JP7698458B2 - One or more primers or probes specific for Bacteroides fragilis - Google Patents
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Description
本発明は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）に対して特異的な１以上のプライマーまたはプローブなどに関する。 The present invention relates to one or more primers or probes specific to Bacteroides fragilis.
特定の細菌種の組成やその割合を比較する場合、１６Ｓ ｒＲＮＡを対象とするシーケンス解析およびショットガンメタゲノム解析などの網羅的解析のデータが通常用いられている。しかし、網羅的解析は、膨大なコストや複雑な情報解析工程を必要とすることに加えて、検出対象ではない生物（例、近縁種、宿主）由来の情報も非特異的に取得してしまうという問題がある。 When comparing the composition or proportion of specific bacterial species, data from comprehensive analyses such as 16S rRNA sequence analysis and shotgun metagenomic analysis are usually used. However, comprehensive analyses require huge costs and complex information analysis processes, and also have the problem of non-specifically obtaining information from organisms that are not the target of detection (e.g., closely related species, hosts).
また、１６Ｓ ｒＲＮＡは細菌ゲノム中に複数コピー存在しているため、１６Ｓ ｒＲＮＡの検出に基づく測定値は、細菌量に当該コピー数を乗算した値になるという問題もある。 In addition, because multiple copies of 16S rRNA exist in the bacterial genome, there is also the problem that the measurement value based on the detection of 16S rRNA is the bacterial amount multiplied by the number of copies.
実際、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の既報の検出系は、複数の細菌を非特異的に検出することが示唆されており、また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を対象とする定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による定量的な測定値は、実際の細菌数の数倍となることが報告されている（特許文献１および２、ならびに非特許文献１）。 In fact, it has been suggested that previously reported detection systems for the 16S rRNA gene nonspecifically detect multiple bacteria, and it has been reported that quantitative measurements using quantitative PCR (qPCR) targeting the 16S rRNA gene are several times higher than the actual number of bacteria (Patent Documents 1 and 2, and Non-Patent Document 1).
バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、ヒトの正常な腸内細菌叢を構成する主要な細菌の一つであり、健康状態によっては疾患の原因となる場合もあれば、免疫を調整し腸炎症を抑制する良い効果も知られており、日和見菌とみなされている細菌である。したがって、ヒト腸内等に存在するバクテロイデス・フラジリスの量は、生体環境を評価するための一指標として有用であると考えられる。バクテロイデス・フラジリスの量は、ヒト糞便等のサンプルに存在するバクテロイデス・フラジリスの量を測定することにより間接的に決定することができる。したがって、糞便等のヒトサンプルに存在する、バクテロイデス・フラジリスの特異的な検出および定量が所望される。 Bacteroides fragilis is one of the major bacteria that constitute the normal intestinal flora of humans. Depending on the health condition, it may cause disease, but it is also known to have a beneficial effect of regulating immunity and suppressing intestinal inflammation, and is considered an opportunistic bacterium. Therefore, the amount of Bacteroides fragilis present in the human intestine is considered to be useful as an indicator for evaluating the biological environment. The amount of Bacteroides fragilis can be indirectly determined by measuring the amount of Bacteroides fragilis present in a sample such as human feces. Therefore, specific detection and quantification of Bacteroides fragilis present in a human sample such as feces is desired.
本発明の目的は、バクテロイデス・フラジリス以外の生物（例、他の近縁なバクテロイデス属細菌、ヒト等の宿主）由来の情報の非特異的な取得を回避することにより、バクテロイデス・フラジリスを特異的に検出することを目的とする。 The object of the present invention is to specifically detect Bacteroides fragilis by avoiding non-specific acquisition of information from organisms other than Bacteroides fragilis (e.g., other closely related Bacteroides bacteria, hosts such as humans).
本発明のさらなる目的は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等の定量的方法において、実際の細菌数をより反映するように、バクテロイデス・フラジリスを定量的に検出することである。 A further object of the present invention is to quantitatively detect Bacteroides fragilis in a quantitative method such as quantitative PCR (qPCR) in a manner that is more reflective of the actual bacterial count.
本発明者らは、鋭意検討した結果、バクテロイデス・フラジリスにおいて特異的であり、かつシングルコピーしか認められ得ない遺伝子を検出対象とする核酸分子を用いることで、上記課題を解決できることを着想した。本着想に基づき、本発明者らは、バクテロイデス・フラジリスにおいて、このような遺伝子を同定することにより、このような遺伝子を検出対象とする核酸分子を提供すること、およびこのような核酸分子を実際に用いてバクテロイデス・フラジリスを定量的に検出することなどに成功し、もって本発明を完成するに至った。 After extensive research, the inventors came up with the idea that the above-mentioned problems could be solved by using a nucleic acid molecule that detects a gene that is specific to Bacteroides fragilis and that can only be found in a single copy. Based on this idea, the inventors have succeeded in identifying such a gene in Bacteroides fragilis, thereby providing a nucleic acid molecule that detects such a gene, and in quantitatively detecting Bacteroides fragilis using such a nucleic acid molecule, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記１）～４９）からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を検出し得る、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）に対して特異的な１以上のプライマーまたはプローブ：
１）３－オキソ－５－α－ステロイド ４－デヒドロゲナーゼ１（ＫＯ番号：Ｋ１２３４３）；
２）ＣＲＰ／ＦＮＲファミリー転写レギュレーター，多糖利用系転写レギュレーター（ＫＯ番号：Ｋ２１５５６）；
３）コンドロイチンＡＣリアーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１９０４９）；
４）ジペプチジル－ペプチダーゼＩＩＩ（ＫＯ番号：Ｋ０１２７７）；
５）α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１２０５）；
６）（Ｒ）－シトラマレートシンターゼ（ＫＯ番号：Ｋ０９０１１）；
７）α－アミラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０７４０５）；
８）４－Ｏ－β－Ｄ－マンノシル－Ｄ－グルコースホスホリラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１６２１２）；
９）Ｎ－アセチルグルコサミン ２－エピメラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１７８７）；
１０）グルカン １，４－α－グルコシダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ２１５７４）；
１１）β－１，４－マンノオリゴ糖／β－１，４－マンノシル－Ｎ－アセチルグルコサミンホスホリラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１８７８５）；
１２）スターチ結合外膜タンパク質ＳｕｓＥ／Ｆ（ＫＯ番号：Ｋ２１５７１）；
１３）マンナン エンド－１，４－β－マンノシダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１９３５５）；
１４）２，３－ビスホスホグリセレート－非依存性ホスホグリセレートムターゼ（ＫＯ番号：Ｋ１５６３５）；
１５）Ｎ－スクシニル－Ｌ－オルニチントランスカルバミラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１３０４３）；
１６）ＴｏｎＢ－依存性スターチ結合外膜タンパク質ＳｕｓＣ（ＫＯ番号：Ｋ２１５７３）；
１７）ＵＤＰ－３－Ｏ－［３－ヒドロキシミリストイル］ Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ／３－ヒドロキシアシル－［アシル－キャリア－タンパク質］ デヒドラターゼ（ＫＯ番号：Ｋ１６３６３）；
１８）シトクロームｃ ニトリトレダクターゼ 小サブユニット（ＫＯ番号：Ｋ１５８７６）；
１９）ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１５９０）；
２０）特徴付けられていないタンパク質（ＫＯ番号：Ｋ０７０７９）；
２１）ジホスフェート－依存性ホスホフルクトキナーゼ（ＫＯ番号：Ｋ００８９５）；
２２）ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０３３４０）；
２３）特徴付けられていないタンパク質（ＫＯ番号：Ｋ０１１６３）；
２４）シアレート Ｏ－アセチルエステラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０５９７０）；
２５）アスパルテート ４－デカルボキシラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０９７５８）；
２６）ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１１９７）；
２７）トリコーンプロテアーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０８６７６）；
２８）アラビナン エンド－１，５－α－Ｌ－アラビノシダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０６１１３）；
２９）２－オキソグルタレート フェレドキシンオキシドレダクターゼ サブユニットδ（ＫＯ番号：Ｋ００１７６）；
３０）２－オキソグルタレート フェレドキシンオキシドレダクターゼ サブユニットγ（ＫＯ番号：Ｋ００１７７）；
３１）二成分系，ＮｔｒＣファミリー，応答レギュレーター（ＫＯ番号：Ｋ０２４８１）；
３２）α－Ｌ－フコシダーゼ２（ＫＯ番号：Ｋ１５９２３）；
３３）マンナン エンド－１，４－β－マンノシダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１２１８）；
３４）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＥ（ＫＯ番号：Ｋ０２１２１）；
３５）シアリダーゼ－１（ＫＯ番号：Ｋ０１１８６）；
３６）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＤ（ＫＯ番号：Ｋ０２１２０）；
３７）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＩ（ＫＯ番号：Ｋ０２１２３）；
３８）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＡ（ＫＯ番号：Ｋ０２１１７）；
３９）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＫ（ＫＯ番号：Ｋ０２１２４）；
４０）Ｖ／Ａ型Ｈ＋／Ｎａ＋輸送ＡＴＰアーゼ サブユニットＢ（ＫＯ番号：Ｋ０２１１８）；
４１）トリプトファンシンターゼβ鎖（ＫＯ番号：Ｋ０６００１）；
４２）ピルベートカルボキシラーゼ サブユニットＢ（ＫＯ番号：Ｋ０１９６０）；
４３）コリスメートムターゼ（ＫＯ番号：Ｋ０４５１６）；
４４）ホスフェート選択的ポリンＯｐｒＯおよびＯｐｒＰ（ＫＯ番号：Ｋ０７２２１）；
４５）ホスフェート ブチリルトランスフェラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ００６３４）；
４６）ＬＬ－ジアミノピメレート アミノトランスフェラーゼ（ＫＯ番号：Ｋ１０２０６）；
４７）２－オキソイソバレレートデヒドロゲナーゼ Ｅ１成分（ＫＯ番号：Ｋ１１３８１）；
４８）ジペプチジル－ペプチダーゼ４（ＫＯ番号：Ｋ０１２７８）；および
４９）α－Ｌ－フコシダーゼ（ＫＯ番号：Ｋ０１２０６）。
〔２〕プライマーまたはプローブが、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列またはその相補塩基配列を含む、〔１〕のプライマーまたはプローブ。
〔３〕前記部分塩基配列が、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基として、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列に特異的な部分領域中のヌクレオチド残基を含む、〔２〕のプライマーまたはプローブ。
〔４〕プライマーまたはプローブが、２以上のプライマーである、〔１〕～〔３〕のいずれかのプライマーまたはプローブ。
〔５〕被験体から得られたバクテロイデス・フラジリス含有サンプルにおいて、〔１〕～〔４〕のいずれかのプライマーまたはプローブを用いて、バクテロイデス・フラジリスを検出することを含む、バクテロイデス・フラジリスの検出方法。
〔６〕バクテロイデス・フラジリスの検出が、２以上のプライマーを用いる遺伝子増幅法により行われる、〔５〕の方法。
〔７〕遺伝子増幅法がＰＣＲである、〔６〕の方法。
〔８〕検出が定量的に行われる、〔５〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕〔１〕～〔４〕のいずれかのプライマーまたはプローブを含む、バクテロイデス・フラジリスの検出試薬。
That is, the present invention is as follows.
