）に接種した。培養液を３０℃で一晩振盪しながらインキュベートした。一晩培養液を、０．１の光学密度（６００ｎｍでの光学密度＝ＯＤ６００）となるよう、４００ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加）中に接種した。得られた培養液を、ＯＤ６００＝０．５となるまで振盪しながら、さらにインキュベートした。組換えタンパク質の発現を誘導するため、１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加した。培養液を３０℃で振盪しながら、さらに４時間インキュベートした。次に、培養液を７，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、細菌ペレットを、１ｇの細菌ペレット当たり５ｍｌのＬＥＷ緩衝液にて、ＬＥＷ緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、蒸留水中、ｐＨ８．０）に再懸濁し、－２０℃で保存した。１ｍｌの１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、５μｌのＢｅｎｚｏａｓｅ（２５Ｕ／μｌ、Ｎｏｖａｇｅｎ）および１０ｍｇのリゾチームを、再懸濁した細菌ペレット１０ｍｌに添加した。得られた懸濁液を室温で２０分間穏やかに回転させた。４℃および１５，０００ｇで６０分間遠心分離した後、ペレットをＬＥＷ緩衝液で洗浄（１ｍｇのペレット当たり１０ｍＬのリュウ緩衝液）し、遠心分離した（４℃、１５０００ｇ、６０分）。洗浄したペレットを、ペレット１ｇ当たり２ｍＬの変性可溶化緩衝液（ＬＥＷ緩衝液中８Ｍ尿素、ｐＨ＝８．０）中に再懸濁し、次に再懸濁したペレット１０ｍＬ当たり１ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。懸濁液を４℃で１時間インキュベートし、その後遠心分離（４℃、１８，０００ｇ、１５分）した。上清を含有するタンパク質を、タンパク質のカラム精製のため、次の工程で利用した。製造業者の指示に従い、カラム（ＰｒｏｔｉｎｏＮｉ－ＩＤＡ２０００カラム、Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を４ｍＬの平衡化緩衝液（ＬＥＷ緩衝液中８Ｍの尿素、ｐＨ＝８．０）で平衡化した。次に、カラムにタンパク質を含有する上清の半分をロードし、平衡化緩衝液４ｍｌで２回（合計８ｍｌの緩衝液）洗浄した。タンパク質を３ｍｌの溶出緩衝液で２回（２５０ｍＭのイミダゾールを含む平衡化緩衝液、合計６ｍｌ）溶出した。この手順を、タンパク質を含有する上清の残り半分で繰り返した。タンパク質を含有する溶出画分をプールし、１Ｍの尿素を含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中で４℃で一晩透析した。透析緩衝液を、０．５Ｍ尿素を含むＰＢＳ（ｐＨ８．０）で交換し、さらに４時間透析を続けた。次に、緩衝液を、尿素を含まないＰＢＳ（ｐＨ８．０）で交換し、さらに４時間透析した。製造元の指示書に従い、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタンパク質濃度を測定した。それぞれのＡｐｘＡ抗原を濾過滅菌（０．２μｍ）し、製剤化まで４℃で保存した。

ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０１ＶＧ（ロット３６０７５Ｍ、Ｓｅｐｐｉｃ）を、製造元の指示に従い用い、修飾ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ（切断型）およびＡｐｘＩＩＩＡ（表６）を用いて試験バッチを調製した。簡潔には、アジュバントおよび抗原を、水浴中で３１℃に予め加温した。無菌ＰＢＳを添加することにより、抗原（複数含む）の体積をアジュバントと等量（５０：５０、ｗ／ｖ）にし、さらに３１℃に維持した。ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０１ＶＧをビーカー中で穏やかに撹拌した。次に、抗原をアジュバントに添加し、さらに３１℃で５分間撹拌した。製剤を２０℃で１時間保存し、ガラスバイアルに充填し、使用するまで４℃で、さらに保存した。

