JP7699588B2

JP7699588B2 - Ｒｅ１サイレンシング転写因子標的遺伝子を抑制解除する組成物

Info

Publication number: JP7699588B2
Application number: JP2022529775A
Authority: JP
Inventors: ネスティ、エドムンド; ピサーチック、アレクサンダー
Original assignee: アルカメナ・ステム・セル・セラピューティクス、エルエルシー
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2025-06-27
Anticipated expiration: 2040-11-20
Also published as: BR112022009898A2; IL293165A; CN115023434A; EP4061833A1; JP2023503920A; CN121045395A; EP4061833A4; US20250206790A1; CN115023434B; AU2020386637A1; MX2022006214A; KR20220104008A; US12180255B2; WO2021102345A1; US20230059411A1; CA3162241A1

Description

本出願は、２０１９年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／９３９，１４９号及び２０２０年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０８６，２４８号の優先権を主張し、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表：本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９０９７＿００１＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１２０，７１７バイトの大きさである。

ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）標的遺伝子を抑制解除するための方法、化合物、及び組成物が提供される。特に、ＴＥＤＬＥＰＰＥＰＰＬＰＫＥＮ（配列番号１）とＥＤＬＥＰＰＥＰＰＬＰＫ（配列番号１５）の配列、又はＤ－アミノ酸（レトロインバーテッド、ＲＩ）ｎｅｋｐｌｐｐｅｐｐｅｌｄｅｔ（配列番号１６）とｋｐｌｐｐｅｐｐｅｌｄｅ（配列番号１７）とからなる逆配列を有するペプチドが、ＲＥＳＴ活性阻害のために開示されている。そのペプチドは、外傷性脳損傷、てんかん、認知症、ハンチントン病（ＨＤ）、慢性疼痛、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、膵臓癌、糖尿病、末梢神経損傷などの治療、予防、改善に有用である。

リプレッサーエレメント１（ＲＥ１）サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）は、数百もの神経細胞遺伝子のリプレッサーである^１。その標的は、末端分化した神経細胞の表現型に必要な遺伝子を表し、電圧及びリガンド依存性イオンチャネル、その受容体、成長因子、及び軸索誘導タンパク質をコード化する遺伝子を含む(Bruce AW et al, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 10458-10463 (2004); Conaco C et al, Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2422-2427 (2006); Mortazavi A et al, Genome Res 16, 1208-1221 (2006); 及び Otto SJ et al, J Neurosci 27, 6729-6739 (2007);ここに参照することでこれら全てを包含する)。したがって、神経細胞発生過程において、ＲＥＳＴは徐々に制御されて、成熟した神経細胞の表現型が形成される(Ballas et al, 2005 supra)。この事象の重要性は、ＲＥＳＴの存続が末端神経細胞の分化を阻害することを示す機能獲得研究によって実証されている (Mandel G et al, Proc Natl Acad Sci U S A 108, 16789-16794 (2011) 及び Gao Z ei a I, J Neurosci 31, 9772-9786 (2011); ここに参照することで双方とも包含する)。

ＲＥＳＴの転写又は転写後の制御についてはほとんどわかっていない(Ballas N et al 2005 supra; Ballas N et al, Neuron 31, 353-365 (2001); and Kojima T et al, Brain Res Mol Brain Res 90, 174-186 (2001);ここに参照することでこれら全てを包含する)。しかしながら、ＲＥＳＴの２つのリン酸化部位（セリン８６１と８６４）が、Ｃ－末端領域小ホスファターゼ１（ＣＴＤＳＰ１）との相互作用により神経細胞分化を制御している^２。ＣＴＤＳＰ１がセリン８６１と８６４からリン酸を除去すると、ＲＥＳＴタンパク質は安定化し、神経細胞分化が抑制される^２－４。

本明細書では、ＣＴＤＳＰ１に対して高い親和性を有するペプチドを開発するための方法、化合物、及び組成物を開示する。

本明細書で開示されるのは、Ｃ末端領域小ホスファターゼ１（ＣＴＤＳＰ１）を結合するための方法、化合物、及び組成物である。

本明細書では、ＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチド、ＴＥＤＬＥＰＰＥＰＰＬＰＫＥＮ（配列番号１）、ＥＤＬＥＰＰＥＰＰＬＰＫ（配列番号１５）、ｎｅｋｐｌｐｐｅｐｐｅｌｄｅｔ（配列番号１６）、及びｋｐｌｐｐｅｐｐｅｌｄｅ（配列番号１７）であって、ＲＥＳＴ活性を阻害するためにＣＴＤＳＰ１に結合するものを開示する。小文字はＤ－アミノ酸を示しており、それらは分解されにくいため、結合親和性を損なわずにペプチドの半減期を長くすることができる^５。

本明細書では、９８個のＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチドバリアント（ＲＰＰ_Ｖ）（配列番号１８～１１７）を開示し、これらはＲＥＳＴに対するＣＴＤＳＰ１活性を様々な程度で阻害する（図２５）。

本明細書では、細胞内輸送を改善するために、Ｎ末端又はＣ末端でＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）に融合され得る、細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）等の細胞内輸送ペプチド及び／又はエンドソーム遊離配列（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）を開示する。さらに、細胞内輸送を改善するために、ＲＰＰ又はＲＰＰ_Ｖとテーブル７に挙げたペプチドの１つとの間に挿入可能なリンカー（配列番号１３８、１３９、１６０、及び１６１）を開示する。

本明細書では、結合親和性及び安定性を改善する（ペプチドの半減期を長くする）ために、Ｎ又はＣ末端で細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合して環化したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）を開示する。環化融合タンパク質の例は、配列番号２、５、１２、１３、及び１４である。

本明細書では、Ｎ又はＣ末端で細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）が、ＲＥＳＴタンパク質の分解を促進することを開示する。融合タンパク質の例は、配列番号２、及び４～１４である。

本明細書では、Ｎ又はＣ末端で細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合した配列番号１及び１５～１７のＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチド又は又は配列番号１８～１１７のＲＰＰ_Ｖが、ＲＥＳＴ標的遺伝子の発現を促進することを開示する。融合タンパク質の例は、配列番号２、４～１４である。

本明細書では、Ｎ又はＣ末端で細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合した配列番号１及び１５～１７のＲＰＰ又は又は配列番号１８～１１７のＲＰＰ_Ｖが、ＲＥＳＴ又はＣＴＤＳＰ１に関連する疾患又は状態を有する動物の治療に有利であることを開示する。治療的に有効量の化合物を動物に投与することによって、ＲＥＳＴ標的遺伝子の発現が増加し、又は、ＢＤＮＦが増加する。融合タンパク質の例は、配列番号２及び４～１４である。

本明細書では、細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合した配列番号１及び１５～１７のＲＰＰ又は配列番号１８～１１７のＲＰＰ_Ｖが、動物の外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、又は膵臓癌の治療に有用であることを開示する。融合タンパク質の例は、配列番号２及び４～１４である。

添付の図面が組み込まれかつ明細書の一部を構成する。図面は、上述した一般的な記述並びに後述する例示的実施形態及び方法の詳細な説明と共に、本発明の原理を説明するためのものである。

（Ａ）は、ＣＴＤＳＰ１結合部位の場所を示す全長のＲＥＳＴタンパク質である。図は配列番号３４７を開示している。（Ｂ）は、環状の細胞透過性ペプチドと一体化したレトロインバーテッド（ＲＩ）ＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチドである。図は配列番号３４８を開示している。ＣＴＤＳＰ１に対するＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチド（ＲＰＰ）の結合親和性が、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を用いて測定された。ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６３）に対するＲＰＰ（テーブル４；配列番号）の親和性は、約１３０ｐＭである。結合の評価は、ＣＴＤＳＰ１上のＨｉｓタグ（４０ｎＭ）をＲＥＤ－ｔｒｉｓＮＴＡ色素（２０ｎＭ）で蛍光標識し、ＲＰＰ（最大０．５μＭ）を結合したときの蛍光の変化を測定することで行った。ＣＴＤＳＰ１に対するＲＰＰの結合親和性が、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥＨｅａｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定された。ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６３）をＣＭ５センサーチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化し、（Ａ）ＧＳＴコントロール又は（Ｂ）ＲＰＰ（テーブル４；配列番号１６５）の結合親和性を測定した。ＲＰＰは細胞透過性があり、核に集積する。（Ａ～Ｄ）間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）に１００ｎＭのＦＬＡＧ－ＲＰＰ－ＣＰＰ（配列番号４）を加え、４時間培養した。培養６日後、ＲＰＰは核に濃縮された。（Ｅ、Ｆ）。６日間で、ペプチドは細胞質から核に転移している（標準偏差、ｎ＝３）。（Ａ）細胞骨格（ファロイジン）、（Ｂ）核（ヘキスト色素）、（Ｃ）ＲＰＰ（ＦＬＡＧＡｂ）、（Ｄ）コンポジットイメージ。ＲＰＰは脊髄の坐骨神経の核に集積する。坐骨神経の周囲の核を示すＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄ラットのＬ３及びＬ４領域の０．７ｃｍ冠状脊髄切片で、１ｍｇ（１ｍｇ／ｍＬ）のペプチドを中腿坐骨神経欠損損傷の部位に注入した４８時間後に摘出したもの。Ａは、ヘキスト染色で核を示す。Ｂは、ＦＬＡＧ抗体によりＦＬＡＧ－ＲＰＰ－ＣＰＰ（配列番号４）の局在を示す。ＲＰＰはＲＥＳＴタンパク質のレベルを低下させる。（左）ビヒクル又は１００ｎＭのＦＬＡＧ－ＲＰＰ－ＣＰＰ（配列番号４）で４時間処理した後のＨＥＫ２９３細胞における外因的に発現したＲＥＳＴタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。ブロットは抗ＲＥＳＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ，０７－５７９）と抗ＧＡＰＤＨでプロービングした。）（右）１００ｎＭのＦＬＡＧ－ＲＰＰ－ＣＰＰでＲＥＳＴタンパク質量が５８％減少したことを示す棒グラフ。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪを使用してゲルピークの面積を測定することにより算出した。ＲＰＰはＢＤＮＦの発現を増加させる。ＦＬＡＧ－ＲＰＰ－ＣＰＰ（配列番号４、１００ｎＭ）又はビヒクル（ＰＢＳ）と共に２４時間培養した後、ｑＰＣＲで測定したＨＥＫ２９３細胞におけるｍＲＮＡのレベル。ＢＤＮＦの発現量（２^－ＤＤＣ _Ｔ）の平均倍率変化(mean fold change)は２．４０１±０．８８５（標準偏差、ｎ＝３）であった。２^－ＤＤＣ _Ｔは、Ｌｉｖａｋら、２００１の記載にしたがって計算した。ＣＴＤＳＰ１阻害後４８時間経過したＮＢＦＬ細胞におけるＫ_Ｖ４．３のｍＲＮＡのレベル。細胞は、ＧＦＰ（＋）をもつＲＰＰ（配列番号１）又はＧＦＰ（－）をもつコントロールペプチドを発現するプラスミドでトランスフェクションされた。トランスフェクションから２４時間後、蛍光強度に基づき細胞をソートした。エラーバーは標準偏差ｎ＝２を表す。線状と環状のＲＰＰの比較。ＮＢＦＬ細胞に、（１μＭ）ＲＰＰ（線状：配列番号４；環状：配列番号２、テーブル８）又はコントロールのペプチド（配列番号３、テーブル９）を２４時間，又は４８時間投与した。（Ａ）ＢＤＮＦ、（Ｂ）ＮＧＦ、（Ｂ）Ｋ_Ｖ４．３転写レベルの変化を測定することにより、有効性を評価した。Ｎ＝１水（コントロール）又は３μＭのＲＰＰ（配列番号９）で４８時間培養した後の、２人の患者からの間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）におけるＢＤＮＦ及びＮＧＦのｍＲＮＡ発現（アクチンに対して正規化）。ｍＲＮＡレベルはコントロールに対する相対値で示す（標準偏差、ｎ＝２）。ｉＰＳＣ（神経幹細胞（ＮＳＣ）－ＮＬ５）に、以下に示すＲＰＰ配列のいずれか（３μＭ）又は水コントロールを投与した。７日間の培養後、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）神経細胞マーカー（ＤＡＰＩで正規化）を用いて、神経細胞分化を評価した。培地とバリアントは３日目に交換した。ＭＡＰ２レベルは棒グラフのコントロールに対する相対値である（標準偏差、ｎ＝４）

ｉＰＳＣ（神経幹細胞（ＮＳＣ）－ＮＬ５）は、１μＭのＲＰＰ（配列番号９）又は水コントロールとした。７日間の培養後、神経細胞マーカーであるＴＵＪ１（クラスＩＩＩベータチューブリン）とＭＡＰ２（ともにＤＡＰＩで正規化）を用いて、細胞の神経細胞分化を評価した。培地とＲＰＰは３日目に交換した。（標準偏差、ｎ＝６）。ｉＰＳＣ（神経幹細胞（ＮＳＣ）－ＮＬ５）は、１μＭのＲＰＰ（配列番号１３）又は水コントロールとした。７日間の培養後、神経細胞マーカーであるＴＵＪ１及びＭＡＰ２（いずれもＤＡＰＩで正規化）を用いて、細胞の神経細胞分化を評価した。培地とＲＰＰは３日目に交換した。（標準偏差、ｎ＝６）。ＲＰＰ（配列番号１２）は、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、及びＯＰＲＭ１の発現を増加させる。成体ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットＬ５ＤＲＧを様々な濃度のｒｐｐと４８時間培養した後の、水コントロールに対するｍＲＮＡ発現（β－アクチンに正規化）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。＊ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とダネットの検定、エラーバー＝平均値の標準誤差。３μＭのＲＰＰ（配列番号１３及び１４）を４８時間投与するとＮａ_Ｖ１．８の発現が増加した。成体ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットＬ５ＤＲＧと共にＲＰＰを培養した後の、水コントロールに対するｍＲＮＡ発現（β－アクチンに正規化）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。エラーバー＝平均値の標準誤差。ＲＰＰ（配列番号１２）は、ＢＤＮＦ及びＮＧＦの発現を増加させる。成体ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットＬ５ＤＲＧ神経細胞を様々な濃度のＲＰＰと共に４８時間培養した後の、水コントロールに対するｍＲＮＡ発現（β－アクチンに正規化）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析及びダネットの検定、エラーバー＝ＳＥＭ。ＲＰＰ（配列番号１２）は、ＤＲＧ神経細胞において壊死を引き起こさない。ＳＤラットを水、ＲＰＰ（１、３、１０μＭ）、又はトリトンと４８時間培養したときのＬＤＨ毒性アッセイ。＊＊＊＝ｐ＜０．００１、一元配置分散分析及びダネットの検定、エラーバー＝ＳＤ。ＳＮＩ後の慢性疼痛遺伝子のＲＮＡレベル。ＳＮＩ後０日目（シャム(擬似的処置)、ｎ＝３）、７日目（ｎ＝５）、又は２８日目（ｎ＝２）のβ－アクチンに対するＲＮＡ倍率変化（平均±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、ダネットの多重比較検定付き一元配置分散分析。ＲＮＡは、坐骨神経ＤＲＧ（Ｌ５）から単離した。ＲＥＳＴｍＲＮＡレベルはＴＢＩ後に増加する。（Ａ）無傷マウスの同側皮質におけるＲＥＳＴｍＲＮＡの発現は正常レベルであった。(Ｂ）皮質制御衝撃損傷の７日後に、マウスの同側皮質でＲＥＳＴレベルが劇的に増加する^６。ｍＲＮＡはＤＡＰＩ対比染色を用いてＲＮＡスコープで可視化した。 (a) ＮＣＲＭ－１ｉＰＳＣの作製に使用したＡＡＶＳ１－Ｎａｎｏｌｕｃ－Ｈａｌｏｔａｇノックイン（ＫＩ）コンストラクトの概略図。ＣＭＶ駆動コンストラクトは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）によってＣｈｒ．１９ｑのセーフハーバーＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入された。ＡＡＶＳ１ＫＩは配列とジャンクションＰＣＲで確認された（図示せず）。（ｂ）ＮＣＲＭ－１ｉＰＳＣの作製に使用したＭＡＰ２－Ｎａｎｏｌｕｃ－Ｈａｌｏｔａｇノックイン（ＫＩ）コンストラクトの概略図。Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＨａｌｏｔａｇをＺＦＮ（ジンク・フィンガー・ヌクレアーゼ）を用いてＭＡＰ２の転写開始点（ＴＳＳ）（Ｃｈｒ．２）にノックインし、ＭＡＰ２インフレームＫＩを配列決定とジャンクションＰＣＲにより確認した（図示せず）。ＣＭＶ－ＮＬＨＴ及びＭＡＰ２－ＮＬＨＴｉＰＳＣは多能性マーカーＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＴＲＡ１－８１／ＴＲＡ１－６０を発現している（図示せず）。（ｃ）ＣＭＶ－ＮＬＨＴｉＰＳＣとＭＡＰ２－ＮＬＨＴ神経幹前駆細胞（ＮＳＰＣ）及び神経細胞のルシフェラーゼアッセイ。ＭＡＰ２－ＮＬＨＴ細胞の神経分化に伴いルシフェラーゼ活性が上昇することに注目されたい。分化に伴うＭＡＰ２発現の上昇と一致する。ラット坐骨神経損傷モデル：（左）坐骨神経切断の外科的アプローチ。(右）坐骨神経の切片からの免疫組織化学－免疫蛍光染色。組織はβＩＩＩチューブリン、ラミニンＩ、及びＤＡＰＩで染色した。スケールバー＝１００μｍ。ラット坐骨神経採取：（左）ラット脊柱と関連する末梢神経のＥｎＢｌｏｃセクション。(右）坐骨神経損傷部位と関連する腰部神経根の画像Ａ．ベースライン（ＢＡＳＥ）と比較して、ＳＮＩは受傷後４日目に機械的疼痛閾値（ＭＴ）の感作を誘導する（ｎ＝１６）；ｐａｉｒｅｄｔ－ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０５、シャムは術後４日目の機械的閾値に有意差なしを示した。Ｂ．ＭＴ損傷後のモルヒネ単回Ｓ．Ｃ．注射による鎮痛効果（ＳＮＩ＋ＭＯＲ、ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ；Ｆ＝４．６２、＊ｐ＜０．０５（処置前後の一元配置分散分析による）；平均差及び９５％＝－７．３、－１４．５～－０．１３５、ｐ＜０．０５（ボンフェローニの多重比較検定による）。２０ｍｇ／ＫｇのＭＯＲ（ｎ＝４；Ｆ＝１９．０３，＊＊ｐ＜０．００１(一元配置分散分析による)）。ＳＮＩマウスにおいて生理食塩水（コントロール）及び４用量のモルヒネ（ＭＯＲ）で条件付けした後の条件付場所選好（ＣＰＰ）。ＭＯＲは用量依存的にＣＰＰを誘発した（一元配置分散分析、Ｆ＝４．１６７、ｐ＜０．０５）；１０ｍｇ対コントロール（ｐ＜０．００１）及び２０ｍｇ（ｐ＜０．０５）はテューキー多重比較検定による。１μＭのＲＰＰ（配列番号１）又はそのバリアントの１つに曝露した後の基質としてのＲＥＳＴペプチド（ＴＥＤｐＳＰＰｐＬＰＫＥＮ（配列番号３２９））に対するイン・ビトロのＣＴＤＳＰ１ホスファターゼ活性（ＧＳＴコントロールとの相対値）（テーブル３）。ＲＰＰ（配列番号１２）に曝露した後、基質としてのリン酸化ＲＥＳＴペプチド（ＴＥＤｐＳＰＰｐＰＬＰＫＥＮ（配列番号３２９））上での、水コントロールに対するイン・ビトロのオンターゲット（ＣＴＤＳＰ１）及びオフターゲットのホスファターゼ活性（１＝ＰＰＡ１、２＝ＰＰＭ１Ｈ、３＝ＰＰＭ１Ａ、４＝ＰＰ３ＣＡ、５＝ＰＰＰ１ＣＡ、６＝ＰＰ５ＣＡ）。Ｎ＝５、エラーバーは標準偏差。ＲＰＰのライブラリの構築。Ａ）実験のスキーム、Ｂ）ＲＥＳＴコンストラクトのヌクレオチド配列（変異導入前）（配列番号３４９）、Ｃ）ＲＥＳＴコンストラクトのタンパク質配列（変異導入前）（配列番号３５０）。ＲＰＰ、ＣＰＰ、及びＨｉｓタグには下線が引かれている。ＲＰＰ（配列番号１３）の構造。構造の下に沿って、２つの２－アミノテトラデカン酸をもつポリアルギニン配列を含むＣＰＰがあり、ＲＥＳＴＲＩリン酸化体（構造の右下のリジンから始まる）と統合されている。

一実施形態において、本発明は、ＣＴＤＳＰ１に対して高い親和性を有するペプチドを開発するための方法（実施例１～３に記載）を提供するものである。重要なのは、この方法が、ペプチド進化技術を利用してＣＴＤＳＰ１に対して高い親和性をもつペプチドを生成していることである。

実施形態において、本発明は、配列番号１及び１５～１７のペプチド、又は配列番号１及び１５～１７に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、又はなおより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するペプチドを提供する。これらのペプチド又はその類似のペプチドを、本明細書ではＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチド（ＲＰＰ）と称することとする。しかしながら、重要なことは、ＲＰＰ中のグルタミン酸、特に配列番号１の５位及び８位、配列番号１５の４位及び７位、配列番号１６の８位及び１１位、並びに配列番号１７の６位及び９位のグルタミン酸が維持されなければならないことである。