[1] One or more primers or probes specific to Bacteroides fragilis, capable of detecting one or more genes selected from the group consisting of 1) to 49) below:
1) 3-oxo-5-α-steroid 4-dehydrogenase 1 (KO number: K12343);
2) CRP/FNR family transcriptional regulator, polysaccharide utilization transcriptional regulator (KO number: K21556);
3) chondroitin AC lyase (KO number: K19049);
4) Dipeptidyl-peptidase III (KO number: K01277);
5) α-N-acetylglucosaminidase (KO number: K01205);
6) (R)-citramalate synthase (KO number: K09011);
7) α-amylase (KO number: K07405);
8) 4-O-β-D-mannosyl-D-glucose phosphorylase (KO number: K16212);
9) N-acetylglucosamine 2-epimerase (KO number: K01787);
10) Glucan 1,4-α-glucosidase (KO number: K21574);
11) β-1,4-mannooligosaccharide/β-1,4-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase (KO number: K18785);
12) Starch-binding outer membrane protein SusE/F (KO number: K21571);
13) Mannan endo-1,4-β-mannosidase (KO number: K19355);
14) 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase (KO number: K15635);
15) N-succinyl-L-ornithine transcarbamylase (KO number: K13043);
16) TonB-dependent starch-binding outer membrane protein SusC (KO number: K21573);
17) UDP-3-O-[3-hydroxymyristoyl] N-acetylglucosamine deacetylase/3-hydroxyacyl-[acyl-carrier protein] dehydratase (KO number: K16363);
18) Cytochrome c nitrile reductase small subunit (KO number: K15876);
19) histidine decarboxylase (KO number: K01590);
20) uncharacterized protein (KO number: K07079);
21) diphosphate-dependent phosphofructokinase (KO number: K00895);
22) Diaminopimelate dehydrogenase (KO number: K03340);
23) Uncharacterized protein (KO number: K01163);
24) Sialyl O-acetylesterase (KO number: K05970);
25) Aspartate 4-decarboxylase (KO number: K09758);
26) Hyaluronoglucosaminidase (KO number: K01197);
27) Tricorn protease (KO number: K08676);
28) arabinan endo-1,5-α-L-arabinosidase (KO number: K06113);
29) 2-oxoglutarate ferredoxin oxidoreductase subunit δ (KO number: K00176);
30) 2-oxoglutarate ferredoxin oxidoreductase subunit γ (KO number: K00177);
31) Two-component system, NtrC family, response regulator (KO number: K02481);
32) α-L-fucosidase 2 (KO number: K15923);
33) Mannan endo-1,4-β-mannosidase (KO number: K01218);
34) V/A type H+/Na+ transport ATPase subunit E (KO number: K02121);
35) Sialidase-1 (KO number: K01186);
36) V/A-type H+/Na+ transport ATPase subunit D (KO number: K02120);
37) V/A-type H+/Na+ transport ATPase subunit I (KO number: K02123);
38) V/A-type H+/Na+ transport ATPase subunit A (KO number: K02117);
39) V/A-type H+/Na+ transport ATPase subunit K (KO number: K02124);
40) V/A-type H+/Na+ transport ATPase subunit B (KO number: K02118);
41) Tryptophan synthase β chain (KO number: K06001);
42) pyruvate carboxylase subunit B (KO number: K01960);
43) Chorismate mutase (KO number: K04516);
44) Phosphate-selective porins OprO and OprP (KO number: K07221);
45) phosphate butyryltransferase (KO number: K00634);
46) LL-diaminopimelate aminotransferase (KO number: K10206);
47) 2-oxoisovalerate dehydrogenase E1 component (KO number: K11381);
48) dipeptidyl-peptidase 4 (KO number: K01278); and 49) α-L-fucosidase (KO number: K01206).
[2] The primer or probe according to [1], wherein the primer or probe comprises a partial base sequence containing at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, or a complementary base sequence thereof.
[3] The primer or probe according to [2], wherein the partial base sequence contains, as at least 15 consecutive nucleotide residues, nucleotide residues in a partial region specific to one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49.
[4] The primer or probe according to any one of [1] to [3], wherein the primer or probe is two or more primers.
[5] A method for detecting Bacteroides fragilis, comprising detecting Bacteroides fragilis in a sample containing Bacteroides fragilis obtained from a subject using the primer or probe according to any one of [1] to [4].
[6] The method according to [5], wherein the detection of Bacteroides fragilis is carried out by a gene amplification method using two or more primers.
[7] The method according to [6], wherein the gene amplification method is PCR.
[8] Any of the methods according to [5] to [7], wherein the detection is carried out quantitatively.
[9] A detection reagent for Bacteroides fragilis, comprising the primer or probe according to any one of [1] to [4].
本発明によれば、バクテロイデス・フラジリスに特異的な遺伝子を検出対象とするため、非特異的な検出を回避できる。また、本発明は、シングルコピー遺伝子を検出対象とするため、バクテロイデス・フラジリスを定量的に検出し易い。 According to the present invention, genes specific to Bacteroides fragilis are detected, so non-specific detection can be avoided. In addition, since the present invention detects single-copy genes, it is easy to quantitatively detect Bacteroides fragilis.
本発明は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）に対して特異的な１以上のプライマーまたはプローブを提供する。本発明のプライマーまたはプローブは、上記１）～４９）からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を検出し得るものである。 The present invention provides one or more primers or probes specific to Bacteroides fragilis. The primers or probes of the present invention are capable of detecting one or more genes selected from the group consisting of 1) to 49) above.
本発明のプライマーまたはプローブは、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸が好ましい。核酸分子はまた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸であってもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましく、ＤＮＡがより好ましい。 The primer or probe of the present invention may be a single-stranded or double-stranded nucleic acid, preferably a single-stranded nucleic acid. The nucleic acid molecule may also be DNA, RNA, or a modified nucleic acid, preferably DNA or RNA, more preferably DNA.
特定の実施形態では、プライマーまたはプローブは、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列またはその相補塩基配列を含んでいてもよい。 In certain embodiments, the primer or probe may contain a partial base sequence containing at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, or a complementary base sequence thereof.
好ましい実施形態では、上記部分塩基配列は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基として、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列に特異的な部分領域中のヌクレオチド残基を含んでいてもよい。 In a preferred embodiment, the partial base sequence may contain, as at least 15 consecutive nucleotide residues, nucleotide residues in a partial region specific to one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49.
本明細書で使用される場合、表現「配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列に特異的な部分領域」とは、バクテロイデス・フラジリス以外の微生物中のゲノム領域中に見出されず、かつバクテロイデス・フラジリス株間（例、実施例１中の（１）～（７）として列挙された株を参照）で共通する、バクテロイデス・フラジリスに特異的な部分塩基配列からなる領域をいう。このような部分領域は、図１～４９に示されるとおり、配列番号１～４９の塩基配列中の下線を付した領域に対応する。したがって、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列に特異的な部分領域中のヌクレオチド残基を含む、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基は、配列番号１～４９の塩基配列中の下線を付した領域のうち、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基からなる下線を付した領域から選択することができる（図１～４９を参照）。 As used herein, the expression "partial region specific to one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49" refers to a region consisting of a partial base sequence specific to Bacteroides fragilis that is not found in a genomic region in a microorganism other than Bacteroides fragilis and is common among Bacteroides fragilis strains (see, for example, the strains listed as (1) to (7) in Example 1). Such a partial region corresponds to the underlined region in the base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 49 as shown in Figures 1 to 49. Thus, at least 15 consecutive nucleotide residues including nucleotide residues in a partial region specific to one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49 can be selected from the underlined region consisting of at least 15 consecutive nucleotide residues in the base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 49 (see Figures 1 to 49).