（２）動物試験（免疫原性）
ワクチン製剤の免疫原性は、ＥＬＩＳＡにおけるＡｐｘＩＡ－、ＡｐｘＩＩＡ－およびＡｐｘＩＩＩＡ特異的ＩｇＧ抗体の定量、ならびに８週齢ブタへのワクチン接種後の血清中のＡｐｘＩＡ中和特性の評価により決定した。

動物
雌雄のブタ（雄（去勢）および雌）を、一般のブタ飼育業者（ＢＨＺＰ，２１３３７Ｌｕｎｅｂｕｒｇ，ＺｕｃｈｔｂｅｔｒｉｅｂＧａｒｌｉｔｚ（ＤＥ－ＬＷＬ１０５１））から入手した。各ブタを固有の耳タグ番号で識別し、試験プロトコルで指定された選択／除外基準の遵守について獣医学的検査に供した。全ての動物はＡＰＰ感染の臨床的徴候を示さず、また動物は試験の開始時点で臨床的徴候（呼吸困難、咳、下痢、跛行）を有さなかった。動物を試験に供する前に、市販のＡＰＰ－ＡｐｘＩＶＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）で血清が陰性であることを確認した。ＩＤＴＢｉｏｌｏｇｉｋａＧｍｂＨ，ＡｍＰｈａｒｍａｐａｒｋ，Ｄ－０６８６１Ｄｅｓｓａｕ－Ｒｏｓｓｌａｕ（ドイツ）の動物施設にブタを汚染物質に対して隔離して管理した。ユニット内には、硬い床に等間隔で２つの独立したルーム／ペンを設けた。寝床としてワラを用い、毎日交換した。手動充填式のドライフィーダーを用い、ブタに（市販のミックスペレットを）自由摂取させた。水道水品質の水を、蛇口およびニップルドリンカーにより供給した。全ての施設を毎日清掃した。

試験デザイン
合計２５匹の８週齢のブタを、５つの群にランダムに割り当て、群当たり５匹の動物とした。３つの群において、１．５ｍＬの「ワクチン１」、「ワクチン２」または「ワクチン３」のいずれかを用い、１４日間の間隔で２回筋肉内投与した。１つの群の５匹の動物には、２ｍＬの市販のＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓＰｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、バッチ：Ａ７８４Ａ０１）を用い、１４日間の間隔で２回投与し、陽性対照とした。別の群にはプラセボワクチンを投与し、陰性対照とした。群および処置の概要を表７に示す。

試験０日目（最初のワクチン接種日）、１４日目（２回目のワクチン接種日）、および２８日目（試験終了時）に、血清検体を各動物から採取した。

ワクチン接種に関連する局所的および全身的な反応について、２回のワクチン接種それぞれの１日前から３日後まで、１日１回評価した。局所的反応の評価においては、注射部位の発赤および腫脹を評価した。

２回のワクチン接種それぞれの１日前から３日後まで、直腸体温を１日１回測定した。ワクチン接種日では、ワクチン接種の直前および６時間後に体温を測定した。体温の結果を表８および図５に示す。

