JP7701964B2 - Ｃｄ１３７及びｏｘ４０に結合する抗体分子 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０の両方に結合し、且つそれらをアゴナイズすることができる抗体分子に関する。抗体分子は、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位とを含む。本発明の抗体分子は、例えば、癌及び感染症などの疾患の処置において用途を見出す。

発明の背景
哺乳動物の免疫系は、バランスの取れたシステムであり、癌などの疾患によって破壊されることがある。チェックポイント受容体は、共刺激効果又は共阻害効果のいずれかを発揮することにより、疾患に対する免疫系の応答に重要な役割を果たし、そのバランスが免疫応答の運命を決定する（Pardoll, 2012）。共阻害剤は、Ｔ細胞の増殖を阻害し、抗炎症性サイトカインの放出を誘導する。それらは、炎症を弱め、過度の免疫応答による臓器／組織の損傷を防ぐ。一方で、共刺激因子は、防御的免疫応答の発生を促進するためにＴ細胞のクローン拡大培養、エフェクター分化及び生存を促進する。

実証済みの癌免疫療法アプローチの１つは、共阻害受容体の機能を遮断するか又は共刺激受容体の活性を誘導する抗体でこれらのチェックポイント受容体を標的とすることにより、免疫系が腫瘍細胞を認識し、死滅させることを誘発する（Pardoll, 2012）。共阻害性受容体の活性を遮断する抗体は、良好な臨床活性を示しており、現在、癌の処置について承認されている（Larkin et al., 2015）。共刺激受容体の活性を誘導する抗体は、前臨床モデルシステムで大きい可能性を示しており（Moran et al., 2013；Schaer et al., 2014）、現在、いくつかの薬剤が臨床試験中である（Mayes et al., 2018；Melero et al., 2013）。これらの抗体は、これらの共刺激受容体のリガンドを模倣することを目的としているため、アゴニスト抗体とも呼ばれる。

いくつかのＴ細胞共刺激受容体は、細胞表面で発現する免疫細胞機能及び非免疫細胞機能の両方に関与するタンパク質の大きいファミリーである、受容体のＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである（Bremer, 2013）。ＴＮＦファミリー受容体とその同族リガンドとの間で形成される複合体の構造解析は、ほとんどの場合、三量体対三量体の化学量論性があり、ＴＮＦＲファミリーリガンドは、典型的には、細胞表面で三量体として発現されることを示す（Wajant, 2015）。ＴＮＦＲ活性化について提案されたモデルは、三量体リガンドとの相互作用が単量体受容体の三量体化を誘導し、シグナル伝達を開始するというものである。これは、ＴＮＦＲファミリーメンバーが単量体として発現され、リガンド相互作用のみが受容体三量体の形成を誘導することを前提としている。このモデルは、最近では疑問視されており（Vanamee&Faustman, 2018）、リガンド相互作用の非存在下でのこれらの単量体のより高次構造への会合は、依然として議論の余地がある。リガンドスーパークラスターを形成し、ＴＮＦ受容体スーパークラスターを誘導することができ、それによってより高いレベルの受容体活性化を誘導する、膜結合型と比較して複数の受容体複合体の追加のクラスター化を必要とする予め組み立てられた受容体二量体又はさらに不活性な三量体の存在は、一部の可溶性の三量体のみのＴＮＦリガンドの活性が低いことを説明する（Mueller et al., 2008）。この理論は、ＴＮＦＲ特異的抗体が、典型的には、アゴニスト活性を有しないか又はアゴニスト活性が低く、十分な受容体のクラスター化及び活性化を誘導し、それによりＴＮＦリガンドスーパークラスターを模倣するために抗体－ＴＮＦ受容体複合体の二次架橋を必要とするという観察結果にも一致している（Wajant, 2015）。

抗体－ＴＮＦ受容体複合体の二次架橋は、プロテインＡ若しくはＧなどの架橋剤又はＴＮＦ受容体特異的アゴニスト抗体の定常ドメインを標的とする二次抗体によってインビトロで達成できる（Vanamee&Faustman, 2018；Wajant, 2015）。しかし、インビボでは、この二次架橋には、マクロファージ、ＮＫ細胞又はＢ細胞などの免疫細胞の表面に存在するＦｃガンマ受容体との相互作用が必要である。抗体のＦｃガンマ受容体との相互作用は、複雑である。これは、ヒトにおいて、４つのヒトＩｇＧアイソタイプに対して異なる発現パターン及び親和性を有する６つのＦｃガンマ受容体があるためである（Bruhns et al., 2009）。Ｆｃガンマ受容体は、インビボでＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的を標的とするアゴニスト抗体の最適な抗腫瘍活性に必要であることが示されている（Bulliard et al., 2013；Bulliard et al., 2014）。しかし、受容体の強力な活性化を誘導するためのＦｃガンマ受容体媒介性架橋に対するＴＮＦＲアゴニスト抗体の依存性は、以下のいくつかの理由により、インビボでそれらの全体的な活性を制限する可能性がある。１）抗体結合細胞は、トランスでＦｃガンマ受容体発現細胞と相互作用する必要があり、この相互作用の頻度により、ＴＮＦＲ発現細胞の活性化が制限される。２）ヒトＩｇＧに対するＦｃガンマ受容体の親和性は、通常、その標的に対する典型的な治療用抗体の親和性と比較してはるかに低い（それぞれマイクロモル濃度範囲対ナノモル濃度範囲）。３）Ｆｃガンマ受容体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食）などの抗体のエフェクター機能を媒介するため、アゴニスト抗体が活性化することを意図した細胞自体を排除する可能性がある（Mayes et al., 2018）。

同族抗原の１つを使用してＴＮＦ受容体アゴニストを架橋する二価二重特異性抗体は、Ｆｃガンマ受容体媒介性架橋の代替となる。抗体架橋の効果は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー及び同じ細胞（シス）又は別の細胞（トランス）のいずれかで受容体を発現する別の細胞に結合することから生じ得る。ここで、抗体架橋のこのメカニズムは、第２の標的が高レベルで発現され、ＴＮＦリガンドスーパークラスターを模倣している場合、ＴＮＦ受容体のスーパークラスター化をもたらし得る。ＴＮＦＲアゴニスト抗体開発への二重特異性抗体アプローチには、単一特異性アゴニスト抗体に対して以下のいくつかの理論上の利点がある。１）ＴＮＦＲアゴニスト作用は、二重特異性抗体の第２の特異性として、チェックポイント受容体又は腫瘍関連抗原などの第２の抗原を標的とすることにより、腫瘍微小環境及び末梢における特定の免疫細胞に向けることができる。２）二重特異性抗体の架橋結合ドメインの親和性は、Ｆｃガンマ受容体に対する抗体の親和性よりも高くなるように設計することができ、それにより架橋がより効果的になる。３）抗体エフェクター機能は、変異を使用して選択的に無効にすることができ、それにより活性化することを意図した細胞の枯渇がないことが保証される。４）２つの別個のＴＮＦ受容体のアゴニスト作用は、単一の二重アゴニスト分子で達成でき、異なる免疫細胞の活性化を組み合わせて免疫応答のより強力な刺激をもたらす。５）共発現した受容体を標的とすることで、２つの細胞が相互作用する必要なく、シスの単一細胞を活性化することができる。

ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーのいくつかは、免疫細胞において重複する発現パターンを有する。具体的には、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ及びＣＤ２７は、活性化Ｔ細胞で発現し、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の共発現は、実験的に検証されている（Ma et al., 2005）。

ＯＸ４０は、主に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、１型及び２型Ｔヘルパー（Ｔｈ１及びＴｈ２）細胞並びに制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む活性化Ｔ細胞上に発現し、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上にも発現する。ＯＸ４０と、そのリガンドであるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）との相互作用は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現し、Ｔ細胞のクローン拡大培養、分化及び生存を増加させ、メモリーＴ細胞の生成を増強する（Croft et al., 2009）。ＯＸ４０刺激は、Ｔ細胞に対する直接的な影響を有し得、Ｔ細胞の増殖及び生存を促進するか、又はＩＬ２及びＩＦＮγなどの炎症性サイトカインの産生を促進することによる間接的な影響を有し得る。ＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの機能を調節することもできるが、これらの細胞ではその抑制活性を抑制する（Takeda et al., 2004）。癌では、ＯＸ４０は、頭頸部癌、黒色腫、結腸直腸癌を有する患者からの腫瘍浸潤Ｔ細胞に発現し、高レベルのＯＸ４０陽性リンパ球が生存率の向上と相関していることが見出された（Petty et al., 2002；Vetto et al., 1997）。マウスにおけるＯＸ４０アゴニスト抗体の前臨床試験では、いくつかの同系腫瘍モデルで治療効果が実証されているが、単剤療法としてＯＸ４０を標的とする効果は、様々であり、腫瘍の免疫原性と相関しているようである（Kjaergaard et al., 2000）。これは、腫瘍特異的Ｔ細胞でのＯＸ４０発現には、免疫原性の低い腫瘍で提供されない可能性のある十分なプライミングが必要であるという見解と一致している。特定の同系モデルでは、ＯＸ４０抗体ＯＸ８６の抗腫瘍活性は、Ｆｃガンマ受容体依存的に高レベルのＯＸ４０を発現する腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させるその能力に起因すると決定されている（Bulliard et al., 2014）。

ＯＸ４０に対するアゴニスト抗体は、現在、癌の臨床試験中であり、ほとんどが良好な安全性プロファイルを示しているが、臨床活性が限られている（Curti et al., 2013）。これらの抗体に選択されるアイソタイプは、様々であるが、いくつかの治験薬は、Ｆｃガンマ受容体対応のヒトＩｇＧ１抗体であり、作用機序としてＴｒｅｇを枯渇させ得ることを目的としている。これらの抗体の明確な臨床活性の欠如により、ＯＸ４０アゴニスト抗体と、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ４阻害、抗ＶＥＧＦ療法及びチロシンキナーゼ阻害剤アキシチニブを含む他のいくつかの療法との併用試験が促された。

このＴｒｅｇ枯渇作用機序は、前臨床モデルにおいて非常に効果的であることが実証されており、いくつかの受容体を標的にして、ＧＩＴＲ（Bulliard et al., 2014）及びＣＴＬＡ４（Simpson et al., 2013）などのＴｒｅｇを排除することができる。しかし、ヒトの均等な受容体を標的とする抗体は、クリニックで同じレベルの抗腫瘍効果を有することが示されていない（Glisson et al., 2016；Tran et al., 2017）。この理由は明確ではないが、マウス同系腫瘍モデル（Milas et al., 1987）と比較して、ヒト腫瘍においてマクロファージなどのＦｃガンマ受容体発現細胞のレベルがより低いことは、これらの抗体の作用機序の臨床翻訳性の欠如の説明の一部であり得る。他の理由は、マウスＴｒｅｇと比較して、ヒトＴｒｅｇにおけるこれらのマーカーの発現レベルが異なることである可能性がある（Aspeslagh et al., 2016）。

ＣＤ１３７は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇを含む活性化Ｔ細胞上でも発現するが、その発現プロファイルには、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）も含まれる（Bartkowiak&Curran, 2015）。ＯＸ４０の場合と同様に、ＣＤ１３７のそのリガンドとの相互作用は、Ｔ細胞の生存、増殖及び細胞傷害活性の誘導をもたらす細胞内シグナル伝達経路の活性化を誘発する。ＣＤ１３７刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に刺激し、炎症性サイトカインの産生を介してそれらの増殖、生存、細胞傷害性エフェクター機能をもたらし、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び維持にも寄与する。ＣＤ１３７は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の腫瘍応答性サブセットで特異的に発現することも実証されており（Weigelin et al., 2016）、これは、インビボでのアゴニスト性係合及び養子移入のためのＴＩＬ選択におけるその使用の背後にある理論的根拠の一部を提供する。ＣＤ１３７単剤療法は、ＭＣ３８、ＣＴ２６及びＢ細胞リンパ腫などのいくつかの前臨床免疫原性腫瘍モデルで有効である。しかし、確立された腫瘍のさらにより効果的な処置のために、化学療法、サイトカイン及び他のチェックポイント制御因子などの他の薬剤と組み合わせたＣＤ１３７の係合は、腫瘍増殖の減少において増強された有益な効果を示した（Bartkowiak&Curran, 2015）。アゴニスト抗体を用いた前臨床モデルでＣＤ１３７を標的とすることは、骨髄細胞によるＩＬ２７産生に依存するＣＤ８＋Ｔ細胞蓄積の増加に起因する肝臓の炎症及び高トランスアミナーゼ血症にも関連している（Bartkowiak et al., 2018）。

ＣＤ１３７に対するアゴニスト抗体は、現在、癌の臨床試験中であるが、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症によって臨床の進行が遅くなり、マウスで行われた観察に類似している可能性がある（Sanchez-Paulete et al., 2016）。ウレルマブ（BMS-663513）は、臨床試験に参加した最初のＣＤ１３７アゴニスト抗体であり、１ｍｇ／ｋｇを超える用量での致命的な肝毒性のために治験が中止される前に臨床活性の兆候を示した（Segal et al., 2017）。これは、架橋の非存在下でＣＤ１３７を活性化できるヒトＩｇＧ４抗体である（米国特許第８，１３７，６６７Ｂ２号）が、スーパークラスター化に媒介される完全な受容体活性化の理論に従って予想されるように、架橋すると活性が増加する。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇまで試験した場合、ウトミルマブ（PF-05082566）では用量制限毒性が観察されていない（Tolcher et al., 2017）。これは、ヒトＩｇＧ２抗体であり、架橋時にのみＣＤ１３７を活性化することができる（米国特許第８，３３７，８５０Ｂ２号）。追加の臨床試験が両方の抗体で進行中であり、単剤療法と、放射線療法及び化学療法並びに既存の標的療法及び免疫腫瘍学療法との組み合わせとの両方を試験している。ウレルマブで見られる肝毒性のため、この抗体は、非常に低いレベルで投与しなければならず、臨床活性の初期の兆候は、これらのレベルで依然として観察されていない。

ＣＤ１３７又はＯＸ４０のいずれかを標的とするいくつかの二重特異性分子は、多くの企業による開発の初期段階にある。ＣＤ１３７刺激の腫瘍標的化は、ＨＥＲ２－及びＥｐｈＡ２－標的ＣＤ１３７アゴニストＤＡＲＴ分子を使用するMacrogenics、FAPalpha－又はＣＤ２０－標的ＣＤ１３７リガンド融合タンパク質を使用するRoche及びＨＥＲ２標的ＣＤ１３７アゴニストアンチカリン分子を使用するPieris Pharmaceuticalsによって試験されている。ＯＸ４０及びＣＴＬＡ４の二重標的化は、両方の標的を高レベルで発現すると予想される腫瘍内Ｔｒｅｇを特異的に枯渇させるために、Aligator Biosciencesによって試験されている。

インビボでのＯＸ４０及びＣＤ１３７の共刺激は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激し、抗原経験のあるバイスタンダーＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗原経験のないバイスタンダーＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の細胞傷害性機能を誘導することが示されている。（Qui et al., 2011）。興味深いことに、二重共刺激は、移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導して、黒色腫同系腫瘍モデル（B16-F10）を接種した免疫不全マウスにおける腫瘍増殖を減少させることができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の殺腫瘍活性を誘導するこの療法の能力を強調している（Qui et al., 2011）。ＯＸ４０アゴニスト（PF-04518600）をＣＤ１３７アゴニスト（ウトミルマブ－PF-05082566）と組み合わせた効果を検討する第Ｉ相用量漸増臨床試験は、現在、この組み合わせの安全性を評価するために進行中であり（ＮＣＴ０２３１５０６６）、同じＴＮＦＲアゴニストを、アベルマブを介したＰＤ－１遮断と組み合わせた第Ｉ相ｂ／ＩＩ臨床試験も現在進行中である（ＮＣＴ０２５５４８１２）。これらの研究では、アゴニスト作用のためにＦｃガンマ受容体の架橋を必要とする単純な単一特異性アゴニスト抗体の組み合わせを検討するものであり、そのため、これらの受容体を組み合わせて標的とする臨床活性を過小評価する可能性がある。

ＯＸ４０及びＣＤ１３７の二重共刺激も、最近、ＯＸ４０及びＣＤ１３７に対する２つの既存の抗体を化学的に結合させることにより、二重特異性抗体アプローチを使用してマウスで試験された（Ryan et al., 2018）。OrthomAbと呼ばれる分子は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖並びにインビトロでの炎症性サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮγの産生を誘導することができた。インビボにおいて、OrthomAbは、黒色腫同系腫瘍モデル（B16-F10）の腫瘍増殖を減少させることもできた。OrthomAbの二価の二重特異性は、両方の標的に係合した際の分子の効率的な架橋を可能にし、ＯＸ４０及びＣＤ１３７受容体のクラスター化並びにその結果としてのＴ細胞の活性化をもたらすと予測されている。これらの結果は、単一分子内のＯＸ４０及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体アプローチを検証する。OrthomAb分子の製造プロセスでは、複数の高次種及び数ラウンドのサイズ排除ステップでさらに精製する必要のある所望の抗体の二量体が生成される。この製造プロセスは、標的の特定の組み合わせを検証するための研究ツール以外のためにこのアプローチを実行可能にする可能性が低い。さらに、２つの大きい高分子が小さい化学リンカーによって一緒に保持されているこの二重特異性抗体の構造は、インビボで不安定である可能性が高く、これに対処する薬物動態データは、示されていない。残念ながら、OrthomAbのインビボ抗腫瘍効果は、ＯＸ４０又はＣＤ１３７アゴニスト抗体のいずれかの活性とのみ比較され、それらの組み合わせと比較されなかったため、その分子が効果を有するのは、その二重特異性によるものであるか、又はＯＸ４０及びＣＤ１３７に対する単剤アゴニスト抗体の組み合わせとして挙動するOrthomAbによるものであるかが不明である。

したがって、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＯＸ４０及びＣＤ１３７のアゴニスト作用を単一の二価、二重特異性且つ安定な分子中に組み合わせる理論的根拠が確立され、ＯＸ４０及びＣＤ１３７のＦｃガンマ受容体非依存性スーパークラスター化を行う可能性があり、それによりＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化して効果的な抗腫瘍免疫応答を開始する。ＯＸ４０又はＣＤ１３７経路のいずれかを標的とするモノクローナル抗体で生成された前臨床の組み合わせデータに基づいて、この分子は、癌治療の標準治療の効果を増強して患者に利益をもたらす組み合わせパートナーとしての可能性も有する。

発明の記載
本発明者らは、ＣＤ１３７及びＯＸ４０の両方に結合し、両方の標的に結合した場合にＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７のクラスター化及びシグナル伝達を誘導することができる抗体分子が例えば腫瘍微小環境において免疫細胞を活性化するのに非常に効果的であることを認識した。さらに、本発明者らは、ＣＤ１３７の活性化を、ＣＤ１３７及びＯＸ４０が共発現される場所に制限することが、既知の抗ＣＤ１３７アゴニスト分子に関連する毒性を誘発することなく免疫細胞を活性化するのに非常に効果的であることを認識した。これは、例えば、癌及び他の疾患の処置のための免疫療法において有用であることが期待される。

上記の背景セクションで説明したように、ＯＸ４０リガンド又はＣＤ１３７リガンドのそれぞれＯＸ４０又はＣＤ１３７への最初のライゲーションは、受容体の三量体化、続いて受容体のクラスター化、活性化及びその後の強力な抗腫瘍Ｔ細胞活性の開始につながる一連のイベントを開始すると考えられる。したがって、治療剤がＯＸ４０又はＣＤ１３７の活性化を効率的に達成するには、いくつかの受容体単量体が、三量体リガンドによる架橋を模倣する方法で一緒に架橋される必要があると予想される。

本発明者らは、ＣＤ１３７のための相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位とを含む抗体分子を単離した。本発明者らは、両方の標的が共発現される場合、そのような抗体分子が両方の標的に同時に結合できることを示した。この意味での共発現は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０が同じ細胞、例えば免疫細胞で発現される状況並びにＣＤ１３７及びＯＸ４０が異なる細胞、例えば腫瘍微小環境において互いに隣接して位置する２つの異なる免疫細胞で発現される状況を包含する。したがって、本発明の抗体分子は、単一細胞上に発現された両方の標的にシスで結合することができ、また異なる細胞上に発現された２つの標的にトランスで結合することができると考えられる。

本発明者らは、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位とを含む抗体分子が両方の標的に二価的に結合できることをさらに示した。具体的には、本発明者らは、そのような抗体分子をＯＸ４０及びＣＤ１３７に結合させ、得られた複合体を架橋し、質量分析に供した場合、複合体の１９％が２つのＯＸ４０部分及び２つのＣＤ１３７部分を含むことが示された。これは、抗体分子が両方の標的に二価的に結合したことを示している。

さらに、本発明者らは、これらの抗体分子が両方の標的に結合すると、インビトロでＯＸ４０及びＣＤ１３７のクラスター化及びシグナル伝達を誘導できることを示した。このように作用することにより、そのような抗体分子は、「二重アゴニスト」と呼ばれ、すなわち、抗体分子は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方への二重結合による架橋の結果として受容体を介したシグナル伝達を誘導することができる。

実施例に示されるように、ＯＸ４０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞で優先的に発現され、ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞で優先的に発現される。本発明者らは、抗体分子がＣＤ４＋Ｔ細胞上でＯＸ４０のアゴニスト作用を誘導できることを実証した。これらの場合、抗体分子は、ＣＤＲベースの抗原結合ドメインを介してＣＤ１３７に結合して、抗体分子を架橋し、同時に、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するＯＸ４０に結合し、それをクラスター化し、活性化することができると考えられる。同様に、本発明者らは、抗体分子がＣＤ８＋Ｔ細胞上でＣＤ１３７のアゴニスト作用を誘導できることを実証した。これらの場合、抗体分子は、ＯＸ４０抗原結合ドメインを介してＯＸ４０に結合して、抗体分子を架橋し、同時に、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ１３７に結合し、それをクラスター化し、活性化することができると考えられる。

さらに、本発明者らは、上に詳述したような２つの抗原結合部位を含み、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるか又は抑制するように修飾された抗体分子が、ＣＤ１３７及びＯＸ４０が共発現した場合、受容体を介してシグナル伝達を誘導できることを示した。これは、Ｆｃγ受容体による架橋を必要とせずにアゴニスト作用が発生したことを示す。Ｆｃγ受容体媒介性架橋は、本発明の抗体分子の活性に必要ではないため、ＯＸ４０又はＣＤ１３７受容体を介したシグナル伝達は、腫瘍微小環境など、両方の標的が存在する部位に局在すると予想される。したがって、抗体分子は、特定の標的の両方の発現に基づいて、追加の架橋剤を必要とせずに自律的にアゴニスト作用を駆動することができる。

さらに、Ｆｃγ受容体結合は、ＡＤＣＣに必要であるため、Ｆｃγ受容体への結合のこの減少が、本発明の抗体分子により標的免疫細胞が枯渇しないようなＡＤＣＣの減少ももたらすことが期待される。本発明者らは、抗体分子が免疫応答を促進するためにＣＤ１３７及び／又はＯＸ４０を発現する免疫細胞を活性化するように設計されたため、これが重要であると考えた。したがって、これらの免疫細胞の枯渇は、望ましくない。本発明者らは、本明細書で定義される特性を有する抗体分子が、免疫細胞、特にＣＤ１３７及び／又はＯＸ４０を発現するＴ細胞を活性化及び誘導できることを実証した。

本発明者らは、上記に詳述したようなＣＤ１３７及びＯＸ４０抗原結合部位を含む抗体分子がマウスにおいてインビボで腫瘍増殖を抑制できることをさらに示した。さらに、一方の抗体分子がＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、他方の分子がＣＤＲベースのＯＸ４０の抗原結合部位を含む２つの単一特異性抗体分子の組み合わせと比較して、二重特異性抗体分子では、より効果的な腫瘍増殖抑制が観察された。これは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の同時係合及びアゴニスト作用が抗腫瘍の有効性を向上させることを示している。さらに、抗体分子は、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて、完全な腫瘍退縮及び腫瘍細胞による再負荷に対する防御免疫記憶の確立を誘導できることが示された。したがって、本発明の抗体分子は、ヒト患者の癌の処置において有効性を示すことが期待される。これらの抗体分子は、ＡＤＣＣ活性を抑制しているため、これらの有益なＴ細胞（メモリー及びエフェクター細胞）を大幅に枯渇させることなく、標的免疫細胞をアゴナイズすることによって腫瘍増殖を抑制していると予想される。

マウスでのインビボ研究で観察されたように、本明細書に記載の抗体分子によって誘導されるＴ細胞の活性化及び増殖は、腫瘍に局在する効果ではなく、全身的な効果であった。さらに、末梢セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化の増加は、本発明の抗体分子を投与されたカニクイザルにおける予備的な用量範囲発見研究で観察された。したがって、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の標的化と同様に、ＯＸ４０及びＣＤ１３７を発現する末梢メモリーＴ細胞は、抗体分子によって標的化されて、腫瘍応答性Ｔ細胞の増殖を駆動し、それらの抗腫瘍効果を提供すると予想される。

したがって、実際の腫瘍自体の部位に加えて、腫瘍の影響を受ける解剖学的位置には、例えば、腫瘍特異的免疫応答が生成される末梢のリンパ節など、体の他の位置も含まれると見なすことができる。

上記の背景セクションで説明したように、ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症（ウレルマブ）又は低い臨床効果（ウトミルマブ）のいずれかに関連する処置のため、少なくとも部分的に阻止されてきた。

理論に拘束されることを望むものではないが、肝臓に存在するＴ細胞は、抗ＣＤ１３７アゴニスト分子によって活性化され、肝臓の炎症を引き起こす可能性を有し得ると考えられる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、敗血症／ウイルス感染症後の肝臓の炎症及びアポトーシスを促進することが示されている（Wesche-Soldato et al., 2007）。マウスにおける抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体療法は、肝臓へのＣＤ１３７依存性Ｔ細胞浸潤をもたらすことが示されている（Dubrot J et al., 2010）。これらの研究の結果を総合すると、ウレルマブなどの高活性の抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の肝臓への浸潤を引き起こし、それにより肝臓の炎症を引き起こし得ることが示されている。ウトミルマブの活性は、この効果を観察するには低すぎた可能性がある。代わりに、ウレルマブ処置で観察された用量制限肝毒性は、この抗体が結合した特定のエピトープに起因し得る。

本発明者らは、二量体のヒトＣＤ１３７に高い親和性で結合する、すなわちＣＤ１３７に高い結合力で結合することが期待される、抗体分子を単離するための広範な選択プログラムを実施した。使用される選択プロトコルを考慮すると、抗体分子は、二量体のＣＤ１３７で観察される親和性よりも低い親和性で単量体ＣＤ１３７に結合すると予想される。

本明細書において言及される「親和性」は、Ｋ_Ｄによって測定される、抗体分子とその同族抗原との間の結合相互作用の強度を指し得る。当業者に容易に明らかであるように、抗体分子が抗原と複数の結合相互作用を形成することができる場合（例えば、抗体分子が抗原を二価的に結合することができ、任意選択により抗原が二量体である場合）、Ｋ_Ｄによって測定される親和性は、結合力によっても影響を受ける可能性があり、ここで、結合力は、抗体－抗原複合体の全体的な強度を指す。

Ｔ細胞などの免疫細胞によるＣＤ１３７の発現は、活性化時にアップレギュレートされる。理論に拘束されることを望むものではないが、活性化された免疫細胞上でのＣＤ１３７の高発現のために、ＣＤ１３７は、そのような細胞の表面上で二量体、三量体及び高次多量体の形態になると考えられる。対照的に、ナイーブＴ細胞などのナイーブ免疫細胞は、細胞表面に低レベル又は無視できるレベルのＣＤ１３７を発現するため、任意の存在するＣＤ１３７は、単量体形態である可能性がある。したがって、ＣＤ１３７に高い結合力で結合する抗体分子は、ナイーブ免疫細胞に対抗して、活性化Ｔ細胞などの活性化免疫細胞に優先的に結合すると予想される。

したがって、上記に照らして、本発明の抗体分子は、ＯＸ４０との係合を介した架橋の非存在下でＣＤ１３７を活性化することがほとんど不可能であると予想される。さらに、上記のように、本発明者らは、ＯＸ４０の共発現がほとんど又は全くない位置でのＣＤ１３７の活性化を回避することを期待して、Ｆｃγ受容体媒介性架橋が減少又は抑制される抗体分子を開発した。Ｆｃγ受容体結合の無効化は、抗体分子の抗腫瘍活性に影響を及ぼさないことが示された。理論に拘束されることを望むものではないが、そのような抗体分子は、患者に投与された場合に低下した毒性を示すと考えられる。これは、ＣＤ１３７の活性化が、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を駆動するのに十分なレベルでＯＸ４０及びＣＤ１３７が共発現する位置に大きく制限されるためと考えられる。本発明者らは、カニクイザルにおける予備的な用量範囲発見研究において、本発明の抗体分子の用量が３０ｍｇ／ｋｇまで十分に許容されることを示した。

本発明者らは、本発明の抗体分子が、架橋がない場合でも低レベルのＯＸ４０クラスター化及び活性化を誘導できることを示した。ＣＤ１３７アゴニスト抗体と異なり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、クリニックで用量制限毒性（ＤＬＴ）を示さず、したがって、架橋の非存在下でのＯＸ４０アゴニスト活性は、臨床処置の問題を表すことが期待されない。反対に、処置される条件に応じて、架橋の非存在下での抗体分子による低レベルのＯＸ４０アゴニスト活性が有利であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、この特性を有するＯＸ４０抗原結合部位を含む抗体分子は、架橋の非存在下で腫瘍反応性Ｔ細胞の限定された活性化及び拡大培養を誘導し、腫瘍反応性Ｔ細胞のより大きいプールをもたらし、腫瘍微小環境内の架橋Ｆｃａｂ分子によってさらに活性化できることにより、癌処置に関連して有用であり得ると考えられる。

Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制するように改変された本発明の抗体分子のさらなる利点は、これらの抗体分子が、ＯＸ４０発現制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇に依存しない抗腫瘍活性を有することであり得る。Ｔｒｅｇは、末梢に位置し、潜在的に保護的であり、免疫系を過剰に刺激することによって引き起こされ得る自己免疫の影響を軽減し得る（Vignali DA et al., 2008）。したがって、Tregの枯渇は、マウスモデルにおいて腫瘍増殖の低減に有意な影響を及ぼし得ると仮定される（Bulliard et al., 2014；Simpson et al., 2013）。しかし、ヒト腫瘍におけるＴｒｅｇ枯渇がＡＤＣＣによって達成できるという証拠は、限られたものであり、Ｔｒｅｇ枯渇がヒトで発生した場合、これは、マウスモデルで観察されたような劇的な抗腫瘍活性をもたらさないようである（Powell et al., 2007；Nizar S et al., 2009；Glisson BS et al., 2016；Tran B et al., 2017）。したがって、抗体分子がＴｒｅｇを有意に枯渇させないが、それでも抗腫瘍活性を有する場合、これは、抗体分子がＦｃγ受容体媒介性Ｔｒｅｇ枯渇から独立した抗腫瘍活性を有することを示し得る。

抗体分子は、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７並びにヒト及びカニクイザルＯＸ４０の両方に高い親和性で結合できることがさらに示されている。この交差反応性は、前臨床開発中にカニクイザルで抗体分子の投与及び安全性試験を実施できるため、有利である。

本発明者らによって同定された抗体分子のさらなる特徴は、ＣＤ１３７のための抗原結合部位及びＯＸ４０の抗原結合部位の両方が抗体構造自体内に含まれていることである。特に、抗体分子は、リンカー又は他の手段を介して他のタンパク質を抗体分子に融合させて、その両方の標的に二価で結合することができる分子をもたらすことを必要としない。これは、多くの利点を有する。具体的には、本発明者らによって同定された抗体分子は、それらが追加の融合部分を含まないため、標準的な抗体の産生に使用されるものと同様の方法を使用して産生することができる。リンカーは、時間の経過と共に分解し、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造は、抗体の安定性の向上にもつながることが期待されている。１つのタンパク質のみが融合した集団内の抗体は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に結合することによる架橋の結果として、二重アゴニストとして作用し、受容体を介してシグナル伝達することができない場合がある。リンカーの切断又は分解は、個体への治療薬の投与前又は投与後に（例えば、酵素的切断又は個体のインビボｐＨを介して）起こり得、それにより個体内を循環している間にその有効性の低下をもたらす。本発明者らによって同定された抗体分子にはリンカーがないため、抗体分子は、投与前及び後の両方で同数の結合部位を保持すると予想される。さらに、本発明者らによって同定された抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。これは、融合タンパク質若しくはリンカー又はその両方の導入が、分子が個体に投与される場合に免疫原性を誘発し得、その結果、治療薬の有効性が低下するからである。

したがって、本発明は、以下を提供する。

［１］ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子であって、
（ａ）ＣＤ１３７のための相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１、２、１６、４、５及び６［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２、２１、４、５及び６［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、４、５及び２８［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号３３、３４、３５、４、５及び３６［FS30-5-37］
に記載されるＣＤＲ１～６を含み、
ＯＸ４０抗原結合部位は、それぞれＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１、第２及び第３の配列は、それぞれ配列番号５１、５２及び５３［FS20-22-49］に記載される配列を有する、抗体分子。

［２］ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子であって、
（ａ）ＣＤ１３７のための相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１及び６［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号７、８、１７、１０、１１及び６［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７、８、２２、１０、１１及び６［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、１０、１１及び２８［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号３７、３８、３９、１０、１１及び３６［FS30-5-37］
に記載されるＣＤＲ１～６を含み、
ＯＸ４０抗原結合部位は、それぞれＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１、第２及び第３の配列は、それぞれ配列番号５１、５２及び５３［FS20-22-49］に記載される配列を有する、抗体分子。

［３］（ｉ）第１の配列は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１４から１８位に位置し；
（ｉｉ）第２の配列は、抗体分子のＣＨ３ドメインの４５．１から７７位に位置し；及び／又は
（ｉｉｉ）第３の配列は、抗体分子のＣＨ３ドメインの９３から１０１位に位置し；
アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］又は［２］に記載の抗体分子。

［４］配列番号５４［FS20-22-49］に記載されるＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］から［３］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［５］［１］又は［２］の（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲ１～６を含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［６］［１］又は［２］の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲ１～６を含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［７］［１］又は［２］の（ｉ）に記載されるＣＤＲ１～６を含む、［１］から［６］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［８］重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、好ましくはＶＨドメイン及びＶＨドメインを含む、［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［９］免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖、好ましくは免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、［１］から［８］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［１０］ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＨドメインは、
（ｉ）それぞれ配列番号１２及び１４［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１８及び１４［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３及び１４［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１７０及び１７２［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号４０及び４２［FS30-5-37］
に記載される、［８］又は［９］に記載の抗体分子。

［１１］［１０］の（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つに記載されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［１０］に記載の抗体分子。

［１２］［１０］の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載されるＶＨ及びＶＬドメインを含む、［１０］又は［１１］に記載の抗体分子。

［１３］［１０］の（ｉ）に記載されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［１０］から［１２］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［１４］ヒトＩｇＧ１分子である、［１］から［１３］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［１５］抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号９５及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-16；
（ｉｉ）それぞれ配列番号９９及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-3；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１０３及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-12；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１０５及び１０７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-35-14；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１０９及び１１１に記載されるFS20-22-49AA/FS30-5-37
の重鎖及び軽鎖を含む、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［１６］［１５］の（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つに記載される軽鎖及び重鎖を含む、［１５］に記載の抗体分子。

［１７］［１５］の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載される軽鎖及び重鎖を含む、［１５］に記載の抗体分子。

［１８］［１５］の（ｉ）に記載される軽鎖及び重鎖を含む、［１５］に記載の抗体分子。

［１９］ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に結合する、［１］から［１８］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２０］ヒトＣＤ１３７は、配列番号１２７に記載される配列からなるか又はそれを含む、［１９］に記載の抗体分子。

［２１］ヒトＯＸ４０は、配列番号１３０に記載される配列からなるか又はそれを含む、［１９］又は［２０］に記載の抗体分子。

［２２］カニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０に結合する、［１］から［２１］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２３］カニクイザルＣＤ１３７は、配列番号１２９に記載される配列からなるか又はそれを含む、［２２］に記載の抗体分子。

［２４］カニクイザルＯＸ４０は、配列番号１３１に記載される配列からなるか又はそれを含む、［２３］又は［２４］に記載の抗体分子。

［２５］ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に結合し、及び抗体分子がヒトＣＤ１３７に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）は、抗体分子がヒトＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の２倍以内である、［５］から［７］、［１１］から［１３］及び［１６］から［１８］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２６］ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に同時に結合することができる、［１９］から［２５］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２７］細胞表面に発現されたＣＤ１３７の存在下で免疫細胞上のＯＸ４０を活性化することができる、［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２８］免疫細胞上のＯＸ４０及びＣＤ１３７への抗体分子の結合は、免疫細胞上のＯＸ４０のクラスター化を引き起こす、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［２９］細胞表面に発現されたＯＸ４０の存在下で免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することができる、［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３０］免疫細胞上のＣＤ１３７及びＯＸ４０への抗体分子の結合は、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こし、ＯＸ４０は、同じ免疫細胞又は別個の細胞上で発現される、［１］から［２９］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３１］免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項［２７］から［３０］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３２］１つ以上のＦｃγ受容体への抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［３１］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３３］１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、［１］から［３２］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３４］Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［３２］又は［３３］に記載の抗体分子。

［３５］Ｔ細胞の増殖を誘導することができる、［１］から［３４］のいずれか一項に記載の抗体分子。

［３６］［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子と、生物活性分子とを含むコンジュゲート。

［３７］［１］から［３６］のいずれか一項に記載の抗体分子と、検出可能な標識とを含むコンジュゲート。

［３８］［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。

［３９］［１］から［４］、［８］から［１０］、［１４］から［１５］及び［１９］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子であって、
（ｉ）それぞれ配列番号９６及び９８に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-16；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１００及び１０２に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-3；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１０４及び１０２に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-12
（ｉｖ）それぞれ配列番号１０６及び１０８に記載されるFS20-22-49AA/FS30-35-14；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１１０及び１１２に記載されるFS20-22-49AA/FS30-5-37
の重鎖核酸配列及び／又は軽鎖核酸配列を含む１つ又は複数の核酸分子。

［４０］［３８］から［３９］のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクター。

［４１］［３８］から［３９］のいずれか一項に記載の核酸分子又は［４０］に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。

［４２］［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法であって、抗体分子の産生のための条件下において、［４１］の組換え宿主細胞を培養することを含む方法。

［４３］抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［４２］に記載の方法。

［４４］［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

［４５］治療によるヒト又は動物の身体の処置方法における使用のための、［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。

［４６］個体の疾患又は障害を処置する方法であって、治療有効量の、［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートを個体に投与することを含む方法。

［４７］抗体分子又はコンジュゲートは、個体の癌又は感染症の処置における使用のためのものである、［４５］に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。

［４８］疾患又は障害は、個体の癌又は感染症である、［４６］の方法。

［４９］癌又は感染症の処置のための医薬の調製における、［１］から［３７］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。

［５０］癌は、固形癌であり、任意選択により、固形癌は、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎癌、胃癌からなる群から選択される、［４７］に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、［４８］の方法又は［４９］に記載の抗体分子若しくはコンジュゲートの使用。

［５１］感染症は、持続性のウイルス感染症であり、任意選択により、持続性のウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスからなる群から選択される、［４７］に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、［４８］の方法又は［４９］に記載の抗体分子若しくはコンジュゲートの使用。

［５２］感染症は、持続性の細菌感染症であり、任意選択により、持続性の細菌感染症は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の持続性感染症である、［４７］に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、［４８］の方法又は［４９］に記載の抗体分子若しくはコンジュゲートの使用。

［５３］感染症は、持続性の真菌感染症であり、任意選択により、持続性の真菌感染症は、カンジダ（Candida）、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス（Cryptococcus）（ガッティ（gattii）及びネオフォルマンス（neoformans））、タラロミセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））マルネッフェ（marneffe）、小胞子菌（Microsporum）、例えばオーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）及びトリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）の持続性感染症である、［４７］に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、［４８］の方法又は［４９］に記載の抗体分子若しくはコンジュゲートの使用。

［５４］感染症は、持続性の寄生虫感染症であり、任意選択により、持続性の寄生虫感染症は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）などのマラリア原虫（Plasmodium）又はドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）などのリーシュマニア（Leishmania）の持続性感染症である、［４７］に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、［４８］の方法又は［４９］に記載の抗体分子若しくはコンジュゲートの使用。