より具体的には、配列番号１～４９の塩基配列中の下線を付した領域のうち、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基からなる下線を付した領域は、以下である。 More specifically, among the underlined regions in the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, the underlined regions consisting of at least 15 consecutive nucleotide residues are as follows:
１）配列番号１（図１参照）
１４～３２位、１８４～２０６位、３１７～３３５位、３４９～３６８位、５１２～５２７位、７３３～７４９位
1) SEQ ID NO: 1 (see FIG. 1)
14th to 32nd, 184th to 206th, 317th to 335th, 349th to 368th, 512th to 527th, 733rd to 749th
２）配列番号２（図２参照）
１～７７位、８２～１０４位、１５８～１７３位、１９９～２３０位、２５０～２６６位、２７４～２９６位、３２５～３４７位、６０７～６２６位、６２８～６４５位、６４７～６６２位、６７６～６９５位
2) SEQ ID NO: 2 (see FIG. 2)
1st to 77th, 82nd to 104th, 158th to 173rd, 199th to 230th, 250th to 266th, 274th to 296th, 325th to 347th, 607th to 626th, 628th to 645th, 647th to 662nd, 676th to 695th
３）配列番号３（図３参照）
８４～９８位、１６０～２１８位、２５９～２９０位、３０１～３３０位、４１１～４２５位、４５６～４８２位、４８４～５０６位、５１４～５２８位、５６５～５８１位、５８６～６０５位、６０７～６４１位、６９１～７１２位、７２４～７５２位、７６５～７８５位、８０２～８２９位、８９５～９１１位、９７０～９８６位、１００４～１０２５位、１１５９～１１７３位、１１９５～１２１７位、１２２８～１２５０位、１２５５～１２８３位、１２８５～１３０１位、１３５６～１３７３位、１４７８～１４９９位、１５１４～１５３２位、１５３４～１５７２位、１５９７～１６４２位、１６５０～１６７６位、１６７８～１７００位、１７２３～１７４８位、１７５５～１７７２位、１７９２～１８１９位、１８３７～１８７３位、１９５０～１９８１位
3) SEQ ID NO: 3 (see FIG. 3)
84th to 98th, 160 to 218th, 259 to 290, 301 to 330, 411 to 425, 456 to 482, 484 to 506, 514 to 528, 565 to 581, 586 to 605 , 607-641st, 691-712, 724-752, 765-785, 802-829, 895-911, 970-986, 1004-1025, 1159-1173, 1 195-1217th, 1228-1250, 1255-1283, 1285-1301, 1356-1373, 1478-1499, 1514-1532, 1534-1572, 1597-1642, 1650-1676, 1678-1700, 1723-1748, 1755-1772, 1792-1819, 1837-1873, 1950-1981
４）配列番号４（図４参照）
２７５～２９７位、３０１～３２３位、３２６～３４７位、４１３～４２７位、１５７３～１５８７位
4) SEQ ID NO: 4 (see FIG. 4)
275th to 297th, 301st to 323rd, 326th to 347th, 413th to 427th, 1573th to 1587th
５）配列番号５（図５参照）
１～２９位、９１～１２５位、１６６～１８２位、２１８～２３９位、２５９～２７５位、３７６～３９３位、３９５～４１０位、４８４～５０９位、５４４～５７０位、６３７～６５３位、７００～７２５位、８５７～８７８位、９４３～９６２位、１０６３～１０８５位、１１７２～１１８７位、１３８４～１４１５位、１４８９～１５４５位、１８１０～１８２６位、１８８２～１８９８位、１９３６～１９５８位、２１３６～２１５０位
5) SEQ ID NO: 5 (see FIG. 5)
1st to 29th, 91st to 125th, 166th to 182nd, 218th to 239th, 259th to 275th, 376th to 393rd, 395th to 410th, 484th to 509th, 544th to 570th, 637th to 653rd, 700th to 725th, 857th to 8th 78th, 943-962, 1063-1085, 1172-1187, 1384-1415, 1489-1545, 1810-1826, 1882-1898, 1936-1958, 2136-2150
６）配列番号６（図６参照）
１２９～１４３位、１４５～１６４位、２２３～２３７位、２６８～２８４位、３６４～３８６位、８１７～８３４位、９７９～１００２位、１１８７～１２１７位、１２３４～１２７４位、１４３２～１４５１位
6) SEQ ID NO: 6 (see FIG. 6)
129th to 143rd, 145th to 164th, 223rd to 237th, 268th to 284th, 364th to 386th, 817th to 834th, 979th to 1002nd, 1187th to 1217th, 1234th to 1274th, 1432nd to 1451st
７）配列番号７（図７参照）
５９～７７位、１１９７～１２１７位、１２５２～１２６７位
7) SEQ ID NO: 7 (see FIG. 7)
59th to 77th, 1197th to 1217th, 1252nd to 1267th
８）配列番号８（図８参照）
１～３３位、３８～５４位、３７６～４１０位、５２４～５３９位、５４１～５６３位、５９２～６１７位、６１９～６４１位、６４６～６６２位、７３６～７５２位、７５４～７７０位、７９３～８０９位、８５７～８７２位、９１６～９４５位、１０６１～１０７６位、１１３０～１１４８位
8) SEQ ID NO: 8 (see FIG. 8)
1st to 33rd, 38th to 54th, 376th to 410th, 524th to 539th, 541st to 563rd, 592nd to 617th, 619th to 641st, 646th to 662nd , 736th to 752nd, 754th to 770th, 793rd to 809th, 857th to 872nd, 916th to 945th, 1061st to 1076th, 1130th to 1148th
９）配列番号９（図９参照）
１～１８位、２８～６２位、６４～１０１位、１０３～１２５位、１５４～２１８位、２９５～３１１位、３２８～３５０位、３５５～３７１位、４３７～４５２位、５２０～５３９位、６３１～６５１位、６６４～６８０位、７００～７１６位、８７１～８８７位、９０７～９２９位、１０１２～１０２８位、１１０６～１１２７位、１１２９～１１５１位、１１５３～１１６９位、１１７１～１１８５位
9) SEQ ID NO: 9 (see FIG. 9)
1st to 18th, 28th to 62nd, 64th to 101st, 103rd to 125th, 154th to 218th, 295th to 311th, 328th to 350th, 355th to 371st, 437th to 452nd, 520th to 539th, 631st to 651th 664-680, 700-716, 871-887, 907-929, 1012-1028, 1106-1127, 1129-1151, 1153-1169, 1171-1185
１０）配列番号１０（図１０参照）
４９～７８位、１４２～１６４位、１７０～１９７位、４９６～５１０位、１０３９～１０６１位、１２００～１２１９位、１７５１～１７６６位、１８３４～１８５０位、１９９６～２０１２位、２１４２～２１６０位
10) SEQ ID NO: 10 (see FIG. 10)
49th to 78th, 142nd to 164th, 170th to 197th, 496th to 510th, 1039th to 1061st, 1200th to 1219th, 1751st to 1766th, 1834th to 1850th, 1996th to 2012th, 2142nd to 2160th
１１）配列番号１１（図１１参照）
１１～３８位、４０～６８位、７０～９５位、９７～１７９位、１８４～２０３位、３７９～３９５位、４８１～５０６位、６２５～６４４位、６４６～６６２位、７３０～７４６位、７８７～８０６位、８４４～８６０位、８７４～８９９位、９７９～９９９位
11) SEQ ID NO: 11 (see FIG. 11)
11th to 38th, 40th to 68th, 70th to 95th, 97th to 179th, 184th to 203rd, 379th to 395th, 481st to 506th, 625th ~644th, 646th-662nd, 730th-746th, 787th-806th, 844th-860th, 874th-899th, 979th-999th
１２）配列番号１２（図１２参照）
７～３５位、６４～１５５位、１８７～２０３位、２８２～２９８位、３３１～３７７位、３９４～４２２位、４３５～４６１位、４６６～４８２位、５４７～５６３位、５９５～６１５位、７００～７１９位、７２１～７３５位、７５７～７９４位、８１４～８４１位、８４３～８５７位、８８９～９１６位、９５９～９９８位、１０４５～１０６４位、１０９９～１１２１位、１１３５～１１５１位、１２５８～１２７７位、１２７９～１３１６位、１３１８～１３３４位、１３８５～１４０６位、１４０８～１４２４位、１４７１～１４８７位
12) SEQ ID NO: 12 (see FIG. 12)
7th to 35th, 64th to 155th, 187th to 203rd, 282nd to 298th, 331st to 377th, 394th to 422nd, 435th to 461st, 46th 6th to 482nd, 547th to 563rd, 595th to 615th, 700th to 719th, 721st to 735th, 757th to 794th, 814th to 841st, 8 43rd to 857th, 889th to 916th, 959th to 998th, 1045th to 1064th, 1099th to 1121st, 1135th to 1151st, 125 8th to 1277th, 1279th to 1316th, 1318th to 1334th, 1385th to 1406th, 1408th to 1424th, 1471st to 1487th
１３）配列番号１３（図１３参照）
８８～１０２位、１０９～１３１位、１５１～１６７位、３８５～４０４位、４２４～４４９位、４５４～４７０位、４９４～５１２位、５１９～５３３位、６６４～６８３位、８６８～９０２位、９６６～９８１位、１０７２～１０８６位、１１２９～１１５１位、１２１３～１２４１位、１２７８～１３０８位
13) SEQ ID NO: 13 (see FIG. 13)
88th to 102nd, 109th to 131st, 151st to 167th, 385th to 404th, 424th to 449th, 454th to 470th, 494th to 512th, 519th to 533rd. , 664th to 683rd, 868th to 902nd, 966th to 981st, 1072nd to 1086th, 1129th to 1151st, 1213th to 1241st, 1278th to 1308th
１４）配列番号１４（図１４参照）
１～２３位、２８～４２位、６３～８４位、８６～１１３位、１３９～１５５位、１５７～１７９位、１９１～２０７位、２１１～２２７位、２６０～２７８位、３４９～３７４位、４２１～４３５位、４３７～４５２位、４８１～４９７位、４９９～５２７位、５３５～５５１位、６０４～６２９位、８９５～９０９位
14) SEQ ID NO: 14 (see FIG. 14)
1st to 23rd, 28th to 42nd, 63rd to 84th, 86th to 113th, 139th to 155th, 157th to 179th, 191st to 207th, 211th to 227th, 260th to 278th , 349th to 374th, 421st to 435th, 437th to 452nd, 481st to 497th, 499th to 527th, 535th to 551st, 604th to 629th, 895th to 909th
１５）配列番号１５（図１５参照）
５３～７２位、１７８～２００位、５９５～６１１位
15) SEQ ID NO: 15 (see FIG. 15)
53rd to 72nd, 178th to 200th, 595th to 611th
１６）配列番号１６（図１６参照）
１～２１位、２３～４４位、４６～８３位、８５～１０１位、１０３～１４０位、１４２～１８５位、１８７～２１９位、２３５～２５１位、３０４～３３５位、３３７～３５６位、３６７～３９５位、３９７～４１９位、４９６～５１２位、５２３～５４２位、５４８～５６３位、５６５～５８４位、６２２～６７４位、７６０～７７９位、８２９～８４５位、９０４～９２０位、９５２～９７７位、９７９～９９５位、１０２１～１０４３位、１０６６～１０８２位、１１１１～１１４２位、１１４４～１１６０位、１１６２～１１８７位、１１９８～１２３５位、１２４２～１２５９位、１２７３～１２９８位、１３２１～１３３７位、１３３９～１３６１位、１４４２～１４６３位、１４７４～１４９６位、１５４１～１５５６位、１５７３～１６１９位、１６７８～１７００位、１７０２～１７３３位、１７３５～１７６０位、１８５２～１８８０位、１９０６～１９２８位、１９７２～１９９７位、２０１７～２０３６位、２０３８～２０６６位、２０６８～２１０８位、２１１０～２１６８位、２２０９～２２３１位、２２４２～２２５８位、２３２０～２３３６位、２３５３～２３７８位、２４４６～２４６２位、２４７０～２４９２位、２５７８～２６００位、２６１１～２６３０位、２６３８～２６５４位、２６８９～２７２０位、２７２５～２７４７位、２７５２～２７７４位、２７７６～２８０７位、２８０９～２８２５位、２８６０～２９０３位、２９１７～２９４８位、２９５３～２９６９位、２９７１～３００２位
16) SEQ ID NO: 16 (see FIG. 16)