結果：

（３）血清学的データ（ＥＬＩＳＡ）
ブタ血清中のＡｐｘＩＡ－、ＡｐｘＩＩＡ－またはＡｐｘＩＩＩＡ特異的ＩｇＧ－抗体のいずれかの定量のため、ＥＬＩＳＡを確立した。簡潔には、ＡｐｘＩＡ－、ＡｐｘＩＩＡ－またはＡｐｘＩＩＩＡを、実施例５に記載されるように発現させ、精製し、定量した。それぞれのＡｐｘＡを、１×ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（１２０１２５；ＣａｎｄｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に５μｇ／ｍＬの最終濃度となるまで希釈した。ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中のそれぞれのＡｐｘＡ１００μｌを、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｂＥＬＩＳＡプレート（４４－２４０４－２１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））の各ウェル中に添加し、４℃で一晩インキュベートする。次に、コーティング緩衝液を除去し、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ））で３回洗浄する。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳを含有するブロッキング溶液を用い、室温（ＲＴ）で１時間、プレートをシェーカー上でブロッキングする。次に、ブロッキング溶液を除去し、全てのウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄する。ブタ血清をブロッキング溶液中で１：１００に予備希釈し、ブロッキング溶液中で１：５希釈系列を調製する（希釈１：１００～１：３１２，５００が含まれる）。各希釈液５０μｌを、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにピペッティングする。Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに数回感染した動物から得られた超免疫血清を陽性対照として用い、上記のように希釈する。室温で１時間、シェーカー上でインキュベートした後、血清希釈液を除去し、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄する。ヤギＩｇＧ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰＯＭｉｎＸｎｏｎｅ（Ｄｉａｎｏｖａ）を二次抗体として用い、ブロッキング緩衝液中で１：４，０００に希釈し、５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。室温で１時間、シェーカー上でインキュベートした後、二次抗体希釈物を除去し、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄する。次に、５０μＬのＴＭＢ基質（５５５２１４、ＢＤ）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、暗所で室温で６分間インキュベートする。ウェル当たり２０μＬの２ＮＨ２ＳＯ４（Ｘ８７３．１、Ｒｏｔｈ）を添加することにより反応を停止させる。４５０ｎｍの波長での各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定する。吸光度値の対数変換およびシグモイド用量応答を伴う非線形回帰により、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．０を用いて吸光度データを処理する。統計的解析においては、ＥＬＩＳＡの結果を、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を用いて解析した。各群のデータを、プラセボ群（群１）の対応するデータと比較した。０．０５以下のｐ値は有意であるとみなした。結果を図６に示す。

（４）血清学的データ（中和アッセイ）
中和アッセイは、各ブタ血清の組換えＷＴＡｐｘＩＡ中和能の定量を可能にする。

ＢＬ３細胞（ＢＬ３．１ＣＲＬ－２３０６）を標的細胞として用いる。ＢＬ３細胞はウシＢ細胞から得られており、ＡｐｘＩＡ毒素によるこの細胞株の溶解について報告されている（Ｔｕ，Ａ．Ｈ．；Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｃ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．；Ｓｔｒｕｃｋ，Ｄ．Ｋ．（１９９４））。ＢＬ３細胞を培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０％のＦＣＳおよび１×非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ）中で３７℃および５％ＣＯ２下で培養した。培地２５ｍｌを有するＴ７５フラスコを培養に用いた。新しいフラスコを用い、５０，０００細胞／ｃｍ２のＢＬ３細胞を毎週播種し、継代培養した。中和アッセイでの利用のため、５０μｌのＢＬ３細胞／培地を９６ウェルプレートのウェルに移した。

ブタの血清を５６℃で３０分間加熱して不活化する。次に、血清をＤＭＥＭ中の２倍希釈系列として希釈し調製する。組換えＷＴＡｐｘＩＡ（活性毒素）を実施例７に従い調製し、最終濃度２４０μｇ／ｍＬに希釈する。７０μｌの各血清希釈液を、３０μｌのＷＴＡｐｘＩＡ希釈液（ウェル当たりの最終ＡｐｘＩＡ量：６μｇ）と９６ウェルプレート上で混合し（１：２～１：２５６の血清希釈）、３７℃で１時間インキュベートする。各ウェルの内容物のうち５０μｌを、５０μＬのＤＭＥＭ中に５０，０００個のＢＬ３細胞／ｃｍ^２を含む丸底９６ウェルプレートに移し、１：４～１：５１２の最終血清希釈とする。プレートを、５％ＣＯ_２および１００％湿度の雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間後、ＷＳＴ－１基質（Ｓｉｇｍａ）を、製造業者の指示に従いプレートの各ウェルに添加する。プレートを、５％ＣＯ_２および１００％湿度を含む雰囲気下、３７℃で、さらに２４時間インキュベートする。次に、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダーを用いて吸光度を測定する。ＷＳＴ－１は、生細胞の細胞表面上の複雑な細胞機構により切断され、可溶性のホルマザンを生じさせる。したがって、形成されたホルマザン色素の量と、ＥＬＩＳＡリーダーで測定される消滅とは、培養液中の代謝活性を有する細胞数と直接的に相関する。群１、２および３の動物の血清学的試験では、２８日目に得られた血清による中和アッセイを用いた。結果を図７に示す。