実施形態において、本発明は、ＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）、又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）と少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するペプチドを提供する。本明細書では、そのペプチド又は類似のペプチドをＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチドバリアント（ＲＰＰ_Ｖ）と称する（配列番号１８～１１７）。しかしながら、重要なことは、配列番号１８～６７のグルタミン酸、特に配列番号１の５及び８に相当する位置のグルタミン酸が維持されなければならないことである。レトロ逆配列（ＲＰＰ_Ｖ ^ＲＩ）（配列番号６８～１１７）については、配列番号１６の８位及び１１位が維持されなければならない。

実施形態において、本発明は、ＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）と、細胞内輸送ペプチド（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）又は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するペプチドとの間の融合タンパク質を提供するものである。

２つ以上の核酸配列間、又は、２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、配列同士の間の同一性又は類似性に関連して表現される。配列の同一性は、同一性パーセントで測定することができ、その割合が高いほど同一性が高いことを意味する。配列の類似性は、（保存的アミノ酸置換を考慮した）類似性パーセントに関連して測定することができ、割合が高いほど類似性が高い。

比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野でよく知られている。各種プログラム及びアライメントアルゴリズムについては：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res.16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 及びPearson et al., Meth. Mol. Bio.24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10, 1990, に記載され、それらは配列アライメントの方法と相同性計算について詳しく考察している。

ＮＣＢＩＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10, 1990) は、配列解析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮＡＮＤＴＢＬＡＳＴＸと関連して使用するために、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) 及びインターネット上のいくつかのソースから利用することが可能である。追加情報はＮＣＢＩのウェブサイト(www.ncbi.nlm.nih.gov)で見ることができる。

核酸配列の比較にはＢＬＡＳＴＮを、アミノ酸配列の比較にはＢＬＡＳＴＰを使用する。比較した２つの配列が相同性をもつ場合、指定された出力ファイルにはその相同領域が整列した配列として表示される。比較した２つの配列が相同性をもたない場合、指定された出力ファイルには整列した配列は表示されない。

一旦整列した後、両者の配列で同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が示される位置の数をカウントすることにより、一致数を決定する。配列同一性パーセントは、一致した数を、同定配列に記載された配列の長さ又は関節長（同定配列に記載された配列からの連続した１００個のヌクレオチド又はアミノ酸残基など）のいずれかで除して得られた値に１００を乗じることによって決定される。例えば、１５５４個のヌクレオチドを有する試験配列と並べたときに、１１６６個の一致をもつ核酸配列は、試験配列と７５．０％の同一性がある（１１６６／１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセントの値は、小数点以下第二位を四捨五入している。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、７５．１４は７５．１に切り捨てられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、７５．１９は７５．２に繰り上げられる。長さの値は常に整数になる。別の例では、以下のように同定された配列からの連続する２０個のヌクレオチドと整列する１５個のヌクレオチドの領域を含む標的配列は、その同定された配列と７５％の配列同一性を共有する領域を含む（すなわち、１５／２０＊１００＝７５）。

約３０個のアミノ酸より多いアミノ酸配列の比較には、デフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列をデフォルトのパラメータ（ギャップ存在コスト１１、残量ギャップコスト５当たり１）に設定して、Ｂｌａｓｔ２シーケンス機能を使用する。ホモログ（相同体）は通常、ＮＣＢＩＢａｓｉｃＢｌａｓｔ２．０、ｎｒやｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースなどのデータベースとのギャップＢＬＡＳＴＰを用いてアミノ酸配列との全長アライメントでカウントした配列同一性が少なくとも７０％以上あることを特徴とする。ＢＬＡＳＴＮプログラムで検索されたクエリはＤＵＳＴ(Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci.10:67-70)でフィルタリングされる。その他のプログラムでは、ＳＥＧを使用する。また、手動でアライメントを行うことも可能である。さらに類似性の高いタンパク質は、この方法で評価した場合、タンパク質との配列同一性が少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％など、同一性パーセントの増加を示すことになる。短いペプチド（約３０個以下のアミノ酸）をアライメントする場合、Ｂｌａｓｔ２シーケンス機能を使用し、ＰＡＭ３０マトリックスをデフォルトのパラメータ（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティ）に設定し、アライメントを行う。参照配列との類似性がさらに高いタンパク質は、この方法で評価すると、タンパク質との配列同一性が少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％など、同一性パーセントの増加を示す。配列の同一性に関して、配列全体よりも少ない配列を比較する場合、ホモログは、通常、１０～２０個のアミノ酸の短い窓に亘って少なくとも７５％の配列同一性を有することになり、そして参照配列に対するそれらの同一性に依存して少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９８％の配列同一性を有することができる。このような短い窓において配列同一性を決定する方法は、ＮＣＢＩウェブサイトに記載されている。

２つの核酸分子が密接に関連していることを示す１つの指標は、上記のように、厳しい条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズすることである。遺伝暗号の縮重により、高度な同一性を示さない核酸配列であっても、同一又は類似の（保存された）アミノ酸配列をコードしている場合がある。この縮重を利用して核酸配列を変更できることで、実質的に同じタンパク質を全てコードする複数の核酸分子を生成することができる。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別の（必ずしも累積的ではない）指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸がコードするポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。

特定の実施形態では、ＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）は、例えば、細胞侵入を可能にするために別のペプチドと融合されてもよい。好ましくは、ＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）は、細胞侵入及びエンドソームからの脱出を可能にするペプチド配列に融合される。より好ましくは、細胞侵入及び脱出ペプチド配列は、配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９のいずれかである。ＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）と細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）は、直接融合してもよく、又は、それらをつなぐリンカー（例えば、配列番号１３８、１３９、１６０又は１６１）配列が含まれてもよい。
細胞又は組織に、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを投与すると、それは核に局在し（図３、配列番号４、及び、図４、配列番号４）、ＲＥＳＴの分解を生じさせ（図５、配列番号４）、ＲＥＳＴが標的とする遺伝子の発現を増加させ（図７、配列番号４、図８、配列番号１、図９、線状＿配列番号４及び環状＿配列番号２、図１０、配列番号９、図１４、配列番号１２、図１５、配列番号１３及び１４、並びに図１６、配列番号１２）、そして神経細胞分化を生じさせる（図１１、配列番号５～１１、図１２、配列番号９、及び図１３、配列番号１３）ことが示された。

本発明は、ＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）がＣＴＤＳＰ１と結合してＲＥＳＴの活性を阻害することを見出した。図２及び図３に示す結合曲線で示されるように、ＲＰＰはＣＴＤＳＰ１に対して低いｐＭの親和性を有する。細胞や動物では、ＲＰＰはＣＴＤＳＰ１に結合し、ＣＴＤＳＰ１がＲＥＳＴに結合するのを阻害している。

増加したＲＥＳＴとそれに伴う神経遺伝子の抑制は、以下の疾患や障害の病態の根幹をなしている：

［外傷性脳損傷］－外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、神経細胞死により認知能力の喪失をもたらす。ＴＢＩ後の認知能力の回復を改善するためには、１）損傷後に続く神経細胞死を減らすこと、２）失われた神経細胞を再生すること、の２つの課題に取り組む必要がある。

ＲＥＳＴの発現量は、ＴＢＩ後に脳内で劇的に増加する（図１９）。一貫して、急性虚血による脳損傷は神経細胞におけるＲＥＳＴの発現を誘導し、その結果、神経細胞が死滅することがいくつかの研究によって示されている^７－９。これらの研究は、ＲＥＳＴを除去すると神経細胞の生存率が向上することを示している^７－９。臨床的な意義は大きい。例えば、ＲＥＳＴ値の上昇は、脳損傷後によく起こる発作の頻度の上昇と相関がある^{１０－１２}。脳損傷の動物モデルでは、ＲＥＳＴを阻害すると発作の発生率が著しく低下する^{１３、１４}。また、ＴＢＩ後に慢性的に上昇するＲＥＳＴは、脳損傷の既往に起因する神経変性疾患に関与している可能性が高い^{１５－１７}。イン・ビトロとイン・ビボの両方の研究で、ＲＥＳＴを除去すると、神経細胞の生存^７－９、機能^{１４、１８}、再生^{２、１９－２４}が改善することが示されている。したがって、ＴＢＩ後のＲＥＳＴを標的にすることで、脳損傷の影響を軽減し、アルツハイマー病などの関連する加齢性神経変性疾患の発症リスクを相殺することができると考えられる^{１７、２５}。

ＴＢＩ患者において神経細胞新生が認知機能を改善する根拠は、神経細胞新生の増加が学習、記憶、及びその他の認知機能の改善に関連する研究^{２６－３０}、そして逆に、抗増殖剤、放射線、又は遺伝子操作による神経細胞新生の阻害が記憶の海馬依存型を損ねることを示す研究^{２９－３３}にある。また、神経細胞新生の欠損は、発達障害（小頭症^３４、巨頭症^３５、自閉症^３５や神経変性疾患（認知症、アルツハイマー病など）^３６など、認知を病因とする多くの疾患と関連している。実験的治療（輸血、成長因子や神経栄養因子、幹細胞移植など^{１０，３７－４９}は、神経細胞の再生に焦点を当てたものである。これらの試みは、少なくともＴＢＩの状況下で神経前駆細胞の末端分化ができないため、認知機能の回復に必要な神経細胞新生を刺激することができなかった^{２６、２８、５０－５７}。神経前駆細胞から神経細胞への最終分化は、ＲＥＳＴと呼ばれるＲＥ１サイレンシング転写因子によって、ある１つのチェックポイントで阻止される。

［末梢神経障害］－末梢神経損傷（ＰＮＩ）患者における神経再生は、少なくとも２つの方法で阻害される。第１に、発達中の神経細胞と成熟した神経細胞の成長、生存、分化を支える神経栄養因子（ＮＴＦ）の減少がある^５８。第２に、軸索伸長、小胞輸送、及びイオンコンダクタンスを含むシナプス可塑性に必要な遺伝子の発現が低下する^５９。この２つの現象は、傷害によって誘発されるＲＥＳＴの発現と同時に起こる^６０。したがって、ＲＥＳＴを除去することで、神経再生の阻害を逆転させ、ＰＮＩからの回復を早めることができる。ＲＰＰでＣＴＤＳＰ１を阻害すると、ＲＥＳＴの分解が促進され（図６）、神経細胞の分化が進み（図１１、１２、１３）、ＮＴＦの発現が増加する（図７、図９、図１０、図１６）。そのことは、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７、１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１、１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）の神経再生刺激への可能性を示している。

［慢性疼痛］－慢性疼痛時に中枢及び末梢回路で抑制される遺伝子の多くは、幹細胞、神経前駆細胞、非神経細胞における神経細胞遺伝子発現抑制因子であるリプレッサーエレメント１（ＲＥ１）サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）の直接的又は間接的な標的である^{６１－６３}。通常、健康な神経細胞では、この強力な神経細胞遺伝子抑制因子をクロマチンに残さないよう、活発な分解が行われ、ＲＥＳＴのレベルは低く保たれている^{６４－６９}。神経障害性疼痛に移行する前に、末梢神経損傷後のマウスやラットの末梢神経の神経細胞でＲＥＳＴレベルが有意に上昇し、その後、痛みの刺激が処理され経験される中枢神経系の神経細胞でスパイクが発生する^{６０、７０、７１}。神経損傷後のＲＥＳＴの活性化により、カリウムチャネルＫ_Ｖ４．３（Ｋｃｎｄ３）とＫ_Ｖ７．２（Ｋｃｎｑ２）、ナトリウムチャネルＮａ_Ｖ１．８（Ｓｃｎ１０ａ）、ミューオピオイド受容体ＯＰＲＭ１を含む感覚神経細胞の正常興奮性に必要な遺伝子が発現低下する（図１８）^{６０、７２－７４}。ＲＥＳＴを阻害して慢性疼痛を緩和する根拠として、マウスやラットの末梢神経損傷（ＰＮＩ）モデルを用いた研究が発表されている^{６０，７２－７４}。マウスでは、ＰＮＩ後の感覚神経細胞におけるＲＥＳＴの遺伝子ノックダウンにより、後根神経節におけるミューオピオイド受容体^{６０，７２，７３}、Ｎａ_Ｖ１．８^{６０，７２，７３}、Ｋ_Ｖ４．３^{７２，７３，７５}、及びＫ_Ｖ７．２^{７２，７３}の遺伝子発現が回復し、Ｃ神経線維のＫ＋Ｍ型電流が正常に回復し^６０、痛覚過敏及び異痛症^{７２－７４}が減少し、慢性疼痛モデルにおけるモルヒネ鎮痛作用^{６０，７４}が回復した（テーブル１２参照）。
ＲＥＳＴ標的を含む多くの遺伝子の転写抑制に寄与するアダプタータンパク質であるｍＳｉｎ３結合部位を最適化したＲＥＳＴ模倣物を用いてＲＥＳＴリプレッサー複合体を破壊すると、慢性疼痛モデルマウスにおいてＣ線維機能の回復、痛覚過敏及び異痛症の軽減、モルヒネ鎮痛作用の回復が認められた（テーブル１２）^７４。ラットでは、ＲＥＳＴのノックダウンにより、急性痛から慢性痛への移行が制御され、痛覚過敏と異痛症の減少、ムスカリン鎮痛作用の回復が証明された（テーブル１２）^{７２，７３}。

テーブル１２に示した研究では、我々は、傷害後に知覚過敏がなく、ＲＥＳＴ標的遺伝子のダウンレギュレーションもないマウスコンディショナルノックアウト（ｃＫＯ）研究（完全ノックアウト）（テーブル１２）と、傷害後に異痛症（最大４５％）と痛覚過敏（最大６５％）が一部しか減少しないラットｓｉＲＮＡノックダウン研究との間において、知覚過敏の減少に不一致があることを認識している。ｓｉＲＮＡのバイオアベイラビリティは、そのサイズ（１３，０００ｋＤ以上）とエンドソームへの封じ込めによる細胞内輸送の悪さによって制限されるため、ノックアウト効果はｓｉＲＮＡのノックダウンよりも強力であると考えられる。

テーブル１２の研究は、１群当たりの動物数を確定するための検出力解析が行われていない点、動物数が少なく統計解析に疑問がある点で、厳密性に欠けると認識している。いくつかの研究では、予測性の低い坐骨神経部分結紮（ｐＳＮＬ）モデルや、推奨される温存神経損傷（ＳＮＩ）慢性疼痛モデルを用いている。これらの研究の大部分は、雄のみを対象としている。しかしながら、これらの欠点にもかかわらず、研究の結果は一貫しており、したがって、我々が提案する慢性疼痛治療薬のイン・ビボ有効性評価を支持するものである。さらに、ＲＥＳＴの活性は哺乳類で高度に保存されているため、これらの研究は、ヒトでＲＥＳＴの調節を試験するための強力な概念的裏付けになると考えている。

我々は、ＲＥＳＴがそのセリン８６１と８６４がリン酸化されることで分解標的となることを発見した。ＲＥＳＴは、Ｃ－末端領域小ホスファターゼ１（ＣＴＤＳＰ１）によってこれらの部位が脱リン酸化されることにより安定化される^２－４。ＣＴＤＳＰ１はＲＥＳＴと同様に非神経細胞組織で発現し、ＲＥＳＴとの相互作用を介して神経細胞遺伝子のサイレンシングに寄与している。その結果、ＣＴＤＳＰ１を阻害すれば、ＲＥＳＴの分解を促進し、遺伝子発現を刺激するのに十分であると結論付けた。この結論を裏付けるように、我々は、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）や神経においてＣＴＤＳＰ１をノックダウンすると、ＲＥＳＴ標的遺伝子が発現し、軸索が再生することを実証している^７６。
我々は、ＲＥＳＴ－ＣＴＤＳＰ１相互作用の機構的理解を活かし、ＲＥＳＴの関連制御領域を包含する環状リン酸化模倣ペプチドを開発した^７７。ＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチド（ＲＰＰ）は、いくつかの薬理学的特性を有する。環状構造とＤ－アミノ酸組成（例えば、配列番号９、１２、１３、１４、１６、１７、６８～１１７）により、高い安定性を有する。また、多くの抗体を上回る低ｐＭの結合親和性を有しており（図２、図３）、オフターゲット効果のリスクが低いことが示唆される。その小さなサイズ（＜３．５ｋＤ）は、低分子医薬のそれに近いバイオアベイラビリティをもつことを示している。我々の予備的データは、我々の模倣物がＣＴＤＳＰ１の活性を阻害し、ＲＥＳＴタンパク質レベルを低下させ、結果として神経細胞の適切な活性に必要な神経遺伝子を発現させることが示している^７７。

最も重要なことは、我々のアプローチが以下の理由で安全かつ有効であると予測されることである。
１）神経損傷後のような再生反応の呼び水となる核標的に対して選択的に作用する。クロマチンの基底組織は、新しい命令のセットのエピジェネティックな「書き込み」を許容しない。しかしながら、神経損傷は、協調的、広範囲、かつ遷移するヌクレオソームの再編成、すなわちゲノム遷移中間状態（Genomic Transient Intermediate State：ＧＴＩＳ）：必要な応答のためのエピジェネティックな再プログラミングに適した一時的ヌクレオソーム構造を引き起こす^{７８－８１}。
２）本薬剤は、非常に高い結合親和性（低ｐＭ）を有するため、オフターゲット効果がない（図２、図３）。
３）我々は、１ヶ月未満の短期間の治療期間を提案している。ＲＥＳＴは神経細胞の末端分化のゲートキーパーであり^{６４，８２}、細胞をその系統に不可逆的にコミットさせるプロセスであるというのが、我々の短い治療期間の根拠である^８３。神経前駆細胞は、ＧＴＩＳでもあるため、慢性疼痛状態の神経細胞とエピジェネティックな類似性を持っており、誘導後数日で末端分化する^６３。ＲＰＰは７日以内に神経細胞分化（神経細胞分化のマーカーであるＭＡＰ２陽性細胞で測定）を誘導できることを一貫して示している（図１１、図１２、図１３）。一度プロセスを開始し、細胞をコミットしたならば、それ以上治療する必要はない。そのため、この早期治療によって得られた痛みの緩和は、持続的なものとなることが期待される。
４）壊死を測定するエクス・ビボのＤＲＧ神経細胞毒性試験において、本薬剤が神経細胞に対して毒性を持たないことを示した（図１７）。
５）ＲＥＳＴとＣＴＤＳＰ１は、主に神経発生に関与しているため、傷ついた成体細胞でこれらの活性を阻害することは、十分な耐性をもつと予想される。
６）ペプチド医薬品の安全性は、治療戦略として魅力的なものである。現在、６８種類以上のペプチド医薬品が販売され、世界的な売上高は１４７億ドルを超えており、１４０種類が臨床開発中である^{８４，８５}。

［イノベーション］
［ファーストインクラス医薬品候補］神経細胞遺伝子の転写抑制因子であるＲＥＳＴを標的とした初めての薬剤を開発した。刊行された文献は、ＲＥＳＴの発現が慢性疼痛に寄与していることが示している（テーブル１２）。ＰＮＩ後、ＲＥＳＴとＣＴＤＳＰ１の発現が末梢神経系（図１８）と中枢神経系の両方で増加し、機能不全を引き起こす^７－９。ＲＥＳＴを阻害することで慢性疼痛が緩和されることが、ネズミを用いたいくつかの研究で発表されている^{６０，７２－７４}。

［革新的なドラッグデザイン］ＲＥＳＴを分解から保護するホスファターゼであるＣＴＤＳＰ１を阻害することでＲＥＳＴを不安定化し^３、神経特異的遺伝子の発現を可能にする環状リン酸化模倣細胞侵入ペプチドを開発した。ＣＴＤＳＰ１は、ＲＥＳＴと同様に、神経細胞の損傷後を除き、非神経細胞型に発現が限定されている。本阻害剤は、再生を誘導するのに必要な遺伝子を即座に制御する転写チェックポイントを直接ターゲットにしている点で新規性がある。転写因子の標的化及びセリンホスファターゼに対する治療薬創製の課題を克服している。後者については、リン酸化タンパク質ホスファターゼ（ＰＰＰ）、及び金属依存性タンパク質ホスファターゼ（ＰＰＭ）に着目したアプローチもある^８６。しかしながら、ＣＴＤＳＰ１は、活性を金属イオンのみに依存するのではなく、２つのアスパラギン酸触媒を用いるハロゲン酸デハロゲナーゼ（ＨＡＤ）である^８７。この触媒部位は、ＨＩＶ－１プロテアーゼのような類似の酵素に対する治療薬開発の成功が示すように、特異的な阻害が可能である^{８８－９１}。最後に、ＣＴＤＳＰ１は他のセリンホスファターゼには見られないプロリン依存性の基質選好性を持っており、これを利用して本薬剤の結合性と安定性を向上させた。

［予備データ］ＲＥＳＴは、イオンチャネル、成長因子、及び軸索誘導タンパク質を含む神経細胞遺伝子の制御領域近傍部のリプレッサーエレメント－１（ＲＥ－１）部位においてクロマチンと結合することによって、遺伝子発現を抑制している^１。したがって、神経前駆細胞（ＮＰＣ）などの幹細胞が末端分化する前に、まずＲＥＳＴをターゲットにして分解し、必要な神経細胞遺伝子を発現させる必要がある^６４。ＲＥＳＴはＣＴＤＳＰ１によって分解から保護されており、このことは神経細胞遺伝子の発現を妨げるのに必要かつ十分な条件である^２。リン酸化された標的に結合できるが脱リン酸化を触媒できないドミナントネガティブなＣＴＤＳＰ１は、Ｐ１９幹細胞の末端分化を誘導する^９２。

