JP7701911B2 - Ｃｅａｃａｍ５およびｃｄ３に対する二特異性抗体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）およびヒトＣＤ３εに結合する二特異性抗体（ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体）に関する。加えて、本発明は、そのような二特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、そのような抗体を選択および生成するための方法、ならびに疾患の処置におけるそのよう抗体を使用する方法にさらに関する。

発明の背景
例えば、膵臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がんなどのような進行性／転移性固形がんの処置を成功させることが、依然として課題となっている。最新のがん免疫療法は、身体の免疫細胞が、がん細胞をより良く攻撃するおよび殺滅するのを助ける方法／技法を導入した。例えば、いくつかの技法／方法が、Ｔ細胞による腫瘍細胞の攻撃を増加させるために開発された。例は、例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を阻害するモノクローナル抗体のような免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＴ細胞上のＣＤ３に結合するＴ細胞二特異性抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞である。ＣＡＲ－Ｔ細胞および二特異性抗体は、血液悪性腫瘍において有効であり、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍または急性リンパ球性白血病ＡＬＬの処置のために承認されているが、今までのところ、進行性／転移性固形がんの治療におけるこれらの方法の実際の画期的成功はない。治療において使用されるモノクローナル抗体、および二特異性抗体はまた、種々の有害作用を引き起こし得る。重要な毒性の問題は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）であり、これは、例えば、アレムツズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、リツキシマブ、トシツズマブおよびＣＤ１９ｘＣＤ３二特異性抗体のブリナツモマブによる治療において見出された。

Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら （Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５， ２０１７ （ｓｕｐｐｌ． ａｂｓｔｒ． ３００２））は、ＡＳＣＯ ２０１７で、単剤療法および抗ＰＤ－Ｌ１抗体のアテゾリズマブとの組合せにおけるＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体（ＲＯ６９５８６８８、シビサタマブ、下記を参照されたい）による進行性／転移性結腸直腸がんを有する患者におけるフェーズ１臨床データを提示した。シビサタマブは、ＣＤ３に結合する１つのＦａｂ断片およびＣＥＡに結合する２つのＦａｂ断片を有する、いわゆる２＋１フォーマットを有する。そのような抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号（国際公開第２０１４１３１７１２号）および米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号（国際公開第２０１４１３１７１１号）に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ＴＣＢ２０１４」は、ＣＤＲとして、米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号の配列番号２７０～２７６および２９０～２９６に示されるＣＤＲを含む（その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号の配列番号４～１０および２４～３０のＣＤＲも参照されたい）、米国特許出願公開第２０１４０２４２０８０号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるような２＋１フォーマットでＣＥＡおよびＣＤ３に結合する二特異性抗体を指す。本明細書で使用される場合、「ＴＣＢ２０１７」は、ＣＤＲとして、国際公開第２０１７０５５３８９号の配列番号４～６、８～１０および１４～１９に示されるＣＤＲを含む国際公開第２０１７０５５３８９号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるように、電荷改変（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＣＥＡバインダー、ヒト化ＣＥＡバインダーにおける電荷改変）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位」フォーマットの分子Ｂを指す。

２＋１構造は、かなり、ネイティブＩｇＧ抗体とは異なる。その構造は、人工アミノ酸（ａａ）架橋、およびＦｃ部分におけるノブイントゥホール技術／ａａ配列によって一緒にされた２つの異なる重鎖も含有する（例えば、米国特許第６７３７０５６号、国際公開第２０１３０５５９５８号を参照されたい）。そのような二特異性抗体（例えば、ＲＯ６９５８６８８、シビサタマブ）は、免疫原性であり、したがって、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成、およびＡＤＡによる薬物の中和に起因する薬物曝露の喪失を引き起こす。Ｍｅｌｅｒｏらは、６０～２００ｍｇ用量で、ＡＤＡを有する患者の５０％またはそれよりも多く、および患者の４５％で、曝露の喪失を報告した（Ｍｅｌｅｒｏら， ＡＳＣＯ ２０１７， Ａｂｓｔｒａｃｔ ２５４９ ａｎｄ Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ． ４１， ＡｂｓｔｒａｃｔはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５， ｎｏ． １５＿ｓｕｐｐｌ （Ｍａｙ ２０， ２０１７） ２５４９－２５４９を参照されたい）。曝露の喪失は、実際の治療を管理することを困難にし、成功の確率を有意に減少させる。ＡＤＡ形成を最小化するために、シビサタマブを、それぞれ、シビサタマブおよびアテゾリズマブの組合せで、抗ＣＤ２０抗体のオビヌツズマブによる前処置後に組合せにおいて臨床的に試験する（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｔｒｉａｌ ＮＣＴ０３８６６２３９を参照されたい）。前処置は、転移性結腸直腸癌を有する患者のＢ細胞を枯渇させるために施される。Ｂ細胞の枯渇は、患者の免疫グロブリンの低下、したがって、潜在的なＡＤＡをもたらすが、同時に、これは、免疫系の弱体化をもたらす。

さらなる二特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体の一本鎖抗体であるＭＥＤＩ－５６５（ＡＭＧ２１１）は、臨床開発されており、結果が公開されている（例えば、Ｍ． Ｐｉｓｈｖａｉａｎら Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１６ ＤＥＣ； １５（４） ３４５－３５１を参照されたい）。研究ＮＣＴ０１２８４２３１（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）は、完了したと報告しており、新たな治験は、何年も開始されていない。この一本鎖二特異性抗体（ａａリンカーによって接続された２つのｓｃＦｖ）は、２．２～６．５時間の極めて短い排泄半減期を有する（Ｐｉｓｈｖａｉａｎら； Ｃｌｉｎ． Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１６ ＤＥＣ； １５（４） ３４５－３５１）（参照により本明細書に組み込まれる）。

本発明は、高有効性の免疫原性がより低いＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を提供する。そのような抗体は、共通重鎖を含み、一実施形態では、ＣＥＡ結合部分中にカッパ軽鎖、およびＣＤ３結合部分中にラムダ軽鎖を含む。

二特異性抗体を得るために共通重鎖を使用する概念は、Ｆｉｓｃｈｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６ （２０１５）： ６１１３． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７１１３およびＭａｇｉｓｔｒｅｌｌｉ Ｇ．ら， ＭＡＢＳ ９ （２０１７） ２３１－２３９において言及されている。カッパラムダ二特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１４０８７２４８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。それらの構造は、ネイティブＩｇＧの構造からほとんど区別ができず、その結果、ＡＤＡ形成がないか、またはＡＤＡ形成が最小限であり、したがって、曝露の喪失が少ないまたは最小限である。共通重鎖可変領域ＶＨの配列および本発明のｈｕＣＤ３ ＶＬ １Ａ４の配列は、国際公開第２０１９１７５６５８号（米国特許出願公開第２０１９／０２８４２９７号）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

上記で言及したように、国際公開第２０１７０５５３８９号は、２＋１フォーマットを有するが、シビサタマブと異なるドメインに結合する二特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体を記載している。これらの抗体の１つ（ＲＯ７１７２５０８またはＲＧ６１２３）は、オビヌツズマブ前処置およびアテゾリズマブとの組合せでも、局所進行性および／または転移性ＣＥＡ陽性固形腫瘍を有する患者において、臨床試験で試験されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；ＲＯ７１７２５０８について検索）。一部のコホートについてのＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖにおける臨床試験の記載によれば、ある特定の閾値を下回る血清ＣＥＡ（脱落（ｓｈｅｄ）可溶性ＣＥＡＣＡＭ５、ｓＣＥＡ）レベルが、処置される患者において、処置に対して患者が適格となるために必要であり、より高いレベルの脱落可溶性ＣＥＡＣＡＭ５がこのＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体の有効性を低下させ得ることを示唆している。本発明の抗体は、それらの腫瘍細胞殺滅有効性に対する脱落可溶性ＣＥＡの最小限の影響を示す。

脱落可溶性ＣＥＡＣＡＭ５は、確立された腫瘍マーカーである。がん患者の血漿中のｓＣＥＡのレベルは、１０００ｎｇ／ｍｌを超え得るが、健康な個体における血漿濃度は、１０ｎｇ／ｍｌを下回る（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ Ｂら Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， １９（５Ｂ）， ４２２９－３３）。したがって、脱落可溶性ＣＥＡＣＡＭ５は、治療用抗ＣＥＡ抗体および抗ＣＥＡ二特異性抗体の結合について、腫瘍細胞上に存在する膜結合ＣＥＡと競合することができ、潜在的に抗ＣＥＡ抗体またはＣＥＡｘＣＤ３抗体の有効性の減少を引き起こす。ＴＣＢ２０１７およびＴＣＢ２０１４（上記を参照されたい）は、可溶性ＣＥＡの存在下、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞のＴ細胞媒介溶解についての試験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明者らによって試験されている。試験へのｓＣＥＡの添加が、溶解曲線を、したがって、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７のＥＣ５０値をより高濃度にシフトさせることが見出され、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７の両方が、ｓＣＥＡに有意に結合することを示唆した。

ヒトＣＥＡファミリーは、２９個の遺伝子を含み、そのうち、７個がＣＥＡサブグループに属し１１個が妊娠特異的糖タンパク質サブグループに属する、１８個が発現される。いくつかのＣＥＡサブグループのメンバーは、細胞接着特性を持つと思われる。ＣＥＡＣＡＭ５は、結腸直腸がん細胞によって発現されるだけでなく、膵臓がん、胃がん、肺がんおよび他のがんの種類によっても発現される。ＣＥＡＣＡＭ５は、自然免疫において役割を有すると思われる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ Ｓ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ９（２）：６７－８１ （１９９９））。癌胎児性抗原５（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７３１）は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭファミリー）および腫瘍関連抗原のメンバーである（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １２１：４３９－４６２， １９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ． Ｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ２０：２１９７－２２０７， ２００２）。複数のモノクローナル抗体が、研究目的のため、診断ツールとして、および治療目的のために、ＣＥＡＣＡＭ５に対して産生されている（例えば、国際公開第２０１２１１７００２号を参照されたい）。癌胎児性抗原ファミリー（ＣＥＡＣＡＭ）のメンバーは、広く発現され、組織に応じて、腫瘍促進、腫瘍抑制、血管新生および好中球活性化を含む多様な機能を調節することができる。このファミリーの４つのメンバーのＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８は、ヒト好中球において、発現および富化される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）。ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体の作用機構を考えると、他のＣＥＡＣＡＭとの交差反応性は、重要な循環する健康な細胞集団の枯渇をもたらす可能性がある。例えば、好中球または造血幹細胞によって発現されるＣＥＡＣＡＭ８との交差反応性は、そのような細胞集団の枯渇をもたらす可能性がある。本発明は、ＣＥＡＣＡＭファミリーのＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０およびＣＥＡＣＡＭ２１のメンバーの１つまたは複数との低い交差反応性を有するＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を提供する。

マウスモノクローナル抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のＰＲ１Ａ３は、ＮＳ１（Ｐ３／ＮＳ ｌ／Ｉ－Ａｇ－４－ｌ）骨髄腫細胞と正常な結腸直腸上皮で免疫されたマウス由来の脾臓細胞との融合によって産生された。Ｒｉｃｈｍａｎ Ｐ． Ｉ． ａｎｄ Ｂｏｄｍｅｒ Ｗ． Ｆ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ３９：３１７－３２８， １９８７は、マウスモノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３を記載している。ＰＲ１ Ａ３のエピトープマッピングは、この抗体が、ＣＥＡ分子のＢ３ドメインおよびＧＰＩアンカーを標的にすることを示す（Ｄｕｒｂｉｎ Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１ ：４３１３－４３１７， １９９４）。ＰＲ１ Ａ３が結合するエピトープは、直鎖状エピトープではなく、立体構造エピトープである（Ｓｔｅｗａｒｔら， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ４７ （１９９９） ２９９－０６）。ヒト化ＰＲｌＡ３（ｈＰＲｌＡ３）抗体は、例えば、Ｃｏｎａｇｈｈａｎ Ｐ． Ｊ．ら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ９８ （２００８）１２１７－１２２５および国際公開第２０１２１１７００２号によって記載されている。ＴＣＢ２０１４において使用されるＣＥＡバインダー（ＣＨ１Ａ１Ａという）は、ＰＲ１Ａ３抗体に由来する、ヒト化され、親和性成熟され、安定性が操作されたバージョンである。Ｍ． Ｂａｃａｃら， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（１３）；３２８６－９７ （２０１６）、Ｃｏｎａｇｈａｎ Ｐ，ら， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００８；９８：１２１７－２５およびＤｕｒｂｉｎ Ｈ，ら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９４；９１：４３１３－７。

ヒトＰＤ－１軸アンタゴニストおよび二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体の組合せによりがんを処置するための方法は、国際公開第２０１７１１８６５７号に言及されており、臨床結果は、ＡＳＣＯカンファレンス２０１７（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５， ２０１７ （ｓｕｐｐｌ． ａｂｓｔｒ． ３００２））で公開されている。免疫チェックポイント経路の２つまたはそれよりも多くの異なる標的を結合する免疫チェックポイントアンタゴニストならびにＣＥＡおよびＴ細胞表面抗原に結合するＴ細胞リダイレクト剤を投与することによって腫瘍を処置する方法は、国際公開第２０１５１１２５３４号に言及されている。シングルドメイン抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体およびウレアーゼからなるコンジュゲートは、今のところ、臨床試験中である（ＮＣＴ０２３０９８９２；国際公開第２０１６１１６９０７号）。ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６および顆粒球に結合するクラスＩ抗体は、米国特許出願公開第２０１１００６４６５３号に言及されている。互いと共有結合した第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む二特異性抗体は、国際公開第２０１８０５３３２８号に言及されている。

現在の技術水準において記載される抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４である（Ｙａｎｇ ＳＪ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８６） １３７； １０９７－１１００））。ＳＰ３４は、霊長類およびヒトのＣＤ３の両方と反応する。ＳＰ３４は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。現在の技術水準において記載されるさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ－１である（国際公開第２００００４１４７４号を参照されたい）。現在の技術水準において記載されるさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ－３である（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用、Ａｎａｓｅｔｔｉら， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４： ８４４ （１９９２））。ＳＰ－３４は、ＣＤ３のもっぱらε鎖上に存在するエピトープを認識するが（Ｓａｌｍｅｒｏｎら， （１９９１） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ３０４７を参照されたい）、ＵＣＨＴ－１およびＢＣ－３は、εおよびγ鎖の両方によって寄与されるエピトープを認識するという点で、ＳＰ３４は、ＵＣＨＴ－１およびＢＣ－３と異なる。抗ＣＤ３抗体は、国際公開第２００７０４２２６１号、国際公開第２００８１１９５６５号、国際公開第２００８１１９５６６号、国際公開第２００８１１９５６７号、国際公開第２０１００３７８３６号、国際公開第２０１００３７８３７号、国際公開第２０１００３７８３８号および米国特許第８２３６３０８号にも記載されている。ＣＥＡに特異的な結合部分およびＣＤ３εに特異的な結合部分を含む二特異性抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号、国際公開第２００７０７１４２６号、国際公開第２０１３０１２４１４号、国際公開第２０１５１１２５３４号、国際公開第２０１７１１８６７５号および国際公開第２０１７０５５３８９号に記載されている。本発明による抗体の第２の結合部分の配列を含む抗ＣＤ３抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／６４３，０９５号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０００２３２号に言及されている。米国特許出願公開第２０１２３２１６２６号は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に結合するＦａｂ断片を含む多特異性Ｆａｂ融合タンパク質に言及している。国際公開第２０１８１９９５９３号は、ＨＥＲ３およびＣＤ３に結合する二特異性抗体に言及している。

上記で既に言及したように、進行性固形腫瘍を有する患者におけるＴ細胞二特異性抗体のＴＡＡｘＣＤ３（ＴＡＡ＝腫瘍関連抗原）による最初の臨床試験の結果は、期待外れであったが、最近の予備フェーズ１の結果が、進行性結腸直腸がんの患者において、単剤療法およびＰＤ－Ｌ１阻害との組合せで、部分奏効および安定な疾患を示す（Ｊ．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３５， ２０１７ （ｓｕｐｐｌ． Ａｂｓｔｒ． ３００２））ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体のシビサタマブ（ＲＯ６９５８６８８、例えば、Ｂａｃａｃら Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２２（１３）， ３２８６－９７ （２０１６）；および米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号を参照されたい）について、公開されている。より良好な結果を得るための別の手法は、Ｔ細胞二特異性抗体に、ＰＤ－１チェックポイント軸の阻害剤を追加することだけでなく、さらなるチェックポイント阻害剤またはアゴニストを追加することである。しかし、今までのところ、利用可能なそのような組合せ手法について見込みのある臨床データは存在しないと考えられる。

進行性固形腫瘍内でのＴ細胞の利用度が限られていることが、確実に、Ｔ細胞二特異性抗体とＰＤ－１軸阻害剤により達成可能な有効性を制限する重要なメカニズムである。

進行性固形腫瘍の腫瘍細胞に対してＴ細胞を向け直すことを目的として、Ｔ細胞二特異性抗体とＰＤ－１軸阻害剤の他の治療剤との組み合わせを追加する代わりに、他の免疫細胞、特に、マクロファージまたはマクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を腫瘍細胞に向け直す治療剤を追加することは、より大きな成功を収め得る。

本発明は、新規のＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を、ＣＥＡを発現する固形腫瘍に対して、マクロファージおよびＮＫ細胞も向け直すＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体と並行して投与することができる方法で設計される、該ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を提供する。ＣＥＡを発現する腫瘍に標的化されるＴ細胞およびマクロファージおよびＮＫ細胞の組合せ攻撃は、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞の優れた有効性／殺滅およびファゴサイトーシスについてかなりの機会を提供する。

固形腫瘍におけるＣＡＲ Ｔ細胞によるこれまでの期待外れの結果は、固形腫瘍に浸透し、そこに分布するＣＡＲ Ｔ細胞の数が十分ではなかっただけである、という単純な説明を有し得る。これは、血液学的悪性腫瘍の大多数において確かに異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞に十分に接近することができ、固形腫瘍における期待外れの有効性と比較して、これらの悪性腫瘍における高い有効性の差を説明する。加えて、ＣＡＲ Ｔ細胞は、大部分は強く免疫抑制である固形腫瘍の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって重度に抑制され得る。

本発明は、高い有効性、有効性に対するｓＣＥＡの低い影響、ＣＥＡＣＡＭ５（＝ＣＥＡ）以外の他のＣＥＡＣＡＭとの低い交差反応性または交差反応性がない、ならびに、したがって、減少した毒性、低い免疫原性、ＣＥＡｘＣＤ４７抗体との並行併用療法の機会を有する、および有益な薬物動態学的特性を有する、新規の二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体を提供する。

米国特許第２０１４０２４２０７９号明細書 国際公開第２０１４１３１７１２号

Ｔａｂｅｒｎｅｒｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５， ２０１７ （ｓｕｐｐｌ． ａｂｓｔｒ． ３００２） Ｍｅｌｅｒｏら， ＡＳＣＯ ２０１７， Ａｂｓｔｒａｃｔ ２５４９ ａｎｄ Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ． ４１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５， ｎｏ． １５＿ｓｕｐｐｌ （Ｍａｙ ２０， ２０１７） ２５４９－２５４９

発明の概要
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分（さらに「ＣＥＡ」ともいう）およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分（さらに「ＣＤ３」ともいう）を含む二特異性抗体（さらに「ｂｓＡｂ ＣＥＡｘＣＤ３」または「ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体」ともいう）に関する。

一実施形態では、二特異性抗体は、前記抗体が、第１の結合部分について一価、および第２の結合部分について一価であることを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、定常および可変フレームワーク領域の配列がヒトであることを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１および第２の結合部分のそれぞれが、免疫グロブリンの重鎖および免疫グロブリンの軽鎖を含むことを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、重鎖を含む第１の結合部分、および重鎖を含む第２の結合部分を有し、それぞれの結合部分中の重鎖は同じ（すなわち、共通重鎖）である。一実施形態では、共通重鎖可変領域は、ＣＤＲとして、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、共通重鎖可変領域は、配列番号１のものである。一実施形態では、共通定常重鎖は、配列番号３０のものである。一実施形態では、共通重鎖は、配列番号４３のものである。一実施形態では、共通重鎖は、配列番号４４のものである。一実施形態では、共通重鎖は、配列番号４５のものである。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分および第２の結合部分中に、重鎖として、共通重鎖を含むこと、第１の結合部分中に、軽鎖として、カッパ軽鎖、および第２の結合部分中に、軽鎖として、ラムダ軽鎖を含むことを特徴とする。一実施形態では、第２の結合部分の軽鎖は、配列番号２８のものであり、第２の結合部分の重鎖は、配列番号４５のものである（例えば、ＡＢ１およびＡＢ１３Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１５Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ２０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／ＮのようなＡＢ－１Ｌ３－１／Ｎに由来する二特異性抗体；ＣＤＲおよびＶＬ配列について、配列表を参照されたい）。