［５５］処置は、抗体分子又はコンジュゲートを第２の治療剤と組み合わせて個体に投与することを含む、［４５］、［４７］及び［５０］から［５４］のいずれか一項に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。

［５６］治療有効量の第２の治療剤を個体に投与することをさらに含む、［４６］、［４８］及び［５０］から［５４］に記載の方法。

［５７］方法は、抗体分子又はコンジュゲートを、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて個体に投与することを含む、［４７］から［５０］に記載の個体の癌を処置する方法における使用のための抗体分子又はコンジュゲート。

図面の簡単な説明
Ｆｃａｂ FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108及びFS20-31-115並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアライメントを示す。ＷＴ配列と比較した、ＦｃａｂのＣＨ３ドメインに存在するＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ並びにアミノ酸の置換、欠失（チルダ「～」で表される）又は挿入の位置が示される。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続番号付け）、ＥＵ及びKabat番号付けシステムに従った残基の番号が示される。 架橋の存在下における、ヒトＣＤ１３７ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。漸増濃度の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの存在下及び架橋抗体の存在下でのＩＬ２放出を示す。G1AA/20H4.9は、架橋抗体の存在下及び非存在下で活性を示したが、G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16抗体の活性は、架橋抗体の存在下でのみ観察された。 架橋の非存在下における、ヒトＣＤ１３７ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。漸増濃度の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの存在下及び架橋抗体の非存在下でのＩＬ２放出を示す。G1AA/20H4.9は、架橋抗体の存在下及び非存在下で活性を示したが、G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16抗体の活性は、架橋抗体の存在下でのみ観察された。 架橋の存在下における、ヒトＣＤ１３７ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。架橋剤の存在下、抗ヒトＯＸ４０ Ｆｃａｂ（FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14）を含むｍＡｂ^２形式の漸増濃度の抗ＣＤ１３７ FS30 ｍＡｂの存在下でのＩＬ２放出を示す。対照は、以下の通り含まれた：抗ＣＤ１３７抗体G2/MOR7480.1（陽性対照）；抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1/11D4及びｍＡｂ^２FS20-22-49AA/4420（陰性対照）；抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ G1/4420（アイソタイプ陰性対照）。マウスＩＬ－２放出の増加によって証明されるように、架橋陽性対照ｍＡｂ（G2/MOR7480.1）及び抗ＣＤ１３７ FS30 ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14）の存在下でDO11.10-hCD137細胞の活性化に濃度依存性の増加があったが、陰性対照ｍＡｂ及びｍＡｂ^２（G1/4420、FS20-22-49AA/4420及びG1/11D4）の存在下でそれがなかったことを示す。 架橋の非存在下における、ヒトＣＤ１３７ Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。架橋剤の非存在下、抗ヒトＯＸ４０ Ｆｃａｂ（FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14）を含むｍＡｂ^２形式の漸増濃度の抗ＣＤ１３７ FS30 ｍＡｂの存在下でのＩＬ２放出を示す。対照は、以下の通り含まれた：抗ＣＤ１３７抗体G2/MOR7480.1（陽性対照）；抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1/11D4及びｍＡｂ^２FS20-22-49AA/4420（陰性対照）；抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ G1/4420（アイソタイプ陰性対照）。架橋の非存在下において、陽性対照G2/MOR7480.1、ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14並びに陰性対照G1/4420、FS20-22-49AA/4420及びG1/11D4は、測定されたＩＬ－２の低い基礎レベルによって証明されるように、Ｔ細胞活性化なしから弱いＴ細胞活性化を示したことを示す。 ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。３．７ｎＭの濃度のｍＡｂ G1/4420（抗ＦＩＴＣ；アイソタイプ対照）、G1AA/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1AA/FS30-10-16（抗ＣＤ１３７）、G1AA/20H4.9（抗ＣＤ１３７）、G1AA/11D4（抗ＯＸ４０）、FS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）及びFS20-22-49AA/4420プラスG1AA/FS30-10-16の組み合わせ並びにｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16の存在下でのＩＬ－２放出を示す。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のみが、アイソタイプ対照と比較して人工架橋剤の非存在下でＴ細胞の活性化を増加させた一方、ＯＸ４０を標的とする抗体G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420並びに抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9は、アイソタイプ対照と比較して人工架橋剤の存在下でのみＴ細胞活性化の増加を示し、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16は、人工架橋剤の存在下でも統計的に有意な活性を示さなかったことを示す。 ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下、漸増濃度のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16の存在下でのＩＬ－２放出を示す。結果は、抗ヒトＣＨ２抗体の非存在下でＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２によって誘導されたＴ細胞の活性化が、この人工架橋剤の存在下で試験された場合と同等であることを示す。 ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の非存在下、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＩＬ－２放出を示す。対照は、G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1/11D4（抗ＯＸ４０）、G2/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1/11D4プラスG2/MOR7480.1の組み合わせ及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）であった。結果は、ＯＸ４０が対照G1/11D4に単独で結合した場合と、それらが架橋しているときに抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G2/MOR7480.1及びFS20-22-49A/4420と組み合わせて投与した場合との両方でＴ細胞の活性化に濃度依存性の増加があったことを示す。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在下及び非存在下で同等の活性を示し、活性は、架橋ＯＸ４０ Ｆｃａｂ（FS20-22-49AA/4420 Xlink）の活性と同様であった。架橋を有する場合と有しない場合との両方において、抗ＣＤ１３７対照抗体（G2/MOR7480.1）のみではほとんど活性が見られなかった。 ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＩＬ－２放出を示す。対照は、G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1/11D4（抗ＯＸ４０）、G2/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1/11D4プラスG2/MOR7480.1の組み合わせ及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）であった。結果は、ＯＸ４０が対照G1/11D4に単独で結合した場合と、それらが架橋しているときに抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G2/MOR7480.1及びFS20-22-49A/4420と組み合わせて投与した場合との両方でＴ細胞の活性化に濃度依存性の増加があったことを示す。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在下及び非存在下で同等の活性を示し、活性は、架橋ＯＸ４０ Ｆｃａｂ（FS20-22-49AA/4420 Xlink）の活性と同様であった。架橋を有する場合と有しない場合との両方において、抗ＣＤ１３７対照抗体（G2/MOR7480.1）のみではほとんど活性が見られなかった。 ヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。３．７ｎＭの濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＩＬ－２放出を示す。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のみが人工架橋剤の非存在下でＴ細胞の活性化を増加させたことを示す。ＯＸ４０を標的とする抗体G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420並びに抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9は、架橋剤の存在下でのみＴ細胞活性化の増加を示した。人工架橋剤の存在下でも、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16の活性は、検出されず、図３Ａに報告されているＳＥＡアッセイの結果が確認された。 ヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下及び非存在下において、漸増濃度のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16によって誘導されるＩＬ－２放出を示す。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在下及び非存在下で同等の活性を有していた。 ヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の非存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤の非存在下、漸増濃度のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及び対照の存在下でのＩＬ－２放出を示す。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でナノモル濃度以下又は１桁のナノモル濃度の活性を有していたことを示す。予想通り、G1/4420対照は、架橋剤の存在にかかわらず、活性を有していなかった。架橋剤が存在しない場合、対照G1/11D4、FS20-22-49AA/4420、G2/MOR7480.1及びG1/11D4とG2/MOR7480.1との組み合わせは、ほとんど活性を有しなかったか又は全く活性を有しなかった。抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストランによって架橋された場合、単剤抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７対照は、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加を示し、したがって、このアッセイは、Ｔ細胞上のＯＸ４０又はＣＤ１３７受容体のいずれかを介してシグナル伝達を検出できたことを示す。 ヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７ ｍＡｂ、ＯＸ４０ Ｆｃａｂ及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されたｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下並びに架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下でＩＬ－２放出を測定した。人工架橋剤（必要に応じてＦＩＴＣ－デキストラン又は抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下、漸増濃度の単剤対照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及びFS20-22-49AA/4420の存在下でのＩＬ－２放出を示す。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でナノモル濃度以下又は１桁のナノモル濃度の活性を有していたことを示す。予想通り、G1/4420対照は、架橋剤の存在にかかわらず、活性を有していなかった。架橋剤が存在しない場合、対照G1/11D4、FS20-22-49AA/4420、G2/MOR7480.1及びG1/11D4とG2/MOR7480.1との組み合わせは、ほとんど活性を有しなかったか又は全く活性を有しなかった。抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストランによって架橋された場合、単剤抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７対照は、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加を示し、したがって、このアッセイは、Ｔ細胞上のＯＸ４０又はＣＤ１３７受容体のいずれかを介してシグナル伝達を検出できたことを示す。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されるように、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す。ｍＡｂ及びｍＡｂ^２は、人工架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の非存在下で試験された。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、架橋抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420（単独及びG1AA/FS30-10-16との組み合わせ）によって活性化されたが、単剤抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16によって活性化されなかった。抗ＯＸ４０対照FS20-22-49AA/4420も、架橋されていない場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下で低レベルの活性を示し、これは、抗体の架橋時に大幅に増加した。したがって、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方で共有される抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂは、抗体が人工架橋剤又はＣＤ１３７へのＦａｂ結合によって架橋された場合、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できることが示された。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されるように、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す。ｍＡｂ及びｍＡｂ^２は、人工架橋剤（抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２対照についてＦＩＴＣ－デキストラン、試験した他の全ての分子について抗ヒトＣＨ２抗体）の存在下で試験された。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、架橋抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420（単独及びG1AA/FS30-10-16との組み合わせ）によって活性化されたが、単剤抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16によって活性化されなかった。抗ＯＸ４０対照FS20-22-49AA/4420も、架橋されていない場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下で低レベルの活性を示し、これは、抗体の架橋時に大幅に増加した。したがって、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方で共有される抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂは、抗体が人工架橋剤又はＣＤ１３７へのＦａｂ結合によって架橋された場合、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できることが示された。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されるように、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す。ｍＡｂ及びｍＡｂ^２は、人工架橋剤の非存在下で試験された（詳細については、図５Ａ及びＢの説明文を参照されたい）。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、人工架橋剤の存在下、抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16（単独及びFS20-22-49AA/4420との組み合わせ）の両方並びに抗ＯＸ４０対照FS20-22-49AA/4420及び程度は少ないがG1AA/11D4で観察された。したがって、G1AA/FS30-10-16対照ｍＡｂ及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方に共通する抗ＣＤ１３７ Ｆａｂアームは、抗体が人工架橋剤又はＯＸ４０へのＦｃａｂ結合のいずれかによって架橋された場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ１３７をアゴナイズできることが示される一方、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方で共有される抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂは、抗体が人工架橋剤又はＣＤ１３７へのＦａｂ結合によって架橋された場合、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できた。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。示されるように、漸増濃度のｍＡｂ及びｍＡｂ^２の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す。ｍＡｂ及びｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在下で試験された（詳細については、図５Ａ及びＢの説明文を参照されたい）。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が人工架橋剤の非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、人工架橋剤の存在下、抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16（単独及びFS20-22-49AA/4420との組み合わせ）の両方並びに抗ＯＸ４０対照FS20-22-49AA/4420及び程度は少ないがG1AA/11D4で観察された。したがって、G1AA/FS30-10-16対照ｍＡｂ及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方に共通する抗ＣＤ１３７ Ｆａｂアームは、抗体が人工架橋剤又はＯＸ４０へのＦｃａｂ結合のいずれかによって架橋された場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ１３７をアゴナイズできることが示される一方、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方で共有される抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂは、抗体が人工架橋剤又はＣＤ１３７へのＦａｂ結合によって架橋された場合、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介してＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できた。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。３．７ｎＭの濃度のｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下及び人工架橋剤の存在下又は非存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す（詳細については、図５Ａ及びＢの説明文を参照されたい）。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の非存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、架橋抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420によって活性化されたが、単剤抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16によって活性化されなかった。抗ＯＸ４０対照FS20-22-49AA/4420も、架橋されていない場合、低レベルの活性を示し、これは、抗体の架橋時に大幅に増加した。したがって、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方で共有される抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂは、抗体が人工架橋剤又はＣＤ１３７へのＦａｂ結合によって架橋された場合、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化できることが示された。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を示す。３．７ｎＭの濃度のｍＡｂ／ｍＡｂ^２の存在下及び人工架橋剤の存在下又は非存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ－２放出を示す（詳細については、図５Ａ及びＢの説明文を参照されたい）。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できたことを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、人工架橋剤の存在下、抗ＣＤ１３７対照G1AA/20H4.9及びG1AA/FS30-10-16（単独及びFS20-22-49AA/4420との組み合わせ）で観察されたが、抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1又は架橋抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420で観察されなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、人工架橋剤の非存在下で抗ＣＤ１３７対照G1AA/20H4.9についても観察された。したがって、G1AA/FS30-10-16対照ｍＡｂ及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の両方に共通する抗ＣＤ１３７ Ｆａｂアームは、抗体が人工架橋剤又はＯＸ４０へのＦｃａｂ結合のいずれかによって架橋された場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ１３７をアゴナイズできることが示された。 ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞よりも低レベルのＣＤ１３７及び高レベルのＯＸ４０を発現していることを示す。グラフは、G1AA/MOR7480.1又はG1AA/11D4で処置されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を示す。ＣＤ１３７に対するG1AA/MOR7480.1の結合は、ＣＤ１３７発現の尺度であり、ＯＸ４０に対するG1AA/11D4の結合は、ＯＸ４０発現の尺度である。 Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ及びｍＡｂ^２の活性を示す。人工架橋剤（必要に応じて抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストラン）の非存在下、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７受容体（FS20m-232-91AA/Lob12.3）に結合する漸増濃度のｍＡｂ^２及び対照抗体の存在下でのＩＬ－２放出を示す。対照は、抗体G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/OX86（抗ｍＯＸ４０）、G1AA/Lob12.3（抗ｍＣＤ１３７）、G1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3の組み合わせ及びFS20m-232-91AA/4420（ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）であった。結果は、架橋剤の非存在下では、対照G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420、G1AA/Lob12.3及びG1AA/OX86とG1AA/Lob12.3との組み合わせが活性を有しなかったことを示す。抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストランによって架橋された場合、G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420及びG1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3対照は、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加を示した。架橋した場合、G1AA/Lob12.3対照について活性のわずかな増加が観察された。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在にかかわらず、良好な活性を示した。 Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７ｍＡｂ及びｍＡｂ^２の活性を示す。人工架橋剤（必要に応じて抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストラン）の存在下、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７受容体（FS20m-232-91AA/Lob12.3）に結合する漸増濃度のｍＡｂ^２及び対照抗体の存在下でのＩＬ－２放出を示す。対照は、抗体G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/OX86（抗ｍＯＸ４０）、G1AA/Lob12.3（抗ｍＣＤ１３７）、G1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3の組み合わせ及びFS20m-232-91AA/4420（ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）であった。結果は、架橋剤の非存在下では、対照G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420、G1AA/Lob12.3及びG1AA/OX86とG1AA/Lob12.3との組み合わせが活性を有しなかったことを示す。抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストランによって架橋された場合、G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420及びG1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3対照は、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加を示した。架橋した場合、G1AA/Lob12.3対照について活性のわずかな増加が観察された。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、人工架橋剤の存在にかかわらず、良好な活性を示した。 Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７ｍＡｂ及びｍＡｂ^２の活性を示す。ＣＤ３で刺激されたDO11.10-mCD137細胞における架橋抗体（クローンＭＫ１Ａ６）の非存在下での異なる抗マウスＣＤ１３７抗体（G1AA/Lob12.3及びG1AA/3H3）の活性を示す。G1AA/3H3の活性は、架橋抗体の非存在下で観察されたが、G1AA/Lob12.3抗体の活性は、架橋抗体の存在下でのみ観察された。したがって、G1AA/3H3抗体は、「架橋非依存性」と呼ばれ、G1AA/Lob12.3抗体は、「架橋依存性」と呼ばれる。 Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ及びｍＡｂ^２の活性を示す。ＣＤ３で刺激されたDO11.10-mCD137細胞における架橋抗体（クローンＭＫ１Ａ６）の存在下での異なる抗マウスＣＤ１３７抗体（G1AA/Lob12.3及びG1AA/3H3）の活性を示す。G1AA/3H3の活性は、架橋抗体の存在下で観察されたが、G1AA/Lob12.3抗体の活性は、架橋抗体の存在下でのみ観察された。したがって、G1AA/3H3抗体は、「架橋非依存性」と呼ばれ、G1AA/Lob12.3抗体は、「架橋依存性」と呼ばれる。 １００倍過剰量のヒトＯＸ４０標的モックｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/4420）、抗ヒトＣＤ１３７抗体（G1AA/FS30-10-16）又はそれらの組み合わせの存在下でのヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16の活性を試験するための競合アッセイを示す。重複からのデータは、平均プラス又はマイナス標準偏差（ＳＤ）として示される。統計的検定は、一元配置分散分析及びダネットの多重比較検定によって行われた。エラーバー上のアスタリスクは、アイソタイプ対照（G1/4420）で処理されたサンプルと比較した有意差を表す（＊＊＊ｐ＜０．０００２）。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７抗体の非存在下で両方の受容体に結合できた場合と比較して、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性が、ＯＸ４０への結合についてFS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びＣＤ１３７への結合についてG1AA/FS30-10-16 ｍＡｂの両方に負ける場合に大きく減少したことを示す。ＯＸ４０標的モックｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/4420及び抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1AA/FS30-10-16の組み合わせは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性をさらに減少させた。これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７のクラスター化及びアゴニスト作用を介して、Ｔ細胞活性化を誘導するために、両方の受容体に対するｍＡｂ^２の二重結合が必要であることを示す。 １００倍過剰量のＯＸ４０標的モックｍＡｂ^２ FS20m-232-91AA/4420、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1/Lob12.3又は陰性対照ｍＡｂ G1AA/4420（抗ＦＩＴＣ）のいずれかの存在下での、マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20m-232-91AA/Lob12.3の活性を試験するための競合アッセイを示す。結果は、ｍＡｂ^２が、抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７抗体の非存在下で両方の受容体に結合できた場合と比較して、ＣＤ１３７への結合についてG1/Lob12.3 ｍＡｂに負ける場合、ｍＡｂ^２の活性が著しく低下し、ＯＸ４０への結合についてFS20m-232-91AA/4420モックｍＡｂ^２に負ける場合も低いレベルに低減されたことを示す。予想されるように、過剰量の陰性対照ｍＡｂ並びに抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７抗体が存在しない場合と同様のレベルの活性は、過剰量の陰性対照ｍＡｂが存在する場合、ｍＡｂ^２について観察された。これらの結果は、ｍＡｂ^２が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７のクラスター化及びアゴニスト作用を介して、Ｔ細胞活性化を誘導するために、両方の受容体に対するｍＡｂ^２の二重結合が必要であることを示す。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性を示す。G1/OX86（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＯＸ４０陽性対照）、G1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＣＤ１３７陽性対照）、G1/4420（ＩｇＧ対照）、G1/OX86とG1/Lob12.3との組み合わせ、抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1AA/OX86と抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1AA/Lob12.3（両方ＬＡＬＡ変異を有する）との組み合わせ、FS20m-232-91/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を有しないＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２）及びFS20m-232-91AA/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの平均ＣＴ２６腫瘍体積（プラス又はマイナス平均の標準誤差）が示される。結果は、ＬＡＬＡ変異（それぞれFS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91AA/Lob12.3）を有する又は有しない両方のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２による処置が、抗ＯＸ４０抗体G1/OX86、抗ＣＤ１３７抗体G1/Lob12.3、これらの２つの抗体の組み合わせ（G1/OX86プラスG1/Lob12.3）及びＬＡＬＡ含有抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の組み合わせ（G1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3）による処置と比較して腫瘍増殖の減少をもたらしたことを示す。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性を示す。３ｍｇ／ｋｇの、アイソタイプ対照（クローンG1AA/4420）、ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２（クローンFS20m-232-91AA/4420）、抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂ（クローンG1AA/Lob12.3）、ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２と抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂとの組み合わせ又はｍＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（クローンFS20m-232-91AA/Lob12.3）のいずれかの腹腔内注射によって処置された個々のＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積（経時）を示す。水平破線は、ｙ軸上で０ｍｍ^３の位置を示す。定性的に、ｍＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２と抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂとの組み合わせが動物のサブセットにおけるＣＴ２６腫瘍増殖を阻害した。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性を示す。図１０Ｂに個別に表されたＣＴ２６担癌マウスの平均腫瘍体積（プラス又はマイナス平均の標準誤差）を示す。ｍＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２で処置された群は、アイソタイプ対照群と比較して遅い初期腫瘍増殖フェーズ（１０～２２日目）を有していた。抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂ及びｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２は、単剤として又は組み合わせで初期腫瘍増殖速度に影響を及ぼさなかった。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性を示す。図１０Ｂ及び１０Ｃで示されているのと同じＣＴ２６担癌マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。生存分析は、抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂ及びｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２の単剤又は組み合わせのいずれでもなく、ｍＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２による処置が、アイソタイプ対照と比較して統計的に有意な生存率の増加をもたらしたことを示す。（対比較は、対数順位検定（Mantel-Cox）を使用して実施した；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意でない。） Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性を示す。マウスをFS20m-232-91AA/Lob12.3（ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２）又はG1/4420（ＩｇＧ対照）で処置した。平均腫瘍体積プラス又はマイナス標準誤差平均がプロットされる。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、G1/4420対照抗体で処置されたマウスと比較してB16-F10同系モデルで腫瘍増殖を有意に減少させることができたことを示す。 ＳＥＡアッセイにおける抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７のｍＡｂ^２の活性を示す。試験したｍＡｂ^２は、FS20-22-49AA/FS30-10-16であった。対照は、G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/S1（抗ＰＤ－Ｌ１）であり、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の存在下又は非存在下のいずれかで試験した。結果は、FS20-22-49AA/FS30-10-16が存在する場合のＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加、及びｍＡｂ^２単独で処置したＴ細胞と比較して、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２へのG1AA/S1の添加がＩＬ－２放出（最大応答）を増加させたことを示す。Ｔ細胞を対照抗体のみで処置した場合、活性は見られなかった。群G1/4420プラスFS20-22-49AA/FS30-10-16及びG1AA/S1プラスFS20-22-49AA/FS30-10-16間の統計的検定は、二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を使用して実施された。ここで、アスタリスクは、ｐ値を示す（＊ｐ＜０．０３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＳＥＡアッセイにおける抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７のｍＡｂ^２の活性を示す。試験したｍＡｂ^２は、FS20-22-49AA/FS30-10-16であった。対照は、G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/5C4（抗ＰＤ－１）であり、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の存在下又は非存在下のいずれかで試験した。結果は、FS20-22-49AA/FS30-10-16が存在する場合のＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加、及びｍＡｂ^２単独で処置したＴ細胞と比較して、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２へのG1AA/5C4の添加がＩＬ－２放出（最大応答）を増加させたことを示す。Ｔ細胞を対照抗体のみで処置した場合、活性は見られなかった。群G1/4420プラスFS20-22-49AA/FS30-10-16及びG1AA/5C4プラスFS20-22-49AA/FS30-10-16間の統計的検定は、二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を使用して実施された。ここで、アスタリスクは、ｐ値を示す（＊ｐ＜０．０３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 単剤で及び組み合わせて試験した、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの抗腫瘍活性を示す。アイソタイプ対照抗体の組み合わせ（G1AA/4420及びmIgG1/4420）で処置されたＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積が示される。細胞接種の６０日後の研究終了時に退縮した腫瘍（６２．５ｍｍ^３以下の腫瘍体積として定義される）を有するマウスの割合が各処置群について示される。 単剤で及び組み合わせて試験した、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの抗腫瘍活性を示す。抗マウスＰＤ－１抗体で処置されたＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積が示される。細胞接種の６０日後の研究終了時に退縮した腫瘍（６２．５ｍｍ^３以下の腫瘍体積として定義される）を有するマウスの割合が各処置群について示される。抗ＰＤ－１抗体で単剤処置に供されたマウスは、試験終了時に０％の腫瘍退縮を示した。 単剤で及び組み合わせて試験した、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの抗腫瘍活性を示す。抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２）で処置されたＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積が示される。細胞接種の６０日後の研究終了時に退縮した腫瘍（６２．５ｍｍ^３以下の腫瘍体積として定義される）を有するマウスの割合が各処置群について示される。FS20m-232-91AA/Lob12.3）で単剤処置に供されたマウスは、試験終了時に７％の腫瘍退縮を示した。 単剤で及び組み合わせて試験した、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの抗腫瘍活性を示す。抗マウスＰＤ－１抗体及び抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２の組み合わせで処置されたＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積が示される。細胞接種の６０日後の研究終了時に退縮した腫瘍（６２．５ｍｍ^３以下の腫瘍体積として定義される）を有するマウスの割合が各処置群について示される。結果は、抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体及びFS20m-232-91AA/Lob12.3の組み合わせが完全な腫瘍退縮反応を示した動物の割合が最も高く、１５匹中７匹（４７％）につながったことを示す。 単剤で及び組み合わせて試験した、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの抗腫瘍活性を示す。図１３Ａ～Ｄで説明したように処置されたＣＴ２６担癌マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。生存分析は、FS20m‐232‐91AA/Lob12.3及び抗ＰＤ‐１抗体の組み合わせがアイソタイプ対照抗体（対数順位（マンテル・コックス）検定、ｐ＜０．０００１）と比較して統計的に有意な延命効果をもたらすことを示した。アイソタイプ対照抗体と比較して、単剤処置では有意な生存率の差は観察されなかった。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の用量依存性の抗腫瘍活性を示す。１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体（G1AA/4420）又は０．１、０．３、１、３若しくは１０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3のいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して処置したＣＴ２６担癌マウスの腫瘍体積を示す。細胞接種の６７日後の研究終了時に退縮した腫瘍（６２．５ｍｍ^３以下の腫瘍体積として定義される）を有するマウスの割合が各処置群について示される（各グラフの右上を参照されたい）。結果は、０．３、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3が研究終了時の動物のそれぞれ４％（１／２５）、４％（１／２５）、８％（２／２５）及び４％（１／２５）で腫瘍退縮をもたらしたことを示す。アイソタイプ対照及び０．１ｍｇ／ｋｇ FS20m-232-91AA/Lob12.3群の動物は、いずれも腫瘍退縮を示さなかった。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の用量依存性の抗腫瘍活性を示す。図１４Ａで説明したように処置されたＣＴ２６担癌マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。生存分析は、試験した全ての用量レベルでのFS20m-232-91AA/Lob12.3が、アイソタイプ対照と比較して統計的に有意な延命効果をもたらしたことを示した。１及び３ｍｇ／ｋｇ群並びに３及び１０ｍｇ／ｋｇ群の比較では、生存率に統計的差異は見られなかった。対比較は、特に明記されていない限り、対数順位検定（Mantel-Cox）を使用して、各群及び１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照間で実施した；＊ｐ≦０．０５、＊＊＊≦０．０００５、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意でない。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて異なる抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンを含有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体の抗腫瘍効果の比較を示す。G1/4420（ＩｇＧ対照）、FS20m-232-91AA/Lob12.3（架橋依存性ＣＤ１３７アゴニストクローンLob12.3を有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２）及びFS20m-232-91AA/3H3（架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニストクローン3H3を有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２）で処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの平均ＣＴ２６腫瘍体積を示す。平均腫瘍体積プラス又はマイナス平均の標準誤差が示される。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体（FS20m-232-91AA/Lob12.3又はFS20m-232-91AA/3H3）のいずれかによる処置が、アイソタイプ対照抗体（G1/4420）による処置と比較して腫瘍増殖の減少をもたらしたこと及びFS20m-232-91AA/Lob12.3又はFS20m-232-91AA/3H3で処置したマウスでは減少レベルの違いが観察されなかったことを示す。 ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて異なる抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンを含有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体の抗腫瘍効果の比較を示す。図１５Ａで説明したように処置されたＣＴ２６担癌マウスのカプラン・マイヤー生存プロットを示す。生存分析は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3又はFS20m-232-91AA/3H3）のいずれかによる処置が、アイソタイプ対照抗体による処置と比較して統計的に有意な延命効果をもたらした（対数順位（Mantel Cox）検定；ｐ＜０．０５）が、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のいずれかで処置したマウス間で差異が観察されなかったことを示した。

詳細な説明
ここで、本発明の態様及び実施形態を、添付の図面を参照して論じる。さらなる態様及び実施形態は、当業者に明らかであろう。本文で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０の両方に結合する抗体分子に関する。具体的には、本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位とを含む。「ＣＤ１３７」及び「ＯＸ４０」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０、マウスＣＤ１３７及びマウスＯＸ４０、及び／又はカニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０を指し得る。好ましくは、「ＣＤ１３７」及び「ＯＸ４０」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０を指す。

「抗体分子」という用語は、天然であるか又は部分的若しくは全体的に合成的に産生されるかを問わず、免疫グロブリンを説明する。抗体分子は、ヒト又はヒト化、好ましくはヒトであり得る。抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプサブクラス、並びにそれらのフラグメントである。抗体分子は、他のポリペプチド及び／又は血清成分に結合することができる抗体などの汚染物質を含まないという意味で単離され得る。

したがって、本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、抗体フラグメントを含む。ただし、前記フラグメントは、ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位及び定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む。したがって、文脈上別段の必要がない限り、本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、「抗体分子又はそのフラグメント」と均等である。

モノクローナル抗体及び他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ＣＤＲ若しくは可変領域及び／又はＯＸ４０抗原結合部位を提供する定常ドメイン配列を異なる免疫グロブリンに導入することを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号又は欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号に記載されている。同様の技術を、関連する定常ドメイン配列に使用することができる。代わりに、抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受け得、これは、産生される抗体の結合特異性を変化させる場合も変化させない場合もある。

抗体は、多くの方法で修飾できるため、「抗体分子」という用語は、抗体フラグメント、誘導体、機能的均等物及び抗体の相同体を包含すると解釈されるべきであり、これは、天然であるか又は全体的若しくは部分的に合成であるかを問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン又は均等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ－０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第Ａ－０１２５０２３号に記載されている。

ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体フラグメントの例は、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al., 1996）。

本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する。これに関連して、結合は、特定の結合を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー（ここではＣＤ１３７及びＯＸ４０）以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、ＣＤ１３７及びＯＸ４０上のエピトープなど、いくつかの抗原によって運ばれる特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合、抗体分子は、エピトープを運ぶ様々な抗原に結合できる。好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＧＩＴＲ、ＮＧＦＲ、ＣＤ４０及び／又はＤＲ６に結合しないか、又はそれらへの有意な結合を示さない。

抗体及びそれらの構築及び使用のための方法は、当技術分野で周知であり、例えばHolliger and Hudson 2005に記載されている。モノクローナル抗体及び他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ある抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体分子に導入することを含み得る（欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号）。

ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域の抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ又は３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲなどの３つのＣＤＲによって形成され得る。好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、３つのＶＬ ＣＤＲ及び３つのＶＨ ＣＤＲによって形成される。抗原の結合に対する異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位によって変動し得る。

抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に位置し得、及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域に位置し得る。

抗体分子は、第１の抗原に対して１つ又は好ましくは２つ以上、例えば２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を有し得る。したがって、抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち例えば天然に存在するＩｇＧ分子の場合のように２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。

ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、又はFS30-35-14、又はFS30-5-37、好ましくは抗体FS30-10-16の３つのＶＨ ＣＤＲ又は３つのＶＬ ＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを含み得る。

これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、次のように記載される。
（ｉ）配列番号FS30-10-16のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号１２及び１４に示され；
（ｉｉ）配列番号FS30-10-3のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号１８及び１４に示され；
（ｉｉｉ）配列番号FS30-10-12のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号２３及び１４に示され；
（ｉｖ）配列番号FS30-35-14のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号１７０及び１７２に示され；
（ｖ）配列番号FS30-5-37のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号４０及び４２に示される。

当業者は、上記の抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列からＣＤＲの配列を決定することに困難はないであろう。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat（Kabat et al., 1991）又は国際的なImMunoGeneTics情報システム（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al., 2015）に従って決定され得る。

ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれ抗体分子のＶＨドメインの２７～３８、５６～６５及び１０５～１１７位に位置する配列であり得る。

Kabat番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＨドメインの３１～３５、５０～６５及び９５～１０２位に位置する配列であり得る。

ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２７～３８、５６～６５及び１０５～１１７位に位置する配列であり得る。

Kabat番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２４～３４、５０～５６及び８９～９７位に位置する配列であり得る。

例えば、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２及び３［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１、２及び１６［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２及び２１［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２５、２６及び２７［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号３３、３４及び３５［FS30-5-37］
のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って定義される。

抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号７、８及び９［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号７、８及び１７［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７、８及び２２［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２９、３０及び３１［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号３７、３８及び３９［FS30-5-37］
のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、Kabatの番号付けスキームに従って定義される。

例えば、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号４、５及び６［FS30-10-16］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６［FS30-10-12］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号４、５及び２８［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号４、５及び３６［FS30-5-37］
のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って定義される。

例えば、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号１０、１１及び６［FS30-10-16］、
（ｉｉ）それぞれ配列番号１０、１１及び６［FS30-10-3］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１０、１１及び６［FS30-10-12］、
（ｉｖ）それぞれ配列番号１０、１１及び２８［FS30-35-14］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１０、１１及び３６［FS30-5-37］
のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、Kabatの番号付けスキームに従って定義される。

抗体FS30-10-16、FS30-10-3及びFS30-10-12のＶＨ及びＶＬ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームによるＶＨの１０９位の残基（Kabat番号付けスキームによるＶＨの残基９７）を除いて同一である。したがって、抗体分子は、抗体FS30-10-16のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列及び／又はＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、ＶＨドメイン配列及び／又はＶＬドメイン配列を含み得、ここで、抗体分子は、任意選択により、ＩＭＧＴ番号付けスキームによる重鎖の１０９位（Kabat番号付けスキームによる重鎖の残基９７）にアミノ酸置換を含み、前記位置の残基は、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）及びロイシン（Ｌ）からなる群から選択される。

ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14又はFS30-5-37、好ましくは抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12又はFS30-35-14、より好ましくは抗体FS30-10-16、FS30-10-3又はFS30-10-12、最も好ましくは抗体FS30-10-16のＶＨ又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨ及びＶＨドメインを含み得る。

抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14及びFS30-5-37のＶＨドメインは、それぞれ配列番号１２、１８、２３、１７０及び４０に記載される配列を有し得る。抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14及びFS30-5-37のＶＬドメインは、それぞれ配列番号１４、１４、１４、１７２及び４２に記載される配列を有し得る。

本発明の抗体分子は、抗体分子の定常ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む。定常ドメインは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４ドメインであり得、好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、より好ましくはＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくはＣＨ３ドメインである。

定常ドメインのアミノ酸残基の位置は、特に明記しない限り、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って本明細書で番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Lefranc et al., Dev.Comp.Immunol., 29, 185-203 (2005)に記載されている。

ＯＸ４０抗原結合部位は、定常ドメインの第１、第２及び第３の構造ループにそれぞれ位置する第１、第２及び第３の配列を含み得る。標的抗原の抗原結合部位を作製するための抗体定常ドメイン構造ループの操作は、当技術分野で知られており、例えばWozniak-Knopp et al., 2010並びに国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載される。好ましくは、第１、第２及び第３の構造ループは、それぞれ抗体分子のＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループである。ＣＨ３ドメインにおいて、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、それぞれＣＨ３ドメインの残基１１～１８、４３～７８及び９２～１０１に位置する。新しい抗原結合部位を作製するための抗体定常ドメインの構造ループ配列の改変は、例えば、国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。

好ましい実施形態において、抗体分子のＯＸ４０抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号５１、５２及び５３に記載されるFS20-22-49；
（ｉｉ）それぞれ配列番号５１、５９及び６０に記載されるFS20-22-38；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号５１、５２及び６０に記載されるFS20-22-41；
（ｉｖ）それぞれ配列番号５１、５２及び６５に記載されるFS20-22-47；又は
（ｖ）それぞれ配列番号５１、５２及び６８に記載されるFS20-22-85
の第１、第２及び第３の配列を含む。

ＯＸ４０抗原結合部位は、FS20-22-49、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47又はFS20-22-85のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含み得、ここで、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、それぞれＣＨ３ドメインの残基１１～１８、４３～７８及び９２～１０１に位置する配列であり、FS20-22-49、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47又はFS20-22-85のＣＨ３ドメインは、それぞれ配列番号５４、６１、６３、６６及び６９に記載される。

より好ましい実施形態において、抗体分子のＯＸ４０抗原結合部位は、それぞれ配列番号５１、５２及び５３に記載されるFS20-22-49の第１、第２及び第３の配列を含む。例えば、ＯＸ４０抗原結合部位は、それぞれ配列番号５６、５７及び５８に示されるFS20-22-49のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含み得る。

抗体分子のＯＸ４０抗原結合部位がFS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49又はFS20-22-85の第１、第２及び第３の配列を含む場合、第１、第２及び第３の配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれ１４から１８、４５．１から７７及び９３から１０１位に位置する。

ＯＸ４０抗原結合部位がFS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49又はFS20-22-85のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含む場合、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれ１１から１８、４３から７８及び９２から１０１位に位置する。

抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインの９１位にロイシン（Ｌ）をさらに含み得る。特に、FS20-22-85の第１、第２及び第３の配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含む抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインの９１位にロイシンを含み得る。

代替的な実施形態において、抗体分子のＯＸ４０抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号７１、７２及び７３に記載されるFS20-31-58；
（ｉｉ）それぞれ配列番号７１、７２及び７６に記載されるFS20-31-66；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７９、８０及び８１に記載されるFS20-31-94；
（ｉｖ）それぞれ配列番号８４、８５及び７６に記載されるFS20-31-102；
（ｖ）それぞれ配列番号８４、８８及び８９に記載されるFS20-31-108；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号８４、９２及び８９に記載されるFS20-31-115
の第１、第２及び第３の配列を含む。

ＯＸ４０抗原結合部位は、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108又はFS20-31-115のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含み得、ここで、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、それぞれＣＨ３ドメインの残基１１～１８、４３～７８及び９２～１０１に位置する配列であり、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108又はFS20-31-115のＣＨ３ドメインは、それぞれ配列番号５４、６１、６３、６６及び６９に記載される。

抗体分子のＯＸ４０抗原結合部位がFS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108又はFS20-31-115の第１、第２及び第３の配列を含む場合、第１、第２及び第３の配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれ１４から１８、４５．１から７７及び９２から１０１位に位置する。

ＯＸ４０抗原結合部位がFS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108又はFS20-31-115のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含む場合、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれ１１から１８、４３から７８及び９２から１０１位に位置する。

ＩＭＧＴ番号付けの代替として、本明細書に記載のアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む、定常ドメインにおけるアミノ酸残基の位置は、ＩＭＧＴエクソン番号付け（連続番号付けとも呼ばれる）、ＥＵ番号付け又はKabat番号付けに従って番号付けされ得る。ＣＨ３ドメインの残基位置のＩＭＧＴ番号付け、ＩＭＧＴエクソン番号付け、ＥＵ番号付け及びKabat番号付け間の一致を図１に示す。

したがって、例えば、本出願が、抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれ１４から１８、４５．１から７７及び９３から１０１位に位置する第１、第２及び第３の配列に言及し、残基の位置がＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる場合、第１、第２及び第３の配列は、ＣＨ３ドメインの１８から２２、４６から５０及び７４から８２位に位置し、ここで、残基の位置は、図１に示すように、ＩＭＧＴエクソン番号付けスキームに従って番号付けされる。

一実施形態において、抗体分子は、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108又はFS20-31-115のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それを有するか又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み、ここで、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108及びFS20-31-115のＣＨ３ドメイン配列は、それぞれ配列番号５４、６１、６３、６６、６９、７４、７７、８２、８６、９０及び９３に記載される。

好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号５４に記載されるFS20-22-49のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それを有するか又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む。

抗体分子のＣＨ３ドメインは、任意選択により、ＣＨ３ドメイン配列のＣ末端のすぐ隣に追加のリジン残基（Ｋ）を含み得る。

さらに、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号４８に記載される配列を有し得る。

抗体分子のＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの１つ以上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩｌａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるか又は抑制することにより、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣが減少するか又は排除されると仮定する。同様に、補体への結合を減少させるか又は抑制することは、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを減少又は排除することが期待される。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させるか又は抑制する変異は、当技術分野で公知である（Wang et al., 2018）。これらの変異には、Bruhns et al., 2009及びHezareh et al., 2001に記載される「ＬＡＬＡ変異」が含まれ、これは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１．３位及び１．２位のロイシン残基をアラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）で置換することを含む。代わりに、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ８４．４位のアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）に変異させることによる、保存されたＮ結合型グリコシル化部位の変異を通じたα－グリコシル抗体の生成は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al., 2018）。さらなる代替として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１１４位のプロリンをアラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）に変異させることによって低減することが知られている（Idusogie et al., 2000；Klein et al., 2016）。これらの変異は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性がさらに低下したか又は全くない抗体分子を生成するために組み合わせることもできる。

したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位及び１．２位のアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位のアラニン又はグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位のアラニン、グルタミン又はグリシン
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。

好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。

例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号４９に記載される配列を有し得る。

代替的な好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位のアラニン
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。

例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号５０に記載される配列を有し得る。

好ましい実施形態において、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子は、
（ａ）ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14又はFS30-5-37、好ましくはFS30-10-16、FS30-10-3又はFS30-10-12、より好ましくはFS30-10-16又はFS30-10-3、最も好ましくはFS30-10-16の３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲ（ＣＤＲ１～６）を含み、
ＯＸ４０抗原結合部位は、それぞれＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、第１、第２及び第３の配列は、それぞれ配列番号５１、５２及び５３に記載されるFS20-22-49の配列を有する。

さらに好ましい実施形態において、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子は、
（ａ）ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）配列番号５４に記載される配列［FS20-22-49］を含むか、それを有するか又はそれからなるＣＨ３ドメイン
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14又はFS30-5-37、好ましくはFS30-10-16、FS30-10-3又はFS30-10-12、より好ましくはFS30-10-16又はFS30-10-3、最も好ましくはFS30-10-16の３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲ（ＣＤＲ１～６）を含む。

さらにより好ましい実施形態において、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子は、
（ａ）ＣＤ１３７のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含むＶＨドメイン及びＶＬドメイン；及び
（ｂ）配列番号５４に記載される配列［FS20-22-49］を含むか、それを有するか又はそれからなるＣＨ３ドメイン
を含み、ＶＨ及びＶＬドメインは、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14又はFS30-5-37、好ましくはFS30-10-16、FS30-10-3又はFS30-10-12、より好ましくはFS30-10-16又はFS30-10-3、最も好ましくはFS30-10-16のＶＨ及びＶＬを含むか、それらを有するか又はそれらからなる。

さらに好ましい実施形態において、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子は、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号９５及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-16；
（ｉｉ）それぞれ配列番号９９及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-3；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１０３及び９７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-10-12；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１０５及び１０７に記載されるFS20-22-49AA/FS30-35-14；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１０９及び１１１に記載されるFS20-22-49AA/FS30-5-37
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか又はそれらからなる重鎖を含み、ここで、抗体分子は、好ましくは、（ｉ）から（ｉｖ）に記載される軽鎖及び重鎖を含み、より好ましくは（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載される軽鎖及び重鎖を含み、最も好ましくは（ｉ）に記載されている軽鎖及び重鎖を含む。

本発明の抗体分子は、本明細書に開示の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列の変異体も含み得る。適切な変異体は、配列の変更又は変異及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０に対する結合特異性及び／又は結合親和性など、親抗体分子の１つ以上の機能的特徴を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親）抗体分子と同じ親和性又はより高い親和性でＣＤ１３７及び／又はＯＸ４０に結合する。親抗体分子は、変異体抗体分子に組み込まれているアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含まない抗体分子である。

例えば、本発明の抗体分子は、本明細書に記載の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列を含み得る。

好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号５４に記載されるＣＨ３ドメイン配列［FS20-22-49］に対して少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。

さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号４８又は４９に記載されるＣＨ２ドメイン配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ２ドメイン配列を有するか又はそれを含む。

配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc、米国サンディエゴ）を参照して定義される。ＧＡＰは、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを使用して、２つの完全配列を整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般的に、ギャップ生成ペナルティが１２に等しく、ギャップ拡張ペナルティが４に等しいデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合もあるが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988の方法を使用）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）、又は上掲Altschul et al. 1990のＴＢＬＡＳＴＮプログラムも、一般的にデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る。特に、psi-Blastアルゴリズム（Altschul et al., 1997）が使用され得る。

本発明の抗体分子は、本明細書に記載の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更又は１つの変更を有する第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖も含み得る。特に、変更は、ＶＨ及びＶＬドメイン配列の外側の抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域及び／又はＣＨ３ドメインの１つ以上のフレームワーク領域においてなされ得る。例えば、変更は、第１、第２及び第３の配列として又はＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列として、本明細書に記載される配列の外側のＣＨ３ドメインに存在し得る。

好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号５４、６１、６３、６６、６９、７４、７７、８２、８６、９０又は９３に記載されるＣＨ３ドメイン配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更又は１つの変更を伴うＣＨ３ドメイン配列を含み得る。

さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号４８又は４９に記載されるＣＨ２ドメイン配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更又は１つの変更を伴うＣＨ２ドメイン配列を含む。

１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている好ましい実施形態において、置換は、例えば、以下の表に従う保存的置換であり得る。いくつかの実施形態において、中央の列の同じカテゴリーのアミノ酸は、互いに置換されており、すなわち、非極性アミノ酸は、例えば、別の非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態において、右端の列の同じ行のアミノ酸が互いに置換されている。

いくつかの実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、いくつかの実施形態において、置換は、均等な非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を与えない（又は実質的に影響を与えない）可能性がある。

抗体分子は、好ましくは、ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に結合する。好ましくは、抗体分子は、ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に同時に結合することができ、ここで、ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０は、共発現される。この意味での共発現は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０が同じ細胞、例えばＴ細胞などの免疫細胞で発現される状況並びにＣＤ１３７及びＯＸ４０が異なる細胞、例えば腫瘍微小環境において互いに隣接して位置する２つの異なる免疫細胞で発現される状況を包含する。したがって、本発明の抗体分子は、シスの単一細胞上の両方の標的に結合することができ、またトランスの異なる細胞上に発現された２つの標的に結合することができると考えられる。

抗体分子は、好ましくは、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ若しくは０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性で二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性でヒトＣＤ１３７に結合する。抗体分子は、単量体のＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合し得る。ヒトＣＤ１３７は、例えば、配列番号１２７に示される配列を有し得る。

抗体分子は、好ましくは、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ若しくは０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性で二量体のヒトＯＸ４０に結合する。好ましくは、抗体分子は、０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性でヒトＯＸ４０に結合する。抗体分子は、単量体のＯＸ４０よりも高い親和性で二量体のＯＸ４０に結合し得る。ヒトＯＸ４０は、例えば、配列番号１３０に記載される配列を有し得る。

抗体分子は、好ましくは、カニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０に結合する。カニクイザルＣＤ１３７及びＯＸ４０並びにヒトＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合することは、ヒトへの投与前に有効性及び毒性についてカニクイザルで抗体分子を試験できるため、有益である。好ましくは、抗体分子は、カニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０に同時に結合することができ、ここで、カニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０は、共発現される。

抗体分子は、好ましくは、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ若しくは０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、０．３ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。カニクイザルＣＤ１３７は、例えば、配列番号１２９に記載される配列を有し得る。

抗体分子は、好ましくは、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ若しくは１ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性で二量体のカニクイザルＯＸ４０に結合する。好ましくは、抗体分子は、１ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）又はそれより高い親和性でカニクイザルＯＸ４０に結合する。カニクイザルＯＸ４０は、例えば、配列番号１３１に記載される配列を有し得る。

抗体分子は、好ましくは、抗体分子が二量体のヒトＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍又は５倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のカニクイザルＯＸ４０に結合する。好ましくは、抗体分子は、抗体分子が二量体のヒトＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の５倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のカニクイザルＯＸ４０に結合する。

抗体分子は、好ましくは、抗体分子が二量体のヒトＣＤ１３７に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の３０倍、２０倍、１０倍、５倍、４倍、３倍又は２倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、抗体分子が二量体のヒトＣＤ１３７に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の２倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。

本実施例に記載されるように、カニクイザル研究におけるｍＡｂ^２の挙動をヒトに外挿することができると期待されるため、ヒト及びカニクイザル抗原との結合の類似性は、有利であり得ると考えられる。これは、カニクイザルで抗体分子を用いて実施された有効性及び毒性の研究を実施するのに有益であると考えられ、これは、ヒトにおける抗体分子及び有効性と毒性を予測するものであり得る。

抗体分子は、好ましくは、抗体分子が二量体のヒトＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍又は５倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、抗体分子が二量体のヒトＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の２倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。

抗体分子は、好ましくは、抗体分子が二量体のカニクイザルＯＸ４０に結合する親和性（Ｋ_Ｄ）の１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍又は５倍以内である親和性（Ｋ_Ｄ）で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。

本実施例に記載されるように、抗体分子は、両方の標的を発現する細胞に結合する可能性がより高いため、両方の標的、すなわちＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合するために同様の親和性を有する抗体分子が有利であり得ると考えられる。

ヒトＯＸ４０、ヒトＣＤ１３７、カニクイザルＯＸ４０又はカニクイザルＣＤ１３７など、同族抗原に対する抗体分子の結合親和性は、例えば、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。細胞表面に発現するＯＸ４０又はＣＤ１３７に対する抗体分子の結合親和性は、フローサイトメトリーによって決定できる。

抗体分子は、リガンド結合について様々な活性を有することが示されている。例えば、抗体分子は、ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を遮断することが可能であるか、遮断することが可能でないか、又は部分的に遮断することが可能であり得る。

好ましくは、抗体分子は、ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を遮断することが可能であるか、遮断することが可能でないか、又は部分的に遮断することが可能であり得る。より好ましくは、抗体分子は、ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を部分的に遮断することができる。

好ましくは、抗体分子は、２つの標的が共発現される場合、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方への二重結合による架橋の結果として、ＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７のシグナル伝達を誘導することができる。このように作用することにより、そのような抗体分子は、「二重アゴニスト」と呼ばれ、すなわち、抗体分子は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方への二重結合による架橋の結果として受容体を介したシグナル伝達を誘導することができる。したがって、好ましくは、抗体分子は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方が共発現される場合、二重アゴニスト作用を誘発することができる。本明細書に記載されるように、そのような二重アゴニストは、有利であることが期待される。例えば、そのような二重アゴニストは、異なる免疫細胞の活性化を組み合わせることができ、例えばトランスで異なる細胞上の両方の標的に結合することによってＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を組み合わせることができるため、免疫応答のより強い刺激を誘発することができ得ると考えられる。さらなる例として、そのような二重アゴニストは、シスで両方の標的に結合することにより、互いに相互作用する２つの細胞を必要とせずに、両方の標的を共発現する単一細胞の活性化をもたらすことができ得ると考えられる。

より好ましくは、二重アゴニストは、その特定の標的（ＯＸ４０及びＣＤ１３７）との同時係合により、追加の架橋、例えば架橋剤又はＦｃγ受容体を必要とせずに自律的にアゴニスト作用を駆動できる必要がある。本明細書に記載されるように、そのような自律的活性は、両方の標的が共発現される位置に制限されるため、有利であることが期待され、したがってＯＸ４０の共発現がほとんど又は全くない位置でのＣＤ１３７の活性化に関連する可能性のある毒性を低減することが期待される。

Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを使用して測定することができる。Ｔ細胞は、活性化するとＩＬ－２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、ＩＬ－２放出を測定して、抗体分子によって誘導されるＴ細胞活性化のレベルを決定し得る。

例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ－２の最大半量の放出を達成するために必要な抗体分子の濃度を測定することによって決定される。これは、以下でＥＣ_５０と呼ばれる。

好ましい実施形態において、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同じアッセイにおけるFS20-22-49AA/FS30-10-16のＥＣ_５０の５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍又は５倍以内であるＥＣ_５０を有し、ここで、FS20-22-49AA/FS30-10-16は、配列番号９５の重鎖及び配列番号９７の軽鎖からなる。

例えば、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ、１ｎＭ又は０．５ｎＭ以下、好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは架橋されている場合に１ｎＭ以下のＥＣ_５０を有し得る。

さらに又は代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度を測定することによって決定され得る。

好ましい実施形態において、抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度は、同じアッセイにおいてFS20-22-49AA/FS30-10-16の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ－２の最大濃度の２０％又は１０％以内であり、ここで、FS20-22-49AA/FS30-10-16は、配列番号９５の重鎖及び配列番号９７の軽鎖からなる。

Ｔ細胞活性化アッセイは、好ましくは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７を共発現するＴ細胞を含む。好ましい実施形態において、Ｔ細胞活性化アッセイは、ＣＤ１３７及びＯＸ４０以外の抗体分子を架橋することができるいかなる薬剤も含まない。

Ｔ細胞活性化アッセイは、本実施例に記載されるような汎Ｔ細胞アッセイ、ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ又はＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイなど、本明細書に記載されるようなＴ細胞アッセイであり得る。

例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離されたＴ細胞に基づくＩＬ－２放出アッセイであり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイ又はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイは、それぞれヒトＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＩＬ－２放出アッセイであり得る。本実施例で説明するように、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイの両方でＴ細胞を活性化することができる抗体分子は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を活性化することができる（「二重アゴニスト」とも呼ばれる）。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球枯渇コーンからヒトＰＢＭＣを分離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。次に、Ｔ細胞がＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＴ細胞（全てのＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を単離するための方法も当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。

活性化アッセイは、例えば、Ｔ細胞培地などの実験培地において、必要な数のＴ細胞を調製することを含み得る。必要なＴ細胞の数は、１．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で調製され得る。次に、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを提供する適切なＴ細胞活性化試薬を使用して、Ｔ細胞が刺激され得る。例えば、Ｔ細胞活性化試薬は、ＣＤ３及びＣＤ２８を含むビーズなど、ＣＤ３及びＣＤ２８を含む試薬であり得る。分離されたＴ細胞は、Ｔ細胞を活性化するために、Ｔ細胞活性化試薬と共に一晩インキュベートされ得る。これに続き、活性化されたＴ細胞は、洗浄されて、Ｔ細胞がＴ細胞活性化試薬から分離され、２．０×１０^６細胞／ｍｌなどの適切な濃度でＴ細胞培地に再懸濁され得る。次に、活性化されたＴ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングされたプレートに添加され得る。

各試験抗体分子の適切な希釈液が調製され、ウェルに添加され得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体と共に３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートされ得る。上清を収集し、アッセイして、上清中のＩＬ－２の濃度が測定され得る。溶液中のＩＬ－２の濃度を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。ヒトＩＬ－２の濃度は、抗体分子の対数濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、対数（アゴニスト）対応答方程式を使用して適合され得る。

抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子は、コンジュゲートと呼ばれ得る。そのようなコンジュゲートにより、本明細書に記載されるような疾患の処置における用途が見出される。

例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくはヒトサイトカインなどの免疫系モジュレーターであり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子にコンジュゲートするためのサイトカインの例には、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＦＮ－ガンマが含まれる。

代わりに、生物活性分子は、サイトカイン、例えばＴＧＦ－ベータ又はＩＬ－６のリガンドトラップなどのリガンドトラップであり得る。

代わりに、生物活性分子は、治療用放射性同位体であり得る。

放射免疫療法は、例えば、癌処置に使用される。放射免疫療法に適した治療用放射性同位体は、当技術分野で知られており、イットリウム－９０、ヨウ素－１３１、ビスマス－２１３、アスタチン－２１１、ルテチウム１７７、レニウム－１８８、銅－６７、アクチニウム－２２５及びヨウ素－１２５及びテルビウム－１６１を含む。

抗体分子にコンジュゲートされ得る適切な検出可能な標識は、当技術分野で公知であり、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、テクネチウム９９などの放射性同位体；フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド並びにシアニン色素誘導体（例えば、Cy7及びAlexa750）などの蛍光色素；ジアミノベンジジンなどの発色色素；ラテックスビーズ；西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識；スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を備えた蛍光体又はレーザー色素；並びに特定の同族の検出可能部分（例えば、標識されたアビジン）への結合を介して検出され得るビオチンなどの化学部分を含む。

抗体分子は、ジスルフィド又はペプチド結合などの任意の適切な共有結合又は非共有結合により、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。適切なペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、長さは、５から２５アミノ酸、５から２０アミノ酸、５から１５アミノ酸、１０から２５アミノ酸、１０から２０アミノ酸又は１０から１５アミノ酸であり得る。

いくつかの実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体分子にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療部位での抗体分子からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーには、アミド結合（例えば、ペプチドリンカー）、ジスルフィド結合又はヒドラゾンが含まれ得る。例えば、ペプチドリンカーは、部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は、細胞質ゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは、酸媒介性加水分解によって切断され得る。

本発明は、本発明の抗体分子をコードする単離された１つ又は複数の核酸分子も提供する。当業者は、当技術分野で周知の方法を使用してそのような核酸分子を調製することに困難はないであろう。

１つ又は複数の核酸分子は、例えば、配列番号５５又は１１３、６２、６４、６７、７０、７５、７８、８３、８７、９１又は９４に記載される配列を含み得、これらは、それぞれFS20-22-49、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108及びFS20-31-115のＣＨ３ドメインをコードする。例えば、１つ又は複数の核酸分子は、配列番号５５又は１１３に記載される配列を含み得、これらは、両方ともFS20-22-49のＣＨ３ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の核酸分子は、配列番号１１３に記載される配列を含み、これは、FS20-22-49のＣＨ３ドメインをコードする。好ましくは、１つ又は複数の核酸分子は、配列番号５５に記載される配列を含み、これは、FS20-22-49のＣＨ３ドメインをコードする。

１つ又は複数の核酸分子は、抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14又はFS30-5-37、好ましくは抗体FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12又はFS30-35-14、より好ましくは抗体FS30-10-16、FS30-10-3又はFS30-10-12、最も好ましくは抗体FS30-10-16のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨドメイン及びＶＨドメインをコードし得る。これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載されている。

例えば、核酸分子は、
（ｉ）配列番号１３に記載される抗体FS30-10-16のＶＨドメイン核酸配列及び／又は配列番号１５に記載される抗体FS30-10-16のＶＬドメイン核酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１９に記載される抗体FS30-10-3のＶＨドメイン核酸配列及び／又は配列番号２０に記載される抗体FS30-10-3のＶＬドメイン核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２４に記載される抗体FS30-10-12のＶＨドメイン核酸配列及び／又は配列番号２０に記載される抗体FS30-10-12のＶＬドメイン核酸配列；
（ｉｖ）配列番号１７１に記載される抗体FS30-35-14のＶＨドメイン核酸配列及び／又は配列番号３２に記載される抗体FS30-35-14のＶＬドメイン核酸配列；又は
（ｖ）配列番号４１に記載される抗体FS30-5-37のＶＨドメイン核酸配列及び／又は配列番号４３に記載される抗体FS30-5-37のＶＬドメイン核酸配列
を含み得る。

１つ又は複数の核酸分子は、重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは抗体FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-35-14又はFS20-22-49AA/FS30-5-37の重鎖及び軽鎖、好ましくは抗体FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12又はFS20-22-49AA/FS30-35-14、より好ましくは抗体FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-10-3又はFS20-22-49AA/FS30-10-12、最も好ましくはFS20-22-49AA/FS30-10-16をコードし得る。これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載されている。

例えば、核酸分子は、
（ｉ）配列番号９６に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-16の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９８に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-16の軽鎖核酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１００に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-3の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１０２に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-3の軽鎖核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１０４に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-12の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１０２に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-10-12の軽鎖核酸配列；
（ｉｖ）配列番号１０６に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-35-14の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１０８に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-35-14の軽鎖核酸配列；又は
（ｖ）配列番号１１０に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-5-37の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１１２に記載される抗体FS20-22-49AA/FS30-5-37の軽鎖核酸配列
を含み得る。

核酸が本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上にコードされ得る。

単離された核酸分子を使用して、本発明の抗体分子を発現させ得る。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上記のような核酸を含むベクターを提供する。プロモーター配列、転写終結フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス性、例えばファージ又はファージミドであり得る。

本明細書に記載の核酸分子又はベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、任意の適切な技術が使用され得る。組換え抗体分子の産生に適した様々な宿主細胞が当技術分野で公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。

本発明の別の態様は、本発明の抗体分子を産生する方法であって、宿主細胞において抗体分子をコードする核酸を発現することと、任意選択により、そのように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することとを含む方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野で周知である。この方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組換え抗体分子を精製するための技術は、当技術分野で周知であり、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＬを使用するもの）を含む。いくつかの実施形態において、精製は、抗体分子上のアフィニティータグを使用して実施され得る。方法は、抗体分子を、任意選択により薬学的に許容される賦形剤又は以下に記載される他の物質と共に医薬組成物に製剤化することも含み得る。

上で説明したように、ＣＤ１３７及びＯＸ４０の両方は、Ｔ細胞を含む免疫系の細胞で発現している。例えば、ＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞、特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、並びに腫瘍浸潤Ｔ細胞、並びに活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫系の細胞上に発現する。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む免疫系の細胞に発現している。ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞上において低レベルで発現するが（実施例１４及び図６を参照されたい）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の一部のサブセットの増殖及び活性化の誘導に関与することも示されている（Wen et al., 2002）。

ＯＸ４０の活性化は、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞のクローン拡大培養、Ｔ細胞の分化及び生存並びにメモリーＴ細胞の生成を増強する役割を果たすことが示されている。ＣＤ１３７の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能並びにＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の維持を増強する役割を果たすことが示されている。ＣＤ１３７の活性化は、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ並びにＢ細胞の増殖、生存及びサイトカイン産生を増強することも実証されている。

ＯＸ４０及びＣＤ１３７の免疫応答増強活性に照らして、ＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト分子は、癌処置に関連して研究されており、感染症の処置における用途を見出すことも期待されている。

したがって、本明細書に記載の抗体分子は、治療用途、特に癌及び感染症の処置に有用であり得る。

本明細書に記載の抗体分子は、ヒト又は動物の体の処置方法において使用され得る。本発明の関連する態様は、
（ｉ）医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉ）疾患又は障害の処置方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の処置における使用のための医薬品の製造における、本明細書に記載の抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体の疾患又は障害の処置方法であって、本明細書に記載の治療有効量の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。

個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。

処置は、何らかの所望の治療効果、例えば状態の進行の阻害又は遅延などが達成される任意の処置又は治療であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒又は寛解（部分的又は全体的）、１つ以上の症状及び／又は状態の兆候を予防、改善、遅延、軽減若しくは阻止すること又は個体若しくは患者の生存期間を処置の不存在時に予想される期間を超えて延長することを含む。

予防的手段（すなわち予防法）としての処置も含まれる。例えば、癌などの疾患の発生又は再発の影響を受けやすいか又はそのリスクがある個体は、本明細書に記載されるように処置され得る。そのような処置は、個体における疾患の発生又は再発を予防又は遅延させ得る。

記載されているような処置方法は、抗体分子に加えて、少なくとも１つのさらなる処置を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、単独で又は１つ以上の他の処置と組み合わせて個体に投与され得る。抗体分子が別の処置と組み合わせて個体に投与される場合、追加の処置は、抗体分子の投与と同時に、連続的に又は別個に個体に投与され得る。追加の処置が抗体分子と同時に投与される場合、抗体分子及び追加の処置は、組み合わせた調製物として個体に投与され得る。例えば、追加の治療は、処置される疾患に対する既知の治療又は治療剤であり得る。

抗体分子は、単独で投与され得るが、抗体分子は、通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。

医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内において、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症のない、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤なども製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、以下で論じられるように、注入、注射又は他の適切な経路によるものであり得る。

非経口、例えば皮下又は静脈内投与（例えば、注射による）の場合、抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。関連技術を有する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノース、デキストリを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて使用し得る。

いくつかの実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、個体に投与する前に滅菌水で再構成され、且つ生理食塩水と混合され得る。

投与は、「治療有効量」であり得、これは、個体への利点を示すのに十分である。実際に投与される量並びに投与の速度及び時間経過は、処置される対象の性質及び重症度、処置される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗体分子のタイプ、投与方法、投与のスケジュール並びに医師に知られている他の要因に依存する。処置の処方、例えば投与量の決定などは、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当技術分野で周知である（Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991）。投与される抗体分子に対して適切である、本明細書又はPhysician’s Desk Reference (2003)に示されている特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は、公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置並びに抗体分子の正確な性質を含む多数の要因に依存する。

典型的な抗体用量は、全身投与の場合に１００μｇから１ｇの範囲であり、局所投与の場合に１μｇから１ｍｇの範囲である。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量が投与され得る。これは、成人個体の単回処置用の用量であり、比例的に小児及び乳児のために調整され得、分子量に比例して他の抗体形式にも調整できる。

処置は、医師の裁量により、毎日、週に２回、週に１回又は月に１回繰り返され得る。個体の処置スケジュールは、抗体組成物の薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路並びに処置される状態の性質に依存し得る。

処置は、定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、約月１回以上、約５週間以上又は約６週間以上であり得る。例えば、処置は、２から４週間ごと又は４から８週間ごとであり得る。適切な製剤及び投与経路は、上に記載されている。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、癌の処置方法における使用のためのものであり得る。

癌は、悪性癌細胞の異常な増殖を特徴とし得る。乳癌などの特定の種類の癌に言及される場合、これは、乳房組織などの関連組織の悪性細胞の異常な増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書で言及されるような乳癌ではなく、卵巣癌である。

癌は、原発癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、癌が原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得る。

本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌の腫瘍は、例えば、その細胞表面上において、ＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７の１つ又は両方を発現するＴＩＬを含むと決定されたものであり得る。細胞表面上の抗原の発現を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、例えばフローサイトメトリーを含む。

例えば、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫などのリンパ腫；並びに肉腫（例えば、軟部肉腫）、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば、膀胱尿路上皮癌）、脳腫瘍（例えば、多形神経膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば、卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺扁平上皮癌などの肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、結腸直腸癌（例えば、結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば、子宮頸扁平上皮癌及び子宮頚管内腺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌）、食道癌（oesophageal cancer）（例えば、食道癌（oesophageal carcinoma））、膵臓癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、副腎癌、胃癌（例えば、胃腺癌）、精巣癌（例えば、精巣胚細胞腫瘍）、胆嚢及び胆道の癌（例えば、胆管細胞癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌及び脳癌などの固形癌からなる群から選択され得る。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、固形癌である。

より好ましくは、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎癌、胃癌からなる群から選択される固形癌である。

さらに好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ４に結合する抗体などの１つ以上のチェックポイント阻害剤による処置に応答する癌であり得る。そのような腫瘍は、チェックポイント阻害剤治療に感受性でない腫瘍よりも高いＴＩＬレベル及び／又は高い腫瘍変異負荷を有すると考えられる。このような腫瘍は、温かい腫瘍又は熱い腫瘍とも呼ばれる。

このような腫瘍の例には、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、黒色腫、肺癌（扁平上皮肺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌［ＮＳＣＬＣ］又は小細胞肺癌［ＳＣＬＣ］など）、前立腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、甲状腺癌、腎癌、結腸直腸癌（ＭＳＩ又はＭＳＳ、例えば結腸直腸腺癌）、食道癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、胃癌、子宮内膜癌、膵臓癌、卵巣癌、肝細胞癌、中皮腫及び尿路上皮癌が含まれる。好ましい実施形態において、癌は、胃癌である。癌は、さらに、以前に化学療法剤又は放射線治療剤で処置されていない癌であり得る。すなわち、処置される個体は、対象の癌の化学療法剤又は放射線治療剤で処置を受けていない癌患者であり得る。好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、個体の１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤に応答する癌を処置する方法における使用のためのものであり、ここで、この方法は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤と組み合わせた抗体分子で患者を処置することを含む。

代わりに、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ４に結合する抗体などの１つ以上のチェックポイント阻害剤による処置に応答しない膵臓癌又は前立腺癌などの癌であり得る。このような腫瘍は、冷たい腫瘍とも呼ばれる。

本発明者らは、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独での処置に応答しなかった腫瘍が、本明細書に記載の抗体分子と組み合わせた抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処置に応答することを示した。したがって、本発明の抗体分子は、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得、ここで、癌は、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか又は抵抗性であり、方法は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤と組み合わせて抗体分子を個体に投与することを含む。癌が１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか又は抵抗性であり、方法が、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤と組み合わせて抗体分子を個体に投与することを含む、個体の癌を処置する方法も企図される。

理論に拘束されることを望むものではないが、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しない癌の化学療法、放射線療法、免疫刺激剤などの免疫療法剤又は抗腫瘍ワクチンによる処置は、癌細胞死を引き起こし、その結果、腫瘍内のＴＩＬが増加し、免疫抑制受容体の発現が高くなり、これにより、癌は、チェックポイント阻害剤による処置に反応するようになり、すなわち冷たい腫瘍が温かい腫瘍に変化すると考えられる。したがって、本発明の抗体分子は、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得、ここで、癌は、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか又は抵抗性であり、方法は、化学療法剤、放射線療法剤若しくは免疫刺激剤又は抗癌ワクチン及び任意選択によりＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤と組み合わせて抗体分子を個体に投与することを含む。個体の癌を処置する方法であって、癌が１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか又は抵抗性であり、方法が、化学療法剤、放射線療法剤若しくは免疫刺激剤又は抗癌ワクチン及び任意選択によりＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤と組み合わせて抗体分子を個体に投与することを含む、方法も企図される。好ましい実施形態において、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する薬剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体である。

癌に関連して、処置は、完全な癌の寛解を含む癌の成長の阻害及び／又は癌の転移の阻害並びに癌の再発の阻害を含み得る。癌の増殖は、一般的に、癌内のより発達した形態への変化を示す多数の指標のいずれかを指す。したがって、癌増殖の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存の低下、腫瘍の体積又は形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査又は他の画像化方法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏性皮膚検査のパフォーマンスの改善、抗癌免疫細胞又は他の抗癌免疫応答の活性の増加及び腫瘍特異的抗原のレベルの減少が含まれる。個体の癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は増強することにより、癌の増殖、特に対象にすでに存在する癌の増殖に抵抗する個体の能力を改善し、及び／又は個体の癌増殖の傾向を低下させ得る。

癌処置に関連して、本明細書に記載の抗体分子は、対象の癌の処置に適切であることが示されているか又は潜在的に適切である抗癌療法又は治療剤などの別の抗癌療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、放射性核種、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法、例えば養子ＮＫ細胞療法又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、自己ＴＩＬ若しくはガンマ／デルタＴ細胞による治療又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて個体に投与され得る。本明細書に記載の抗体分子は、アジュバント又はネオアジュバント（ネオアジュバントホルモン療法など）、抗血管新生剤（抗ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦＲ２抗体など）又は細胞傷害性薬剤と組み合わせても個体に投与され得る。

理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗体分子は、抗癌治療におけるアジュバントとして作用し得ると考えられる。具体的には、例えば、化学療法又は放射線療法と組み合わせた抗体分子の個体への投与は、化学療法又は放射線療法単独で達成されるよりも、癌に対してより大きい免疫応答を誘発すると考えられる。

本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ－ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、プラチナ類似体、ヌクレオシド類似体、葉酸代謝拮抗剤、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍化学療法剤などからなる群から選択され得る。タキサンは、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ－パクリタキセルを含み；細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン並びにドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンなどのアントラサイクリンを含み；チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブを含み；ＰＡＲＰ阻害剤は、ピラパリブを含み；Ｂ－Ｒａｆ酵素阻害剤は、ベムラフェニブ及びダブラフェニブを含み；アルキル化剤は、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドを含み；プラチナ類似体は、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含み；ヌクレオシド類似体は、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンを含み；及び葉酸代謝拮抗剤は、メトトレキサート及びペメトレキセドを含む。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン及びビンブラスチンが含まれる。本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための化学療法剤は、フルオロピリミジンであり得る。例えば、処置される癌がＨＥＲ２陰性胃癌などのＨＥＲ２陰性である場合、本明細書に記載の抗体分子は、プラチナ、プラチナ類似体及びフルオロピリミジンと組み合わせて投与され得る。処置される癌がＨＥＲ２陽性胃癌などのＨＥＲ２陽性である場合、本明細書に記載の抗体分子は、プラチナ又はプラチナ類似体、フルオロピリミジン及びトラスツズマブと組み合わせて投与され得る。

本明細書に記載の抗体分子と共に投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン及びオキサリプラチンである。

本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射療法又は近接照射療法であり得る。

本明細書に記載の抗体分子と共に投与するための放射性核種は、イットリウム－９０、ヨウ素－１３１、ビスマス－２１３、アスタチン－２１１、ルテチウム１７７、レニウム－１８８、銅－６７、アクチニウム－２２５、ヨウ素－１２５及びテルビウム－１６１からなる群から選択され得る。

本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、ヌクレオチド、サイトカイン又はサイトカインベースの治療剤であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば阻害性チェックポイント分子又は免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体又は腫瘍抗原、例えば細胞表面腫瘍抗原又は可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例には、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＫＩＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ－１０及びＣＳＦ－１が含まれる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ－５）及びＳＴＩＮＧが含まれる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ－ベータが含まれる。

本発明者らは、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた本発明の抗体分子の投与が、本発明の抗体分子又は抗ＰＤ－１若しくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみのいずれかによる処置と比較して、マウス腫瘍モデルにおいて増強されたＴ細胞活性化及び腫瘍退縮をもたらすことを示した。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、本発明の抗体分子を、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することができる薬剤と組み合わせて投与すると、抗腫瘍効果が増強されることと、このような組み合わせ投与が、難治性若しくは耐性であるか、又はＰＤ－１若しくはＰＤ－Ｌ１抗体の単剤療法後に再発した腫瘍の処置に適している可能性があることとを示唆している。

したがって、本発明の抗体分子は、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得、ここで、この方法は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することができる薬剤と組み合わせた抗体分子を投与することを含む。個体の癌を処置する方法における使用のためのＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体分子など、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することができる薬剤も提供され、ここで、方法は、本発明の抗体と組み合わせて、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することができる薬剤を投与することを含む。処置有効量の本発明の抗体分子と、治療有効量のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することができる薬剤とを個体に投与することを含む、個体の癌を処置する方法である。

好ましい実施形態において、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害することができる薬剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体分子である。ＰＤ－１に結合する抗体は、当技術分野で公知であり、ニボルマブ（5C4）及びペンブロリズマブを含む。ＰＤ－Ｌ１に結合する既知の抗体には、YW243.55.S1、デュルバルマブ、アテゾリズマブ及びアベルマブが含まれる。本発明の抗体分子は、これらの公知の抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１抗体の１つ又は別の抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１抗体と共に投与するためのものであり得る。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する代替的抗体の調製は、定型的な方法を使用する当業者の能力の範囲内である。

本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。

サイトカイン又はサイトカインベースの治療は、ＩＬ２、コンジュゲートＩＬ－２のプロドラッグ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。

癌の処置のための抗腫瘍ワクチンは、クリニックで実施され、且つ科学文献で詳細に議論されている（Rosenberg, 2000など）。これは、主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を伴う場合と伴わない場合との両方において、ワクチン接種方法としてこれらの細胞を使用することにより、自己又は同種異系の癌細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を刺激する戦略を含む。ＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示において強い反応を引き起こし、前記戦略で使用される場合に特によく機能する。

本明細書に記載の抗体分子は、癌を有する個体、特に胃癌を有する個体にラムシルマブ及び／又はパクリタキセル；イリノテカン及びドセタキセル又はパクリタキセル；又はペンブロリズマブと組み合わせても投与され得る。ＭＳＩ－Ｈ及び／又はｄＭＭＲ胃癌の処置では、ペンブロリズマブと組み合わせた本明細書に記載の抗体分子による処置が好ましい。

ＯＸ４０及びＣＤ１３７の免疫応答増強活性に照らして、ＯＸ４０及びＣＤ１３７二重アゴニスト分子は、感染症の処置に見出すことが期待される。したがって、別の好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、急性又は持続性感染症などの感染症を処置する方法における使用のためのものであり得る。

理論に拘束されることを望むものではないが、ＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト分子は、好中球及び単球などの自然免疫細胞の急速な浸潤及び活性化を誘発することにより、病原体によって引き起こされる急性感染症に対する免疫応答を強化することが可能であり得、それにより急性感染症の原因となる病原体のクリアランスが促進されると考えられる。したがって、さらなる実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、急性細菌性疾患などの急性感染症の処置方法における使用のためのものであり得る。好ましい実施形態において、急性感染症は、リステリア（Listeria）属の細菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）など、グラム陽性菌による感染によって引き起こされる急性細菌性疾患である。

感染症は、通常、免疫系によって排除されるが、一部の感染症は、数ヶ月又は数年などの長期間にわたって持続し、免疫系によって効果的に対抗されない。このような感染症は、持続性又は慢性感染症とも呼ばれる。

好ましくは、本明細書に記載の抗体分子は、持続性のウイルス、細菌、真菌又は寄生虫感染、好ましくは持続性のウイルス又は細菌感染など、持続性感染症を処置するために使用される。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される持続性ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスの持続性感染である。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される持続性の細菌感染症は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の持続性感染症である。

ＣＤ１３７アゴニスト作用は、グラム陽性菌による感染症の処置において有益であると説明されている。したがって、好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される持続性の細菌感染症は、グラム陽性菌による持続性感染症である。より好ましい実施形態において、持続性の細菌感染症は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、らい菌（Mycobacterium leprae）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からなる群から選択されるグラム陽性菌による持続性感染症である。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される持続性の真菌感染症は、カンジダ（Candida）、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス（Cryptococcus）（ガッティ（gattii）及びネオフォルマンス（neoformans））、タラロミセス（Talaromyces）（ペニシリウム（Penicillium））マルネッフェ（marneffe）、小胞子菌（Microsporum）、例えばオーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）及びトリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）の持続性感染症である。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される持続性の寄生虫感染症は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）などのマラリア原虫（Plasmodium）又はドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）などのリーシュマニア（Leishmania）の持続性感染症である。

持続性感染症の処置に関連して、抗体分子は、対象の病原体の処置に適していることが示されているか、又は適切であると期待される第２の治療又は治療剤と組み合わせて個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、免疫療法剤と組み合わせて個体に投与され得る。本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子であり得る。例えば、治療用抗体分子は、自然免疫系の受容体に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ－５）及びＳＴＩＮＧが含まれる。

抗体分子が感染症を予防するために使用される場合、抗体分子は、対象の病原体に対するワクチンと組み合わせて投与され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗体分子は、ワクチン接種におけるアジュバントとして作用し得ると考えられる。具体的には、ワクチンと組み合わせた個体への抗体分子の投与は、ワクチン単独で達成されるよりも病原体に対するより大きい免疫応答を誘発すると考えられる。

持続性感染症の処置に関連して、処置は、感染を排除すること、個体の病原性負荷を低減すること及び感染の再発を防止することを含み得る。例えば、処置は、１つ以上の症状及び／又は持続性感染症の兆候を予防、改善、遅延、軽減又は阻止することを含み得る。代わりに、処置は、感染症の予防を含み得る。

前述の説明、以下の特許請求の範囲又は添付の図面に開示され、それらの特定の形態において又は開示された機能を実行するための手段若しくは開示された結果を得るための方法若しくはプロセスの観点から、適切に表現された特徴は、別個に又はそのような特徴の任意の組み合わせでその多様な形態において本発明を実現するために利用され得る。

本発明は、上記の例示的な実施形態と併せて説明されてきたが、本開示を与えられた場合、多くの均等な改変形態及び変形形態が当業者に明らかであろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、例示的であり、限定的でないと見なされる。記載される実施形態に対する様々な変更形態は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。

疑義を避けるため、本明細書において提供される理論的説明は、いずれも読者の理解を向上させる目的で提供されている。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望むものではない。

本明細書において使用されるセクションの見出しは、整理的な目的のみであり、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の定めがない限り、「含む（comprise）」及び「包含する」という単語並びに「含む（comprises）」、「含んでいる」及び「包含している」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他のいかなる整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味するものと理解される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈が明確に別のものを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書において、範囲は、「約」ある特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は、任意選択によるものであり、例えば＋／－１０％を意味する。

実施例
本発明者らは、人工架橋剤又はＦｃγ受容体媒介性架橋の非存在下でＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方をアゴナイズでき、癌などの疾患に対する増強した免疫応答を産生することができるｍＡｂ^２を生成することを目的とした。これに関連して、ｍＡｂ^２は、ＣＤ１３７に結合するＣＤＲベースの抗原結合部位と、抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位とを含む抗体分子である。