我々はこれまでに、ＣＴＤＳＰ１とＲＥＳＴの相互作用は、ＭＡＰキナーゼであるＥＲＫ２によるＲＥＳＴのセリン８６１及び８６４のリン酸化に依存していること、これらのセリンをアラニンに変異させるとＲＥＳＴの安定性が増すことを明らかにしてきた^２－４。このＲＥＳＴ制御領域の非加水分解性リン酸化模倣剤が、ＣＴＤＳＰ１の活性を低下させ、ＲＥＳＴの分解を促進し得ると推測された。この仮説を検証するために、我々はＲＥＳＴリン酸化模倣ペプチドすなわちＲＰＰ^７７を開発し、ＲＥＳＴとＲＥＳＴ標的に対する用量依存的な効果を評価した。ＲＰＰは、ＲＥＳＴからのアミノ酸８５８～８７０を含み、セリン８６１と８６４はグルタミン酸に変異しており、それらはホスホセリンの形と全体の電荷を模倣することができる。Ｃ末端には、それぞれＨＩＶ－ＴａｔとＨＡ２由来のアルギニンに富む細胞侵入ペプチドとエンドソーム出口配列を融合させた。これらは、培養哺乳類細胞及び生きた組織にペプチド及びタンパク質を送達し、血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を促進するために用いられる^{９３－９６。}

ＲＰＰがＲＥＳＴタンパク質を減少させるか否かを検討した（図６）。左図では、ＲＰＰがＨＥＫ細胞におけるＲＥＳＴ（外因性＋内因性）レベルを減少させたことをウェスタンブロット（ＷＢ）で示している。右図では、ＲＥＳＴタンパク質の総量（外因性＋内因性）のＷＢ分析による定量化が、ＲＰＰを投与したＨＥＫ細胞において全体的に５８．３％減少したことを示している（図６）。

イン・ビトロの結合試験において、ＲＰＰはＣＴＤＳＰ１に対して低いｐＭの親和性を有し、オフ速度も遅かった（図２及び図３）。イン・ビトロのホスファターゼ阻害試験において、ＲＰＰは低濃度のｎＭで標的であるＣＴＤＳＰ１を阻害したが、１０μＭでは標的外のＰＰ５、ＰＰ１、ＰＰＭ１Ｈ、ＰＰＭ１Ａ、又はＰＰ３ＣＡの活性を阻害しなかった（図２６）。ＭＰＣの細胞透過性と安定性アッセイでは、ＲＰＰは核内に移動し（図４及び図５）、これはＲＥＳＴとＣＴＤＳＰ１の両方の局在プロファイルと一致した^{９２，９７}。ＲＰＰのレベルは、培養６日後でも安定していた。

げっ歯類の慢性疼痛モデルにおいてＲＥＳＴを阻害すると、痛覚過敏や異痛症の原因とされるＮａ_Ｖ１．８、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、及びＯＰＲＭ１のダウンレギュレーションを抑制できることが確立されている（テーブル１２参照）。これらの研究に基づき、ＣＴＤＳＰ１を阻害することで、慢性疼痛に関連するＲＥＳＴ標的遺伝子の発現を刺激できるかどうかを検証した。また、ＲＰＰでトランスフェクションした、又は線状もしくは環状ＲＰＰを投与したＮＢＦＬ細胞（ＨＩＶＴＡＴ－ＨＡ２なし）は、Ｋ_Ｖ４．３のｍＲＮＡが増加（それぞれ２倍、最大４倍）することを示した（図８及び図９）。

我々は、３μＭのＲＰＰ（配列番号５～１１）が、ＤＡＰＩ（核）で正規化したＭＡＰ２（成熟神経細胞マーカー）発現による測定において、コントロールに比べて２～２．７倍のヒト神経前駆細胞（ｉＰＳＣ）の分化を増加させること（図１１）を見出し、そして、１μＭのＲＰＰ（配列番号９及び１３）が、ＤＡＰＩ（核）で正規化したＴＵＪ１（それぞれ最大３６％及び３倍）及びＭＡＰ２（それぞれ最大３３％及び２倍）（神経細胞マーカー）発現による測定において、ヒト神経前駆細胞（ｉＰＳＣ）の分化を増加させることを見出した（図１２及び図１３）。コントロールと比較して、細胞死の増加は見られなかった（データは示さず）。このスクリーンを用いる根拠は、神経前駆細胞においてＲＥＳＴを除去すると神経細胞の分化が誘導されることが示されていることであり^２２、これは神経細胞遺伝子のアンサンブルデプレッションの読み取りである。

有効性と毒性の予備評価として、ＲＰＰを、０、１、３、又は１０μＭで４８時間、全ＤＲＧ神経細胞のエクス・ビボ培養で、Ｋ_Ｖ４．３（図１４）、Ｋ_Ｖ７．２（図１４）、Ｎａ_Ｖ１．８（図１４、図１５）、及びＯＰＲＭ１（図１４）の発現誘導と、神経毒性を引き起こす可能性（図１７）について評価した。
３μＭの配列番号１２は、コントロールと比較して、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、ＯＰＲＭ１をそれぞれ約０倍、６倍、３倍、３倍に誘導した（図１４）。３μＭの配列番号１３と１４は、Ｎａ_Ｖ１．８をそれぞれ約６倍と１３倍に誘導した（図１５）。１０μＭの配列番号１２は、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、ＯＰＲＭ１をそれぞれ約２倍、７倍、５倍、４倍に誘導した（図１４）。
乳酸脱水素酵素ＬＤＨ細胞毒性試験において、ＲＰＰ配列番号１２は０、１、３、１０μＭで毒性を示さなかった（図１６）。予想通り、ポジティブコントロール（トリトン，ｎ＝６）は毒性があった（図１７）。

［てんかん］- てんかんは、混乱、意識喪失、制御不能な動作を引き起こす、脳内の制御不能な電気的活動である^９８。それは、ＲＥＳＴの抑制対象であるＳＣＮ１Ａ（Ｎａ_Ｖ１．１）、ＳＣＮ２Ａ（Ｎａ_Ｖ１．２）、ＳＣＮ１Ｂ（Ｎａ_Ｖβサブユニット１）、ＫＣＮＱ２（Ｋｖ７．２）、及びＫＣＮＱ３（Ｋｖ７．３）を含むイオンチャネル及び受容体の制御異常の結果である^{１４，９９}。てんかんの根本的な原因は、神経細胞の核にあるＲＥＳＴレベルの上昇である^１００。

［糖尿病］－膵臓β細胞及び神経細胞は、それらの分化プログラムにおいて、ＲＥＳＴの排除を伴う類似の転写経路を共有している^１０１。β細胞におけるＲＥＳＴの過剰発現によるＲＥＳＴ標的遺伝子のダウンレギュレーションは、インスリン分泌を低下させる^{１０２，１０３}。

［アルツハイマー病］－アルツハイマー病では、アセチルコリンと、アセチルコリンの合成に必要な転移酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）が非常に少なくなっている。この酵素の濃度低下は、アルツハイマー病に伴う記憶障害や認知障害の一因となる。脳内のＲＥＳＴ濃度が上昇すると、ＣｈＡＴが抑制される^１６。

［ハンチントン病］－ハンチントン病では、ＲＥＳＴが神経細胞の細胞質から核に移動することが、この病気に伴う神経細胞変性の原因であると考えられている^{１０４－１０６}。

［多形性神経膠芽腫を含む脳腫瘍］－多形性膠芽腫（ＧＢＭ）などの脳腫瘍は、がん幹細胞である脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）に由来し、強固な自己複製能を示すことでがん化する。これらの細胞は放射線や化学療法に耐性があり、治療後数ヶ月で増殖性を示すようになる^{１０７－１０９}。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、ＢＴＩＣを末端分化させることによって腫瘍の形成を防ぐ可能性がある。いったん末端分化した細胞は、もはや増殖して新たな腫瘍の種を蒔くことはできない^１１０。
ここで重要なのは、末端分化は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤を用いてクロマチンリモデリングを標的とするなどの他の方法によって達成される分化とは異なるということである。これらの酵素の阻害は遺伝子発現を無差別に変化させるもので、ＧＢＭの再発防止に必要な永久的な末端分化を達成することはできない。
ＢＴＩＣから神経細胞への末端分化は、ＲＥＳＴにより１つのチェックポイントで阻害される。この抑制因子が発がん性の維持に重要であることは、ＲＥＳＴレベルの増加がＧＢＭの再発^{１１１－１１３}と無病生存期間の短縮^{１１２，１１４}の両方に相関するという観察によって強調されている。ＢＴＩＣが癌原性を維持するためにＲＥＳＴに依存していることは、治療介入の機会を生み出す。
ＲＥＳＴはセリン８６１と８６４のリン酸化により分解の標的となるが、これらのセリンはＣ末端領域小リン酸化酵素であるＣＴＤＳＰ１により脱リン酸化状態に保たれている^２。したがって、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）でＣＴＤＳＰ１を阻害すれば、末端分化のＲＥＳＴ－ブレーキを解除して、ＧＢＭ及びその他の脳腫瘍の再発を防止できるはずである。

［膵臓がん］－ＲＥＳＴレベルは、進行期、転移陽性の膵臓がん細胞で高くなる^１１５。腫瘍内のＲＥＳＴ濃度が高い膵臓がん患者は、生存率が悪い^１１５。イン・ビトロの機能実験では、ＲＥＳＴをノックダウンすると、膵臓がん細胞（ＡｓＰＣ－１及びＰＡＮＣ－１）の増殖、遊走、浸潤、上皮間葉転換が抑制されることが示されている^１１５。イン・ビボ実験（ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス皮下投与モデル、上腸間膜静脈注射ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデル）では、ＲＥＳＴのノックダウンにより異種移植腫瘍の増殖と転移が抑制されることが示された^１１５。よって、ＲＥＳＴを阻害することにより、それらの疾患の患者の転帰が改善される。
したがって、本発明はまた、細胞におけるＲＥＳＴを阻害するための方法に関するものである。一般に、この方法は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを細胞に接触させることを含む。例えば、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）が細胞に入り、ＲＥＳＴ活性に影響を与えるために十分な時間細胞を曝露させることであってもよい。この方法は、イン・ビトロでもイン・ビボでも実施することができる。
イン・ビトロで実施する場合、この方法は、ＲＥＳＴの活性を研究するために使用することが可能である。それは、ＲＥＳＴに対する、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）の効果を補足又は拮抗する能力について他の化合物を試験するため、あるいは研究者にとって重要なその他の理由のための研究である。イン・ビボで実施する場合、本方法は、ＲＥＳＴに関連する１つ以上の疾患又は障害について対象を治療する方法として使用することができる。
本発明のこの態様の方法によれば、好ましくは、ＲＥＳＴの活性が低減される。細胞に接触させるステップは、薬剤を１つ以上の標的細胞に物理的に接触させる任意の動作とすることができる。したがって、接触させる細胞のイン・ビトロ培養物に薬剤を直接添加し、薬剤が培地中を拡散して少なくとも１つの細胞に接触するのに十分な時間を与える方法によることができる。同様に、水性環境下での細胞への薬剤の添加によってもよい。それに替えて、任意の許容される投与経路を介して対象に薬剤を投与し、対象の身体が自然のプロセスを通じて薬剤を標的細胞に分布させる方法とすることもできる。したがって、イン・ビボ法では、全ての哺乳動物及び特にヒトを含む動物における細胞への薬剤の局所的又は全身的な送達の方法とすることができる。この態様によれば、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）を使用して、対象を治療的に又は予防的に処置し、そして、処置に使用するための組成物を調製することができる。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＲＥＳＴが関与する疾患又は障害に罹患している又は罹患の危険性がある対象者を処置する方法を提供する。一般に、本方法は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）を、対象者におけるＲＥＳＴの量又は活性に影響を与えるのに十分な量で投与することを含む。特定の態様において、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）のＣＴＤＳＰ１への結合は、細胞内のＲＥＳＴ活性の抑制をもたらす。
一般に、この方法は、ＲＥＳＴ活性を阻害するのに十分な量の、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）を、十分に時間をかけて投与することを含む。
多くの場合、投与量と投与時間は、疾患や障害の１つ以上の臨床症状の変化を見るため、又は疾患や障害の進行が１つ以上の臨床症状を見る段階に達するのを止めるために適切なものである。この態様によれば、薬剤は、対象者を治療的又は予防的に処置するために使用することができ、処置に使用するための組成物を調製するために使用することができる。

一実施形態では、本発明は、対象者の外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、又は膵臓癌を治療、緩和、又は改善するための方法を提供するものである。本明細書で使用される用語「治療する」又は「緩和する」又は「改善する」及び同様の用語は、予防と、完全又は部分的な治療とを含む。また、それらの用語は、症状の軽減、症状の改善、症状の重症度の軽減、疾患の発症率の低下、その他患者の状態の変化など、治療成果を向上させることを含むこともできる。
本方法は、動物における外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、もしくは膵臓癌を患う対象、又は、動物における外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、または膵臓癌の治療を必要とする対象に、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）を投与することを含む。

対象への、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）の投与は、既知の許容できる経路によるものとすることができる。このような経路としては、経口、粘膜経由（例えば、鼻腔、吸入経由、直腸、子宮内又は膣内、舌下）、静脈内（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入）、腹腔内、及び皮下などがあるが、必ずしもこれらに限定されない。投与は、同様に、標的細胞（すなわち、治療されるべき細胞）を含む部位（例えば、器官、組織）への直接注射によって行うことができる。
さらに、投与は任意の数のレジメンに従うことができる。したがって、薬剤の単回の投与もしくは投薬、又は一定期間にわたる複数回の投与もしくは投薬で構成することができる。したがって、治療には、所望の結果が得られるまで、投与するステップを１回以上繰り返すことができる。
実施形態では、治療は、数週間、数ヶ月、数年など、長期間にわたって継続することができる。当業者であれば、当技術分野で既知のパラメータに基づき、個人に適した投与法を容易に開発することが十分に可能である。このように、本方法は、疾患や障害を制御することも想定しているが、必ずしも除去する必要はない。本発明にしたがった好ましい投与経路は、経口および粘膜経由である。

投与量は、対象者、疾患の段階、対象者の年齢、対象者の一般的な健康状態、及び医療技術に精通した者が日常的に考慮する既知の他の様々なパラメータによって変化する。一般論として、対象者の症状における検出可能な変化をもたらすために、十分な量の薬剤が投与されることになる。適切な量は本明細書に開示されており、さらなる適切な量は、当業者であれば過度の実験をすることなく特定することができる。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）は、対象者にとって許容可能な、耐え得る、かつ有効な形態で投与される。生物学的に活性な薬剤のための多数の薬学的形態及び処方が当技術分野で知られており、そしてこれらのいずれか及び全てが本発明によって企図されるものである。したがって、例えば、内服液、カプレット、カプセル、注射剤、点滴剤、坐剤、トローチ剤、錠剤、クリームや軟膏、吸入剤などに製剤化することができる。

当業者であれば、有効な投与量や投与レジメンを、医療行為や個々の対象者の臨床状態によって容易に最適化するであろう。

投与頻度は、化合物の薬物動態パラメータ及び投与経路に依存する。最適な医薬製剤は、投与経路及び所望の投与量に応じて当業者により決定されることになる。このような製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、イン・ビボの放出速度、及びイン・ビボのクリアランス速度に影響を与える可能性がある。投与経路により、体重、体表面積、又は臓器の大きさに応じて適切な投与量が算出される。動物モデルの利用は、治療薬の適切な投与量の決定を容易にする上で特に有用である。適切な治療投与量を決定するために必要な計算をさらに洗練させることは、特に本明細書に開示された投与量情報及びアッセイ、並びに動物又はヒトの臨床試験で観察された薬物動態データに照らして、当業者であれば過度な実験をすることなく日常的に行われる。

通常、適切な投与量は、血中濃度を決定するための確立されたアッセイと、関連する用量反応データを併用することで確認される。最終的な投与量は、薬剤の作用を修飾する要因、例えば、薬剤の特異的な活性、損傷の程度及び患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性別、及び食事と、感染の程度、投与時間、及びその他の臨床的要因とを考慮して、医者が決定することになる。今後、研究が進めば、特定の疾患や症状に対する適切な投与量や治療期間など、さらなる情報が得られると思われる。しかしながら、それらの研究は日常的なものであり、当業者のレベルの範囲内である。典型的な投与量は、毎週（ヒトにおいて）、より好ましくは毎月、約０．６ｍｇ（０．０１ｍｇ／ｋｇ）～約６０ｇ（１ｇ／ｋｇ）とすることができる。

本発明のペプチド、組成物、及び治療方法は、ヒトの医学及び獣医学の分野で有用であることが理解されよう。したがって、治療する対象は、ヒトなどの哺乳類動物である。獣医学的な目的では、例えば、牛、羊、豚、馬、ヤギなどの家畜、犬や猫などのコンパニオン動物、外来動物や動物園動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどの実験動物が対象となる。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）は、錠剤、カプセル、溶液、又はエマルションなどの医薬的又は獣医学的な組成物として、それを必要とする対象動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物に投与することができる。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）と融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）は、他の成分を含む組成物中に存在することができる。本発明に適した組成物の非限定的な例は、医薬組成物、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、多粒子（顆粒、ビーズ、ペレット、及びマイクロカプセル化粒子を含む）、粉末、エリキシル、シロップ、懸濁液、及び溶液の形態である。
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される希釈剤又は担体を含むであろう。医薬組成物は、好ましくは、非経口的（例えば、経口）投与に適合される。経口投与可能な組成物は、固体又は液体の形態であってよく、特に、錠剤、粉末、懸濁液、及びシロップの形態をとることができる。任意に、組成物は１つ以上の香料及び／又は着色剤を含む。一般に、治療用組成物及び栄養組成物は、対象への薬剤の作用を著しく阻害しない任意の物質を含んでいてもよい。

このような組成物に使用するのに適した薬学的に許容される賦形剤又は担体は、薬学の技術分野においてよく知られている。本発明の組成物は、０．０１～９９重量％の薬剤を含有することができる。本発明の組成物は、一般に、単位投与形態で調製される。これらの組成物の調製に使用される賦形剤は、当技術分野でよく知られている。

組成物のための製品形態のさらなる例は、ゼラチン、デンプン、及び変性デンプンと、グルコース、スクロース、ラクトース、及びフルクトースなどのデンプン誘導体とからなる群から選択されるカプセル化材料を含むソフトジェル又はハードカプセルの形態などの、食品サプリメントである。カプセル化材料は、任意に、架橋剤又は重合剤、安定剤、酸化防止剤、感光性フィルを保護するための光吸収剤、防腐剤などを含んでもよい。

一般に、担体という用語は、本願を通じて、薬剤が混合され得る組成物、それが医薬担体、食品、栄養補助食品、又は食事補助食品であることを表すために使用され得る。上記の材料は、本発明の目的のために、薬剤の担体とみなすことができる。本発明の特定の実施形態において、担体は、特にＲＥＳＴに対する生物学的活性をほとんど乃至は全く有さない。

これ以上の説明は省くが、当業者であれば、先の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を製造及び利用し、請求項に記載の方法を実施できることを信じられる。以下、実施例を挙げて本発明を説明する。本発明は、実施例に記載された特定の条件又は詳細に限定されるものではないことを理解されたい。

［実施例１－Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１プラスミドの構築］
コドン最適化（ＩＤＴコドン最適化ツール使用）したＣＴＤＳＰ１遺伝子を、ｐＢＡＤ－ＨｉｓＡプラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。まず、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限部位を導入したプライマーＰ３３とＰ３４（テーブル１）を用いて、ｐＢＡＤ－ＨｉｓＡプラスミドを増幅した。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を最初に９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で６分間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片を、ＱＩＡＧＥＮのゲルバンド精製キットでゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された断片はすべてＱＩＡＧＥＮのキットで精製し、製造者の推奨にしたがって、Ｔ４・ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使って適切な組み合わせでライゲーション（連結）した。

ライゲーションされた断片は、製造者のプロトコールに従って、１０Ｇ化学的コンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で形質転換された。形質転換した細胞を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で一晩培養した。コロニーを、コロニーＰＣＲによりインサートの存在を検査した。コロニーを摘出し、２０μｌの滅菌済み０．９％塩化ナトリウム溶液に再懸濁した。この溶液１μｌをＰＣＲチューブに移し、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ＃Ｍ０４８２Ｓ）と３０ｐＭのフランキングプライマーとを用いて増幅させた。各ＰＣＲ反応液（２０μＬ）は、最初に９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物は、アガロース電気泳動で可視化した。正しいインサートをもつクローンを、適切な抗生物質を含む５ｍＬのＬＢを含む培養管に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、モナーク・プラスミド・ミニプレップキット（ＮＥＢ）を用いてコンストラクトを精製した。

［実施例２－Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１の発現と精製方法］
Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６２）。ｐＢＡＤ－ＣＴＤＳＰ１コンストラクトを有する大腸菌（１０Ｇ株、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を３７℃で一晩激しく振とうしながら培養した。その後、１Ｌフラスコに入れた５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍＬに夜間培養液４ｍＬを加え、３７℃で振とう培養を行った。培養のＯＤ６００が０．４になったところで、アラビノースを最終濃度０．０２％まで添加し、３０℃で１６時間振とう培養を行った。翌朝、細胞を最高速度でスピンダウン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８１０Ｒ）し、－８０℃で凍結した。必要に応じて、細胞ペレットをフリーザーから取り出し、室温で培養し、４ｍＬのＢＰＥＲタンパク質溶解試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）で溶解し、ＨｉｓＰｕｒＣｏｂａｌｔ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃａｔ＃９００９１）で製造者に記載の方法でタンパク質を精製した。