1st to 21st, 23rd to 44th, 46th to 83rd, 85th to 101st, 103rd to 140th, 142nd to 185th, 187th to 219th, 235th to 251st, 304th to 335th, 337th to 356th , 367-395, 397-419, 496-512, 523-542, 548-563, 565-584, 622-674, 760-779, 829-845 , 904-920, 952-977, 979-995, 1021-1043, 1066-1082, 1111-1142, 1144-1160, 1162-1187 1198-1235, 1242-1259, 1273-1298, 1321-1337, 1339-1361, 1442-1463, 1474-1496, 154 1-1556th, 1573-1619, 1678-1700, 1702-1733, 1735-1760, 1852-1880, 1906-1928, 1972-19 97th place, 2017-2036th place, 2038-2066th place, 2068-2108th place, 2110-2168th place, 2209-2231st place, 2242nd-2258th place, 2320th-2336th place, 2 353-2378th, 2446-2462, 2470-2492, 2578-2600, 2611-2630, 2638-2654, 2689-2720, 2725- 2747th, 2752-2774, 2776-2807, 2809-2825, 2860-2903, 2917-2948, 2953-2969, 2971-3002
１７）配列番号１７（図１７参照）
６８～８９位、９８～１１７位、１７４～１８８位、２２１～２３７位、４１３～４２８位、４６０～４７４位、６２２～６３９位、７５２～７６７位、１０１３～１０２９位、１０５４～１０６８位、１２７９～１２９８位
17) SEQ ID NO: 17 (see FIG. 17)
68th to 89th, 98th to 117th, 174th to 188th, 221st to 237th, 413th to 428th, 460th to 474th, 622nd to 639th, 752nd to 767th, 1013th to 1029th, 1054th to 1068th, 1279th to 1298th
１８）配列番号１８（図１８参照）
１９６～２２１位、２２３～２４２位、２７１～３３８位、３４０～３６９位、４２７～４９７位、５０５～５８８位
18) SEQ ID NO: 18 (see FIG. 18)
196th to 221st, 223rd to 242nd, 271st to 338th, 340th to 369th, 427th to 497th, 505th to 588th
１９）配列番号１９（図１９参照）
１～１４９位、１５８～１９７位、２０２～２１８位、２２３～２４２位、２５９～２８１位、２９８～３２６位、３７３～４３４位、４３６～４５２位、４５４～４７９位、４８１～４９７位、５０８～５３０位、５３２～５７８位、５９２～６３３位、６７３～７４０位、７４７～７７６位、７８２～８４５位、８４７～８６６位
19) SEQ ID NO: 19 (see FIG. 19)
1st to 149th, 158th to 197th, 202nd to 218th, 223rd to 242nd, 259th to 281st, 298th to 326th, 373rd to 434th, 436th to 452nd, 454th to 4th 79th place, 481st-497th place, 508th-530th place, 532nd-578th place, 592nd-633rd place, 673rd-740th place, 747th-776th place, 782nd-845th place, 847th-866th place
２０）配列番号２０（図２０参照）
１９～３９位、１６５～１８０位、４１２～４２８位、４６６～４９１位、５１１～５４５位、５９２～６４４位、７２９～７４７位、９８３～９９９位、１００５～１０２６位、１１４８～１１６７位、１１７３～１１８８位、１１９４～１２５５位、１２９３～１３６７位、１３６９～１３８３位
20) SEQ ID NO: 20 (see FIG. 20)
19-39th, 165-180, 412-428, 466-491, 511-545, 592-644, 729-747, 983-99 9th place, 1005th to 1026th place, 1148th to 1167th place, 1173rd to 1188th place, 1194th to 1255th place, 1293rd to 1367th place, 1369th to 1383rd place
２１）配列番号２１（図２１参照）
１００９～１０２８位
21) SEQ ID NO: 21 (see Figure 21)
1009-1028th place
２２）配列番号２２（図２２参照）
１０１～１２３位、１５４～１６８位
22) SEQ ID NO: 22 (see Figure 22)
101st to 123rd, 154th to 168th
２３）配列番号２３（図２３参照）
１５～２９位、３４～５０位、５２～７１位、１０９～１４０位、１４６～１６７位、３４３～３６５位、３８５～４０１位、４０３～４１９位、５２０～５４２位、５９８～６１７位、６１９～６３５位、６６１～６８９位、７３３～７６４位、７６６～７９５位、８６３～８８１位、８９５～９１８位
23) SEQ ID NO: 23 (see Figure 23)
15th to 29th, 34th to 50th, 52nd to 71st, 109th to 140th, 146th to 167th, 343rd to 365th, 385th to 401st, 403rd to 419th, 52nd 0-542nd, 598-617th, 619-635th, 661st-689th, 733rd-764th, 766th-795th, 863rd-881st, 895th-918th
２４）配列番号２４（図２４参照）
１～３８位、５２～６６位、１３９～１６１位、１６６～２００位、２０８～２３０位、２４４～２６６位、２７３～２９１位、２９４～３４１位、３４３～３６５位、３６７～３８１位、３９０～４３４位、４３６～５１８位、５２３～５５７位、５５９～６０２位、６０４～６５６位、７１２～７３７位、７３９～７７５位、８５０～８６４位、８６６～８８１位、８８３～８９９位、９０１～９２９位、９３１～９４５位、９４９～１０２２位、１０５６～１１０９位、１１６５～１１８１位、１１８３～１２６２位、１２７３～１３１６位、１３３３～１３５６位、１３５９～１３９７位、１３９９～１４４２位、１４４７～１５０８位、１５１０～１５４２位、１５５２～１５８７位、１５９１～１６３０位、１６４２～１６７９位、１６８１～１７１５位、１７１７～１７６６位、１７８０～１８２３位、１８２５～１８４１位、１９００～１９２８位、１９３０～１９５４位、１９６９～２００６位、２０１１～２０３０位、２０４４～２０７０位
24) SEQ ID NO: 24 (see Figure 24)
1st to 38th, 52nd to 66th, 139th to 161st, 166th to 200th, 208th to 230th, 244th to 266th, 273rd to 291st, 294th to 341st, 343rd to 365th, 367th to 381st, 390th to 434th, 436th to 518th, 523rd to 5th 57th, 559-602, 604-656, 712-737, 739-775, 850-864, 866-881, 883-899, 901-929, 931-945, 949-1022, 1056-1109, 11 65-1181st, 1183-1262, 1273-1316, 1333-1356, 1359-1397, 1399-1442, 1447-1508, 1510-1542, 1552-1587, 1591-1630, 1642-1679, 1681-1715, 1717-1766, 1780-1823, 1825-1841, 1900-1928, 1930-1954, 1969-2006, 2011-2030, 2044-2070
２５）配列番号２５（図２５参照）
４～５９位、６４～７８位、９０～１０７位、１３３～１５８位、１９３～２１６位、２８３～３０５位、３７０～３９２位、４８１～５００位、５２６～５４２位、５６２～６１７位、６１９～６５０位、６６７～７１３位、７３４～７６１位、７９３～８７５位、９２２～９４４位、９８８～１００４位、１０３０～１０５２位、１０５７～１０７４位、１０９９～１１１８位、１１４４～１１５８位、１３４８～１３６７位、１４５７～１４７５位、１４７７～１４９１位、１５１３～１５５０位、１５５５～１５７７位、１５８８～１６２０位
25) SEQ ID NO: 25 (see Figure 25)
4th to 59th, 64th to 78th, 90th to 107th, 133rd to 158th, 193rd to 216th, 283rd to 305th, 370th to 392nd, 481st to 5th 00th place, 526th-542nd place, 562nd-617th place, 619th-650th place, 667th-713th place, 734th-761st place, 793rd-875th place, 922nd- 944th, 988-1004, 1030-1052, 1057-1074, 1099-1118, 1144-1158, 134 8th to 1367th, 1457th to 1475th, 1477th to 1491st, 1513th to 1550th, 1555th to 1577th, 1588th to 1620th
２６）配列番号２６（図２６参照）
１～５５位、６９～９２位、２２７～２５１位、４４８～４７０位、４８４～５０６位、５３５～５５４位、６２５～６４４位、６５５～６７７位、９６４～９８０位、１０９３～１１１０位、１１４４～１１６９位、１１８３～１２０２位、１２１０～１２２７位、１２６１～１２８０位、１３５１～１３７０位、１５４３～１５６５位、１６６０～１６７９位、１７２６～１７５７位、１８６１～１８７５位、１８８２～１９０４位、１９２４～１９４０位、１９６４～１９８５位、２０６２～２０７８位、２０８９～２１０８位、２１７１～２１８６位、２２０３～２２１９位
26) SEQ ID NO: 26 (see Figure 26)
1st to 55th, 69th to 92nd, 227th to 251st, 448th to 470th, 484th to 506th, 535th to 554th, 625th to 644th, 655th to 677th 964-980, 1093-1110, 1144-1169, 1183-1202, 1210-1227, 1261-1280, 1351st to 1370th, 1543rd to 1565th, 1660th to 1679th, 1726th to 1757th, 1861st to 1875th, 1882nd to 1904th , 1924-1940, 1964-1985, 2062-2078, 2089-2108, 2171-2186, 2203-2219
２７）配列番号２７（図２７参照）
１０９～１５３位、１７５～２４５位、２５３～２８４位、３１６～３３２位、３４１～３５９位、４６０～４７８位、５１４～５３０位、５３２～５５４位、５７４～５９３位、６０１～６１８位、６２４～６３８位、６４３～７０７位、７３５～７４９位、７７５～７９４位、８３８～８６０位、８７４～８９１位、９３７～９６２位、９８５～１０７３位、１０８１～１１７２位、１１８６～１２０２位、１２０４～１３６４位、１３６６～１４８８位、１４９５～１６１６位、１６１８～１６５５位、１６７８～１７２７位、１７２９～１７６３位、１７６５～１８０２位、１８０４～１８５７位、１８５９～１９４６位、１９４８～２０５１位、２０５３～２１２２位、２１２４～２１３９位、２１４１～２１８９位、２１９１～２２１９位、２２２１～２２５２位、２２７６～２２９１位、２２９６～２３３６位、２３３８～２３９５位、２４１０～２４３５位、２４３７～２５０６位、２５０８～２５５５位、２５５７～２６０６位、２６０８～２６２４位、２６２６～２６６０位、２６６２～２８０４位、２８０６～２８８５位、２８８７～２９５４位、２９５６～２９７５位、３１４５～３１８０位、３２００～３２２７位
27) SEQ ID NO: 27 (see Figure 27)
109th to 153rd, 175th to 245th, 253rd to 284th, 316th to 332nd, 341st to 359th, 460th to 478th, 514th to 530th, 5 32nd to 554th, 574th to 593rd, 601st to 618th, 624th to 638th, 643rd to 707th, 735th to 749th, 775th to 794th, 83 8th to 860th, 874th to 891st, 937th to 962nd, 985th to 1073rd, 1081st to 1172nd, 1186th to 1202nd, 1204th to 13th 64th, 1366-1488, 1495-1616, 1618-1655, 1678-1727, 1729-1763, 1765-1 802nd, 1804-1857, 1859-1946, 1948-2051, 2053-2122, 2124-2139, 2141 ~2189th, 2191-2219, 2221-2252, 2276-2291, 2296-2336, 2338-2395, 24 10th to 2435th, 2437th to 2506th, 2508th to 2555th, 2557th to 2606th, 2608th to 2624th, 2626th to 2660th, 2662nd to 2804th, 2806th to 2885th, 2887th to 2954th, 2956th to 2975th, 3145th to 3180th, 3200th to 3227th
２８）配列番号２８（図２８参照）
１１～３０位、３２～４７位、４９～７４位、７６～９２位、９４～１２５位、１４５～１５９位、１６３～２１５位、２１７～２４５位、２４７～２６９位、２７１～３４４位、３８３～３９８位、４３６～４６４位、４９３～５１２位、５５６～６０２位、６５５～６９３位、７０３～７２７位、７２９～７４９位、７５１～７７２位、８０５～８３４位、８４７～８９１位、８９３～９１１位、９１３～９２９位、９４０～９５６位
28) SEQ ID NO: 28 (see Figure 28)
11th to 30th, 32nd to 47th, 49th to 74th, 76th to 92nd, 94th to 125th, 145th to 159th, 163rd to 215th, 217th to 245th, 247th to 269th, 271st to 344th, 383rd to 398th, 436th to 464th , 493-512, 556-602, 655-693, 703-727, 729-749, 751-772, 805-834, 847-891, 893-911, 913-929, 940-956
２９）配列番号２９（図２８参照）
１～３５位、４９～１１３位、１１５～１７９位、１８７～２０１位
29) SEQ ID NO: 29 (see Figure 28)
1st to 35th, 49th to 113th, 115th to 179th, 187th to 201st
３０）配列番号３０（図３０参照）
１７～６８位、８８～１２５位、１３９～１６４位、２１１～２３３位、２３５～２５４位、３４０～３５６位、３７３～３８９位、４３６～４５０位、５２０～５３６位
30) SEQ ID NO: 30 (see Figure 30)
17th to 68th, 88th to 125th, 139th to 164th, 211th to 233rd, 235th to 254th, 340th to 356th, 373rd to 389th, 436th to 450th, 520th to 536th.