ＡＢ１３、１４、１５などは、本発明の二特異性抗体の第１の結合部分（抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体アーム）について表し、Ｌ３－１は、本発明の二特異性抗体の第２の結合部分（抗ＣＤ３抗体アーム、１Ａ４とも呼ぶ）について表す。任意のＡＢＸＸ抗ＣＥＡアームは、Ｌ３－１抗ＣＤ３アームと組み合わされて、二特異性抗体を形成することができ、例えば、ＡＢＸＸＬ３－１は、ＷＴ ｈＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含む本発明によるＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を表し；ＡＢＸＸＬ３－１／Ｄは、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ変異を持つｈＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含む本発明によるＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を表し；ＡＢＸＸＬ３－１／Ｎは、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｐ３２９Ａ変異を持つｈＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含む本発明によるＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体を表す。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分および第２の結合部分中に、重鎖として、共通重鎖を含むこと、第１の結合部分中に、軽鎖可変領域として、ラムダ型領域、および軽鎖定常領域として、カッパ型領域（「ハイブリッドフォーマット軽鎖」）、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖として、ラムダ軽鎖を含むことを特徴とする（例えば、Ｌ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／Ｄ、図２および図２の説明を参照されたい）。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分および第２の結合部分中に、重鎖として、共通重鎖を含むこと、第１の結合部分中に、軽鎖可変領域として、ラムダ型領域、および軽鎖定常領域として、ラムダ型領域、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖可変領域として、ラムダ型領域、および軽鎖定常領域として、カッパ型領域（「ハイブリッドフォーマット軽鎖」）を含むことを特徴とする；例えば、ＡＢ８Ｌ３－１ Ｈ－ＣＫ５／Ｄ。

本発明の二特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５以外のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに対する低い結合／交差反応性を示す。一実施形態では、二特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０およびＣＥＡＣＡＭ２１からなる群から選択されるＣＥＡＣＡＭを発現するＰＥＡＫｒａｐｉｄ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２８２８（商標））への結合についてのＭＦＩ値が、同じ実験条件下のＷＴ ＰＥＡＫ細胞（すなわち、トランスフェクトされていないＰＥＡＫ細胞）への結合についてのＭＦＩ値と比較して、２倍以下であることを特徴とする。一実施形態では、二特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８からなる群から選択されるＣＥＡＣＡＭを発現するＰＥＡＫｒａｐｉｄ細胞への結合についてのＭＦＩ値が、同じ実験条件下のＷＴ ＰＥＡＫ細胞への結合についてのＭＦＩ値と比較して、２倍以下であることを特徴とする。一実施形態では、二特異性抗体は、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫｒａｐｉｄ細胞への結合についてのＭＦＩ値が、同じ実験条件下のＷＴ ＰＥＡＫ細胞への結合についてのＭＦＩ値と比較して、２倍以下であることを特徴とする。ＰＥＡＫ細胞のトランスフェクションのため、およびこれらのＰＥＡＫ細胞への抗体の結合を測定するための実験手順を、実施例１および５に記載する。

一実施形態では、二特異性抗体は、０．５ｎＭ～５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞（ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ ４０９）に結合する。一実施形態では、二特異性抗体は、０．５ｎＭ～３０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞に結合する。一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、２００ｎＭ、１０００ｎＭおよび５０００ｎＭでのＭＫＮ－４５細胞への結合についてのＭＦＩ値が、ＴＣＢ２０１４で得られたＭＦＩ値の少なくとも２倍であることを特徴とする。結合アッセイを、実施例７ａに記載する。一実施形態では、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて測定される腫瘍細胞系ＭＫＮ－４５の殺滅についてのＥＣ５０は、本発明の二特異性抗体について、ＴＣＢ２０１４について測定されるＥＣ５０よりも４０％以上低い。一実施形態では、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて測定される腫瘍細胞系ＬＳ－１７４Ｔの殺滅についてのＥＣ５０は、本発明の二特異性抗体について、ＴＣＢ２０１４について測定されるＥＣ５０よりも４０％以上低い。

一実施形態では、二特異性抗体は、０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅している。一実施形態では、二特異性抗体は、０．０１～１ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅している。

ＣＥＡ陽性細胞のＴ細胞再標的化溶解／殺滅を測定するためのアッセイを、実施例８に記載する。

一実施形態では、二特異性抗体は、同じアッセイ（ＣＥＡ陽性ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞の殺滅）におけるＥＣ５０値が、同じ実験条件下での可溶性ＣＥＡＣＡＭ５なしの溶解についてのＥＣ５０値と比較して、５μｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡＣＡＭ５の存在下で、２０倍を超えて増加せず、一実施形態では、１５以下、一実施形態では、１０以下であることを特徴とする。

別の実施形態では、二特異性抗体は、同じアッセイにおけるＥＣ５０値が、同じ実験条件下での可溶性ＣＥＡＣＡＭ５なしの溶解についてのＥＣ５０値と比較して、１μｇ／ｍｌの可溶性ＣＥＡＣＡＭ５の存在下で、１０倍を超えて増加せず、一実施形態では、５以下であることを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、前記二特異性抗体が、同じ実験条件下でのビヒクル群における腫瘍体積の成長と比較して、１８日目まで、２５％またはそれよりも大きく、ＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおいて腫瘍体積の成長を阻害することを特徴とする。一実施形態では、二特異性抗体は、前記二特異性抗体が、同じ実験条件下でのＴＣＢ２０１４と比較して、同様に、１８日目まで、ＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおいて腫瘍体積の成長を阻害し、統計的に有意な様式で異ならないことを特徴とする。マウス腫瘍モデルを、実施例９ａに記載する。

一実施形態では、二特異性抗体は、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中に、活性化しているＦｃ受容体への結合を低減し、および／またはエフェクター機能を低減する、アミノ酸置換を含み、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、ならびに／またはＰ３２９Ａ、Ｐ３２９ＧおよびＰ３２９Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群から選択されるＰ３２９の置換である。一実施形態では、二特異性抗体は、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中に、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む。Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）は、２３４／２３５位のアミノ酸のロイシンが、アラニンによって置き換えられることを意味する。Ｐ３２９Ａ（ＰＡ）は、３２９位のアミノ酸のプロリンが、アラニンによって置き換えられることを意味する。

一実施形態では、二特異性抗体は、共通重鎖を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、ＣＤＲとして、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む共通重鎖を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、第２の結合部分中に、ＣＤＲとして、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖領域を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分中に、軽鎖定常領域として、配列番号３９の領域を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分中に、軽鎖定常領域として、配列番号４１の領域を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分中に、軽鎖定常領域として、配列番号５８の領域を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、配列番号４３の共通重鎖、または配列番号４４の共通重鎖、または配列番号４５の共通重鎖を含む。一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分中に、軽鎖定常領域として、配列番号３９の領域および配列番号４５の配列番号の共通重鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から、または配列番号６７、６８、６９、７０および７１のハイブリッドフォーマット軽鎖（ＬＣ）群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、第１の結合部分中に、軽鎖定常領域として、配列番号３９の領域、配列番号４５の共通重鎖、および第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号４８および４９の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（抗ＣＥＡ抗体ＭＥＤＩ）、ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号４６および４７の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（抗体ＳＭ３Ｅ）、ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号５６および５７の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ラベツズマブ（Ｌａｂ））、ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号５０および５１の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ＳＡＲ）、ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号５４および５５の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（Ｔ８６．６６）、ならびにＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号５２および５３の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ＣＨ１Ａ１Ａ）からなる群から選択される抗ＣＥＡ抗体と競合する。図１および実施例５ｃ）も参照されたい。

本発明による二特異性抗体におけるＣＥＡ ＶＬまたはＣＬ領域として有用であり、かつ組換えＣＥＡへの結合についてＭＥＤＩと競合する抗体についての例は、抗ＣＥＡ抗体ＡＢ１、およびＡＢ１のリード最適化によって得られる抗体である（実験方法について、実施例１１を参照されたい）。抗ＣＥＡ抗体のＡＢ１３、１４、１５、１７、２０、５４、６０、６６、７１、７２、７３、ならびにそれぞれの二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体のＡＢ１３Ｌ３－１、ＡＢ１４Ｌ３－１、ＡＢ１５Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ２０Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１およびＡＢ７３Ｌ３－１は、抗体のＡＢ１のそれぞれのＡＢ１Ｌ３－１と同じ様式で競合している。本発明による二特異性抗体におけるＣＥＡ ＶＬまたはＣＬ領域として有用であり、かつ組換えＣＥＡへの結合についてＳＭ３Ｅと競合する抗体についての例は、抗ＣＥＡ抗体ＡＢ８、および縮重オリゴヌクレオチドを使用するＡＢ８のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって得られる抗体である。本発明による二特異性抗体におけるＣＥＡ ＶＬまたはＣＬ領域として有用であり、かつ組換えＣＥＡへの結合についてＴ８４．６６と競合する抗体についての例は、抗ＣＥＡ抗体１Ｂ４、および縮重オリゴヌクレオチドを使用する１Ｂ４のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって得られる抗体である。

本発明による二特異性抗体におけるＣＥＡ ＶＬまたはＣＬ領域として有用であるが、組換えＣＥＡへの結合について参照抗体のいずれとも競合しない抗体についての例は、抗ＣＥＡ抗体Ｃ１１、および縮重オリゴヌクレオチドを使用するＣ１１のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって得られる抗体である。

ＡＢ１は、それぞれ、配列番号８０および７８に示される核酸配列によってコードされる、配列番号４３のＨＣおよび配列番号４０のカッパＬＣを有する抗ＣＥＡ抗体である。

ＡＢ８は、それぞれ、配列番号８０および７９に示される核酸配列によってコードされる、配列番号４３のＨＣおよび配列番号４２のラムダＬＣを有する抗ＣＥＡ抗体である。

１Ｂ４は、それぞれ、配列番号８０および７７に示される核酸配列によってコードされる、配列番号４３のＨＣおよび配列番号７４のラムダＬＣを有する抗ＣＥＡ抗体である。

Ｃ１１は、それぞれ、配列番号８０および７６に示される核酸配列によってコードされる、配列番号４３のＨＣおよび配列番号７３のカッパＬＣを有する抗ＣＥＡ抗体である。

カッパ軽鎖として有用なＣＥＡ軽鎖は、配列番号４０のものである。カッパ軽鎖として有用なＣＥＡ軽鎖は、配列番号７３のものである。ラムダ軽鎖として有用なＣＥＡ軽鎖は、配列番号７４のものである。ハイブリッドカッパ軽鎖として有用なＣＥＡ軽鎖は、配列番号７５のものである。

一実施形態では、二特異性抗体は、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中に、活性化しているＦｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低減する、最大で３つのアミノ酸置換を含み、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ならびにＰ３２９Ａ、Ｐ３２９ＧおよびＰ３２９Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群から選択されるＰ３２９の置換である。一実施形態では、本発明による抗体の共通重鎖は、配列番号４３、４４または４５のものである。一実施形態では、本発明による抗体の共通重鎖は、配列番号４５（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ）のものである。

一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）０．５ｎＭ～５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞に結合すること、ｂ１）ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号４８および４９の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ＭＥＤＩ）と競合すること、またはｂ２）ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号４６および４７の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ＳＭ３Ｅ）と競合すること、またはｂ３）ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号５４および５５の配列のＶＬおよびＣＨを含む抗ＣＥＡ抗体（Ｔ８４．６６）と競合すること、またはｂ４）ツール抗体（ツール抗体について、実施例５ｃを参照されたい）のいずれとも競合しないこと、ｃ）Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中に、活性化しているＦｃ受容体への結合および／もしくはエフェクター機能を低減するアミノ酸置換を含むことであって、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、ならびにＰ３２９Ａ、Ｐ３２９ＧおよびＰ３２９Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群から選択されるＰ３２９の置換である、こと、ｄ）０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩおよび／またはＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅することの群から選択される１つまたは複数の特性を示す。

一実施形態では、二特異性抗体は、
ａ）０．５ｎＭ～５０ｎＭのＥＣ５０値で、ＭＫＮ－４５細胞に結合すること、
ｂ）０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩまたはＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅すること、
ｃ）ＣＥＡＣＡＭ５を発現するＰＥＡＫ細胞に結合するが、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫ細胞と交差反応しないこと、
ｄ）ＴＤＣＣアッセイ（実施例８）における殺滅ＥＣ５０が、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を標的細胞として使用する場合に、１μｇ／ｍＬのｓＣＥＡの存在下で、５倍を超えて増加しないこと、
ｅ）対照群（ビヒクルのみ）と比較して、２５％またはそれよりも大きく、ＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおける腫瘍成長を阻害すること、
ｆ）ＶＬおよびＶＨドメインとして、配列番号４８および４９の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体（ＭＥＤＩ）と競合すること、ならびに
ｇ）Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中に、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含むこと
の群から選択される１つまたは複数の特性を示す。

一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）～ｄ）の特性を示す。一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）～ｆ）のすべて特性を示す。一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）～ｄ）およびｇ）の特性を示す。一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）～ｄ）およびｆ）およびｇ）の特性を示す。一実施形態では、二特異性抗体は、ａ）～ｇ）のすべての特性を示す。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖（ｃＨＣ）を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、
ｉ）カッパ軽鎖定常領域（ＣＬ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、配列番号３２のＣＤＲＬ１、配列番号３３のＣＤＲＬ２および配列番号３４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、または縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３１から得られる軽鎖可変領域
を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）第２の結合部分が、ラムダ軽鎖定常領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む重鎖を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ＣＤＲとして、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３２から得られ、かつ最大で４つのアミノ酸置換を含むＣＤＲＬ１、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３３から得られ、かつ最大で４つのアミノ酸置換を含むＣＤＲＬ２、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３４から得られ、かつ最大で４つのアミノ酸置換を含むＣＤＲＬ３を含む、軽鎖可変領域ＶＬを含み、
ｃ）第２の結合部分が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする。

そのような二特異性抗体は、限定されるものではないが、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体のＡＢ１３Ｌ３－１、ＡＢ１４Ｌ３－１、ＡＢ１５Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ２０Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１およびＡＢ７３Ｌ３－１である。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域ＶＨを含み、
ｂ）第１の結合部分が、軽鎖可変領域として、
ｂ１）配列番号３２のＣＤＲＬ１、配列番号３３のＣＤＲＬ２および配列番号３４のＣＤＲＬ３、
ｂ２）配列番号８１のＣＤＲＬ１、配列番号８２のＣＤＲＬ２および配列番号８３のＣＤＲＬ３、
ｂ３）配列番号８４のＣＤＲＬ１、配列番号８５のＣＤＲＬ２および配列番号８６のＣＤＲＬ３、
ｂ４）配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２および配列番号８９のＣＤＲＬ３、
ｂ５）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ｂ６）配列番号９３のＣＤＲＬ１、配列番号９４のＣＤＲＬ２および配列番号９５のＣＤＲＬ３、
ｂ７）配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３、
ｂ８）配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３、
ｂ９）配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３、
ｂ１０）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、
ｂ１１）配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９のＣＤＲＬ２および配列番号１１０のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ１２）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、ならびに配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域ＶＨを含み、
ｂ）第１の結合部分が、軽鎖可変領域として、
ｂ１）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ｂ２）配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３、
ｂ３）配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３、
ｂ４）配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３、
ｂ５）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ６）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、ならびに配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域ＶＨを含み、
ｂ）第１の結合部分が、軽鎖可変領域として、
ｂ１）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ｂ２）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ３）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、ならびに配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬを含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、本発明は、
ａ）第１の結合部分中に、配列番号１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）ｂ１）配列番号３１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、ならびに配列番号３２のＣＤＲＬ１、配列番号３３のＣＤＲＬ２および配列番号３４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１４と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、ならびに配列番号８１のＣＤＲＬ１、配列番号８２のＣＤＲＬ２および配列番号８３のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１１５と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号８４のＣＤＲＬ１、配列番号８５のＣＤＲＬ２および配列番号８６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１１６と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２および配列番号８９のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１１７と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ６）配列番号１１８と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９３のＣＤＲＬ１、配列番号９４のＣＤＲＬ２および配列番号９５のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ７）配列番号１１９と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ８）配列番号１２０と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ９）配列番号１２１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１０）配列番号１２２と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１１）配列番号１２３と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９のＣＤＲＬ２および配列番号１１０のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｂ１２）配列番号１２４と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、
ｃ）第２の結合部分に、配列番号１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、ならびに配列番号１７と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、
ａ）第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、ならびに
ｂ）ｂ１）配列番号３１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１４の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１１５の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１１６の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ６）配列番号１１８の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ７）配列番号１１９の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ８）配列番号１２０の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ９）配列番号１２１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１０）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１１）配列番号１２３の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ１２）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、
ａ）第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、ならびに
ｂ）ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１９の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１２０の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１２１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ６）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、
ａ）第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、ならびに
ｂ）ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ３）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分中に、
ａ）配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、ならびに
ｂ）ｂ１）配列番号４０の軽鎖、
ｂ２）配列番号１２５の軽鎖、
ｂ３）配列番号１２６の軽鎖、
ｂ４）配列番号１２７の軽鎖、
ｂ５）配列番号１２８の軽鎖、
ｂ６）配列番号１２９の軽鎖、
ｂ７）配列番号１３０の軽鎖、
ｂ８）配列番号１３１の軽鎖、
ｂ９）配列番号１３２の軽鎖、
ｂ１０）配列番号１３３の軽鎖、および
ｂ１１）配列番号１３４の軽鎖、および
ｂ１２）配列番号１３５の軽鎖
からなる群から選択される軽鎖、ならびに、
ｃ）第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号２８の軽鎖
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明は、第１の結合部分中に、
ａ）ａ１）配列番号４３の重鎖、
ａ２）配列番号４４の重鎖、または
ａ３）配列番号４５の重鎖
からなる群から選択される共通重鎖、および
ｂ）ｂ１）配列番号４０の軽鎖、
ｂ２）配列番号１２５の軽鎖、
ｂ３）配列番号１２６の軽鎖、
ｂ４）配列番号１２７の軽鎖、
ｂ５）配列番号１２８の軽鎖、
ｂ６）配列番号１２９の軽鎖、
ｂ７）配列番号１３０の軽鎖、
ｂ８）配列番号１３１の軽鎖、
ｂ９）配列番号１３２の軽鎖、
ｂ１０）配列番号１３３の軽鎖、
ｂ１１）配列番号１３４の軽鎖、または
ｂ１２）配列番号１３５の軽鎖
からなる群から選択される軽鎖、および
ｃ）第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖
を含むことを特徴とする、本発明による二特異性抗体に関する。

一実施形態では、本発明による二特異性抗体（ＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ）は、配列番号４５の共通重鎖（／Ｎ）、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖（１Ａ４ ＬＣそれぞれＬ３－１）、および第１の結合部分中に、軽鎖として、配列番号１２８の軽鎖（ＡＢ１７）を含む。一実施形態では、本発明による二特異性抗体（ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ）は、配列番号４５の共通重鎖（／Ｎ）、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖（Ｌ３－１）、および第１の結合部分中に、軽鎖として、配列番号１３３の軽鎖（ＡＢ７１）を含む。一実施形態では、本発明による二特異性抗体（ＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎ）は、配列番号４５の共通重鎖（／Ｎ）、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖（Ｌ３－１）、および第１の結合部分中に、軽鎖として、配列番号１３５の軽鎖（ＡＢ７３）を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、
ｉ）ラムダ軽鎖定常領域（ＣＬ）、ならびに
ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、配列番号３６のＣＤＲＬ１、配列番号３７のＣＤＲＬ２および配列番号３８のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、または縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３５から得られる軽鎖可変領域
を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）第２の結合部分が、ハイブリッドカッパ鎖定常領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号６７、６８、６９、７０および７１からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、第２の結合部分は、軽鎖定常領域として、配列番号４１のラムダ軽鎖定常領域を含むことができ、その場合において、第１の結合部分は、一実施形態では、軽鎖定常領域として、配列番号５８のハイブリッドカッパ軽鎖領域を含む。一実施形態では、ハイブリッド軽鎖定常領域を持つアームは、限定されるものではないが、安定性および生産性を含む、ｂｓＡｂの全体的な特性に基づく。

一実施形態では、第１の結合部分の軽鎖可変領域は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３５から得られ共通重鎖は、配列番号４５のものであり、共通重鎖の可変領域は、配列番号１のものである。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、
ｉ）カッパ軽鎖定常領域（ＣＬ）、ならびに
ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、配列番号６４のＣＤＲＬ１、配列番号６５のＣＤＲＬ２および配列番号６６のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号６３から得られる軽鎖可変領域
を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）第２の結合部分が、ラムダ軽鎖定常領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択される軽鎖を含む。

本発明の一実施形態では、第１の結合部分の軽鎖可変領域は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号６３から得られ、共通重鎖は、配列番号４５のものである。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ラムダ軽鎖定常領域（ＣＬ）、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、配列番号６０のＣＤＲＬ１、配列番号６１のＣＤＲＬ２および配列番号６２のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、または縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号５９から得られる軽鎖可変領域、
ｃ）第２の結合部分が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）第２の結合部分が、ハイブリッドカッパ鎖定常領域を含む
ことを特徴とする。

本発明のさらなる一実施形態では、第２の結合部分は、軽鎖定常領域として、配列番号４１のラムダ軽鎖定常領域（ａ ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｃｈａｉｎ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、その場合において、第１の結合部分は、一実施形態では、軽鎖定常領域として、配列番号５８のハイブリッドカッパ軽鎖定常領域を含む。ハイブリッド軽鎖定常領域を持つアームの選択は、限定されるものではないが、安定性および生産性を含む、最終ｂｓＡｂの全体的な特性に基づく。