［実施例３－ＣＴＤＳＰ１に高親和性を有するペプチドの開発］
ペプチド候補は、ＲＮＡディスプレイとタンパク質進化法を用いて作製した。

［ＲＮＡディスプレイライブラリーの構築］ＲＰＰバリアントから３種類のライブラリーを構築した。全てのライブラリーにおいて、セリン８６１と８６４はグルタミン酸に置換されている。プライマーＰ１１～Ｐ１４（テーブル１）を用いてライブラリー１を構築した。ライブラリー１では、ＲＥＳＴペプチドの各位置を変異させた。１×１０^９のバリアントを有すると推定された。ライブラリー２（プライマーＰ１４～Ｐ１８、テーブル１）では、グルタミン酸は縮重オリゴに触れなかった。このライブラリーには６５×１０^６のバリアントがあると推定された。ライブラリー３では、グルタミン酸の１つと２つ目毎のコドンのみに変異があった。このライブラリーは６５０００のバリアントしか生成しないと推定された。

３つのライブラリーとも、ＲＰＰ配列（配列番号１）は、合成の縮重オリゴによって多様化された。１つのコドンにつき、１つだけ退化した塩基が導入され、１番目か２番目の位置で、４つのアミノ酸が選択できるようになった。ＲＥＳＴカセットは、ｐＢＡＤコンストラクトから２つのフラグメント（左と右）として増幅され、ライゲーションによって再合体された（図２７）。左の断片は、フランキングフォワードプライマーＰ２３（テーブル１）とリバースプライマーの１つ（１１Ｒ～２２Ｒ、テーブル１）で増幅した。

右の断片は、フォワードプライマー（１１Ｆ～２２Ｆ、テーブル１）のいずれかとリバースプライマーＰ２４（テーブル１）で増幅した。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で４０秒間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットでゲル精製し、混合してＴ４・ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。ライゲーション反応液には、２０μｌの１０×ライゲーションバッファー、１００ｎｇのフラグメントミックス、０．５μｌの１００ｍＭＡＴＰ、１μｌのＴ４・ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２０２Ｓ）、及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが含まれていた。この反応混合物を室温で培養し、上記のプログラムを用いて、フランキングプライマーＰ１７とＰ２０（テーブル１）を鋳型として用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットでゲル精製し、ｍＲＮＡディスプレイ実験の鋳型として使用した。

品質管理のため、このライブラリーの一部をクローニングし、配列決定した。このライブラリーのアリコートをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ＱＩＡＧＥＮキットで精製した後、上記のＣＴＤＳＰ１遺伝子と同様にｐＢＡＤベクターにクローニングした。個々のクローンはＧｅｎｅＷｉｚで配列決定し、ＲＥＳＴカセットが正常に変異していること、大部分のクローンがフレームシフト変異なしにライゲーションされたことを確認した。

［イン・ビトロ転写］ＲｉｂｏＭＡＸＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍＴ７（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｐ１３００）を用いて増幅したライブラリーから、製造者のプロトコルに従ってＲＮＡを翻訳し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃７４１０４）で精製した。

［ｍＲＮＡとＤＮＡリンカーのピューロマイシンによるライゲーション］ＸＬ－ＰＳＯオリゴヌクレオチドは、ＩＤＴ社により合成された。オリゴヌクレオチドの配列は、次の通りである。５’－ＰｓｏＣ６－（ｕａｇｃｃｇｇｕｇ）_{２’－ＯＭｃ}－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－Ｓｐａｃｅｒ９－Ｓｐａｓｅｒ９－ＡＣＣ－Ｐｕｒｏ－３’（配列番号３３０）。
このオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡにライゲーションさせるために、ＰＣＲチューブで以下の試薬を混合した。２９．５μｌのＲＮＡｓｅフリー水、１μｌの１ＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、５μｌの１ＭＫＣｌ、２μｌの２５ｍＭスペルミジン、０．５μｌの１２５ｍＭＥＤＴＡ、前ステップからの８μｌのｍＲＮＡ、４μｌの１００ｍＭのＸＬ－ＰＳＯオリゴヌクレオチド。
ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置にセットし、７０℃で５分間加熱した後、０．１℃／秒の速度で２５℃まで冷却した。その後、氷上で９６ウェルプレートに移し、３６５ｎｍのハンディＵＶランプを載せて２０分間照射した。その後、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃７４１０４）により架橋ＲＮＡを精製した。

［イン・ビトロ翻訳］翻訳には、ＰＵＲＥｅｘｐｒｅｓｓイン・ビトロタンパク質合成キット（ＮＥＢ，Ｃａｔ＃Ｅ６８００Ｓ）を使用した。１．５ｍｌチューブに以下の試薬を混合した。Ａ液２０μｌ、Ｂ液１５μｌ、ＲＮＡｓｉｎＰｌｕｓ０．５ μｌ、水４．５μｌ、クロスラインＲＮＡ（１μｇ／μｌ）１０μｌ。この混合物を３７℃で２時間培養した。

［Ｈｉｓ－ｔａｇをもつペプチドの精製］Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃３６１１１）を用いてＲＮＡ－ペプチド複合体を精製した。１００μｌのビーズを３００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、磁気スタンド上で分離し、３００μｌの洗浄バッファーに懸濁させた。前ステップからのＲＮＡ－ペプチド複合体２５μｌを洗浄したビーズに加え、エンドオーバーエンドシェーカーで３０分間、室温で培養した。ビーズを洗浄バッファーで３回洗浄した後、磁気スタンドで分離し、５０μｌの溶出液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で溶出させた。

［オリゴｄ（Ｔ）_２５（配列番号３３１）磁気ビーズによる精製］オリゴｄ（Ｔ）_２５（配列番号３３１）磁気ビーズは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｃａｔ＃Ｓ１４１９Ｓ）から購入した。１００μｌのビーズ懸濁液を、５００μｌの洗浄バッファーＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、バッファー中で過ごさせて磁気スタンドで分離させ、次に５０μｌの洗浄バッファーＩで懸濁させた。前ステップからのＲＮＡ－ペプチド複合体５０μｌを、５０μｌの結合バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ）と混合し、６５℃で２分間加熱後、氷上に１分間置き、洗浄したビーズと混合した。この混合物を室温で５分間培養した後、５００μｌの洗浄バッファーＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、そして５００μｌの洗浄バッファーＩＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄した。

［ペプチドの環化］オリゴｄ（Ｔ）_２５（配列番号３３１）磁気ビーズに結合したＲＮＡ－ペプチド複合体を、環化バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．００ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのα，α”－ジブロモ－ｍ－キシレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３３％のアセトニトリル）中で３０分間定期的に振とうしながら培養した。インキュベーション後、ビーズを洗浄バッファーＩＩＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２－メルカプトエタノール）で洗浄し、次に洗浄バッファーＩＶ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．３ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴＣＥＰ）で洗浄した。その後、洗浄バッファーＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）及び洗浄バッファーＩＩ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。３０μｌの溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８）を加え、６５℃で２分間培養した後、磁気ビーズスタンドですぐに分離し、精製物をビーズから溶出させた。

［アフィニティーセレクション］アフィニティーセレクション（親和性選択）はＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１（Ｔａｂｌｅ２；配列番号１６３）を１００μｌのＰＢＳに溶解し、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに移し、オービタルシェーカーで室温で２時間培養した。プレートウェルをＰＢＳで２回洗浄し、カゼイン（ＰＢＳＣバッファー又は１％カゼイン入りＰＢＳ）で室温で１時間振とうしながらブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。ネガティブセレクションウェルは、３００μｌのＰＢＳＣ溶液と培養してカゼインのみをコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。精製したＲＮＡ－ペプチド複合体を、まず１００μｌのＰＢＳを含むこれらのネガティブセレクションウェルに加え、室温で２０分間振とうしながら培養した。次に、この溶液を１２５μｌのＰＢＳＣを含むポジティブセレクションウェル（Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１でカバー）に移し、室温で１時間振とうしながら培養した。精製したＨｉｓ－ＣＴＤＳＰ１を各ウェルに２５μｌ添加し、３分間培養することでオフターゲットセレクションを行った。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ｃＤＮＡ合成に使用した。

［ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ］ｃＤＮＡの合成には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ－ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃１８０８０－０５１）を使用した。まず、１６μｌの水に２μｌの５０ｍＭプライマーＰ１９（テーブル１）と１μｌのｄＮＴＰ溶液を混ぜ、この混合物をＭａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに添加した。次に、このプレートを６５℃で５分間培養した後、４℃で１分間冷却した。次に、プレートから２０μｌの混合物をＰＣＲチューブに移し、４μｌの１０ｘバッファー、８μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ２、４μｌの０．１ＭＤＴＴ、２μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ、及び２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素を含む反応混合物を２０μｌ加えた。この混合物を５０℃で５０分間培養した後、２μｌのＲＮＡｓｅＨを加え、３７℃で２０分間培養した。

セレクションに生き残った強い結合体に対応するＤＮＡをプライマーＰ１７とＰ２０で増幅した（テーブル１）。増幅はＶｅｎｔ・ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃３０秒間伸長を２０又は２５サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をアガロースゲル上で走らせ、ＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットで製造者のプロトコルにしたがって精製した。

［ＮＧＳデータの解析］各サイクルのＰＣＲ反応物を次世代シーケンス解析に供した。Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺサービスＧｅｎｅＷｉｚを使用した。ユニークな配列を定量化し、最も豊富な配列をさらなる試験のために選択した（テーブル３及び３ａ）。

［実施例４－ペプチド－ＧＳＴ融合体の構築及びその発現］
第一段階として、ＧＳＴタンパク質をｐＥＴ２９ベクターにクローニングした。ＧＳＴはコドン最適化され、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ部位で挟まれ、ＩＤＴで合成された。プライマーＰ１０９及びＰ１０８を用いてＰｈｕｓｉｏｎ・ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ，ｃａｔ＃Ｍ０５３０Ｓ）により増幅した（テーブル１）。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮ社のゲルバンド精製キットで製造者のプロトコルにしたがってゲル精製した。

ｐＥＴ２９プラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限部位を導入したプライマーＰ１２及びＰ１４（テーブル１）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で６分間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットでゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で消化した。全ての消化断片をＱＵＩＡＧＥＮキットで精製し、製造者の推奨に従ってＴ４・ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使って適切な組み合わせでライゲーションさせた。ライゲーションした断片を１０Ｇ化学コンピテントで形質転換し、上記のように配列を決定した。ＧＳＴ－ＲＰＰの発現コンストラクトをテーブル４（配列番号１６４）に示す。

選択された配列をテーブル５に示すプライマーを用いてＰＣＲで再作製し、ＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットでゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ＧＳＴタグとインフレームで上述のｐＥＴベクターにクローニングした。ライゲーションされた断片は、製造者のプロトコールに従って、１０Ｇ化学的コンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で形質転換された。形質転換した細胞を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートにプレーティングし、３７℃で一晩培養した。翌朝、コロニーは、コロニーＰＣＲによって挿入物の存在を検査された。コロニーは摘出され、２０μｌの滅菌された０．９％塩化ナトリウム溶液に再懸濁された。この溶液１μｌをＰＣＲチューブに移し、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ＃Ｍ０４８２Ｓ）と３０ｐモルのフランキングプライマーで増幅した各ＰＣＲ反応液（２０μＬ）は、最初に９５℃で２．５分加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅産物はアガロース電気泳動で可視化した。２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む培養チューブに正しい挿入物をもつクローンを接種し、３７℃で一晩培養した。翌朝、モナーク・プラスミド・ミニプレップキット（ＮＥＢ）を用いてコンストラクトを精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に上記のようにコンストラクトを形質転換した

［ペプチドＧＳＴ融合体の精製］選択したコンストラクトをもつ大腸菌（ＢＬ２１株）を３７℃で一晩、激しく振とうしながら培養した。翌朝、１Ｌフラスコに入れた２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地１００ｍｌに夜間培養物１ｍｌを加え、３７℃で振とう培養した。培養液のＯＤ６００が０．４になった時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、３０℃で１６時間振とう培養を行った。翌朝、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５８１０Ｒで細胞を最高速度でスピンダウンし、－８０℃で凍結した。必要に応じて、細胞ペレットをフリーザーから取り出し、室温で培養し、３ｍｌのＢＰＥＲタンパク質溶解試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）で溶解させた。ペプチド－ＧＳＴ融合体は、グルタチオンアガロース（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１６１００）を用いて、製造者の記載に従って精製した。

［実施例５－ＲＰＰ及びＲＰＰバリアントによるＣＴＤＳＰ１ホスファターゼ活性の阻害］
［結果：］図２５－ＲＮＡディスプレイ／タンパク質進化スクリーニングで同定された最も豊富なＲＰＰバリアント上位５１種を、豊富なペプチドが多い順（Ｖ１）から少ない順（Ｖ５１）にテーブル３に示す。これらのペプチドの作製に使用したプライマーをテーブル５に示す。ホスファターゼ活性スクリーニング（テーブル６、図２５）を用いて、上位５１のＲＰＰｖが内因性リン酸化ＲＥＳＴペプチド（ＴＥＤｐＳＰＰｐＰＬＰＫＥＮ（配列番号３２９））上のアミノ酸８６１及び８６４においてＣＴＤＳＰ１ホスファターゼ活性を阻害する能力を評価した。

リン酸化ＲＥＳＴペプチド（ＴＥＤｐＳＰＰｐＰＬＰＫＥＮ（配列番号３２９））はＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社で合成したものである。ホスファターゼ反応は、１０ｍＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｎＭのＣＴＤＳＰ１、０．５μＭのリン酸センサ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）、５０μＭのＲＥＳＴペプチド及び種々の濃度のペプチド－ＧＳＴ融合体により、室温で１０分間行った。全てのアッセイは、水で１０回リンスした９６ウェルペート（ＣｏｒｎｉｎｇＰ／Ｎ３６８６）で実施した。蛍光はＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸで励起波長４２０／２７ｎｍ、発光波長４８５／２０ｎｍのキネティックリードを用いて測定した。

スクリーニングの結果、ＲＰＰ（Ｖ１）は、１μＭでコントロール（ＧＳＴ）に対して約６０％ホスファターゼ活性を阻害した（テーブル６、図２５）。いくつかのバリアントは、ＲＰＰよりも優れたホスファターゼ活性を阻害した（テーブル６、図２５）。最も強力な阻害剤はｖ３３であり１００％阻害し、ｖ３５は約９０％ホスファターゼ活性を阻害した（テーブル６、図２５）。

図２６、テーブル１３－ＲＰＰ配列番号１２は、約２０ｎＭのＥＣ５０でＣＴＤＳＰ１活性を阻害したが、他のいくつかのホスファターゼの活性には影響を与えなかった。

［アッセイ］ＲＰＰ配列番号１２が、内因性リン酸化ＲＥＳＴペプチド（ＴＥＤｐＳＰＰｐＰＬＰＫＥＮ（配列番号３２９））上のアミノ酸８６１及び８６４でＣＴＤＳＰ１活性を阻害する能力を、上記図２６について記載したように、評価した。

［実施例６－Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）及びＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥＨｅａｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＲＰＰの結合親和性］
Ｈｉｓ－ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６２）及びＧＳＴ－ＲＰＰ（テーブル４；配列番号１６４）の発現構築物を、実施例２に記載のように構築し、精製した。ＣＴＤＳＰ１上のＨｉｓタグ（４０ｎＭ）をＲＥＤ－ｔｒｉｓＮＴＡ色素（２０ｎＭ）で、色素とＣＴＤＳＰ１の比率を３：１として標識し、未結合の色素を重力流サイズ排除で除去した。線状ＧＳＴ－ＲＰＰ（テーブル４；配列番号１６５）のＨｉｓ－ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６３）への結合親和性は、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を用いて、製造者の推奨にしたがって決定した。結合アッセイの結果を図２に示す。ＲＰＰ（テーブル４；配列番号１６５）は、低ｐＭから０．５μＭまでの範囲のいくつかの濃度でＨｉｓ－ＣＴＤＳＰ１への結合を評価された。線状ＲＰＰのＣＴＤＳＰ１への結合に相当するＫ_Ｄは１３０ｐＭと算出された。

線状ＧＳＴ－ＲＰＰ（テーブル４；配列番号１６５）とＨｉｓ－ＣＴＤＳＰ１（テーブル２；配列番号１６３）の結合親和性は、ＧＥＨｅａｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社のＢｉａｃｏｒｅを使用して測定した。２０μＬ（５μｇ／ｍＬ）のＨｉｓタグＣＴＤＳＰ１を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で、Ｂｉａｃｏｒｅ社推奨プロトコルにしたがいアミンカップリングを用いてＣＭ５チップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）上に固定化した（ｃａｔ＃ＢＲ－１０００－５０，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）。この精製により、ＣＭ５チップに結合した約１３００ＲＵのタンパク質が得られた。その後、ＣＭ５チップをＨＢＳ－ＥＰバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、分析対象物１２０μＬを注入した。ＧＳＴ－ＲＰＰ又はＧＳＴ単独（ネガティブコントロール）を５００ｎＭの濃度でＨＢＳ－ＥＰバッファー（ｐＨ７．４）中に３０μＬ／分の流速で注入した。会合時間は２分、解離時間は３分である。最後に、結合したタンパク質を、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５（ＢＲ－１００３－５４、ＧＥＨｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅ）で５０μＬ／分の流速で２５秒間洗浄した。線状ＲＰＰのＣＴＤＳＰ１への結合は、以下の結果となった。Ｋ_Ｄ＝１．７ｐＭ（図３Ｂ、ネガティブコントロールは図３Ａに示す）。

［実施例７－細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）及び／又はエンドソーム脱出を促進するペプチドと融合したＲＰＰ及びＲＰＰｖ］
細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）及び／又はエンドソーム脱出を促進するペプチドを付加した幾つかのＲＰＰ及びＲＰＰｖを合成した。使用したＣＰＰとリンカーのリストをテーブル７に示す。

［実施例８－ＲＰＰは間葉系前駆細胞及び坐骨神経に内在化される］
［間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）］
［結果］ＲＰＰ（配列番号４）と共に４時間培養した後、６日間培養すると、ＲＰＰは間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）に内在したままとなり（図４、Ｃ及びＤ）、６日間の培養期間中に核に局在するようになった（図４、Ｅ及びＦ）。

［材料と方法］
［投与と細胞培養］ＭＰＣを上述^１１６の通り培養し、２４ウェルプレートのガラスカバースリップ上に１．０×１０^４細胞／ｃｍ^２でプレーティングし、３７℃で一晩培養し、１００ｎＭのＲＰＰ（配列番号４）を４時間投与し、その後、培地を変更した。細胞は２日おきに培地を交換しながら６日間培養した。細胞内のＲＰＰ局在を評価するため、２４時間及び７２時間にＭＰＣの中間採取を行った。

［免疫組織化学］細胞骨格の染色にはファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、核の可視化にはヘキスト３３３４２９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）色素を、ＲＰＰの可視化にはＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。画像は共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影した。

［坐骨神経］
［結果］線形ＲＰＰは坐骨神経組織の核に集積する（図５、Ａ、Ｂ）。
［材料と方法］
［投与方法と手順］図５：ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの坐骨神経（Ｌ３及びＬ４領域）を露出し（Ｓｃｈｍｉｔｚ及びＢｅｅｒ、２００１）^１１７、そして０．７ｃｍのセクションを除去して、神経の切り株の後退後に約１ｃｍのセグメント欠陥を形成した（Ｈｅｍｓ及びＧｌａｓｂｙ、１９９３）^１１８、ＰＢＳ中のＲＰＰ（配列番号４）１ｍｇを損傷部位に注入し、外科切開部を閉鎖した。４８時間後、動物を犠牲にし、Ｌ４からＬ６領域の脊髄を冠状に切開した。

［投与レベルの合理性。実現可能な最大量］
［テストアーティクル識別］ＲＰＰ（配列番号４)
純度：９５％以上

［免疫組織化学］核の可視化にはヘキスト３３３４２９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）色素を、ＲＰＰの可視化にはＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。画像は光学顕微鏡で撮影した。

［実施例９－ＲＰＰによるＲＥＳＴタンパク質の分解］
［結果］ＲＰＰ（配列番号４）は、ビヒクルコントロールと比較して、ＲＥＳＴタンパク質レベルを５８％減少させた（図６）。
［材料と方法］
［テストアーティクル識別］ＲＰＰ（配列番号４)
純度：９５％以上

［投与と細胞培養］ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ血清添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で培養した。１００ｎＭの完全長ヒトＲＥＳＴタンパク質^２を含むＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションは、３５ｍｍディッシュの８０～９０％コンフルエント培養で、リポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の推奨にしたがって実施した。トランスフェクション後２４時間、細胞に１００ｎＭのＲＰＰ（配列番号４）又はビヒクルコントロール（ＰＢＳ）を一晩投与した。

［ウェスタンブロット解析］全細胞ライセートは、Ｂａｌｌａｓら２００１^１１９の手順にしたがって調製した。ウェスタンブロットは、赤外色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に結合した抗ＲＥＳＴ－Ｃ^６４、抗ＧＡＰＤＨ（ａｂｃａｍ［６Ｃ５］）、及び抗ＩｇＧを用いて標準手順で行い、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外蛍光イメージャ（ＬｉＣｏｒ）で分析した。棒グラフは、ＩｍａｇｅＪ（https://imagej.nih.gov/ij）を用いたウェスタンブロットの定量化である。

［実施例１０－ＲＰＰは、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、ＯＰＲＭ１のｍＲＮＲの発現誘導に使用でき、神経毒性はない］
［結果］ＲＰＰは、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、ＯＰＲＭ１のｍＲＮＲの発現を増加させる（図７、図８、図９、図１０、図１４、図１５、図１６、テーブル１５）。ＲＰＰ（配列番号１２）は、様々な濃度のＲＰＰと４８時間培養したＤＲＧ神経細胞のＬＤＨ細胞毒性アッセイによって示されるように、ＤＲＧ神経細胞に壊死を引き起こさない（図１７）。＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎ＝４、一元配置分散分析及びダネットの検定、エラーバー＝ＳＤ