３１）配列番号３１（図３１参照）
１～３２位、３４～８４位、９５～１２２位、１２４～１７６位、１９３～２２１位、２２３～２４２位、２７５～３２３位、３８５～４０２位、４０９～４３１位、４３３～４７９位、４９６～５７２位、５７４～５９６位、６２２～６６９位、６７１～７３１位、７５７～７８０位、７８２～８２１位、８３５～８５８位、８６０～９０５位、９０７～９３５位、９３７～９６５位、９７０～１００１位、１０３９～１０７０位、１１１２～１１４１位、１１８３～１１９７位、１２０５～１２６５位、１３２１～１３４４位
31) SEQ ID NO: 31 (see Figure 31)
1st to 32nd, 34th to 84th, 95th to 122nd, 124th to 176th, 193rd to 221st, 223rd to 242nd, 275th to 323rd, 38th 5th to 402nd, 409th to 431st, 433rd to 479th, 496th to 572nd, 574th to 596th, 622nd to 669th, 671st to 731st , 757th to 780th, 782nd to 821st, 835th to 858th, 860th to 905th, 907th to 935th, 937th to 965th, 970th to 1001st, 1039-1070, 1112-1141, 1183-1197, 1205-1265, 1321-1344
３２）配列番号３２（図３２参照）
２６～５０位、８５～１１０位、１２４～１４０位、２０８～２２４位、２４１～２５７位、２６２～２８１位、３０４～３２３位、３４９～３７１位、３９４～４１０位、４１８～４５２位、５５７～５７７位、６１６～６４４位、７５４～７６８位、７９１～８３０位、８４１～８６４位、９０４～９２０位、９２２～９３８位、９７３～１０１３位、１０１５～１０３５位、１０３８～１０５５位、１１５６～１１７５位、１２４２～１２６０位、１４４４～１４５８位、１６９３～１７０９位、１７１４～１７３９位、１８４６～１８６２位、１９８４～２００９位、２０１１～２０２７位、２１１７～２１３２位、２３０８～２３３０位、２３３３～２３５１位、２３５３～２３６７位
32) SEQ ID NO: 32 (see Figure 32)
26th to 50th, 85th to 110th, 124th to 140th, 208th to 224th, 241st to 257th, 262nd to 281st, 304th to 323rd, 349th to 371st, 394th to 410th, 418th to 452nd, 557th to 577th, 616th to 644th, 754th to 768th, 791st to 830th, 841st to 864th, 904th to 920th, 922nd to 938th, 973rd to 10th 13th, 1015-1035, 1038-1055, 1156-1175, 1242-1260, 1444-1458, 1693-1709, 1714-173 9th, 1846-1862, 1984-2009, 2011-2027, 2117-2132, 2308-2330, 2333-2351, 2353-2367
３３）配列番号３３（図３３参照）
１～６８位、７４～１１８位、１２１～２０６位、２１７～３７４位、３７６～５１８位、５２０～６４７位、６５２～７２２位、７２４～８０９位、８１１～８７９位、８８１～８９６位、８９８～９９３位、１００３～１０３４位、１０３６～１０６４位、１０９６～１１１１位
33) SEQ ID NO: 33 (see Figure 33)
1st to 68th, 74th to 118th, 121st to 206th, 217th to 374th, 376th to 518th, 520th to 647th, 652nd to 722nd, 724th to 809th, 811-879, 881-896, 898-993, 1003-1034, 1036-1064, 1096-1111
３４）配列番号３４（図３４参照）
７０～８４位、９８～１１３位、２４４～２６０位、２８０～３０２位、３７７～３９２位、４１５～４３５位
34) SEQ ID NO: 34 (see Figure 34)
70th to 84th, 98th to 113th, 244th to 260th, 280th to 302nd, 377th to 392nd, 415th to 435th
３５）配列番号３５（図３５参照）
１～６１位、６７～１４０位、１４２～１６７位、１７５～１９５位、１９７～２４８位、２５０～２７２位、２７４～３０８位、３１０～３６７位、３６９～３９９位、４０１～４４１位、４４３～４７６位、４８４～５０４位、５０６～５３３位、５５０～５９０位、５９２～６４４位、６４６～６９５位、６９７～８８０位、８８２～９２９位、９４０～９７７位、９８８～１０８８位、１０９０～１１２４位、１１２６～１２２６位、１２２８～１２６１位、１２６４～１３５８位、１３６２～１３８５位、１３８７～１４３６位、１４３８～１５３８位、１５４０～１５９２位、１５９４～１６２９位
35) SEQ ID NO: 35 (see Figure 35)
1st to 61st, 67th to 140th, 142nd to 167th, 175th to 195th, 197th to 248th, 250th to 272nd, 274th to 308th, 310th to 367th, 369th to 399th, 401st to 441st, 443rd to 476th, 484th to 504th, 506th to 533rd, 550th to 590th, 592nd to 644th, 646th to 69th 5th place, 697th to 880th place, 882nd to 929th place, 940th to 977th place, 988th to 1088th place, 1090th to 1124th place, 1126th to 1226th place, 1228th to 12th place 61st, 1264-1358, 1362-1385, 1387-1436, 1438-1538, 1540-1592, 1594-1629
３６）配列番号３６（図３６参照）
３６２～３７７位、３７９～３９３位、５３８～５５２位
36) SEQ ID NO: 36 (see Figure 36)
362nd to 377th, 379th to 393rd, 538th to 552nd
３７）配列番号３７（図３７参照）
１０～２６位、２８～５５位、１４８～１６２位、２９２～３１６位、４２２～４３７位、４３９～４５８位、５２６～５６０位、６１０～６３８位、６６１～６８０位、８４４～８６０位、１０９９～１１１５位、１１１７～１１４８位、１１８５～１２１１位、１２２５～１２４１位、１３０９～１３２５位、１３８４～１４１５位、１４４８～１４６３位、１５０７～１５２９位、１６１９～１６４６位、１７０８～１７３３位、１７５０～１７８４位、１７９５～１８１７位
37) SEQ ID NO: 37 (see Figure 37)
10th to 26th, 28th to 55th, 148th to 162nd, 292nd to 316th, 422nd to 437th, 439th to 458th, 526th to 560th, 610th to 638th, 661st to 680th, 844th to 860th, 1099th to 1115th, 1117th to 1148th, 1185-1211, 1225-1241, 1309-1325, 1384-1415, 1448-1463, 1507-1529, 1619-1646, 1708-1733, 1750-1784, 1795-1817
３８）配列番号３８（図３８参照）
なし
38) SEQ ID NO: 38 (see Figure 38)
none
３９）配列番号３９（図３９参照）
なし
39) SEQ ID NO: 39 (see FIG. 39)
none
４０）配列番号４０（図４０参照）
なし
40) SEQ ID NO: 40 (see Figure 40)
none
４１）配列番号４１（図４１参照）
１～２６位、７０１～７１６位
41) SEQ ID NO: 41 (see Figure 41)
1st to 26th, 701st to 716th
４２）配列番号４２（図４２参照）
１～２１位、４８～７５位、８３～１０８位、１６１～２４０位、３１１～３４５位、３５３～４８６位、５４７～５７９位、５８７～６１０位、６６３～６７８位、６８４～７５０位、７５８～７８６位、８５０～９１１位、９１３～９５０位、９５２～９９５位、９９７～１０５８位、１０６０～１１４７位、１１５４～１２６０位、１２６６～１３０４位、１３０６～１４３０位、１４４１～１４６６位、１４６８～１５５３位、１５６７～１７７６位
42) SEQ ID NO: 42 (see Figure 42)
1 to 21, 48 to 75, 83 to 108, 161 to 240, 311 to 345, 353 to 486, 547 to 579, 587 to 610, 663 to 678, 684 to 750, 758 to 786, 850 to 911, 9 13th to 950th, 952nd to 995th, 997th to 1058th, 1060th to 1147th, 1154th to 1260th, 1266th to 1304th, 1306th to 1430th, 1441st to 1466th, 1468th to 1553rd, 1567th to 1776th
４３）配列番号４３（図４３参照）
１～１５位、３４～５３位、１２０～１４７位、１６９～１８５位、２０５～２２４位、３４０～３５９位、４６１～４７６位、６１４～６３４位、７２２～７４１位、８６２～８９６位、９１６～９４０位、９６１～９８７位、９９３～１０４２位、１０４８～１０６２位
43) SEQ ID NO: 43 (see Figure 43)
1st to 15th, 34th to 53rd, 120th to 147th, 169th to 185th, 205th to 224th, 340th to 359th, 461st to 476th, 614th ~634th, 722nd to 741st, 862nd to 896th, 916th to 940th, 961st to 987th, 993rd to 1042nd, 1048th to 1062nd
４４）配列番号４４（図４４参照）
１～５３位、５５～３４１位、３４３～４７３位、４７８～６０８位、６１３～６４７位、６４９～６７４位、６７６～７４３位、７４５～７８０位、７８２～８２４位、８２６～８９９位、９２５～９８０位、９９１～１０１３位、１０１５～１０３２位、１０３４～１０７９位、１０８１～１２５３位、１３００～１３２０位
44) SEQ ID NO: 44 (see Figure 44)
1st to 53rd, 55th to 341st, 343rd to 473rd, 478th to 608th, 613th to 647th, 649th to 674th, 676th to 743rd, 745th to 780th, 782nd to 82nd 4th place, 826th to 899th place, 925th to 980th place, 991st to 1013th place, 1015th to 1032nd place, 1034th to 1079th place, 1081st to 1253rd place, 1300th to 1320th place
４５）配列番号４５（図４５参照）
６５～８６位、８８～１０５位、６７２～７１６位、７２４～７４０位、９０１～９２１位、９２３～９４２位
45) SEQ ID NO: 45 (see Figure 45)
65th to 86th, 88th to 105th, 672nd to 716th, 724th to 740th, 901st to 921st, 923rd to 942nd
４６）配列番号４６（図４６参照）
１２８～１５３位、２３６～２６９位、２７８～３０４位、４４３～４５９位、６２３～６４７位、６６２～６８２位、６９２～７１０位、９１４～９３６位、９９５～１０１１位、１０６１～１０８３位
46) SEQ ID NO: 46 (see Figure 46)
128-153rd, 236-269, 278-304, 443-459, 623-647, 662-682, 692-710, 914-936, 995-1011, 1061-1083
４７）配列番号４７（図４７参照）
１３～３８位、４０～５９位、１２７～１４６位、２３５～２５１位、３１６～３７１位、３８２～４０１位、４７８～５００位、５０８～５２４位、５８９～６０５位、６０７～６２３位、６６１～６８０位、７４２～７６１位、１０００～１０１９位、１４１４～１４４８位、１４５０～１４８１位、１４９５～１５１７位、１５２２～１５４１位、１５７６～１６０１位、１７５６～１７７０位、１８１２～１８２６位、１９３３～１９６５位、１９８４～２０１８位
47) SEQ ID NO: 47 (see Figure 47)
13th-38th, 40-59th, 127-146, 235-251, 316-371, 382-401, 478-500, 508-524, 589-605, 607-623, 661-680, 742-761, 10 00-1019, 1414-1448, 1450-1481, 1495-1517, 1522-1541, 1576-1601, 1756-1770, 1812-1826, 1933-1965, 1984-2018
４８）配列番号４８（図４８参照）
１～１０４位、１０６～１４８位、１５０～２５４位、２６４～２７８位、２８０～３１４位、３１６～３５３位、３５５～３９３位、３９５～４１６位、４３３～５４０位、５４２～５９０位、６１３～６５６位、６６６～８０３位、８０５～９０５位、９０７～９７７位、９８６～１０１０位、１０１２～１０６４位、１０６６～１１０４位、１１１０～１１４５位、１１４７～１２９８位、１３００～１３４１位、１３６６～１４４０位、１４４２～１４６４位、１５１０～１５２４位、１５９２～１６１１位、１６４３～１６６１位、１７１２～１７４３位、１８２０～１８３６位、１８９８～１９１７位、２０１２～２０２８位、２１１７～２１４５位
48) SEQ ID NO: 48 (see Figure 48)
1st to 104th, 106th to 148th, 150th to 254th, 264th to 278th, 280th to 314th, 316th to 353rd, 355th to 393rd, 395th to 416th, 433rd to 540th, 542nd to 590th, 613th to 656th, 666th to 803rd, 805th to 905th, 907th to 977th, 986th to 1010th, 1012th to 1064th, 1066th ～1104th, 1110-1145, 1147-1298, 1300-1341, 1366-1440, 1442-1464, 1510-1524, 1 592-1611th, 1643-1661, 1712-1743, 1820-1836, 1898-1917, 2012-2028, 2117-2145
４９）配列番号４９（図４９参照）
５９～１０９位、１１５～１７３位、２１６～２３６位、２４２～３６３位、３７０～３９８位、４００～４４８位、４５５～５００位、５０９～５２９位、５５１～６１６位、６２４～６３８位、６４０～６６８位、６８５～７０５位、７１２～７２７位、７２９～７６４位、７７５～８３９位、８４５～９６８位、９７３～９９２位、１０００～１０３３位、１０４２～１１１９位、１１５０～１１７６位、１２０４～１２２０位、１３３３～１３５０位
49) SEQ ID NO: 49 (see Figure 49)
59-109, 115-173, 216-236, 242-363, 370-398, 400-448, 455-500, 509-529, 551-616, 624-638, 640-668, 685-7 05th, 712-727, 729-764, 775-839, 845-968, 973-992, 1000-1033, 1042-1119, 1150-1176, 1204-1220, 1333-1350
一実施形態では、本発明のプライマーまたはプローブは、１以上のプライマーであってもよい。例えば、このような本発明の１以上のプライマーは、バクテロイデス・フラジリスへの特異性に優れるので、シーケンシング用プライマーとして有用である。 In one embodiment, the primer or probe of the present invention may be one or more primers. For example, such one or more primers of the present invention are useful as sequencing primers because they have excellent specificity for Bacteroides fragilis.
本発明の１以上のプライマーがシーケンシング用プライマーである場合、シーケンシング用プライマーは、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列またはその相補塩基配列からなるものであってもよい。 When one or more primers of the present invention are sequencing primers, the sequencing primers may consist of a partial base sequence containing at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, or a complementary base sequence thereof.
別の実施形態では、本発明の１以上のプライマーは、２以上のプライマーを含むプライマーセットであってもよい。例えば、このようなプライマーセットは、バクテロイデス・フラジリスへの特異性に優れるので、遺伝子増幅用プライマーセットとして有用である。 In another embodiment, the one or more primers of the present invention may be a primer set including two or more primers. For example, such a primer set has excellent specificity for Bacteroides fragilis and is therefore useful as a primer set for gene amplification.
本発明の１以上のプライマーが遺伝子増幅用プライマーセットである場合、遺伝子増幅用プライマーセットは、（ａ）配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列を含む第１プライマー、および（ｂ）配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列の相補塩基配列を含む第２プライマーを含んでいてもよい（ここで、（ａ）および（ｂ）において対象とされる配列番号は同じである）。 When one or more primers of the present invention are a gene amplification primer set, the gene amplification primer set may include (a) a first primer including a partial base sequence including at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, and (b) a second primer including a complementary base sequence of the partial base sequence including at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49 (wherein the target sequence numbers in (a) and (b) are the same).
遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、遺伝子増幅法の種類に応じて変動する。例えば、ＰＣＲでは、遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、２個である。一方、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例、国際公開第００／２８０８２号参照）では、遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、４個または６個である。したがって、２個を超えるプライマーが必要な遺伝子増幅法による増幅が意図される場合、プライマーセットは、追加のプライマーを含んでいてもよい。 The number of primers required for gene amplification varies depending on the type of gene amplification method. For example, in PCR, the number of primers required for gene amplification is two. On the other hand, in LAMP (loop-mediated isothermal amplification) (see, e.g., WO 00/28082), the number of primers required for gene amplification is four or six. Thus, if amplification by a gene amplification method requiring more than two primers is intended, the primer set may include additional primers.
上記（ａ）および（ｂ）を含むプライマーセットは、その増幅産物が検出可能なサイズであるように設定される限り特に限定されないが、好ましくは、検出が容易な任意のサイズ（例えば、１５０ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、２５０ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、３５０ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、４５０ｂｐ以上、または５００ｂｐ以上）の増幅産物を生成するように設定することができる。上記のような増幅産物を生成できる遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＴＭＡ、ＩＣＡＮ、ＳＤＡ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡが挙げられる。 The primer set including (a) and (b) above is not particularly limited as long as it is set so that the amplification product is of a detectable size, but preferably can be set to generate an amplification product of any size that is easily detectable (e.g., 150 bp or more, 200 bp or more, 250 bp or more, 300 bp or more, 350 bp or more, 400 bp or more, 450 bp or more, or 500 bp or more). Examples of gene amplification methods that can generate such amplification products include PCR, LAMP, TMA, ICAN, SDA, LCR, and NASBA.
別の実施形態では、本発明のプライマーまたはプローブは、１以上のプローブであってもよい。例えば、このような本発明の１以上のプローブは、バクテロイデス・フラジリスへの特異性に優れるので、バクテロイデス・フラジリスの検出に有用である。 In another embodiment, the primer or probe of the present invention may be one or more probes. For example, such one or more probes of the present invention have excellent specificity for Bacteroides fragilis and are therefore useful for detecting Bacteroides fragilis.
本発明のプローブは、配列番号１～４９の塩基配列からなる群より選ばれる１以上の塩基配列における少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む部分塩基配列またはその相補塩基配列からなるものであってもよい。 The probe of the present invention may be a partial base sequence containing at least 15 consecutive nucleotide residues in one or more base sequences selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 49, or a complementary base sequence thereof.
本発明のプライマーまたはプローブの長さは、１以上のプライマーまたはプローブにより上記１）～４９）からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を検出し得る限り特に限定されず、例えば、少なくとも１５個のヌクレオチド残基を含んでいてもよい。好ましくは、本発明の核酸分子の長さは、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のヌクレオチド残基を含んでいてもよい。本発明のプライマーまたはプローブの長さはまた、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４５個以下、または４０個以下のヌクレオチド残基を含んでいてもよい。 The length of the primer or probe of the present invention is not particularly limited as long as one or more genes selected from the group consisting of 1) to 49) above can be detected by one or more primers or probes, and may contain, for example, at least 15 nucleotide residues. Preferably, the length of the nucleic acid molecule of the present invention may contain at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 nucleotide residues. The length of the primer or probe of the present invention may also contain 100 or less, 90 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, 50 or less, 45 or less, or 40 or less nucleotide residues.
本発明はまた、バクテロイデス・フラジリスの検出方法を提供する。本発明の方法は、バクテロイデス・フラジリス含有サンプルにおいて、本発明のプライマーまたはプローブを用いて、バクテロイデス・フラジリスを検出することを含む。 The present invention also provides a method for detecting Bacteroides fragilis. The method of the present invention includes detecting Bacteroides fragilis in a sample containing Bacteroides fragilis using a primer or probe of the present invention.
一実施形態では、バクテロイデス・フラジリス含有サンプルは、被験体から得られたバクテロイデス・フラジリス含有サンプルであってもよい。被験体から得られたバクテロイデス・フラジリス含有サンプルとしては、バクテロイデス・フラジリスの菌体、ゲノムおよび／または遺伝子の転写物を含有する限り特に限定されない。被験体としては、例えば、哺乳動物、鳥類等の動物が挙げられ、哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。このようなサンプルとしては、低侵襲性のサンプルが好ましい。このようなサンプルとしては、例えば、糞便、直腸スワブ、唾液、口腔内スワブ、尿、血液、皮膚スワブ、涙液、鼻汁、鼻腔内スワブが挙げられる。 In one embodiment, the Bacteroides fragilis-containing sample may be a Bacteroides fragilis-containing sample obtained from a subject. The Bacteroides fragilis-containing sample obtained from a subject is not particularly limited as long as it contains the bacterial body, genome and/or gene transcript of Bacteroides fragilis. Examples of subjects include animals such as mammals and birds, preferably mammals, and more preferably humans. Such samples are preferably minimally invasive samples. Examples of such samples include feces, rectal swabs, saliva, oral swabs, urine, blood, skin swabs, tears, nasal discharge, and nasal swabs.
別の実施形態では、バクテロイデス・フラジリス含有サンプルは、環境サンプルであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、土壌、下水、河川、海水、建造環境を構成する壁、天井、床、建具、家具、装具、機械、乗り物の外装及び内装などの表面が挙げられる。 In another embodiment, the Bacteroides fragilis-containing sample may be an environmental sample. Examples of environmental samples include soil, sewage, rivers, seawater, and surfaces that make up the built environment, such as walls, ceilings, floors, fixtures, furniture, fixtures, machinery, and the exterior and interior of vehicles.
本発明の方法では、サンプルからゲノムＤＮＡまたは遺伝子の転写物が抽出されてもよい。このような抽出は、任意の方法により行うことができる。抽出されたゲノムＤＮＡまたは遺伝子の転写物は、意図される増幅産物のサイズに応じた適切な遺伝子増幅法（例、ＰＣＲ、またはＬＡＭＰ）に供することができる。あるいは、試料は、遺伝子増幅法に直接供されてもよい（例、ダイレクトＰＣＲ）。 In the method of the present invention, genomic DNA or gene transcripts may be extracted from the sample. Such extraction may be performed by any method. The extracted genomic DNA or gene transcripts may be subjected to an appropriate gene amplification method (e.g., PCR or LAMP) depending on the size of the intended amplification product. Alternatively, the sample may be directly subjected to a gene amplification method (e.g., direct PCR).
検出は、定性的または定量的に行うことができる。好ましくは、検出は、定量的に行うことができる（例、定量的ＰＣＲ）。本発明で標的とされる、上記１）～４９）からなる群より選ばれる１以上の遺伝子は、バクテロイデス・フラジリスにおいてシングルコピーしか認められ得ない遺伝子であるため、本発明の方法は、バクテロイデス・フラジリスの定量性に優れる。 Detection can be performed qualitatively or quantitatively. Preferably, detection can be performed quantitatively (e.g., quantitative PCR). Since one or more genes selected from the group consisting of 1) to 49) targeted in the present invention are genes that can be found in only a single copy in Bacteroides fragilis, the method of the present invention is excellent in quantitative determination of Bacteroides fragilis.
特定の実施形態では、検出は、リアルタイムで行われてもよい（例、リアルタイムＰＣＲ）。この場合、リアルタイムでの検出を可能にする方法としては、例えば、インターカレーター法、蛍光物質標識プローブ法が挙げられる。 In certain embodiments, detection may be performed in real time (e.g., real-time PCR). In this case, methods that allow real-time detection include, for example, the intercalator method and the fluorescent substance-labeled probe method.
本発明はまた、本発明のプライマーまたはプローブを含む、バクテロイデス・フラジリスの検出試薬を提供する。本発明の試薬によれば、本発明の方法を簡便に行うことができる。 The present invention also provides a detection reagent for Bacteroides fragilis, comprising the primer or probe of the present invention. The reagent of the present invention makes it possible to easily carry out the method of the present invention.
本発明の試薬は、本発明の１以上のプライマーまたはプローブを粉末（例、凍結乾燥）または溶液の形態で含むことができる。溶液は、水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、滅菌蒸留水）、緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）緩衝液、塩酸－塩化カリウム緩衝液、グリシン－塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液が挙げられる。本発明の試薬が本発明の１種以上のプライマーを含む溶液である場合、溶液中のプライマーの濃度は、プライマーの用途およびプライマーの使用の際の希釈倍率等の因子によって変動するが、例えば０．１～１００ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭであってもよい。溶液は、安定化剤等の他の成分を含んでいてもよい。 The reagent of the present invention may contain one or more primers or probes of the present invention in the form of a powder (e.g., lyophilized) or solution. The solution is preferably an aqueous solution. Examples of the aqueous solution include water (e.g., sterile distilled water) and buffer solutions. Examples of the buffer solution include TE (Tris-EDTA) buffer, hydrochloric acid-potassium chloride buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, citrate buffer, acetate buffer, citrate-phosphate buffer, phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, carbonate-bicarbonate buffer, borate buffer, and tartrate buffer. When the reagent of the present invention is a solution containing one or more primers of the present invention, the concentration of the primer in the solution may vary depending on factors such as the application of the primer and the dilution ratio when the primer is used, but may be, for example, 0.1 to 100 mM, preferably 1 to 10 mM. The solution may contain other components such as a stabilizer.
本発明の試薬は、キットの形態で提供されてもよい。このような場合、本発明の試薬は、（ａ）１以上のプライマーまたはプローブ、および（ｂ）蛍光物質または蛍光物質標識プローブを含んでいてもよい。蛍光物質としては、例えば、インターカレーター法に用いられる蛍光物質（例、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ）が挙げられる。蛍光物質標識プローブとしては、例えば、５’末端または３’末端の一方に蛍光物質が結合し、かつ５’末端または３’末端の他方にクエンチャーが結合しているプローブ（例、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が挙げられる。 The reagent of the present invention may be provided in the form of a kit. In such a case, the reagent of the present invention may include (a) one or more primers or probes, and (b) a fluorescent substance or a fluorescent substance-labeled probe. Examples of fluorescent substances include fluorescent substances used in the intercalator method (e.g., SYBR (registered trademark) Green I). Examples of fluorescent substance-labeled probes include probes in which a fluorescent substance is bound to one of the 5' end or the 3' end and a quencher is bound to the other of the 5' end or the 3' end (e.g., TaqMan (registered trademark) probe).
本発明の試薬は、遺伝子増幅用試薬である場合、（ａ）１以上のプライマー、および（ｂ）ポリメラーゼを含むキットの形態で提供されてもよい。ポリメラーゼとしては、遺伝子増幅法の種類に応じた適切なポリメラーゼを使用することができる。例えば、ＰＣＲであれば耐熱性ポリメラーゼの使用が好ましく、ＬＡＭＰであれば鎖置換型ポリメラーゼの使用が好ましい。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。 When the reagent of the present invention is a gene amplification reagent, it may be provided in the form of a kit containing (a) one or more primers and (b) a polymerase. As the polymerase, an appropriate polymerase according to the type of gene amplification method can be used. For example, in the case of PCR, it is preferable to use a heat-resistant polymerase, and in the case of LAMP, it is preferable to use a strand-displacing polymerase. As the polymerase, a DNA polymerase is preferable.
本発明のキットは、（ａ）および（ｂ）に加えて、さらなる構成成分を含んでいてもよい。このような構成要素としては、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）混合物、反応緩衝液、分子量マーカー、コントロール（例、各種ＨＬＡアレルの増幅産物の標品）が挙げられる。本発明のキットがさらなる構成成分を含む場合、各構成成分は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよいが、予め混合された形態（例、ＰｒｅＭｉｘ）等で提供されてもよい。 The kit of the present invention may contain further components in addition to (a) and (b). Such components include a deoxynucleoside triphosphate (dNTP) mixture, a reaction buffer, a molecular weight marker, and a control (e.g., a standard sample of an amplification product of each HLA allele). When the kit of the present invention contains further components, each component may be provided in a form isolated from the others, for example, in a form stored in a different container (e.g., a tube), or may be provided in a premixed form (e.g., PreMix).