この目的を達成するために、本発明者らは、最初に、選択及び親和性成熟法を使用して、ＯＸ４０に結合し、ヒト及びマウスでそれぞれＴ細胞活性化を誘導することができたＦｃａｂを同定した（実施例２及び３を参照されたい）。その後、本発明者らは、これらのＦｃａｂからのＯＸ４０抗原結合部位をｍＡｂ^２形式に導入し、これらの抗ヒトＯＸ４０「モック」ｍＡｂ^２のいくつかがヒト及びカニクイザルＯＸ４０に高い親和性で結合し、架橋時にＴ細胞を活性化できることを示した（実施例４を参照されたい）。これらのうち、クローンFS20-22-49は、架橋時にアゴニスト活性の最大の増加を示し、また架橋の存在下でのアゴニスト活性について最低のＥＣ_５０を有していたため、対象ｍＡｂ^２の開発のためのＯＸ４０抗原結合部位として進められた。

ＣＤ１３７に結合してアゴナイズできるＣＤＲベースの抗原結合部位を開発するために、本発明者らは、ヒトＣＤ１３７に結合でき、架橋された場合にＴ細胞を活性化することができるのみであるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定する（実施例５を参照されたい）選択方法を使用した。これらの同定されたｍＡｂｓからのＣＤＲは、その後、FS20-22-49 ＯＸ４０抗原結合部位を含むｍＡｂ^２にクローニングした。これらのｍＡｂ^２のＣＤＲは、以下のｍＡｂ^２：FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及びFS20-22-49AA/FS30-5-37（実施例６を参照されたい）を産生するために最適化された配列であった。これらのｍＡｂ^２の全ては、ヒトＣＤ１３７に対する特異性の高いレベルを有することが示され、Ｔ細胞活性化アッセイで架橋される場合にＣＤ１３７を活性化することができた（実施例７を参照されたい）。ｍＡｂ^２は、いずれも架橋の非存在下でＣＤ１３７を活性化する有意な能力を示さなかった。

選択されたｍＡｂ^２におけるFS20-22-49AA ＯＸ４０抗原結合部位は、架橋時にＯＸ４０と結合し、活性化できたこと並びにこれとは別に、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-10-16、FS30-35-14及びFS30-5-37 ＣＤ１３７ ＣＤＲベースの抗原結合部位は、架橋時にＣＤ１３７に結合し、活性化できたことを確立し、本発明者らは、これらの抗原結合ドメインを含有するｍＡｂ^２がＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を活性化できること（「二重アゴニスト作用」とも呼ばれる）を実証しようとした。このような二重アゴニストは、ｉ）ＯＸ４０に結合してｍＡｂ^２を架橋し、ＣＤ１３７に結合し、ＣＤ１３７をクラスター化し、活性化（アゴナイズ）し、ｉｉ）ＣＤ１３７に結合してｍＡｂ^２に結合し、ＯＸ４０をクラスター化し、活性化（アゴナイズ）することができる。重要なことに、二重アゴニストは、特定の標的（ＯＸ４０及びＣＤ１３７）の発現に基づいて、追加の架橋剤を必要とせずに自律的にアゴニスト作用を駆動できる必要がある。

本発明者らは、試験したｍＡｂ^２分子がヒトＣＤ１３７、ヒトＯＸ４０、カニクイザルＣＤ１３７及びカニクイザルＯＸ４０に結合でき（実施例８を参照されたい）、試験したｍＡｂ^２分子がヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に同時に結合できる（実施例９を参照されたい）ことを実証した。本発明者らは、ｍＡｂ^２のＣＨ２ドメインにおける「ＬＡＬＡ」変異がＦｃγ受容体へのそれらの結合を減少させ、ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16がＡＤＣＣバイオアッセイにおいてＡＤＣＣ活性化を誘導できなかったことを示した（実施例１０を参照されたい）。

本発明者らは、試験されたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２分子が、細胞発現されたヒト及びカニクイザルのＯＸ４０及びＣＤ１３７に結合し、非特異的結合が観察されなかったことも示した（実施例１１を参照されたい）。

次に、本発明者らは、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ；実施例１２を参照されたい）を使用するＴ細胞活性化アッセイにおいて、このＬＡＬＡ変異を含有する試験されたｍＡｂ^２分子が人工架橋剤の非存在下でＴ細胞活性化を誘導できることを実証した。本発明者らは、試験されたｍＡｂ^２分子が汎Ｔ細胞活性化アッセイにおいて人工架橋剤の非存在下でＴ細胞活性化を誘導できること及びこの活性が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に同時に係合するｍＡｂ^２に依存することも実証した（実施例１３及び１６を参照されたい）。本発明者らは、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２が架橋の非存在下でそれぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞においてこれらの受容体を活性化できることをさらに確認した（実施例１４を参照されたい）。

抗ヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、マウスタンパク質に結合しなかったため、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２がＴ細胞媒介性抗腫瘍反応を不正に起こす可能性を試験するために、ＬＡＬＡ変異がある場合とない場合との両方において、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７を標的とする並行ｍＡｂ^２が作製された（それぞれFS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91/Lob12.3とラベルを付した）。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が追加の架橋剤なしでＴ細胞活性化を誘導できること及びこの活性が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に同時に係合するｍＡｂ^２に依存することを示した（実施例１５及び１６を参照されたい）。

本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91/Lob12.3 ｍＡｂ^２がＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいてインビボで抗腫瘍効果を有することを実証する（実施例１７を参照されたい）。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が循環Ｔ細胞に影響を及ぼし、活性化及び増殖するＴ細胞の頻度を増加させることをさらに実証する（実施例１８及び１９を参照されたい）。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２がB16-F10同系腫瘍モデルにおいてインビボで抗腫瘍効果を有することを実証した（実施例２０を参照されたい）。

本発明者らは、ｍＡｂ^２の分析的特徴付け及び予備的安定性評価を実施した（実施例２１を参照されたい）。試験された５つ全てのｍＡｂ^２は、有利な分析的特性及び有利な安定性良好な安定性を示した。

本発明者らは、ＳＥＡを用いたＴ細胞活性化アッセイにおいて、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ－１抗体との組み合わせが、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２単独で見られた上記インビトロでのＴ細胞の最大活性の増加をもたらし得ることを実証した。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせによる、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおけるインビボでの処置が抗腫瘍活性の増加をもたらし、延命効果を提供し、いずれかの単剤での処置と比較して、増殖するＴ細胞及びＮＫ細胞の薬力学的調節を強化できることをさらに示した（実施例２２を参照されたい）。

本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が特定の用量レベルまでのＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいてインビボで用量依存性の抗腫瘍活性を有し、この活性がより高い用量レベルで維持されることを実証した。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が「完全応答者」マウスにおいて防御免疫記憶の確立を誘導し、ＣＴ２６細胞の再接種から防御できることも示した（実施例２３を参照されたい）。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が循環Ｔ細胞に影響を及ぼし、様々な用量レベルで増殖する（Ｋｉ６７＋）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を有意に増加させることを実証した（実施例２４を参照されたい）。本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が、活性化され（ＣＤ６９＋）、増殖する（Ｋｉ６７＋）ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を増加させ得ること及びＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇が、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２によって媒介されるこの末梢薬力学的応答に有害な効果を有することをさらに示した（実施例２５を参照されたい）。本発明者らは、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２が、均等なヒトアッセイと比較して、一次カニクイザルＰＢＭＣアッセイにおいて同様の機能的活性を有していたこと、ｍＡｂ^２は、３０ｍｇ／ｋｇの用量までカニクイザルで十分に許容されたこと、カニクイザルにおいて、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び活性化の薬物関連の増加を誘導できたことを示した（実施例２６を参照されたい）。

本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける研究において、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニストと比較して、肝臓におけるＴ細胞の浸潤及び増殖のレベルを中程度且つ一過性に増加させ、これが肝臓のＴ細胞の浸潤、増殖及び活性化の上昇及び持続を誘導したことも示した（実施例２７を参照されたい）。最後に、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおいて、本発明者らは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２の架橋依存性抗ＣＤ１３７ Ｌｏｂ１２．３クローンと比較して増加したＴ細胞レベル及び増殖を誘導する架橋依存性Ｆａｂクローンの能力にもかかわらず、架橋非依存性抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンと対形成される同じＯＸ４０ Ｆｃａｂを含むFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２又はＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のいずれかで処置したマウス間において、腫瘍増殖又は生存に差がなかったことを示した（実施例２８を参照されたい）。

これらの実験は、以下の実施例でより詳細に説明される。

実施例１ － 抗原選択及び特性評価
ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に結合し、アゴナイジングすることが可能なｍＡｂ^２を識別するために使用される選択及びスクリーニング方法は、様々なＯＸ４０及びＣＤ１３７抗原の使用を必要とする。これらの抗原の産生については、以下でより詳細に説記載される。

１．１ ＯＸ４０抗原
ヒト及びマウスＯＸ４０に特異的なＦｃａｂの選択及び選択したＦｃａｂとカニクイザルＯＸ４０との交差反応性の試験について使用されたＯＸ４０抗原は、自社生産で調製するか、又は以下で記載される商業的供給元から入手されたかのいずれかであった。

１．１．１ 組換え可溶性ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０抗原の調製
組換え可溶性二量体ＯＸ４０抗原を調製するために、ＯＸ４０の細胞外ドメインをマウスＦｃに融合させ、抗原の溶解性と安定性を改善した。具体的には、関連するＯＸ４０（ヒト、カニクイザル又はマウス）の細胞外ドメインを、EcoRI-HF及びBglII制限酵素を使用して、pFUSE-mIgG2aFc2 vector（Invivogen カタログ番号pfuse-mg2afc2）にクローニングし、Ｃ末端にマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインで抗原を産生した。次に、組換えＯＸ４０抗原は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（カナダ国立研究評議会（National Research Council Canada））での一過性発現によって産生され、mAb Select SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare、11003494）を使用し、続いて、得られた抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にするためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製された。

組換えＯＸ４０抗原のビオチン化バージョンを調製するために、EZ-Link（商標）Sulfo-NHS-SS-Biotin kit（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号21331）を製造元のプロトコルに従って使用して、抗原をビオチン化した。ビオチン化ＯＸ４０抗原は、以下に記載する選択実験に使用されたが、結合親和性の測定には使用されなかった。ビオチン化ＯＸ４０抗原の精製は、PD-10 desalting column（GE Healthcare、17-0851-01）、続いてAmicon 30k spin column（Millipore、UFC903024）を製造元の指示に従って使用して、２つのステップで実行された。組換え抗原の生物物理学的特性は、凝集体が存在しないことを確実にするためのＳＥ－ＨＰＬＣ分析及び分子サイズを実証するためのＰＡＧＥによって特徴付けられた。ＰＡＧＥによるサイズ決定は、それらの推定分子量が単量体の予測分子量の２倍であったため、可溶性抗原が二量体であることを示した。組換え抗原は、ビオチン化の程度が９０％を超えることを示したゲルシフト分析によっても分析された。ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ビオチン化組換えヒト（ｈＯＸ４０－ｍＦｃ）、マウス（ｍＯＸ４０－ｍＦｃ）及びカニクイザル（ｃＯＸ４０－ｍＦｃ）ＯＸ４０抗原がヒト及びカニクイザルＯＸ４０についてのＯＸ４０特異的抗体（抗体１１Ｄ４［欧州特許第２２４２７７１号］）；カニクイザルＯＸ４０に対するポリクローナルヒツジ抗ヒトＯＸ４０抗体［R&D Systemsカタログ番号AF3388］；ヒトＯＸ４０に対する抗体ＡＣＴ３５［Biolegendカタログ番号35002］及びマウスＯＸ４０に対する抗体ＯＸ８６［Biolegendカタログ番号119408］）によって結合できることを確認した。これらの抗原を以下の表２に列挙する。

１．１．２ ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０を発現する細胞株の調製
ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０（配列については、表１を参照されたい）をＳｐｅＩ－ＨＦ及びＮｏｔＩ－ＨＦ制限酵素を使用してベクターpLVX-EF1a-IRES-puro（Clontech、カタログ番号631253）にクローニングした。次に、ベクターをLenti-X HTXパッケージミックス（Clontech、カタログ番号631249）と供にLenti-X 293Ｔ細胞株（Clontech、カタログ番号632180）に形質転換し、レンチウイルスを生成した。次に、レンチウイルスを使用してＤＯ１１．１０細胞を形質導入した（National Jewish Health）。ＯＸ４０を過剰発現する細胞を、５μｇ／ｍｌのプロマイシン（Life Technologiesカタログ番号A11113803）と細胞で約２週間インキュベートした後、段階希釈により細胞株をクローニングすることにより選択した。細胞株によるＯＸ４０の発現は、蛍光標識されたＯＸ４０特異的抗体（ＯＸ８６；ＡＣＴ３５；及び実施例１．１．１及び表２に記載されているようにポリクローナルヒツジ抗ヒトＯＸ４０）を使用したフローサイトメトリーによって試験された。ヒト（DO11.10-hOX40）、マウス（DO11.10-mOX40）又はカニクイザル（DO11.10-cOX40）ＯＸ４０を発現する細胞株が選択され、フローサイトメトリー分析で、非形質導入細胞よりも少なくとも１０倍高い蛍光値を示した。これらの細胞株を以下の表２に列挙する。

１．１．３ 市販のＯＸ４０抗原
いくつかの市販のＯＸ４０抗原が試験された。

組換えＨｉｓタグ付きヒトＯＸ４０細胞外ドメインを、SinoBiologicals（カタログ番号10481-H08H-50）から入手した。しかし、この抗原のＳＥ－ＨＰＬＣ分析では、抗原の５０％未満が単量体の非凝集型であることが示された。したがって、この抗原はその後の分析で使用されなかった。

Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む組換えヒトＯＸ４０／ヒトＦｃ（ｈＯＸ４０－ｈＦｃ）及び組換えマウスＯＸ４０／ヒトＦｃ（ｍＯＸ４０－ｈＦｃ）は、R&D Systems（ｈＯＸ４０－ｈＦｃ：カタログ番号3388-OX-050；ｍＯＸ４０－ｈＦｃ：カタログ番号1256-OX-050）及び自社でのビオチン化から得られた。これらの可溶性抗原の生物物理学的特性は、凝集体が存在しないことを確実にするためのＳＥ－ＨＰＬＣ分析及び分子サイズを実証するためのＰＡＧＥによって特徴付けられた。ＰＡＧＥによるサイズ決定は、それらの推定分子量が単量体抗原に期待されたものの２倍であったため、可溶性抗原が二量体であることを示した。可溶性抗原は、ビオチン化の程度が９０％を超えることを示したゲルシフト分析によっても分析された。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用して、ビオチン化組換えヒト（ｈＯＸ４０－ｈＦｃ）及びマウス（ｍＯＸ４０－ｈＦｃ）ＯＸ４０抗原が実施例１．１．１及び以下の表２で記載されるようにＯＸ４０特異的抗体（11D4；ACT35；及びOX86に結合することができる事を確認した。

１．２ ＣＤ１３７抗原
ヒトＣＤ１３７についてのｍＡｂ特異性の選択及び選択したＦｃａｂとカニクイザルＯＸ４０との交差反応性の試験について使用されたＣＤ１３７抗原は、自社生産で調製するか、又は以下で記載される商業的供給元から入手されたかのいずれかであった。

１．２．１ 組換え可溶性ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７抗原の調製
いくつかの市販の組換え抗原は、例えば、試験時に許容できないレベルの凝集体が存在するため、使用に不適切であることが判明したため、以下の組換え二量体及び単量体抗原（表３）を、抗ＣＤ１３７ｍＡｂの選択、スクリーニング及びさらなる特性評価のために使用のために自社産生した。

単量体抗原は、EcoRI-HF及びBamHI-HF制限酵素を使用して、Ａｖｉ配列及び６つのＣ末端ヒスチジン残基と共にヒトＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを修飾pFUSE vector（Invivogen、カタログ番号pfuse-mg2afc2）にクローニングすることによって産生された。ベクターをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現したＣＤ１３７をHisTrap（商標）excelニッケルカラム（GE Healthcare、17-3712-06）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。

二量体抗原を産生するために、Ａｖｉ配列と共にｍＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインと融合したヒト又はカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ構築物を修飾pFUSE vectorにクローニングし、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞にトランスフェクトした。組換えＣＤ１３７は、MabSelect SuRe（商標）プロテインＡカラム（GE Healthcare、11003494）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。

二量体及び単量体ＣＤ１３７抗原のビオチン化バージョンは、BirA biotin-biotin protein ligase reaction kit（Avidity LLC、BirA500）を使用して調製し、単一ビオチン分子で標識された単量体ＣＤ１３７抗原及び２つの単量体の各々一つずつの２つのビオチン分子で標識された二量体ＣＤ１３７抗原を産生した。具体的には、３ｍｇのＣＤ１３７抗原を７．８μｌのBirA酵素混合物と、酵素対基質のモル比を１：５０で混合した。次に、製造業者の推奨に従って添加剤を添加し（１４２μｌのBiomix A、１４２μｌのBiomix B、１４２μｌのビオチン）、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化抗原の完全性を維持するために、Amicon 30 μｍフィルターを使用して、反応混合物を直ちにＤＰＢＳに緩衝液交換をした。

ＣＤ１３７抗原は、ＳＥＣによってさらに精製され、BirA酵素の除去を確実にし、高分子量の凝集体を含まない最終的な高品質の単分散タンパク質調製物が生成された。具体的には、同じ製造ロットの抗原を混合し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及び多角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって安定性及び純度を分析した。タンパク質の完全なビオチン化は、ストレプトアビジンシフトＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって確認された。組換えヒトＣＤ１３７抗原は、抗ヒトＣＤ１３７陽性対照抗体である２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるインビトロ及びフローサイトメトリーによるヒトＣＤ１３７リガンド発現ＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。組換えカニクイザルＣＤ１３７抗原は、フローサイトメトリーによりカニクイザルＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。選択プロトコルで使用されるＣＤ１３７抗原について可能な限り高い純度を確実にするために、抗原の徹底的なタンパク質特性評価は、存在するタンパク質凝集体の割合が２％を超えないことを確実にするために実行された。

１．２．２ ヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ１３７を発現する細胞株の調製
「DO11.10-hCD137」及び「DO11.10-cCD137」とそれぞれ命名された（表４を参照されたい）完全長型のヒト又はカニクイザルＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）は、選択された抗ＣＤ１３７ｍＡｂの選択及びさらなる特性評価中にその最も自然な確認において抗原を提示するために産生された。

細胞発現マウスＣＤ１３７に結合する抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の結合を決定するために、「DO11.10-mCD137」と命名された完全長型マウスＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞も生成された（実施例１１．２を参照されたい）。

レンチウイルス形質導入は、Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、631249）を使用して、ヒト、カニクイザル又はマウスＣＤ１３７受容体を過剰発現するＤＯ１１．１０細胞を生成するために使用された。ヒトＣＤ１３７（配列番号１２６）をコードするｃＤＮＡを含有するLenti-X expression vector（ｐＬＶＸ）（Clontech、631253）、カニクイザルＣＤ１３７（配列番号１２８）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１６４）は、Lenti-X HTX Packaging Mixと共にLenti-X 293T Cell Line（Clontech、632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、ＤＯ１１．１０細胞株にこれらのレンチウイルスベクターを形質導入した。

これらの細胞でのヒト、カニクイザル又はマウスＣＤ１３７の発現は、フローサイトメトリーを使用した抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（２０Ｈ４．９、ＭＯＲ７４８０．１（それぞれ米国特許出願公開２０１２／０２３７４９８ Ａ１号）及びＬｏｂ１２．３（University of Southampton）の細胞への結合によって確認された。

実施例２ － 抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂの選択及び特性評価
２．１ 抗ヒトＯＸ４０ Ｆｃａｂのナイーブ選択
ナイーブファージライブラリーからヒトＯＸ４０に特異的なＦｃａｂを選択するために、組換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０－ｍＦｃ；表２を参照されたい）及び細胞発現ヒトＯＸ４０（DO11.10-hOX40）の両方を抗原として使用した。一部の選択プロトコルでは、組換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０に加えて、ヒトＯＸ４０を発現する細胞を使用して、選択されたＦｃａｂが細胞表面のその自然な立体構造でＯＸ４０に結合が可能であることを確実にした。

ＣＨ３において部分的にランダム化されたＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基１４から残基１８）及びＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基９２から残基１０１）を含むＣＨ３ドメイン（ＩＭＧＴ番号１．４～１３０）を表示する６つのナイーブファージライブラリーが構築された。６つのライブラリーの１つは、ＣＨ３ドメインのＥＦループの１０１位に２つ又は４つのアミノ酸（２つ又は４つのＮＮＫコドンによってコードされる）のいずれかが挿入されたクローンを追加で含んでいた（挿入された残基はＩＭＧＴ番号付けスキームにより１０１．１から１０１．４の番号が付けられる）。

６つのライブラリーの全てを、組換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０－ｍＦｃ；表２を参照されたい）を使用して３つのラウンドの選択に供した。６つのライブラリーの全ては、第１の選択ラウンドでｈＯＸ４０－ｍＦｃを、続いて細胞発現ヒトＯＸ４０（DO11.10-hOX40をさらに２回の選択ラウンドで使用。表２を参照されたい）を使用して、さらなる選択キャンペーンに供した。

６つのライブラリーからの第３ラウンドの選択後に同定された２１３３のクローンを、ＥＬＩＳＡによってヒトＯＸ４０への結合についてスクリーニングした。これにより、３２の固有の陽性結合体が特定され、これらは、サブクローン化され、ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞中の可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジ［配列番号１０１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる）として発現された（ExpiFectamine 293 Transfection kit［Life Technologies、A14524］を使用してExpi293F細胞［Life technologies、A14527］にトランスフェクトされたｐＴＴ５ベクター［カナダ国立研究評議会］にクローニングされたＦｃａｂ）。

３２の固有のＦｃａｂを、細胞発現ヒトＯＸ４０（DO11.10-hOX40）に結合するそれらの能力について試験した。スクリーニングされた３２のＦｃａｂのうちの１５のＦｃａｂは、DO11.10-hOX40への細胞結合及びこれらの相互作用のＥＣ_５０は、０．１～６２ｎＭの範囲を示した。DO11.10-hOX40への結合を示した１５のＦｃａｂは、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化についての試験をする社内のヒトＮＦ－κＢレポーターアッセイを使用して試験された。１５のＦｃａｂのうちの６つは、ヒトＮＦ－κＢレポーターアッセイにおいて抗ヒトＦｃ抗体と架橋する場合に活性の増加を示し、これらのＦｃａｂがＯＸ４０シグナル伝達を活性化できることを示唆している。FS20-22及びFS20-31と命名されたＦｃａｂは、このアッセイで高レベルの活性を示し、それらの活性は、Ｆｃａｂが抗ヒトＣＨ２ｍＡｂ（クローンMK1A6（Jefferis et al, 1985及びefferis et al, 1992）、自社生産）と架橋する場合に増加した。これらは親和性成熟について選択された。

２．２ 抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂの親和性成熟
システインを除くアミノ酸の等モル分布を用いたELLA Biotech社製のランダム化プライマーを使用して、ＣＨ３ドメインのＡＢループ内の５つの残基（残基１４から残基１８）又はＣＤループ内の５つの残基（残基４５．１から残基７７）をランダム化するか、又はＥＦループの１部（ＣＨ３ドメインの残基９２から残基９４及び残基９７から残基１０１（ＩＭＧＴ番号付けスキームにより全ての残基番号の番号付け）をランダム化することにより、FS20-22及びFS20-31についての親和性成熟ライブラリーを作製した。

親和性成熟のアウトプットからの１４１０Ｆｃａｂを、ヒトＯＸ４０への結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、２０４の固有の陽性結合体を上記の実施例２．１に記載したようにＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞において可溶性Ｆｃａｂとして、特定し、サブクローニングし、発現した。

ｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合の可溶性Ｆｃａｂのオフレートを、抗ヒトＣＨ２ ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６を使用して抗ＣＨ２架橋の非存在下及び存在下でBiacore 3000（GE Healthcare）を使用して測定した（実施例２．１を参照されたい）。関連する親Ｆｃａｂと比較して、改善されたオフレートを有するＦｃａｂは、細胞発現ヒトＯＸ４０への結合及び社内のヒトＴ細胞活性化アッセイにおける活性についてさらなるスクリーニングを行った。全てのＦｃａｂは細胞発現ヒトＯＸ４０に結合した。ヒトＴ細胞活性化アッセイにおける高レベルの活性を示したFS20-22系統からの１０のＦｃａｂ及びFS20-31系統からの１８のＦｃａｂは、以下に記載するようにループシャッフリング用に選択された。

FS20-22系統の場合、３つのＣＤループ、６つのＥＦループ及び親ＡＢループ又は親和性成熟ＡＢループのいずれかをシャッフルすることにより、２つのループシャッフルライブラリーが生成された。FS20-31系統の場合、４つのＡＢループ、７つのＣＤループ及び７つのＥＦループを含有する１つのループシャッフルライブラリーが生成された。

シャッフルされた配列は、上記の実施例２．１に記載されているようにＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞で可溶性Ｆｃａｂとして発現され、OctetQK^e System（Pall ForteBio）上のDip and Read（商標）ストレプトアビジンバイオセンサー（Pall ForteBio、18-5050）を使用して、ビオチン化ｈＯＸ４０－ｍＦｃ抗原への結合についてスクリーニングされた。親Ｆｃａｂと比較して、ｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合にオフレートが改善されたＦｃａｂの配列が決定され、FS20-22系統から３５の固有のＦｃａｂ及びFS20-31系統から６２の固有のＦｃａｂが得られた。同定された固有のＦｃａｂは、Biacore 3000機器（GE Healthcare）を使用して、ＣＨ２架橋の存在下及び非存在下で抗ヒトＣＨ２ ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６を使用して、ｈＯＸ４０－ｍＦｃ抗原への結合について試験された。

FS20-22系統では、１８のＦｃａｂは、モック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式での発現及びｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合のＣＨ２架橋を伴う最も遅いオフレート、ｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合の非架橋及びＣＨ２架橋オフレート間の最大の差及び上記のように、ｈＯＸ４０－ｍＦｃへの結合の強さに基づいてさらなる特性評価のために選択した。FS20-31系統では、ｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合のＣＨ２架橋を伴うオフレートが最も遅い９つのＦｃａｂ及びｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合した場合のＣＨ２架橋を伴わないオフレートが最も遅い９つのＦｃａｂを発現及びモック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２の形式のさらなる特性評価のために選択した。Ｆｃａｂの数が９つのＦｃａｂのこれらの群の両方に共通していたため、ＣＨ２架橋の非存在下において、ｈＯＸ４０－ｍＦｃに結合する場合の遅いオフレートを示す追加のＦｃａｂをFS20-31系統から選択し、モックｍＡｂ^２形式において、発現とさらなる特性評価のためにこの系統からのＦｃａｂの総数を１８とした。Ｔ細胞活性化アッセイのデータを使用して、FS20-22系統からのさらなる６つのＦｃａｂ及びFS20-31系統からの８つのＦｃａｂは同定され、このアッセイにおいて高い活性を示し、そのためモック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式でも発現しさらなる特性評価が行われた（実施例４を参照されたい）。

実施例３ － 抗マウスＯＸ４０Ｆｃａｂの選択及び特性評価
３．１ 抗マウスＯＸ４０Ｆｃａｂのナイーブ選択
ＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基１１～残基１８）及びＣＨ３ドメインのＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基９２～残基１０１）のランダム化及びＡＢループの残基１６及び残基１７（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる）間に５残基のランダム化された挿入を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを表示するナイーブ酵母ライブラリーが、選択に使用された。酵母をヒトＩｇＧＦｃドメインと融合したビオチン化組換えマウスＯＸ４０（ｍＯＸ４０－ｈＦｃ；表２）と共にインキュベートし、ストレプトアビジンコーティングビーズを使用してＭＡＣＳにより分取した。次に、５倍モル過剰のｈＦｃの存在下でビオチン化ｍＯＸ４０－ｈＦｃの濃度を下げて、３ラウンドのＦＡＣＳ選択を行った。細胞をストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（BD Bioscience、349024）又は抗ビオチン－ＡＰＣ（Miltenyi Biotec、130-090-856）で染色し、FACSAria（BD Bioscience）セルソーターを使用して分取した。濃縮された集団からの１８２の個々のＦｃａｂを抗原結合についてスクリーニングし、２つの固有の陽性結合剤をサブクローニングし、実施例２．１で前述したように可溶性Ｆｃａｂとして発現させた。Ｆｃａｂは、ＥＬＩＳＡによるｍＯＸ４０－ｈＦｃへの結合及び自社マウスＮＦ－κＢレポーターアッセイにおける活性について特性評価された。ＮＦ－κＢレポーターアッセイでは、１つのＦｃａｂ、FS20m-232のみが活性であり、マウスＯＸ４０を発現する細胞への結合を示したため、このＦｃａｂが親和性成熟のために選択された。

３．２ ｍＯＸ４０ Ｆｃａｂの親和性成熟
システインを除くアミノ酸の等モル分布を用いたELLA Biotech社製のランダム化プライマーを使用して、FS20m-232 ＦｃａｂのＡＢループ内の７残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基１５～残基１６．５）（ライブラリー１）、ＣＤループ内の６残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基４５．１～残基７８）（ライブラリー２）又はＥＦループ内の５残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームによる残基９２～残基９４及び残基９７～残基９８）（ライブラリー３）をランダム化することにより、３つのファージディスプレイ親和性成熟ライブラリーを構築した。

ストレプトアビジンコーティング（ThermoFisher Scientific、11205D）及びニュートラアビジンコーティング（ThermoFisher Scientific、14203及びA2666）されたダイナビーズを交互に捕捉した組換えビオチン化ｍＯＸ４０－ｍＦｃを使用して、親和性成熟ライブラリーについて３回の選択ラウンドを行った。抗原濃度を５０ｎＭ（第１のラウンド）から、１０ｎＭ（第２のラウンド）、１ｎＭ（第３のラウンド）に減少させて、高親和性結合体の同定のために使用した。第３の選択ラウンドからの１６５５の個々のファージを、ファージＥＬＩＳＡにより、ｍＯＸ４０－ｍＦｃへの結合についてスクリーニングし、実施例２．１に記載したように、ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞において、可溶性Ｆｃａｂとして９８の固有の陽性結合体を同定し、サブクローニングし、発現させた。Ｆｃａｂを、マウスＮＦ－κＢリポーターアッセイで細胞結合及び活性について、さらなるスクリーニングした。最も活発なＦｃａｂはループシャッフルに選択された。

３７のＥＦループ（ファージＥＬＩＳＡ及びＷＴ配列においてマウスＯＸ４０に最もよく結合するもの）でシャッフルされた２７のＣＤループ（親和性成熟及びＷＴ配列から同定された２６個の固有の配列の全て）を含有するループシャッフルライブラリーが生成され、全てのシャッフルクローンにFS20m-232ＦｃａｂのＡＢループが含有されていた。７５０のシャッフルされた配列は、上記のようにＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞において可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジ含有）として発現された。OctetQK^e System（Pall ForteBio）上のDip and Read（商標）ストレプトアビジンバイオセンサー（Pall ForteBio、18-5050）を使用して、ビオチン化ｍＯＸ４０－ｍＦｃ（表２）へのＦｃａｂの結合を測定することにより、オフレートを改善するために、Ｆｃａｂを含有するＨＥＫ上清をスクリーニングした。１１の固有のＡＢループランダム化Ｆｃａｂ及び６０の固有ＥＦループランダム化Ｆｃａｂを、上記のようにＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３細胞において可溶性Ｆｃａｂとしてサブクローニング及び発現した。これらのＦｃａｂは、マウスＴ細胞活性化アッセイにおいて、細胞結合及び活性についてオフレートが最も遅い４３のシャッフルされたＦｃａｂと一緒にさらにスクリーニングされた。FS20m-232-91Ｆｃａｂは、ビオチン化ｍＯＸ４０－ｍＦｃに結合する場合にオフレートが最も遅く、抗ヒトＣＨ２ ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６によって架橋された場合、マウスＴ細胞活性化アッセイで最も高い活性を示したため、その後の実験で使用するため、マウス（サロゲート）Ｆｃａｂとして選択された。

実施例４ － ｍＡｂ^２形式における抗ＯＸ４０Ｆｃａｂ構築、発現及び特性評価
４．１ モックｍＡｂ^２の構築及び発現
抗ヒトＯＸ４０及び上記で同定した抗マウスＯＸ４０ Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ^２は、ｍＡｂ^２形式においてこれらＦｃａｂの特性評価を可能にするために調製した。これらのモックｍＡｂ^２は、ヒトＩｇＧ１骨格中の抗ＯＸ４０Ｆｃａｂ及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０（Bedzyk et al., 1989及びBedzyk et al., 1990）の可変領域（詳細については、配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６を参照されたい）又はヒトＩｇＧ１骨格中の抗鶏卵卵白リゾチーム（ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３（Braden et al., 1996）の可変領域（詳細については、配列番号１１７及び配列番号１１８を参照されたい）から、ヒトＩｇＧ１の未修飾ＣＨ３ドメインの配列中に存在するＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位内の抗ＯＸ４０ＦｃａｂのＣＨ３ドメインで、抗ＦＩＴＣ抗体及び抗ＨＥＬ抗体のＣＨ３ドメインを置換することにより調製されたものであった。モックｍＡｂ^２は、抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ４４２０（配列番号１１６）又は抗ＨＥＬ ｍＡｂＤ１．３（配列番号１１８）の軽鎖をそれぞれ含み、またＦｃ－ガンマ受容体の相互作用及び潜在的なＦｃ－ガンマ受容体誘導性架橋を減少させるために、重鎖のＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異を含んでいた。モックｍＡｂ^２及びｍＡｂ^２におけるＬＡＬＡ変異の存在は、これらの実施例で言及し、それらのクローン名のＦｃａｂ部分の末尾に接尾辞「ＡＡ」で表される。

モックｍＡｂ^２をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。

４．２ 細胞発現ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対するモックｍＡｂ^２形式における抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂの結合親和性
細胞発現ヒト又はカニクイザルＯＸ４０（ヒト［DO11.10-hOX40］又はカニクイザルＯＸ４０［DO11.10-cOX40］のいずれかを発現するＤＯ１１．１０細胞；表２を参照されたい）に対する結合について、モック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式における抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂの親和性を、フローサイトメトリーを使用して測定した。非特異的結合は、フローサイトメトリーによってＯＸ４０を発現しないＨＥＫ細胞に対する結合を試験することによっても評価された。

モック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２及び対照ｍＡｂ希釈液（２×最終濃度）を１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）で３回調製した。DO11.10-hOX40若しくはDO11.10-cOX40又はＨＥＫ細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に５０μｌ／ウェルで４×１０^６細胞／ｍｌで播種した。５０μｌのモック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２又は対照ｍＡｂ（抗ヒトＯＸ４０ ｍＡｂ、１１Ｄ４）希釈液を、細胞含有ウェル（最終容量１００μｌ）に加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ－４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を添加し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Biotium、カタログ番号40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。CantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用してプレートを読み取った。死細胞を除外し、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍ／５３０／３０）の蛍光を測定した。GraphPadプリズムソフトウェアの対数（アゴニスト）対応答を使用してデータを適合させた。

ヒトＩｇＧ１骨格中で、重鎖のＣＨ２ドメイン（G1AA/11D4；配列番号１７３及び１７５）にＬＡＬＡ変異を含有するＦｃａｂ（全てモック［４４２０ ＬＡＬＡ］ｍＡｂ^２形式でテスト済み）及び陽性対照抗ヒトＯＸ４０ ｍＡｂ、１１Ｄ４は、ある範囲の親和性でヒトＯＸ４０に結合した。FS20-22系統からの５つのクローン及びFS20-31系統からの６つのクローンを、細胞発現したヒト及びカニクイザルＯＸ４０に結合する能力について試験し、これらのクローンの結合親和性を表５に示す。

４．３ モックｍＡｂ^２形式における抗ＯＸ４０ ＦｃａｂによるインビトロでのＯＸ４０の活性化
活性化されたＴ細胞は、細胞表面にＯＸ４０を発現する。三量体ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０への結合は、受容体の三量体化をもたらす。ＯＸ４０リガンドは、抗原提示細胞の細胞表面にクラスターとして発現するため、ＯＸ４０リガンド及びＯＸ４０間の相互作用がＯＸ４０のクラスター化をもたらし、ＯＸ４０シグナル伝達及びさらなるＴ細胞の活性化に不可欠であることが知られている。ＯＸ４０をアゴナイズする抗体は、ＯＸ４０リガンドのこのクラスター化活性を模倣する必要がある。単一特異性抗ＯＸ４０抗体の場合、Ｆｃガンマ受容体は抗体のＦｃドメインに結合し、それらを架橋して、ＯＸ４０クラスター化をもたらす。

上記のＬＡＬＡ変異含有モック（４４２０）ｍＡｂ^２形式における抗ヒトＯＸ４０及び抗マウスＯＸ４０Ｆｃａｂを、架橋剤の存在下において、Ｆｃａｂの架橋時にＴ細胞上に発現するＯＸ４０を活性化するそれらの能力について、Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。モック（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式における抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂの試験についてのヒトＴ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴ細胞の分離を含み、Ｔ細胞活性化のマーカーであるＩＬ－２の放出について試験した。アッセイは、実施例１３で後述する方法と類似の方法で実施し、陽性対照（１１Ｄ４）又はモック（４４２０ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式でのＦｃａｂをそれぞれ架橋するために、抗ヒトＣＨ２ ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma）の使用に関与した。

Ｆａｂ標的（ＦＩＴＣ－デキストラン）による架橋における場合の抗ヒトＯＸ４０ Ｆｃａｂ（４４２０ ＬＡＬＡ）ｍＡｂ^２形式は、Ｔ細胞活性化アッセイにおける活性のある一定範囲を示した。全てのＦｃａｂは、抗ＣＤ３抗体の存在下でＴ細胞を共刺激し、ヒトＩＬ２の産生を誘導する能力を有していた。FS20-22系統及びFS20-31系統からのＦｃａｂは、架橋を有する又は有しない両方で活性を示した。具体的には、これらの系統からのＦｃａｂは、架橋時に顕著に増加した架橋剤の非存在下で活性を示した。これらのＦｃａｂはカニクイザルＯＸ４０に対して高い交差反応性を保持しているため（ヒトＯＸ４０の結合と比較して）、この種で毒物学研究が可能であろう。FS20-22系統のクローンのうち、クローンFS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49及びFS20-22-85は、架橋された場合のアゴニスト活性についてのＥＣ_５０値が最も低く、したがって、この系統からの好ましいクローンである。これらのうち、クローンFS20-22-49は、架橋時にアゴニスト活性の最大の増加を示し、架橋の存在下でのアゴニスト活性の最低のＥＣ_５０でもあったため、好ましいクローンである。

上記のように、本発明者らは、追加の架橋剤の非存在下でＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方にアゴナイジングすることが可能なｍＡｂ^２を生成することを目的とした。上記の実験は、FS20-22-49Ｆｃａｂが対かの架橋剤の存在下でＯＸ４０を活性化できることを実証する。追加の架橋剤を必要としない二重アゴニストを生成するために、本発明者らは、最終的なＯＸ４０－及びＣＤ１３７を標的とするｍＡｂ^２分子におけるこれらの抗体からのＣＤＲの使用することを意図して、抗ＣＤ１３７抗体を生成するために選出した。

実施例５ － 抗ヒトＣＤ１３７抗体の選択及び特性評価
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（MSM Technologies）でランダム化されたヒト生殖細胞系列のＦａｂドメインを表示する合成ナイーブファージミドライブラリーを、実施例１．２に記載の組換え及び細胞表面発現ＣＤ１３７抗原を用いた抗ヒトＣＤ１３７ ｍＡｂのナイーブ選択に使用した。

ストレプトアビジンダイナビーズ（Thermo Fisher Scientific、11205D）及びダイナビーズに結合したニュートラアビジン結合タンパク質（Thermo Fisher Scientific、31000）を使用して、Ｆａｂライブラリーを３ラウンドで選択し、ビオチン化ヒトＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ又はヒトＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓに結合したファージを単離した。細胞表面に発現したＣＤ１３７へのＦａｂの結合を確実にするために、組換えＣＤ１３７抗原を使用した選択からの第１のラウンドのアウトプットも、DO11.10-hCD137細胞を使用した２つのさらなる選択のラウンド及びDO11.10-cCD137細胞を使用した第４のラウンドの選択を受けた。