［図７：材料と方法］
［テストアーティクル識別］ＲＰＰ（配列番号４) 純度：９５％以上
［投与と細胞培養］１００ｎＭのＲＰＰ、ＨＥＫ２９３細胞

［ｍＲＮＡ抽出及び定量化プロトコル］細胞をＱＩＡｓｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ）で溶解し、ＲＮｅａｓｙミディキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従い、トータルＲＮＡを抽出した。精製したＲＮＡはナノドロップ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦＩｓｈｅｒ）で定量化し、逆転写はハイキャパシティｃＤＮＡリバーストランスクリプションキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と反応当たり２ｎｇ／μＬのＲＮＡを用いて実行した。ｑＲＴ－ＰＣＲでは、５μＬのｃＤＮＡ（ＲＮＡの１０ｎｇに相当）を、１０μＬのＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ）と１μＬの各プライマー（最終プライマー濃度各５００ｎＭ）に混合した。反応はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）７フレックスリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で３回に分けて実行した。増幅データは、比較サイクル閾値（ΔＤＣｔ）法とβ－アクチンをキャリブレーターとして用いて解析した。使用したプライマーは以下の通りである。β-アクチン・フォワード：５’－ＡＧＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣ－３’（配列番号３３２）、β-アクチン・リバース：５’－ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡ－３’（配列番号３３３）、ＢＤＮＦフォワード：５’ＴＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＧ３’（配列番号３３４）、及び、ＢＤＮＦリバース：５’ＧＡＡＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴ３’（配列番号３３５）。

［図８：材料及び方法］
［一過性のトランスフェクション及び細胞培養］ＮＦＢＬ細胞を上述したように増殖させ、ＮＦＢＬ細胞を１２０．０Ｍの３５ｍｍディッシュに播種し、３７℃で一晩培養し、製造者の推奨にしたがって、リポフェクトアミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２μｇのＲＥＳＴ（配列番号１）－ＩＲＥＳ－ＧＦＰｃＤＮＡ^２でトランスフェクションさせた。４８時間の培養後、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により細胞を選別した

［ｍＲＮＡの抽出と定量化］ＧＦＰ＋及び－細胞から、実施例１０に記載したようにｍＲＮＡを抽出した。Ｋ_Ｖ４．３のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ^１１６を用いて測定した。遺伝子発現は、内部ハウスキーピングコントロールとしてβ－アクチン（ＡＣＴＢ）を用いて正規化した。使用したβ－アクチンプライマーは、実施例１０と同じである。Ｋ_Ｖ４．３のプライマーは、フォワード：ＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号３３６）、及び、リバース：ＴＣＡＧＴＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣ（配列番号３３７）であった。

［図９：材料及び方法］
［プラスミド］ＲＰＰ（配列番号２及び４）：Ｔ７プロモーター、ＣＰＰ、Ｈｉｓタグを含むこのコンストラクトの１セグメントは、ＩＤＴによりｇＢｌｏｃｋ（テーブル８）として合成され、テーブル８に記載のプライマーを用いて増幅された。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で３０秒間伸長のサイクルを３０回繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮ社のゲルバンド精製キットで製造者のプロトコルにしたがってゲル精製した。

ｐＥＴ２９プラスミドをプライマーで増幅した：フォワード：ＳｂｆＩとＸｈｏＩ制限部位を導入したＰ１２とＰ１４（テーブル１）。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で６分間伸長を３０サイクル繰り返した。増幅後、ＰＣＲ断片をＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットでゲル精製し、ＳｂｆＩとＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された断片は全てＱＩＡＧＥＮのキットで精製し、製造者の推奨にしたがってＴ４・ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて適切な組み合わせでライゲーションした。ライゲーションされた断片は、１０Ｇ化学的コンピテントセルで形質転換され、配列決定された。

ＲＰＰのヌクレオチド配列（テーブル８）を組み立て、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩの制限酵素で消化した。この断片は、ＣＰＰ及びＨｉｓタグとインフレームで前述のｐＥＴベクターにクローニングされた。

［コントロールペプチド］コントロールペプチド（ＣＰ）をテーブル９に示すｇＢｌｏｃｋ配列に組み込み、ｐＥＴベクターにクローニングした。ＣＰの配列はテーブル９に示す通りである。

［イン・ビトロでの発現］ＲＰＰ（テーブル８）又はＣＰ（テーブル９）は、ピュアエクスプレス・イン・ビトロ・タンパク質合成キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて、イン・ビトロで発現させた。ＲＰＰ（配列番号２及び４）又はＣＰ発現コンストラクト（テーブル８及び９）からテーブル８に示すプライマーでＲＰＰ（配列番号２及び４）又はＣＰ配列を増幅し、ＱＩＡＧＥＮゲルバンド精製キットによりゲル精製を行った。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）を９５℃で２．５分間加熱した後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、及び７２℃で３０秒間伸長のサイクルを３０回繰り返した。次に、精製したＰＣＲ断片１５μＬをピュアエクスプレス・イン・ビトロ・タンパク質合成キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のＳｏｌｕｔｉｏｎＡ１０μＬ及びＳｏｌｕｔｉｏｎＢ７．５μＬと混合し、３７℃で２時間培養した。次に、２μＬのＤＮＡｓｅＩを加え、３７℃で２０分間培養した。

［精製］ＲＰＰ（配列番号２及び４）及びＣＰ：イン・ビトロ発現ステップの最終溶液を１００μＬに希釈し、アミコン・ウルトラセル０．５ｍＬ－１００Ｋカラム（Ｓｉｇｍａ）でろ過してリボソームを除去した。フロースルーを洗浄済みのＮｉ－ＮＴＡ磁気アガローズビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）１００μＬに加え、製造者記載の洗浄バッファーで洗浄した。

［環化］ＲＰＰ（配列番号２）は、２．６５ｍＬの１．３３ｘＰＢＳ（６６．５ｍＭのリン酸緩衝液、４００ｍＭのＮａＣｌ）と１．３２ｍＬのジブロモ－ｍ－キシレン溶液をアセトニトリル（２．５ｍｇ／ｍＬ）中で混合して作った環化溶液５００μＬとビーズを混合して環化した。環化溶液との培養後、ビーズは洗浄バッファーＩ（２５ｍＭのイミダゾール入りＰＢＳ、０．５μＬ／ｍＬのメルカプトエタノール）で１回、洗浄バッファーＩＩ（２５ｍＭのイミダゾール入りＰＢＳ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）で１回、洗浄バッファＩＩＩ（２５ｍＭのイミダゾール入りＰＢＳ）で２回洗浄し、５０μＬの溶出バッファー（５００ｍＭのイミダゾール入りＰＢＳ）で溶出させた。ビオ－ラド・マイクロ・ビオ－スピン・クロマトグラフィカラムを用いてイミダゾールを除去した。

［投与及び細胞培養］６ウェルで培養したＮＢＦＬ細胞（図９）に、１μＭの線状（配列番号２）又は環状（配列番号２）ＲＰＰ（テーブル８）又はコントロールペプチド（テーブル９）を１６時間又は４８時間、投与した。

２名の患者から得た間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）（図１０）を１２ウェルプレートにプレーティングし、一般培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＰＳＦ）中で培養した。凍結乾燥したＲＰＰ（配列番号９）を５ｍＭの濃度で水に溶かし（１ｍｇ／３４．８９，培地で３μＭに希釈）、４８時間細胞とともに培養した。コントロールは水であった。

［ｍＲＮＡの抽出と定量化］投与後、細胞を溶解し、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｋ_Ｖ４．３のｍＲＮＡレベルを評価した（図９）。使用したプライマーは、ＮＧＦを除いてすべて記載されている。フォワード：５’ＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＴ３’（配列番号３３８）、及び、リバース：ＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣ３’（配列番号３３９）。

［図１０：材料及び方法］
ＭＰＣは、Ｇｅｒｖａｓｉら２０２０^７６に記載のように培養した。

［図１４、図１５及び図１６：材料及び方法］
Ｌ５ＤＲＧは雄成体ラットより解剖し、ポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）とラミニンでプレコートした１２ウェルプレートに、最小量の培地（Ｂ２７（ＧＩＢＣＯ）、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びペニシリン・ストラプトマイシンで補足した２５０ｕｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）－Ａ培地（ＧＩＢＣＯ））を入れて培養プレートへの接着が可能になるようにした。プレーティングから１日後、ＤＲＧをＲＰＰ（配列番号１２：培養液中に１μＭ、３μＭ、又は１０μＭ、図１４及び図１６；配列番号１３及び１４：３μＭ、図１５）と４８時間培養した。ＲＮＡ発現解析のために、ＤＲＧをバレット・ブレンダー・ティッシュー・ホモゲナイザー（ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ）を用いて、バレット・ブレンダー・ピンク・ビーズを含む１．５ｍｌチューブ中の３００μｌのＱｉａｚｏｌで溶解した。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミディキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示にしたがって抽出した。精製したＲＮＡはナノドロップ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦＩｓｈｅｒ）で定量化し、逆転写はハイ・キャパシティｃＤＮＡリバーストランスクリプションキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と反応当たり２ｎｇ／ｕｌのＲＮＡを用いて行った。ｑＲＴ－ＰＣＲでは、５ｕｌのｃＤＮＡ（１０ｎｇのＲＮＡに相当）を、１０ｕｌのＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ）と各プライマー（最終プライマー濃度各５００ｎＭ）１ｕｌと混合した。反応はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）７ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で３回に分けて実行した。増幅データは、比較サイクル閾値（ΔΔＣｔ）法とβ－アクチンをキャリブレーターとして用いて解析した。プライマーは、以下の通りであった。β－アクチン：Ｆ－ＡＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣ（配列番号３４０）、Ｒ－ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡ（配列番号３３３）；Ｋ_Ｖ４．３：Ｆ－ＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＴ（配列番号３４１）、Ｒ－ＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴ（配列番号３４２）；Ｋ_Ｖ７．２：Ｆ－ＣＣＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号３４３）、Ｒ－ＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＡＧＡＴ（配列番号３４４）；ＯＰＲＭ１：Ｆ－ＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡ（配列番号３４５）、Ｒ－ＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＧＣＴＡＡ（配列番号３４６）。

［図１７：材料及び方法］
［細胞毒性アッセイ］ＲＰＰ（配列番号１２）の細胞毒性は、ＬＤＨ－Ｇｌ_Ｏ（登録商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者の説明書にしたがって評価した。ＲＰＰ処理又は２％トリトンＸ－１００（壊死を誘導する）で１５分間培養した後、４８時間後に培地を回収した。培地はＬＤＨ保存バッファー（２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、１０％グリセロール、１％ＢＳＡ）で１：５０に希釈された。本アッセイの直線性範囲を確認するために、ＬＤＨ滴定曲線も試験試料と一緒に測定した。５０μｌの希釈培地又はＬＤＨ連続希釈液を５０μｌのＬＤＨ検出試薬（５０μｌのＬＤＨ検出酵素混合物、０．２５μｌの還元酵素基質）と共に４０分間培養した。発光はインフィニットＭ２００プロ（Ｔｅｃａｎ）装置で記録した。

［実施例１１－ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、神経分化誘導に使用することができる］

［アプローチ１］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドがヒト神経発生及び分化促進に最も有効かどうかを判断するために、ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１のｉＰＳ細胞株の神経幹前駆細胞（ＮＳＰＣ）を用いたイン・ビトロのスクリーニングアッセイが用いられるであろう。ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１のｉＰＳ細胞は、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞からエピソームプラスミドのリプログラミングにより作製し^１２１、胚様体（ＥＢ）法により神経幹前駆細胞（ＮＳＰＣ）に分化させた^１２２。ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１のＮＳＰＣは、位置的にナイーブなＮＳＰＣであり、神経細胞へ迅速に分化させることができる^１２３。このため、広範な毒性学及び表現型スクリーニングプラットフォームに理想的である^{１２４－１２６}。

９６ウェルプレートアッセイでハイスループットなスクリーニングを行うために、２つのエンジニアリングされたＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１株を使用する。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが細胞毒性であるか否かを決定するために、ＣＭＶプロモーター制御下にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼを構築して発現するＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１株を使用する。この株では、ＣＭＶ－ナノルシフェラーゼ－ハロタグ（ＣＭＶ－ＮＬＨＴ）コンストラクトが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）によってＣｈｒ．１９ｑのセーフハーバーＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入された（図２０ａ）。ＣＭＶ－ＮＬＨＴ細胞数の迅速な代替指標としてルシフェラーゼ活性を使用する。この方法を用いて、薬剤への長期曝露による毒性を測定するための時間経過データを収集する。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ルシフェラーゼシグナルの１０％以上の損失をもたらす毒性レベルを示した場合、ＣｅｌｌＴｏｘ（登録商標）グリーン細胞毒性アッセイを用いて確認することになる。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドのプロニューラル分化促進効果を評価するために、第２の工学的ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１株を使用することにする。この株では、ナノルシフェラーゼ－ハロタグ（ＮＬＨＴ）をＺＦＮ（ジンク・フィンガー・ヌクレアーゼ）を用いてＭＡＰ２転写開始点（ＴＳＳ）（Ｃｈｒ．２）にノックインしている（図２０ｂ）。ＭＡＰ２の発現は、ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１培養における神経分化に伴って増加し^１２７、このことはＭＡＰ２－ＮＨＬＴ培養液におけるルシフェラーゼ活性の増加によって再現された（図２０ｃ）。培地中のルシフェラーゼ活性をＭＡＰ２－ＮＬＨＴ神経分化の代替指標として用い、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）の分化作用をリアルタイムに追跡するための時間経過データを収集する。
この方法により、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処理した培養物の神経分化速度を迅速に比較することが可能になる。ポジティブな神経分化作用は、２つの細胞運命マーカー遺伝子のコホートをｑＲＴ－ＰＣＲ発現スクリーニングによって独立して検証される^１２１。それらは、ＬＩＮ２８Ａ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＩＦＩＴＭ２、ＩＧＦＢＰ３、ＡＮＸＡ１のＮＳＰＣ及び多能性マーカー遺伝子のコホート；及びＣ１ＯＲＦ６１、ＩＧＬＯＮ５、ＩＧＳＦ１１、ＣＨＬ１、ＳＯＸ９の神経マーカー遺伝子のコホートである。
ルシフェラーゼ活性とｑＲＴ－ＰＣＲの値は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で報告される。神経細胞分化速度に対する統計的に有意な薬剤効果は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定される。

［予想される結果と代替策］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドをヒトＮＳＰＣに投与することによって、ビヒクルコントロールと比較して、ＭＡＰ２ルシフェラーゼ活性の増加、ＮＳＰＣ／多能性マーカーの発現低下、及び神経細胞マーカーの発現増加により測定した神経細胞分化が促進されることを予測する。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの効果により時間プロファイルＮＣＲＭ－１／ＸＣＬｓマーカー発現がシフトする場合、代替時点でのデータ収集が必要となる場合がある。ルシフェラーゼスクリーンが、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの分化促進効果を評価する感度に欠ける場合、ｑＲＴ－ＰＣＲデータを使用して神経分化を評価することが可能である。

［材料及び方法］
［プラスミド］ＣＭＶ－ナノルシフェラーゼ－ハロタグ（ＣＭＶ－ＮＬＨＴ）はＰｒｏｍａｇａ社から市販されている。

［細胞株及び細胞培養］ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１のｉＰＳ細胞は、ＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞からエピソームプラスミドの初期化により作製し^１２１、上述の通り、胚様体（ＥＢ）法により神経幹前駆細胞（ＮＳＰＣ）に分化させ^１２２、神経細胞^１２３に分化させた。ＣＭＶ－ナノルシフェラーゼ－ハロタグ（ＣＭＶ－ＮＬＨＴ）コンストラクトを転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）によってＣｈｒ．１９ｑのセーフハーバーＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入する方法（ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１細胞株）は、以前にＰａｐａｐｅｔｒｏｕら、２０１６^１２８に記載された。ナノルシフェラーゼ－ハロタグ（ＮＬＨＴ）をジンク・フィンガー・ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いてＭＡＰ２の転写開始点（ＴＳＳ）（ＮＣＲＭ－１／ＸＣＬ－１細胞株のＣｈｒ．２、）にノックインする方法は既に記述した^１２７。

［ルシフェラーゼアッセイ］ＣＭＶ－ＮＬＨＴ細胞数及び神経分化（ＭＡＰ２－ＮＬＨＴ）の測定方法は、Ｆｒｉｔｚら、２０１７^１２７及びＨｅら、２０１１^１２９に既に記述されている。

［ｑＲＴ－ＰＣＲスクリーン］細胞運命マーカー遺伝子をスクリーニングするためのｑＲＴ－ＰＣＲ法は、Ｃｈｏｕら，２０１１^１２１にて既に記述されている。

［アプローチ２］以下の「ニューロン・トゥ・ブランク」プロトコルを用いて、ＲＰＰ投与７日後の人工多能性幹細胞（神経幹細胞（ＮＳＣ）－ＮＬ５）（図１１（配列番号５～１１、３μＭ）；図１２（配列番号９、１μＭ，）；図１３（配列番号１３（図２７）、１μＭ））を分化させた。
１．２４ウェル培養プレート（ＢｌａｃｋＶｉｓｉｐｌａｔｅ）にマトリゲルを塗布した（１２ｍＬ／ウェル、３７℃、３０分間）。
２．ＮＳＣｓ－ＮＬＳ（下記培地参照）は、１ウェルあたり０．５×１０^５でプレーティングした。

３．２４時間後（細胞は７０％以上コンフルエントであること）、培地を神経分化培地（下記）に変更し、様々な濃度の試験ペプチド又は水コントロールを加えた（図１１、１２、１３、テーブル１４）。新しい試験ペプチドとコントロールが添加された神経細胞分化培地は、２日毎に交換し、５日間続けた。

４．７日目に、細胞を１ｘＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した。
５．細胞をマウス抗ＴＵＪ１（１：１０００）及びウサギ抗Ｍａｐ２（１：５００）で一晩免疫標識した。その後、２ｎｄ抗体（抗マウス４８８、抗ウサギ５６８、ＤＡＰｉ）で１時間標識した。
６．データ収集はＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで行った
ａ．ＤＡＰＩ：励起３６０／４０；放出４６０／２０、ゲイン３５
ｂ．Ａｌｅｘａ４８８：励起４８５／２０；発光５２８／２０、ゲイン５０
ｃ．Ａｌｅｘａ５６８：励起５６０／２０；発光６２０／１０、ゲイン７５

［結果］図１１において、３μＭのＲＰＰ（配列番号５～１１）は、ＤＡＰＩ（核）で正規化したＭＡＰ２（成熟神経細胞マーカー）発現により測定すると、コントロールと比較して、７日後にＮＳＣ－ＮＬ５の分化を（１．７～２．７倍）増加させた。
図１２において、１μＭのＲＰＰ（配列番号９）は、ＴＵＪ１及びＭＡＰ２神経細胞マーカー（ＤＡＰＩ（核）に正規化）により測定すると、コントロールと比較して、７日後にＮＳＣ－ＮＬ５分化を約３５％増加させた。
図１３において、０．１及び１μＭのＲＰＰ（配列番号１３）は、ＴＵＪ１（それぞれ６０％及び３倍増加）及びＭＡＰ２（それぞれ２７％及び２倍増加）神経細胞マーカー（ＤＡＰＩ（核）に対して正規化し対照と比較）で測定すると、コントロールと比較して、７日後にＮＳＣ－ＮＬ５分化を増加させた。
このスクリーンを用いる根拠は、神経前駆細胞でＲＥＳＴを除去すると、神経細胞の分化が誘導されることが示されており^２２、神経細胞遺伝子のアンサンブルデプレッションが読み取れるからである。

［実施例１２－ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、外傷性脳損傷後の運動および認知機能の改善に使用することができる］

［アプローチ］ＴＢＩのラットモデルにおいて、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処理することで、神経細胞の生存と神経新生の量に変化があるか否かを判断する。これらの指標を病理組織学的及び機能回復の結果と相関させ、ＴＢＩ後のＲＥＳＴペプチドの有効性を明らかにする。損傷後にＲＥＳＴｍＲＮＡが病変部の周囲で増加することが示された（図１９）。我々は、制御された皮質衝撃損傷（ＣＣＩ）のよく特徴づけられたラットモデルを使用する^{６，１３０－１３４}。

雄雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（約２５０～３００ｇ雄、１５０～２００ｇ雌）を右頭頂皮質上に片側ずつＣＣＩで損傷する（直径５ｍｍ、速度４ｍ／ｓ、深さ２ｍｍ）。シャム動物には、影響を与えずに同じ処置を行う。
ＣＣＩの６時間後、ラットは、コントロール又は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを脳室内カテーテル（ＩＣＶ）で送達するために浸透圧ミニポンプに取り付けられるカニューラを右心室に移植する（０．１７μｇ／時間）。
６時間は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの効果を決定するためにトランスレーショナルな関係性のある現実的な初期治療ウィンドウであり、犠牲まで注入される。
第１コホートは３ｄｐｉで神経細胞死と増殖に対する、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの急性効果を調べ、第２コホートは３０ｄｐｉで機能・形態回復と神経新生に対する、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの効果を調べるため、２つの異なる時点でラットを犠牲にする。
各コホートについて、３（コントロールペプチド、２用量のＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド×２（シャム、ＣＣＩ）×２（雄／雌））デザインの１２群が用意される。
雄ラットと雌ラットは、傷害、行動、又は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドに対する反応における性特異的差異を識別できるよう異なる日に実行されるであろう。
ラットは最初の週に毎日ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射され、増殖と成熟細胞の運命を決定する（第１コホート：１～３ｄｐｉに毎日注射、最終注射の２時間後に犠牲、第２コホート：１～７ｄｐｉに毎日注射）。
これまでの経験から、重要な行動データ（第２コホート）には１６匹／群、免疫組織化学（第１コホート）には８匹／群のラットが必要であることが示唆される。