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子の抽出
下記手順１～４により、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子を抽出した。
［手順１］まず、保有遺伝子データテーブルを、下記手順ａ～ｇにより作成した。
Example 1: Extraction of genes specific to Bacteroides fragilis Genes specific to B. fragilis were extracted by the following steps 1 to 4.
[Step 1] First, a gene data table was created by the following steps a to g.
［手順ａ］ＮＣＢＩが公開しているゲノムデータベースから、計１１，５９６株の微生物の全ゲノム配列をダウンロードした。 [Step a] The whole genome sequences of a total of 11,596 microbial strains were downloaded from the genome database published by NCBI.
［手順ｂ］遺伝子予測ソフトウェア「Ｐｒｏｋｋａ」を用いて、ダウンロードした各全ゲノム配列上における遺伝子領域配列を予測した。これにより、計１１，５９６件の全ゲノム配列のそれぞれに対し、遺伝子領域が紐付けられた。 [Step b] Using the gene prediction software "Prokka," gene region sequences were predicted for each downloaded whole genome sequence. As a result, gene regions were linked to each of the total 11,596 whole genome sequences.
［手順ｃ］相同性検索ソフトウェア「ＤＩＡＭＯＮＤ」を用いて、予測した各遺伝子領域の配列の相同性検索を、遺伝子配列データベース「ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベース」に対し行うことによって、各遺伝子領域のアノテーションを行った。これにより、予測した全ての遺伝子領域のそれぞれに対し、機能分類が紐付けられた。 [Step c] Using the homology search software "DIAMOND", a homology search of the sequence of each predicted gene region was performed against the gene sequence database "KO (KEGG Orthology) Database", and annotated for each gene region. As a result, a functional classification was linked to each of the predicted gene regions.
［手順ｄ］各遺伝子領域の機能分類ごとに、遺伝子ＩＤを付与した。これにより、予測した全ての遺伝子領域のそれぞれに対し、遺伝子ＩＤが紐付けられた。 [Step d] A gene ID was assigned to each functional classification of each gene region. This allowed a gene ID to be linked to each of the predicted gene regions.
［手順ｅ］ダウンロードした全ゲノム配列ごとに、付与した全ての遺伝子ＩＤのそれぞれの保有数を集計した。 [Step e] For each downloaded genome sequence, the number of each assigned gene ID was tallied.
［手順ｆ］ＮＣＢＩが公開しているＴａｘｏｎｏｍｙデータベースを参照して、ダウンロードした全ゲノム配列ごとに系統情報（生物種名）を付与した。 [Step f] Phylogenetic information (species name) was assigned to each downloaded whole genome sequence by referring to the Taxonomy database published by NCBI.
［手順ｇ］ダウンロードした各全ゲノム配列についての、集計した各遺伝子ＩＤの保有数と付与した系統情報とを含む保有遺伝子データテーブルを作成した。 [Step g] A gene data table was created for each downloaded whole genome sequence, containing the number of gene IDs held and the associated lineage information.
次に、このように作成された保有遺伝子データテーブルを記憶する遺伝子検索装置を用いて、検出対象となる「Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの全ての株」が共通して保有し、且つ、非検出対象となる「保有遺伝子データテーブルで管理されている、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の全ての微生物の保有率が０．１未満であり、且つ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの全ての株がゲノム中に１コピーのみ保有している６６遺伝子ＩＤを検索した。 Next, using a gene search device that stores the thus-created possessed gene data table, a search was conducted for 66 gene IDs that are possessed in common by "all strains of B. fragilis" to be detected, have a possession rate of less than 0.1 in "all microorganisms other than B. fragilis that are not to be detected and are managed in the possessed gene data table," and have only one copy in the genome of all strains of B. fragilis.
検出対象となる「Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの全ての株」は、以下であった。
（１）ＹＣＨ４６株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＰ００６８４１．１）
（２）ＮＣＴＣ９３４３株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ６２６９２７．１）
（３）６３８Ｒ株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＱ３１２００４．１）
（４）ＢＯＢ２５株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１１０７３．１）
（５）ＢＦＢＥ１．１株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＮ８７７２９３．１）
（６）Ｓ１４株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１２７０６．１）
（７）Ｑ１Ｆ２株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１８９３７．１）
The "all strains of B. fragilis" to be detected were as follows:
(1) YCH46 strain (GenBank accession number: AP006841.1)
(2) NCTC9343 strain (GenBank accession number: CR626927.1)
(3) 638R strain (GenBank accession number: FQ312004.1)
(4) BOB25 strain (GenBank accession number: CP011073.1)
(5) BFBE1.1 strain (GenBank accession number: LN877293.1)
(6) S14 strain (GenBank accession number: CP012706.1)
(7) Q1F2 strain (GenBank accession number: CP018937.1)
［手順２］［手順１］で検索した遺伝子ＩＤに対応する遺伝子領域配列を、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの全ゲノム配列から抽出した。 [Procedure 2] The gene region sequences corresponding to the gene IDs searched for in [Procedure 1] were extracted from the entire genome sequence of B. fragilis.
［手順３］マルチプルアライメント解析プログラム「ＭＡＦＦＴ」およびコンセンサス配列作成プログラム「ｃｏｎｓ」を用いて、遺伝子ＩＤに対応する抽出した遺伝子領域配列に対しコンセンサス配列を作成した。 [Step 3] Using the multiple alignment analysis program "MAFFT" and the consensus sequence creation program "cons", a consensus sequence was created for the extracted gene region sequence corresponding to the gene ID.
［手順４］プライマー設計プログラム「Ｐｒｉｍｅｒ３」を用いて、作成したコンセンサス配列に対しプライマー配列セットを作成した。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株間の配列多様性が低い領域にプライマーが結合し、かつ１５０塩基対から２００塩基対の長さの増幅産物が得られるようなプライマーペアが作成可能な４９個の遺伝子を抽出した。結果を表１に示す。
[Step 4] A primer sequence set was created for the created consensus sequence using the primer design program "Primer3". 49 genes were extracted for which primer pairs could be created that would bind to regions with low sequence diversity between B. fragilis strains and produce amplification products with lengths of 150 to 200 base pairs. The results are shown in Table 1.
以上より、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株間で高度に保存されており、かつ所望の遺伝子増幅産物を生成するプライマーペアが作成可能である、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子が４９個抽出された。 From the above, 49 genes specific to B. fragilis were extracted that are highly conserved among B. fragilis strains and for which primer pairs can be created to generate the desired gene amplification products.
実施例２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子における高特異性領域の抽出
上記手順１～４後に下記手順５～７を行うことで、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子を抽出した。
Example 2: Extraction of highly specific regions in genes specific to Bacteroides fragilis Genes specific to B. fragilis were extracted by carrying out the above steps 1 to 4 and then the following steps 5 to 7.
［手順５］相同性検索プログラム「Ｂｌａｓｔ＋」を用いて、ＮＣＢＩが公開しているゲノムデータベースからダウンロードした計１１，５９６件の全ゲノム配列をデータベースとして、［手順４］で抽出した遺伝子の相同性検索を行った。抽出した遺伝子と部分的に同じ配列を持つＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域を抽出した。 [Step 5] Using the homology search program "Blast+", a homology search was performed for the genes extracted in [Step 4] using a total of 11,596 whole genome sequences downloaded from the genome database published by NCBI as a database. Genomic regions of microorganisms other than B. fragilis that have partially identical sequences to the extracted genes were extracted.
［手順６］マルチプルアライメントツール「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」を用いて、［手順４］で抽出したＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子と、［手順５］で抽出した部分的に同じ配列であるＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域のアライメントを行った。 [Step 6] Using the multiple alignment tool "Clustal Omega," we aligned the B. fragilis-specific genes extracted in [Step 4] with the genomic regions of microorganisms other than B. fragilis that had partially identical sequences extracted in [Step 5].
［手順７］Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子の配列中で、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域と一致しない領域をＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列として抽出した。 [Step 7] Regions in the B. fragilis-specific gene sequence that do not match the genomic regions of microorganisms other than B. fragilis were extracted as B. fragilis-specific gene sequences.
結果を図１～図４９に示す。図の左端がＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子の５’末端を示し、図の右側がＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子の３’末端を示す。図の上段において、黒色はＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子の配列中でＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域と一致する領域であり、白色はＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的遺伝子の配列中でＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域と一致しない領域である。図の下段において、黒色は全３８のＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓゲノムのうち１ゲノムでも残り全てのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓゲノムと異なる配列である領域であり、白色は３８ゲノム全てが同じ配列である領域である。上段・下段共に白色で表される、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外の微生物のゲノム領域と一致せず、且つ株間多様性のない領域について図下の塩基配列で表す。 The results are shown in Figures 1 to 49. The left end of the figure shows the 5' end of the B. fragilis-specific gene, and the right side of the figure shows the 3' end of the B. fragilis-specific gene. In the upper part of the figure, black indicates regions in the sequence of the B. fragilis-specific gene that match with genomic regions of microorganisms other than B. fragilis, and white indicates regions in the sequence of the B. fragilis-specific gene that do not match with genomic regions of microorganisms other than B. fragilis. In the lower part of the figure, black indicates regions in which even one of the 38 B. fragilis genomes has a different sequence from all the remaining B. fragilis genomes, and white indicates regions in which all 38 genomes have the same sequence. B. fragilis, which is shown in white in both the upper and lower parts, The regions that do not match the genomic regions of microorganisms other than B. fragilis and do not have interstrain diversity are shown in the base sequence at the bottom of the figure.
［手順７］で抽出したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子における高特異性領域を用いれば、核酸プローブによりＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ＤＮＡを検出することで、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓを特異的、且つ、定量性高く同定・解析することが可能となる。 By using the highly specific region in the gene specific to Bacteroides fragilis extracted in [Step 7], it is possible to specifically and quantitatively identify and analyze B. fragilis by detecting B. fragilis-derived DNA with a nucleic acid probe.
実施例３：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列に基づき設計されたプライマーの特異性の検証（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列を対象にプライマーを設計し、当該プライマーの特異性をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検証した。検証は、下記手順８および９で行った。
Example 3: Verification of the specificity of primers designed based on B. fragilis-specific gene sequences (in silico)
Primers were designed targeting the B. fragilis-specific gene sequence, and the specificity of the primers was verified in silico. The verification was performed in the following steps 8 and 9.
［手順８］非検出対象における保有率が最も低い遺伝子のうち、遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」について、［手順４］で作成したＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列を検出するプライマーを検証に使用した。使用したフォワードプライマー配列は、「５’－ＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣ－３’」（配列番号５０）であり、リバースプライマー配列は、「５’－ＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣ－３’」（配列番号５１）である。配列番号５０の塩基配列は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のフォワードプライマーの塩基配列を示す。配列番号５１の塩基配列は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のリバースプライマーの塩基配列を示す。 [Procedure 8] Among the genes with the lowest retention rate in non-detection subjects, the primers for detecting the B. fragilis-specific gene sequence created in [Procedure 4] for gene ID "K21556" were used for verification. The forward primer sequence used was "5'-ATTGCAGAGATGTGGGCTCC-3'" (SEQ ID NO: 50), and the reverse primer sequence was "5'-CTTCTGCCTCCTACACCGTC-3'" (SEQ ID NO: 51). The base sequence of SEQ ID NO: 50 shows the base sequence of the forward primer for detecting the B. fragilis-specific gene (gene ID "K21556"). The base sequence of SEQ ID NO: 51 shows the base sequence of the reverse primer for detecting the B. fragilis-specific gene (gene ID "K21556").