一実施形態では、第１の結合部分の軽鎖可変領域は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号５９から得られる。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ヒトカッパ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、０、１、２、３または４個のアミノ酸の置換を有する配列番号３２のＣＤＲＬ１、０、１、２、３または４個のアミノ酸の置換を有する配列番号３３のＣＤＲＬ２、および０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号３４のＣＤＲＬ３を含む、ヒトカッパ型の軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ヒトラムダ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ヒトラムダ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号３６のＣＤＲＬ１、０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号３７のＣＤＲＬ２、および０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号３８のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ハイブリッドカッパ軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号６７、６８、６９、７０および７１からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ヒトラムダ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、０、１、２、３または４個のアミノ酸の置換を有する配列番号６０のＣＤＲＬ１、０、１、２、３または４個のアミノ酸の置換を有する配列番号６１のＣＤＲＬ２、および０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号６２のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ヒトカッパ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号６７、６８、６９、７０および７１からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）第１の結合部分および第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、共通重鎖を含み、可変領域として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として含む、可変領域を含み、
ｂ）第１の結合部分が、ヒトカッパ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号６４のＣＤＲＬ１、０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号６５のＣＤＲＬ２、および０、１、２、３、４または５個のアミノ酸の置換を有する配列番号６６のＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む、ヒトカッパ型の軽鎖可変領域を含み、
ｃ）第２の結合部分が、ヒトラムダ型の軽鎖定常領域、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として、
Ｉ）配列番号６のＣＤＲＬ１、配列番号７のＣＤＲＬ２および配列番号８のＣＤＲＬ３、
ＩＩ）配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２および配列番号１２のＣＤＲＬ３、
ＩＩＩ）配列番号１４のＣＤＲＬ１、配列番号１５のＣＤＲＬ２および配列番号１６のＣＤＲＬ３、
ＩＶ）配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３、ならびに
Ｖ）配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２および配列番号２４のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲの群を含む、ヒトラムダ型の軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする。

一実施形態では、ｃ）における第２の結合部分は、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択される軽鎖を含む。

一実施形態では、二特異性抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含み、
ａ）第１の結合部分は、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
ｂ）第１の結合部分は、ＣＤＲＬ１が、配列番号１３６のコンセンサス配列を有し、ＣＤＲＬ２が、配列番号１３７のコンセンサス配列を有し、ＣＤＲＬ３が、配列番号１３８のコンセンサス配列を有するＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ｃ）第２の結合部分は、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含むＶＨを含む。

一実施形態では、第１の結合部分は、可変軽鎖フレームワーク配列として、配列番号３１のフレームワーク配列を含む。一実施形態では、第１の結合部分は、可変軽鎖フレームワーク配列として、配列番号３５のフレームワーク配列を含む。一実施形態では、第１の結合部分は、可変軽鎖フレームワーク配列として、配列番号５９のフレームワーク配列を含む。一実施形態では、第１の結合部分は、可変軽鎖フレームワーク配列として、配列番号６３のフレームワーク配列を含む。

一実施形態では、ＣＥＡに特異的に結合する第１の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖可変領域、および軽鎖可変領域として、配列番号３１または配列番号３５、配列番号５９または配列番号６３の群から選択されるアミノ酸配列と９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的に結合する第２の結合部分は、重鎖可変領域として、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖可変領域、ならびに軽鎖可変領域として、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む。

一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、カッパ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含むＣＥＡに特異的な第１の結合部分、ならびにラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含むＣＤ３εに特異的な第２の結合部分を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含むＣＥＡに特異的な第１の結合部分、ならびにラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含むＣＤ３εに特異的な第２の結合部分を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、ラムダ軽鎖可変ドメインおよびラムダ軽鎖定常ドメインを含むＣＥＡに特異的な第１の結合部分、ならびにラムダ軽鎖可変ドメインおよびカッパ軽鎖定常ドメインを含むＣＤ３εに特異的な第２の結合部分を含むことを特徴とする。

特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ネイティブ／野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減された結合親和性および／または低減されたエフェクター機能を示す。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減された結合親和性および／または低減されたエフェクター機能を有するように操作される。一実施形態では、Ｆｃドメインは、１つもしくは複数のＦｃ受容体への結合を低減し、および／またはエフェクター機能を低減する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、そのような１つまたは複数の置換は、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の喪失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５からなる群から選択される（Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ． Ｌ．，ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１） ６５９１－６６０４；Ｌｕｎｄ， Ｊ．，ら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９ （１９９５） １１５－１１９；Ｍｏｒｇａｎ， Ａ．， ら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６ （１９９５） ３１９－３２４；欧州特許出願第０３０７４３４号）。一実施形態では、抗体は、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５に変異を有するＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスのＦｃＲ結合に関わるか、ならびに／あるいはＰＶＡ２３６変異を含有する。一実施形態では、Ｆｃドメイン中の変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である。別の実施形態では、Ｆｃドメイン中の変異は、ＩｇＧ４ではＳ２２８Ｐに、ならびにＩｇＧ１ではＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａにある。一実施形態では、１つもしくは複数のＦｃ受容体への結合を低減し、および／またはエフェクター機能を低減する、Ｆｃドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）の群から選択される１つまたは複数の位置においてである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、Ｆｃ受容体への結合を低減し、および／またはエフェクター機能を低減する、２つのアミノ酸置換を含み、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）である。特定の実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、Ｆｃ受容体への結合を低減し、および／またはエフェクター機能を低減する、３つのアミノ酸置換を含み、ここで、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）である。そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４サブクラスのものであり、一実施形態では、Ｓ２２８Ｐの変異を有するＩｇＧ４サブクラスのものである。

一実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化しているＦｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡである。一実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）であるが、ＡＤＣＣのみに限定されない。

本発明の実施形態は、配列番号４３、４４または４５の共通重鎖、および第１の結合部分におけるＣＬ領域として配列番号４１のラムダＣＬ領域を含む、二特異性抗体の構築における第２の結合部分におけるＣＬ領域としての使用のための配列番号５８のカッパＣＬ領域である。

本発明の実施形態は、配列番号４３、４４または４５の共通重鎖、およびＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分におけるＣＬ領域として配列番号４１のラムダＣＬ領域を含む、本発明による二特異性抗体の構築におけるＣＤ３に特異的に結合する第２の結合部分におけるＣＬ領域としての使用のための配列番号５８のカッパＣＬ領域である。

本発明の実施形態は、配列番号４３、４４または４５の共通重鎖、配列番号５、９、１３、１７または２１の可変軽鎖、およびＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分におけるＣＬ領域として配列番号４１のラムダＣＬ領域を含む、本発明による二特異性抗体の構築におけるＣＤ３に特異的に結合する第２の結合部分におけるＣＬ領域としての使用のための配列番号５８のカッパＣＬ領域である。

本発明のさらなる実施形態は、配列番号３１、３５、５９および６３のそれぞれの軽鎖可変領域の縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発による抗体の親和性成熟における使用のための配列番号７６、７７、７８および７９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドである。

別の態様では、本発明の二特異性を生成する方法であって、ａ）本発明の宿主細胞を、二特異性抗体の発現のために好適な条件下で培養するステップ、およびｂ）二特異性抗体を回収するステップを含む方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって生成する二特異性抗体も包含する。

本発明は、本発明の二特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明の二特異性抗体および医薬組成物を使用する方法も本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の二特異性抗体または医薬組成物を提供する。一態様では、それを必要とする個体における疾患の処置における使用のための本発明による二特異性抗体または医薬組成物が提供される。具体的な実施形態では、疾患は、がんである。

それを必要とする個体における疾患の処置のための医薬の製造における使用のための本発明の二特異性抗体、および個体における疾患を処置する方法であって、前記個体に、薬学的に許容される形態で、本発明による二特異性抗体を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法も提供される。具体的な実施形態では、疾患は、がんである。上記の実施形態のいずれかでは、個体は、好ましくは、哺乳動物、特に、ヒトである。

本発明は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法であって、Ｔ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下、標的細胞を本発明の二特異性抗体と接触させることを含む、方法も提供する。

本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象を処置するための医薬の製造における使用のための本発明による二特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明による医薬の製造における使用のための本発明による二特異性抗体であって、がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、食道がん、胃／食道接合部がん、膵臓がんおよび乳がんからなる群から選択されることを特徴とする、本発明による二特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、抗ＣＤ４７抗体との同時、別々または逐次的組合せでの使用のための本発明による二特異性抗体である。一実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、マグロリマブ、ＡＬＸ１４８もしくはＴＴＩ－６２１および／またはＴＴＩ－６２２である。

本発明のさらなる実施形態は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象の処置における、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第３の結合部分およびヒトＣＤ４７に特異的に結合する第４の結合部分を含む第２の二特異性抗体との同時、別々または逐次的組合せでの使用のための本発明による二特異性抗体である。

そのような第２の二特異性ＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号および米国出願第１６／４２８，３５９号に記載されている。

本発明のさらなる実施形態は、本発明による使用のための本発明による二特異性抗体であって、本発明による二特異性抗体および第２の二特異性ＣＥＡｘＣＤ４７抗体が、前記対象に、そのような間隔に限定されないが、６～１５日の間隔で交互に投与されることを特徴とする、本発明による使用のための本発明による二特異性抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明によるがんの処置における使用のための本発明によるヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の結合部分を含む本発明による第１の二特異性抗体ならびに第２の二特異性抗体ＣＥＡｘＣＤ４７であって、前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がんおよび乳がんであることを特徴とする、本発明による第１の二特異性抗体ならびに第２の二特異性抗体ＣＥＡｘＣＤ４７である。

本発明のさらなる実施形態は、本発明による二特異性抗体を含む組成物であって、ＣＥＡを発現するがんを有する対象の処置における使用のための上記に定義された前記第２のＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体と競合しないことを特徴とする、組成物である。

本発明のさらなる実施形態は、腫瘍（がん）、特に、固形腫瘍、特に、ＣＥＡを発現する固形がん、特に、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がんおよび乳がんを有すると診断されたヒト患者の処置のための方法であって、有効量の、本発明による二特異性抗体、ならびにＣＥＡおよびＣＤ４７に対する国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号および米国出願第１６／４２８，３５９号に記載される第２の二特異性抗体を、ヒト患者に投与することを含み、方法が、その後、
患者に、０．１～３０ｍｇ／ｋｇの用量、さらなる実施形態では、０．５～１０ｍｇ／ｋｇの用量、さらなる実施形態では、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量の前記第２の抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体を、例えば、４～１２週間にわたって毎週投与すること、
患者に、前記第２の抗体を、ｑ１、ｑ２ｗ、ｑ３ｗ、または必要に応じて、ｑ４ｗで投与すること、
これらの４～１２週間後および前記抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の追加の２または３または４の排泄半減期後に、患者に、０．１～１０ｍｇ／ｋｇの用量の本発明による抗体を投与すること、
患者に、本発明による前記抗体を、ｑ１、ｑ２ｗ、ｑ３ｗ、または必要に応じて、ｑ４ｗで投与すること、
本発明による前記抗体の２または３または４の排泄半減期を待つこと、ならびに、次いで必要に応じて、ＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体の投与と、それに続くＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体の投与の前記サイクルを繰り返すこと、ならびに必要に応じて、このサイクルを再び繰り返すこと
を含む、方法である。

この「交互」方法は、本発明の抗体および第２の二特異性抗体が、ＣＥＡへの結合に関して競合する場合に適用される。

本発明による前記ＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体およびＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体が競合的ではない場合では、２つの二特異性抗体は、例えば、患者への、およそ同時での、０．１～３０ｍｇ／ｋｇの用量、さらなる実施形態では、０．５～１０ｍｇ／ｋｇの用量、さらなる実施形態では、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体、および０．１～１０ｍｇ／ｋｇの本発明のＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体の投与、それに続いて、例えば、ｑ１ｗもしくはｑ２ｗもしくはｑ３ｗ、または必要に応じて、ｑ４ｗの頻度での１つまたは複数のこれらの組合せ投与による、患者が並行して両方の二特異性抗体の治療的に有効な血漿および組織濃度を経験する様式（「同時様式」）で投与することもできる。

「ｑ１ｗ」という用語は、週に１回の投与を意味し、ｑ２ｗは、２週間ごとの投与を意味するなどである。

本発明のさらなる実施形態は、本発明による抗体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる好ましい実施形態は、医薬としての使用のための本発明による抗体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる好ましい実施形態は、ＣＥＡを発現する固形腫瘍障害の処置における医薬としての使用のための本発明による抗体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる好ましい実施形態は、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、食道がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における医薬としての使用のための本発明による抗体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる実施形態は、がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がんまたは乳がんであることを特徴とする、本発明による組成物である。

本発明のさらなる実施形態は、医薬組成物の製造における使用のための本発明による抗体である。

本発明のさらなる実施形態は、医薬組成物の製造における使用のための本発明による抗体および薬学的に許容される賦形剤または担体である。

本発明のさらなる実施形態は、固形腫瘍障害の処置における医薬の製造における使用のための本発明による抗体の実施形態である。

本発明のさらなる実施形態は、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、食道がん、膵臓がんまたは乳がんの処置における使用のための本発明による抗体の実施形態である。

本発明の別の態様は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、腫瘍細胞を上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体と接触させることを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん細胞、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん細胞、食道がん細胞、膵臓がん細胞または乳がん細胞である。

一実施形態では、細胞溶解は、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）によって誘導される。

本発明の別の態様は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象を処置する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体を投与することを含む、方法を提供する。

本発明の別の態様は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象を処置する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体を、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ４７に結合する二特異性抗体と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。ＣＥＡｘＣＤ４７抗体およびＣＥＡｘＣＤ３抗体が競合している場合、それらは、腫瘍細胞の表面上のＣＥＡ受容体について競合し、それぞれの組合せパートナーについての受容体占有および有効性は、それらの結合親和性およびそれらの血漿濃度に依存し、したがって、予測することは困難であり、また、２つの薬物の濃度がそれぞれ身体からのクリアランスの異なる排泄半減期を有する場合に、経時的に変動する。したがって、競合するＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体は、逐次的に（交互に）与えられなければならない。ＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体が競合していないか、または最小限、競合しているだけである場合、それらは、逐次的に与えられ得るだけでなく、並行して（同時に）与えられ得、これは、ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体によるＴ細胞の関与を介し、かつ同時のＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体によるマクロファージの関与を介する腫瘍細胞殺滅が、相加的であると予想されるか、またはさらに相乗的である場合があり、これは、有効性が、両方の薬物が並行して与えられる場合に増加することを意味するので、十分に有利であり得る。

本発明の別の態様は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象における無増悪生存期間および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がん、乳がん、頭頸部癌、子宮がん、膀胱がんまたは別のＣＥＡを発現するがんである。

これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、対象は、結腸直腸がん、または肺がん、または胃がん、食道がん、または膵臓がん、または乳がん、または別のＣＥＡを発現するがんを患っている患者である。

これらの方法のある特定の実施形態では、本発明の二特異性抗体は、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される。ある特定の実施形態では、本発明の二特異性抗体は、患者に、１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。

本発明の別の態様は、ＣＥＡを発現するがんを有する対象を処置する方法であって、方法が、対象に、治療有効量の上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体を、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ４７に対する二特異性抗体と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体と組み合わせて投与される。これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、本発明の抗体との交互のパターンで、本発明の抗体および二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の投与の間が６～１５日の間隔で投与される。ある特定の実施形態では、抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される。

これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、ＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて投与される。これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体およびＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１軸アンタゴニストは、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される。

本発明の別の態様は、ＣＥＡを異常に発現するがんを有する対象における無増悪生存期間および／または全生存期間を増加させる方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の上記に記載される実施形態のいずれかの二特異性抗体を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がんまたは乳がんである。

これらの方法のある特定の実施形態では、二特異性抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、対象は、結腸直腸がん、または肺がん、または胃がん、食道がん、または膵臓がん、または乳がん、または別のＣＥＡを発現するがんを有するがん患者である。

本発明の別の実施形態は、上記に記載される処置の方法のいずれかにおける使用のための本発明による二特異性抗体を提供する。一実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、食道がん、膵臓がんおよび乳がんからなる群から選択される。

本発明の別の実施形態は、ＣＥＡＣＡＭ５またはＣＤ３εに免疫特異的に結合する本明細書に開示される二特異性抗体またはそのドメイン（例えば、可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域）をコードするポリヌクレオチドを提供する。ある特定の態様では、本明細書に記載される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のＶＨまたは重鎖ＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のＶＬまたは軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

ある特定の実施形態は、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。ある特定の他の実施形態は、本明細書に開示される二特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養におけるヒト細胞からなる群から選択される。