第２コホートでは、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドによる治療が、コントロール群と比較して機能的にどうなるかを調べるため、重金属損傷後又はシャム損傷後の異なる時点での運動と認知行動を調べる。
受傷前にラットを訓練し、ビームウォーク、ロータロッド、オープンフィールド試験における運動機能のベースライン測定値を得る。ラットは、受傷後１、３、７、１０日目にビームウォークとロータロッドの両方で運動機能の回復を確認する。オープンフィールド試験は、４日目、１２日目、２２日目のｄｐｉに実施される。認識記憶は、２０ｄｐｉで行う新奇物体認識試験で評価する。データは、反復測定二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットのポストホック補正により解析する。
空間記憶と学習は２５ｄｐｉからＭｏｒｒｉｓ水迷路（ＭＷＭ）アッセイによって決定される。すべての試行で、泳ぐ速度と隠れたプラットフォームを見つけるまでの待ち時間が記録される。訓練５日目に行われるプローブ試行では、以前は隠しプラットフォームがあった場所にラットが滞在する時間を測定する。また、動物間の視力差が少ないことを確認するために、各ラットに対して可視プラットフォームテストも実施する。
テューキー多重比較補正を用いた二元配置分散分析により、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、コントロールペプチドと比較してシャムラット又は損傷ラットのいずれにおいてもＭＷＭの認知機能を著しく変化させるか否かを判断する^１３５。

機能評価後、１群８匹のラットを経心筋灌流により犠牲にし、脳を摘出し処理する。３ｄｐｉと３０ｄｐｉの両時点で、切片をクレジルバイオレットで染色し、病変部を５００μｍ間隔で１２枚測定することにより、病変部の大きさを決定する。病変の体積は、同側半球の体積に対する割合で表示される。前頭葉皮質と海馬背面の脳室下帯（ＳＶＺ）と歯状回（ＤＧ）を含む連続的な冠状切片を調べる。
異なる海馬領域およびＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞（抗ＢｒｄＵで検出）の総数を、立体視を用いてカウントし、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、損傷後の新たに増殖した細胞の生存を変えるか否かを決定する。
３ｄｐｉ時点での増殖した細胞の識別と３０ｄｐｉ時点での成熟の運命を決定するために、切片を異なる細胞特異的なマーカーで共染色する。細胞特異的マーカーとしては、ＮｅｕＮ（成熟神経細胞）、ＳＯＸ２（神経幹細胞）、ＤＣＸ（神経前駆細胞）、ＧＦＡＰ又はＡＬＤＨ１Ｌ１（アストロサイト）、Ｉｂａ１（ミクログリア）、ＮＧ２（オリゴデンドロサイト前駆細胞、ＯＰＣ）、ＡＰＣ又はＧＳＴｐｉ（成熟オリゴデンドロサイト）などがある。
３０ｄｐｉにおけるＤＧ及び嗅球のＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ二重陽性細胞の数を異なる処理群間で比較し、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、損傷後の神経形成を増加するか否かを判定する。

また、ＢｒｄＵ＋神経前駆細胞や成熟神経細胞が、ＤＧから離れて又はＳＶＺから離れて病変部やＲＭＳ（rostral migratory stream）に向かって海馬の異なる領域に移動しているか否かも決定する。
神経原性ニッチに加えて、周辺領域内の各ＢｒｄＵ＋細胞タイプの総数を調べることで、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、損傷後の病理を変化させるかどうかを判定することができる。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、神経細胞の生存率を高めると考えられるので、両時点における葉周辺部の変性神経細胞数（フルオロジェードＣ）、及び生存神経細胞数（ＮｅｕＮ）を数値化してみる。
ミエリンの量の違いを示すために、ルクソルファストブルーで脳梁を調べる。無バイアス光学分画装置法を用いて、神経原性領域、病変周辺領域、吻合流、及び嗅球の細胞をカウントし、正確な細胞特異性及び増殖性細胞のカウントを得る。
全てのデータは、ダネットのポストホック補正を用いた二元配置分散分析によって解析される。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの分布は、ＦＬＡＧ抗血清で染色することにより切片で検査される。
残りの各群８匹（第２コホート）は犠牲にし、脳を速やかに摘出する。病変の同側及び対側の脳領域は、ＲＮＡとタンパク質の単離のために打ち抜き、スナップ冷凍する。ＲＥＳＴの発現量をウェスタンブロットで、ＢＤＮＦの発現量をｑＲＴ－ＰＣＲで、病変部周辺や神経原性ニッチでの発現量をコントロール群と比較して測定する。

［予想される結果と代替策］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、神経細胞の生存を高めることにより３ｄｐｉおよび３０ｄｐｉの両方においてＣＣＩ後の病変量を減少すると予想される。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド処理の神経細胞生存への影響を直接評価するために、変性及び生存する神経細胞を両方の時点で調べる。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの腓骨部における著しい早期神経保護効果により、最初の１週間で運動機能が改善されると考えられる。
マウスでは、ＣＣＩ後３ｄｐｉに最大の神経細胞死が起こることが以前に見出されたが^１３６、ラットでは別の時点を調べる必要がある可能性がある。
また、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処理した動物は、コントロールペプチドで処理した動物と比較して神経新生の増加を示すと予想される。
我々のデータは、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドによる処理によって、３ｄｐｉにおける異なる脳領域でのＤＣＸ＋前駆体の増加又は３０ｄｐｉにおける海馬、嗅球もしくは病巣周辺でのＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋成熟神経細胞の増加が生じるか否かを示す。
これらのデータを行動学的結果と関連づけることにより、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処理すると、ＭＷＭアッセイ又は新奇物体認識アッセイの性能が向上するか否かを確認できるようになる^１３５。このようにして、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、炎症又は細胞増殖に何らかの悪影響を及ぼすか否かを判断できるようになる。

［材料及び方法］
［試験システム］
種：Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの雄と雌。
試験開始時の年齢：約２２週～２９週
試験開始時の体重：雄で約２５０～３００ｇ、雌で約１５０～２００ｇ。

［研究計画］各コホート（第１及び第２）について、３（コントロールペプチド、２用量のＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド）×２（シャム、ＣＣＩ）×２（雄／雌））デザインの１２群がある。第１コホート（免疫組織化学）では８匹／群、第２コホート（行動）では１６匹／群になる。

［投与量の合理性］高用量は、実現可能な最大用量（約０．１７μｇ／ｈ）とし、低用量は、実施例１３で決定した有効量に近似した脳脊髄液（ＣＳＦ）薬剤レベルに基づく推定有効量とする。

［投与経路］右心室に留置したカニューレに浸透圧ミニポンプを取り付け、脳室内カテーテル（ＩＣＶ）で投与する。
［投与頻度］犠牲まで連続注入。
［投与間隔］第１コホート：３ｄｐｉ、第２コホート：３０ｄｐｉ
［環境条件］２匹/ケージ、餌と水は自由に与えられる。

［テストアーティクル識別］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド
［純度］９５％以上。
［投与製剤の調製］４日毎にまとめて行う。
［投与製剤のアッセイと安定性］投与製剤の安定性と濃度は、試験開始１週間目の１日目と７日目に評価。許容濃度範囲は，公称値の±１０％である。

［皮質衝撃制御（ＣＣＩ）モデル］ＣＣＩモデルについては既報の通りである^{６，１３０－１３４}。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド、又はコントロール（ビヒクルのみ）の投与は、ＣＣＩ後６時間から開始される。

［免疫組織化学］方法はＸｉｏｎｇ，Ｙら２００７及び２００８^{１３５，１３７} によって既に記述されている。
［モリス・ウォーター・メイズ］方法は、Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，２００６^１３８によって既に記述されている。

［実施例１３－ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、末梢神経損傷後の再生改善に使用できる］

［アプローチ］末梢神経損傷（ＰＮＩ）後の機能回復には、神経栄養因子（ＮＴＦ）が必要であり、その有無は、再生反応の強さを示すバイオマーカーとなる^{１３９，１４０}。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、プレイトロフィン（ＰＴＮ）、及びニューロトロフィン－３（ＮＴＦ－３）などいくつかのＮＴＦ遺伝子は、損傷によるＲＥＳＴの発現抑制が知られており、我々はＲＰＰ（配列番号２）がこの転写抑制を、少なくともＢＤＮＦとＮＧＦの場合において逆転できることを示した（図７、図９、図１０、図１６）^{１４１，１４２}。

１）リアルタイム定量化逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析により、１μＭの線状（配列番号４）又は環状（配列番号２）ＲＰＰを１６時間又は４８時間投与したＮＢＦＬ細胞は、ＢＤＮＦ及びＮＧＦのｍＲＮＡ発現の増加を誘発することがわかった（図９、Ａ、及びＢ並びに以下のテーブル参照）。

２）ＲＰＰ（配列番号９，３μＭ）は、４８時間後、水コントロールに対して、ＮＴＦＢＤＮＦとＮＧＦをそれぞれ約２倍と３倍増加させた。このことから、ＲＰＰがＭＰＣで活性化していることが確認された（図１０）。ＭＰＣは、Ｇｅｒｅｖａｓｉら、２０２０^７６によって以前に記載されたように、一般培地で培養された。

３）筋骨格系外傷の男女患者から分離した間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）において、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＴＮ、及びＮＴＦ－３の発現に与える影響を定量化する。ＭＰＣは、末梢神経損傷部位に存在し、広範囲に渡って特徴づけられている^１４３。ＭＰＣは、ＬｅｏｎＮｅｓｔｉ博士によって開発された標準的な分離プロトコルを用いて、通常及び事前に計画された外科治療の過程で採取される^{１１６，１４３}。３人の異なる対象者から得たＭＰＣを培養して拡大する。
まず、神経細胞誘導を行わずに細胞を４回継代し、ｑＲＴ－ＰＣＲとウェスタンブロット（ＷＢ）によりＲＥＳＴとＮＴＦの転写及びタンパク質レベルの発現のベースラインを確立する。次に、Ｂｕｌｋｅｎ－Ｈｏｏｖｅｒら^１４４に記載されているように、神経細胞誘導で膨張を繰り返す。簡単に説明すると、ＭＰＣをプレ誘導培地で２日間、次にオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）で１日間増強し、その後、神経誘導培地で７日間培養する。神経誘導培地は３日ごとに交換する。導入後７日目に、ＲＥＳＴとＮＴＦのレベルを評価する。神経細胞の誘導により、ＲＥＳＴの発現が減少し、それに伴いＮＴＦの発現が増加することが予想される。

ＭＰＣにおけるＮＴＦ発現における、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの誘導の効力を評価するために、まずＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの細胞毒性を評価することによって、投与を確立する必要がある。
簡単に言うと、ＭＰＣは、１０μＭまでの４つの用量レベルでの、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドでＲＡを置換した修正導入前培地、又は、（ＲＡを含む）導入前培地で１日間プレーティングする。
各投与群には３つの技術的複製と３つの生物学的複製があり、細胞毒性は、ＭＴＴアッセイ^１４５を用いて決定される。ＲＥＳＴのレベルを下げ、ＮＴＦのレベルを上げるべく、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの最適濃度を決定するために、処理後１、３、６日目（ｄｐｔ）に、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドをＲＡに置換した神経誘導培地で用量反応（３用量レベル）を行う。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの投与は、ＭＴＴアッセイ^１４５の知見に基づいて行われる。
ネガティブコントロールとポジティブコントロールは、それぞれ神経誘導培地－又は＋ＲＡとなる。ＲＥＳＴとＮＴＦの遺伝子発現とタンパク質量をｑＲＴ－ＰＣＲとＷＢ^{１３９，１４６}で定量化する。１、４、７ｄｐｔに細胞を採取し、細胞溶解液からＲＮＡとタンパク質を分離する。
二元配置分散分析に続いて、テューキーのポストホック検定を行い、指定された時点における－及び＋のコントロールと、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド投与群との間の比較を行う。母集団の平均値は、平均値±ＳＤで報告され、ｐ値が０．０５以下であれば統計的に有意とみなされる。統計解析は、ＳＡＳ統計パッケージ（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣａｒｙＮＣ）を用いて実施する。

４）ＲＰＰ（配列番号１２）を０、０．３、１、３、１０μＭで、ＤＲＧ神経細胞全体（Ｌ５、ＳＤ雄ラット由来）のエクス・ビボ培養で、ＢＤＮＦ及びＮＧＦの発現誘導能を評価した（図１６）。ＲＰＰは、ＢＤＮＦの発現を０．３、１、３μＭで約２５％、１０μＭで７５％増加させた。ＲＰＰは、３μＭと１０μＭでそれぞれＮＧＦを約５０％と２倍に増加させた（図１５）。１μＭでは影響が見られず、０．３μＭではｎ＝１であったため結論は出なかった（図１６）。

５）ＲＰＰ（配列番号１２）を、エクス・ビボ培養した全ＤＲＧ神経細胞（Ｌ５、雄ＳＤラット由来）で実施したＬＤＨ細胞毒性アッセイで評価した。ＲＰＰは０、１、３、１０μＭで毒性を示さなかった（図１７）。予想通り、ポジティブコントロール（２％トリトン）は、９０，０００ＲＬＵの増加によって示されるように、神経毒性を示した。

６）ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの、運動及び感覚の両方のエクス・ビボ神経モデルにおけるＮＴＦ発現誘導と再生刺激能力を、脊髄及び分離後根神経節（ＤＲＧ）抽出物のそれぞれの使用を通じて評価する^１４７。両モデルとも、成長因子の神経保護及び栄養特性を研究するために広く用いられている^１４８。
（６匹のラットの）脊柱の両側（Ｌ４－Ｌ６）から無傷のＤＲＧの１０ｍｍセグメントを抽出し、培養する（図２１及び図２２）^{１４９，１５０}。残りの脊柱材料は運動ニューロン連動脊髄スライス培養用に保存される。これらの脊柱をミクロトームで３００μｍ間隔で横方向に切り出し、そのスライスを半透膜の付いた培養インサートに移し、１週間培養条件に馴染ませる^{１４９，１５０}。生後１週間の器官型脊髄スライスを入れた培養インサートは、生存する運動神経細胞の安定した集団を有し、その後、６ウェルプレートに移してさらに７日間の培養を行う。

いずれの生体外摘出培養物もニューロベース／Ｂ２７培地で２週間維持し、神経細胞の突起を広範囲に伸長させる^１４７。物理的損傷を誘発するために、ガラス製のパスツールピペットを用いて、ＤＲＧ神経節の周囲及び腹部脊髄スライスの灰白質接合部から６ｍｍの精巧な神経細胞突起に傷をつける。エクス・ビボ培養物は、損傷後２４時間から、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド（０、１、３、又は１０μＭ）で処理する。

損傷した神経突起（運動神経と感覚神経）の再生能力は、細胞生存率をモニターし、軸索の伸長を測定することによって決定される。細胞生存率は、生細胞と死細胞をそれぞれカルセイン－ＡＭとエチジウムホモダイマー－１で標識することにより、７日後に評価する。神経細胞再生の指標である神経突起伸長は、１、４、７日目に測定する。スクラッチ領域のグレースケール顕微鏡写真は、モノクロデジタルカメラと結合したＺｅｉｓｓＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で取得される^１５１。スクラッチ領域内で再生された芽の数、長さ、総面積をＩｍａｇｅＪで解析する^１５２。

ＮＧＦはその受容体であるＤＲＧのＴｒｋＡ受容体を介して機能的活性の多くを発揮し^１５３、ＰＴＮは主に運動神経細胞において軸索伸長の増加を引き起こすことが分かっている^{１５０，１５４}。ＢＤＮＦとＮＴＦ－３は、運動神経と感覚神経の両方に存在する。ｑＲＴ－ＰＣＲとＷＢでＮＴＦの遺伝子発現量とタンパク質量を定量化する^{１３９，１４６}。１、４、７ｄｐｉにそれぞれのエクス・ビボシステムから組織を採取し、ＲＮＡとタンパク質のライセートを単離した。二元配置分散分析及びテューキーのポストホック検定を行い、指定された時点におけるコントロール群とＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド投与群との間の比較を行う。母集団の平均値は、平均値±ＳＤで報告され、ｐ値が０．０５以下であれば統計的に有意とみなす。統計解析はＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣａｒｙＮＣ）を用いて行われる。

７）ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、１００匹のラットにおけるイン・ビボでの坐骨神経欠損後の再生及び機能回復改善能について評価する。坐骨神経損傷部位にＲＰＰを注射して４８時間後に、脊髄の坐骨神経細胞核にＲＰＰが集積することを明らかにした（図４）。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、静脈内（ＩＶ）投与されることによって、筋肉内（ＩＭ）投与又は皮下（ＳＣ）投与と比較して高い最大実行可能量（ＭＦＤ）を試験できるようになる。また、ＩＶ投与により、経口投与や腹腔内（ＩＰ）投与に伴う初回通過代謝を回避することができる。
再生及び機能回復試験における投与濃度は、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いた１ヶ月単回ＩＶ用量範囲の確定、すなわち毒性及びトキシコキネティック試験の結果に基づいて決定される。１）の完了後、完了次第、用量範囲確定毒性試験を開始する。簡単に言えば、本試験では、ＦＤＡガイダンス（Ｍ３（Ｒ２）、２００９年）で推奨されているように、１０００ｍｇ／ｋｇ又は最大耐用量又はＭＦＤまでの４段階の用量レベルを用いる。
各群に割り当てる動物数は以下の通りとする。本試験：１０／性別／群；ＴＫ：３／性別／コントロール群及び９／性別／投与群。動物は、体重、摂餌量、臨床化学、血液学、尿検査、臓器重量、病理組織学（主要８組織）、及びトキシコキネティクスについて評価される。

再生及び機能回復試験では、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、３投与群（ＴＢＤ）＋コントロール（１０／性別／群）として、毎週、長期静脈カテーテルを用いて静脈投与し、６週間投与する^１５５。すべての動物に麻酔をかけ、坐骨神経を露出させ^１５６、０．７ｃｍの部分を切除し、神経の切り株を後退させた後に約１ｃｍの分節性欠損を形成する^１５７。脱細胞化神経移植片を用いて神経を修復する。その後、手術の切開部分を閉じ、６週間かけて神経を再生させる。投与群のみ、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが投与される。
６週間の期間中、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド投与に対する機能回復及び耐性を評価する。毎週、ラットの体重、体温を記録し、つま先開脚反射試験（運動神経機能を調べるために負傷した脚の最大足幅を測定する）を実施する^１５６。歩行軌跡解析（デジゲート）を２週間毎に実施し、電気生理学的研究^１５８を行う。簡単に説明すると、電気生理学的検査はラットの坐骨神経で行われる。電気刺激は、移植片縫合点から５ｍｍ近位の地点で、本来の坐骨神経幹に単一パルスショック（１ｍＡ、０．１ｍｓ）を用いて加える。腓腹筋の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を１Ｖから１２Ｖまで、又は上限のＣＭＡＰに達するまで記録する。比較のため、手術をしていない対側の坐骨神経からの正常なＣＭＡＰも記録している。回復率は、損傷した後肢のＣＭＡＰと対側の正常な後肢のＣＭＡＰの比によって決定される^{１５９，１６０}。

６週目の終わりに、坐骨神経だけでなく、Ｌ４～Ｌ６神経根に関連する脊髄の腹角（ＶＨ）とＤＲＧを採取する^{１６１，１６２}。神経再生は組織学的に評価される。グラフトの近位端、遠位端及び中央部を、断面を通す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用に準備し、グラフトに沿った髄鞘形成を評価する^{１６３，１６４}。簡単に説明すると、ウルトラミクロトームを用いて神経から約７０ｎｍの超薄切片を切り出し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色する。無作為の切片から１０～１５フィールドを解析用に選択し、有髄線維の数とサイズを定量化する。平均繊維密度は、上述したように計算される^７３。
ＴＥＭに加え、軸索の直接成長を測定するためにβ－チューブリンＩＩＩを可視化するＩＨＣ、グラフトへのシュワン細胞の浸透と成長を測定するＳ１００、治癒神経の血管新生と毛細血管浸潤を評価するフォン・ヴィレブランド因子、及びグラフト内のミエリン形成を測定するルクソールブルー染色^{１６５，１６６}のために同じ神経からさらに切片が作成される。
腹角とＤＲＧは、損傷した運動神経と感覚神経の細胞体内における、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドに関連する変化を評価される。
染色した組織の画像を光学顕微鏡で撮影し、解剖学的に一致した組織の陽性反応の強度と面積率をＩｍａｇｅＪソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij）を用いて定量化し、群間の神経再生率を比較する^１６５。損傷した神経のＤＲＧ神経細胞は、上述したようにカウントし、対側の損傷していないＤＲＧと比較する^１６７。ＮＴＦ（ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＰＴＮ、ＮＴＦ－３）、ＣＴＤＳＰ１、ＲＥＳＴは、ｑＰＣＲとＷＢで調べる。

［予想される結果と代替策］間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）を、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド＋神経誘導培地（－レチノイン酸、ＲＡ）で処理すると、神経誘導培地－ＲＡと比較して神経栄養因子（ＮＴＦ）の発現が増加し、ＲＥＳＴのレベルが減少するが、神経誘導培地＋ＲＡと同様であると予想される。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処理したエクス・ビボのモデルは、ＲＥＳＴレベルの低下により無処理群と比較して神経突起伸長が増加すると予想される。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの再生効果は、神経細胞損傷後に生体内で神経栄養因子を分泌できる支持細胞がない場合には顕著にならない可能性がある。