［手順９］相同性検索プログラム「Ｂｌａｓｔ＋」を用いて、設計したプライマー配列（配列番号５０、配列番号５１）、及び、既存の１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマー配列の相同性検索を［手順５］にてダウンロードした計１１，５９６件の全ゲノム配列をデータベースとして行った。既存の１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なフォワードプライマー配列は、「５’－ＡＴＡＧＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＧＲＡＡＧＡＴ－３’」（配列番号５２）であり、リバースプライマー配列は、「５’－ＣＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＴＡ－３’」（配列番号５３）である。結果、設計したプライマー配列が前記非検出対象に存在しないことが確認された。一方、１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマー配列はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｐａｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｚｏｏｇｌｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｅｃｉｍｕｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓに存在することが確認された。結果を図５０に示す。図５０において、縦軸はプライマー配列の存在が確認された菌種であり、横軸はプライマー配列である。ＨＵ＿ＦはＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のフォワードプライマー、ＨＵ＿ＲはＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のリバースプライマー、ｇ＿Ｂｆｒａ＿Ｆ３＿Ｆは既存の１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なフォワードプライマー、ｇ＿Ｂｆｒａ＿Ｆ３＿Ｒは既存の１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なリバースプライマーを示す。図５０において、ヒートマップ中の黒色はプライマー配列と細菌ゲノムが１００％一致または１塩基を除き全て一致していることを示し、白色はプライマー配列と細菌ゲノムに一致する場所が存在しなかったことを示している。 [Step 9] Using the homology search program "Blast+", a homology search was performed for the designed primer sequences (SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51) and existing primer sequences specific to B. fragilis that detect 16S rRNA, using a total of 11,596 whole genome sequences downloaded in [Step 5] as a database. The forward primer sequence specific to B. fragilis that detects existing 16S rRNA is "5'-ATAGCCTTTCGAAAGRAAGAT-3'" (SEQ ID NO: 52), and the reverse primer sequence is "5'-CCAGTATCAACTGCAATTTTA-3'" (SEQ ID NO: 53). As a result, it was confirmed that the designed primer sequence was not present in the non-detection target. On the other hand, the B. fragilis that detects 16S rRNA was not present in the non-detection target. It was confirmed that primer sequences specific to B. fragilis are present in Bacteroides ovatas, Bacteroides heparinolyticus, Bacteroides zoogleoformans, Bacteroides caccae, Bacteroides caecimuris, Bacteroides thetaiotamicron, Bacteroides cellulosilyticus, Bacteroides dorei, and Bacteroides helcogenes. The results are shown in FIG. 50. In FIG. 50, the vertical axis indicates the bacterial species in which the presence of the primer sequence was confirmed, and the horizontal axis indicates the primer sequence. HU_F indicates B. 50 indicates a forward primer for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556"), HU_R indicates a reverse primer for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556"), g_Bfra_F3_F indicates a forward primer specific to B. fragilis that detects existing 16S rRNA, and g_Bfra_F3_R indicates a reverse primer specific to B. fragilis that detects existing 16S rRNA. In FIG. 50, black in the heat map indicates that the primer sequence and the bacterial genome match 100% or match all but one base, and white indicates that there was no match between the primer sequence and the bacterial genome.
本実施例の上記結果から、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列を検出するプライマー配列はＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ以外には存在せず、非特異検出が予想されないこと、および、既存の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子検出プライマー配列は複数のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属細菌に存在し、これら菌種の非特異検出が予想されることが確認された。 The above results of this example confirmed that primer sequences for detecting gene sequences specific to B. fragilis do not exist in any organism other than B. fragilis, and non-specific detection is not expected, and that existing primer sequences for detecting 16S rRNA genes exist in multiple Bacteroides bacteria, and non-specific detection of these bacterial species is expected.
実施例４：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列に基づき設計されたプライマーの特異性の検証（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例３で作成したＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列遺伝子を検出するプライマーを用いて、当該遺伝子が実際に検出できるかをｉｎ ｖｉｔｒｏで検証した。検証は、下記手順１０～１２で行った。
Example 4: Verification of the specificity of primers designed based on B. fragilis-specific gene sequences (in vitro)
Using the primers for detecting the B. fragilis-specific gene sequence gene prepared in Example 3, it was verified in vitro whether the gene could actually be detected. The verification was performed according to the following steps 10 to 12.
［手順１０］定量ＰＣＲの絶対定量のスタンダードとすることを目的に、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡを用いて、１０μＬのＰＣＲ反応溶液を調製した。反応溶液の成分は以下の通りである。以下に列挙した計２の反応溶液を調製した。 [Procedure 10] To serve as a standard for absolute quantification in quantitative PCR, 10 μL of PCR reaction solution was prepared using genomic DNA from B. fragilis JCM 11019 strain. The components of the reaction solution are as follows. A total of two reaction solutions were prepared, as listed below.
＜反応溶液の成分＞
テンプレートＤＮＡ：１μＬ
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製の「ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」：５μＬ
１０μＭに調製されたフォワードプライマー：０．５μＬ
１０μＭに調製されたリバースプライマー：０．５μＬ
精製水：３μＬ
<Components of reaction solution>
Template DNA: 1 μL
"NEBNext Q5 Hot Start HiFi 2X Master Mix" manufactured by New England Biolabs: 5 μL
Forward primer adjusted to 10 μM: 0.5 μL
Reverse primer adjusted to 10 μM: 0.5 μL
Purified water: 3μL
＜調製した反応溶液＞
（１）Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡと、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセット（配列番号５０、配列番号５１）を用いた反応溶液１
（２）Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡと、１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマーセット（配列番号５２、配列番号５３）を用いた反応溶液２
<Prepared reaction solution>
(1) Reaction solution 1 using genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a primer set (SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51) for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556")
(2) Reaction solution 2 using genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a primer set (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53) specific to B. fragilis for detecting 16S rRNA
［手順１１］調製したＰＣＲ反応溶液を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のサーマルサイクラー「Ｖｅｒｉｔｉ」を用いた。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で３０秒のインキュベーションを行った後、９８℃１０秒の熱変性、６５℃１５秒のアニーリングおよび７２℃３０秒の伸長反応を３５サイクル行うというものである。 [Step 11] PCR was performed using the prepared PCR reaction solution. A Thermo Fisher Scientific Veriti thermal cycler was used for PCR. The PCR reaction conditions were incubation at 98°C for 30 seconds, followed by 35 cycles of thermal denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 65°C for 15 seconds, and extension at 72°C for 30 seconds.
［手順１２］Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡを用いて、２０μＬの定量ＰＣＲ反応溶液を調製した。また、絶対定量のためのスタンダードとして、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７コピーのＰＣＲ増幅産物が含まれるＤＮＡ溶液を用いた２０μＬの定量ＰＣＲ反応溶液を調製した。反応溶液の成分は以下の通りである。以下に列挙した計４の反応溶液を調製した。 [Procedure 12] 20 μL of quantitative PCR reaction solution was prepared using genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain. In addition, 20 μL of quantitative PCR reaction solution was prepared using DNA solution containing 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , and 10 7 copies of PCR amplified product as a standard for absolute quantification. The components of the reaction solution are as follows. A total of four reaction solutions listed below were prepared.
＜反応溶液の成分＞
テンプレートＤＮＡ：１μＬ
Ｔｏｙｏｂｏ社製の「２ｘ ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ」：１０μＬ
１０μＭに調製されたフォワードプライマー：１μＬ
１０μＭに調製されたリバースプライマー：１μＬ
ＲＯＸ：０．４μＬ
精製水：６．６μＬ
<Components of reaction solution>
Template DNA: 1 μL
Toyobo's "2x KOD SYBR qPCR Mix": 10 μL
Forward primer adjusted to 10 μM: 1 μL
Reverse primer adjusted to 10 μM: 1 μL
ROX: 0.4 μL
Purified water: 6.6 μL
＜調製した反応溶液＞
（１）Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡと、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセット（配列番号５０、配列番号５１）を用いた反応溶液１
（２）Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡと、１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマーセット（配列番号５２、配列番号５３）を用いた反応溶液２
（３）［手順１０～１１］の通り、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡとＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した増幅産物で、１０３または１０４または１０５または１０６または１０７コピーのＰＣＲ増幅産物が含まれるＤＮＡ溶液と、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセット（配列番号５０、配列番号５１）を用いた反応溶液３
（４）［手順１０～１１］の通り、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムＤＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した増幅産物で、１０３または１０４または１０５または１０６または１０７コピーのＰＣＲ増幅産物が含まれるＤＮＡ溶液と、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセット（配列番号５０、配列番号５１）を用いた反応溶液４
<Prepared reaction solution>
(1) Reaction solution 1 using genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a primer set (SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51) for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556")
(2) Reaction solution 2 using genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a primer set (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53) specific to B. fragilis for detecting 16S rRNA
(3) As in [Steps 10-11], a DNA solution containing 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, or 10 7 copies of PCR amplified products obtained by PCR amplification using the genomic DNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a primer set for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556") was used, and a reaction solution 3 using a primer set (SEQ ID NO : 50 , SEQ ID NO: 51) for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556") was used.
(4) As in [Steps 10-11], a DNA solution containing 10 3, 10 4 , 10 5, 10 6 , or 10 7 copies of PCR amplified products using a primer set specific to B. fragilis for detecting genomic DNA and 16S rRNA of B. fragilis JCM 11019 strain and a reaction solution 4 using a primer set (SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51) for detecting a gene (gene ID "K21556") specific to B. fragilis
［手順１３］調製した定量ＰＣＲ反応溶液を用いて定量ＰＣＲを実施した。定量ＰＣＲには、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の「Ｍｘ３００５Ｐ」を用いた。定量ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分のインキュベーションを行った後、９８℃１０秒の熱変性、６０℃１０秒のアニーリング、６８℃３０秒の伸長反応を４０サイクル行うというものである。 [Step 13] Quantitative PCR was performed using the prepared quantitative PCR reaction solution. For quantitative PCR, Agilent Technologies' "Mx3005P" was used. The quantitative PCR reaction conditions were 2 minutes of incubation at 98°C, followed by 40 cycles of thermal denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 60°C for 10 seconds, and extension at 68°C for 30 seconds.
［手順１４］取得したスタンダードデータから遺伝子コピー数とＣｔ値の検量線を作成し、取得したサンプルデータからテンプレートＤＮＡ中の遺伝子コピー数を算出した。算出結果をテンプレートＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度とＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムサイズから算出した理論値と比較した。比較結果を図５１に示す。実験内で３個のテクニカルレプリケートで実施し、平均値を解析に用いた。図５１において、白色のグラフは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的な遺伝子（遺伝子ＩＤ「Ｋ２１５５６」）検出用のプライマーセット（配列番号５０、配列番号５１）を用いたｑＰＣＲの絶対定量値を示し、黒色のグラフは、１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なプライマーセット（配列番号５２、配列番号５３）を用いたｑＰＣＲの絶対定量値を示し、網掛けのグラフはＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＪＣＭ １１０１９株のゲノムサイズから算出した理論値を示す。図５１において、棒グラフの頂点は３個のテクニカルレプリケートでの平均値を示し、エラーバーは３個のテクニカルレプリケートでの標準誤差を示す。 [Step 14] A calibration curve of gene copy number and Ct value was created from the acquired standard data, and the gene copy number in the template DNA was calculated from the acquired sample data. The calculation results were compared with the theoretical value calculated from the DNA concentration of the template DNA solution and the genome size of the B. fragilis JCM 11019 strain. The comparison results are shown in FIG. 51. Three technical replicates were performed within the experiment, and the average value was used for analysis. In FIG. 51, the white graph shows the absolute quantitative value of qPCR using a primer set (SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51) for detecting a gene specific to B. fragilis (gene ID "K21556"), the black graph shows the absolute quantitative value of qPCR using a primer set (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53) specific to B. fragilis for detecting 16S rRNA, and the shaded ... The theoretical value calculated from the genome size of the B. fragilis JCM 11019 strain is shown. In FIG. 51, the top of the bar graph indicates the average value for three technical replicates, and the error bar indicates the standard error for three technical replicates.
本実施例の上記結果から、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ特異的な遺伝子配列を検出するプライマーで、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓが実際に検出できること、および、既存の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子検出による定量に比べ絶対定量値が正確であることが確認された。 The above results of this example confirmed that B. fragilis can actually be detected using primers that detect B. fragilis-specific gene sequences, and that the absolute quantitative values are more accurate than those obtained by existing quantification using 16S rRNA gene detection.
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