ある特定の実施形態は、本明細書に開示される抗体を作製する方法である。一部の実施形態では、抗体を作製する方法は、本明細書に開示される二特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を使用して、抗体を発現させることを含む。一部の実施形態では、抗体を作製する方法は、本明細書に開示される二特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含有する細胞を培養すること、およびそこで発現した抗体を単離することを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、
ａ）前記第１の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
ｂ）前記第１の結合部分が、
ｂ１）配列番号３２のＣＤＲＬ１、配列番号３３のＣＤＲＬ２および配列番号３４のＣＤＲＬ３、
ｂ２）配列番号８１のＣＤＲＬ１、配列番号８２のＣＤＲＬ２および配列番号８３のＣＤＲＬ３、
ｂ３）配列番号８４のＣＤＲＬ１、配列番号８５のＣＤＲＬ２および配列番号８６のＣＤＲＬ３、
ｂ４）配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２および配列番号８９のＣＤＲＬ３、
ｂ５）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ｂ６）配列番号９３のＣＤＲＬ１、配列番号９４のＣＤＲＬ２および配列番号９５のＣＤＲＬ３、
ｂ７）配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３、
ｂ８）配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３、
ｂ９）配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３、
ｂ１０）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、
ｂ１１）配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９のＣＤＲＬ２および配列番号１１０のＣＤＲＬ３、ならびに
ｂ１２）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ｃ）前記第２の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含むＶＨを含み、
ｄ）前記第２の結合部分が、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含むＶＬを含む、
二特異性抗体。
（項目２）
前記第１の結合部分が、
ａ１）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ａ２）配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３、
ａ３）配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３、
ａ４）配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３、
ａ５）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、ならびに
ａ６）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載の二特異性抗体。
（項目３）
前記第１の結合部分が、
ａ１）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
ａ２）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、ならびに
ａ３）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の二特異性抗体。
（項目４）
ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）前記第１の結合部分中に、
ｂ１）配列番号３１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１４の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１１５の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１１６の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ６）配列番号１１８の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ７）配列番号１１９の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ８）配列番号１２０の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ９）配列番号１２１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１０）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１１）配列番号１２３の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ１２）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、項目１に記載の二特異性抗体。
（項目５）
ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）前記第１の結合部分中に、
ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１９の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１２０の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１２１の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ６）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、項目２に記載の二特異性抗体。
（項目６）
ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）前記第１の結合部分中に、
ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、および
ｂ４）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、項目３に記載の二特異性抗体。
（項目７）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、
ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）前記第１の結合部分中に、
ｂ１）配列番号４０の軽鎖、
ｂ２）配列番号１２５の軽鎖、
ｂ３）配列番号１２６の軽鎖、
ｂ４）配列番号１２７の軽鎖、
ｂ５）配列番号１２８の軽鎖、
ｂ６）配列番号１２９の軽鎖、
ｂ７）配列番号１３０の軽鎖、
ｂ８）配列番号１３１の軽鎖、
ｂ９）配列番号１３２の軽鎖、
ｂ１０）配列番号１３３の軽鎖、
ｂ１１）配列番号１３４の軽鎖、および
ｂ１２）配列番号１３５の軽鎖
からなる群から選択される軽鎖、ならびに、
ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号２８の軽鎖を含む、二特異性抗体。
（項目８）
ａ）配列番号４３の重鎖、
ｂ）配列番号４４の重鎖、および
ｃ）配列番号４５の重鎖
からなる群から選択される共通重鎖を含むことを特徴とする、項目１～７のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目９）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１２８の軽鎖を含む、二特異性抗体。
（項目１０）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１３３の軽鎖を含む、二特異性抗体。
（項目１１）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１３５の軽鎖を含む、二特異性抗体。
（項目１２）
がんの処置における使用のための二特異性抗体であって、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含むことを特徴とし、
ａ）０．５ｎＭ～５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞に結合すること、
ｂ）０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩまたはＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅すること、
ｃ）ＣＥＡＣＡＭ５を発現するＰＥＡＫ細胞に結合するが、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫ細胞と交差反応しないこと、
ｄ）標的細胞としてＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を使用するＴＤＣＣアッセイにおける殺滅についてのＥＣ５０値が、１μｇ／ｍＬのｓＣＥＡの存在下で、５倍を超えて増加しないことを特徴とする、二特異性抗体。
（項目１３）
前記抗体が、
ａ）ビヒクル対照群と比較して、２５％またはそれよりも大きく、ＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおける腫瘍成長を阻害し、
ｂ）ＶＬおよびＶＨドメインとして、それぞれ、配列番号４８および４９のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体と競合する（ＭＥＤＩ）、
項目１２に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目１４）
Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、項目１２または１３に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目１５）
結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんおよび／または乳がんの処置における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１６）
ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１７）
がんを患っているヒト対象への、本発明の二特異性抗体を含有する薬学的有効量の組成物の投与に使用するための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１８）
結腸直腸癌、食道がん、膵臓腺癌、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部癌、子宮がんおよび膀胱がんの処置における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１９）
ＣＥＡを発現する固形腫瘍の処置のための単剤療法における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目２０）
同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体と組み合わせたがんの処置における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目２１）
同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体および／またはＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせたがんの処置における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目２２）
同時、別々または逐次的組合せで、ＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせたがんの処置における使用のための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目２３）
がんの処置における本発明の抗体および二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の投与の間が６～１５日の間隔の交互投与において投与に使用するための、項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体および二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体。
（項目２４）
本発明の抗体が、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、項目１５～２３のいずれか一項に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目２５）
本発明の抗体が、患者に、１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与されることを特徴とする、項目２３に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目２６）
前記抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体が、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与されることを特徴とする、項目２０または２１のいずれか一項に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目２７）
前記ＰＤ－１軸アンタゴニストが、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、項目２２に記載の使用のための二特異性抗体。
（項目２８）
項目１～１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目２９）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、
ａ）前記第１の結合部分および前記第２の結合部分が、それぞれ、重鎖として、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む可変領域を含む共通重鎖を含み、
ｂ）前記第１の結合部分が、
ｉ）ラムダ軽鎖定常領域、ならびに
ｉｉ）縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３２から得られるＣＤＲＬ１、縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３３から得られるＣＤＲＬ２、および縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって配列番号３４から得られるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域
を含み、
ｃ）前記第２の結合部分が、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）前記第２の結合部分が、配列番号４１の軽鎖定常領域を含む、
二特異性抗体。
（項目３０）
ｃ）における前記第２の結合部分が、配列番号２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択される軽鎖を含む、項目２９に記載の二特異性抗体。
（項目３１）
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、
ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、
ｂ）ｂ１）配列番号３１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、ならびに配列番号３２のＣＤＲＬ１、配列番号３３のＣＤＲＬ２および配列番号３４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ２）配列番号１１４と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、ならびに配列番号８１のＣＤＲＬ１、配列番号８２のＣＤＲＬ２および配列番号８３のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ３）配列番号１１５と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号８４のＣＤＲＬ１、配列番号８５のＣＤＲＬ２および配列番号８６のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ４）配列番号１１６と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号８７のＣＤＲＬ１、配列番号８８のＣＤＲＬ２および配列番号８９のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ５）配列番号１１７と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ６）配列番号１１８と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９３のＣＤＲＬ１、配列番号９４のＣＤＲＬ２および配列番号９５のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ７）配列番号１１９と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ８）配列番号１２０と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ９）配列番号１２１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１０）配列番号１２２と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、
ｂ１１）配列番号１２３と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９のＣＤＲＬ２および配列番号１１０のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
ｂ１２）配列番号１２４と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性、ならびに配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域ＶＬ
からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、
ｃ）前記第２の結合部分に、配列番号１と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域ＶＨ、ならびに配列番号１７と９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、二特異性抗体。
（項目３２）
前記共通重鎖が、配列番号４３のものである、項目２９～３１のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目３３）
前記共通重鎖が、配列番号４４のものである、項目２９～３１のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目３４）
前記共通重鎖が、配列番号４５のものである、項目２９～３１のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目３５）
がんを処置する方法であって、有効量の、項目１～１１もしくは２９～３４のいずれか一項に記載の二特異性抗体、または項目２８に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目３６）
前記二特異性抗体が、０．５ｎＭ～５０ｎＭのＥＣ５０値でＭＫＮ－４５細胞に結合する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記二特異性抗体が、０．０１～１０ｎＭのＥＣ５０値で、濃度依存性の様式で、ヒトＰＢＭＣを含有するアッセイにおいて、ＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩまたはＬＳ１７４Ｔ細胞を殺滅する、項目３５または３６に記載の方法。
（項目３８）
前記二特異性抗体が、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するＰＥＡＫ細胞に結合するが、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫ細胞と交差反応しない、項目３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
標的細胞としてＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を使用するＴＤＣＣアッセイにおける殺滅についての前記二特異性抗体のＥＣ５０値が、ｓＣＥＡの非存在下での前記ＥＣ５０と比べて、１μｇ／ｍＬのｓＣＥＡの存在下で、５倍を超えて増加しない、項目３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記二特異性抗体が、ビヒクル対照群と比較して、２５％またはそれよりも大きく、ＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおける腫瘍成長を阻害する、項目３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記二特異性抗体が、ＶＬおよびＶＨとして、配列番号４８および４９の配列のＶＬおよびＶＨを含む抗ＣＥＡ抗体と競合する、項目３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記二特異性抗体が、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けして、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニット中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａを含む、項目３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記対象が、ヒトである、項目３５～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胃がん、膵臓がんまたは乳がんを有する、項目３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が、癌を有する、項目３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記対象が、結腸直腸癌、食道がん、膵臓腺癌、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部癌、子宮がんまたは膀胱がんを有する、項目３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記二特異性抗体が、単剤療法として投与される、項目３５～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記二特異性抗体が、ＣＥＡを発現する固形腫瘍の処置として投与される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記二特異性抗体が、同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体と組み合わせて投与される、項目３５～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記二特異性抗体が、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体との交互の様式で、本発明の二特異性抗体および前記二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の投与の間が６～１５日の間隔で投与される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記二特異性抗体が、同時、別々または逐次的組合せで、ＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて投与される、項目３５～４６、４９または５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記二特異性抗体が、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、項目３５～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記二特異性抗体が、１～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目３５～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記二特異性抗体が、分割用量で投与される、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記二特異性抗体が、持続注入によって投与される、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５６）
前記二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体が、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、項目４９～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＰＤ－１軸アンタゴニストが、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、項目５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
項目１～３４のいずれか一項に記載の抗体またはその結合部分をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目５９）
項目５８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目６０）
項目５８に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは項目５９に記載のベクターを含む細胞。
（項目６１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養におけるヒト細胞からなる群から選択される、項目６０に記載の細胞。
（項目６２）
二特異性抗体を作製する方法であって、項目項目６０または６１に記載の細胞中で前記二特異性抗体を発現させることを含む、方法。
（項目６３）
二特異性抗体を作製する方法であって、項目６０または６１に記載の細胞を培養すること、およびそこで発現した前記抗体を単離することを含む、方法。

図１：カッパ／ラムダ（ＫＬ）ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体において使用される新たなＣＥＡバインダーのエピトープビニング（実施例５ｃに詳述する） 本発明の新たなＣＥＡ結合抗体の特性評価のために、競合的イムノアッセイを使用する。抗体であって、全てがＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）に結合し、結合エピトープが既に公開されている抗体に対して、競合的ブロッキングプロファイルを作出する。ＳＭ３Ｅ、ＭＥＤＩ（＝ＭＥＤＩ－５６５）、ＳＡＲ、Ｔ８４．６６、ラベツズマブおよびＣＨ１Ａ１Ａは、そのような抗体であり、これらの抗体およびアッセイの詳細について、実施例５ｃを参照されたい。

図２：精製された二特異性抗体のＡｇｉｌｅｎｔプロファイル 実施例６の表現において、新たなカッパラムダ二特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体の精製および分析を記載する。精製された二特異性抗体は、変性および還元条件下、電気泳動によって分析する。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用し、図は、本発明のカッパラムダ抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／Ｄ（配列番号２８のラムダＣＤ３ ＬＣおよび配列番号４０のカッパＣＥＡ ＬＣおよび配列番号４４の共通ＨＣを有するＫＬ ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体）およびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／Ｄ（配列番号７０のハイブリッドカッパＣＤ３ ＬＣおよび配列番号４２のラムダＣＥＡ ＬＣおよび配列番号４４の共通ＨＣを有するハイブリッドＫＬ ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体）について得られた典型的な結果を示す。Ｙ４ Ｌ３－１／Ｄは、ＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／Ｄと同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、二特異性抗体であり、この抗体は、対照抗体として、薬理学的アッセイにおいて頻繁に使用される。

図３：ＣＤ３^ＰＯＳＪｕｒｋａｔ細胞（およびＣＤ３^ＮＥＧＴＩＢ－１５３細胞）への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤのＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞への濃度依存性結合。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。Ｙ４Ｌ３－１／Ｄは、同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体である。右側の図は、１００ｎＭの二特異性抗体の濃度でも、ＣＤ３陰性細胞系のＴＩＢ－１５３への結合がないことを示す。

図４：ＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤのＣＥＡを発現するＭＫＮ－４５細胞への濃度依存性結合。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｄは、ＭＫＮ－４５細胞に結合しない。右側の図は、ＣＥＡＣＡＭ５のノックアウト後に、１００ｎＭの濃度でも、ＭＫＮ－４５細胞への結合がないことを示す。

図５：ＣＥＡ^ＰＯＳＬＳ１７４Ｔ細胞への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤのＣＥＡを発現するＬＳ １７４Ｔ細胞への濃度依存性結合。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｄは、ＬＳ １７４Ｔ細胞に結合しない。

図６：ＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）の殺滅 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤによるＭＫＮ－４５細胞の濃度依存性のＴ細胞再標的化殺滅／溶解（実施例８ａに記載されるアッセイ）。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じ殺滅効力を示す。これは、ＡＢ１ Ｌ３－１／ＤのＭＫＮ－４５への結合が、Ｌ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／Ｄの結合よりも非常に弱いので、驚くべきことである／予想外である（図４を参照されたい）。 同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｄは、およそ１００倍高い濃度で、非常に低い殺滅／溶解効力を示すにすぎない。 右側の図：３つの二特異性抗体のすべてによるＣＥＡノックアウトＭＫＮ－４５細胞のただ単に非常に低い非特異的殺滅／溶解。

図７：ＣＥＡ^ＰＯＳＬＳ－１７４Ｔの殺滅 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１ Ｌ３－１／ＤおよびＬ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤによるＬＳ－１７４Ｔ細胞の濃度依存性のＴ細胞再標的化殺滅／溶解（実施例８ａに記載されるアッセイ）。両方のＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。Ｌ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／Ｄは、ＡＢ１ Ｌ３－１／Ｄよりも強い殺滅効力を示す。Ｌ３－１ＡＢ８ Ｈ－ＣＫ５／ＤのＬＳ－１７４Ｔ細胞への結合は、ＡＢ１ Ｌ３－１／Ｄの結合よりも強力である（図５を参照されたい）。 同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｄは、１００倍よりも高い濃度で、非常に低い殺滅／溶解効力を示すにすぎない。

図８：モノクローナル抗ＣＥＡ ｍＡｂ １Ｂ４の異なる組換えタンパク質への結合（ＥＬＩＳＡ）。 ＣＥＡ ＥＣＤ＝ＣＥＡの細胞外ドメイン；ＣＥＡ Ａ３Ｂ３は、ＣＥＡのＡ３ Ｂ３ドメインである。組換えメソテリンＭＳＬＮを対照として使用して、非特異的結合（結合は、ＣＥＡのＥＣＤに、それぞれＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインに特異的でない）を測定する。

図９：モノクローナル抗ＣＥＡ ｍＡｂ Ｃ１１の異なる組換えタンパク質への結合（ＥＬＩＳＡ）。 ＣＥＡ ＥＣＤ＝ＣＥＡの細胞外ドメイン；ＣＥＡ Ａ３Ｂ３は、ＣＥＡのＡ３ Ｂ３ドメインである。組換えメソテリンＭＳＬＮを対照として使用して、非特異的結合（結合は、ＣＥＡのＥＣＤに、それぞれＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインに特異的でない）を測定する。

図１０：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ １抗体のＣＤ３^{Ｐ ＯＳ}Ｊｕｒｋａｔ細胞（およびＣＤ３^ＮＥＧＴＩＢ－１５３細胞）への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１３Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１５Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１７Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ２０Ｌ３－１／ＮのＣＤ３を発現するＨＵＴ－７８細胞への濃度依存性結合。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。ＡＢ１Ｌ３－１／Ｎは、リードの最適化によって上記で言及したｂｓＡｂがそれから得られる親のＫＬ二特異性抗体である。Ｙ４Ｌ３－１／Ｎは、同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体である。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。ｈＩｇＧ１は、アイソタイプ対照として使用される非結合性ヒトＩｇＧ１抗体に相当する。右側の図は、１００ｎＭの二特異性抗体の濃度でも、ＣＤ３陰性細胞系のＪＫＴβ－ｄｅｌへの結合がないことを示す。方法を、実施例７ｂに記載する。

図１１：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ １抗体のＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５細胞、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞およびＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＬ－１８８（商標））細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１３Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１５Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１７Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ２０Ｌ３－１／Ｎの、ＣＥＡ陽性のＭＫＮ－４５（Ａ）；ＨＰＡＦ－ＩＩ（Ｃ）およびＬＳ１７４Ｔ（Ｄ）、またはＣＥＡ陰性のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ（Ｂ）細胞への濃度依存性結合。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。ＡＢ１Ｌ３－１／Ｎは、親和性成熟によって上記で言及したｂｓＡｂがそれから得られる親のＫＬ二特異性抗体である。Ｙ４Ｌ３－１／Ｎは、同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体である。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。ｈＩｇＧ１は、アイソタイプ対照として使用される非結合性ヒトＩｇＧ１抗体に相当する。図１０Ｂは、１００ｎＭの二特異性抗体の濃度でも、ＣＥＡ陰性細胞系のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞への結合がないことを示す。１００ｎＭの濃度での本発明の抗体のＭＫＮ－４５および／またはＨＰＡＦ－ＩＩ細胞への結合は、ＴＣＢ２０１４の結合よりも４０％以上高い。実施例７ａに記載される方法。 同上。

図１２：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ １抗体によるＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩおよびＬＳ１７４Ｔ細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）の殺滅 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１３Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１５Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１７Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ２０Ｌ３－１／Ｎによる、ＣＥＡ陽性のＭＫＮ－４５（Ａ）；ＨＰＡＦ－ＩＩ（Ｃ）およびＬＳ１７４Ｔ（Ｄ）、またはＣＥＡ陰性のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ（Ｂ）細胞の濃度依存性のＴ細胞再標的化殺滅／溶解（実施例８ａに記載されるアッセイ）。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。すべてのＫＬ二特異性抗体は、リードの最適化によってそれらがそれから得られる親のＡＢ１Ｌ３－１／Ｎ抗体と比較して、改善された殺滅を示すが、ＣＥＡ陽性細胞が使用された場合（Ａ、Ｃ、Ｄ）、ＣＥＡノックアウトＭＫＮ－４５細胞（Ｂ）の非常に低い非特異的殺滅／溶解を示すにすぎない。同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｎは、試験された最大濃度で、非常に低い殺滅／溶解効力を示すにすぎない。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。本発明の二特異性抗体のＥＣ５０は、ＴＣＢ２０１４のＥＣ５０よりも低く、腫瘍細胞殺滅についての改善された効力を実証する。実施例８ａに記載される方法。 同上。

図１３：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ ２抗体のＣＤ３^ＰＯＳ初代Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）ならびにＣＤ３^ＮＥＧＢ細胞および単球への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎの、ＣＤ３陽性の初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ａ）および初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｂ）、またはＣＤ３陰性のＢ細胞（Ｃ）および単球（Ｄ）への細胞への濃度依存性結合。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持ち、ＣＤ３陽性Ｔ細胞集団に同様に結合する。同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｎは、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に、同様に良好に結合する。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。抗ヒトＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２（ａＣＤ４７ ｍＡｂ）を陽性対照として使用した（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球はＣＤ４７を発現する）。二次Ａｂは、検出抗体のみが細胞に添加された条件にのみ対応し、バックグラウンドシグナルを決定するのに役立つ（陰性対照）。すべての試験された抗体は、２００ｎＭの濃度でも、ＣＤ３陰性細胞集団への結合がないことを示す。 同上。

図１４：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ ２抗体のＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５細胞、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞およびＬＳ１７４Ｔ細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）への結合 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎの、ＣＥＡ陽性のＭＫＮ－４５（Ａ）；ＨＰＡＦ－ＩＩ（Ｃ）およびＬＳ１７４Ｔ（Ｄ）、またはＣＥＡ陰性のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ（Ｂ）細胞への濃度依存性結合。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。Ｙ４Ｌ３－１／Ｎは、同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体である。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。図１４Ｂは、２００ｎＭの二特異性抗体の濃度でも、ＣＥＡ陰性細胞系のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞への結合がないことを示す。図１４Ａについて、ＥＣ５０値を表４に報告する。２００ｎＭの濃度での本発明の二特異性抗体の結合は、ＴＣＢ２０１４の結合よりも４０％以上高い。 同上。

図１５：Ｌｅａｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｖｅ ２抗体によるＣＥＡ^ＰＯＳＭＫＮ－４５、ＨＰＡＦ－ＩＩおよびＬＳ１７４Ｔ細胞（およびＣＥＡ^ＮＥＧＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ細胞）の殺滅 本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎによる、ＣＥＡ陽性のＭＫＮ－４５（Ａ）；ＨＰＡＦ－ＩＩ（Ｃ）およびＬＳ１７４Ｔ（Ｄ）、またはＣＥＡ陰性のＭＫＮ－４５＿ｈＣＥＡ^ＫＯ（Ｂ）細胞の濃度依存性のＴ細胞再標的化殺滅／溶解（実施例８ａに記載されるアッセイ）。すべてのＫＬ二特異性抗体は、同じＣＤ３アームを持つ。同じＣＤ３アームを有するが、第２のアームがＣＥＡに結合しない、ＫＬ二特異性抗体のＹ４Ｌ３－１／Ｎは、試験された最大濃度で、非常に低い殺滅／溶解効力を示すにすぎない。ＴＣＢ ２０１４は、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７９号に記載される別のＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞二特異性抗体に相当し、これは、参照抗体として含めた。この参照抗体のＴＣＢ２０１４と比較して、本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎはすべて、より低いＥＣ５０値を、ＣＥＡ陽性標的細胞のそれぞれのより強力な殺滅（Ａ、Ｃ、Ｄ）を示すが、ＣＥＡノックアウトＭＫＮ－４５細胞の同等の低い非特異的殺滅／溶解を示す（Ｂ）。図１５Ａ、ＣおよびＤについて、ＥＣ５０値を表５に報告する。 同上。

図１６：ＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介殺滅後のサイトカインの分泌 ＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介殺滅後の本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎによって媒介されるパーフォリン（Ｂ）；グランザイムＢ（Ｃ）；ＩＦＮ－γ（Ｄ）；ＴＮＦ－α（Ｅ）；ＩＬ－２（Ｆ）；ＩＬ－６（Ｇ）；ＩＬ－１０（Ｈ）の分泌（Ｅ：Ｔ（ヒトＰＢＭＣ：腫瘍細胞）＝１０：１、４８時間のインキュベーション、特異性溶解を（Ａ）に示す）。実施例８ｅに記載される方法。 同上。

図１７：ＭＫＮ－４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介殺滅後のＴ細胞活性化 ＣＥＡ陽性ＭＫＮ－４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介殺滅の２日後の本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎによって媒介されるＣＤ２５（ＡおよびＢ）およびＣＤ６９（ＣおよびＤ）のヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の上方調節（図１６Ａに示す腫瘍細胞の殺滅／溶解）。

１００ｎＭでの統計的に異ならない腫瘍細胞溶解にもかかわらず、ＴＣＢ２０１４と比較して本発明の抗体のより少ないＴ細胞活性化は、同じ腫瘍溶解でのより低い副作用を示唆する。実施例８ｃに記載される方法。
同上。

図１８：ｈｕＰＢＭＣ移入を有するＮＯＧマウスのＨＰＡＦ－ＩＩモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性 ｈｕＰＢＭＣ移入を有するＮＯＧマウスのＨＰＡＦ－ＩＩ腫瘍細胞系モデルにおける本発明のＫＬ二特異性抗体のＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／ＮおよびＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎ、ならびにＴＣＢ２０１４のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性（すべて単回１０ｍｇ／ｋｇ注射）。マウスは、平均腫瘍体積が１５０ｍｍ^３に近くなった１１日目に無作為化した。結果は、異なる研究群において、キャリパーによって測定された８匹のマウスの腫瘍体積からの平均およびＳＥＭを示す。ＡＢ７３Ｌ３－１／ＮおよびＴＣＢ２０１４の間に統計学的差異は見出されなかった。実施例９ａに記載される方法。

定義
用語は、他に定義されない限り、以下のように、当技術分野で一般に使用されるように本明細書で使用する。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分、結合部分」という用語は、その最も広い意味で、ＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３などの抗原決定基を特異的に結合する抗体の部分を指す。

より具体的には、本明細書で使用される場合、膜結合ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５と同じ）を結合する、またはＣＤ３に結合する結合部分は、ＣＥＡまたはＣＤ３に、より詳細には、細胞表面または膜結合ＣＥＡもしくはＣＤ３に特異的に結合する。「特異的に結合する、に特異的な、に結合する」とは、結合が、抗原に対して選択的であり、望ましくないか、または非特異的な相互作用と区別することができることを意味する。一部の実施形態では、抗標的抗体の、関連しない非標的タンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定されるように、抗体の前記標的への結合よりも、約１０倍、好ましくは、＞１００倍低い。標的は、本明細書で議論されるタンパク質、例えば、ＣＥＡ、ＣＤ４７およびＣＤ３εである。

「ＣＥＡ、ＣＤ３に特異的に結合する、ＣＥＡ、ＣＤ３に結合する」は、一実施形態では、抗体が、ＣＤ３の、ＣＥＡの、それぞれの結合を介した腫瘍細胞へのＴ細胞の再標的化において治療剤として有用であるような十分な親和性で、標的のＣＥＡに、ＣＤ３に、それぞれ結合することができる抗体を指す。

好ましくは、本発明による二特異性抗体は、異なる種から、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体を指す。一実施形態では、抗体は、全長抗体である。本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、全長抗体について定義されるように、可変領域（可変ドメイン）および定常領域（定常ドメイン）からなる抗体重鎖を指す。本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、全長抗体について定義されるように、可変領域および定常領域からなる抗体軽鎖を指す。本発明のために有用な定常軽鎖は、本発明に開示される軽鎖に含まれる。