代替実験として、神経支持細胞（シュワン細胞及び間葉系幹細胞など）を、運動神経細胞及び感覚神経細胞が濃縮された後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄の摘出物と共に、損傷とその後のＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの処理前に共培養することを含む。
続いて、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ラットモデルで切断した神経の再生を助ける能力を分析する。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドで処置したラットは、組織学、電気生理学及び機能評価により決定されるように、コントロールラットと比較して回復が改善すると期待される。また、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ＮＴＦ発現を増加させ、ＲＥＳＴタンパク質レベルを減少させると予想される。
回復の兆候及びＲＥＳＴ遮断の除去が観察されない場合、標的部位（すなわち、移植片部位又は髄腔内）への直接注入により、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの局所濃度を増加させることにする。

［材料及び方法］
［細胞培養］ＭＰＣの採取、培養、及び神経栄養誘導は、上述されている^１６８。簡単に言えば、ＭＰＣを前誘導培地で２日間プレーティングし、次に全トランスレチノイン酸（ＲＡ）で１日間増強し、その後、神経誘導培地で７日間プレーティングする。神経誘導培地は３日毎に交換する。誘導後７日目に、ＲＥＳＴとＮＴＦのレベルを評価する。

［ｑＲＴ－ＰＣＲ］実施例１０に記載の方法。
［ウェスタンブロット解析］全細胞ライセートは、Ｂａｌｌａｓら、２００１^１１９の手順にしたがって調製した。ウェスタンブロットは、抗ＲＥＳＴ－Ｃ６４、抗ＮＴＦ（市販の抗体を使用）、抗ＧＡＰＤＨ（ａｂｃａｍ［６Ｃ５］）、赤外色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と結合した抗ＩｇＧを用いて標準手順で行い、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外蛍光イメージャ（ＬｉＣｏｒ）で解析する。

［テストアーティクル識別］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド。純度９５％以上。
［投与製剤の調製］４日毎にまとめて行う。
［投与製剤の評価と安定性］投与製剤の安定性と濃度は、試験開始１週間目の１日目と７日目に評価される。許容濃度範囲は公称値の±１０％である。

［脊椎動物の動物］雄および雌の成体Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（約２５０～３００ｇ雄、１５０～２００ｇ雌）を使用して、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドのＰＮＩからの回復改善における効果を決定する。この研究では、８～１１週齢のラットが１００匹必要である。ラットはＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手する

[手順説明]
手術：ラットはすべての外科的処置の前にイソフルオラン（導入４％、維持３％）で麻酔される。２）では、器官型脊髄培養を、出生後８日目のラット（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）の腰椎脊髄から上述した技術を用いて調製する（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、１９９３；Ｃｏｒｓｅら、１９９９）。簡単に説明すると、ラットを素早く犠牲にし、腰仙髄を取り出し、グルコースを含むＧｅｙの平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ）（６．４ｍｇ／Ｌ）に入れる。無菌状態で層流フード内で髄膜を慎重に剥がし、腰部脊髄神経根を切断する。脊髄はアクラーフィルム上に置き、マッキルウェイン組織チョッパーでＬ２からＬ５まで３００μｍ間隔で切片化する。
個々の脊髄切片は、Ｇｅｙの平衡塩／グルコース溶液を用いて、６ウェル培養プレートのミリセル－ＣＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）透過性メンブレンに注意深く移される。各メンブレンに５本の脊髄切片が配置される。
各ウェルには、５０％の最小必須培地と、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５％のハンクス平衡塩溶液とＤ－グルコース（２５．６ｍｇ／Ｌ）、２５％の熱不活性化ウマ血清、及び２ｍＭのＬ－グルタミンとからなる培地を１ｍＬずつ入れた。培養は、３７℃、５％ＣＯ２下の加湿インキュベーターで、３日毎に培地を交換しながら１週間維持する。１週間後、スライスを別の６ウェル培養プレートに移し、さらに７日間培養して神経突起を安定化させ伸展させた後、何らかの処置を施す。

３）では、坐骨神経を露出させ^１１７（図２１、図２２）、そして０．７ｃｍの部分を切除し、神経の切り株を引き込んだ後に約１ｃｍの分節性欠損を形成する（ＨｅｍｓａｎｄＧｌａｓｂｙ，１９９３）。脱細胞化神経移植片を用いて神経を修復する。その後、外科的切開部を閉鎖し、６週間神経を再生させる。
第１群（コントロール）は、約１ｃｍの坐骨神経切除を行い、１ｃｍの脱細胞化同種移植神経を移植する。第２群～第５群は、坐骨神経を１ｃｍ切除し、１ｃｍの脱細胞化同種移植片を移植し、用量範囲決定試験で決定した薬剤濃度の、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを毎週静脈注射する。全ての動物は６週目に犠牲となる。

［行動評価］機能回復とペプチド治療への耐性を評価するため、最長で６週間動物を観察する。毎週、ラットの体重、体温を記録し、つま先開脚反射試験（運動神経機能を調べるために負傷した脚の最大足幅を測定する）を実施する^１１７。歩行軌跡の解析は２週間毎に行い、電気生理学的検査は６週間後の犠牲の前に実施する。

［電気生理学的評価］電気生理学的検査は、従来の方法^１５８にしたがって実施する。簡単に説明すると、ラットの坐骨神経を再露出させ、グラフト縫合点から５ｍｍ近位にある本来の坐骨神経幹に電気刺激（単一パルスショック、１ｍＡ、０．１ｍｓ）を加える。ＣＭＡＰは腓腹筋の腹部で１Ｖ～１２Ｖまで、又は上限のＣＭＡＰに達するまで記録される。比較のため、手術をしていない対側の坐骨神経からの正常なＣＭＡＰも記録している。試験にはグラステックＳ８８Ｘスティミュレータ（Ａｓｔｒｏ－ＭｅｄＩｎｃ．）を、記録にはポリＶＩＷＥ１６データ収集ソフトウェア（Ａｓｔｒｏ－ＭｅｄＩｎｃ．）を使用する。回復率とは、ラットの損傷した後肢のＣＭＡＰと対側の正常な後肢のＣＭＡＰの比である^１５８。

［犠牲］ラットは受傷後６週目に犠牲になる。犠牲後、組織学的に移植片を介した軸索の成長、再髄鞘化、損傷部位のＭＰＣ細胞活性、前角細胞及びＤＲＧ活性、並びに再生神経の血管新生を評価する。各ラットの腓腹筋と前脛骨筋を犠牲後に採取し、総重量を評価し、萎縮を定量化する。

［正当性］ＰＮＩ後、血管系、免疫系、末梢神経系に内在する全ての細胞の間で、細胞や分子の複雑な相互作用が見られるようになる。外傷後に起こる様々な細胞、シグナル伝達分子、細胞間相互作用、回路などの順序や相互作用を完全に理解しているわけではないので、現時点では試験管内でモデル化することは不可能である。さらに、本提案で検討対象としている、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、神経前駆細胞、成体神経細胞だけでなく他の細胞種にも影響を与える可能性があり、ＰＮＩという観点からイン・ビボで評価を行うことが重要であると考えられる。
ＦＤＡは、生物学的製剤のＩＮＤ申請を許可する前に、イン・ビボでの有効性の証明も要求しており、このことは、これらの実験がイン・ビボであることをさらに正当化する。ラットが使用されるのは、ＰＮＩ後の行動学的研究により、この種の実験における信頼性が示されているためである。そのため、実験の計画と実行のための詳細なフレームワークを提供する文献が豊富に存在する。ラットはマウスよりも知能が高く、体も大きいので、傷害後の機能回復の変化を見分ける能力が高い。ラットの生理機能はマウスよりもヒトに類似しており、実験データのトランスレーショナルな関係性をより良くすることができる。さらに、我々がターゲットにしているＲＥＳＴ経路は、ラットで保存されている。

［痛みと苦痛の最小化］ラットは分節性末梢神経欠損のためイソフルラン（３－４％）で麻酔される。手術後、動物は移動するまで温熱パッド上で回復させる。ラットは術後２日間はアセトアミノフェン（飲料水中６ｍｇ／ｍｌ）を投与し、痛みや苦痛の兆候が見られた場合は追加で投与する。ラットは毎日、実験室と獣医の両方のスタッフによって観察され、苦痛を感じていると判断された動物は、獣医の勧告にしたがって治療または安楽死させられる。
［安楽死］使用される安楽死は、米国獣医師会の「動物の安楽死に関するガイドライン」の勧告に沿っている。

［実施例１４－ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、慢性疼痛の予防及び治療に用いることが可能である］
［完了した評価］:神経損傷後のＲＥＳＴの活性化によって、カリウムチャネルＫ_Ｖ４．３（Ｋｃｎｄ３）及びＫ_Ｖ７．２（Ｋｃｎｑ２）、ナトリウムチャネルＮａ_Ｖ１．８（Ｓｃｎ１０ａ）、並びにミューオピオイド受容体ＯＰＲＭ１など、感覚神経細胞の正常興奮性に必要な幾つかの遺伝子の発現が低下することとなる^{６０、７２－７４}。ＲＥＳＴを阻害して慢性疼痛を緩和する根拠として、マウスやラットの末梢神経損傷（ＰＮＩ）モデルを用いた研究が発表されている^{６０，７２－７４}。

１）リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析により、ＮＢＦＬ細胞に１μＭの線状（配列番号４）又は環状（配列番号２）のＲＰＰを１６時間又は４８時間投与すると、Ｋ_Ｖ４．３のｍＲＮＡの発現が増加することがわかった（図９のＣ及び以下のテーブル１６）。

４）ＲＰＰ（配列番号１２；０（水）、１、３、又は１０μＭ）を全ＤＲＧ（Ｌ５、ＳＤ雌ラット由来）のエクス・ビボ培養で４８時間培養し、慢性疼痛関連遺伝子Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、Ｎａ_Ｖ１．８、ＯＰＲＭ１の発現誘導の可能性について評価した（図１４）。
ＲＰＰは、Ｋ_Ｖ４．３の発現を１０μＭでコントロールの２倍に、Ｋ_Ｖ７．２の発現を３μＭと１０μＭでそれぞれ７．５倍と９倍に、Ｎａ_Ｖ１．８の発現を３μＭと１０μＭでそれぞれ２．９倍と４．８倍に、ＯＰＲＭ１発現を３μＭと１０μＭでそれぞれ増加させた（図１４参照）。
ＲＰＰ配列番号１３及び１４は、全ＤＲＧ（Ｌ５、ＳＤ雄ラット）のエクス・ビボ培養において、４８時間の投与期間後、３μＭでＮａ_Ｖ１．８の発現を評価された。配列番号１３及び１４は、コントロールと比較して、それぞれＮａ_Ｖ１．８発現を６倍及び１３倍に増加させた（図１５）。

５）ＲＰＰ（配列番号１２）は、エクス・ビボ培養した全ＤＲＧ神経細胞（Ｌ５、ＳＤ雄ラット由来）に対して行ったＬＤＨアッセイにおいて神経毒性を示さなかった。ＲＰＰはコントロールと比較して、ＲＬＵレベルを増加させなかった。予想通り、ポジティブコントロール（２％トリトン）はＲＬＵを９０，０００倍に増加させた（図１７）。

［計画的評価］
［目的１］：ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの薬物動態、分布、及び投与量を決定すること。

［サブ目的１．１］ラット及びサルの血漿、ＣＳＦ、及び組織中の、（１０～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲）を検出する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法の開発及び妥当性検証を行う。

［サブ目的１．２］イン・ビボ動物試験及び臨床における投与経路を決定するために、ＳＤラットを用いた探索的薬物動態（ＰＫ）試験を実施する。
１０００ｍｇ／ｋｇの、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、５分、３０分、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間（２／性別／時点）にてＩＶ、ＳＣ、又はＰＯで投与後に血漿サンプルを採取し、ピーク薬剤濃度（Ｃ_ｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、及び半減期（ｔ_１／２）について評価する。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの、中枢及び末梢神経系への浸透性を評価するため、安楽死時に標的組織（ＣＳＦ、脳、腰髄、後根神経節（ＤＲＧ））も採取し、薬剤濃度を測定する。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、検証済みのＬＳ－ＭＳ／ＭＳ法（ＳＵＢＡＩＭ１．１）で検出される。

［サブ目的１．３］ラット有効性試験（目標２）における投与量を決定するため、ＳＤラットを用いてＳＵＢＡＩＭ１．１で明らかになった最適投与経路による単回投与範囲確認試験を実施する。ＳＵＢＡＩＭ１．１のＰＫデータに基づき、４つの用量レベル＋ビヒクルコントロール（３／性別／群）を選択する。
高用量（ＨＤ）は、限界用量（最大実現可能量（ＭＦＤ）、最大耐量（ＭＴＤ）、及び／又は曝露飽和）を特定する必要がある。低用量は１／３刻みで投与する。動物は毎日、生存率と臨床症状（異常と痛み又は苦痛の兆候）を評価する。
ＳＵＢＡＩＭ１．１のＰＫデータに基づいて選択された６つの時点で投与後に血液を採取し、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ_１／２を評価する。
有効性試験で遺伝子変化を評価する組織（ＤＲＧ、腰髄、脳）は安楽死時に採取し、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドについて濃度を評価する。

［目的２］：ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの慢性疼痛に対する効果を評価すること。

坐骨神経切断部位にＲＰＰを投与すると、４８時間後に腰部（Ｌ４～Ｌ６）脊髄の運動神経細胞の核に蓄積することを明らかにした（図４）。痛みに対する我々の薬剤の効果を評価するために、坐骨神経を用いた前臨床ＳＮＩモデルを使用する。ＳＮＩは、神経障害性疼痛の動物モデルとして確立されており、熱感受性の強固かつ長期の変化、末梢及び中枢のモルヒネ鎮痛、ｃ線維の知覚低下が生じる^７４。
さらに、ＳＮＩは、慢性疼痛に関与するＲＥＳＴとその標的遺伝子の発現を誘導することが、我々や他の研究者によって既に示されている（それぞれ図１８とテーブル１２）^{６０，７２－７４}。さらに、我々が予測したように、ＣＴＤＳＰ１レベルの増加が観察された（図１８）。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの、慢性疼痛低減効果を第１フェーズで、疼痛低減の持続性を第２フェーズで判定する。
ＳＮＩ坐骨神経ラットモデルを用いて、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、慢性神経因性疼痛を減少させるか否かを試験する。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド、又はビヒクル、もしくは神経障害性疼痛の治療に用いられる標準治療薬であるオキシコドンの投与が行われる。
第１フェーズの実験手順を以下のテーブル１７にまとめた。

この目的のために、合計３１２２ヶ月齢のＳＤラット（雄と雌が同数）が必要である。各群１２匹のラットのサンプルサイズは、痛みの評価において１．２０標準偏差の差を検出する８０％の検出力を有する。検出力分析は、独立標本のｔ検定に基づき、５％（両側有意水準）で行った。有効性試験では、ラットを右表に示す実験群（ｎ＝１２／群）に無作為に割り付ける。無作為化された１０群の各ラットについて、刺激誘発及び非刺激誘発行動試験、形態学的、免疫組織化学的分析、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析、ＷＢ分析が行われる。安楽死時に、薬剤投与開始後２時点（１４日及び２８日）で採血を行い、標準的なＰＫパラメータを評価する。ＤＲＧと脳を抽出し、ＯＰＲＭ１、Ｎａ_Ｖ１．８、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２の濃度を測定する。さらに、組織を採取してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ｒｐｐ濃度を測定する。

手術：ＳＮＩ又はシャム手術（神経を傷つけずに神経枝を露出させる手術）は、上述したように実施される^１６９。簡単に説明すると、ラットに麻酔をかけ、総腓骨神経と脛骨神経を結紮する。坐骨神経の３番目の枝である腓骨神経をそのまま残して、結紮の遠位にある各神経の２～４ｍｍのセグメントを切断して除去する。腓骨神経は、同側の神経支配領域において、侵害刺激及び非侵害刺激に対して、受傷後４日目から増加した反応を示し、７日目で安定し、６ヶ月まで維持される。受傷後７日間は、慢性神経障害性疼痛の発症時期として認められており、トランスレーショナルに関係する。

薬剤／ビヒクル：投与は術後５日目から開始する。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドについては、試験経路、回数、及び薬剤濃度が特定目標１のＰＫ試験に基づいて決定される。オキシコドンについては、ヒトでの有効曝露量に近似したラットでの投与経路及び有効曝露量が知られている（オキシコドン０．５６ｍｇ／ｋｇ及び０．２ｍＬビヒクル）^１７０。

行動試験：痛みの伝達と運動機能への影響を、術前１日と術後４日目から１日おきに評価する。刺激誘発行動試験と非刺激誘発行動試験の両方を用いて、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの、オキシコドン及びビヒクルと比較した機能効果を測定する。
近年、幾つかの刺激誘発行動試験のトランスレーショナル性が問題となり、刺激誘発、非刺激誘発、及びオペラント又は随意行動試験が用いられるようになってきている。この提案では、最も広く使用されトランスレーショナル性のある刺激誘発行動試験である電子フォン・フレイ試験及び熱痛覚試験、非刺激誘発歩行分析、並びに痛みの回避状態を測定する場所逃避／回避パラダイムを使用する^１７１。最近の研究では、動物モデルの微妙な改善や悪化を検出するために、歩行分析を含めることの価値が示されている^１７２。行動試験を行うラットハンドラー及び評価者は、ラットがどの実験群／コントロール群に無作為に割り当てられたかについて盲検化される。各動物には固有の動物番号をつける。コントロール群と実験群を指定するために、秘密のカラーコードが使用される。このコードは分析後にのみ明らかにされる。

刺激誘発行動試験：機械的刺激に対する過敏症：プラスチック製のチップを取り付けた手持ちの力変換器からなる電子フォン・フレイ（Ｂｉｏｓｅｂ，Ｃｈａｖｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、左右の後肢の機械的引き抜き閾値を検査する。力変換器のプラスチック製の先端を、伏在神経の検査では足底内側に、坐骨神経（腓骨神経）の検査では足底外側に当てる。

熱過敏症：熱の痛覚過敏は、熱源としてレーザーを使用するように修正した公表された方法に基づいて測定される^１７３。熱源には波長８０８ｎｍのレーザーを使用し（出力２Ｗ、皮膚上のビーム径３ｍｍ）、検査する神経に関連する皮膚孔に照射する。ビームサイズが小さいため、関係する皮膚膜を特異的にターゲットにすることができる。坐骨神経と伏在神経については、熱刺激による四肢の離脱潜時を、１０秒のカットオフポイントとして記録する。

非刺激誘発行動試験：歩行分析：坐骨神経運動機能は、デジゲイトとサイアティック・ナーブ・インデックス^１７２を用いて評価する。簡単に説明すると、当研究室で開発・最適化されＲｏｄｅｎｔＢｅｈａｖｉｏｒａｌＣｏｒｅから市販されているデジゲイトを用いて、坐骨神経機能を損傷前と術後７日目、１４日目、２８日目に測定する。ラットをデジゲイトホルダー内の電動トレッドミルに乗せ、２０ｃｍ／秒の速度に設定して全動物の記録を行う。坐骨神経指標プログラムにより、患側後肢の機能を解析する。

場所脱出・回避：この方法は、ラットが痛覚過敏部位への機械的刺激に関連した環境を避けるようになるという仮説を検証するために考案されたものである。傷害を受けたラットでは、鎮痛剤投与後に逃避・回避行動の変化に対する感受性が生じることが報告されている（Ｂａａｓｔｒｕｐら２０１０）^１７４。大脳依存性逃避・回避パラダイムテストはＬａＢｕｄａとＦｕｃｈｓ（２０００）^１７１によって報告され、新規の回避環境に対する逃避・回避学習に依存するものである。動物は、傷害後３～５週間後に同じ訓練を受けた治験責任医師によって１回だけ検査される。試験は、ＵＳＵラット・ビヘイビア・コアで行われる。動物を、試験室内の光と音の環境に最低１時間以上慣らす。
この試験では、ラットは、メッシュの床をもつ密閉された部屋の「非回避的」暗側と「回避的」明側の間を自由に行き来し、下からフォン・フレイ・フィラメントで容易にアクセスすることができるようにする。ラットが暗い場所にいる場合は負傷した後肢、明るい場所にいる場合は負傷していない後肢のどちらかをそれぞれ日常的に刺激する。傷ついた前足に引き込み反応を引き起こすのに十分な機械的刺激（フォン・フレイ・フィラメント）を、その間の動物の位置に応じて、１５秒毎に片方の後足の外側足底面に３０分間加える。
脱出・回避行動は、暗所から明所への移動と定義する。箱の白い側にいる時間の割合と、黒い側と白い側を行き来した回数が記録される。白い側の累積時間と総渡り回数が、逃避・回避学習の指標となる。

安楽死：形態学的及び免疫組織化学的分析のために、ラットは、ケタミン／キシラジン（８０～１００ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、２１ゲージ針）で麻酔し、３００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に続いて０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラフォルムアルデヒド３００ｍｌを経心的に灌流させる。灌流後、神経、ＤＲＧ、脊髄を切り離し、４％パラホルムアルデヒドで２４時間後固定し、３０％スクロースで２４時間凍結保護する。組織サンプルは、クライオスタット（ＬｅｉｃａＣＭ３０５０Ｓ，ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０μｍの切片に切断される。

組織学：安楽死と神経採取後、切片をヘマトキシリン・エオジン色素で染色する。ＲＥＳＴ標的遺伝子であるＯＰＲＭ１、Ｎａ_Ｖ１．８、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２の発現量と分布は免疫蛍光法で評価される。