ファージＥＬＩＳＡにより、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉへの結合について、ラウンド３及びラウンド４のアウトプットからの約２２００クローンをスクリーニングした。ビオチン化ｍＦｃを陰性対照として含有した。陽性クローン（ＣＤ１３７結合シグナルがｍＦｃへの結合シグナルより少なくとも４倍高いクローン）の可変領域の配列が決定され、３６の固有のＶＨ／ＶＬ配列の組み合わせを同定した。同定された配列は、組換えＣＤ１３７抗原及び細胞表面発現ＣＤ１３７抗原を使用した両方の選択に由来し、両方の選択戦略を使用して分離された複数のクローンを有していた。ファージＥＬＩＳＡに基づき、３６のクローンのうちの２２のクローンは、カニクイザル交差反応性であったが、ファージＥＬＩＳＡの感度は、弱いカニクイザル交差反応性結合体を検出するのに十分ではなかった可能性があるため、３６クローン全てをＩｇＧ１分子に再形式設定に前進させた。各クローンについて、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン各々にＬＡＬＡ変異又はＣＬドメインを有する）のいずれかを含有するｐＴＴ５発現ベクター（カナダ国立研究評議会）に個別にクローン化した。ＬＡＬＡ変異（ＡＡ）を有する得られたｐＴＴ５－FS30 ＶＨ及びｐＴＴ５－FS30 ＶＬベクターを、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。２８のクローンは可溶性ＩｇＧ１分子として発現した。これらはmAb Select SuReプロテインＡカラムで精製し、さらなる試験を供した。

抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの結合は、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉを使用したＥＬＩＳＡで分析された。試験した２８のクローンのうち、１０はヒトＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉへの用量依存的結合を示し、ヒトＯＸ４０－ｍＦｃ－Ａｖｉ、ｍＦｃ又はストレプトアビジンへの結合は示さなかった。この群内で、４つのクローン、FS30-5、FS30-10、FS30-15及びFS30-16は、カニクイザルＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉと交差反応した。得られたカニクイザル交差反応性クローンの数が少ないため、追加のクローンをスクリーニングし、上記のように発現させた。これにより、１つの追加のカニクイザル交差反応性結合体FS30-35の分離をもたらした。

抗ヒトＣＤ１３７ ｍＡｂ FS30-5、FS30-10、FS30-15及びFS30-16は、フローサイトメトリーを使用して、ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７（DO11.10-hCD137又はDO11.10-cCD137）を発現する細胞への結合について試験した。非特異的結合は、ＣＤ１３７発現を欠くＤＯ１１．１０細胞及びＨＥＫ２９３細胞への結合を試験することによっても評価された。結合親和性を、２つの陽性対照ｍＡｂ、ＭＯＲ７４８０．１（米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８号）及び２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）の結合親和性と比較し、これらの可変ドメインはクローン化され、ＣＨ２ドメイン（G1AA形式）においてＬＡＬＡ変異を含むヒトＩｇＧ１形式で発現された。

FS30-5、FS30-10、FS30-15及びFS30-16クローンは、細胞表面に発現されたヒト及びカニクイザルＣＤ１３７受容体に結合することが見出され、ＥＣ_５０値は、陽性対照ｍＡｂに匹敵する０．１５～０．５７ｎＭの範囲であった。親ＤＯ１１．１０又はＨＥＫ２９３細胞への結合は観察されず、結合の特異性を示した。これらの細胞では、２０Ｈ４．９陽性対照抗ＣＤ１３７抗体のカニクイザルＣＤ１３７への結合は観察されなかった。公開されたデータ（米国特許第７２８８６３８号）は、ＩｇＧ１形式の２０Ｈ４．９がＰＭＡ（ホルボールミリステート酢酸塩）誘導されたカニクイザルＰＭＢＣ上のカニクイザルＣＤ１３７に結合することを示す。本発明者の管理下において、G1AA形式の２０Ｈ４．９は組換えカニクイザルＣＤ１３７に結合したが、親和性はヒトＣＤ１３７よりもはるかに低く（データは示さず）、これは、DO11.10-cCD137細胞に対する抗体で観察された結合の欠如を説明し得る。

FS30 ｍＡｂの生物物理学的特性を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施し、単量体画分の割合を分析した。試験した４つのFS30 ｍＡｂは全て、単一ピークプロファイルを示し、９７％を超える単量体であった。この高レベルの単量体タンパク質により、機能活性試験の開始を可能にした。

次に、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの機能的活性を、一次Ｔ細胞活性化アッセイで分析した。インビボでは、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂはＦｃｙ受容体の動員によってアゴニスト作用を誘導し、そのためにｍＡｂ及びＣＤ１３７受容体のクラスター化をもたらした。表面ＣＤ１３７受容体分子をクラスター化するｍＡｂの最大能力を模倣するために、FS30 ｍＡｂを、アッセイ前に抗ヒトＣＨ２抗体（クローンＭＫ１Ａ６、自社生産）を使用して架橋した。Ｔ細胞活性化を非架橋ｍＡｂと比較した。ＬＡＬＡ変異（G1AA/HelD1.3）を有するヒトＩｇＧ１骨格における抗鶏卵卵白リゾチーム（ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３を陰性対照として含有していた。

架橋する場合、FS30-5、FS30-10、FS30-15及びFS30-16 ｍＡｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて強力な活性を示し、ＥＣ_５０値は１０ｎＭ未満であり、ＩＬ－２（_Ｅｍａｘ）最大レベルは、陽性対照の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ（抗ＣＤ１３７ ＭＯＲ７４８０．１ ｍＡｂ、５６３７ ｈＩＬ－２ｐｇ／ｍｌ；及び抗ＣＤ１３７ ２０Ｈ４．９ ｍＡｂ、１０２３２ ｈＩＬ－２ｐｇ／ｍｌ）と類似であった。FS30-6 ｍＡｂ（１５１２ ｈＩＬ－２ ｐｇ／ｍｌ）のＥ_ｍａｘは、陽性対照及び他のFS30 ｍＡｂのそれよりも顕著に低く、Ｔ細胞活性化の全体的なレベルが低いことを示していた。架橋の非存在下で活性を示した陽性対照抗ＣＤ１３７ ２０Ｈ４．９ ｍＡｂ（３１７４ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ－２産生）と異なり、FS30 ｍＡｂは活性を示さなかった（測定されたＩＬ－２測定のバックグラウンド応答レベルによって示されたように架橋されていない場合）。

実施例６ － ヒトＯＸ４０及びヒトＣＤ１３７を標的とするｍＡｂ^２の構築物及び発現
抗ヒトＣＤ１３７ Ｆａｂとペアにした抗ヒトＯＸ４０Ｆｃａｂを含むｍＡｂ^２を調製した。ヒトＯＸ４０を標的とするＦｃａｂ FS20-22-49は、Ｔ細胞アッセイでのその活性が高いため、ＣＤ１３７を標的とするＦａｂとのペアリングに選択された（実施例４．３を参照されたい）。

６．１ ｍＡｂ^２形式におけるｍＡｂの発現及び特性評価
FS30-5、FS30-10、FS30-15、FS30-16又はFS30-35クローンのいずれかのＣＤＲを含み、ＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異及びＣＨ３ドメインにおけるFS20-22-49ヒトＯＸ４０受容体結合部位を含むＩｇＧ１分子からなるｍＡｂ^２分子を調製した。これらｍＡｂ^２分子が、抗ヒトＯＸ４０ ｍＡｂ^２、FS20-22-49AA/HelD1.3のＶＨドメインをFS30クローンの対応するＶＨドメインで置換し、生成されたＶＨをFS30 ｍＡｂの対応する軽鎖に同時トランスフェクトすることによって生成された。ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異を、得られたｍＡｂ^２分子中に保持した。これらのｍＡｂ^２の分子を、FS20-22-49AA/FS30-5、FS20-22-49AA/FS30-10、FS20-22-49AA/FS30-15、FS20-22-49AA/FS30-16及びFS20-22-49AA/FS30-35と命名した。ｍＡｂ^２をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。

ＣＤ１３７は、サイトカイン受容体の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する（Moran et al., 2013）。５つのｍＡｂ^２分子の抗ＣＤ１３７のＦａｂ結合部位の特異性を分析するために、ヒトＣＤ１３７及び５つの密接に関連したヒトのＴＮＦＲＳＦメンバー（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＧＩＴＲ、ＮＧＦＲ及びＣＤ４０）のｍＡｂ^２に対する結合を、ＳＰＲを用いて試験した。この目的は、１μＭの濃度で密接に関連した抗原へのｍＡｂ^２の結合を示さないが、１ｎＭの濃度でＣＤ１３７受容体への結合を示すことにより、１０００倍の特異性を示すことであった。

FS20-22-49AA/FS30-5、FS20-22-49AA/FS30-10、FS20-22-49AA/FS30-16及びFS20-22-49AA/FS30-35 ｍＡｂ^２は、高レベルの特異性（１０００倍近く）を示したのに対し、FS20-22-49AA/FS30-15 ｍＡｂ^２は、試験された５つの密接に関連したＴＮＦＲＳＦメンバー全てに非特異的な結合を示した。このクローンによって示された非特異的結合は、同じ濃度でＣＤ１３７受容体に結合するよりも平均約５～１０倍低く、ＣＤ１３７に密接に関連した同じ５つのＴＮＦＲＳＦメンバーへの結合について試験した場合、FS30-15 ｍＡｂが同じ結合プロファイルを示したため、ｍＡｂ^２分子のＦａｂ結合部位に起因すると結論付けられた。このデータに基づいて、FS30-15クローンは、以降の選択キャンペーンから除外された。

６．２ 抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの配列最適化
FS30-5、FS30-10、FS30-16及びFS30-35抗ＣＤ１３７ ｍＡｂは、ＣＤ１３７に対して高い親和性及び特異性を示し、Ｔ細胞活性化アッセイで活性を示す一方、それらは、ＣＤＲループ内に１つ以上の潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を含んだ。結合及び活性を維持又は向上させながら、これらの部位で置換され得るアミノ酸残基を同定する試みにおいて、これらのクローンをさらに操作することが決定された。同定された潜在的なＰＴＭ部位は、ＶＨ ＣＤＲ３のメチオニン残基（FS30-5におけるKabat位Ｍ１００Ｄ及び Ｍ１００Ｈ、FS30-10におけるＭ９７、FS30-16におけるＭ１００Ａ及びFS30-35におけるＭ１００Ｆ）、ＶＨ ＣＤＲ２の潜在的なアスパラギン酸異性化モチーフ（FS30-16におけるKabat位Ｄ５４Ｇ５５）及びＶＬ ＣＤＲ３の潜在的な脱アミド部位（FS30-16におけるKabat位Ｑ９０Ｇ９１）を含有していた。

部位特異的変異導入は、５つのFS20-22-49AA/FS30 ｍＡｂ^２クローンをテンプレートとして使用し、メチオニン、アスパラギン酸又はグリシン残基をコードする部位に縮重コドンＮＮＫを含有するプライマーを使用して、全ての可能なアミノ酸置換を可能にした。新規の潜在的なＰＴＭモチーフを生成することが可能なシステイン残基及びアミノ酸は、除外された。クローンを発現させ、DO11.10-hCD137細胞への結合についてスクリーニングした。親ｍＡｂ^２クローンと比較して類似（２倍以内）又は向上した１０ｎＭでの結合を有するクローンは、３０～５０ｍｌスケールで発現のために選択され、DO11.10-hCD137細胞及び架橋剤として抗ヒトＣＨ２抗体ＭＫ１Ａ６を使用して、プロテインＡカラムで精製し、Ｔ細胞活性化アッセイでスクリーニングした。

DO11.10-hCD137細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０％ ＦＢＳ（Life Technologies）及び５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Life Technologies、A11113803）含有ＤＯ１１．１０細胞培地（RPMI medium（Life Technologies））に１．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳで希釈した０．１μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ３抗体で３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートすることにより、抗マウスＣＤ３抗体（Thermo Fisher Scientific、clone 17A2）でコーティングし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。DO11.10-hCD137細胞は、１×１０^５細胞／ウェルでプレートに添加した。各試験抗体の２μＭ希釈液をＤＰＢＳ（Gibco）で調製し、さらにＤＯ１１．１０細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）で１：１０に希釈して、２００ｎＭ希釈液を得た。ＭＫ１Ａ６架橋剤を、架橋させるため試験抗体サンプルと１：１のモル比でウェルに添加した。９６ウェルプレートで、各抗体又は抗体／架橋剤混合物の段階希釈液を調製した。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋剤混合物をプレート上のDO11.10-hCD137細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。上清を回収し、製造元の指示に従って、マウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D Systems）でアッセイした。Gen5ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。

各クローンについて、細胞表面ＣＤ１３７への結合を保持又は向上した限られた数のアミノ酸が、重鎖ＣＤＲ３のメチオニン残基の置換について同定された。FS20-22-49AA/FS30-16 ｍＡｂ^２クローンは３つの潜在的なＰＴＭ部位が含有しており、各変異により結合親和性がわずかに低下した。これらを１つの分子に結合させる場合、減少した結合は相加的であり（データは示さず）、その結果、このクローンはそれ以上追及されなかった。関連する親クローンと比較して、ＣＤ１３７への結合と機能的活性を改善する変異はほとんど見られなかった。３つの変異ｍＡｂ^２クローンは全て、結合親和性及び機能的活性を改善したことが判明したFS20-22-49AA/FS30-10 ｍＡｂ^２クローン由来であった。これらのｍＡｂ^２は、１つのアスパラギン、１つのトレオニン又は親FS20-22-49AA/FS30-10 ｍＡｂ^２の９７位のメチオニン残基の代わりに１つのロイシン残基のいずれかを含有し、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16とそれぞれ指定された。FS20-22-49AA/FS30-35親ｍＡｂ^２クローン由来の変異体クローンのＥＣ_５０値は、親クローンと比較して、機能的活性における改善を示さなかったが、親クローンの１００Ｆ位のメチオニン残基に置換されたアラニン残基を含有するFS20-22-49AA/FS30-35-14と指定された１つの変異体クローンは、結合の改善を示した。FS20-22-49AA/FS30-5親ｍＡｂ^２クローンの場合、１００Ｄ位のメチオニン残基及び１００Ｈ位のメチオニン残基の両方を、同一分子内のイソロイシン残基及びロイシン残基にそれぞれ変更して、FS20-22-49AA/FS30-5-37と指定された変異型ｍＡｂ^２クローンを得た。FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及びFS20-22-49AA/FS30-5-37クローンは、さらなる特性評価のために選択された。

６．３ ヒトＣＤ１３７リガンド遮断アッセイ
ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌの相互作用は、ＣＤ１３７受容体の活性化に必要である。アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体は、リガンド相互作用を模倣することによってＣＤ１３７の活性化を促進し得、それによってリガンド結合を潜在的に遮断するか、又はリガンド結合を妨害することなく受容体のクラスター化と活性化を促進する。抗体がＣＤ１３７Ｌを模倣する可能性がある場合、受容体及びリガンドの相互作用を遮断し得る。ＭＯＲ７４８０．１がリガンド／受容体相互作用を遮断することは、当技術分野で知られているが（ＵＳ ２０１２／０２３７４９８）、２０Ｈ４．９抗体は、ＣＤ１３７及びそのリガンド間の相互作用を遮断しないことが以前に報告されている（米国特許第７２８８６３８号）。

抗ヒトＣＤ１３７ｍＡｂ^２クローン、FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14は、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用してＣＤ１３７～ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断する能力について試験された。ＩｇＧ１形式における抗ＯＸ４０ｍＡｂ １１Ｄ４（欧州特許第２２４２７７１号）（G1/11D4；配列番号１７４及び１７５）は、アイソタイプ／陰性対照として使用され、抗ＯＸ４０ ＦｃａｂクローンFS20-22-49AA及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０のＦａｂ領域を含むｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/4420をＯＸ４０結合について陰性対照ｍＡｂ^２として；抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1/MOR7480.1（配列番号１１９及び１２０）及びG1/20H4.9（配列番号１２１及び１２２）をＣＤ１３７結合及びリガンドブロッキング活性の陽性対照として使用した。

具体的には、組換えヒトＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ抗原を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、Maxisorp９６ウェルプレート上で、４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Tween20（商標））で洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Sigma、A3059-500G）で、室温で１時間撹拌しながらブロックした。ブロッキング後、プレートを再びＰＢＳＴで洗浄した。各試験抗体の１００ｎＭ希釈液を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで調製し、ＣＤ１３７でコーティングしたプレートに加え、室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。このインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次にＰＢＳ中の２０ｎｇ／ｍｌ CD137L-His（R&D Systems、2295-4L-025/CF）と室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に抗ｈｉｓ二次抗体（R&D Systems、MAB050H）を用いて、ＰＢＳ中の１：１０００希釈液で、室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、陽性対照ウェルが青色に変色するまでＴＭＢ検出試薬（Thermo Fisher Scientific、002023）とインキュベートし、その後、反応は、２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加で停止した。Gen5ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。差し引かれた吸光度値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（阻害剤）対応答式を使用して適合させた。値は、G1/11D4及び G1/MOR7480.1対照ｍＡｂを０及び１００％ブロッキング値としてそれぞれ設定することにより正規化された。データを、一元配置分散分析及びGraphPadPrismを使用したHolm-Sidakの多重比較検定を使用して分析した。

試験した５つの抗ヒトＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンについて、ある一定範囲のブロッキング活性が観察された。FS20-22-49AA/FS30-5-37は、陽性対照抗体と同様に、受容体－リガンド相互作用の完全な阻害を示した。FS30-10系統（すなわちFS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16）の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂのＦａｂ領域を含有する全てのｍＡｂ^２のクローンは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３７Ｌ間の相互作用を４９～５４％阻害し、したがって、部分的な遮断剤と見なされた。ＣＤ１３７及びＣＤ１３７Ｌ間の相互作用を部分的に遮断するのみにより、これらの抗体の１つが結合する場合でも、このメカニズムを介して一部のＣＤ１３７シグナル伝達が依然として発生し得るように、これらのｍＡｂが、ＣＤ１３７Ｌとその受容体との自然な相互作用を完全に阻害し得ない可能性がある。FS20-22-49AA/FS30-35-14クローンは、陰性対照FS20-22-49AA/4420 ｍＡｂ^２分子と同様に、受容体－リガンド相互作用を顕著に阻害する能力を欠いていたため、非遮断剤と見なされた。

要約すると、このＥＬＩＳＡベースのアッセイの結果は、試験された抗ＣＤ１３７ ｍＡｂのパネルが、完全、部分的及びブロッキング活性なしを含有する、ある一定範囲のリガンドブロッキング能力を示したことを示した。クローンFS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14の各々は、陽性対照抗ＣＤ１３７ ｍＡｂのそれと異なるブロッキング活性を示した。リガンドブロッキング活性の範囲が特定されたため、各抗体の機能的活性を試験した。

クローンFS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16は、細胞ベースの方法を使用して、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断するそれらの能力についてさらに試験した。ある一定範囲のブロッキング活性が観察され、FS20-22-49AA/FS30-5-37は、このアッセイで使用された陽性対照抗体（G1/MOR7480.1）と同様に、受容体－リガンド相互作用の完全な阻害を示した。FS30-10系統（すなわちFS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16）の抗ＣＤ１３７ ｍＡｂのＦａｂ領域を含有する３つの全てのｍＡｂ^２のクローンは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３７Ｌ間の相互作用を４６～７６％阻害し、したがって、部分的な遮断剤と見なされた。したがって、このアッセイの結果は、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイの結果と類似しており、試験した抗ＣＤ１３７ ｍＡｂのパネルが、完全なブロッキング活性から部分的なブロッキング活性までのある一定範囲のリガンドブロッキング能力を示したことを示した。クローンFS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16の各々は、陽性対照抗体のそれと異なるブロッキング活性を示した。

実施例７ － ヒトＣＤ１３７Ｔ細胞活性化アッセイにおけるｍＡｂ及びｍＡｂ^２クローンの結合特異性及び機能活性
７．１ ｍＡｂ^２クローンの結合特異性
ＣＤ１３７及びＯＸ４０は、サイトカイン受容体の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する（Moran et al., 2013）。抗ＣＤ１３７ Ｆａｂ並びに５つのｍＡｂ^２分子のＯＸ４０ Ｆｃａｂ結合部位の特異性を分析するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒトＣＤ１３７、ヒトＯＸ４０及び６つの密接に関連するヒトＴＮＦＲＳＦメンバーへのFS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及びFS20-22-49AA/FS30-5-37 ｍＡｂ^２の結合を試験した。この目的は、１μＭの濃度で密接に関連する抗原へのｍＡｂ^２の結合を示さないが、１ｎＭの濃度でＣＤ１３７及びＯＸ４０受容体への結合を示すことにより、１０００倍の特異性を示すことであった。抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ ＭＯＲ７４８０．１及び抗ＯＸ４０ ｍＡｂ１１Ｄ４を陽性対照として使用した。

簡単に説明すると、ＣＭ５チップ上のフローセルを、ヒトＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ（表３）、ＯＸ４０－ｍＦｃ（表２）、組換えヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ－Ｆｃ、組換えヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂ－Ｆｃ、組換えヒトＧＩＴＲ－Ｆｃ、組換えヒトＮＧＦＲ－Ｆｃ、組換えヒトＣＤ４０－Ｆｃ又は組換えヒトＤＲ６－Ｆｃのいずれかの約１０００ＲＵで固定化した。フローセル１はブランクの固定化用として残した。５つのｍＡｂ^２は、１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１μＭ及び１ｎＭ（GE Healthcare、製品コードBR100188）に希釈し、３分間チップ上に流動させ、次いで４分間解離させた。再生のために、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒注入を使用した。各抗原のコーティングを実証するために、陽性対照ｍＡｂを５０～１００ｎＭで注入した。結合レベルは、会合フェーズの終わりに決定され、比較された。

選択されたｍＡｂ^２の全ては、それぞれＭＯＲ７４８０．１及び１１Ｄ４陽性対照と類似するか又はより高いヒトＣＤ１３７及びＯＸ４０受容体に対する高いレベルの特異性を示した。

７．２ ヒトＣＤ１３７Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７アゴニスト抗体の機能活性
異なる抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の活性を理解するために、DO11.10-hCD137細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイを使用した。抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体G1AA/MOR7480.1（配列番号１２５及び１２０）、G1AA/20H4.9（配列番号１６５及び１２２）及びG1AA/FS30-10-16（配列番号１５４及び９７）及びアイソタイプ陰性対照として、ＩｇＧ１形式の抗ＦＩＴＣ抗体４４２０（G1/4420；配列番号１１５及び１１６）を試験した。抗体分子は、架橋抗ヒトＣＨ２抗体ＭＫ１Ａ６の存在下及び非存在下の両方で試験された（実施例２．１を参照されたい）。Ｔ細胞活性化の尺度としてマウスＩＬ－２産生を使用した。

DO11.10-hCD137細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０％ ＦＢＳ（Life Technologies）及び５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Life Technologies、A11113803）含有ＤＯ１１．１０細胞培地（RPMI medium（Life Technologies）に１．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳで希釈した０．１μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ３抗体で３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートすることにより、抗マウスＣＤ３抗体（Thermo Fisher Scientific、clone 17A2）でコーティングし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。DO11.10-hCD137細胞は、１×１０^５細胞／ウェルでプレートに添加した。各試験抗体の２μＭ希釈液をＤＰＢＳ（Gibco）で調製し、さらにＤＯ１１．１０細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）で１：１０に希釈して、２００ｎＭ希釈液を得た。ＭＫ１Ａ６架橋剤を、必要に応じて、試験抗体と１：１のモル比でウェルに添加した。９６ウェルプレートで、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の段階希釈液を調製した。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上のDO11.10-hCD137細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。上清を回収し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D Systems）でアッセイした。Gen5ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。

アッセイの結果を図２Ｃ及びＤに示す。抗ＣＤ１３７抗体は、その活性に対する架橋抗体の要件が異なり、３つ全ての抗ＣＤ１３７抗体は、架橋抗体の存在下で濃度依存的にＩＬ－２産生の増加を示したが、架橋抗体の非存在下では、G1AA/20H4.9抗体のみが活性を示した。したがって、G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16は、架橋抗体の添加を必要としており、つまり、それらの活性は「架橋依存性」であった。一方で、G1AA/20H4.9は架橋抗体の存在下及び非存在下の両方で活性を示し、すなわちその活性は「架橋非依存性」であった。

７．３ ヒトＣＤ１３７Ｔ細胞活性化アッセイにおけるｍＡｂ^２の機能活性
選択したFS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２クローンの機能活性を、DO11.10-hCD137細胞を使用してＴ細胞活性化アッセイで試験した。ＩｇＧ１形式の抗ＦＩＴＣ抗体４４２０（G1/4420；配列番号１１５及び１１６）をアイソタイプ陰性対照として、抗ＯＸ４０ ｍＡｂG1/11D4（配列番号１７４及び１７５）及びｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/4420（配列番号１２３及び１１６）を陰性対照として使用し、ＩｇＧ１（G1/MOR7480.1；配列番号１１９及び１２０）及びＩｇＧ２（G2/MOR7480.1；配列番号１２４及び１２０）形式の両方の抗ＣＤ１３７抗体ＭＯＲ７４８０．１、臨床試験で試験されている抗体の形式であるＩｇＧ２形式（Gopal et al., 2017；Tolcher et al., 2017）を陽性対照として使用した。ｍＡｂ及びｍＡｂ^２分子を、抗ヒトＣＨ２抗体、ＭＫ１Ａ６（実施例２．１を参照されたい）を用いて架橋し、ある実験では、非架橋ｍＡｂ及びｍＡｂ^２分子の活性を調査した。Ｔ細胞活性化の尺度としてマウスＩＬ－２産生を使用した。実験は、実施例７．２に記載されているように実施された。

架橋される場合、全ての５つの選択されたｍＡｂ^２クローンは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて強力な活性を示し、ＥＣ_５０値の平均は、１５ｎＭ未満及びＥｍａｘ値の平均は、約１６０００～２００００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－２（表６及び図２Ａ）の範囲であった。試験されたｍＡｂ^２クローンの活性は、架橋の非存在下で観察されなかった（図２Ｂ）。ＭＯＲ７４８０．１陽性対照抗体は、架橋される場合にのみ活性を示すことが観察された（G1/MOR7480.1について、３．３ｎｍのＥＣ_５０及び１２５７５ｐｇ／ｍｌのＥ_ｍａｘ及びG2/MOR7480.1について、２．４ｎＭのＥＣ_５０及び８５４７ｐｇ／ｍｌのＥ_ｍａｘ）。架橋抗ＯＸ４０ ｍＡｂ（G1/11D4）の活性の欠如及び非架橋抗ＯＸ４０Ｆｃａｂ含有ｍＡｂ^２分子について観察された低いバックグランドシグナルの組み合わせは、このアッセイの結果が、ＣＤ１３７活性のみの読み出しであることを示しており、ＣＤ１３７受容体発現の高レベル及びＤＯ１１．１０細胞によるＯＸ４０受容体発現の非検出可能レベルに起因するものである可能性が高い（データは示さず）。

したがって、抗ヒトＣＤ１３７モノクローナル抗体FS30-5-37、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-10-16及びFS30-35-14のCDRを含むｍＡｂ^２は、架橋される場合、DO11.10-hCD137Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ＣＤ１３７を活性化することができる強力な活性を示した。架橋の非存在下で顕著な活性は観察されなかった。これらのｍＡｂ^２は、Ｔ細胞アッセイ（実施例４．３を参照されたい）で架橋される場合にも高い活性を示した抗ヒトＯＸ４０ Ｆｃａｂ FS20-22-49からのＣＨ３ドメインを含む。ＬＡＬＡ変異と共に調製されたこのｍＡｂ^２は、FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16と指定された。

これらのｍＡｂ^２を、特定の標的の発現及び追加の架橋剤を必要としないことに基づき、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を自主的にアゴナイズすることができる二重アゴニストとして作用することが可能であるかを決定するためにさらなる分析のために選択した。

実施例８ － ヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７についてのｍＡｂ^２の結合親和性
ＣＤ１３７の親和性を決定するために、Biacore CM5チップ（GE Healthcare）を、Human Antibody Capture Kit（GE Healthcare）を使用し、製造元の条件に従って、抗ヒトＦｃでコーティングし、表面密度を約４０００ＲＵとした。試験抗体のサンプル（ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16、抗ＣＤ１３７陽性対照G1/MOR7480.1及び抗ｈＯＸ４０陰性対照G1/11D4）は、約８０ＲＵまで捕捉された。ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７（hCD137-mFc-Avi又はcCD137-mFc-Avi）を、２００ｎＭから開始する３倍希釈系列の濃度範囲で、流速７０μｌ／分で流した。会合時間は２分であり、解離時間は８分であった。泳動用緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ（GE Healthcare BR100188）であった。３Ｍ塩化マグネシウムを流速３０μｌ／分で３０秒間注入することにより、フローセルを再生した。

ＯＸ４０の親和性を決定するために、Biacore CM5チップをHuman Fab Capture Kit（GE Healthcare 28958325）を使用し、製造者の条件に従って、抗ヒトＦａｂでコーティングし、表面密度を約８０００ＲＵとした。試験抗体のサンプル（FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２、G1/MOR7480.1（陰性対照）及びG1/11D4（陽性対照））を約８０ＲＵまで捕捉し、次にヒト又はカニクイザルＯＸ４０抗原（ｈＯＸ４０－ｍＦｃ又はｃＯＸ４０－ｍＦｃ）を２００ｎＭから始まる３倍希釈系列の濃度範囲で、流速７０μｌ／分で流した。会合時間は２分であり、解離時間は８分であった。泳動用緩衝液はＨＢＳ－ＥＰであった。ｐＨ２．１の塩化グリシンを流速３０μｌ／分で３０秒間注入することにより、フローセルを再生した。

そのデータを、意図的にブランクのままにされた（抗体結合なし）フローセルに対して二重参照することによって分析した。結合速度論を、１：１ラングミュアモデルに適合させて、結合結合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）速度を生成した。平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を、解離速度を各サンプルの会合速度で割ることによって計算した。データ分析は、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を使用して実行された。結果を表７に示す。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の結合親和性は、これらの分子が両方の受容体に高い親和性で結合することを示している。ヒトＯＸ４０に対するこれらの分子の親和性は、類似しており、これらの分子は全てＯＸ４０Ｆｃａｂを共有しているため予想されることである。カニクイザルＯＸ４０に対する親和性は、ヒトＯＸ４０の５倍以内である。ヒトＣＤ１３７に対する親和性は４～０．２ｎＭの範囲であり、抗ＣＤ１３７ Ｆａｂは分子ごとに異なるため、カニクイザルＣＤ１３７との交差反応性もばらつきがある。FS20-22-49AA/FS30-10-16は、ヒトＣＤ１３７に対してより高い親和性を有し、カニクイザルＣＤ１３７に対しても類似の親和性を有する。カニクイザル研究におけるｍＡｂ^２の挙動を、ヒトに外挿することができると期待されるため、ヒト及びカニクイザル抗原との結合の類似性は、有利であり得る。

また、FS20-22-49AA/FS30-10-16は、ヒトＯＸ４０及びヒトＣＤ１３７に対して類似の親和性を有し、これらが共発現される場合、ｍＡｂ^２は、両方の標的に等しく良好に結合するはずであることが期待される。

ＯＸ４０及びＣＤ１３７に結合し、両方の標的のクラスター化及び活性化を同時に促進するｍＡｂ^２は、二重アゴニストとして機能することが期待される。ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方は、Ｔ細胞に存在することが知られている（Ma, et al., 2005）。理論に拘束されるものではないが、両方の標的への結合に対する類似の親和性を有するｍＡｂ^２は、ｍＡｂ^２が両方の標的を発現する細胞に結合する可能性が高いため、二重アゴニストとして有利である可能性があり得ると考えられる。一方の標的に他方よりも顕著に高い親和性を有し、優先的に結合するｍＡｂ^２は、両方の標的を発現しない細胞に優先的に結合し得るため、二重アゴニストとして作用することができなくてもよい。

実施例９ － ＯＸ４０及びＣＤ１３７に対するｍＡｂ^２の同時結合
９．１ ヒトＯＸ４０及びＣＤ１３７に対するｍＡｂ^２の同時結合
ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3及びFS20-22-49AA/FS30-10-16のＯＸ４０及びＣＤ１３７に対する同時結合の能力を、Biacore3000でＳＰＲによって試験された。G1/MOR7480.1を対照として使用した。製造元の指示に従って、ビオチン化ヒトＣＤ１３７（hCD137-mFc-Avi-Bio）をＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１００ｎＭに希釈し、ストレプトアビジン（ＳＡ）チップ（GE Healthcare BR100032）に固定化して表面密度を約１０００ＲＵにし、フローセルは、バックグラウンド除去のために固定化されたいずれのタンパク質なしで活性化及び非活性化された。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１００ｎＭに希釈した抗体を、１００ｎＭのヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０－ｍＦｃ）又はＨＢＳ－ＥＰ緩衝液のいずれかと流速３０μｌ／分で同時注入した。各結合ステップについて、解離を３分間追跡した。センサーチップを、各サイクル後にグリシン２．５（GE Healthcare）を流量３０μｌ／分で１５μｌ注入して再生した。試験した全てのｍＡｂ^２は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７に同時に結合することが可能であった。対照ｍＡｂ、G1/MOR7480.1は、ＣＤ１３７のみに結合する。

９．２ マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７に対するマウス受容体標的ｍＡｂ^２の同時結合
抗マウスＣＤ１３７ Ｆａｂを有する抗マウスＯＸ４０Ｆｃａｂを含むｍＡｂ^２を、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７に同時に結合するその能力を試験するために調製した。マウスＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ FS20m-232-91が選択されたのは、Ｔ細胞アッセイにおいて、その活性がより高いために選択され、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ形式（G1/Lob12.3；University of Southampton）における抗マウスＣＤ１３７抗体Ｌｏｂ１２．３のＦａｂ（Taraban et al., 2002）が、マウスＣＤ１３７発現細胞への良好な細胞結合を示し、インビトロ及びインビボでの活性を有するアゴニスト性ＣＤ１３７抗体として文献で幅広く使用されているため、FS20m-232-91 Ｆｃａｂとのペアリングのために選択された。抗マウスＣＤ１３７抗体Ｌｏｂ１２．３及びＬＡＬＡ変異のFS20m-232-91 CH3ドメイン及びＦａｂを含有するｍＡｂ^２は、「FS20m-232-91AA/Lob12.3」と指定される一方、ＬＡＬＡ変異を有しない抗マウスＣＤ１３７抗体Ｌｏｂ１２．３及びFS20m-232-91 CH3ドメイン及びＦａｂを含有するｍＡｂ^２は、「FS20m-232-91/Lob12.3」と指定された。

FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が２つの標的に同時に結合する能力は、BIAcore 3000instrument（GE Healthcare）のＳＰＲによって試験された。G1/Lob12.3を、陽性対照として使用した。製造元の指示に従って、組換えマウスＣＤ１３７（mCD137-hFc；R&D Systems、カタログ番号937-4B-050）を酢酸ナトリウムpH 5.0（GE Healthcare）で２００ｎＭに希釈し、表面密度を約１０００ＲＵでBiacoreCM5チップに固定化して、フローセルはバックグラウンド除去用に固定化されたタンパク質なしで活性化及び非活性化された。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中１００ｎＭに希釈したｍＡｂ^２及び陽性対照は、ヒトＯＸ４０（ｍＯＸ４０－ＭＦＣ）又はＨＢＳ－ＥＰ緩衝液のいずれか１００ｎＭで、流速３０μｌ／分で同時注入した。各結合ステップについて、解離を３分間追跡した。センサーチップは、各サイクルの後に、流速２０μｌ／分でｐＨ１．７のグリシン－ＨＣｌ水溶液を３０秒間注入して再生した。ｍＡｂ^２は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７に同時結合することが可能であった。G1/Lob12.3 ｍＡｂは、ＣＤ１３７にのみ結合する。

実施例１０ － Ｆｃγ受容体へのｍＡｂ^２の結合
ＴＮＦＲファミリーメンバーを標的とするアゴニスト性抗体は、インビボ活性の標的のクラスター化及び活性化を促進するために、Ｆｃγ受容体媒介性架橋を必要とすることが文献から知られている（Wajant, 2015）。しかしながら、これは、二重アゴニストであることが意図されている抗体にとっては、望ましくない可能性がある。そのため、ＬＡＬＡ変異の挿入により、Ｆｃγ受容体に対して結合するｍＡｂ^２の能力を削減することを決定した。

ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体は、Ｆｃγ受容体への結合が可能である。これにより、それらがＦｃγ受容体に結合する場合、標的を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能が誘導され、細胞溶解が生じる可能性がある。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の意図されたメカニズムは、それらを死滅させることなくＯＸ４０及びＣＤ１３７発現する細胞を活性化するため、ｍＡｂ^２により誘導されるＡＤＣＣの減少が望ましい。

また、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は二重アゴニストとして機能することを意図しているため、それらの意図された作用メカニズムは、同じ細胞上で共発現されるか又は異なる細胞上で発現される場合、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方への二重結合による架橋の結果として受容体を介してシグナル伝達することであり、Ｆｃγ受容体を介して架橋する能力は、機能についての要件ではない。

さらに、ＣＤ１３７標的抗体は、臨床において、肝臓毒性を示していることが知られており（Segal et al., 2017）、毒性メカニズムは、不明であるが、抗ＣＤ１３７抗体のＦｃγＲ媒介架橋又は肝臓若しくは末梢における抗ＣＤ１３７発現細胞の活性化に依存している可能性がある。ＦｃγＲ媒介架橋を介したＣＤ１３７アゴニスト作用の予防は、これらの分子がＯＸ４０及びＣＤ１３７に対して二重結合を介してのみ架橋するため、本発明のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の毒性リスクを減少させ得る。

ＳＰＲによる結合を使用して、ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16のＬＡＬＡ変異の存在が、Ｆｃγ受容体、特に、hFcγR1（R&D Systems、カタログ番号1257-FC-050/CF）、hFcγR2a（R&D Systems、カタログ番号1330-CD-050/CF）、hFcγR2b（R&D Systems、カタログ番号1460-CD-050/CF）及びhFcγR3a（R&D Systems、カタログ番号4325-FC-050/CF）に対する結合親和性を低下させたことを確認した。抗ｈＯＸ４０ ｍＡｂｓ G1AA/11D4及びG1/11D4（それぞれＬＡＬＡ変異を有する及び有しない）及び抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1AA/20H4.9及びG1/20H4.9（それぞれＬＡＬＡ変異を有する及び有しない）は、全てｈＩｇＧ１アイソタイプ形式においてであり、抗ｈＣＤ１３７ ｍＡｂ G4/20H4.9は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ形式においてであり、対照抗体として使用された。

結合をBiacore 3000 instrument（GE Healthcare）で試験した。ヒトＯＸ４０（BPS Bioscienceカタログ番号71310）及びヒトＣＤ１３７（自社生産）ビオチン化ｈｉｓタグ付き抗原をＳＡチップ（GE Healthcareカタログ番号BR100398）に２μＭの濃度でコーティングした。ヒトＯＸ４０及びヒトＣＤ１３７を、別々のフローセル上にコーティングし、別のフローセルはバックグラウンド除去のためにブランクのままにされた。再生条件は、２０μｌ／分の流速でｐＨ２．０の１２μｌの１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ水溶液であると決定された。抗体（表８を参照されたい）及びヒトＦｃγＲｓ（表８を参照されたい）をＨＢＳ－Ｐ中（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％重量／重要界面活性剤Ｐ２０、GE Healthcare、BR-1003-68）で、１００ｎＭ（抗体）又は５００ｎＭ（ヒトＦｃγＲｓ）に希釈し、流速２０μｌ／分で同時注入し、解離を５分間追跡した。

データ分析は、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２ ＲＣ１を使用して、ブランクフローセルに対して参照し、抗体の会合後に曲線を整列させることによって実行された。会合フェーズの終了時の結合応答の値は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７受容体に対する抗体結合の効果を正常化するために、抗体の会合フェーズの終了時の絶対応答からＦｃγＲの会合フェーズの終了時の絶対応答を差し引くことによって生成された。

ＦｃγＲＩの解離フェーズの終了時の結合応答のための測定値は、このＦｃγＲに対する結合が完全に除去されていない場合、ＦｃγＲＩ結合のオフレートを増加させるＬＡＬＡ変異の効果を実証するために行われた。これらは、ＦｃγＲの解離フェーズの終了時の絶対応答から、ＦｃγＲの会合フェーズの終了時の絶対応答を差し引くことにより生成された。抗ＣＤ１３７抗体の値をＣＤ１３７－Ｈｉｓ抗原でコーティングされたフローセルから採取し、抗ＯＸ４０抗体の値は、ＯＸ４０－Ｈｉｓ抗原でコーティングされたフローセル及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２については、ＯＸ４０－ｈｉｓ抗原でコーティングされたフローセル及びＣＤ１３７－ｈｉｓ抗原でコーティングされたフローセルの両方から採取された。結果を表８に示す。