「全長抗体」という用語は、２つの「全長抗体重鎖」および２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を表す。「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ－ＣＬと略される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの全長抗体ドメインは、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインの間、ならびに全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結される。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような天然抗体である。本発明による全長抗体は、一実施形態では、ヒトＩｇＧ１型のものであり、さらなる一実施形態では、下記に定義されるＦｃ部分中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。本発明による全長抗体は、ＶＨおよびＶＬの対によってそれぞれ形成される２つの結合部分を含み、一方がＣＥＡに結合し、他方がＣＤ３に結合する。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域；Ｆｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指し、ＩｇＧ１抗体の場合では、Ｃ末端領域は、－ＣＨ２－ＣＨ３を含む（上記を参照されたい）。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、非常にわずかに変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びるとして定義される。

定常領域は、現在の技術水準において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａによって記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．， ａｎｄ Ｗｕ， Ｔ．Ｔ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８ （２０００） ２１４－２１８；Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．，ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２ （１９７５） ２７８５－ ２７８８を参照されたい）。

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面の基（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造の特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。

本明細書で使用される場合、「共通重鎖（ｃＨＣ）」という用語は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドを指し、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される。本発明による二特異性抗体のために好適な共通重鎖は、国際公開第２０１２０２３０５３号、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１４０８７２４８号、国際公開第２０１９１７５６５８号および国際公開第２０１６１５６５３７号（これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている重鎖である。一実施形態では、本発明による二特異性抗体のｃＨＣは、重鎖ＣＤＲとして、配列番号２のＣＤＲＬ１、配列番号３のＣＤＲＬ２および配列番号４のＣＤＲＬ３を含む。一実施形態では、本発明による二特異性抗体のｃＨＣは、重鎖可変領域として、配列番号１のＶＨ領域を含む。一実施形態では、本発明による二特異性抗体のｃＨＣは、配列番号４３、４４または４５のものである。

本発明による、共通重鎖を含む二特異性抗体のフォーマットは、標準的なＩｇＧ分子と区別ができず、かつ標準的なモノクローナル抗体と区別ができない特徴を有する、二特異性抗体のアフィニティー精製を可能にし（例えば、国際公開第２０１３０８８２５９号、国際公開第２０１２０２３０５３号を参照されたい）、患者における免疫原性の可能性がないか、またはそれが低いことが見込まれる。

本明細書で使用される場合、「ＡＢ１Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１、ＡＢ７３Ｌ３－１など」は、重鎖ＣＤＲとして、配列番号２、３および４のＣＤＲを含む共通重鎖、ならびに第２の結合部分中に、軽鎖ＣＤＲとして、配列番号１８、１９および２０のＣＤＲを含む軽鎖を含む、本発明による二特異性ＣＥＡｘＣＤ３抗体を指す。ＡＢ１などは、したがって、第１の結合部分（抗ＣＥＡＣＡＭ５結合部分）を表し、Ｌ３－１は、第２の結合部分（抗ＣＤ３結合部分）を表す。

一実施形態では、ＡＢ１Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１、ＡＢ７３Ｌ３－１などは、配列番号４３の共通重鎖（ＷＴ ｈＩｇＧ１）、および第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖を含む。そのような本発明の二特異性抗体は、実施例において、ＡＢ１Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１、ＡＢ７３Ｌ３－１としても指定される。

一実施形態では、ＡＢ１Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１、ＡＢ７３Ｌ３－１などは、配列番号４４の共通重鎖（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ変異を有するｈＩｇＧ１）、および第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖を含む。そのような本発明の二特異性抗体は、実施例において、ＡＢ１Ｌ３－１／Ｄ、ＡＢ１７Ｌ３－１／Ｄ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｄ、ＡＢ７２Ｌ３－１／Ｄ、ＡＢ７３Ｌ３－１／Ｄなどとして指定される。

一実施形態では、ＡＢ１Ｌ３－１、ＡＢ１７Ｌ３－１、ＡＢ５４Ｌ３－１、ＡＢ６０Ｌ３－１、ＡＢ６６Ｌ３－１、ＡＢ７１Ｌ３－１、ＡＢ７２Ｌ３－１、ＡＢ７３Ｌ３－１などは、配列番号４５の共通重鎖（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ＋Ｐ３２９Ａ変異を有するＩｇＧ１）、および第２の結合部分中に、軽鎖として、配列番号２８の軽鎖を含む。そのような本発明の二特異性抗体は、実施例において、ＡＢ１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ５４Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６０Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ６６Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎなどとして指定される。

共通重鎖を含む本発明の二特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１２０２３０５３号に従って、作製することができる。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載される方法は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一である二特異性抗体を生成する。この種類の分子は、２コピーのユニークな重鎖ポリペプチド、カッパ定常ドメインに融合された第１の軽鎖可変領域、およびラムダ定常ドメインに融合された第２の軽鎖可変領域から構成される。

本発明の二特性抗体では、一方の結合部位は、ＣＥＡへの特異性を示し、他方の部位は、ＣＤ３への特異性を示し、ここで、それぞれに対して、重鎖およびそれぞれの軽鎖が寄与する。軽鎖可変領域は、ラムダまたはカッパファミリーのものであり得、好ましくは、それぞれ、ラムダおよびカッパ定常ドメインに融合される。これは、非天然ポリペプチド結合の発生を回避するために好ましい。しかしながら、２つの特異性のいずれかについて、カッパ軽鎖可変ドメインをラムダ定常ドメインに融合することによって、または２つの特異性のいずれかについても、ラムダ軽鎖可変ドメインをカッパ定常ドメインに融合することによって、本発明の二特異性抗体の生成のために用いることができる抗体アームを得ることも可能である。国際公開第２０１２０２３０５３号に記載されている二特異性抗体は、「κλボディ」である。このκλ－ボディフォーマットは、標準的なモノクローナル抗体と区別ができない特徴を有する標準的なＩｇＧ分子と区別ができない二特異性抗体のアフィニティー精製を可能にし、したがって、例えば、アミノ酸架橋または他の非天然エレメントを含む以前のフォーマットと比較して、好ましい。

方法の必須のステップは、同じ重鎖可変ドメインを共有する異なる抗原特異性を有する（可変軽ドメインおよび可変重ドメインによってそれぞれ構成される）２つの抗体Ｆｖ領域の同定である。モノクローナル抗体およびその断片の作製についての多数の方法が記載されている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ Ｅ， ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ， １９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹを参照されたい）。完全ヒト抗体は、ＣＤＲ１および２を含む軽鎖ならびに重鎖の両方の配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。ＣＤＲ３領域は、ヒト起源のものであり得るか、または合成手段により設計され得る。そのような抗体は、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，ら， １９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４： ７２を参照されたい）；およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ，ら， １９８５ Ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７－９６を参照されたい）を使用することによって、調製することができる。ヒトモノクローナル抗体が、利用され得、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅ，ら， １９８３． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０： ２０２６－２０３０を参照されたい）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、エプスタインバーウイルスでヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，ら、上記を参照されたい）、産生され得る。

「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、本明細書で使用される場合、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）で記載されるヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。

本明細書で使用される場合、「ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５」という用語は、細胞表面糖タンパク質および腫瘍関連抗原（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １２１：４３９－４６２， １９６５； Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ ＮＬ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ２０：２１９７－２２０７， ２００２）であるヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ－５またはＣＤ６６ｅ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７３１）を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ６」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもある、ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０１９９）を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもある、ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１３６８８（ＣＥＡＭ１＿ＨＵＭＡＮ））を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ８」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメンバーでもある、ヒトＣＥＡＣＡＭ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３１９９７（ＣＥＡＭ８＿ＨＵＭＡＮ））を指す。さらなる情報およびＣＥＡファミリーの他のメンバーに対する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇに見出すことができる。

本明細書で使用される場合、「ＣＥＡに特異的に結合する、ＣＥＡに結合する、ＣＥＡ結合部分」という用語は、本発明による二特異性抗体の文脈では、細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性を指す。細胞におけるＣＥＡへの結合は、細胞あたり１００，０００～４００，０００個のＣＥＡコピーを含む胃腺癌ＭＫＮ－４５細胞を用いて測定することができる。本発明による抗体の濃度は、上記で定義されるＭＫＮ－４５細胞への結合について得られたＥＣ５０値に関して適切な範囲内で変動する。本発明による二特異性抗体は、そのような細胞膜結合ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する。

本明細書で使用される場合、「膜結合ヒトＣＥＡ」という用語は、細胞の膜部分に、または細胞の表面に、特に、腫瘍細胞の表面に結合するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を指す。「膜結合ヒトＣＥＡ」という用語は、ある特定の状況では、細胞の膜に結合しないが、本発明による抗体が結合する膜結合ＣＥＡエピトープを保存するように構築されたＣＥＡを指し得る。

本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ８に対する交差反応性なし」という用語は、本発明による二特異性抗体の文脈では、本発明による二特異性抗体の結合が、ＷＴ ＰＥＡＫ細胞への結合との比較において、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫ細胞において試験されること（詳細については、実施例１および５を参照されたい）を指し、交差反応性なしは、ＣＥＡＣＡＭ８を発現するＰＥＡＫ細胞について測定されるＭＦＩが、ＷＴ ＰＥＡＫ細胞について測定されるＭＦＩの２倍以下であることを意味する。本明細書で使用される場合、「ある特定のＣＥＡＣＡＭに対する交差反応性なし」という用語は、本発明による二特異性抗体の文脈では、ＣＥＡＣＡＭ８について記載された同じ実験手順および定義の下での前記交差反応性を指す。

本明細書で使用される場合、「ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ３に結合する二特異性抗体、ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂ」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＤ３εに結合する二特異性抗体を意味する。

本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非隣接抗原結合（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位（抗原結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）領域としても公知である）を記載する。ＣＤＲは、「超可変領域」とも称され、その用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、「ＣＤＲ」という用語と互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９８３）によって、およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７）によって、記載されている。Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列それ自体を超える任意の実験データに依拠することなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９８３）によって記載される番号付けシステムを指す。他に規定されない限り、本発明による二特異性抗体（例えば、ＣＤＲ配列）における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」という用語は、縮重オリゴヌクレオチドを使用するそのような方法に関する。それぞれのＣＤＲの変異誘発のために、さまざまな縮重オリゴヌクレオチドの組合せが使用される。これらは、（限定されるものではないが）縮重コドンＮＮＳ、ＨＭＴ、ＤＭＴ、ＮＨＴを含む。

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、現在の技術水準から公知の適切な様式で、本発明による抗体の重鎖および軽鎖を含む１つまたは複数のベクターを指す。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の二特異性抗体を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を包含する。一実施形態では、宿主細胞は、抗原結合分子の産生を可能にするように操作される。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸の置換」という用語は、１個のアミノ酸の、２０個のタンパク新生標準アミノ酸の群からの別のアミノ酸による置換を指す。
本発明による抗ＣＥＡｘＣＤ３抗体を使用する治療的適用および方法

本発明によるＣＥＡＣＡＭｘＣＤ３二特異性抗体は、単剤療法において、または併用療法、特に、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体および／もしくはＰＤ－１軸アンタゴニストと一緒の併用療法においてのいずれかで、固形腫瘍の処置のために最適化される。本発明による抗体およびＣＤ４７抗体またはＣＥＡｘＣＤ４７抗体は、下記に記載されるように投与することができる。

特定の実施形態では、疾患のそれぞれの固形腫瘍は、限定されるものではないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、食道がん、膵臓腫瘍および乳房腫瘍の群を含む、ＣＥＡを発現またはさらに過剰発現するがんである。特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。本明細書に記載されるすべての治療的適用、使用の方法、使用、組合せなどは、特に、これらの腫瘍／疾患の処置のための実施形態である。

本発明者らは、本発明による抗体が、それぞれ有効性を喪失させるＡＤＡを中和することにより、それぞれ曝露を喪失させるＡＤＡを形成する潜在能が低いかそれがないことを示すことを認識する。

一実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで、癌（がん、腫瘍、例えば、ヒト癌）、特に、ＣＥＡを発現する腫瘍を処置する方法を提供する。この方法は、対象に、本発明の二特異性抗体を含有する薬学的有効量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）の組成物を投与することを含む。「対象」とは、ヒト対象、一実施形態では、がん／腫瘍／癌を患っている患者を意味する。

さまざまな腫瘍実体、特に、結腸直腸癌、食道がん、膵臓腺癌、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部癌、子宮がんおよび膀胱がんなどにおけるＣＥＡ発現は、一般に非常に高い。消化管における健康な正常な腺上皮では、ＣＥＡは、細胞の頂端表面において偏ったパターンで、主に発現される。この偏った発現パターンは、全身投与される抗ＣＥＡ単一特異性または二特異性の抗体による影響の受け易さ（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を、したがって、潜在的な毒性を制限する。この偏った発現パターンは、消化管の悪性腫瘍の細胞において失われる。ＣＥＡは、がん細胞の細胞表面全体にわたって等しく発現され、これは、がん細胞が、正常な健康な細胞よりも本発明の抗体にはるかに良好に接近可能であり、それぞれの本発明のＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体によって、上記で言及した組合せによって、選択的に殺滅され得ることを意味する。

一実施形態では、本発明の二特異性抗体は、進行性固形腫瘍、一実施形態では、ＣＥＡを発現する腫瘍の処置のための単剤療法において使用することができる。一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、ＣＥＡｘＣＤ４７ ｂｓＡｂと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、ＣＥＡｘＣＤ４７ ｂｓＡｂおよび／またはＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明による二特異性抗体は、同時、別々または逐次的組合せで、ＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて使用される。そのようなＰＤ－１軸アンタゴニストは、例えば、国際公開第２０１７１１８６７５号に記載されている。そのような組合せは、マクロファージおよびＴ細胞によって、固形がんを攻撃する。ＣＤ４７抗体は、例えば、国際公開第２００９０９１６０１号、国際公開第２００９０９１５４７号、国際公開第２０１１１４３６２４号、国際公開第２００９１３１４５３号、国際公開第２０１３１１９７１４号、国際公開第２０１５１０５９９５号、国際公開第２０１７１８１０３３号、国際公開第２０１８０２６６００号、国際公開第２０１９１５７４３２号および国際公開第２０１３０３２９４８号に記載されており、ＣＥＡおよびＣＤ４７に対する二特異性抗体は、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号および米国出願第１６／４２８，５３９号に記載されている。

本明細書で使用される場合、本発明による抗体、ならびにヒトＣＤ４７またはヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ４７に結合する第２の抗体との「組合せ、同時、別々または逐次的組合せ」という用語は、２つの抗体（または、本発明の抗体、ＣＤ４７ ｍＡｂまたはＣＥＡｘＣＤ４７ ｂｓＡｂおよびＰＤ－１軸アンタゴニストの組合せの場合には、３つの抗体）の、別々または一緒のいずれかでの任意の投与を指し、ここで、２つまたは３つの抗体は、例えば、別々の、逐次的な、同時の、並行の、時間的にずらしたまたは交互の投与において、併用療法の利益を得るために設計された適切な投与レジメンの一部として投与される。したがって、２つまたは３つの抗体は、同じ医薬組成物の一部として、または別々の医薬組成物でのいずれかで投与することができる。本発明による抗体は、第２の二特異性抗体の投与の前に、それと同時に、もしくはその後に、またはそれらの一部の組合せで、投与することができる。本発明による抗体が、患者に、例えば、処置の標準的な過程の間に反復間隔で投与される場合、第２の二特異性抗体は、本発明の抗体のそれぞれの投与の前に、それと同時に、もしくはその後に、またはそれらの一部の組合せで、あるいは本発明の抗体による処置に関連して異なる間隔で、あるいは本発明の抗体による処置の過程の前に、その間の任意の時に、またはその後に単回投与で、投与され得る。一実施形態では、本発明による抗体および第２の二特異性抗体は、一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体の投与の間に６～１５日の間隔で、交互投与で投与される。そのような交互投与では、最初の投与は、本発明の抗体または第２の抗体であり得る。

「ＰＤ－１軸アンタゴニスト」という用語は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を指す。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ、ピディリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１およびＲＥＧＮ２８１０である。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、国際公開第２００８１５６７１号、国際公開第２０１３１７３２２３号、国際公開第２０１５０２６６３４号、米国特許第７５２１０５１号、米国特許第８００８４４９号、米国特許第８３５４５０９号、国際公開第２００９１／１４３３５号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００８１５６７１２号、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２００３０９９１９６号、国際公開第２００９１０１６１１号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０２７８２７号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２００８／１５６７１２号および国際公開第２００８／１５６７１２号に記載されている。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１ １０５、デュルバルマブおよびアベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、国際公開第２０１５０２６６３４号、国際公開第２０１３／０１９９０６号、国際公開第２０１００７７６３４号、米国特許第８３８３７９６号、国際公開第２０１００７７６３４号、国際公開第２００７００５８７４号および国際公開第２０１６００７２３５号に記載されている。

本発明による抗体および第２の二特異性抗体の組合せ投与に関して、両方の化合物は、１つの単一剤形で、または別々の剤形で、例えば、２つの異なるもしくは同一の剤形で、存在し得る。

本発明の抗体および第２の抗体が、ＣＥＡＣＡＭ５に関して競合しない場合、一実施形態では、両方の抗体は、同時に投与される。本発明の抗体および第２の抗体が、ＣＥＡＣＡＭ５に関して競合する場合、一実施形態では、抗体は、交互投与で投与される。

本発明の抗体は、典型的には、患者に、当技術分野において公知のように、患者が処置されているがんの（有効性および安全性の両方の視点から）最も有効な処置を提供する投与レジメンで投与される。この手法の完全な治療ポテンシャルを達成するためには、好ましくは、腫瘍細胞は、Ｔ細胞およびマクロファージによって同時に攻撃され、ＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体は、細胞表面上のＣＥＡへの結合に関して非競合的でなければならない。

上記で議論されたように、投与される抗体の量および本発明の抗体の投与のタイミングは、処置される患者の種類（例えば、性別、年齢、体重）および状態、処置される疾患または状態の重症度、ならびに投与の経路に依存し得る。例えば、本発明の抗体および第２の抗体は、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体および第２の抗体のそれぞれは、患者に、１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。一部の場合では、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルが適切であり得るが、他の場合では、さらに高い用量が、任意の有害な副作用を引き起こすことなく、用いられ得る。

本明細書で使用される場合、「抗体の半減期」という用語は、通常の薬物動態アッセイにおいて測定される前記抗体の半減期を指す。本発明による抗体ならびにＣＥＡおよびＣＤ４７に対する第２の二特異性抗体は、３～１４日間の排泄半減期を有する。

別の態様では、本発明は、疾患、特に、ＣＥＡが発現される、特に、ＣＥＡが同じ細胞型の正常組織と比較して異常に発現される（例えば、細胞表面上において過剰発現または異なるパターンで発現される）細胞増殖障害の処置における本発明による二特異性抗体の使用も対象とする。そのような障害としては、限定されるものではないが、結腸直腸がん、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、胃がん、食道がん、膵臓がんおよび乳がんが挙げられる。ＣＥＡの発現レベルは、当技術分野において公知の方法によって（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイなどを介して）、決定され得る。

一態様では、本発明の二特異性抗体は、ＣＥＡを発現するｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を標的化するために使用することができる。本発明の二特異性抗体は、腫瘍細胞のＴＤＣＣの誘導を介した、腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶および腫瘍成長または転移の阻害において特に有用である。本発明の二特異性抗体は、ＣＥＡを発現する任意の腫瘍を処置するために使用することができる。本発明の二特異性抗体で処置され得る特定の悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、胃がん、食道がん、膵臓がんおよび乳がんが挙げられる。

本発明の二特異性抗体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトに、ボーラスとして静脈内に、または一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所もしくは吸入経路によって、ヒトに投与され得るものを含む、下記で議論されるものなどの薬学的に許容され得る剤形で、投与される。本発明の二特異性抗体はまた、好適には、腫瘍内、腫瘍周辺、病変内、または病変周辺の経路によって投与されて、局所的および全身的な治療効果を発揮する。

疾患の処置について、本発明の二特異性抗体の適切な投与量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および過程、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。本発明の二特異性抗体は、好適には、患者に、１回または一連の処置にわたって投与される。本発明は、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を選択的に殺滅するための方法を提供する。

この方法は、本発明の二特異性抗体と前記腫瘍細胞との相互作用を含む。これらの腫瘍細胞は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、食道がん、膵臓癌および乳癌を含む、ヒト癌に由来し得る。

別の態様では、本発明は、異常なＣＥＡ発現に関係する疾患を処置するための医薬の製造における使用のための本発明の二特異性抗体を対象とする。特定の実施形態では、疾患は、限定されるものではないが、結腸直腸腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腫瘍、食道がん、膵臓腫瘍および乳房腫瘍を含む、ＣＥＡを発現またはさらに過剰発現するがんである。特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。
組成物、製剤、投与量および投与の経路

一態様では、本発明は、本発明の二特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。本発明は、がんなどの疾患の処置の方法における使用のため、またはがんなどの疾患の処置のための医薬の製造における使用のためのそのような医薬組成物をさらに対象とする。具体的には、本発明は、疾患の処置のための、より詳細にはがんの処置のための方法であって、方法が、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を対象とする。