実施例１６：ブタにおける本発明のＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドの有効性
（１）抗原およびワクチン製剤の調製
抗原および製剤の調製は、実施例１５に記載されるように実施した。表９は、各ワクチン試験バッチにおける処方を要約する。

（２）動物試験（有効性）
本試験の目的は、ブタにおけるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＰＰ）の血清型９による曝露に対する、組換え発現させた修飾ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡワクチン製剤を用いたワクチン接種により得られる防御効果を評価することである。

動物
雌雄のブタ（雄（去勢）および雌）を、一般のブタ飼育業者（ＤａｌｍａｎｄｉＭｅｚｏｇａｚｄａｓａｇｉＺｒｔ．，７２１１Ｄａｌｍａｎｄ，Ｆｅｌｓｚａｂａｄｕｌａｓｕ．４２）から入手した。各ブタを固有の耳タグ番号で識別し、試験プロトコルで指定された選択／除外基準の遵守について獣医学的検査に供した。

原産地（群れ）にはＡＰＰおよびマイコプラズマは存在しなかった。母ブタに由来する仔ブタは、母体由来の抗体のワクチン接種による干渉を回避するため、ＡＰＰに対するワクチン接種を行わなかった。動物には、臨床的徴候（呼吸困難、咳、下痢、跛行）がなかった。さらに、動物を試験に供する前に、市販のＡＰＰ－ＡｐｘＩＶＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）で血清が陰性であることを確認した。ブタは完全に発育し、機能障害もなく、先天的な奇形もなかった。

ＰＲＯＰＨＹＬＬｔｄ，Ｔｏｐ．番号：０４５／７，ＢａｒＨ－７７１１，Ｈｕｎｇａｒｙの動物施設に動物を汚染物質に対して隔離して管理した。手動充填式のドライフィーダーを用い、ブタに（市販のミックス粉砕物を）自由摂取させた。水道水品質の水を、蛇口およびニップルドリンカーにより供給した。全ての施設を毎日清掃した。

試験デザイン
鼻腔内へのＡＰＰ血清型９の曝露に対する、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０１ＶＧ（ロット３６０７５Ｍ、Ｓｅｐｐｉｃ）とともに製剤化された各修飾ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ（切断）およびＡｐｘＩＩＩＡを２５μｇ含有するワクチンにより誘導される有効性を、登録ＡＰＰワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＰＰ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ロット：Ａ７３９Ａ０１）群およびＰＢＳを受けたプラセボ群と比較した。群および処置の概要を表１０に示す。

４２～４５日齢の全てのブタ対し、処置群毎に、２．０ｍＬのそれぞれのワクチンを用い、筋肉内にワクチンを接種した（試験０日目）。２８日後、ブタに対し、筋肉内経路を採用して、それぞれのワクチンで２回目のワクチン接種を行った（試験２８日目）。２回目のワクチン接種の２週間後、全ての動物に対し、ＡＰＰ血清型９による鼻腔内曝露（５×１０^７ＣＦＵ／ブタ）を行った（試験４２日目）。

曝露日から７日間にわたり、毎日臨床試験を実施した。各試験では、臨床観察に応じ、表１１に従い、スコアを得た。経時的に各動物についての臨床スコアを累積し、全な観察期間にわたる群当たりの平均スコアを算出した。統計的分析のため、臨床スコアの結果は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を用いて分析した。各群のデータを、プラセボ群（群３）の対応するデータと比較した。０．０５以下のｐ値を有意であるとみなした。結果を図８に示す。曝露後の動物の生存率の結果を図９に示す。