ＬＡＬＡ変異を有しないｍＡｂ^２及び対照抗体は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４形式の両方において、予想通りＦｃγ受容体の各々に全て結合された。ＬＡＬＡ変異を含有するＩｇＧ１形式のｍＡｂ^２及び対照抗体は、ＬＡＬＡ変異を有しないＩｇＧ１形式の対照抗体及びＩｇＧ４形式の対照抗体と比較して、ＦｃγＲＩを除く、試験したＦｃγ受容体の各々に対する会合フェーズ（オンレート）の終了時に、顕著に減少した結合を示した。高親和性Ｆｃγの結合受容体、ＦｃγＲＩのｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ含有抗体に対する結合率は、ＬＡＬＡを含有しないＩｇＧ１抗体と比較してわずかに減少したのみであり、そのような変異の導入によって顕著に変化しなかった。しかしながら、ＦｃγＲＩのオフレートは、ＦｃγＲＩの解離段階の終了時の結合応答のより大幅に減少すると示されるように、ＬＡＬＡ変異含有抗体の方がＬＡＬＡを有しない抗体よりも速かった（ＬＡＬＡ含有抗体の各々について２００ＲＵを超えるのに対し、ＬＡＬＡを含有しない抗体については６０ＲＵ未満であった）。

全体的に、野生型ヒトＩｇＧ１と比較した場合、他のＬＡＬＡ含有ｈＩｇＧ１抗体と類似の方法及びＩｇＧ４対照抗体よりも低いレベルで、ＬＡＬＡ変異含有ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、Ｆｃγ受容体への結合を減少した。Ｆｃγ受容体結合は、ＡＤＣＣ活性に必要であるため、ＬＡＬＡ変異によって引き起こされるＦｃγ受容体への結合のこの減少が、ｍＡｂ^２結合による標的細胞が枯渇しないようなＡＤＣＣの減少ももたらすことが期待される。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２はアゴニスト抗体であり、ｍＡｂ^２が刺激することを目的とする細胞であるため、標的細胞の枯渇は望ましくないため、これは重要であると考えられる。

ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞に発現し、ＡＤＣＣの媒介に重要であることが示されている（Chan et al., 2015）。ＳＰＲデータによって確認されたように、ＦｃγＲＩＩＩａに対するFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２結合の減少がＡＤＣＣ経路の低活性化又は無視できる程度に翻訳されるかどうかを決定するため、エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａを発現する操作されたジャーカット細胞及び標的細胞としてＯＸ４０又はヒトＣＤ１３７のいずれかを過剰発現するラージ細胞を使用して、ＡＤＣＣバイオアッセイを実行した。アッセイを使用した陰性又は陽性対照抗体について観察された応答を比較して、ｍＡｂ^２は、ＯＸ４０発現又はＣＤ１３７発現ラージ細胞のいずれにおいても、ＡＤＣＣ活性化を誘導しないことが観察された。

他のアゴニスト抗体は、高次構造を作成する抗体のFcγ受容体架橋に依存していることが知られており（Stewart et al., 2014；Wajant, 2015）、それらのアゴニスト活性を発揮するため、細胞表面の受容体のクラスター化及び活性化をもたらす。Ｆｃγ受容体媒介架橋は、本発明のｍＡｂ^２活性には必要ではなく、細胞のアゴニスト作用は、両方の標的が存在する部位に局在化するであろう。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のＬＡＬＡ変異により、Ｆｃγ受容体への結合の減少がもたらされるため、ＣＤ１３７結合のみを介したＦｃγ受容体架橋駆動活性が可能であることは期待されない。その結果、ｍＡｂ^２は、ＯＸ４０の発現の非存在下でＣＤ１３７発現細胞を活性化する可能性は低い。ヒトにおいて、ＣＤ１３７を標的とすることに関連した肝臓毒性リスクが知られているため（例えば、ウレルマブ（BMS-663513）による処置で見られるような）（Segal et al., 2017）、ＬＡＬＡ変異含有ｍＡｂ^２のＦｃγ受容体誘導性架橋の可能性の減少は、ＣＤ１３７がＯＸ４０も発現している場所でのみ活性化されるため、ｍＡｂ^２による処置時に発生するそのような肝毒性の可能性を減少させることが期待されている。ＣＤ１３７誘導肝臓毒性の現在の理論は、ＣＤ１３７発現骨髄細胞が、ＣＤ１３７アゴニストにより処置されたマウスで見られる肝臓の炎症となる細胞型であるということを示している（Bartkowiak,et al., 2018）。

マクロファージは、ＣＤ１３７標的抗体の架橋を潜在的に媒介し得るＦｃγＲＩを発現することが知られているが、これらの細胞は、ＯＸ４０を発現することは知られていない。したがって、ＬＡＬＡ変異含有の本発明のｍＡｂ^２は、理論的には、ＣＤ１３７を発現するが、ＯＸ４０も発現しない肝臓マクロファージを活性化することができないはずである。これは、活性についてＦｃγ受容体架橋を必要とするＣＤ１３７アゴニスト又は活性について架橋を必要としないＣＤ１３７アゴニストのいずれかと比較した場合、本発明のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の肝臓毒性リスクを低下させると考えられる。ＯＸ４０の場合、ＣＤ１３７結合の非存在下、ＯＸ４０の一部の活性化につながり得る架橋の非存在下でＦｃａｂの一部の残留活性が観察されているが、ＯＸ４０アゴニストを用いた臨床試験で用量制限毒性がこれまでに報告されていないため、これは、リスクと考えられない。

実施例１１ － ＯＸ４０及びＣＤ１３７を発現する細胞に対するｍＡｂ^２の結合
１１．１．ヒト又はカニクイザルＯＸ４０若しくはＣＤ１３７を発現する細胞に対するｍＡｂ^２の結合
細胞発現ヒト又はカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７についてのｍＡｂ^２FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及びFS20-22-49AA/FS30-10-16の結合親和性は、フローサイトメトリーを使用して決定された。これらのｍＡｂ^２抗体及び対照抗体G1/4420（ＦＩＴＣ）、G1/11D4（ＯＸ４０）、G1/MOR7480.1（ＣＤ１３７）及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）（全てＩｇＧ１アイソタイプ形式）の希釈（２Ｘ最終濃度）を１ＸＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）で調製した。DO11.10-hOX40、DO11.10-cOX40、DO11.10-hCD137、DO11.10-cCD137又はＨＥＫ細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に５０μｌ／ウェルで４×１０^６細胞／ｍｌで播種した。５０μｌの抗体希釈液を、細胞含有ウェル（最終容量１００μｌ）に加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ－４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を添加し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。プレートは、洗浄され、ＤＡＰＩ（Biotium、カタログ番号40043）を１μｇ／ｍｌで含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁したCantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用してプレートを分析し、FlowJoを使用してデータを分析した。死細胞を、ＵＶ（４０５ｎｍ／４５０／５０）チャネルでより高い蛍光により同定し、分析から除外した。ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍ／５３０／３０）で幾何学的平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を、抗体結合の尺度として使用した。ＧＭＦＩデータを、GraphPad Prismソフトウェアにおける対数（アゴニスト）対対応（３つのパラメーター）を使用して適合させ、ＥＣ_５０値を生成した。

この結果は、試験されたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２がＤＯ１１．１０細胞上に発現したヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７に結合することを確認する。ｍＡｂ^２及び陽性対照（ヒトＩｇＧ１骨格における抗ヒトＯＸ４０ ｍＡｂ、G1/11D4及びヒトＩｇＧ１骨格の抗ヒトＣＤ１３７ ｍＡｂG1/MOR7480.1）は、一定範囲の親和性を持つヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に結合した（表９を参照されたい）。ＨＥＫ細胞株の表面に発現する他のタンパク質との交差反応性は観察されず、これは、試験した抗体のいずれについても、この細胞株との結合を検出できなかったためである。したがって、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、ヒトＯＸ４０及びヒトＣＤ１３７に特異的に結合し、非特異的結合は確認されなかった。

１１．２ FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２及びその構成部分のヒト又はカニクイザルＯＸ４０又はＣＤ１３７発現する細胞に対する結合
細胞発現ヒト又はカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７に対するｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16及びその構成部分、すなわちＯＸ４０ Ｆｃａｂ（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２形式；FS20-22-49AA/4420）及びＣＤ１３７ Ｆａｂ（ＩｇＧ１形式；FS30-010-016）の親和性を比較するために、実施例１１．１に記載の方法と同じ方法を用いた。ただし、この実験では、非特異的結合を分析するためにＨＥＫ細胞を使用する代わりに、非形質導入ＤＯ１１．１０細胞を使用した。G1/4420抗ＦＩＴＣ抗体を対照として使用した。実験は、計算されたＥＣ_５０値の信頼性を高めるために３回繰り返した。試験された分子に対する平均の平均ＥＣ_５０値を表１０に示す。

結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）が、ナノモル濃度以下の親和性で、ＤＯ １１．１０細胞上に発現したヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７に結合すること、ｍＡｂ^２のＯＸ４０Ｆｃａｂ成分が、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２と同等の親和性でヒト及びカニクイザルＯＸ４０に結合すること及びｍＡｂ^２のＣＤ１３７ Ｆａｂ成分が、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が同等の親和性でヒト及びカニクイザルＣＤ１３７に結合することを確認した。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のその構成要素又はアイソタイプ対照抗体（Ｇ１／４４２０）のいずれについても、非形質導入ＤＯ１１．１０細胞に対する非特異的結合は観察されなかった。その結果は、細胞発現カニクイザルＯＸ４０に対するFS20-22-49AA/FS30-10-16ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びFS20-22-49AA ＯＸ４０ Ｆｃａｂの親和性は、以前に観察された（実施例１１．１及び表９）よりも高く（低いＥＣ_５０値によって示されるように）、ＳＰＲにより決定された親和性結果と類似していた（実施例８及び表７）。表１０に詳述した平均ＥＣ_５０値は、３つの独立した実験の結果であるため、ＤＯ１１．１０細胞上で発現したヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＣＤ１３７について試験した分子の親和性をより良好に示す。

１１．３ マウスＯＸ４０又はＣＤ１３７を発現する細胞に対するｍＡｂ^２結合
細胞発現マウスＯＸ４０及びＣＤ１３７に対するFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２の結合親和性を、フローサイトメトリーを使用して決定した。FS20m-232-91AA/Lob12.3及び対照抗体G1/4420（ＦＩＴＣ）、G1/Lob12.3（ＣＤ１３７）、G1/OX86（ＯＸ４０）及びFS20m-232-91AA/HELD1.3（ＯＸ４０／ＨＥＬモックｍＡｂ^２）の希釈液（最終濃度の２倍）を１ＸＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）で調製した。DO11.10-mOX40、DO11.10-mCD137又はＨＥＫ細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に５０μｌ／ウェルで４×１０^６細胞／ｍｌで播種した。５０μｌの抗体希釈液を、細胞含有ウェル（最終容量１００μｌ）に加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ－４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を添加し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。プレートは、洗浄され、ＤＡＰＩ（Biotium、カタログ番号40043）を１μｇ／ｍｌで含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁したCantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用してプレートを分析し、FlowJoを使用してデータを分析した。死細胞を、ＵＶ（４０５ｎｍ／４５０／５０）チャネルでより高い蛍光により同定し、分析から除外した。ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍ／５３０／３０）で幾何学的平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を、抗体結合の尺度として使用した。ＧＭＦＩデータを、GraphPad Prismソフトウェアにおける対数（アゴニスト）対対応（３つのパラメーター）を使用して適合させ、ＥＣ_５０値を生成した。結果を表１１に示す。

結果は、ＤＯ１１．１０細胞上に発現したマウスＯＸ４０及びＣＤ１３７に対してFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２を結合することを確認する。ｍＡｂ^２及び陽性対照（ヒトＩｇＧ１骨格における抗マウスＯＸ４０ ｍＡｂ、ＯＸ８６及びヒトＩｇＧ１骨格の抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ Ｌｏｂ１２．３）は、一定範囲の親和性を持つマウスＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７の両方に結合した（表１１を参照されたい）。ＨＥＫ細胞株の表面に発現する他のタンパク質との交差反応性は観察されず、これは、試験した抗体のいずれについても、この細胞株との結合を検出できなかったためである。

したがって、抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７に特異的に結合し、非特異的結合は確認されなかった。

実施例１２ － ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイで共発現受容体を標的とするＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
腫瘍浸潤リンパ球でのＯＸ４０発現は、これら２つの分子が活性化Ｔ細胞でしばしば共発現することが多いため、ＣＤ１３７の発現を伴う可能性が高い（Ma et al., 2005）。これらの２つの共発現受容体を標的とするｍＡｂ^２によるＯＸ４０及びＣＤ１３７のアゴナイジングは、あらかじめ活性化したＴ細胞による炎症性サイトカインの増殖及び産生を誘導することができる。

完全に活性化されるために、Ｔ細胞は、二つのシグナルを必要とし、第１のシグナルは、抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の膜上にあるペプチド抗原を提示するＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子と相互作用するＴ細胞受容体を介して供給され、第２のシグナルは、抗原非特異的シグナルである共刺激シグナルで、これは、ＡＰＣ及びＴ細胞の膜上に発現される共刺激分子間の相互作用によって供給される。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を試験するために、第１のシグナルとして、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）スーパー抗原を使用したＴ細胞活性化アッセイを確立した。ＳＥＡは、ＡＰＣの表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子及びＴ細胞のＴＣＲを架橋し、それによってＴ細胞活性化の第１のシグナルを提供する。それらの完全な活性化のために、Ｔ細胞は、対照分子又は必要に応じて、架橋ｍＡｂ^２により、第２の共刺激シグナルを受信しなければならない。このアッセイは、血液から分離されたＰＢＭＣを使用して実行され、分離されたＴ細胞を使用して実行されたアッセイと比較して、インビボで発生すると期待されることをより正確に表す必要がある。

ＳＥＡ刺激アッセイは、人工架橋剤の存在下又は非存在下で異なるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体の活性を確立するために使用され、異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンを比較するために、１０人のＰＢＭＣドナー群におけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16について代表的なＥＣ_５０値を確立した。

１２．１ ＳＥＡ刺激ＰＢＭＣ上のＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の活性
異なるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体に対するＳＥＡアッセイの感度を確立するために、表１２に列挙されたｍＡｂ^２抗体（FS22-20-49AA/FS30-10-16）及び対照抗体を、アッセイでそれらの活性について試験した。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1AA/FS30-10-16（抗ＣＤ１３７）、G1AA/20H4.9（抗ＣＤ１３７）、G1AA/11D4（抗ＯＸ４０）及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を対照として使用した。Ｔ細胞活性化の尺度としてＩＬ－２産生を使用した。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、血小板提供の副産物である白血球枯渇コーン（NHS Blood and Transplant service）から分離された。簡単に説明すると、白血球コーンの内容物をＰＢＳで洗い流し、フィコール勾配（GE Lifesciencesカタログ番号１７１４４００２）に重ねた。ＰＢＭＣを遠心分離及びフィルコール勾配を通過しなかった細胞の回収により分離した。ＰＢＭＣをさらにＰＢＳで洗浄し、残りの赤血球を、製造元の指示に従って１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加により溶解した。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭのヘペス（Gibco）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）及び５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Gibco）を有するＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies））中の２．０×１０^６細胞／ｍＬを、再懸濁した。次に、ＳＥＡ（Sigmaカタログ番号Ｓ９３９９）を２００ｎｇ／ｍｌでＰＢＭＣに添加し、細胞を２×１０^５細胞／ウェル（１００μｌ／ウェル）でプレートに添加した。

各試験抗体の２μＭ希釈液（詳細については、表１２を参照されたい）をＤＰＢＳ（Gibco）で調製し、さらにＴ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）で１：１０に希釈して、２００ｎＭ希釈液を得た。人工架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体（クローンＭＫ１Ａ６、自社生産）又はＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma）（表１２を参照されたい）を、必要に応じて試験抗体と１：１のモル比でウェルに添加した。９６ウェルプレートで、試験抗体の段階希釈を調製し、希釈した抗体混合物１００μｌをプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。

細胞を、３７℃５％ＣＯ_２で１２０時間インキュベートした。上清を回収し、製造元の指示に従って、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D Systems）を使用してＩＬ－２の放出を測定した。Gen5ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の濃度を試験抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。表１３は、人工架橋剤の存在下又は非存在下でＳＥＡアッセイにおいて観察されたＥＣ_５０値及びＩＬ－２放出の最大応答を示す。図３Ａは、ＳＥＡアッセイにおいて、単一濃度（３．７ｎＭ）で試験された抗体によって誘導されたＩＬ－２放出のレベルを示す。これらの抗体が最も高いレベルのＩＬ－２産生を誘導する濃度を、この分析のために選択した。統計分析は、二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定によって行われた。エラーバー上のアスタリスクは、アイソタイプ対照（G1/4420）で処理されたサンプルと比較した有意差を表す（＊ｐ＜０．０３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図３Ｂは、ＳＥＡアッセイにおいて、人工架橋剤の存在下又は非存在下でＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）によって誘導されたＩＬ－２放出のプロットを示す。

この結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）のみが人工架橋剤の非存在下でＩＬ－２レベルを増加させることができ、人工架橋剤の添加は、いずれかＥＣ_５０又は最大応答の観点から、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を増加しなかったことを示す。ＯＸ４０標的抗体G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420並びに抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9の活性は、人工架橋剤の存在下でのみ観察され、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16について、人工架橋剤の存在下でもアイソタイプ対照と比較して統計的に有意な活性が検出されなかった。抗ＯＸ４０抗体G1AA/11D4は、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16より高いＩＬ－２レベル及び抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9に同等のＩＬ－２レベルを誘導したが、G1AA/11D4抗体は、その著しく低いＥＣ_５０値によって示されるように、G1AA/20H4.9抗体より高い能力を有することが観察された。これらの結果は、このＳＥＡアッセイがＣＤ１３７アゴニスト作用よりもＯＸ４０アゴニスト作用に敏感であることを示している。これは、ＯＸ４０が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で優先的に発現され、ＣＤ１３７が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で優先的に発現されることに関連している可能性があり（Croft, 2014及び図６に示す内部データ）、ヒトＰＢＭＣにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりＣＤ４＋Ｔ細胞が一般的に多く存在することに起因する。

１２．２ ＳＥＡ刺激ＰＢＭＣにおける異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンの活性
５つの異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンは、ＳＥＡアッセイでそれらの活性について試験した。アッセイで使用されるｍＡｂ^２及び対照抗体の詳細を表１４で提供する。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1/11D4（抗ＯＸ４０）、G2/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1/11D4プラスG2/MOR7480.1の組み合わせ及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を、対照として使用した。このアッセイを、実施例１２．１に記載されているように実行した。

表１５は、人工架橋剤による架橋の存在下又は非存在下でＳＥＡアッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。図３Ｃ及びＤは、ＳＥＡアッセイについてＩＬ－２放出のプロットを示す。

図３Ｃ及びＤ並びに表１５は、非架橋又は架橋抗ＦＩＴＣ抗体G1/4420又は非架橋抗ＯＸ４０抗体（G1/11D4単独又はG2/MOR7480.1との組み合わせ）で、予想通り、ＩＬ－２産生が観察されなかったことを示す。抗ＯＸ４０陽性対照抗体結合により、ＯＸ４０が活性化された場合、ＩＬ－２がＴ細胞により産生されたが、それは、人工架橋剤が存在する場合にのみであった（G1/11D4単独で０．１３ｎＭのＥＣ_５０、G2/MOR7480.1と組み合わせた場合の０．１１ｎＭのＥＣ_５０）。モックｍＡｂ^２形式（４４２０ ＬＡＬＡ）FS20-22-49AA/4420のＯＸ４０標的化Ｆｃａｂは、このアッセイにおいて、架橋が存在しない場合（８．５３ｎＭのＥＣ_５０）において、ある程度のアゴニスト活性を示したが、ＦＩＴＣ－デキストランへのＦａｂアームの結合によって架橋された場合、ＩＬ－２産生の増加によって示されるような、ＥＣ_５０の減少（０．３１ｎＭ）及びＩＬ－２産生の最大量の増加（最大応答）によって実証されるように、活性の増加を示した。

架橋したＣＤ１３７標的化抗体G2/MOR7480.1の単独では、活性は認められず、ＯＸ４０標的化抗体G1/11D4及びＣＤ１３７標的化抗体G2/MOR7480.1の組み合わせの活性は、架橋した場合、架橋したＯＸ４０標的化抗体G1/11D4単独の活性と類似であった。

このＳＥＡ Ｔ細胞活性化アッセイでは、５つのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローン（表１５を参照されたい）の活性は、人工架橋剤の存在にかかわらず、同等であった。人工架橋剤の存在下において、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性も、架橋されたFS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２と同等であった。このＳＥＡアッセイのこれらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、ｍＡｂ^２の抗ＣＤ１３７ Ｆａｂアームの係合によって提供される架橋の結果として、人工架橋剤を必要とせずに、ＯＸ４０を介してシグナル伝達できることを示している。

このアッセイで、架橋したＣＤ１３７標的抗体G2/MOR7480.1について活性が検出されなかったが、ＣＤ１３７がｍＡｂ^２の架橋を生じさせることを可能にするＴ細胞上のレベルで発現することが期待される。この発現は、ＣＤ１３７に結合した場合、各５つのｍＡｂ^２クローンがＯＸ４０にも結合し、非架橋FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２によって誘導される低レベルの活性よりもはるかに高く、その活性化を駆動することができるレベルであったと仮定される。

人工架橋剤の非存在下において、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２で観察されたＴ細胞活性化は、これらの分子がＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方がインビボで発現されるＴ細胞を活性化できることも示唆している。

１２．３ １０人のＰＢＭＣドナーからのＳＥＡ刺激ＰＢＭＣにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16の活性
ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16は、ＳＥＡアッセイで１０人の異なるドナーからＰＢＭＣで試験し、その活性について正確なＥＣ_２０値、ＥＣ_３０値及びＥＣ_５０値を確立した。このアッセイを、人工架橋剤の非存在下において、実施例１２．１に記載されるように実施した。平均値プラス又はマイナス標準偏差（ＳＤ）は、各ドナーの生データから計算された。ＥＣ_５０値を計算するために、生データをロジスティック関数に適合させた（４つのパラメーター：Top、Bottom、Hill slope及びＥＣ_５０）。

ｙ軸は、測定された応答（ＩＬ－２レベル）をｌｏｇ_１０（ｃ）の関数として示し、ここで、ｃは試験対象品の濃度を示す。

適合からの各パラメーター推定値には、その推定値の精度を示す標準誤差がある。与えられた実験の異なるドナー及び／又は技術的複製は、異なるパラメーター推定値及び異なる精度レベルを与えるため（例えば、各ケースのデータの品質に依存する）、各ドナー及び／又は技術的複製からのパラメーターは、加重平均に含めた。重量は、パラメーターの正規性を仮定して、パラメーターの標準誤差の２乗の逆数として定義された。

さらに、ｌｏｇ_１０（ＥＣ_２０）値及びｌｏｇ_１０（ＥＣ_３０）値を、類似の方程式にデータを適合させ計算した。

全てのロジスティック適合は、GraphPadPrismを使用して実行され、加重平均は、MicrosoftExcelを使用して実行された。加重平均と加重平均の標準誤差に使用される計算式を以下に示す。

ここで、加重標準偏差は次のように推定される。

ＳＥＡアッセイにおいて、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２について観察されたＩＬ－２放出のためのＥＣ_２０値、ＥＣ_３０値及びＥＣ_５０値を表１６に示す。

これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、異なるドナーからのＰＢＭＣに匹敵する活性を有することを示す。

実施例１３ － 汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
実施例１２に記載されているＳＥＡ Ｔ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞を刺激するためにＰＢＭＳ及びスーパー抗原を使用した。分離されたＴ細胞のＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニストの影響を評価するために、Ｔ細胞活性化アッセイを確率した。このアッセイでは、プラスチック表面に固定化された抗ＣＤ３抗体を使用して、Ｔ細胞を分離及び刺激した。固定化された抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞のＴＣＲをクラスター化することができ、Ｔ細胞の活性化に必要な第１のシグナルを提供し、試験分子は第２のシグナルを提供する。

Ｔ細胞刺激アッセイは、架橋剤の存在下又は非存在下で異なるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体及びＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体の活性を確立するために使用され、異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンを比較するために、９人のＰＢＭＣドナー群におけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16について代表的なＥＣ_５０値を確立した。

１３．１ 汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の活性
異なるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体に対してＴ細胞活性化アッセイの感度を確率するために、表１７に列挙されたｍＡｂ^２抗体（FS20-22-49AA/FS30-10-16）及び対照抗体をアッセイでそれらの活性を試験した。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1AA/FS30-10-16（抗ＣＤ１３７）、G1AA/20H4.9（抗ＣＤ１３７）、G1AA/11D4（抗ＯＸ４０）及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を、対照として使用した。Ｔ細胞活性化の尺度としてＩＬ－２産生を使用した。

実施例１２．１に記載されているように、ヒトＰＢＭＣを分離した。次に、Ｔ細胞を、製造元の指示に従って、Pan T Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec Ltd）を使用して、ＰＢＭＣから分離した。

Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies、11452D）をボルテックスで再懸濁した。ビーズを、１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭヘペス（Gibco）、２ｍＭＬ-グルタミン（Gibco）及び５０μＭ２-メルカプトエタノール（Gibco）を有したＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies））で２回洗浄した。

Ｔ細胞培地中の１．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で必要な数のＴ細胞を、Ｔ－２５フラスコ（Sigma）中で、細胞対ビーズ比２：１で洗浄したヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで刺激し、Ｔ細胞を活性化するために、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。活性化Ｔ細胞は、ダイナビーズから洗浄し、２．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＴ細胞の培地中に再懸濁した。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳで希釈した２．５μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ３抗体（R&D Systems clone UHCT1）で３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートすることにより、抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。活性化Ｔ細胞は、２×１０^５細胞／ウェルでプレートに添加した。

各試験抗体の２μＭ希釈液（詳細については、表１７を参照されたい）を調製し、必要に応じて、上記の実施例１２．１に記載されているように、架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体（クローンＭＫ１Ａ６、自社生産）又はＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma）（表１７を参照されたい））と１：１のモル比でウェルに添加した。９６ウェルプレートで、試験抗体の段階希釈を調製し、希釈した抗体混合物１００μｌをプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。

Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。次に、上清を回収し、ＩＬ－２放出を測定し、実施例１２．１に記載されているようにデータを調製した。表１８は、架橋剤による架橋の存在下又は非存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。図４Ａは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、単一濃度（３．７ｎＭ）で試験された抗体によって誘導されたＩＬ－２放出のレベルを示す。これらの抗体が最も高いレベルのＩＬ－２産生を誘導する濃度を、この分析のために選択した。統計分析は、二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定によって行われた。エラーバー上のアスタリスクは、アイソタイプ対照（G1/4420）で処理されたサンプルと比較した有意差を表す（＊ｐ＜０．０３２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図４Ｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、架橋剤の存在下又は非存在下でＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）によって誘導されたＩＬ－２放出のプロットを示す。

この結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）のみが人工架橋剤の非存在下でＩＬ－２レベルを増加させることができ、人工架橋剤の添加は、いずれかＥＣ_５０又は最大応答の観点から、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を増加しなかったことを示す。ＯＸ４０標的抗体G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420並びに抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9の活性は、人工架橋剤の存在下でのみ観察され、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16について、人工架橋剤の存在下でさえも、活性は検出されなかった。ＯＸ４０アゴニスト抗体FS20-22-49AA/4420は、３つ全てのＣＤ１３７アゴニスト抗体よりも高いＩＬ－２レベルを誘導した。抗ＯＸ４０抗体G1AA/11D4は、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16より高いＩＬ－２レベル及び抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9に同等のＩＬ－２レベルを誘導したが、G1AA/11D4抗体は、その低いＥＣ_５０値によって示されるように、G1AA/20H4.9抗体より高い能力を有することが観察された。これらの結果は、このＴ細胞活性化アッセイがＣＤ１３７アゴニスト作用よりもＯＸ４０アゴニスト作用に敏感であることを示している。実施例１２．１で推察されるように、これは、ＯＸ４０が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で優先的に発現され、ＣＤ１３７が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で優先的に発現されることに関連している可能性があり（Croft, 2014及び図６に示す内部データ）、ヒトＰＢＭＣにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりＣＤ４＋Ｔ細胞が一般的に多く存在することに起因する。

１３．２ 汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の活性の複数のサイトカイン分析
Ｔ細胞活性化アッセイに対するＯＸ４０及びＣＤ１３７の刺激の影響をより理解するために、複数のサイトカインレベルを分析した。表１９に列挙された抗体及びｍＡｂ^２抗体（FS20-22-49AA/FS30-10-16）及び対照抗体を使用した。対照抗体G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/FS30-10-16（抗ＣＤ１３７）及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を、人工架橋剤の存在下で試験し、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を人工架橋剤の非存在下で試験した。全ての抗体を単一濃度（１０ｎＭ）で使用した。このアッセイを、実施例１３．１に記載されているように実行した。

インキュベーション後回収された上清中のサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ－１０を、次に、Pro-inflammatory V-plexキット（MSD、K15049D-1）を製造元の指示に従って使用し、測定した。結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）及び架橋ＯＸ４０標的抗体（FS20-22-49AA/4420）は、Ｔ細胞によるＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３及びＴＮＦαサイトカイン放出が増加し、ＩＬ－１０放出が減少したことを示した。抗ＣＤ１３７抗体（G1AA/FS30-10-16）について活性は検出されなかった。

１３．３ 汎Ｔ細胞活性化アッセイにおける異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンの活性
このアッセイで試験された分子及びそれぞれのそれらの架橋剤の詳細は、該当する場合、以下の表２０に示す。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1/11D4（抗ＯＸ４０）、G2/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）、G1/11D4プラスG2/MOR7480.1の組み合わせ及びFS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を、対照として使用した。全ての分子を、人工架橋剤の非存在下で試験した。単剤対照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及びFS20-22-49AA/4420を、人工架橋剤の存在下でさらに試験した。このアッセイを、実施例１３．１に記載されているように実行した。

表２１は、架橋の非存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて試験した全ての分子について、観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。表２２は、架橋剤の存在下において、追加で試験された単剤対照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及びFS20-22-49AA/4420で観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。図４Ｃ及びＤは、Ｔ細胞活性化アッセイについてＩＬ－２放出のプロットを示す。

表２１及び図４Ｃは、非架橋ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が活性（０．２０１９ｎＭから１．２０１ｎＭの範囲にあるＥＣ_５０）を有し、したがって、両方の標的に結合することができ、その結果、Ｔ細胞活性化を誘導するため、それらの一方又は両方にクラスター化を生じたことを示す。予想通り、非架橋又は架橋抗ＦＩＴＣ抗体G1/4420又は非架橋抗ＯＸ４０抗体（G1/11D4単独又はG2/MOR7480.1との組み合わせ）で、ＩＬ－２産生が観察されなかった。架橋剤の存在下において、抗ＯＸ４０陽性対照抗体により、ＯＸ４０受容体が標的化された場合、ＩＬ－２がＴ細胞により産生された（G1/11D4単独で０．０５ｎＭのＥＣ_５０及びG2/MOR7480.1と組み合わせた場合の０．０２ｎＭのＥＣ_５０）。

モックｍＡｂ^２形式/4420（４４２０ ＬＡＬＡ）FS20-22-49AA/4420におけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂは、ＳＥＡアッセイで見られるように、架橋の非存在下で（５．０２ｎＭのＥＣ_５０及び１５０８ｐｇ／ｍｌ ｈＩＬ－２の最大応答）、一部のアゴニスト活性を有し、この活性は、モックｍＡｂ^２を、そのＦａｂアームにＦＩＴＣ－デキストランを結合させることによって架橋した場合にさらに強化された。

非架橋抗ＣＤ１３７抗体G2/MOR7480.1単独では、活性は観察されなかったが、架橋した場合、Ｔ細胞活性化を誘導することができ、ＳＥＡ Ｔ細胞活性化アッセイ（実施例１２）と異なり、このアッセイが、上記で確認されたＯＸ４０シグナル伝達と同様に、この抗ＣＤ１３７クローンによるＣＤ１３７シグナル伝達を測定することができる。人工架橋剤の非存在下又は存在下のいずれにおいても、活性が検出されなかった実施例１３．１のＩｇＧ１形式と同じ抗ＣＤ１３７クローン（G1AA/MOR7480.1）と比較して、この架橋抗体について観察された活性の違いは、一部のドナーが他のドナーよりもＣＤ１３７刺激によく反応し得ることによるＴ細胞ドナーのばらつきによって説明し得る。

実施例７．１に記載のDO11.10-hCD137細胞を使用するヒトＣＤ１３７Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、試験ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14）及びG2/MOR7480.1対照は、強力にＩＬ－２生産を誘導した。したがって、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗ＣＤ１３７ Ｆａｂアームは、本実施例の一次Ｔ細胞活性化アッセイにおいて検出可能なＩＬ－２シグナルを生成するために、Ｔ細胞発現ＣＤ１３７にもアゴナイズできると想定される。

１３．４ ９人のＰＢＭＣドナーからのＴ細胞による汎Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16の活性
ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２クローンFS20-22-49AA/FS30-10-16は、Ｔ細胞活性化アッセイで９人の異なるドナーからＰＢＭＣで試験し、その活性について正確なＥＣ_２０値、ＥＣ_３０値及びＥＣ_５０値を確立した。このアッセイを、人工架橋剤の非存在下において、実施例１３．１に記載されるように実施した。

各ドナーについて、実施例１２．３に記載されるように、平均値プラス又はマイナス標準偏差（ＳＤ）は、生データから計算された。Ｔ細胞アッセイにおいて、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）について観察されたＩＬ－２放出についてのＥＣ_２０値、ＥＣ_３０値及びＥＣ_５０値も、実施例１２．３に記載されているように計算され、表２３に示す。

これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、異なるドナーからのＴ細胞上に匹敵する活性を有することを示す。

実施例１４ － ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
Ｔ細胞を、免疫系でのそれらの機能に応じてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に細分化することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞と呼ばれ、免疫応答を調節するサイトカインを産生し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔキラー細胞と呼ばれ、標的細胞を直接排除する。ＯＸ４０の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ１３７発現よりも高いことが観察されており、逆に、ＣＤ１３７の発現はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＯＸ４０発現よりも高いことが観察されている（Croft, 2014及び図６を参照されたい）。この発現レベルの違いにもかかわらず、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が２つの受容体を共発現する（Ma et al., 2005）。

これらの２つのＴ細胞集団におけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性をさらに調査するために、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を分離し、別々のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、各Ｔ細胞集団を活性化するため、下記の表２４に列挙された分子の能力を試験した。このアッセイでは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の共発現を利用して、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２FS20-22-49AA/FS30-10-16の架橋を測定した。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/11D4（抗ＯＸ４０）、G1AA/MOR7480.1（抗ＣＤ１３７）G1AA/FS30-10-16（抗ＣＤ１３７）、FS20-22-49AA/4420（ＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）及びFS20-22-49AA/4420プラスG1AA/FS30-10-16の組み合わせを対照として使用した。Ｔ細胞活性化の尺度としてＩＬ－２産生を使用した。

ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を分離するために、実施例１３．１に記載されているように、ＰＢＭＣを最初に分離した。次に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット（ヒト）（Miltenyi Biotec、130-096-533）及びＣＤ８＋Ｔ細胞分離キット（ヒト）（Miltenyi Biotec、130-096-495）を使用して、製造元の指示に従って、PBMCから別々に分離した。

実施例１３．１に記載したように、ヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを使用して、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞培地中の１．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で必要とされる量で一晩活性化した。

活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、ダイナビーズから洗浄し、２．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度でＴ細胞の培地中に再懸濁した。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳで希釈した２．５μｇ／ｍｌ（ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイの場合）又は１０μｇ／ｍｌ（ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイの場合）のいずれかの抗ヒトＣＤ３抗体（R&D Systems、クローンUHCT1）で３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートすることにより、抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、活性化されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、２×１０^５細胞／ウェルで、それぞれのプレートに添加した。

各試験抗体の２μＭ希釈液（詳細については、表２４を参照されたい）を調製し、必要に応じて、実施例６に記載されているように、架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ－デキストラン（Sigma）（表２４を参照されたい））と１：１のモル比でウェルに添加した。９６ウェルプレートで、試験抗体の段階希釈を調製し、希釈した抗体混合物１００μｌをそれぞれのプレート上の活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞に添加した。

Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。上清を回収し、実施例１２．１に記載されているように測定されたＩＬ－２放出及びデータを調製した。表２５は、架橋剤による架橋の存在下又は非存在下で別々のＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。図５ＡからＣは、それぞれＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイについてＩＬ－２放出のプロットを示す。

上清を回収した後、Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１０００分の１に希釈したAlexa Fluor 488標識抗ヒトFc二次抗体（Jackson Immunoresearch、カタログ番号109-546-098）で、４℃で１時間染色した。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、カタログ番号89139-054）を含む１００μｌ／ウェルのＰＢＳに１μｇ／ｍｌで再懸濁した。次に、細胞をBD FACS CantoIIフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。図６は、G1AA/MOR7480.1又はG1AA/11D4で処置されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの４８８チャネルにおける幾何平均蛍光強度を示す。

表２５及び図５Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、架橋抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420（単独及びG1AA/FS30-10-16と組み合わせの両方）によって活性化され得るが、単剤抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16によって活性化され得ないことを示す。一方で、図５Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、架橋した抗ＯＸ４０対照G1AA/11D4及びFS20-22-49AA/4420と同様に、架橋する場合、抗ＣＤ１３７対照G1AA/MOR7480.1及びG1AA/FS30-10-16の両方によって活性化されたが、単剤抗ＣＤ１３７対照G1AA/FS30-10-16に対する応答のレベルは、両単剤抗ＯＸ４０対照よりも大きかったことを示している。ＳＥＡアッセイ（実施例１２．２）及びヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイ（実施例１３．３）において観察されたように、モックｍＡｂ^２形式（FS20-22-49AA/4420）のＯＸ４０ Ｆｃａｂは、架橋の非存在下及びＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下でいくらかの活性を示し、この抗体が架橋される場合のこの活性が増加した。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）は、以前の結果から予想されたように、架橋の非存在下、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の存在下で活性を示した（実施例１２及び１３を参照されたい）。

図６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞よりも低レベルのＣＤ１３７及び高レベルのＯＸ４０を発現していることを示す。ＣＤ１３７に対するG1AA/MOR7480.1の結合は、ＣＤ１３７発現の尺度であり、ＯＸ４０に対するG1AA/11D4の結合は、ＯＸ４０発現の尺度である。

分離されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるこのＴ細胞アッセイを、上記と同じプロトコルに従って繰り返したが、異なるＰＢＭＣドナーから分離されたＴ細胞を用い、抗ＣＤ１３７抗体G1AA/20H4.9を添加した（表２４を参照されたい）。図５ＡからＤに示される結果と一致して、図５Ｅ及び５Ｆは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ１３７アゴニスト作用により応答し、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＯＸ４０アゴニスト作用により応答することを示す。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を架橋したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を架橋しなかった場合において、抗ＯＸ４０抗体（G1AA/11D4及びモックｍＡｂ^２形式FS20-22-49AA/4420の抗ＯＸ４０ Ｆｃａｂ）及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を架橋したがＣＤ４＋Ｔ細胞を架橋しなかった場合において、ＣＤ１３７抗体（G1AA/20H4.9及びG1AA/FS30-10-16）。実施例７．１に記載のDO11.10-hCD137細胞アッセイで得られた結果と類似して、G1AA/20H4.9抗体は、架橋抗体の非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞も活性化した。この繰り返し実験では、G1AA/MOR7480.1抗体は、架橋した場合にＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化しなかった。一部のＰＢＭＣドナーは、他のドナーよりもＣＤ１３７共刺激の影響を受けやすく、この実験で得られた異なる結果は、この自然変異の結果である可能性がある。

これらのデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＯＸ４０アゴニスト作用を介した活性化に敏感であり、逆に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ１３７アゴニスト作用を介した活性化に敏感であることを示す。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０お及びＣＤ１３７受容体の発現レベルの報告された違いと相関しており、前者はＣＤ１３７よりも高レベルのＯＸ４０を発現し、後者はＯＸ４０よりも高レベルのＣＤ１３７を発現する。架橋された抗ＣＤ１３７対照抗体G1AA/FS30-10-16のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下での活性は、そのＦａｂアームがＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16に存在し、ｍＡｂ^２は、そのＦｃａｂがＯＸ４０に結合することによって架橋される場合、ＣＤ１３７受容体を活性化する能力を持っていることを実証する。さらに、モックｍＡｂ^２形式（FS20-22-49AA/4420）における架橋された抗ＯＸ４０ＦｃａｂのＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下での活性は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16にも存在し、ｍＡｂ^２が、そのＦａｂアームのＣＤ１３７に対する結合により架橋された場合、ＯＸ４０受容体を活性化する能力を有することを示す。したがって、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２は、ＯＸ４０のアゴニスト作用を介して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ＣＤ１３７及びＯＸ４０の低い範囲のアゴニスト作用を介して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することにより、二重アゴニストとして機能する可能性があると結論付けることができる。ｍＡｂ^２によるＯＸ４０の活性化は、そのＦｃａｂを介して発生し、そのＦａｂアームを介してＣＤ１３７への結合した場合にｍＡｂ^２の架橋によって増加する一方、ＣＤ１３７に対するそのＦａｂアームの結合及びそのＦｃａｂを介してＯＸ４０に結合した場合のｍＡｂ^２の架橋を介してＣＤ１３７の活性化は発生する。

実施例１５ － Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及び抗マウスＣＤ１３７抗体の活性
抗ヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、マウスタンパク質に結合しないため、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍反応を不正に起こす可能性を試験するために、マウスＯＸ４０及びマウスＣＤ１３７を標的とする並行試薬が作製された（実施例８．２を参照されたい）。

１５．１ 汎Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
これら２つの共発現受容体を標的とするマウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）が、あらかじめ活性化したＴ細胞による炎症性サイトカインの産生を誘導できるかどうかを試験するために、マウスＴ細胞活性化アッセイが設立された。抗体G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、G1AA/OX86（抗ｍＯＸ４０）、G1AA/Lob12.30（抗ｍＣＤ１３７）、G1AA/OX86及びG1AA/Lob12.3の組み合わせ及びFS20m-232-91AA/4420（ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）を対照として使用し（詳細については、表２６を参照されたい）、ＩＬ－２産生を、Ｔ細胞刺激の尺度として使用した。

Ｔ細胞を分離するために、４～８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Charles River）から脾臓を回収した。マウスを人道的に安楽死させ、脾臓を解剖により分離した。脾臓細胞を、５ｍｌのプラスチックシリンジの内部を使用して７０μｍのセルストレーナー（Corning）に脾臓を押し込むことによって分離した。セルストレーナーを１ｍｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Gibco）で１０回洗浄し、溶出液を５０ｍｌのチューブに回収した。溶出液中の赤血球を、製造元の指示に従って１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加により溶解した。Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、Pan T cell Isolation Kit II（マウス）（Miltenyi Biotec Ltd）を使用して、溶出液中に存在する脾細胞から分離し、次いで、実施例１３．１に記載のＴ細胞活性化アッセイと本質的に同じプロトコルを使用したが、代わりにＴ細胞の活性化のためにマウスT-ActivatorCD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies）、プレートのコーティングのために抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend clone145-2C11）及びＩＬ－２放出の測定のためにマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）を用いて、活性化した。

表２７は、試験したｍＡｂ^２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を示す。図７Ａ及びＢは、Ｔ細胞活性化アッセイについてＩＬ－２放出の代表的なプロットを示す。

表２７及び図７Ｂは、ＯＸ４０受容体が標的化され、抗ＯＸ４０抗体が架橋された場合、Ｔ細胞の活性化が増加することを示す。予想通り、架橋又は非架橋抗ＦＩＴＣ抗体G1/4420又は非架橋抗ＯＸ４０抗体（G1AA/OX86単独又はG1AA/Lob12.3との組み合わせ）で、Ｔ細胞活性化が観察されなかった。架橋剤の存在下において、抗ＯＸ４０抗体G1AA/OX86により、ＯＸ４０受容体が標的化された場合、ＩＬ－２がＴ細胞により産生された（G1AA/OX86単独で２．４１ｎＭのＥＣ_５０及びG1AA/Lob12.3と組み合わせた場合の１．７２ｎＭのＥＣ_５０）。

モックｍＡｂ^２形式（FS20m-232-91AA/4420）のＯＸ４０を標的としたＦｃａｂは、架橋が非存在下では、アゴニスト活性を示さなかったが、ＦＩＴＣ－デキストランに対してＦａｂアームを結合させることにより架橋した場合、強力なＴ細胞活性化を示した。ＯＸ４０標的Ｆｃａｂが抗ＣＤ１３７のＦａｂ（Ｌｏｂ１２．３）とペアになった場合、ｍＡｂ^２は、追加の架橋剤の非存在下でＴ細胞活性を示した。これは、ｍＡｂ^２が同じ細胞表面上に共発現された受容体に結合することにより架橋されていることを示した。

架橋したＣＤ１３７標的化抗体G1AA/Lob12.3単独では、限界活性が認められ、ＯＸ４０標的化抗体G1AA/OX86及びＣＤ１３７標的化抗体G1AA/Lob12.3の組み合わせの活性は、架橋した場合、架橋したＯＸ４０標的化抗体G1AA/OX86単独の活性と同程度であり、そのアッセイは、Ｌｏｂ１２．３によるＣＤ１３７のアゴニスト作用の検出について、感度が低いことを示唆した。これは、架橋抗ＣＤ１３７対照G2/MOR7480.1について、より強いＣＤ１３７特異的シグナル（ＩＬ－２放出の最大応答）が観察された実施例１３．３に記載のヒトＴ細胞アッセイとは対照的である。抗マウスＣＤ１３７及び抗ヒトＣＤ１３７対照抗体に見られる機能的活性のこの違いは、それぞれのＣＤ１３７標的に対して異なる親和性を有することに関連し得る。これは、細胞の供給源（ヒトＰＢＭＣ対マウス脾細胞）又はマウス対ヒトのシステムにおける標的生物学の微妙な違いも反映し得る。

このデータは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ＯＸ４０／ＣＤ１３７ｍＡｂ^２が、両方の受容体に同時に係合することにより、追加の架橋剤なしでＴ細胞の活性化を誘導できることを示す。

抗ヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２分子は、マウスの交差反応性ではなく、抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、並行したインビトロ実験系において、ヒトのリードと機能的に同等であるため、抗マウス分子は、インビボで抗腫瘍免疫を誘導するためのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の可能性を推測するのに適したサロゲートと考えられる。

１５．２ マウスＣＤ１３７Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７抗体の活性
マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローン（Ｌｏｂ１２．３）の活性は、実施例１５．１の汎Ｔ細胞アッセイにおいて、ほとんど又は全く検出されなかったため、異なる抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の活性を理解するために、DO11.10-mCD137細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイを実施した。抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体G1AA/Lob12.3（表２６を参照されたい）及びG1AA/3H3（配列番号１６６及び１６７）並びにアイソタイプ陰性対照としてＩｇＧ１形式（G1/4420、配列番号１１５及び１１６）抗ＦＩＴＣ抗体４４２０を試験した。ｍＡｂ分子を、架橋抗ヒトＣＨ２抗体、ＭＫ１Ａ６（実施例２．１を参照されたい）の存在又は非存在下の両方で試験した。Ｔ細胞活性化の尺度としてマウスＩＬ－２産生を使用した。

このアッセイは、実施例６．２に記載されたように、しかし、DO11.10-hCD137細胞の代わりにDO11.10-mCD137細胞を使用して実行された。Gen5ソフトウェア（BioTek）を備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。

結果を図７Ｃ及びＤに示す。抗ＣＤ１３７抗体は、活性を誘導するための架橋抗体についてそれらの要件が異なる。G1AA/Lob12.3は、活性のために架橋抗体の添加を必要とすることが観察され、すなわち、その活性は、架橋依存性であったのに対し、G1AA/3H3は、架橋抗体の存在下でも非存在下でも活性を示し、架橋に依存しない活性を示した。

実施例１６ － ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性について、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の二重係合が必要である。
１６．１ ヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２
ＯＸ４０／ＣＤ１３７標的ｍＡｂ^２は、ＳＥＡ（実施例１２）、ヒト汎Ｔ細胞（実施例１３）及びＴ細胞が共発現するＯＸ４０及びＣＤ１３７を共発現させるヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞（実施例１４）アッセイにおいて、追加の架橋剤の非存在下で活性を示した。この活性が、２つの受容体に同時に結合するために、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を必要とするかどうかを試験するために、Ｔ細胞競合アッセイを実施して、ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16の能力を評価し、１００倍過剰のＯＸ４０標的化FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２プラスG1AA/FS30-10-16 ｍＡｂの組み合わせ又はアイソタイプ対照ｍＡｂ G1/4420のいずれかの存在下において、分離したＴ細胞を活性化した。Ｔ細胞活性化の尺度としてＩＬ－２産生を使用した。

実施例１３に記載されているように、Ｔ細胞を分離した。次に、分離されたＴ細胞を活性化し、実施例１３に記載されるようにプレートを抗ＣＤ３抗体でコーティングした。活性化Ｔ細胞は、２ｎＭのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）を補充し、１００μｌ中２×１０^５細胞／ウェルでプレートに添加した。したがって、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の最終濃度は、１ｎＭであった。

各試験抗体の２μＭ希釈液をＤＰＢＳ（Gibco）で調製し、さらにＴ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）で１：１０に希釈して、２００ｎＭ希釈液を得て、希釈した各抗体の１００μｌをプレート上の活性化したＴ細胞に添加した。

Ｔ細胞をインキュベートし、上清を回収し、実施例１３に記載されているようにＩＬ－２放出を測定した。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。統計分析を、一元配置分散分析及びGraphPadPrismソフトウェアパッケージを使用したダネットの多重比較検定を使用して分析した。

図８は、競合アッセイについてのＩＬ－２放出を示す。ｍＡｂ^２が、抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７抗体の非存在下で両方の受容体に結合できた場合と比較して、ｍＡｂ^２の活性は、ＯＸ４０への結合についてFS20-22-49AA/4420モックｍＡｂ^２及びＣＤ１３７への結合についてG1AA/FS30-10-16 ｍＡｂの両方により競合された場合に大きく減少した。ＯＸ４０標的モックｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/4420及び抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1AA/FS30-10-16の組み合わせは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性をさらに減少させた。これらの結果は、ｍＡｂ^２が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７のクラスター化及びアゴニスト作用を介して、Ｔ細胞活性化を誘導するために、両方の受容体に対するｍＡｂ^２の二重結合が必要であることを示す。

１６．２ マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２
マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７標的ｍＡｂ^２は、Ｔ細胞が２つの受容体を共発現するＴ細胞アッセイにおける追加の架橋剤の非存在下で活性を示す。この活性が２つの受容体に同時に結合するために、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を必要とするかどうかをテストするために、競合アッセイを実施して、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２能力を評価し、１００倍過剰のＯＸ４０標的化モックｍＡｂ^２ FS20m-232-91AA/4420、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ G1/Lob12.3又は陰性対照ｍＡｂ G1AA/4420（ＦＩＴＣ）のいずれかの存在下において、分離したＴ細胞を活性化した。実施例１５．１に記載されているように、Ｔ細胞を分離した。次に、分離されたＴ細胞を活性化し、プレートを実施例１３．１（ヒト汎Ｔ細胞活性化アッセイ）に記載されたように、抗ＣＤ３抗体でコーティングしたが、代わりにＴ細胞の活性化のためにマウスT-Activator CD3/CD28 Dynabeads（LifeTechnologies）及びプレートのコーティングのために抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend clone 145-2C11）抗体を使用した。活性化Ｔ細胞は、２ｎＭのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）を補充し、２×１０^５細胞／ウェルでプレートに添加した。

各試験抗体の２μＭ希釈液をＤＰＢＳ（Gibco）で調製し、さらにＴ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）で１：１０に希釈して、２００ｎＭ希釈液を得て、希釈した各抗体の１００μｌをプレート上の活性化したＴ細胞に添加した。

Ｔ細胞をインキュベートし、上清を回収し、実施例１２．１に記載されているように、ＩＬ－２放出を測定したが、代わりに、ＩＬ－２放出の測定にマウスＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&Dシステム）を使用した。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5ソフトウェア、BioTek）に基づいていた。統計分析を、一元配置分散分析及びGraphPadPrismソフトウェアパッケージを使用したダネットの多重比較検定を使用して分析した。図９は、競合アッセイのＩＬ－２放出の代表的なプロットを示す。

図９は、ＯＸ４０又はＣＤ１３７結合について競合する抗体が過剰に導入する場合、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２により誘導されるＩＬ－２産生量の減少があることを示す。使用された競合抗体は、同じエピトープが標的となることを確実にするために、ｍＡｂ^２構成部分（モック（４４２０）ｍＡｂ^２形式においてのＦｃａｂ及びＦｃａｂなしのＦａｂ）であった。これらの競合する抗体の添加により、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２によって誘導されるＩＬ－２放出量が減少し、この分子がその活性のために二重結合を必要とすることを示す。これは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２活性が、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方に同時に係合し、それによって両方の受容体をクラスター化しアゴナイズすることに依存していることを示す。

実施例１７ － ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
１７．１ ＬＡＬＡ変異を有する又は有しないＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性の比較
ＣＴ２６ Ｂａｌｂ／ｃ同系マウス結腸直腸腫瘍モデルを、抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性をインビボで試験するために使用した。ＣＴ２６腫瘍モデルは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の両方に感受性であることが以前に示されており（Sadun et al., 2008）、ＣＴ２６腫瘍から分離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を発現すると予想される。この抗体試験を表２８に詳述する。

ＬＡＬＡ変異を有する又は有しない、腫瘍増殖を阻害するｍＡｂ^２の能力（それぞれFS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91/Lob12.3）は、アイソタイプ対照ｍＡｂ G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、単剤ｍＡｂ G1/OX86（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＯＸ４０対照）又はG1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＣＤ１３７対照）、G1/OX86プラスG1/Lob12.3の組み合わせ又はG1AA/OX86（ＬＡＬＡ変異含有抗ＯＸ４０ ｍＡｂ）プラスG1AA/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異含有抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ）の組み合わせと比較された。

８～１０週齢及び体重約２０ｇの各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間順応させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには１２匹のマウスがいた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２６３８）を、拡大培養、貯蔵し、その後、ＩＭＰＡＣＴ Ｉプロトコルを使用して、病原体について、IDEXX Bioresearchにより事前スクリーニングし、病原体がないことが示された。ＣＴ２６細胞（約３～５×１０^６）を－１５０℃の保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ内の１０％ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含む２０ｍｌ ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用してマウスを麻酔し、各動物に１×１０^６細胞を左脇腹に皮下注射して腫瘍を生成した。腫瘍細胞接種後１０日目に、腫瘍を測定し、腫瘍体積に基づいてマウスを試験コホートにランダム化した。この時点で腫瘍を有しないマウスは全て試験から除外された。

注射の２４時間前に、抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイリングで分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、２００μｌ／マウスに腹腔内（ＩＰ）注射して、２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。注射は、腫瘍接種後１３日目、１５日目及び１７日目に（２日ごとに３回投与）実施された。動物は、週３回麻酔下で健康スクリーニングを受け、その間に腫瘍の正確な測定が行われた。腫瘍の最長軸及び最短軸を決定するために、カリパスを使用して腫瘍体積の測定を行った。次の計算式を使用して、腫瘍体積を計算した。
Ｌｘ（Ｓ^２）／２
（ここで、Ｌ＝最長軸、Ｓ＝最短軸）

英国動物（科学的処置）法及びＥＵ指令ＥＵ８６／６０９に従って、腫瘍体積が人道的エンドポイントに達した２７日目に試験を中止した。

統計的検定では、混合モデルを使用して腫瘍体積を対数スケールで分析する。対象となる処置の各ペアに個別のモデルを適合させた。このモデルは、
ｌｏｇ_１０（体積）＝Ａ＋Ｂ×（日－開始日）＋ε
である。

ＡとＢは、それぞれ切片及び傾きである。それらは、マウスごとに異なり、群に対する固定効果及び動物に対する変量効果を含む。
Ａ＝Ａ_０＋Ａ_１Ｔ＋ε_Ａ
Ｂ＝Ｂ_０＋Ｂ_１Ｔ＋ε_Ｂ

Ｔは、一方の群に値０、もう一方の群に１の値を持つ処置群を表すダミー変数である。変量効果は正規分布で分布する。
εＡ～Ｎ（０，σ_Ａ）、εＢ～Ｎ（０，σ_Ｂ）
ここで、σ_Ａ及びσ_Ｂそれぞれ切片と傾きの動物間のばらつきの標準偏差である。動物間のばらつきも、通常、標準偏差σで分布する。
ε～Ｎ（０，σ）

処置の各ペアについて、上記のモデルをデータに適合させた。Ａ_１及びＢ_１について、ゼロからの差の（両側）ｐ値が計算された。０．０５未満のｐ値は、処置群間の差について統計的に有意な証拠である。

結果を表１０Ａに示す。平均ＣＴ２６腫瘍体積プラス又はマイナス標準誤差平均がプロットされる。結果は、ＬＡＬＡ変異（それぞれFS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91/Lob12.3）を有する及び有しない両方のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２による処置は、抗ＯＸ４０対照（G1/OX86）、抗ＣＤ１３７対照（G1/Lob12.3）、これらの２つの抗体の組み合わせ（G1/OX86＋G1/Lob12.3）又はＬＡＬＡ含有抗ＯＸ４０抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の組み合わせ（G1AA/OX86＋G1AA/Lob12.3）よる処置と比較して腫瘍増殖の減少をもたらしたことを示す。

この結果は、対照抗体（G1/4420）と比較して、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20-232-91/Lob12.3）の統計的に有意な抗腫瘍効果があることを示す。ＯＸ４０及びＣＤ１３７の標的抗体の組み合わせ（G1/OX86プラスG1/Lob12.3又はG1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3）の活性は、腫瘍の増殖を有意に抑制せず、単剤対照も抑制しなかった（G1/OX86又はG1/Lob12.3）。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のヒトＩｇＧ１骨格のＦｃ領域におけるＬＡＬＡ変異導入は、ＯＸ４０又はＣＤ１３７を発現する細胞のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ又はこれらの受容体を発現する細胞上でＯＸ４０又はＣＤ１３７のいずれかに結合した場合、ｍＡｂ^２のＦｃγ受容体媒介架橋が阻止されると期待される。したがって、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２の活性化は、Ｆｃ媒介エフェクター機能又はＦｃγ受容体媒介架橋ではなく、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の共係合を介して駆動され、いずれか又は両方の受容体を介してシグナル伝達をもたらすと考えられる。その後、これはＯＸ４０及びＣＤ１３７を発現するＴ細胞の活性化につながり、最終的にはＴ細胞を媒介した抗腫瘍活性をもたらすと期待される。

これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体が、ＴＩＬを発現するＯＸ４０及びＣＤ１３７を含むと予想される腫瘍に対して、インビボで抗腫瘍効力を有することを実証し、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２によるＯＸ４０及びＣＤ１３７の二重特異的係合によって媒介されるＯＸ４０及びＣＤ１３７のインビボ活性化が、腫瘍増殖の制御において有効であることを示す。

背景のセクションで上記されたように、肝臓毒性はＣＤ１３７アゴニスト抗体を用いて臨床で観察されている（Segal et al., 2017）。この毒性作用のメカニズムは、完全には解明されていないが、前臨床モデルの試験では、ＣＤ１３７アゴニスト抗体に応答してＩＬ－２７を産生するＣＤ１３７発現ミエロイド細胞の役割が強調されている（Bartkowiak et al., 2018）。この肝臓毒性メカニズムにおけるＦｃγ受容体の役割は研究されていないが、観察された毒性の考えられる説明は、ミエロイド細胞におけるＣＤ１３７及びＦｃγ受容体の共発現が、これらの細胞上のＣＤ１３７アゴニスト抗体の架橋をもたらし、炎症性サイトカインの産生を誘発し得るということである。したがって、本発明のＯＸ４０／ＣＤ１３７二重アゴニスト抗体分子のＦｃγ受容体架橋が、腫瘍微小環境又は周縁部から離れた位置で、ＯＸ４０の非存在下において、ＣＤ１３７を発現する細胞の任意の活性化につながる可能性がある場合、この分子にＬＡＬＡ変異を含むことが望ましいと考えられた。したがって、両方の標的に同時に係合することにより、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を発現するＴ細胞を刺激するが、分子内にＬＡＬＡ変異が存在するために、ＯＸ４０の非存在下では、Ｆｃγ受容体媒介架橋を介してＣＤ１３７発現細胞を活性化しない二重アゴニスト抗体分子を操作することにより、本発明の抗体分子は、臨床での毒性の可能性が低いと考えられる。

本発明の抗体分子にＬＡＬＡ変異を含めるさらなる理由は、この分子が腫瘍増殖を抑制するために活性化することを意図しているＯＸ４０及びＣＤ１３７発現細胞のＦｃγ受容体媒介殺傷を回避するために役立つことである。特定の前臨床腫瘍モデルにおけるＯＸ４０アゴニスト抗体の作用機序は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇのＦｃγ受容体媒介枯渇を介することであり、これらの分子におけるＦｃγ受容体機能障害性変異の導入は、抗腫瘍活性を損なっていると記載されている（Bulliard et al., 2014）。ＬＡＬＡ変異の効果は、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇の欠如を伴う、本発明の抗体分子により活性化されることを意図した有益な免疫細胞の保存であり得るが、前臨床腫瘍モデルにおいて見られるように、腫瘍Ｔｒｅｇ枯渇の同じメカニズムを発生するように設計されたＯＸ４０標的ヒトＩｇＧ１抗体は、腫瘍増殖を制御するための同じ能力を示さなかったことが注目される（Glisson et al., 2016）。Ｔｒｅｇを枯渇させるために設計された他の分子も高いレベルの臨床活性を示していない（Powell et al., 2007、Tran et al., 2017）。同系マウス腫瘍モデルにおいて見られるＴｒｅｇ枯渇の影響の臨床的翻訳可能性のこの欠如は、腫瘍微小環境におけるＦｃγ受容体発現細胞の低レベル（Milas et al., 1987）、ヒト及びマウス間のＴｒｅｇの生物学的相違（Liu et al., 2016）又は他の未知の要因（Stewart et al., 2014）による可能性がある。

驚くべきことに、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２におけるＬＡＬＡ変異の含有は、ＣＴ２６モデルにおけるその抗腫瘍活性は損なわれず、ＬＡＬＡ変異は、Ｆｃγ受容体発現細胞との相互作用に依存しないＦｃγ受容体非依存性の作用機序を有することが示唆された。実施例１９に記載された「作用機序」試験におけるこのＬＡＬＡ変異含有ｍＡｂ^２による腫瘍Ｔｒｅｇの観察可能な枯渇の欠如及び血中での強力なＴ細胞増殖の誘導は、本明細書に記載されたように、ＯＸ４０／ＣＤ１３７二重アゴニストｍＡｂ^２のＦｃγ受容体非依存作用機序に対して、さらなる支持を提供するものである。その活性について、Ｆｃγ受容体相互作用に依存する抗体に見られる臨床活性が不十分であることを考慮すると、本発明の抗体分子のＦｃγ受容体非依存性作用機序は、臨床においてより大きい効力をもたらすことが期待される。

１７．２ ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びその構成要素Ｆｃａｂ及びＦｃａｂ部分についての抗腫瘍活性の比較
マウス汎Ｔ細胞活性化アッセイ（実施例１５）において、マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）は、ＣＤ１３７及びＯＸ４０受容体の両方同時に係合することにより、単一特異的対照抗体G1AA/Lob12.3（抗ｍＣＤ１３７ ｍＡｂ）及びFS20m-232-91AA/4420（ｍＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２）とは対照的に、追加の架橋剤の非存在下でインビトロ活性を示した（実施例１６．２）。汎Ｔ細胞活性化アッセイに続いて、FS20m-232-91AA/Lob12.3の抗腫瘍活性を、その構成部分、すなわちモック（抗ＦＩＴＣ）ｍＡｂ^２形式（FS20m-232-91AA/4420）のFS20m-232-91AA Ｆｃａｂ及びＦｃａｂ（G1AA/Lob12.3）を含有しない単一特異的抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ（G1AA/Lob12.3）を単剤若しくは組み合わせて又はＣＴ２６腫瘍モデルにおけるアイソタイプ対照（G1AA/4420）と比較した。

実施例１７．１に記載された同じ方法に従って、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下にＣＴ２６腫瘍が確立された。ＣＴ２６細胞接種後１０日目に、担癌マウスは、１群あたり２５匹のマウスの試験コホートにランダム化され、抗体処置を受けた。

抗体をＰＢＳで０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、各マウスに２００μｌの容量を腹腔内注射して、２０ｇのマウスについて３ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた（各抗体の固定用量６０μｇ）。注射は、腫瘍接種後１０日目から開始して、合計３回の用量にわたり、２日（Ｑ２Ｄ）ごとに１回実施した。腫瘍体積は、前述のようにカリパス測定によって決定された。細胞接種後６４日で試験を終了し、腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的エンドポイントに達した時点で、動物を試験から除外した。

個々の動物の経時的な腫瘍体積データを図１０Ｂに示し、図１０Ｃに示す平均結果は、アイソタイプ対照抗体（G1AA/4420）と比較して、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が初期のＣＴ２６腫瘍増殖速度（１０日目から２２日目）を阻害したことを示唆している。明らかな腫瘍増殖阻害を、抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ抗体、マウスＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２又はこれらの組み合わせで処置したコホートにおいて観察されなかった。

前記の同じ混合モデル法に従い、２２日目までの腫瘍体積データ分析（細胞接種後、表２９）は、FS20m-232-91AA/Lob12.3が、アイソタイプ対照と比較して平均腫瘍増殖速度の統計的に有意な（ｐ＝０．００３）減少をもたらしたことを示した。比較して、抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ、マウスＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２又はそれらの組み合わせでの処置は、アイソタイプ対照と比較して腫瘍増殖速度に有意差をもたらさなかった。混合モデル法を使用した、全試験期間（６４日）にわたる腫瘍増殖速度の比較は、アイソタイプ対照と比較して、全ての処置群で腫瘍増殖速度の統計的に有意な減少を示した（分析は示さず）。

生存分析は、FS20m-232-91AA/Lob12.3が、対数順位（マンテル－コックス）検定を使用したアイソタイプ対照と比較して統計的に有意な生存の改善をもたらしたことを示した（ｐ≦０．０００１）（図１０Ｄ）。抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ、マウスＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ^２又はその組み合わせのいずれかを受ける担癌マウスが、アイソタイプ対照と比較して、生存において統計的に有意差を示さなかった。

結論として、その結果はFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が、その構成成分Ｆｃａｂ及びＦａｂ部分の組み合わせ又はいずれかの成分部分のみに対して、より大きく非等価な抗腫瘍活性を有することを実証する。

実施例１８ － ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の薬力学的応答
１８．１ 薬力学的応答ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及び抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７対照ｍＡｂの比較
ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２の薬力学的応答を、ＣＴ２６同系腫瘍担癌マウスにおいて評価した。この目的のために、血液サンプルを、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２、アイソタイプ対照（G1/4420）、単剤抗マウスＯＸ４０対照（G1/OX86）、単剤抗マウスＣＤ１３７対照（G1/Lob12.3）又はこれらの抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７対照（G1/OX86プラスG1/Lob12.3）の組み合わせを経時的に接種されたＣＴ２６担癌マウスから採取し、フローサイトメトリーでＴ細胞活性化及び増殖マーカーを分析した。

実施例１７に記載された同じプロトコルに従って、８～１０週齢で、約２０ｇの体重の各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を試験開始のために調製し、ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、CRL-2638）に接種した。腫瘍細胞接種後１０日目に、腫瘍を測定し、マウスを腫瘍体積に基づいて１群あたり１０匹の試験コホートにランダム化した。この時点で腫瘍を有しないマウスは全て試験から除外された。

前述のように、抗体を分析し不純物を確認し、抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、２００μｌ／マウスに注射して、２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。腫瘍接種後１０日目、１２日目及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射により、抗体をマウスに投与した。

投与１時間前の１０日目、１１日目（初回投与２４時間後）、１５日目（３回目投与２４時間後）に尾静脈から且つ１７日目及び２４日目の心臓穿刺により、血液をＥＤＴＡ含有チューブ中に回収した。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscienceカタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。Ｆｃブロック（eBioscienceカタログ番号14-0161-86、１：１００）の存在下において、全てeBioscienceから提供された、ｓｔａｉｎ１（ＣＤ４－Ｅ４５０（クローンＧＫ１．５）、Ｋｉ６７－ＦＩＴＣ（クローンＳｏｌＡ１５）、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（クローンＦＪＫ－１６ｓ）、ＣＤ６９－ＰＥＣｙ５（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＣＤ３－ＰＥＣｙ７（クローン１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ８－ＡＰＣ（クローン５３－６．７）、固定可能生存率色素（fixable viability die）780及びBD Bioscienceから提供されたＣＤ４５－Ｖ５００（クローン３０－Ｆ１１）又は全てeBioscienceから提供されたｓｔａｉｎ２（ＣＤ４９ｂ－Ｅ４５０（クローンＤＸ５）、Ｆ４／８０－ＰＥ（クローン６Ｆ１２）、ＣＤ６９－ＰＥＣｙ５（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＣＤ１９－ＰＥＣｙ７（クローン１Ｄ３）、ＣＤ３－ＡＰＣ（クローン１４５－２Ｃ１１）及び固定可能生存率色素（fixable viability die）780、BD Bioscienceから提供されたＣＤ４５－Ｖ５００（クローン３０－Ｆ１１）並びにJackson ImmunoResearchから提供された抗ｈＦｃ－４８８（ポリクローナル））のいずれかを使用して、フローサイトメトリーのために細胞を染色した。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ｓｔａｉｎ２で染色したサンプルを２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、FACS CantoIIで泳動した。ｓｔａｉｎ１で染色されたサンプルについて、細胞を最初に１００μｌの抗体ミックス１（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）で、４℃で３０分間染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscienceカタログ番号00-5523-00）で透過処理した。簡単に説明すると、２００μｌの固定液を各ウェルに加え、４℃の暗所で一晩放置した。次に、細胞を２００μｌの透過処理緩衝液で洗浄した。次に、細胞を再度回転させ、Ｆｃブロック（全て１：１００希釈）の存在下において、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞をBD FACS CantoIIサイトメーターで分析した。FlowJoX、Excell及びGraphPadPrismを使用してデータを分析した。全Ｔ細胞並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団について経時的に観察されたＴ細胞の活性化及び増殖が決定された。

この実験は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が循環Ｔ細胞に影響を与え、全ての対照処置群と比較して、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ６９＋）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６９＋）及び増殖性Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｋｉ６７＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｋｉ６７＋）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｋｉ６７＋）の頻度を増加させ、また抗ＯＸ４０対照又は抗ＣＤ１３７対照単独又はアイソタイプ対照のいずれかと比較して、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋）の頻度を増加させることを示した。活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋）の頻度の類似の増加が、抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７対照ｍＡｂの組み合わせで処置された対照群で観察された。これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２もＴ細胞の活性化の増加を示したインビトロの結果と一致し、Ｔ細胞の増殖に関与するサイトカインであることが知られているＩＬ－２の産生によって測定されるようであった。

１８．２ ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びその構成成分Ｆｃａｂ及びＦｃａｂ部分の薬力学的応答の比較
抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）の末梢薬力学的応答を、その構成部分、特に、モック（４４２０）ｍＡｂ^２形式（FS20m-232-91AA/4420）のFS20m-232-91AA Ｆｃａｂ及びＦｃａｂ（G1AA/Lob12.3）を含有しない単一特異的抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ（G1AA/Lob12.3）を単剤若しくは組み合わせて又はＣＴ２６腫瘍モデルにおけるアイソタイプ対照（G1AA/4420）と比較した。

実施例１７．２に記載された同じ試験において、ＣＴ２６細胞接種後１６日目に、血液サンプルを１群あたり１０匹のマウスの尾静脈から採取し、ＥＤＴＡ含有チューブに回収した。実施例１８．１に記載された同じ方法に従って、赤血球を溶解し、残りの細胞を生存率色素で染色し、続いて、抗Ｋｉ６７及び抗Ｆｏｘｐ３を除いて、Ｆｃブロックの存在下で実施例２２．２．２に記載の試薬で表面染色した（抗マウスＣＤ４クローンＧＫ１．５（BD Bioscience、カタログ番号563790）を抗ＣＤ４クローンＲＭ４－５の代わりに本試験に使用した）。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、一晩eBioscience Foxp3染色キット（eBioscience）で透過処理した。その後、細胞を抗Ｋｉ６７及び抗Ｆｏｘｐ３抗体で細胞内染色した。洗浄後、BDFortessaフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。データ分析を、FlowJo、Excel及びGraphPad Prism7ソフトウェアを使用して実行した。

FS20m-232-91AA/Lob12.3は、アイソタイプ対照処置と比較して、血液中のＫｉ６７^＋ＣＤ４^＋エフェクター（総ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－細胞の％として）及びＫｉ６７^＋ＣＤ８^＋末梢Ｔ細胞（総ＣＤ８^＋細胞の％として）の割合を有意に増加させることが観察された。抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ及びFS20m-232-91AA/4420モックｍＡｂ^２を単剤又は組み合わせて、アイソタイプ対照処置マウスと比較して、増殖性Ｋｉ６７^＋ＣＤ４^＋エフェクター及びＫｉ６７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のレベルの有意な増加を誘導することができた。ただし、FS20m-232-91AA/Lob12.3の投与後のＫｉ６７^＋ＣＤ８^＋増殖性Ｔ細胞のレベルの増加は、抗マウスＣＤ１３７ ｍＡｂ単独、FS20m-232-91AA/4420モックｍＡｂ^２単独又はそれらの組み合わせのいずれかについて観察されたものよりも有意に大きかった。

結論として、これらの発見は、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２が、Ｋｉ６７^＋ＣＤ８^＋増殖性Ｔ細胞の頻度の増加に関して、その構成成分Ｆｃａｂ及びＦａｂ部分又はいずれかの構成部分のみと比較して、末梢薬力学的応答の増強を誘導できたことを示す。

実施例１９ － ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の作用機序
ＣＴ２６同系腫瘍モデルを、インビボでの抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性の作用機序（ＭＯＡ）を決定するために使用した。ＣＴ２６同系腫瘍モデルは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の両方に感受性であることが以前に示されており（Sadun et al., 2008）、ＣＴ２６腫瘍から分離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を発現すると期待される。抗体試験を表３０に詳述する。

ＬＡＬＡ変異を有する又は有しないｍＡｂ^２（それぞれFS20m-232-91AA/Lob12.3及びFS20m-232-91/Lob12.3）の、血液又は腫瘍中のＴ細胞の増殖を活性化及び増殖する能力を、アイソタイプ対照ｍＡｂ G1/4420（抗ＦＩＴＣ）、単剤ｍＡｂ G1/OX86（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＯＸ４０対照）又はG1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＣＤ１３７対照）、G1/OX86プラスG1/Lob12.3の組み合わせ又はG1AA/OX86（ＬＡＬＡ変異含有抗ＯＸ４０ ｍＡｂ）プラスG1AA/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異含有抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ）の組み合わせと比較した。

８～１０週齢及び体重約２０ｇの各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには５匹のマウスがいた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２６３８）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。ＣＴ２６細胞（約３～５×１０^６）を－１５０℃の保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ内の１０％ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含む２０ｍｌ ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用して、マウスを麻酔し、各動物に１×１０^６細胞を左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞接種後１０日目に、マウスは、健康状態を観察し、カリパスを使用して腫瘍を測定し、腫瘍体積に基づいてマウスを試験コホートにランダム化した。この時点で腫瘍を有しないマウスは全て試験から除外された。

注射された抗体を、注射から２４時間以内にＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、２００μ／マウスに注射し、２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。腫瘍接種後１０日目、１２日目及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射により、抗体をマウスに投与した。腫瘍体積の測定は、カリパスを使用して週３回行われ、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。３回目の投与から７日後（腫瘍接種後２１日目）にマウスを安楽死させ、解剖により腫瘍を分離し、心臓穿刺により血液を回収した。

腫瘍を、Tumour dissociation kit、マウス（Miltenyi 130-096-730）を製造元の指示に従って使用して解離した。簡単に説明すると、１腫瘍あたり２．３５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０、１００μｌ酵素Ｄ、５０μｌ酵素Ｒ及び１２．５μｌ酵素Ａを添加して酵素ミックスを調製し、各腫瘍をgentle MACS Cチューブに入れ、そのチューブをGentle MACS Dissociator上に置き、ｍ＿ＴＤＫ＿１プログラムで実行し、振とう（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。得られた細胞懸濁液を７０μＭセルストレーナー（Corning カタログ番号３５２３５０）を使用して濾し、遠心分離（＠１５００ｒｐｍで１０分間）し、ＰＢＳで１回洗浄し、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。

血液は、心臓穿刺によりＥＤＴＡ含有チューブに回収された。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscienceカタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。

腫瘍及び血液から分離された細胞を、以下の抗体パネル及び試薬を使用してフローサイトメトリー用に染色した（Ｓｔａｉｎ１）。全てeBioscienceから提供された、ＣＤ４－Ｅ４５０（クローンＧＫ１．１）、Ｋｉ６７－ＦＩＴＣ（クローンＳｏｌＡ１５）、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（ＦＪＫ－１６ｓ）、ＣＤ６９－ＰＥＣｙ５（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＣＤ３－ＰＥＣｙ７（クローン１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ８－ＡＰＣ（クローン５３－６．７）、固定可能生存率色素７８０及びＦｃブロック（クローン９３）並びにBD Bioscienceから提供されたＣＤ４５－Ｖ５００（クローン３０－Ｆ１１）。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後１００μｌの抗体ミックス１（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscienceカタログ番号00-5523-00）で透過処理した。簡単に説明すると、２００μｌの固定液を各ウェルに加え、４℃の暗所で一晩放置した。次に、細胞を２００μｌの透過処理緩衝液で洗浄した。次に、細胞を再度回転させ、Ｆｃブロック（全て１：１００希釈）の存在下において、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞をBD FACS CantoIIサイトメーターで分析した。

FlowJoX、Excell及びGraphPadPrismを使用してデータを分析した。群を比較するための統計分析を、一元配置分散分析を使用して実行し、続いてGraphPadPrismソフトウェアパッケージを使用して、各ペアのテューキーの多重比較検定を実行した。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２又は対照処置後にＣＴ２６細胞を接種したマウスの血液又は腫瘍におけるＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）、増殖性Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｋｉ６７＋）及びＴ調節細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）の頻度を測定した。FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２は、アイソタイプ対照（Ｇ１／４４２０）と比較して、増殖性Ｔ細胞の統計的に有意な増加と血中のＴｒｅｇの増加を示した。腫瘍内では、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２がＴ細胞の頻度を増加させる傾向があった。

抗ＣＤ１３７抗体G1/Lob12.3及びこの抗ＣＤ１３７抗体と抗ＯＸ４０抗体G1/OX86との組み合わせで処置したマウスでは、アイソタイプ対照による処置と比較して腫瘍内のＴｒｅｇのレベルが統計的に有意に減少した。しかし、ＬＡＬＡ変異が抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ１３７抗体に導入された場合、これらの抗体の組み合わせ（G1AA/OX86プラスG1AA/Lob12.3）による処置は、腫瘍のＴｒｅｇのレベルをもはや低下しない。ＬＡＬＡ変異含有ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）は、Ｔｒｅｇのレベルを低下させなかったが、ＬＡＬＡ変異を有しないＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２野生型ヒトＩｇＧ１バージョン（FS20m-232-91/Lob12.3）は、腫瘍内のＴｒｅｇのレベルの統計的に有意な減少を示した。

これらのデータは、ヒトＩｇＧ１へのＬＡＬＡ変異の導入が、Ｔｒｅｇを枯渇させるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の能力を抑制し、従って、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のヒトＩｇＧ１ＬＡＬＡ変異体（FS20m-232-91AA/Lob12.3）で観察される抗腫瘍活性がＴｒｅｇ枯渇とは無関係であることを示す。さらに、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２は、評価された時点で末梢において、Ｔ細胞増殖を発生させることが観察され、これは抗腫瘍免疫応答を誘発するＴ細胞のプールを拡大すると予想される。これらのデータは、ヒトＩｇＧ１ＬＡＬＡ含有ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が、ｍＡｂ^２のＦｃγ受容体との係合がない場合、癌における抗腫瘍活性の可能性があることを示唆し、これは、腫瘍に蔓延することも又はしないこともあり得る。