一態様では、本発明は、上記で定義されるように、ヒトの癌、腫瘍を処置するための医薬組成物、組合せおよび方法を包含する。例えば、本発明は、ヒトの癌の処置における使用のための薬学的有効量の本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。

本発明の二特異性抗体組成物は、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内、または直接腫瘍内の投与を含む、従来の投与の様式を使用して投与することができる。静脈内投与または皮下投与が好ましい。

本発明の一態様では、本発明の二特異性抗体を含有する治療製剤は、所望の純度を有する抗体を必要に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０））、凍結乾燥製剤または液体製剤の形態で、保管のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。本発明の医薬組成物のための最も有効な投与の様式および投与量レジメンは、疾患の重症度および過程、患者の状態および処置に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。したがって、組成物の投与量は、均一な用量であり得るか、または個々の患者、例えば、体重に適合され得る。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は、一般に、０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。

本発明の二特異性抗体は、１モルあたり１５０ｋＤの大きさの分子量を有する。それらは、一実施形態では、Ｆｃ部分を持つ。患者における排泄半減期は、３～１４日の範囲である。この半減期は、限定されるものではないが、１日に１回、１週間に１回または２週間ごとに１回の投与を可能にする。

本発明の二特異性抗体およびそれらのそれぞれの組成物は、限定されるものではないが、液状の液剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞、リポソーム、および注射用または注入用液剤を含む、各種の剤形であり得る。好ましい形態は、投与の様式および治療的適用に依存する。

本発明の二特異性抗体を含む組成物は、適正診療規範と適合する方法で、製剤化され、投薬され、投与される。この文脈における考慮のための因子としては、処置される特定の疾患または障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患または障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療実務者に公知の他の因子が挙げられる。

製品
本発明の別の態様では、上記に記載される障害の処置、予防および／または診断のために有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器の上またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの各種の材料から形成され得る。容器は、それ自体によって、または状態を処置するため、予防するためおよび／もしくは診断するために有効な別の組成物と組み合わせて組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する点滴静注バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の１つの活性剤は、本発明の二特異性抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態を処置するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）組成物がその中に含有される第１の容器であって、組成物が本発明の二特異性抗体を含む、第１の容器；および（ｂ）組成物がその中に含有される第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む、第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が、特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。あるいは、または加えて、製品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含んでいてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
表１
配列表

（実施例１）
ヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーのクローニング、発現および精製

クローニング
ＣＥＡＣＡＭ５の完全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびＡ３－Ｂ３ドメインに相当する配列を、合成し、ｐＥＡＫ８哺乳動物発現ベクター（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）にサブクローニングした。ベクターを、改変して、Ｃ末端に、Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｄｅｎｖｅｒ Ｃｏｌｏ．）およびヘキサヒスチジンタグ、ヒトＦＣ領域またはマウスＦＣ領域のいずれかを導入した。構築物を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。組換え可溶性タンパク質の精製を、ＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）、ＦｃＸＬまたはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－Ｆｃ（ｍｓ） Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって行った。

ヒトＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６、７、８、１８、１９、２０、２１、およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６の全長バージョンをコードするベクターも、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の細胞表面での発現のために生成した。可溶性の全長ヒトＣＥＡＣＡＭ１６も同様にクローニングした。

加えて、ヒトＣＥＡＣＡＭ５の以下のトランケートバージョンをコードするベクターも、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の細胞表面での発現のために生成した：Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ａ３－Ｂ３。Ｂ３サブドメインは、ヒトＣＤ８６タンパク質の最初の１４０ａａへの融合タンパク質として発現される。

発現
次いで、上記で言及したプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのリポソーム系トランスフェクション試薬を使用して、哺乳動物細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションステップは、ごく少量のＤＮＡおよび細胞、典型的には、ウェルあたり４×１０^５個の細胞および２μｇのプラスミドＤＮＡを必要とし、トランスフェクションを、６ウェルプレートで行った。異なる哺乳動物細胞系を使用することができるが、下記に示される実施例では、形質転換ヒト胎児腎臓単層上皮細胞（ＰＥＡＫ細胞）をトランスフェクトする。これらの細胞は、エピソーム複製プロセスをさらにサポートするＥＢＮＡ－１遺伝子を安定に発現し、半接着性であり、標準的な細胞培養条件（５％のＣＯ_２；１０％のウシ胎仔血清が補充されたＤＭＥＭ培地中、３７℃）下で成長することができる。２４時間後、細胞を、０．５～２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する培地を追加することによって、選択的条件下に置く：エピソームベクターを保有する細胞は、この抗生物質に対して耐性である。

トランスフェクションの２～３週間後、増幅および選択された細胞を、産生ステップのための使い捨てＣＥＬＬｉｎｅ（商標）バイオリアクター（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に注入した。ＣＥＬＬｉｎｅ（商標）は、標準的な細胞培養インキュベーターにおいて使用することができる２区画バイオリアクターである。より小さな区画（１５ｍｌ）は、細胞を含有し、１０ｋＤａのカットオフサイズを有する半透膜によって、より大きな（１リットル）培地を含有する区画から分離される（Ｂｒｕｃｅら ２００２， ＭｃＤｏｎａｌｄら ２００５）。このシステムは、細胞および分泌タンパク質をより小さな区画に保持しながら、栄養素、ゲイズ（ｇａｚｅｓ）および代謝廃棄物の拡散を可能にする。培養物を、上清の回収前に、７～１０日間維持する。培地は血清を含有するので、細胞は、良好な生存率を維持し、数回のプロダクションランを、同じ細胞および容器を使用して、行うことができる。

精製
回収後、細胞培養上清を、遠心分離によって清澄化する。次いで、上清に、１００ｍＭのイミダゾールを補充し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上にロードする。比較的高濃度のイミダゾールは、樹脂への夾雑物の結合を最小化する。カラムの洗浄後、タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステム（Ｃｙｔｉｖａ）において、３０ｍＬのイミダゾール勾配（２０～４００ｍＭのイミダゾール）を使用して、２ｍＬ／分の流量で溶出させる。溶出勾配は、組換えタンパク質の純度をさらに改善するが、クロマトグラフィーシステムが利用可能ではない場合、段階的溶出手法によって置き換えることができる。溶出した画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡによって分析して、組換えタンパク質中のそれらの含有量を決定することができる。目的の画分をプールし、リン酸緩衝食塩水または別の適切な緩衝液で平衡化したＡｍｉｃｏｎ（登録商標）１０ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において脱塩する。次いで、脱塩されたタンパク質を、さまざまな技法を使用して定量することができ、それらの純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析することができる。組換えタンパク質を、製造者の指示に従って、ビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｄｅｎｖｅｒ Ｃｏｌｏ．）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでビオチン化する。脱塩後、ビオチン化レベルを、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用するプルダウンアッセイおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって評価する。
（実施例２）
固定された可変重ドメインを含有するヒトｓｃＦｖライブラリーを使用するＣＥＡＣＡＭ５ Ｆｖのファージディスプレイ選択

Ｍ１３バクテリオファージ上にディスプレイされるヒトｓｃＦｖライブラリーの構築および取り扱いについての一般的な手順は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＶａｕｇｈａｎら （Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９６， １４：３０９－３１４）に記載されている。選択およびスクリーニングのためのライブラリーは、同じＶＨドメインをすべて共有し、ＶＬドメインにおいて単に多様化されるｓｃＦｖをコードする。固定されたＶＨライブラリーの生成のための方法、ならびに二特異性抗体の同定およびアセンブリーのためのそれらの使用は、米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号に記載されており、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合するｓｃＦｖを同定するための手順を、下記に記載する。
タンパク質選択

ｓｃＦｖファージライブラリーのアリコート（１０^１２Ｐｆｕ）を、ロータリーミキサーで、３％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有するＰＢＳで、室温で１時間、ブロッキングする。ブロッキングされたファージを、ロータリーミキサーで、室温で１時間、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０）上で、選択解除する。選択解除したファージ（ｄｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｈａｇｅ）を、ロータリーミキサーで、ストレプトアビジン磁気ビーズ上に捕捉された１００ｎＭのビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５またはＡ３－Ｂ３ドメインのいずれかとともに、室温で２時間、インキュベートする。ビーズを、磁気スタンドを使用して捕捉し、続いて、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で５回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄する。ファージを、ロータリーミキサーで、１００ｎＭのＴＥＡにより、室温で３０分間、溶出させる。溶出したファージおよびビーズを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ７．４で中和し、１０ｍｌの指数関数的に成長しているＴＧ１細胞（ファージディスプレイにおいて一般に使用されるＥ．ｃｏｌｉ株）に直接添加し、ゆっくりと振とうしながら（９０ｒｐｍ）、３７℃で１時間、インキュベートする。感染したＴＧ１のアリコートを、段階希釈して、選択アウトプットを力価測定する。残りの感染したＴＧ１を、３８００ｒｐｍで１０分間スピンし、２ｍｌの２ｘＴＹに再懸濁させ、２ｘＴＹＡＧ（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する２ｘＴＹ培地）寒天バイオアッセイプレート上に広げる。３０℃での終夜のインキュベーション後、１０ｍｌの２ｘＴＹをプレートに添加し、細胞を、表面からこすり取り、５０ｍｌのポリプロピレン管に移す。５０％のグリセロール溶液を、細胞懸濁物に添加して、１７％のグリセロールの最終濃度を得る。選択ラウンドのアリコートを、－８０℃で保つ。
ファージレスキュー

先の選択ラウンドから得られた５０μｌの細胞懸濁物を、５０ｍｌの２ｘＴＹＡＧに添加し、０．３～０．５のＯＤ_６００に達するまで、撹拌しながら（２４０ｒｐｍ）、３７℃で成長させる。次いで、培養物を、１．２×１０^１１個のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで超感染させ、３７℃（９０ｒｐｍ）で１時間、インキュベートする。細胞を３８００ｒｐｍで１０分間遠心分離すること、培地を除去すること、およびペレットを５０ｍｌの２ｘＴＹＡＫ（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン；５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＴＹ培地）に再懸濁することによって、培地を交換する。次いで、培養物を、３０℃（２４０ｒｐｍ）で終夜、成長させる。翌日、ファージを含有する上清を、次の選択ラウンドのために使用する。
細胞表面選択

ファージを含有する上清を、ロータリーミキサーで、３％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有するＰＢＳで、室温で１時間、ブロッキングする。次いで、ブロッキングされたファージを、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現しないＭＫＮ－４５ ＣＥＡＣＡＭ５^ＫＯ細胞上で、１時間、選択解除する。選択解除したファージを、（ＰＢＳ、３％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ_３でブロッキングした）ＣＥＡＣＡＭ５を発現する２×１０^７個のＭＫＮ－４５細胞とともに、穏やかに撹拌しながら、室温で２時間、インキュベートする。細胞を、ペレット化し、ＰＢＳで６回洗浄する。結合したファージを、７６ｍＭのクエン酸で溶出させ、１０分間、振とうする。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ８での中和後、細胞を、１０ｍｌの指数関数的に成長しているＴＧ１に直接添加し、ゆっくりと振とうしながら、３７℃で１時間、インキュベートする。感染したＴＧ１のアリコートを、段階希釈して、選択アウトプットを力価測定する。感染したＴＧ１を、３８００ｒｐｍで１０分間スピンし、２ｍｌの２ｘＴＹ培地に再懸濁させ、２ｘＴＹＡＧ寒天バイオアッセイプレート上に広げる。３０℃での終夜のインキュベーション後、１０ｍｌの２ｘＴＹをプレートに添加し、細胞を、表面からこすり取り、５０ｍｌのポリプロピレン管に移す。５０％のグリセロール溶液を、細胞懸濁物に添加して、１７％のグリセロールの最終濃度を得る。選択ラウンドのアリコートを、－８０℃で保つ。
（実施例３）
可溶性ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ１へのｓｃＦｖ結合／非結合についてのスクリーニング
結合および機能試験のためのｓｃＦｖペリプラズム調製

選択アウトプットからの個々の形質転換されたＴＧ１クローンを、ウェルあたり０．９ｍｌの２ｘＴＹＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１％のグルコースを含有する２ｘＴＹ培地）を含有するディープウェルマイクロタイタープレートに接種し、３７℃で５～６時間、成長させる（２４０ｒｐｍ）。次いで、２ｘＴＹ培地中のウェルあたり１００μｌの０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加して、０．０２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度を得る。プレートを、２４０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で終夜、インキュベートする。ディープウェルプレートを、３２００ｒｐｍで、４℃で１０分間、遠心分離し、上清を、注意深く除去する。ペレットを、１５０μｌのＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２０％のスクロース、完全プロテアーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅを補充）に再懸濁させる。低張ショックを、１５０μｌの希釈ＴＥＳ緩衝液（１：５のＴＥＳ：水希釈）を添加すること、および氷上での３０分間のインキュベーションによって生じさせる。プレートを、４０００ｒｐｍで、４℃で１０分間、遠心分離して、細胞および残屑をペレット化する。上清を、別のマイクロタイタープレートに注意深く移し、機能アッセイまたは結合アッセイですぐに試験するために、氷上で保つ。
結合

ＣＥＡＣＡＭ５への結合についてのｓｃＦｖのスクリーニングを、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）技術を使用して、ホモジニアスアッセイにおいて試験する。以下の試薬を、３８４透明底ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のそれぞれウェル中で混合する：ビオチン化ＣＥＡＣＡＭ５、ビオチン化ドメインＡ３－Ｂ３または対照タンパク質のためのビオチン化ＮｕｓＡのいずれかでコーティングされた３０μｌのストレプトアビジンポリスチレンビーズ懸濁物（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；３０００個ビーズ／ウェル）；６０μｌのブロッキングされたｓｃＦｖペリプラズム調製物；１０μｌの検出緩衝液（５μｇ／ｍｌのマウス抗ｃ－ｍｙｃ抗体；１：２００希釈された抗マウスＦｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７を含有するＰＢＳ）。６００ｒｐｍで５分間混合した後、３８４ウェルプレートを、室温でインキュベートし、２時間後、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇプラットフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において読み取る。ＮｕｓＡではなくＣＥＡＣＡＭ５に特異的なシグナルを与えるｓｃＦｖを発現するクローンを、さらなる分析または配列決定のために選択する。

ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６および他のＣＥＡＣＡＭへの結合を、同じ様式で測定することができる。
クローン配列決定

単一クローンを、ウェルあたり１ｍｌのＬＢＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを有するＬＢ培地）を含有する９６ディープウェルマイクロタイタープレートに接種し、３００ｒｐｍで、３７℃で終夜、成長させる。ＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ－９６ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出し、配列決定する。
（実施例４）
固定されたＶＨ候補のＩｇＧへの再フォーマット化および哺乳動物細胞における一過性発現

スクリーニングおよび配列決定の後、所望の結合特性を有するｓｃＦｖ候補を、ＩｇＧに再フォーマットし、ＰＥＡＫ細胞への一過性トランスフェクションによって、発現させる。選択されたｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列を、特定のオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、重鎖および軽鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングし、構築物を、配列決定することによって検証する。発現ベクターを、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、哺乳動物細胞にトランスフェクトする。簡潔には、４×１０^６個のＰＥＡＫ細胞を、Ｔ７５フラスコにおいて、ウシ胎仔血清を含有する２５ｍｌの培養培地中で培養する。トランスフェクトされた細胞を、３７℃で５～６日間培養し、ＩｇＧ産生を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６装置を使用して定量する。上清を、製造者の指示に従って、ＦｃＸＬアフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ＩｇＧ精製のために回収する。簡潔には、トランスフェクトされた細胞からの上清を、適切な量のＦｃＸＬ樹脂とともに、４℃で終夜、インキュベートする。ＰＢＳによる樹脂の洗浄後、試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｐｒｏカラムにロードし、その後、ＩｇＧを、５０ｍＭのグリシンｐＨ３．５で溶出させる。次いで、溶出したＩｇＧ画分を、ヒスチジンＮａＣｌ ｐＨ６．０緩衝液に対して、Ａｍｉｃｏｎ ５０ｋＤａによって透析し、ＩｇＧ含有量を、２８０ｎｍでの吸収によって定量する。純度およびＩｇＧ完全性を、製造者の指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用する電気泳動によって検証する（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）。
（実施例５）
ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体の特性評価
ａ）抗ＣＥＡＣＡＭ５アームのＣＥＡＣＡＭファミリーの異なるメンバーでトランスフェクトされた細胞への結合

二価ｍＡｂまたは一価ｂｓＡｂとして試験される抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体アームの特異性を、ＣＥＡＣＡＭファミリーの異なるメンバーでトランスフェクトされたＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞を使用して、フローサイトメトリーによって示す。

ヒトＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６、７、８、１８、１９、２０および２１および２０の全長バージョンをコードするベクターを使用して、実施例１に記載されているように、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の表面でこれらのタンパク質を発現させる。同様に、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５および６の全長バージョンをコードするベクターも使用して、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の表面でこれらのタンパク質を発現させる。トランスフェクトされていないＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞を、陰性対照として使用する。細胞を、回収し、カウントし、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ２％のＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）中に３×１０^６個細胞／ｍｌで再懸濁させる。１００μｌの細胞懸濁物を、Ｖ底９６ウェルプレートに分配する（３×１０^５個細胞／ウェル）。上清を、１３００ｒｐｍ、４℃で３分間の遠心分離によって除去し、細胞を、漸増濃度の本発明による抗体とともに、４℃で１５分間、インキュベートする。試験するための抗ＣＥＡＣＡＭ５アームを持つ抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈し、濃度範囲は、３０ｐＭ～５００ｎＭである。細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、適合性抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともに、４℃でさらに１５分間、再インキュベートする。細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：１５００希釈されたＴＯＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させる。蛍光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣｙｔｏｆｌｅｘ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、測定する。用量反応結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、フィットさせる。同じ様式で、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６および他のＣＥＡＣＡＭを特性評価することができる。

実施例１および５ａに記載される実験手順を使用することによって得られた結果を、表２および３に示す（１０ｍｃｇ／ｍｌの全サイズの抗体で試験した；ＢｉＴＥ ＭＥＤＩ－５６５を等モル濃度で試験した）。二特異性抗体のＡＢ１７Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７１Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７２Ｌ３－１／Ｎ、ＡＢ７３Ｌ３－１／Ｎについて、ＣＥＡＣＡＭ５がトランスフェクトされた細胞への結合について測定されたＭＦＩは、２９０００～４１０００に見出された（表２）。対照的に、ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、８でトランスフェクトされたＰＥＡＫ細胞を使用することによって見出されたＭＦＩは、ＣＥＡＣＡＭ８がトランスフェクトされた細胞におけるＡＢ７２Ｌ３－１／Ｎについての強いシグナルのみを除き、１０００を下回ることが見出された。任意の所与のＣＥＡＣＡＭを発現するトランスフェクトされた細胞において得られたＭＦＩ値をＷＴ ＰＥＡＫ細胞において得られた値によって割る場合、「ＰＥＡＫ ＷＴに対する倍数」を計算することができる（表３）。ＡＢ７２Ｌ３－１／Ｎを除いて、本発明の抗体は、「ＰＥＡＫ ＷＴに対する倍数」値がすべて２．０を下回るので、すべてＣＥＡＣＡＭ５に特異的である。対照的に、ＭＥＤＩ－５６５ ＢｉＴＥは、ＣＥＡＣＡＭ８について２よりも高い「ＰＥＡＫ ＷＴに対する倍数」を示し、そのようなＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに対する交差反応性を示唆する。これは、上記で既に言及したように、ヒト好中球が表面上でＣＥＡＣＡＭ８を発現するので、例えば、好中球の殺滅を引き起こし得る。
表２ ＰＥＡＫ細胞における一過性発現したＣＥＡＣＡＭｘへの結合［ＭＦＩ］
表３ ＰＥＡＫ細胞における一過性発現したＣＥＡＣＡＭｘへの結合［ＰＥＡＫ ＷＴに対する倍数］
ｂ）酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）におけるＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体の組換えタンパク質への結合

ビオチン化組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルマイクロプレートにおいて、０．５μｇ／ｍＬで捕捉する。プレートを洗浄し、本発明のモノクローナル抗ＴＡＡ二価抗体を、幅広い濃度範囲（例えば、５×１０^－４～１μｇ／ｍＬ）で添加し、１時間の間、インキュベートする。プレートを洗浄し、結合した抗体を、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出する。洗浄後、プレートを、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（登録商標）試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で明らかにする。蛍光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）において測定する。

ＣＥＡＣＡＭ１およびＣＥＡＣＡＭ６などの他の組換えＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合を、同様に評価することができる。結合結果を、それぞれ、１Ｂ４ ｍＡｂおよびＣ１１ ｍＡｂについて、図８および９に示す。
ｃ）参照抗体との競合による本発明の抗体のエピトープビニング

エピトープビニングは、例えば、標的タンパク質に対する新たなモノクローナル抗体の結合を特性評価するために使用される競合イムノアッセイである。標的タンパク質に結合する新たな抗体の競合ブロッキングプロファイルを、この標的タンパク質にも結合し、結合エピトープが既に確立／公開されている抗体について作出する。これらの参照抗体の１つとの競合は、新たな抗体が、同じまたは近い場所にあるエピトープを有し、それらが一緒に「ビニング」されることを示す。