曝露７日後、生存する全ての動物を人為的に安楽死させ、死後検査を行った。全ての動物の肺に対し剖検を行い、ＡＰＰにより引き起こされた病変を観察した。肺の評価は、表１２に示すスコア付けシステムに従い実施した。肺病変は、固化した肺腫瘤のパーセンテージに応じて、肺葉（ｌｏｂｅ）ごとに０から５でスコア付けした。肺のスコア付けの結果を、各ブタの累積肺スコア（０～３５の範囲）として表した。累積肺スコアは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を用いて分析した。各群のデータを、プラセボ群（群３）の対応するデータと比較した。０．０５以下のｐ値を有意であるとみなした。結果を図１０に示す。

Claims

ワクチン組成物であって、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドであって、
ａ．
ｉ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５６０およびＫ６８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５５７およびＮ６８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
ｉｉｉ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５７１およびＫ７０２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸で修飾され、
かつ、前記少なくとも１つのアミノ酸が、欠失しているか、またはアシル化感受性のないアミノ酸により置き換えられている、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチド、または、
ｂ．ａ．で定義される前記アミノ酸配列の、体液性および／または細胞性の免疫学的応答を誘導するアナログもしくは断片であって、ａ．で定義される前記アミノ酸配列の全長と少なくとも９０％同一であり、前記アナログまたは断片が、ａ．で定義されるアシル化感受性のないアミノ酸または少なくともアミノ酸の欠失を含む、アナログもしくは断片と、
少なくとも薬学的担体、希釈剤、および／またはアジュバントと、
を含む、ワクチン組成物。
前記アシル化感受性のないアミノ酸が、独立して、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸、システイン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
ａ．配列番号１に記載のＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５６０およびＫ６８６で修飾され、
ｂ．配列番号２に記載のＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５５７およびＮ６８７で修飾され、
ｃ．配列番号３に記載のＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が、Ｋ５７１およびＫ７０２で修飾されている、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
ａ．前記修飾されたＡｐｘＩＡの野生型アミノ酸配列が配列番号４であり、
ｂ．前記修飾されたＡｐｘＩＩＡの野生型アミノ酸配列が配列番号５であり、
ｃ．前記修飾されたＡｐｘＩＩＩＡの野生型アミノ酸配列が配列番号６である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
請求項１に記載のＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドをコードする核酸分子または核酸分子の組み合わせ。
前記核酸分子がベクターに含まれている、請求項５に記載の核酸分子または核酸分子の組み合わせ。
請求項１に記載のＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドを発現する微生物。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株またはアクチノバシラス(Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ)株である、請求項７に記載の微生物。
アクチノバシラス・プルロニューモニエ株である、請求項８に記載の微生物。
前記ワクチン組成物が、サブユニットワクチンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
前記サブユニットワクチンが、アクチノバシラス・プルロニューモニエの少なくとも１つのさらなるポリペプチドを含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
前記ワクチン組成物が、前記ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡおよびＡｐｘＩＩＩＡポリペプチドを発現するアクチノバシラス・プルロニューモニエ株を含む生ワクチンである、請求項１に記載のワクチン組成物。
少なくとも２つの異なるアクチノバシラス・プルロニューモニエ株を含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
前記アクチノバシラス・プルロニューモニエが、ＡｐｘＩＶ遺伝子または／およびｓｘｙ遺伝子の欠失を含む、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
肺炎、胸膜炎または胸膜肺炎の、予防的、メタフィラキシー的または治療的処置に使用される、請求項１～４及び１０～１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
アクチノバシラス・プルロニューモニエにより生じる肺炎、胸膜炎または胸膜肺炎の、予防的、メタフィラキシー的または治療的処置に使用される、請求項１～４及び１０～１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
筋肉内、皮内、静脈内、皮下または粘膜への適用により投与される、請求項１～４及び１０～１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。