遺伝子発現解析：坐骨神経とそれに関連するＤＲＧ及び脊髄セグメントの遺伝子発現解析のために、ＲＥＳＴ標的遺伝子ＯＰＲＭ１、Ｎａ_Ｖ１．８、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２、及びコントロール遺伝子（Ｈｐｒｔ、Ｇａｐｄ、Ｒｎ１８ｓ）をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価する。

タンパク質の発現解析：坐骨神経関連ＤＲＧのタンパク質発現解析は、ＯＰＲＭ１、Ｎａ_Ｖ１．８、Ｋ_Ｖ４．３、Ｋ_Ｖ７．２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫ブロッティングによって評価される。ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして使用する。

統計的アプローチ：行動データについては、結果は平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表示される。２要因分散分析を用いて、治療後の時間に基づいて動物群を評価する。多重比較の調整にはボンフェローニ・ホルム法を用いる。両側の統計的有意性はＰ＜０．０５として確立される。免疫組織化学的解析では、二元配置分散分析を用いて、群及び時間の効果だけでなく、相互作用の平均値を比較する。ｑＲＴ－ＰＣＲの場合、値は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で報告される。遺伝子発現に対する統計的に有意な薬剤の影響は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により判定する。

第２フェーズの実験手順の概略は以下のテーブル１８の通りである。

第２フェーズでは、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの疼痛低減の持続性を検討する。本試験では、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの用量（低、中、高）と薬剤投与期間（１４又は２８日間）は、第１フェーズで最も有効であると判断されたものが使用される。上記の第１フェーズの有効性試験と同じ方法論で実施する。
薬剤投与期間（１４日又は２８日）終了後、３０日間、１日おきにラットの痛み反応と運動機能をモニターし、行動評価する点が異なる。ラットは３０日目に安楽死させる。この試験には、合計７２２ヶ月齢のＳＤラット（雄と雌が同数）が必要である。各群１２匹のラットのサンプルサイズは、痛みの評価において１．２０標準偏差の差を検出する８０％の検出力を有する。検出力分析は、独立標本のｔ検定に基づき、５％（両側有意水準で行った。ラットは右表の実験群に無作為に振り分けられる。
無作為化された１０群の各ラットについて、刺激誘発及び非刺激誘発行動試験、形態学的、免疫組織化学的分析、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析、ＷＢ分析が行われる。

［目的３］：ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの毒物・安全性薬理学的評価

ヒト初投与をサポートするため、ＦＤＡのガイダンスＭ３（Ｒ２）、Ｓ２Ｂ、Ｓ６（Ｒ１）、Ｓ７Ａ、Ｓ７Ｂ１７５－１７９で推奨されているように、２つの種で、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドのイン・ビトロでの心臓及び遺伝毒性及びイン・ビボでの毒性、安全薬理、毒物動態の評価を行う。両種とも、投与経路は、目的１のＰＫ評価の結果に基づいて選択する。

［サブ目的３．１］サルにおける単回投与範囲決定試験：サル３匹／性別／群で、４つの用量レベル＋ビヒクルコントロールを評価する。ＨＤは、ＭＴＤ、ＭＦＤ、及び／又は曝露飽和を特定する必要がある。低用量は１／３刻みで投与する。６つの時点で血液を採取し（目標１で収集したＰＫデータに基づいて決定予定）、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ_１／２を評価する。毎日、生存率と臨床徴候の評価が行われる。

［サブ目的３．２及び３．３］ラット（３．２）及びサル（３．３）を用いた毒性試験：投与期間は両種とも４週間とし、ヒトでの投与期間と６週間の回復期間をサポートし、その投与期間は、細胞アッセイで観察されたｒｐｐの高い安定性から選択される。３つの用量レベル＋ビヒクルコントロールとする。高用量は、用量範囲決定試験（目的１．２のラット及び目的３．１のサル）で確認された最大耐容量とする。ＭＤは、範囲決定試験におけるＡＵＣから、ＨＤより１／３低い値になる。ＬＤは、イン・ビボ有効性試験（目的２）での有効量に近似している。投与間隔は、各種において、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドのｔ_１／２とする。
ラット試験では、１５／性別／群となる。投与期間終了時に１０／性別／群が、回復期間終了時に５／性別／ビヒクルが犠牲となる。さらに、９／性別／ｒｐｐ群及び３／性別／ビヒクル群が本試験のトキシコキネティック部分に割り当てられる。
サル試験では、全ての動物に毒物検査とＴＫ検査（本試験では３／性別／群、回復期では２／性別／群）を実施する。
両種において以下の毒性学的パラメータを評価する：臨床観察、体重、食物摂取量、眼科検査（眼底検査及び細隙灯検査）、及び臨床化学の標準バッテリー、内臓重量、及び組織学的パラメータが評価される。

サルは、ＦＤＡガイダンスＳ７Ａ^１７９で推奨されているように、非外科的遠隔測定機能^１７９を用いて測定した呼吸（潮量、ヘモグロビン酸素飽和度など）及び心電図記録の評価を受けることになる。心血管系評価は、治療前、初回投与後、回復期の終了時（必要な場合）に２回実施する。記録は、コンサルタントである心臓専門医によって定性的に評価される。すべての波形は、ＰＲ及びＱＲＳ間隔の評価を含む、リズム又は伝導障害を検出するために定性的に評価される。
ラットは、修正アーウィンの機能観察バッテリー^{１７９，１８０}を用いて、中枢神経系機能を評価する。血漿からのＴＫ評価（Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ_１／２）は６時点（範囲決定試験で決定）で行われる。

［サブ目的３．４］イン・ビトロｈＥＲＧアッセイ^１７７：ｈＥＲＧチャネルの阻害は、ＱＴ延長症候群の一般的な原因であり、心室細動や心臓突然死を引き起こす不整脈とも相関している。ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ｈＥＲＧチャネル電流を阻害するか否かを調べるために、高濃度のＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド（１０μＭ）又はポジティブコントロール（ｃｉｓａｐｒｉｄｅ、０．０３μＭ）で処理したＣＨＯ細胞でｈＥＲＧチャネル電流の電気生理学的評価を行う。各細胞はそれぞれのポジティブコントロールとして機能する。全細胞記録は、従来の電圧クランプ技術を用いて行われる。

［サブ目的３．５］遺伝毒性：ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、遺伝毒性を決定するために、イン・ビトロでのＯＥＣＤ準拠のＡｍｅｓ及びイン・ビトロでの染色体異常アッセイ（Ｓ２Ｂ、１９９７年１１月）^１７６で評価する。

［目的４］：ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの乱用可能性アセスメント

オピオイド受容体遺伝子の発現はＲＥＳＴによって抑制されるため、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、エンドルフィンなどの内因性オピオイド受容体のリガンド効果を増強する可能性がある^{１８１，１８２}。さらに、最近の研究では、痛みを伴う条件下では、ＤＲＧとＰＡＧ（Ｐｅｒｉａｑｕｅｄｕｃｔａｌｇｒａｙａｒｅａ）においてＲＥＳＴの発現が増加することが示されている^{１８３，１８４}。
ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが報酬要求行動を引き起こすかどうかを調べるために、薬剤の報酬特性を調べるために広く用いられている行動アッセイの条件付場所選好（ＣＰＰ）を用いてラットに対する影響を評価する^{１８５－１８９}。ＣＰＰテストは、ＳＮＩ動物モデルにおいてモルヒネ報酬要求行動を実証した確立された方法である。

まず、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを無傷のラットに投与（経路未定）し、ＣＰＰテストを実施する。目的２との整合性を図るため、ポジティブコントロールとしてモルヒネの代わりにオキシコドンを使用し、ネガティブコントロールとして生理食塩水を別のラットに注射する。

装置は３つのコンパートメントからなり、外側の２つのコンパートメントは異なる特性（例えば、白い壁と黒い壁）をもつように設計されており、中央のコンパートメントは特別な特性はない。各試験は３つのフェーズで構成されている。
［フェーズＩプレテスト（１日目）］：生理食塩水投与後、ラットを中央のコンパートメントに入れ、ゲートを開けて他のコンパートメントと行き来できるようにする。ラットを１５分間モニターし、各部屋での滞在時間を記録することでベースライン嗜好を決定する。コンパートメントの平均的な自発的選好時間が決定される。試験時間の６０％以上を１つの部屋で過ごすラットは偏りがあると判断し、実験から除外する。
［フェーズIIコンディショニング（２日目～７日目）］：ラットにビヒクル又はＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを投与し、その後、一方のコンパートメントにＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドを、もう一方のコンパートメントにビヒクルを投与するよう無作為に割り当て／条件付けする。使用するＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの用量は、目的２で決定した、機械的及び熱的痛覚過敏に測定可能な効果をもたらす濃度に基づき決定される。薬剤とビヒクルの処置コンパートメントと投与順序は、バイアスを避けるため、全群で相殺される。このフェーズでは、３０分のコンディショニングセッションを６回連続して行う。また、別の群でオキシコドンによるコンディショニングも行う。［フェーズIIIテスト（８日目）］：ポストコンディショニング中に薬剤対のコンパートメントで過ごした時間とプレコンディショニング中に過ごした時間との間の差は、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドによって誘発された場所条件付けの程度を評価するために用いられる^１９０。

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、８群１２匹の傷害ラットを用いて評価する（ＳＮＩ対シャム；オキシコドン、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド、及び生理食塩水による条件付け）。
各群１２匹のラットのサンプルサイズは、痛みの評価において１．２０標準偏差の差を検出する８０％の検出力を有する。検出力分析は、独立標本のｔ検定に基づき、５％、両側有意水準とする。ラットは、実験群に無作為に割り当てる。ラットはＳＮＩ又はシャム手術を受けるよう無作為に割り当てられる。
受傷１日前、受傷４日後、８日後にフォン・フレイ試験を実施し、痛みの状態を観察する。受傷後８日目にＣＰＰテストを前述のように実施する。行動試験を行う研究員は、ラットがどの実験群／コントロール群に無作為に割り付けられたかについて盲検化される。
各動物には固有の動物番号をつける。コントロール群と実験群を指定するために、秘密のカラーコードが使用される。このコードは分析後にのみ明らかにされる。動物は安楽死させ、目的２に記載されているようにサンプルを分析する。

［予測される結果と代替策］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、損傷した神経細胞のＲＥＳＴレベルを下げ、興奮性に必要なイオンチャネルの発現を適切に回復すると予測される。行動レベルでは、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが、ＳＮＩラットの刺激又は非刺激誘発行動試験をベースラインに戻すはずである。
さらに、その作用機序から、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドが中毒性を有するとは考えていない。
しかし、薬剤投与により乱用可能性が示された場合、ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド投与中の強化の進行比率（ＰＲ）スケジュールでこのポジティブ結果を確認する。

［実施例１５－ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドは、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の再発を防ぐために使用することが可能である］

ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチドの、脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）及びイン・ビボでの神経原性及び抗癌性効力について評価すること。

試験物（ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド）の活性は、我々が確立した方法^{１９１－１９３}によりメイヨークリニックで得られた１０人のグレードＩＶのＧＢＭ患者由来の初代培養ＢＴＩＣで評価する。
細胞（０．２５×１０^４）を、培地（２５０μＬ）中にプレーティングし、５μＬのビヒクル又は最適用量範囲（実施例１３に記載の神経細胞分化試験で決定）の３用量レベルの試験物を、０、２、４、又は８日間投与し（本試験）、その後試験物を洗い流した後に８日間回復させる（回復期間）。多能性（Ｓｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎ）、増殖（Ｋｉ６７）、細胞死（カスパーゼ３）、及び分化（ＭＡＰ２、神経細胞及びＧＦＡＰ、グリア）のマーカーは、投与期間の０、２、４、８日目（本試験）と、回復期間の１０、１３、１６日目（各日３／ＴＣウェル／群）にＷＢとＲＴ－ＰＣＲでモニターする。

１０人のグレードＩＶのＧＢＭ患者から得た初代培養ＢＴＩＣを、我々及び他者らが以前に記述したように、頭蓋内異種腫瘍化ヌードマウスモデルに使用する^{１９１，１９２，１９４}。簡単に言えば、細胞（５×１０^４）を、５μＬのＰＢＳ（コントロール）又は３種類のＴＢＤ（上記のＢＴＩＣ神経原性アッセイに基づく）試験物の用量レベルのいずれかを含むＰＢＳに懸濁し、ガイドスクリューシステム付きの自動シリンジポンプを用いて投与する^{１１２，１９５}。注入座標は、Ｘ：１．５；Ｙ：１．３４；Ｚ：－３．５で、腫瘍生着の信頼性が高いマウスの線条体をターゲットとする^１９６。マウスは、カプラン－マイヤー法^１９７を用いて４、８、１６、２０週目の生存率を測定した後、死後の病理組織学で腫瘍サイズと浸潤性（Ｈ＆Ｅ染色）、細胞死（ＴＵＮＥＬ）、及び増殖（抗ヒト核）を評価する（すべての処置について３／性別／群）。

統計手法：数値は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）で表示される。統計的な有意性は、適切なパラメトリック又はノンパラメトリックの学生のｔ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用することによって決定される。簡単に説明すると、異なるコントロールと薬剤候補の処理における総ＲＥＳＴとリン酸化ＲＥＳＴの比率を、クルスカル－ウォリス検定を用いて統計的に検証する。
ＢＴＩＣコントロールと薬剤候補の培養物及び同位体異種移植の間のマーカー発現の差は、テューキー多重比較検定を用いて統計的に検定される。
コントロール又は試験物を投与したＢＴＩＣを注射したマウス間の腫瘍サイズと浸潤性の差は、マン・ホイットニーのＵ検定で統計的に検定し、生存率の差は、ログランク検定とＣｏｘ比例ハザード検定^１９８で統計的に検定する。

［予測される結果］各時点で、ＢＴＩＣを投与した試験物の異種移植片をもつマウスは、コントロールと比較して、腫瘍がないか、より小さい浸潤性の腫瘍で、より多くの細胞死（ＴＵＮＥＬ）、より少ないＧＢＭ増殖（抗ヒト核）を呈すると予想される。また、試験物とＢＴＩＣを投与したマウスは、ＢＴＩＣ単独と比較して生存期間が延長することが期待される。

［材料及び方法］
［試験システム］
［細胞］グレードＩＶのＧＢＭ患者１０名から初代培養脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）を得た。ＢＴＩＣの抽出と伝播の方法は、ＡｌｆｒｅｄｏＱｕｉｎｏｎｅｓ－Ｈｉｎｏｊｏｓａ博士とその研究チームによって既に記述されている^{１９１－１９３}。
［種／系統］Ｎｕ／ｎｕＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙマウス
［齢］試験開始時６週間
［体重］試験開始時雄：２０－３０ｇ、雌：１８－３５ｇ

［試験物同定］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド
［純度］９５％以上ＨＰＬＣ
［投与製剤の調製と安定性］ＣＰＰ（配列番号１１８～１３７及び１４０～１５９）に融合したＲＰＰ（配列番号１及び１５～１７）又はＲＰＰ_Ｖ（配列番号１８～１１７）ペプチド、及び、ビヒクルコントロールを毎週まとめて調製する。投与製剤の濃度は、毎週の初めに評価する。許容濃度範囲は公称値の±１０％である。
［ビヒクル］水

［研究計画］
［試験物の神経原性試験内容］
［投与量］試験物＋ビヒクルコントロールの３つの用量レベル。試験物の用量は、実施例１１に記載の神経細胞分化試験の結果に基づいて決定される。
［投与］投与は２日おきに培地交換をしながら行う。
［期間］本試験：０、２、４、８日間、回復期間：２、５、８日間。
［複製数］１群当たり３つの組織培養（ＴＣ）ウェル。
［投与量］５μＬ
［解析パラメータ］多能性（Ｓｏｘ２、Ｎｅｓｔｉｎ）、増殖（Ｋｉ６７）、細胞死（カスパーゼ３）、及び分化（ＭＡＰ２、神経細胞、ＧＦＡＰ、グリア）のマーカーは、投与期間の０、２、４、８日目（本試験）と、回復期間の１０、１３、１６日目（各日３／ＴＣウェル／群）に、ＷＢとＲＴ－ＰＣＲによりモニターする（テーブル１０）。

［マウスにおけるＢＴＩＣに対する試験物の抗がん作用］
［投与量］試験物＋ビヒクルコントロールの３つの用量レベル。試験物の投与量は、神経原性試験の結果に基づいて決定される。
［投与頻度］単回投与
［経路］ガイドスクリューシステムによる自動シリンジポンプ^{１１２，１９５}。注入座標はＸ：１．５；Ｙ：１．３４；Ｚ：－３．５で、腫瘍生着の信頼性の高い部位であるマウスの線条体をターゲットにする^１９６。
［ビヒクル］リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
［動物数］３／性別／群
［投与量］５μＬ
［解析パラメータ］マウスは、４、８、１６、２０週目にカプラン－マイヤー法^１９７を用いて生存率を測定した後、死後の病理組織学で腫瘍の大きさと浸潤性（Ｈ＆Ｅ染色）、細胞死（ＴＵＮＥＬ）、増殖性（抗ヒト核）を評価する（テーブル１１）。

［環境条件］
［ハウジング］２匹／ケージ、１２時間明暗サイクル。
［食事］食事と水は自由自在。

配列番号１～３２４の配列を以下のテーブル１９に示す。

本発明の特定の現在好ましい実施形態を本明細書で具体的に説明したが、本発明が属する技術分野の当業者には、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に示され説明された様々な実施形態の変形及び修正がなされ得ることは明らかであろう。

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配列番号２５７－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２５８－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２５９－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６０－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６１－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６２－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６３－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６４－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６５－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６６－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６７－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６８－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２６９－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２７０－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２７１－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２７２－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２７３－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２７５－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２７６－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２８１－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２９０－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２９１－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号２９２－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号２９３－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号２９４－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２９５－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号２９６－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２９７－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号２９８－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号２９９－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３００－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０１－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０２－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０３－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０４－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０５－人工配列の説明：合成プライマー
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配列番号３０６－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３０７－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３０８－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３０９－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３１０－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３１１－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３１２－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
配列番号３１３－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
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配列番号３１４－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
配列番号３１５－人工配列の説明：合成プライマー
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
ａ，ｃ，ｔ，ｇ，未知又はその他
配列番号３１６－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３１７－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３１８－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３１９－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２０－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３２１－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３２２－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３２３－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２４－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２５－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２６－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２７－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２８－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３２９－未知の説明：ＲＥＳＴペプチド
リン酸化Ｓｅｒ
リン酸化Ｓｅｒ
配列番号３３０－人工配列の説明：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３３１－人工配列の説明：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３３２－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３３－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３４－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３５－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３６－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３７－人工配列の説明：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３３８－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３３９－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４０－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４１－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４２－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４３－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４４－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４５－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４６－人工配列の説明：合成プライマー
配列番号３４７－未知の説明：ＲＥＳＴペプチド
配列番号３４８－人工配列の説明：合成プライマー
Ｄ－アミノ酸
配列番号３４９－人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド
配列番号３５０－人工配列の説明：合成ポリペプチド

Claims

配列番号１、１５、１６、１７、１８、２２、２５、３１、３５、６０、６３、６４、６６、６８、７５、８１、８５、１１０、１１３、１１４、及び１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
配列番号１、１５、１６、１７、１８、２２、２５、３１、３５、６０、６３、６４、６６、６８、７５、８１、８５、１１０、１１３、１１４、及び１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、前記アミノ酸配列と融合した細胞侵入ペプチド又はエンドソーム遊離配列とからなる融合ペプチドである、単離ペプチド。
前記細胞侵入ペプチド又はエンドソーム遊離配列は、配列番号１１８～１３７又は１４０～１５９からなる群から選択される、請求項２に記載の単離ペプチド。
リンカーが、前記アミノ酸配列と、前記細胞侵入ペプチド又は前記エンドソーム遊離配列とを連結している、請求項２に記載の単離ペプチド。
前記リンカーが、配列番号１３８、１３９、１６０、及び１６１からなる群から選択される、請求項４に記載の単離ペプチド。
前記細胞侵入ペプチド又は前記エンドソーム遊離配列が、Ｎ末端又はＣ末端で前記アミノ酸配列に融合している、請求項２に記載の単離ペプチド。
前記融合ペプチドが環化されている、請求項６に記載の単離ペプチド。
前記融合ペプチドが、配列番号２及び４～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２記載の単離ペプチド。
ＣＴＤＳＰ１と接触させることによって、ＲＥＳＴ活性をイン・ビボで阻害するために用いられる、請求項１又は２に記載の単離ペプチド。
動物の外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、又は膵臓癌を治療するために用いられる、請求項１又は２に記載の単離ペプチド。
それを必要とする動物に投与することによって、外傷性脳損傷、慢性疼痛、末梢神経損傷、てんかん、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、又は膵臓癌からなる群より選択される疾患を、治療、緩和、又は改善するために用いられ、前記疾患を治療、緩和、又は改善するのに有効な請求項１又は２に記載の単離ペプチド。
ＣＴＤＳＰ１に結合する、請求項１１に記載の単離ペプチド。
静脈内、皮下、経口、又は粘膜を介して投与される、請求項１１に記載の単離ペプチド。
一定の期間にわたって複数回投与される、請求項１１に記載の単離ペプチド。
前記期間が１ヶ月より短い、請求項１４に記載の単離ペプチド。
投与量が０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇである，請求項１４に記載の単離ペプチド。
請求項１又は２に記載の単離ペプチドを含む医薬組成物。
前記単離ペプチドが、内服液、カプレット、カプセル、注射剤、注入剤、座剤、ロゼンジ、錠剤、クリーム、軟膏、又は吸入剤に含まれる、請求項１７に記載の医薬組成物。
賦形剤をさらに含む、請求項１７に記載の医薬組成物。