ＣＥＡＣＡＭ５参照抗体と競合する本発明のＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの能力を、マウスＦｃ領域を持つ以下の参照抗体を用いた組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５についてのＥＬＩＳＡによって試験する：ＳＭ３Ｅ、米国特許出願公開第２００５０１４７６１４Ａ１号特許に記載されているｓｍ３Ｅに由来するｍＡｂ；ＭＥＤＩ、国際公開第２０１６０３６６７８Ａ１号特許に記載されているＭＥＤＩ－５６５に由来するｍＡｂ；ＳＡＲ、欧州特許出願公開第３１９９５５２Ａ１号特許に記載されているＭａｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２に由来するｍＡｂ；ＣＨ１Ａ１Ａ、米国特許出願公開第２０１２０２５１５２９号特許およびＫｌｅｉｎら ｉｎ Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２０１７ Ｊａｎ １１；６（３）に記載されているＣＨ１Ａ１Ａ－２Ｆ１に由来するｍＡｂ；ヒト化Ｔ８４．６６、国際公開第２０１７０５５３８９号特許に記載されているバリアント１に由来するｍＡｂ；ＬＡＢ、米国特許出願公開第２００２／０１６５３６０Ａ１号特許に記載されているｈＭＮ１４に由来するｍＡｂ。

ＳＭ３Ｅは、例えば、ＣＥＡのＮ末端の細胞膜遠位部分により多く結合し、ＭＥＤＩは、中央部分に結合し、ＣＨ１Ａ１Ａは、膜の近くに結合する。

ビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５を、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、０．５μｇ／ｍｌでコーティングし、１０μｇ／ｍｌの参照ｍＡｂまたはマウスＦｃ領域を持つ無関係なｍＡｂとともに、１時間インキュベートする。本発明のＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂ（二価モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を意味する）を、０．２μｇ／ｍｌで、室温で１時間、添加する。プレートを洗浄し、結合したＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂを、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出する。洗浄後、プレートを、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標） Ｒｅｄ試薬で明らかにする。蛍光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）において測定する。

ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂで見出された結果に基づいて、本発明による誘導されたＣＥＡｘＣＤ３は、ツール抗体の添加ありおよびなしの結果を比較する場合にＣＥＡＣＡＭ５への結合が８０％より大きく低減される場合、参照抗体と競合すると考えられる。ＣＥＡｘＣＤ３抗体は、ツール抗体の添加ありおよびなしの結果を比較する場合にＣＥＡＣＡＭ５への結合が２０％未満、低減される場合、ツール抗体と非競合として同定される。図１は、実施例５ｃにおいて使用された参照抗体の結合領域を、模式的な方法で示す。
ｄ）トランケート型のＣＥＡＣＡＭ５を使用する本発明の抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ５ドメインの決定

その細胞外サブドメインの１つまたは複数を欠くトランケート型のＣＥＡＣＡＭ５を使用して、本発明の抗体が結合するサブドメインを決定することができる。

ヒトＣＥＡＣＡＭ５の全長バージョン（その細胞外ドメインをすべて含有する、すなわち、Ｎ－Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３）をコードするベクター、およびＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインのサブセット（Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ｂ２－Ａ３－Ｂ３；Ａ３－Ｂ３およびＢ３）のみをコードするベクターを使用して、実施例１に記載されるように、ＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞の表面でこれらのタンパク質を発現させる。トランスフェクトされていないＰＥＡＫおよび／またはＣＨＯ細胞を、陰性対照として使用する。フローサイトメトリー染色および取得を、実施例５のサブセクションａ）に記載されるようにして行う。

本発明による抗体は、結合した抗体がＰＥコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体によって検出される場合に、所与のトランケートされたＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に結合するものとして見出される。
（実施例６）
ラムダおよびカッパ軽鎖を持つ二特異性抗体の発現および精製

同じ細胞中の１つの重鎖および２つの軽鎖の同時発現は、３つの異なる抗体のアセンブリーをもたらすことができる。同時発現は、共発現される鎖の１つを発現する複数のベクターのトランスフェクション、または複数の遺伝子発現を駆動するベクターを使用することによるなどの異なる方法で、達成することができる。異なる抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体をコードするベクターを、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を発現する別のベクターと共トランスフェクトする。あるいは、それらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号に記載されるようにして、２つの軽鎖を、１つの重鎖、１つのカッパ軽鎖および１つのラムダ軽鎖の共発現を可能にするように以前に生成されたベクターｐＮｏｖｉ κＨλにクローニングする。３つの遺伝子の発現を、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）によって駆動し、ベクターは、安定細胞系の選択および樹立を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）も含有する。抗ＣＥＡＣＡＭ５ ＩｇＧおよび抗ＣＤ３ ＩｇＧの共通ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、哺乳動物細胞における一過性発現のために、ベクターｐＮｏｖｉ κＨλにクローニングする。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、適切な数の細胞および培養培地体積を有する適切なエルレンマイヤーフラスコ中、懸濁培養する。プラスミドＤＮＡを、最後に、ＰＥＩを使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトする。トランスフェクト細胞の上清中の抗体濃度を、産生の間、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６を使用して測定する。抗体濃度に従って、上清を、トランスフェクションの５～７日後に回収し、１３００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化する。精製は、３ステップの精製プロセスに基づく。最初に、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＦｃＸＬアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳで洗浄し、次いで、清澄化された上清中に添加する。＋４℃および２０ｒｐｍでの終夜のインキュベーション後、上清を２０００ｇで１０分間、遠心分離し、フロースルーを保存し、樹脂をＰＢＳで２回洗浄する。次いで、樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ Ｐｒｏカラムに移し、ｐＨ３．０の５０ｍＭのグリシンを含有する溶液を、溶出のために使用する。いくつかの溶出画分を、生成し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４で中和し、プールする。総ヒトＩｇＧを含有するプール（二特異性および２つの単一特異性の抗体）を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）を使用して定量し、次いで、適切な体積のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＫａｐｐａＸＬアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）．ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに、２０ｒｐｍで、室温で３０分間、インキュベートする。樹脂の回収および洗浄、溶出、ならびに中和ステップを、先に記載されるようにして行う。最後のアフィニティー精製ステップを、カッパ精製ステップについてと同じプロセスを適用して、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ラムダＦａｂアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行う。すべての溶出画分を、プールし、５０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、Ｈｉｓ－ＮａＣｌ ｐＨ６製剤緩衝液に対して脱塩する。最終産物を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、定量する。

精製された二特異性抗体を、製造者（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）によって記載されるようにして、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒとＰｒｏｔｅｉｎ ８０キットを使用して、変性および還元条件下での電気泳動によって分析する。４μＬの精製された試料を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）が補充された試料緩衝液と混合する。試料を、９５℃で５分間加熱し、次いで、チップにロードする。すべての試料を、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を使用して、エンドトキシン混入について試験する。
（実施例７）
一価および二特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価
ａ）一価および二特異性抗体のＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞およびＣＥＡＣＡＭ５を発現しない細胞への結合

ＣＤ３ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体の標的細胞への結合を実証するために、ＣＤ３ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体の結合をそれらの一価対応物と比較するフローサイトメトリーに基づく一連の実験を行うことができる。使用され得る細胞の例は、胃腺癌細胞系ＭＫＮ４５（細胞あたり１５５，０００個のＣＥＡＣＡＭ５分子を発現する）または膵臓腺癌細胞系ＨＰＡＦ－ＩＩ（細胞あたり１０８，０００個のＣＥＡＣＡＭ５分子を発現する）または結腸直腸腺癌細胞系ＬＳ１７４Ｔ（細胞あたり２６，０００個のＣＥＡＣＡＭ５分子を発現する）などのＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞系、ならびに肺癌細胞系Ａ５４９およびＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９方法論によって生成されたＭＫＮ４５ ＣＥＡＣＡＭ５ノックアウト細胞系などのＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞系を含む。細胞染色および結合評価を、上記に記載されるようにして行うことができる。得られた結合曲線を、図４、５、１１および１４に示す。ＥＣ５０値を、ＭＫＮ４５細胞への結合について、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して計算することができ、データを表４に示す。２００ｎＭ、１０００ｎＭおよび５０００ｎＭでの本発明のｂｓＡｂの結合は、ＴＣＢ２０１４の結合と比較して、４０％およびそれよりも高い（表４、また図１１および１４を参照されたい）。
表４： ＭＫＮ－４５細胞に対する結合ＥＣ５０。Ｎ／Ａ：該当せず
ｂ）一価および二特異性抗体のＣＤ３を発現する細胞およびＣＤ３を発現しない細胞への結合

ＣＤ３ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体のエフェクターＴ細胞への結合を実証するために、ＣＤ３ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体の結合をそれらの一価対応物と比較するフローサイトメトリーに基づく一連の実験を行うことができる。使用され得る細胞の例は、ヒト初代Ｔ細胞、およびＣＤ３陽性（Ｊｕｒｋａｔおよび／またはＨｕＴ ７８）またはＣＤ３陰性（ＴＩＢ－１５３および／またはＪＫＴ－ベータ－ｄｅｌ）細胞系を含む。細胞染色および結合評価を、上記に記載されるようにして行うことができる。結果を図３および１０に示す。
ｃ）参照抗体との競合によるＣＥＡＣＡＭ５抗体のエピトープビニング

エピトープビニングは、本発明による抗体の結合、または、例えば、第１の結合部分の関連抗ＣＥＡ（標的タンパク質）抗体の結合を特性評価するために使用される競合イムノアッセイである。標的タンパク質に結合する抗体の競合ブロッキングプロファイルを、この標的タンパク質にも結合し、結合エピトープが既に確立／公開されている抗体に対して作出する。これらの参照抗体の１つとの競合は、抗体が、同じまたは近い場所にあるエピトープを有し、それらが一緒に「ビニング」されることを示す。抗ＣＥＡＣＡＭ５参照抗体と競合する本発明の二特異性抗体の部分である抗ＣＥＡＣＡＭ５アームの能力を、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５およびマウスＦｃ領域を持つ以下の参照抗体を用いてＥＬＩＳＡによって試験する：ＳＭ３Ｅ、米国特許出願公開第２００５０１４７６１４Ａ１号特許に記載されているＳＭ３Ｅに由来するｍＡｂの配列、標準的な方法を使用して産生されたｍＡｂ；ＭＥＤＩ、国際公開第２０１６０３６６７８Ａ１号特許に記載されているＭＥＤＩ－５６５に由来するｍＡｂ；ＣＨ１Ａ１Ａ、米国特許出願公開第２０１２０２５１５２９号特許およびＫｌｅｉｎら ｉｎ Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２０１７ Ｊａｎ １１；６（３）に記載されているＣＨ１Ａ１Ａ－２Ｆ１に由来するｍＡｂ。ＳＭ３Ｅは、ＣＥＡのＮ末端の細胞膜遠位部分により多く結合し、ＭＥＤＩは、中央部分に結合し、ＣＨ１Ａ１Ａは、膜の近くに結合する。

１μｇ／ｍｌで使用されるκλボディを、９６ウェル黒色マイクロプレートに１０μｇ／ｍｌでコーティングされたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって捕捉し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ ２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０）でブロッキングする。競合相手のＩｇＧ（０．０３～２０μｇ／ｍｌ）を、ブロッキング緩衝液中の０．１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ５とともに、１時間、プレインキュベートする。κλボディのプレートを、洗浄し、プレインキュベートされた競合相手のＩｇＧ／ＣＥＡＣＡＭ５混合物とともに、１時間、インキュベートする。洗浄後、ＣＥＡＣＡＭ５を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出する。プレートを、Ａｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で明らかにし、蛍光シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）において測定する。

ＣＥＡＣＡＭ５のκλボディへの結合が、それぞれのツール抗体によって８０％またはそれよりも大きく低減される場合、ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体が、ツール抗体と競合的に結合するように分類されると結論付けることができる。したがって、ＣＥＡｘＣＤ３抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５のそれぞれのκλボディへの結合が、ツール抗体の添加ありおよびなしの結果を比較する場合に２０％またはそれ未満、低減される場合、ツール抗体と非競合として同定される。
ｄ）二特異性抗体の初代ヒト血液細胞への結合

ＣＤ３ｘＣＥＡＣＡＭ５κλ抗体の、初代Ｔ細胞への結合、ならびに初代Ｂ細胞および単球（ＣＥＡ陰性集団）への結合の欠如を実証するために、フローサイトメトリーに基づく一連の実験を行うことができる。細胞染色および結合評価を、実施例７ａに記載されるようにして行うことができる。データを図１３に示す。
（実施例８）
二特異性抗体によって媒介されるＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）
ａ）ＣＥＡＣＡＭ５陽性およびＣＥＡＣＡＭ５陰性の細胞系のＴＤＣＣ

本発明のＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体によって誘導される異なるＣＥＡＣＡＭ５陽性およびＣＥＡＣＡＭ５陰性の腫瘍細胞系のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）を、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣまたは精製された初代Ｔ細胞のいずれかを使用して、評価する。

標的細胞を、ＰＢＳでの２回の洗浄後、トリプシンまたは細胞解離溶液で脱離させる。遠心分離ステップ後、細胞を、アッセイ媒体に再懸濁させ、必要な濃度に調整し、９６ウェルプレートに蒔く。

エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製されたＴ細胞のいずれかであり得る。ＰＢＭＣは、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを使用して、健康なヒトドナーから得られたバフィコートから単離される。精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用する場合、追加の精製ステップを行い、ここで、Ｔ細胞は、Ｔ細胞免疫磁気陰性選択キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により、ＰＢＭＣから負に単離される。

ＴＤＣＣアッセイのために、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、これらを１０：１の最終Ｅ：Ｔ比で標的細胞に添加し、精製されたＴ細胞を使用する場合、５：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用する。次いで、本発明のＣＥＡｘＣＤ３抗体および関連対照抗体を、用量範囲の濃度（最大で１００ｎＭ、二連）で、事前に蒔かれた標的細胞およびエフェクター細胞に添加する。標的細胞殺滅を、３７℃、５％のＣＯ_２での２４時間、４８時間または７２時間のいずれかのインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔＰＬＵＳ （ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）により媒体に放出されたＬＤＨを定量することによって、評価する。最大ＬＤＨ放出（＝１００％溶解）を、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００とともに標的細胞をインキュベートすることによって得た。自然ＬＤＨ放出（＝０％溶解）は、添加されるいかなる抗体もなしで、エフェクター細胞と共培養された標的細胞を指す。ＴＤＣＣ曲線（図６、７、１２および１５）およびＥＣ５０値（表５）を、ＭＫＮ－４５およびＬＳ１７４Ｔ細胞系について、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して計算することができ、表５に示される本発明のｂｓＡｂで見出されたＥＣ５０が、ＴＣＢ２０１４で測定されたＥＣ５０よりも有意に低く、これらの本発明のｂｓＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞殺滅についてのより高い効力を実証する。
表５ ３つのＣＥＡ＋細胞系の殺滅ＥＣ５０
ｂ）ＣＥＡｘＣＤ３およびＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体の組合せによる殺滅アッセイ

本発明の二特異性抗体と抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１４０９８９号および国際公開第２０１７１９６７９３号に記載）との、またはＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体（国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号に記載、参照により本明細書に組み込まれる）との組合せを、上記に記載されるモデルにおいて試験することができる。追加の試験条件を、実験設計に追加し、ここで、そのようなＣＤ４７標的化抗体（単一または二特異性）を、単独で、または本発明のＣＥＡｘＣＤ３抗体との組合せのいずれかで、異なる用量で、使用する。
ｃ）ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂによって誘導されるＣＥＡを発現する腫瘍細胞の殺滅におけるＴ細胞活性化マーカーの上方調節

ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂによって誘導されるＣＥＡ陽性腫瘍細胞の殺滅は、Ｔ細胞の活性化を必要とし、これは、ＣＤ６９（早期活性化マーカー）またはＣＤ２５（後期活性化マーカー）などの特異的Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗体を使用して、フローサイトメトリーによって定量することができる。

殺滅アッセイ（上記の実施例８ａに記載）の最後でのＴ細胞の活性化状態を評価するために、以下の手順を続ける：浮遊細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む）を、新たなＶ底９６ウェルプレート中に移す。上清を、遠心分離（４℃で３分間、１３００ｒｐｍ）によって除去し、細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ２％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ_３）で２回洗浄した後、Ｆｃ－ブロック試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、４℃で１５分間、インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、以下の抗体とともに、４℃で１５分間、インキュベートする（製造者の推奨に従って使用）：抗ＣＤ４５（Ｖ５００コンジュゲート化、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６９（ＦＩＴＣコンジュゲート化、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート化、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（ＰＥコンジュゲート化、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＡＰＣコンジュゲート化、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｒ７００コンジュゲート化、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させる。蛍光を、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定し、データを、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ｖ１０ソフトウェア（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析する。結果を図１７に示す。
ｄ）ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂ分子によって誘導されるＴ細胞増殖

ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂを、ＣＥＡ陽性腫瘍標的細胞の存在下での架橋の際にＴ細胞増殖を誘導するそれらの能力について分析する。陰性対照として、ＣＥＡ陰性悪性細胞を、同様に使用する。新鮮な単離されたヒトＰＢＭＣを、温ＰＢＳで、１ｍＬあたり１００万個細胞に調整し、ＰＢＳ中の０．２μＭのカルボキシルフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３７℃で１５分間、染色し、完全ＲＰＭＩ培地（１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノールおよび２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する）で数回洗浄し、９６ウェルプレートに、１ｍＬあたり２×１０^６個細胞で移す。０．０２×１０^６個の標的細胞を、平底９６ウェルプレートのウェルごとに蒔き、異なるＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂを、示された濃度で添加する。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得るために添加し、アッセイプレートを、加湿インキュベーター中、３７℃で５日間、インキュベートする。５日目に、エフェクター細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ_３）で２回洗浄し、次いで、細胞を、死細胞を排除するＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ６２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６４９９６）、ならびに抗ＣＤ４５（Ｖ５００コンジュゲート化、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、１７－００４９－４１）および抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１０３２）で染色する。ＣＦＳＥ染色を、生ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞において、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析し、結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって評価する。
ｅ）ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂによって誘導されるＣＥＡを発現する腫瘍細胞の殺滅の際に上清中に放出されたサイトカイン

ＣＥＡｘＣＤ３ ｂｓＡｂによって誘導されるＣＥＡ陽性腫瘍細胞の殺滅は、Ｔ細胞活性化を必要とする。活性化の際に、Ｔ細胞は、免疫モジュレート剤としてさらに作用し得る複数のサイトカインを放出することができる。ＣＥＡを発現する腫瘍細胞の殺滅の際にＴ細胞によるサイトカイン放出を誘導する本発明の二特異性抗体の能力を、実施例８ａに記載されるＴＤＣＣアッセイの最後に、上清中の選択されたサイトカインを定量することによって評価した。ＣＥＡ陽性標的細胞およびＣＤ３陽性エフェクターＴ細胞の共培養の２日後に、培養上清を、遠心分離によって回収し、さらなる分析まで－８０℃で凍結保存した。グランザイムＢ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどのサイトカイン／酵素を、マルチプレックスキットを使用することによる、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して定量し、結果を図１６に示す。
ｆ）脱落ＣＥＡの存在下でのＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞のＴＤＣＣ

ＣＥＡ陽性腫瘍は、ＣＥＡを脱落させることが公知である。そのような脱落ＣＥＡは、膜結合ＣＥＡに優先的に結合しないＣＥＡ標的化抗体の抗腫瘍有効性に負の影響を与え得る。本発明の二特異性抗体が、脱落ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）によって影響を受けるかどうかを評価するために、実施例８ａに記載されるＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイを、様々な濃度のスパイクされたｓＣＥＡ（ＢｉｏＲａｄ＃ ＰＨＰ２８２）の存在下で行う。次いで、ｓＣＥＡの存在下でのＥＣ５０値を、ｓＣＥＡの非存在下で得られたＥＣ５０と比較する（表６）。次いで、所与のｓＣＥＡ濃度（０．２、１または１μｇ／ｍＬ）について計算されたＥＣ５０を、ｓＣＥＡの非存在下（０μｇ／ｍＬ）で得られたものと比較し、脱落ＣＥＡなしの条件と比較したＥＣ５０の倍数変化として表す。そのような値を表７に報告する。
表６ ｓＣＥＡの存在下でのＬＳ１７４Ｔ細胞の殺滅のＥＣ５０
＊トッププラトーなし
表７ 脱落ＣＥＡなし条件と比較したＥＣ５０の倍数変化（０ μｇ／ｍＬ）
＊トッププラトーなし

１および５μｇ／ｍＬのｓＣＥＡで、本発明の二特異性抗体と比較して、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７に、ｓＣＥＡが添加される場合に、腫瘍細胞殺滅についてのＥＣ５０の有意なより高いシフトが見出された。１μｇ／ｍＬおよびそれを上回るｓＣＥＡの濃度が、ＣＥＡ陽性腫瘍を有する患者において見出される。本発明のｂｓＡｂの殺滅曲線のｓＣＥＡに起因するより低いシフトは、ＴＣＢ２０１４およびＴＣＢ２０１７と比較して、本発明のｂｓＡｂの有効性に対する高ｓＣＥＡレベルの影響をあまり阻害しないことを示唆する。
ｇ）ＣＥＡＣＡＭ５陰性初代血液細胞集団のＴＤＣＣ

ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体の作用機構を考えると、他のＣＥＡＣＡＭとの交差反応性は、重要な循環する健康な細胞集団の枯渇をもたらし得る。例えば、好中球によって発現されるＣＥＡＣＡＭ８との交差反応性は、そのような細胞集団の枯渇をもたらし得る。結合の非存在、したがって、そのようなＣＥＡ陰性の循環する健康な細胞集団の殺滅の非存在を確認するために、好中球などの精製された初代細胞を、実施例８ａに記載される実験手順におけるＣＥＡ陽性細胞系の代わりに「標的細胞」として使用する。
（実施例９）
ヒト化マウス腫瘍モデルにおける、単剤としてまたはＣＤ４７標的化抗体との併用療法におけるＣＥＡｘＣＤ３ Ｔ細胞再標的化分子の抗腫瘍活性の評価
ａ）ＰＢＭＣヒト化マウス腫瘍モデルにおけるＣＥＡｘＣＤ３分子の抗腫瘍活性

８～１０週齢のＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＯＬ－２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、１～５×１０^６個のＣＥＡ陽性腫瘍細胞（細胞系由来または患者由来）を皮下に（ｓ．ｃ．）移植し、いくつかの処置群に無作為化する。４～７日後、すべてのマウスに、ヒト化プロセスのために、ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．で、１０×１０^６個または２０×１０^６個のヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を注射する。次いで、ＣＤ３ｘＣＥＡ分子または対照を、異なる用量で、ＰＢＭＣ注射の３～６日後に開始して、週に１回または２回、ｉ．ｖ．投与する。マウスを、腫瘍の発生について、週に３回、モニターし、腫瘍を、実験のエンドポイント（腫瘍体積＝１５００ｍｍ^３またはＧｖＨＤ症状の発症）まで、デジタルキャリパーによって測定する。腫瘍体積を、式（長さ×幅^２）×０．５を使用して、計算する。統計分析を、研究の最後に、一元配置分散分析の比較分析を使用して行う。１００万個のＨＰＡＦ－ＩＩ細胞をＮＯＧマウスにおいて皮下に生着させ、その後１０００万個のヒトＰＢＭＣを注射した実験からの結果を、図１９に示す。
ｂ）ＣＤ３４^＋ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるＣＥＡｘＣＤ３分子の抗腫瘍活性

１４週齢の血液中に＞２５％のヒトＣＤ４５^＋細胞を有する完全ヒト化ＣＤ３４^＋－ｈｕＮＯＧマウス（ＣＤ３４^＋生着（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ）ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＯＬ－２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、１～５×１０^６個のＣＥＡ陽性腫瘍細胞（細胞系由来または患者由来）を皮下（ｓ．ｃ．）移植し（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）、いくつかの処置群に無作為化する。平均腫瘍体積が、所定の値（１００～２００ｍｍ^３の範囲）に達したときに、ＣＤ３ｘＣＥＡ分子または対照を、異なる用量で、週に１回または２回、ｉ．ｖ．投与する。マウスを、腫瘍成長について、週に３回、モニターし、腫瘍を、実験のエンドポイント（腫瘍体積＝１５００ｍｍ^３）まで、デジタルキャリパーによって測定する。腫瘍体積を、式（長さ×幅^２）×０．５を使用して、計算する。統計分析を、研究の最後に、一元配置分散分析の比較分析を使用して行う。
ｃ）ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるＣＤ４７標的化抗体（単一特異性または（ｏｆ）二特異性）と組み合わせたＣＥＡｘＣＤ３分子の抗腫瘍活性

本発明の二特異性抗体と抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１４０９８９号および国際公開第２０１７１９６７９３号に記載）またはＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体（国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号に記載、参照により本明細書に組み込まれる）との組合せを、上記に記載されるモデルにおいて試験することができる。ＣＤ４７標的化抗体（単一特異性または二特異性）が、さまざまな用量で、単独または本発明のＣＥＡｘＣＤ３抗体と組み合わせてのいずれかで、毎週１回または２回、ｉ．ｖ．投与される処置群を含む追加群を実験設計に追加する。
ｄ）トランスジェニックマウス腫瘍モデルにおけるＣＤ４７標的化抗体（単一特異性または（ｏｆ）二特異性）と組み合わせたＣＥＡｘＣＤ３分子の抗腫瘍活性

本発明の二特異性抗体と抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（例えば、米国特許出願公開第２０１４０１４０９８９号および国際公開第２０１７１９６７９３号に記載）またはＣＥＡｘＣＤ４７二特異性抗体（国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５４５５９号に記載、参照により本明細書に組み込まれる）との組合せを、ヒトＣＥＡおよびヒトＣＤ４７を発現するように操作された０．５～５×１０^６個マウス腫瘍細胞を皮下に（ｓ．ｃ．）移植された、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ４７およびヒトＳＩＲＰαを発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて試験することができる。平均腫瘍体積が、所定の値（１００～２００ｍｍ^３の範囲）に達したときに、マウスを無作為化する。処置を、異なる用量で、週に１回または２回、ｉ．ｖ．投与する。マウスを、腫瘍成長について、週に３回、モニターし、腫瘍を、実験のエンドポイント（腫瘍体積＝１５００ｍｍ^３）まで、デジタルキャリパーによって測定する。腫瘍体積を、式（長さ×幅^２）×０．５を使用して、計算する。統計分析を、研究の最後に、一元配置分散分析の比較分析を使用して行う。
（実施例１０）
健康なヒトドナーのヒト血液由来の全血およびＰＢＭＣにおいて試験されるサイトカイン放出

ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン放出アッセイを、水性状態（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）中の試験抗体（９５％ｖ／ｖ血液）による最小希釈の全血（ＷＢ ＣＲＡ）を使用して行う。このアッセイフォーマットは、サイトカイン放出の機構に影響を与え得る生理学的濃度で因子を含有する、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を厳密に模倣すると考えられる。しかしながら、このフォーマットは、Ｔ細胞媒介性サイトカイン放出（例えば、抗ＣＤ２８）を予測するのに不十分であると考えられる。

あるいは、サイトカイン放出アッセイを、Ｔ細胞媒介性サイトカイン放出（ＰＢＭＣ ＡＰ ＣＲＡ）を評価するために、健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、水性状態（水相、ＡＰ）中の抗体を用いて行うことができる。このフォーマットは、架橋の際に抗ＣＤ３抗体で観察される高いサイトカイン放出を回避するために、ｍＡｂの架橋を制限する。

それぞれのアッセイフォーマットについての陰性対照（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂおよびＰＢＳ）および特異的陽性対照（抗ＣＤ５２ ｍＡｂ、ＣＥＡｘＣＤ３ ＢｉＴＥおよび／または抗ＣＤ２８ ｍＡｂ）を、ＣＥＡｘＣＤ３二特異性抗体と並行して試験する。ＷＢ ＣＲＡについて２４時間後、およびＰＢＭＣ ＡＰ ＣＲＡについて４８時間後、上清を、読み取りとして電気化学発光を使用するマルチプレックスアッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｓｅｃｔｏｒ ６００）において、サイトカインについて試験する。ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－６を、ＷＢ ＣＲＡについて測定し、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０およびＴＮＦαを、ＰＢＭＣ ＡＰ ＣＲＡについて測定する。結果をサイトカインごとにプロットし、各ドナーは単一のデータポイントとして表示する。
（実施例１１）
縮重オリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（リード最適化；ＬＯ）によるＣＥＡ抗体の親和性成熟

実施例３に記載されるスクリーニングプロセスの間に同定された抗体を、それらの親和性および効力を増加させるために、親和性成熟のために選択する。すべてのこれらの抗体は、同じ可変重鎖を共有するが、異なる可変軽鎖を有する。ＡＢ１およびＣ１１は、カッパ軽鎖（それぞれ、ＩＧＫＶ３－１１およびＩＧＫＶ１－５、ＩＭＧＴ命名法に従う）を含有するが、ＡＢ８および１Ｂ４は、ラムダ軽鎖（それぞれ、ＩＧＬＶ２－１４およびＩＧＬＶ３－２１）を含有する。ｓｃＦｖバリアントを提示するいくつかのファージライブラリーを、重鎖可変領域を未改変に保ちながら、可変軽鎖領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に多様性を導入することによって、生成する。異なる多様化戦略を使用して、それぞれの候補についてライブラリーを生成し、ここで、ＣＤＲＬ１＋ＣＤＲＬ２；またはＣＤＲＬ３のみ、またはすべての３つのＣＤＲＬを、縮重オリゴヌクレオチドを使用する親配列のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって、多様化させる（ＣＤＲＬ１＋ＣＤＲＬ２＋ＣＤＲＬ３）。ＣＤＲＬ１は、１～５のアミノ酸位置で多様化され、ＣＤＲＬ２は、１～４のアミノ酸位置で多様化され、ＣＤＲＬ３は、１～５のアミノ酸位置で多様化される。最大で１０^１４の理論多様性を部分的にカバーする合計で最大で５×１０^９個の形質転換体を、それぞれの候補について生成する。

候補ＡＢ１および１Ｂ４について、すべてのＣＤＲＬにわたって最大で１７のアミノ酸位置で多様化された追加のライブラリーを、最大で１０^２１の理論多様性を部分的にカバーする最大で５×１０^９個の形質転換体で生成する。

選択ストリンジェンシーを、異なる選択ラウンド間で組換え体ｈＣＥＡＣＡＭ５の濃度を１００ｎＭから０．０１ｎＭまで徐々に下げて低減することによって、またはＳＮＵＣ－１細胞系のようにより低いレベルのｈＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞を使用することによって、ラウンド間で増加させることを除いて、これらのライブラリーを、実施例２に記載されるようにして、ファージディスプレイ選択のために使用する。選択されたバリアントを、実施例３に記載されるアッセイを使用して、ＣＥＡＣＡＭ５に結合する能力についてスクリーニングする。陽性クローンを、ＩｇＧとして再フォーマットし、実施例４および５にそれぞれ記載されるようにして、特性評価する。

抗ＣＥＡアームＡＢ１（配列番号３１～３４）を、２つの連続するリード最適化ウェーブにおいて最適化した。ウェーブ１は、抗ＣＥＡアームＡＢ１３、ＡＢ１４、ＡＢ１５、ＡＢ１７およびＡＢ２０をもたらした。ウェーブ２は、抗ＣＥＡアームＡＢ５４、ＡＢ６０、ＡＢ６６、ＡＢ７１、ＡＢ７２およびＡＢ７３をもたらした。
（実施例１２）
腫瘍に由来するオルガノイドのＴＤＣＣ（Ｔ細胞依存性細胞傷害）および／またはＴＤＣＣとＡＤＣＰ

腫瘍細胞に由来するオルガノイドは、Ｔ細胞再標的化化合物ならびに／またはマクロファージおよびＮＫ細胞再標的化化合物を試験するための高度なトランスレーショナルモデルである。

オルガノイドを、標準手順（Ｓｃｈｕｅｔｔｅら， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１７； ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４２６２）に従って調製し、ＰＢＭＣとの共培養で最長で８日間、化合物とともにインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマクロファージを生成する。培地を、４日ごとに交換し、新鮮な培地で置き換える。

オルガノイドを、収集し、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、３７℃で５分間、単一細胞に酵素的に解離させる。細胞を、ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、４００μｍの細胞ストレーナーを通して濾過する。等細胞数の懸濁物を、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＥＡおよびＣＤ１４に対する抗体（すべて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ由来）とともに、氷上で３０分間、インキュベートする。生細胞ゲーティングのために、ヨウ化プロピジウムを使用し、測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を使用して分析する。

それぞれのウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡを使用することによるＴ細胞活性の分析のために、－８０℃で凍結する。
（実施例１３）
患者に由来する腫瘍組織スライスのＴＤＣＣおよび／またはＴＤＣＣとＡＤＣＰ

患者に由来する新鮮な腫瘍組織スライスは、Ｔ細胞および／またはマクロファージおよび／またはＮＫ細胞再標的化化合物を試験するための別の高度なトランスレーショナルモデルである。

新鮮な腫瘍組織試料を、以前に公開された標準手順（Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎら， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ， １７ （２０１８） ｅ１８９－ｅ１９９）に従って、切断する。簡潔には、外科的切除および最初の肉眼での病理学的評価の直後に、腫瘍試料を、組織チョッパー（ＭｃＩｌｗａｉｎ ＴＣ７５２；Ｃａｍｐｄｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、３５０μｍのスライスに切断する。次いで、組織スライスの直径を、３ｍｍのコアリングツール（ｋａｉ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、標準化する。３つの組織スライスを、無作為にプールし、膜インサートに置き、６ウェルプレート中で培養する。スライスを、３７℃および５％のＣＯ_２の標準化条件下でインキュベートする。培地を、処理の前に、調製の２時間および２４時間後に交換する。

標準細胞培養培地中での事前培養の２４時間後、三連のスライスを、それぞれ、単独でまたは組合せで、本発明による二特異性抗体に、最長で１２０時間、曝露することができる。必要により、インキュベーション時間を７２時間に減らす。培地を、７２時間後に交換する。

化合物曝露後、腫瘍スライスを、４％のパラホルムアルデヒドを使用して、終夜、固定する。それぞれのウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡを使用するＴ細胞活性の分析のために、－８０℃で凍結する。

パラホルムアルデヒド固定スライスを、パラフィンに包埋し、５μｍの切片に処理する。ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色を行って、病理組織学的態様および腫瘍細胞の割合を評価する。全細胞カウント、腫瘍細胞カウントおよび増殖を、免疫蛍光染色によって分析する。簡潔には、パラフィン切片を、脱パラフィン化する。抗原回復後、切片を、０．３％のＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘで洗浄し、５％の正常ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）で、３０分間、ブロッキングする。それぞれ、サイトケラチン
、Ｋｉ６７および切断ＰＡＲＰに対する一次抗体を、０．５％のウシ血清アルブミンに希釈し、４℃で終夜、インキュベートする。切片を、０．３％のリン酸緩衝食塩水／Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘですすぎ、二次抗体で標識する。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色する。さらなる分析のために、ＣＥＡ（腫瘍細胞）、ＣＤ１６３（マクロファージ）、およびＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－Ｌ１ならびにＦｏｘＰ３（すべてＴ細胞）に対する抗体を、腫瘍スライスの利用可能性に応じて含める。

腫瘍細胞を含有する領域を、スライドスキャン（Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＳＣＡＮおよびＰａｎｎｏｒａｍｉｃ Ｖｉｅｗｅｒ、３Ｄ Ｈｉｓｔｅｃｈ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して、ＨＥ切片中で分析して、様々な腫瘍細胞画分を調べる。新生物性上皮細胞よりも多くの良性上皮細胞を含有するスライスを、分析から除外する。腫瘍細胞を含有していなかったスライスを、増殖している腫瘍細胞画分の分析から除外するが、条件ごとの腫瘍細胞の分析に含める。さらなる分析のために、組織スライスごとに５枚の写真（２０×）を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、蛍光染色された切片から取得する。陽性ピクセルカウントを、Ｉｍａｇｅ Ｊのための染色特異的セグメンテーションアルゴリズムを用いて、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、サイトケラチン、Ｋｉ６７および切断ＰＡＲＰ染色について決定する。増殖／アポトーシス腫瘍領域を、サイトケラチン陽性ピクセルの周囲のＫｉ６７／切断ＰＡＲＰ陽性核のピクセルを分析することによって計算する。

すべての写真について、総細胞カウント（Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性）、腫瘍細胞カウント（Ｈｏｅｃｈｓｔおよびサイトケラチン陽性）および増殖している腫瘍細胞カウント（Ｈｏｅｃｈｓｔ、サイトケラチン、およびＫｉ６７陽性／切断ＰＡＲＰ）を計算する。腫瘍細胞カウントを、総細胞カウントに対して正規化し、増殖している腫瘍細胞カウントを、腫瘍細胞カウントに対して正規化し、写真ごとの異なる腫瘍細胞画分を考慮する。次いで、平均スライス値を、単一の画像値から計算する。条件についての平均値を、平均スライス値を使用して計算する。

本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む受託番号／データベース配列は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が、参照によりそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (28)

1. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、
   ａ）前記第１の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
   ｂ）前記第１の結合部分が、
   ｂ１）配列番号９０のＣＤＲＬ１、配列番号９１のＣＤＲＬ２および配列番号９２のＣＤＲＬ３、
   ｂ２）配列番号９６のＣＤＲＬ１、配列番号９７のＣＤＲＬ２および配列番号９８のＣＤＲＬ３、
   ｂ３）配列番号９９のＣＤＲＬ１、配列番号１００のＣＤＲＬ２および配列番号１０１のＣＤＲＬ３、
   ｂ４）配列番号１０２のＣＤＲＬ１、配列番号１０３のＣＤＲＬ２および配列番号１０４のＣＤＲＬ３、
   ｂ５）配列番号１０５のＣＤＲＬ１、配列番号１０６のＣＤＲＬ２および配列番号１０７のＣＤＲＬ３、
   ｂ６）配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９のＣＤＲＬ２および配列番号１１０のＣＤＲＬ３、ならびに
   ｂ７）配列番号１１１のＣＤＲＬ１、配列番号１１２のＣＤＲＬ２および配列番号１１３のＣＤＲＬ３
   からなる群から選択されるＣＤＲＬのセットを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
   ｃ）前記第２の結合部分が、配列番号２のＣＤＲＨ１、配列番号３のＣＤＲＨ２および配列番号４のＣＤＲＨ３を含むＶＨを含み、
   ｄ）前記第２の結合部分が、配列番号１８のＣＤＲＬ１、配列番号１９のＣＤＲＬ２および配列番号２０のＣＤＲＬ３を含むＶＬを含む、
   二特異性抗体。
2. ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
   ｂ）前記第１の結合部分中に、
   ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ２）配列番号１１９の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ３）配列番号１２０の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ４）配列番号１２１の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ５）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ６）配列番号１２３の軽鎖可変領域ＶＬ、および
   ｂ７）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
   からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
   ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
   を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
3. ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
   ｂ）前記第１の結合部分中に、
   ｂ１）配列番号１１７の軽鎖可変領域ＶＬ、
   ｂ２）配列番号１２２の軽鎖可変領域ＶＬ、および
   ｂ３）配列番号１２４の軽鎖可変領域ＶＬ
   からなる群から選択される軽鎖可変領域ＶＬ、ならびに
   ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号１７の軽鎖可変領域ＶＬ
   を含む、請求項２に記載の二特異性抗体。
4. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、
   ａ）前記第１の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨ、
   ｂ）前記第１の結合部分中に、
   ｂ１）配列番号１２８の軽鎖、
   ｂ２）配列番号１３０の軽鎖、
   ｂ３）配列番号１３１の軽鎖、
   ｂ４）配列番号１３２の軽鎖、
   ｂ５）配列番号１３３の軽鎖、
   ｂ６）配列番号１３４の軽鎖、および
   ｂ７）配列番号１３５の軽鎖
   からなる群から選択される軽鎖、ならびに、
   ｃ）前記第２の結合部分中に、配列番号１の重鎖可変領域ＶＨおよび配列番号２８の軽鎖を含む、二特異性抗体。
5. ａ）配列番号４３の重鎖、
   ｂ）配列番号４４の重鎖、および
   ｃ）配列番号４５の重鎖
   からなる群から選択される共通重鎖を含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
6. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１２８の軽鎖を含む、二特異性抗体。
7. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１３３の軽鎖を含む、二特異性抗体。
8. ヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合する第１の結合部分およびヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の結合部分を含む二特異性抗体であって、前記抗体が、配列番号４５の共通重鎖、ならびに前記第２の結合部分中に、配列番号２８の軽鎖、および前記第１の結合部分中に、配列番号１３５の軽鎖を含む、二特異性抗体。
9. Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、Ｆｃドメインを含むことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
10. ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物。
11. がんを患っているヒト対象への投与に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物。
12. 結腸直腸癌、食道がん、膵臓腺癌、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部癌、子宮がんおよび膀胱がんの処置における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物。
13. ＣＥＡを発現する固形腫瘍の処置のための単剤療法における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物。
14. がんの処置における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物であって、同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
15. がんの処置における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物であって、同時、別々または逐次的組合せで、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体および／またはＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
16. がんの処置における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物であって、同時、別々または逐次的組合せで、ＰＤ－１軸アンタゴニストと組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
17. 前記ＰＤ－１軸アンタゴニストが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、およびランブロリズマブからなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
18. がんの処置における使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体および二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体を含む組み合わせ物であって、本発明の抗体および前記二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体が、本発明の抗体および前記二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の投与の間が６～１５日の間隔の交互投与において投与されることを特徴とする、組み合わせ物。
19. 前記抗体が、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、請求項１０～１７のいずれか一項に記載の組成物または請求項１８に記載の組み合わせ物。
20. 本発明の抗体が、患者に、１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物または組み合わせ物。
21. 前記抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体が、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与されることを特徴とする、請求項１４、１５または１８のいずれか一項に記載の組成物または組み合わせ物。
22. 前記ＰＤ－１軸アンタゴニストが、患者に、１日あたりまたは１週間あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、単回もしくは分割用量でまたは持続注入によって投与される、請求項１９に記載の組成物。
23. 請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
24. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
25. 請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
26. 請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２５に記載のベクターを含む細胞。
27. がんの処置における使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物は、前記組成物および二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体の投与の間が６～１５日の間隔の前記二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体との交互投与において投与されることを特徴とする、組成物。
28. がんの処置における使用するための、二特異性抗ＣＥＡｘＣＤ４７抗体を含む組成物であって、前記組成物は、請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体および前記組成物の投与の間が６～１５日の間隔の請求項１～９のいずれか一項に記載の二特異性抗体との交互投与において投与されることを特徴とする、組成物。