実施例２０ － Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
Ｂ１６－Ｆ１０同系マウス大腸腫瘍モデルを、抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）の抗腫瘍活性をインビボで試験するために使用した。この試験では、抗体G1/4420を対照として使用した。Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルは、ＯＸ４０又はＣＤ１３７アゴニスト抗体に感受性があることはこれまで示されていない（Hirschhorn-Cymerman et al., 2009；Wilcox et al., 2002）。ただし、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍から分離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を発現すると期待される。

８～１０週齢及び体重約２０ｇの各Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間順応させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートは１０匹のマウスがいた。Ｂ１６－Ｆ１０結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－６４７５）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。

Ｂ１６－Ｆ１０細胞を－１５０℃の保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ内の１０％ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含む２０ｍｌ ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。各動物は、左脇腹に皮下注射された１×１０^６細胞を受けた。腫瘍細胞接種後の７～８日目に、この時点で腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えるために、２００μｌ／マウスの体積で、ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で注入される前に、前述のように抗体を分析し、不純物を確認した。各マウスは、腫瘍接種後８日目、１０日目及び１２日目に腹腔内（ＩＰ）注射により抗体を投与された。腫瘍体積は、（実施例１７に記載されているように）カリパスを使用して測定することによって決定され、その日に予定されている任意の薬物投与が行われた。

腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的なエンドポイントに達した時点でマウスを犠牲にした。腫瘍増殖の統計的な分析は、実施例１７に記載された混合モデル統計分析を使用して実施された。試験結果を図１１に示す。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）は、対照抗体（G1/4420）を注射した対照動物と比較して、顕著な抗腫瘍活性を示した。このモデルは、ＯＸ４０又はＣＤ１３７刺激に鈍感であることが以前に示されているため、これは驚くべきことである（Hirschhorn-Cymerman et al., 2009；Wilcox et al., 2002）。重要なことに、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２において観察された活性は、ＬＡＬＡ変異の存在下にあり、したがって腫瘍のＴｒｅｇ枯渇に依存していなかった。これは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２のＭＯＡが、Ｂ１６－Ｆ１０などの免疫浸潤レベルが低いモデルでも、様々な同系腫瘍モデルで抗腫瘍活性をもたらすことを示している。

実施例２１ － ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の分析特性及び予備的安定性評価
２１．１ ｍＡｂ^２の発現、精製及び分析特性
ｍＡｂ^２FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14はラボスケールで製造され、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した標準的な分析方法によって特徴付けられた。

ｍＡｂ^２をコードするＤＮＡ配列は、ＨＥＫ２９３－６Ｅ（カナダ国立研究評議会）で一過性に発現した。５日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン－Ａプレパックカラム（両方GE Healthcare）で精製した。カラムの平衡化は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ ＮａＣｌで行い、続いて、回収した細胞培養液をロードした。次に、樹脂を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ ＮａＣｌを使用して洗浄し、これに続いてｐＨ３．５の緩衝液を使用してｍＡｂ^２を溶出した。ｍＡｂ^２は、ＰＤ－１０脱塩カラム（GE Healthcare、製品番号17085101）を使用して、調製前緩衝液に緩衝液交換した。

移動相として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８を使用し、TSK-GEL SUPERSW 3000 ４．６ｍｍＩＤ×３０．０ｃｍカラム（Tosoh Bioscience）を装備したAgilent１１００シリーズＨＰＬＣシステム（Agilent）でＳＥ－ＨＰＬＣを行った。単量体の割合の定量化を、Chemstationソフトウェア（Agilent）を使用して実施した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析の結果は表３１に要約する。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル及び１ｘＭＯＰＳ分離緩衝液（Thermo Fisher Scientific）を使用して、基本的に製造元の指示に従って実施した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合、変性ステップ前にサンプルをアルキル化試薬であるＮ－エチルマレイミド（Sigma-Aldrich）に曝露し、２－メルカプトエタノールを変性混合物から除外した。タンパク質バンドは、Coomassie InstantBlue（Expedeon）によって視覚化された。

ＳＥ－ＨＰＬＣで測定した場合、５つのｍＡｂ^２は全て、９５％を超える単量体純度でプロテインＡを精製した後、好ましい分析特性パラメーターを示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、組換えＩｇＧ１に典型的なタンパク質バンドパターンが明らかになった。したがって、非還元条件下では、単一のバンドが予想される分子量に対応する領域に移動し、還元条件下では、重鎖及び軽鎖にそれぞれ対応する２つのバンドが、５１ｋＤａ及び２８ｋＤａの分子量マーカーの近くに移動した。フラグメントは観察されなかった（データは示さず）。

２１．２ ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の予備的安定性評価
ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及びFS20-22-49AA/FS30-35-14の安定性について予備的評価が実施された。予備的安定性評価に入る前に、ｍＡｂ^２は、調整前緩衝液で平衡化されたSuperdex HiLoad26/600 200pgカラム（GE Healthcare）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製された。安定性サンプルを５℃で保存し、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を使用した標準的な分析方法により２週間後及び４週間後に分析した。

移動相として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８を使用し、TSK-GEL SUPERSW 3000 ４．６ｍｍＩＤ×３０．０ｃｍカラム（Tosoh Bioscience）を装備したAgilent１１００シリーズＨＰＬＣシステム（Agilent）でＳＥ－ＨＰＬＣを行った。単量体含有量のデータ取得及び定量化を、Chemstationソフトウェア（Agilent）を使用して実施した。結果は表３２に要約する。

５℃で４週間の保存の後、試験された全てのｍＡｂ^２についてＳＥ－ＨＰＬＣにより測定された単量体含有量は、出発物質（Ｔ＝０）と同等（±０．９％以内）のままであった。したがって、試験された全てのｍＡｂ^２は、良好な安定性プロファイルを示した。

ＣＥ－ＳＤＳ分析を、製造元の推奨に従い、2100 Bioanalyzerキャピラリー電気泳動システム（Agilent）で実施した。ＣＥ－ＳＤＳを還元するために、ＤＴＴを添加し、サンプルを７０℃で５分間変性させた。重鎖及び軽鎖材料のデータ取得及び割合定量化は、2100 Expertソフトウェア（Agilent）を使用して実施した。純度の割合は、重鎖材料の割合及び軽鎖材料の割合の合計として計算された。分析の結果は表３３に要約する。

還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによる重鎖材料及び軽鎖材料の割合の合計として決定された、試験された全てのｍＡｂ^２の純度も出発物質と同等（±１．０％以内）のままであった。したがって、再度、全ての試験されたｍＡｂ^２が良好な安定性を示した。

実施例２２ － 抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２活性
抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境の細胞でのＰＤ－Ｌ１発現は、ＰＤ－１の相互作用を介したＴ細胞の活性化、増殖、エフェクター及び細胞傷害性機能を阻害することが知られている。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１のいずれかに対するモノクローナル抗体を使用したこの相互作用の遮断は、いくつかの種類の癌を有する患者の生存率が向上することが示されている。

ただし、一部の腫瘍では、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＰＤ－１抗体はほとんど又はまったく効果がない。本発明者らは、インビトロ及びインビボ試験において、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及び抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ－１抗体との組み合わせを試験して、組み合わせの使用がＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体単独の使用と比較して、改善された効果をもたらすことができるかどうかを理解した。

２２．１ ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）アッセイでＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１遮断と組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性
ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性は、上記の実施例１２に記載したように第１のシグナルとして、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）スーパー抗原を使用して、Ｔ細胞活性化アッセイを試験した。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の相互作用の遮断と組み合わせたＴ細胞刺激活性に対するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の効果を試験するために、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１遮断抗体をＳＥＡアッセイにおいてＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２と組み合わせた。

ＳＥＡアッセイで使用される抗体及びｍＡｂ^２を以下の表３４に列挙した。G1/4420（抗ＦＩＴＣ）とFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２との組み合わせ、G1AA/S1（抗ＰＤ－Ｌ１）、G1AA/5C4（抗ＰＤ－１）単独又はFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２と組み合わせて試験した。Ｔ細胞活性化の尺度としてインターロイキン－２（ＩＬ－２）産生を使用した。

５Ｃ４及びＹＷ２４３．５５．Ｓ１（Ｓ１）抗体の可変ドメイン配列は、それぞれ米国特許第８，００８，４４９Ｂ２号及び米国特許出願公開第２０１３／００４５２０２Ａ１号にも開示されている。

ＰＢＭＣを分離し、ＳＥＡアッセイを上記の実施例１２．１に記載したように本質的に実施した。G1/4420をアイソタイプ対照として使用し、このアッセイでは架橋剤を使用しなかった。

抗ＰＤ－Ｌ１（G1AA/S1）又は抗ＰＤ－１抗体（G1AA/5C4）のいずれかと組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２（FS20-22-49AA/FS30-10-16）の活性は、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２プラスアイソタイプ対照（G1/4420）の活性或いはＰＤ－Ｌ１抗体（G1AA/S1）若しくはＰＤ－１抗体（G1AA/5C4）又はアイソタイプ対照（G1/4420）単独の活性と比較した。ＳＥＡアッセイにおいて観察されたＩＬ－２放出のＥＣ_５０値及び最大応答を、表３５に示す。図１２Ａ及びＢは、ＳＥＡアッセイについてＩＬ－２放出のプロットを示す。

予想通り、アイソタイプ対照（G1/4420）では活性は観察されなかった。同様に、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１単独間の相互作用の遮断は、このアッセイでは活性がなかった。しかし、ＯＸ４０及びＣＤ１３７受容体の刺激（ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２による）と、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の相互作用の遮断（抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ－１抗体のいずれかによる）との組み合わせは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２単独で見られるものを超える、最大ＩＬ－２産生によって測定されるＴ細胞の最大活性の増加がもたらされた。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた場合に見られるＴ細胞の最大の活性の増加は、類似であった。

２２．２ ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２及びＰＤ－１アンタゴニストの投与による抗腫瘍活性及び薬力学的応答
ＣＴ２６マウス腫瘍モデルを使用して、FS20m-232-91AA/Lob12.3及びＰＤ－１アンタゴニスト抗体（クローンＲＭＰ１－１４マウスＩｇＧ１）の組み合わせの抗腫瘍活性及び薬力学的応答をいずれかの単剤と比較して確立した。

２２．２．１ 抗腫瘍活性の評価
実施例１７に記載された同じプロトコルに従って、８～１０週齢で、約２０ｇの体重のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を試験開始のために調製し、ＣＴ２６結腸癌細胞に接種した。腫瘍細胞接種後の１０日目、腫瘍を測定し、腫瘍を有しないマウスを試験から除外し、残りのマウスを１群あたり１５匹の動物で４つの処置群（表３６）にランダム化した。動物に以下を腹腔内注射した：（１）１ｍｇ／ｋｇのG1AA/4420及び１０ｍｇ／ｋｇのmIgG1/4420アイソタイプ（絶対抗体、クローン４４２０、カタログ番号Ab00102-1.1）対照抗体の組み合わせ、（２）１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ－１抗体（絶対抗体、クローンＲＭＰ１－１４マウスＩｇＧ１、カタログ番号Ab00813-1.1）、（３）１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２又は（４）１０ｍｇ／ｋｇ抗マウスＰＤ－１抗体及びＰＢＳ中の１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２。動物にG1AA/4420又はFS20m-232-91AA/Lob12.3の腹腔内（ＩＰ）注射を２日ごとに１回を合計３回、腫瘍接種後１０日目から開始した。mIgG1/4420又は抗マウスＰＤ－１抗体を腫瘍接種後１０日目から４日ごとに計４回ＩＰ投与した腫瘍体積は、カリパス測定により決定された。（実施例１７に記載されたように）。細胞接種後６０日目で試験を終了し、腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的エンドポイントに達した時点で、動物を試験から除外した。処置群、試験された分子、用量及び投与スケジュールを表３６に要約する。

図１３Ａ－Ｄに示すように、抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体及び１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の組み合わせは、試験終了時に完全な腫瘍退縮反応（腫瘍体積が≦６２．５ｍｍ^３と定義される）を示した動物の割合が最も高く、１５匹中７匹（４７％）の結果となった（図１３Ｄ）。アイソタイプ対照抗体（図１３Ａ）、単剤抗ＰＤ－１抗体（図１３Ｂ）及び１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3（図１３Ｃ）は、試験終了時にそれぞれ０％、０％及び７％の腫瘍退縮が見られた。

生存分析は、抗ＰＤ－１抗体とFS20m-232-91AA/Lob12.3との組み合わせがイソタイプ対照抗体（対数順位（マンテル・コックス）検定、ｐ＜０．０００１）と比較して統計的に有意な延命効果をもたらしたことを示した（図１３Ｅ）。アイソタイプ対照抗体と比較して、いずれの単剤処置では有意な生存率の差は観察されなかった。これらの結果は、このモデルにおいて、アンタゴニストによるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害経路の遮断及び抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２によるＯＸ４０及びＣＤ１３７の二重アゴニスト作用が、単剤と比較して、抗腫瘍活性を高め、延命効果をもたらすことができたことを示す。

２２．２．２ 末梢薬力学的応答の評価
実施例２２．２．１に記載された試験では、FS20m-232-91AA/Lob12.3に対する薬力学的応答を調節する抗ＰＤ－１アンタゴニストの能力も調べられ、単剤処置と比較された。投与開始から６日後（腫瘍細胞接種から１６日後）に、処置群１、２、３及び５からランダムに選択した６匹のＣＴ２６担癌マウスの尾静脈からＥＤＴＡ含有チューブに血液を回収した（表３６）。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（Miltenyi Biotech、#130-094-183）で２回溶解した。細胞を、全てBD Bioscienceから提供された試薬ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（クローンＲＭ４－５）、ＣＤ８－ＢＵＶ７３７（クローン５３－６．７）、ＣＤ４４－ＢＶ５１０（クローンＩＭ７）及びＣＤ３ｅ－ＢＶ７８６（クローン１４５－２Ｃ１１）、全てeBioscienceから提供されたＣＤ６９－ＦＩＴＣ（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン２９Ａ１．４）、ＰＤ－１－ＡＰＣ（クローンＪ４３）、ＣＤ４５－Ａｌｅｘａ７００（クローン３０－Ｆ１１）及び固定可能生存率色素７８０、Biolegendから提供されたＣＤ６２Ｌ－ＢＶ４２１（クローンＭＥＬ－１４）を用いて、Ｆｃブロック（eBioscience、カタログ番号14-0161-86、１：５０）の存在下で４℃３０分間フローサイトメトリー分析のために染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscienceカタログ番号00-5523-00）で一晩、透過処理した。細胞を、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体（Ｋｉ６７－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＳｏｌＡ１５）及びＦｏｘｐ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＦＪＫ－１６ｓ、両方ともeBioscienceから提供された）を用い、１００μＬの透過性緩衝液に再懸濁し、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳプラス０．５％ ＢＳＡに再懸濁した。次に、細胞をBD Fortessaサイトメーターで分析した。データ分析を、FlowJo、Excel及びGraphPad Prism7ソフトウェアで実施した。

増殖するＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（総ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（総ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋）及びＫｉ６７＋ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞（総ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＮＫｐ４６＋）の頻度は、上記されているように、フローサイトメトリー分析によって決定された。アイソタイプ対照と比較して、FS20m-232-91AA/Lob12.3は、以前の結果（実施例１８）を確認した増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋及びＫｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及び増殖Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞の統計的に有意な増加を誘導した（対比較マン・ホイットニーノンパラメトリック検定；３つの免疫細胞集団全てについて、ｐ≦０．００５）。単剤抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体は、アイソタイプ対照と比較して、３つの免疫細胞集団に顕著な影響を及ぼさなかった。１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3及び抗ＰＤ－１抗体の組み合わせは、単剤又はアイソタイプ対照と比較して、増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＫｉ６７＋ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞のレベルが統計学的に有意に高かった（FS20m-232-91AA/Lob12.3単独（ｐ≦０．０５）と比較した増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルに対する組み合わせの効果を除き、全ての統計的に有意な比較に対してｐ≦０．００５であった）。

単剤抗ＰＤ－１抗体、ｍＡｂ^２ FS20m-232-91AA/Lob12.3及び抗PD-1抗体及びFS20m-232-91AA/Lob12.3の組み合わせによる末梢血ＰＤ－１発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）並びにＮＫ細胞に対する効果についても、上記のようにフローサイトメトリー分析により決定した。単剤抗ＰＤ－１抗体及びFS20m-232-91AA/Lob12.3は、アイソタイプ対照と比較して、ＰＤ－１発現ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増加させ、抗ＰＤ－１単独と比較して、FS20m-232-91AA/Lob12.3処置後のＰＤ－１＋細胞の頻度の中央値が高くなった。FS20m-232-91AA/Lob12.3単独では、アイソタイプ対照と比較して、ＰＤ－１＋ＮＫ細胞の頻度が増加した。組み合わせは、単剤又はアイソタイプ対照いずれかと比較して、ＰＤ－１発現ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＮＫ細胞ではない）のレベルが統計学的に有意に高かった（対比較マン・ホイットニーノンパラメトリック検定；FS20m-232-91AA/Lob12.3単独（ｐ≦０．０５）と比較したＰＤ－１発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に対する組み合わせの効果を除き、全ての統計的に有意な比較に対して、ｐ≦０．００５）。

抗腫瘍活性評価で得られた知見と一致して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害経路をアンタゴニストにより同時遮断し、ＯＸ４０及びＣＤ１３７を抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２により二重アゴニスト作用させることで、抗腫瘍免疫を促進するための組み合わせアプローチの活用を支持する増殖Ｔ細胞及びＮＫ細胞の薬力学的調節の増強をもたらした。

結論として、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を遮断しながら、ＯＸ４０及びＣＤ１３７もアゴナイジングすると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単独を遮断するよりも効果が増大する。特に、抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２と抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせは、抗体単独の一つの応答よりも、使用よりも改善された効果をもたらした。実施例２２．１に記載されたＳＥＡアッセイにおいて、試験した抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１抗体のいずれも、０．１４７４ｎＭのＥＣ_５０を有した抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２と比較して、いかなる活性も有しなかった。しかし、抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかと組み合わせて試験した場合、ＥＣ_５０値は、それぞれ０．２３７３ｎｍ及び０．５９６１ｎＭであった。さらに、いずれかの組み合わせによって産生されたＩＬ－２の最大応答は、抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２単独のそれの２倍を超えるものであった。このインビトロデータは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体では活性が観察されない系において、これらの抗体のいずれかと抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を組み合わせることで、活性が顕著に向上することを示す。

このインビトロ活性は、実施例２２．２に記載されているように、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２単独又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、インビボで試験することによってさらに支持された。この試験の結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２又は抗ＰＤ－１抗体単独（ここでは腫瘍のない動物はいなかった）と比較して、抗ＰＤ－１抗体とＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を組み合わせて処置した群から、より多くの動物が試験終了時に腫瘍がなかったことを示した。さらに、統計的に有意な延命効果も観察され（図１３Ｅ）、増殖Ｔ細胞及びＮＫ細胞の薬力学的調節は、ｍＡｂ^２又は抗ＰＤ－１抗体単独のいずれかと比較して、組み合わせ処置により増強された。

抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体について、インビトロ又はインビボ試験のいずれかで、活性は観察されなかったが、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を併用投与した場合、顕著な向上が観察された。これは、そのような抗体と組み合わせたＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２が抗腫瘍活性効果の増強をもたらし、このような組み合わせは、応答性がない、例えば難治性若しくは抵抗性又は抗ＰＤ－１抗体若しくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体単剤療法後に再発した抗腫瘍の処置に適し得ることを示している可能性がある。

実施例２３ － ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の用量依存性、抗腫瘍活性及びＣＴ２６腫瘍細胞との再チャレンジに対する防御免疫記憶の確立
ＣＴ２６同系マウス結腸直腸腫瘍モデルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２の用量及び抗腫瘍活性間の関係を評価するために、０．１から１０ｍｇ／ｋｇで５つの異なる用量レベルを評価した。

実施例１７に記載された同じプロトコルに従って、８～１０週齢で、約２０ｇの体重の各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）に、ＣＴ２６結腸癌細胞を各動物の左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞接種後の１０日目、腫瘍を測定し腫瘍を確立された腫瘍を有しない動物は試験から除外された。残りのマウスを、１群あたり２５匹の動物で６つの処置群にランダム化した。

アイソタイプ対照抗体（G1AA/4420）及びＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）を濾過し、注射前にＰＢＳで希釈した。各動物に、１回の投与あたり希釈抗体２００μｌ容量を腹腔内投与し、２０ｇのマウスについて１回の用量１０ｍｇ／ｋｇのG1AA/4420又は０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇFS20m-232-91AA/Lob12.3の最終用量を与えた。注射は、腫瘍接種後１０日目から開始して、合計３回の用量にわたり、２日（Ｑ２Ｄ）ごとに１回実施した。腫瘍体積は、カリパス測定により実施例１７に記載されているように決定した。細胞接種後６７日めで試験を終了し、腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的エンドポイントに達した時点で、動物を試験から除外した。

異なる用量レベルでG1AA/4420又はFS20m-232-91AA/Lob12.3のいずれかで処置された個々の動物について経時的な腫瘍体積を図１４Ａに示す。０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の用量レベルは、１群あたりそれぞれ４％（１／２５）、４％（１／２５）、８％（２／２５）及び４％（１／２５）の動物において、完全な腫瘍退縮（６０日目に≦６２．５ｍｍ^３として定義される）を導いた。アイソタイプ対照の動物及び０．１ｍｇ／ｋｇサロゲートｍＡｂ^２群は、いずれも完全な腫瘍退縮を経験しなかった。

FS20m-232-91AA/Lob12.3及びG1AA/4420で処置した群間の平均腫瘍増殖速度の対比較は、実施例１７で記載した混合モデル統計分析を使用して実施し、アイソタイプ対照と比較して、試験した全ての用量レベルで、（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）統計的に有意差（ｐ＜０．０１）が観察された。（表３７）。FS20m-232-91AA/Lob12.3は、０．１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇで投与した場合、用量依存的に平均腫瘍増殖速度（ＴＧＲ）を低下させた（平均Ｌｏｇ（ＴＧＲ）は、それぞれ０．２５５５２９から０．１５６７６７）。３ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の平均ＴＧＲは、１ｍｇ／ｋｇ用量レベルについての平均ＴＧＲと統計的に差はなかった（ｐ＝０．１８）。ただし、用量レベルを１０ｍｇ／ｋｇの増加は、３ｍｇ／ｋｇの用量群と比較してＴＧＲを速めた（ｐ＜０．００１）。

生存分析は、試験した全ての用量レベルでのFS20m-232-91AA/Lob12.3が、対数順位（マンテル－コックス）検定を使用したアイソタイプ対照と比較して統計的に有意な延命効果をもたらしたことを示した（図１４Ｂ）。１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群の比較は、生存に統計的な差を示さなかった。

結論として、腫瘍体積及び生存データは、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２をＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて、インビボで抗腫瘍活性を発生させ得ることを、実施例１７の知見を支持する図１４Ａ及び表３７に示す。さらに、観察された抗腫瘍活性は、０．１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇへ用量依存的に増加しており、試験された高い用量レベル（３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で維持された。

ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２がＣＴ２６腫瘍細胞に対して、防御免疫記憶を誘導できるかどうかを試験するために、上記の本実施例の用量設定試験から完全な腫瘍退縮（完全奏効）を経験した動物に、第１の細胞接種後８４日目に１×１０^５のＣＴ２６細胞を皮下に再接種した。処置ナイーブ非担癌ＢＡＬＢ／ｃマウスにも、対照群としてＣＴ２６細胞を接種した。上記のように腫瘍体積をモニターした。第１の細胞接種後１３７日目で試験を終了し、腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的エンドポイントに達した時点で、動物を試験から除外した。試験の終わりに、対照群のマウスの０％（０／４）が生き残ったが、対照的に、完全奏功の動物の１００％（４／４）が生き残った。これらの結果は、マウスのサブセットにおいて、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２が、ＣＴ２６細胞での再チャレンジに対する防御免疫記憶の完全な腫瘍退縮及び確立を誘発できることを示す。

実施例２４ － ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ｍＡｂ^２用量依存性、薬力学的応答
ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）の用量レベル、投与頻度、末梢性薬力学的応答との関係を、ＣＴ２６同系マウス結腸直腸腫瘍モデルを用いて評価した。１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの異なる用量レベルのFS20m-232-91AA/Lob12.3を単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射又は１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3を３回のｉ．ｐ．注射を２日に１回（Ｑ２Ｄ）投与した場合を比較した。FS20m-232-91AA/Lob12.3の薬力学的応答、具体的には、循環Ｔ細胞に対するサロゲートｍＡｂ^２の効果を、実施例１８に記載したように、血液中の免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー分析によって評価した。

実施例１７に記載された同じプロトコルに従って、８～１０週齢で、約２０ｇの体重の各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）に、ＣＴ２６結腸癌細胞を各動物の左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞接種後の１０日目、腫瘍を測定し腫瘍を確立された腫瘍を有しない動物は試験から除外された。残りのマウスを１群あたり６匹の動物で６つの処置群にランダム化した。

アイソタイプ対照抗体（G1AA/4420）及びOFS20m-232-91AA/Lob12.3を濾過し、注射前にＰＢＳで希釈した。各動物に、１回の投与あたり希釈抗体２００μｌ容量を腹腔内投与し、２０ｇのマウスについて１回の用量３０ｍｇ／ｋｇのG1AA/4420又は１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の最終用量を与えた。腫瘍接種後１０日目から開始して、動物に、G1AA/4420（３０ｍｇ／ｋｇ）若しくはFS20m-232-91AA/Lob12.3（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ若しくは３０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射又はFS20m-232-91AA/Lob12.3（１用量あたり１ｍｇ／ｋｇ）の合計３回の投与を２日に１回（Ｑ２Ｄ）与えた。腫瘍体積は、カリパス測定により実施例１７に記載されているように決定した。動物は、投与開始から６日後（細胞接種後１６日目）に試験から除外した。

血液は、心臓穿刺によりＥＤＴＡ含有チューブに回収した。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（Miltenyi Biotech、#130-094-183）で２回溶解した。細胞を、Ｆｃブロック（eBioscience、カタログ番号14-0161-86）の存在下において、全てBD Bioscienceから提供されたＣＤ４－ＢＵＶ３９５（クローンＲＭ４－５）、ＣＤ８－ＢＵＶ７３７（クローン５３－６．７）、ＣＤ４４－ＢＶ５１０（クローンＩＭ７）及びＣＤ３ｅ－ＢＶ７８６（クローン１４５－２Ｃ１１）；全てeBioscienceから提供されたＣＤ６９－ＦＩＴＣ（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＮＫｐ４６－ＰＥ（クローン２９Ａ１．４）、ＣＤ４５－Ａｌｅｘａ７００及び固定可能生存率色素７８０；並びにBiolegendによって提供されたＣＤ６２Ｌ－ＢＶ４２１（クローンＭＥＬ－１４）の試薬を用いてフローサイトメトリー分析のために染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscience、カタログ番号00-5523-00）で一晩、透過処理した。細胞は、Biolegendから提供された抗Ｇｚｍｂ、抗Ｋｉ６７及び抗Ｆｏｘｐ３抗体（Ｇｚｍｂ－ＡＦ６４７（クローンＧＢ１１）及び両方ともeBioscienceから提供されたＫｉ６７－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＳｏｌＡ１５）及びＦｏｘｐ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＦＪＫ－１６ｓ）を用い、１００μｌ透過処理緩衝液に再懸濁し、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳプラス０．５％ＢＳＡで再懸濁した。次に、細胞をBD Fortessaサイトメーターで分析した。データ分析を、FlowJo、Excel及びGraphPad Prism7ソフトウェアを使用して実行した。

初回投与から６日目の末梢血中のＫｉ６７＋ＣＤ８＋（全ＣＤ８＋のうち）及びＫｉ６７＋ＣＤ４＋（全ＣＤ４＋のうち）増殖Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリー分析により測定した。１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の単回投与では、アイソタイプ対照と比較して、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋増殖Ｔ細胞の頻度が統計学的に有意に増加した。１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3の単回投与では、アイソタイプ対照と比較して、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋増殖Ｔ細胞の頻度が統計学的に有意に増加した。

Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋増殖Ｔ細胞は、１ｍｇ／ｋｇの単回投与レベルで最も高い傾向があり、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋増殖Ｔ細胞は１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与レベルで最も高い傾向があった。３０ｍｇ／ｋｇの用量レベルの増加は、アイソタイプ対照と比較して、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋及びＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に顕著な影響はなかった。注目すべきことに、どの用量レベルでも明白な臨床所見又は体重減少は観察されなかった。

複数回投与群（１ｍｇ／ｋｇのFS20m-232-91AA/Lob12.3 Ｑ２Ｄ ３回投与時）及び１ｍｇ／ｋｇ単回投与群を比較したところ、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋及びＫｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞レベルに統計的有意差は認められなかった（対応のないマン・ホイットニー検定、それぞれｐ＝０．４８４８、ｐ＝０．０９３１）。このデータは、少なくともこの試験で評価された６日間以内の複数回投与が、末梢Ｋｉ６７＋薬力学的調節に追加の効果をもたらさなかったことを示唆する。

実施例１８の結果と一致して、この実験は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２が循環Ｔ細胞に影響を及ぼし、１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、増殖（Ｋｉ６７＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を有意に増加させ、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、増殖（Ｋｉ６７＋）ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を有意に増加させることを示す。

実施例２５ － ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の薬力学的応答に対するＣＤ４Ｔ細胞枯渇の影響
ＣＤ１３７－及びＯＸ４０－を標的とする共刺激抗体の組み合わせは、マウスにおけるブドウ球菌腸毒素Ａ投与後に、いずれか一方の薬剤単独と比較して特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン拡大培養を相乗的に増強することが以前に示されている（Lee et al., 2004年）。機構的に、Lee et alが、ＣＤ４Ｔ細胞が、増強された特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する役割を果たすことを実証した。ＣＴ２６マウス腫瘍モデル及びマウスＣＤ４ Ｔ細胞枯渇抗体を用いて、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２での処置に応答して、宿主ＣＤ４ Ｔ細胞が、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増殖に必要であるか又はそれに寄与するかどうかを試験した。

実施例１７に記載された同じプロトコルに従って、８～１０週齢で、約２０ｇの体重のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）に、ＣＴ２６結腸癌細胞を各動物の左脇腹に皮下注射した。動物を７日目に処置群にランダム化し、各時点で１群あたり５匹の動物がいた。

前述のように、抗体を分析し、不純物について確認した。アイソタイプ対照抗体（G1/4420）及びＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）をＰＢＳで最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。抗マウスＣＤ４抗体（GK1.5；BioXCell、カタログ番号BE0003-1）を、ＰＢＳで最終濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈した。各動物に、１回の投与あたり希釈抗体２００μｌ容量を投与し、２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇ（G1/4420又はFS20m-232-91AA/Lob12.3）又は１０ｍｇ／ｋｇ（ＧＫ１．５）のいずれかの最終用量を与えた。G1/4420及びFS20m-232-91AA/Lob12.3は、細胞接種後１０日目、１２日目及び１４日目に腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に投与された。ＧＫ１．５のＩ．ｐ．注射は、８日目、９日目、１１日目、１３日目及び１５日目に与えられた。

細胞接種後１６日目に動物を試験から除外し、フローサイトメトリー分析のために組織を回収した。血液は、心臓穿刺によりＥＤＴＡ含有チューブに回収した。実施例１９に記載されている同じプロトコルに従って、凝固していない血液の赤血球を、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（Miltenyi Biotech、#130-094-183）で２回溶解し、製造元の指示に従って腫瘍を、腫瘍解離キット、マウス（Miltenyi Biotech、130-096-730）及びgentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotech）を使用して解離した。得られた腫瘍細胞懸濁液を、７０μｍセルストレーナー（Corning、カタログ番号352350）を使用して濾し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。脾臓からの細胞懸濁液は、脾臓を７０μｍセルストレーナー（Corning）に押し込み、赤血球溶解緩衝液（Milteny Biotech）でインキュベートすることにより、赤血球を溶解し、残りの脾臓細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁することにより調製した。

細胞を最初に、Ｆｃブロック（eBioscience、カタログ番号１４－０１６１－８６）の存在下において、全てeBioscienceによって提供された試薬ＣＤ４－Ｅ４５０（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ６９－ＰＥ－Ｃｙ５（クローンＨ１．２Ｆ３）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ８－ＡＰＣ（クローン５３－６．７）及び固定可能生存率色素７８０並びにBD Bioscienceより提供されたＣＤ４５－Ｖ５００（クローン３０－Ｆ１１）で染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscience、カタログ番号00-5523-00）で、透過処理した。細胞を、Ｆｃブロック（全て１：１００）の存在下において、（両方ともeBioscienceから提供の抗Ｋｉ６７及び抗Ｆｏｘｐ３抗体（Ｋｉ６７－ＦＩＴＣ（クローンＳｏｌＡ１５）及びＦｏｘｐ３－ＰＥ（クローンＦＪＫ－１６ｓ）を用い、１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、暗所で、４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞をBD FACS CantoIIサイトメーターで分析した。データ分析を、FlowJo、Excel及びGraphPad Prismソフトウェアを使用して実行した。処置群間の対比較を、GraphPadPrismソフトウェア内の両側マン・ホイットニー検定を使用して実行した。

FS20m-232-91AA/Lob12.3単独での処置は、アイソタイプ対照処置動物と比較して、血液と脾臓における活性化ＣＤ６９＋及び増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合及び腫瘍における増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の統計学的に有意な増加を誘導した。

FS20m-232-91AA/Lob12.3とＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇抗体ＧＫ１．５との組み合わせも、アイソタイプ対照と比較して、血中の増殖Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、統計的に有意な増加を導いたが、この増加は、FS20m-232-91AA/Lob12.3単剤処置動物で観察された増加よりも有意に低かった。増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは、FS20m-232-91AA/Lob12.3プラスＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇抗体ＧＫ１．５で処置と比較した場合、FS20m-232-91AA/Lob12.3単独での処置後の脾臓及び腫瘍組織において、統計的に有意差は認められなかった。

血液中の活性化ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導したFS20m-232-91AA/Lob12.3は、ＧＫ１．５抗体により阻害され、アイソタイプ対照群及びFS20m-232-91AA/Lob12.3プラスＣＤ４枯渇群間に統計的に有意差は認められなかった（それぞれＣＤ８Ｔ細胞全体の中央値１．６％及び２．３３％）。FS20m-232-91AA/Lob12.3単剤群及びFS20m-232-91AA/Lob12.3プラスＣＤ４枯渇群の比較は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が脾臓において（それぞれ中央値頻度２９．３％対６．４５％、枯渇を有しない及び枯渇を有する）及び腫瘍において（それぞれ中央値頻度８６．４％対６６．５％、枯渇を有する及び枯渇を有しない）、有意に低下することを示した。

実施例１８に記載したように以前の知見と一致して、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２は、活性化（ＣＤ６９＋）及び増殖（Ｋｉ６７＋）ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を増加し、本試験の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇が、このＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２媒介末梢薬力学的応答に悪影響を与えたことを示す。さらに、このデータは、抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２活性をインビボにおいて、媒介するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の潜在的な相互作用及びＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２とインビボにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の最適な共刺激に必要とされ得ると示唆する。

実施例２６ － カニクイザル細胞ベースアッセイにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の機能活性及びカニクイザルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の薬力学的応答及び忍容性
２６．１ カニクイザル細胞ベースアッセイにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の機能活性
実施例１３に記載された一次Ｔ細胞アッセイと類似した一次ＰＢＭＣアッセイを、分離された活性化Ｔ細胞の代わりにＰＢＭＣを使用して実施し、内因的に発現されたヒト及びカニクイザル受容体に対する抗ヒトFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２の相対的効力を確立した。簡単に説明すると、カニクイザル又はヒトＰＢＭＣを分離し、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２又は３日間（カニクイザル）又は４日間（ヒト）、アイソタイプ対照の漸増濃度の存在下において、Ｔ細胞活性化の尺度として機能するＩＬ－２放出で、コーティングされた抗ＣＤ３抗体を用いて刺激した。

カニクイザルのＰＢＭＣに対するｍＡｂ^２の機能活性（平均ＥＣ_５０＝０．２８±０．１５ｎＭ）を均等なヒトアッセイで観察される活性と類似していることが観察された（平均ＥＣ_５０＝０．２６±０．１ｎＭのＩＬ－２）。したがって、カニクイザルは、ｍＡｂ^２のための毒性試験のための薬理学的に関連する種であると考えられる。

２６．２ カニクイザルにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２に対する忍容性及び薬力学的応答
ヒト抗ヒトＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２ FS20-22-49AA/FS30-10-16の忍容性を評価するために、予備的な用量範囲探索試験を実施し、カニクイザルを用いたFS20-22-49AA/FS30-10-16に応答する主要白血球集団の割合の薬力学的変化の可能性及び特異的Ｔ細胞サブセットの増殖及び活性化の誘導を評価した。

簡単に説明すると、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２は、単回投与又は反復投与として静脈内注入を介してカニクイザルに投与した。体重、食餌量、臨床所見、血液学及び血液化学などの標準的な毒物学パラメーターについて、試験期間中の忍容性評価を評価した。

FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２は、臨床化学及び組織病理学の結果によって決定されるように、３０ｍｇ／ｋｇの週投与までの良好な忍容性であった。

ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデル（実施例１８）における循環Ｔ細胞に対する抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の効果を評価するための研究の所見と一致して、中枢記憶及びエフェクター記憶ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞並びにＫｉ６７及びある程度ＣＤ６９の発現の増加によって測定されたＮＫ細胞においても、細胞増殖及び活性化における薬物関連の増加が観察された。

これらの結果から、抗ヒトFS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２は、カニクイザルにおいてインビボで強力な薬理学的活性を有し、３０ｍｇ／ｋｇまでの良好な忍容性であることが強く示唆された。さらに、本試験で生成された薬力学的データは、実施例１８に記載されたマウス薬力学試験において、ＯＸ４０／ＣＤ１３７サロゲートｍＡｂ^２について観察されたデータと一致しており、ヒト癌患者において、FS20-22-49AA/FS30-10-16 ｍＡｂ^２のようなＯＸ４０及びＣＤ１３７を結合するｍＡｂ^２の抗腫瘍効果及び忍容性を期待されることについてのさらなる証拠を提供する。

実施例２７ － ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の肝臓薬理学
ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、マウスの前臨床モデルにおいて、肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を誘導し、１つのＣＤ１３７アゴニスト抗体は、臨床において１ｍｇ／ｋｇを上回る用量で肝臓毒性を誘導することが示されている（Dubrot et al., 2010；Segal et al., 2017）。したがって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の効果は、ＣＤ１３７アゴニスト抗体と比較して肝臓Ｔ細胞浸潤が増加しているかどうかを決定するために試験された。血液及び脾臓組織を対照として使用し、Ｔ細胞レベル並びにＴ細胞増殖及び活性化を試験した。試験した抗体の詳細を表３８に示す。

血液、脾臓及び肝臓における増殖Ｔ細胞の増加、活性化及び誘導するｍＡｂ^２（FS20m-232-91AA/Lob12.3）の能力を、ｍＡｂ単剤（G1/OX86、G1/Lob12.3、G1/3H3及びG1/4420）及び組み合わせ（G1/OX86及びG1/Lob12.3）の対照と比較した。８～１０週齢及び体重約２０ｇの各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには６匹のマウスがいた。

注射の２４時間前に、抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイリングで分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、２００μｌ／マウスに腹腔内（ＩＰ）注射して、２０ｇのマウスについて１０ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。注射は、試験の０日目、２日目及び４日目（２日ごとに１回の投与）に実施された。３回目の投与から７日後及び１４日後に、１群あたり３匹のマウスを安楽死させ、解剖により脾臓及び肝臓を分離し、心臓穿刺により血液を回収した。

肝臓と脾臓を、Miltenyi dissociationキット（肝臓－Miltenyi、130-105-807；脾臓－Miltenyi、130-095-926）を製造元の指示に従って使用して解離した。得られた細胞懸濁液を７０μＭセルストレーナー（Corning、カタログ番号352350）を使用して濾し、遠心分離（１５００ｒｐｍで１０分間）し、ＰＢＳで１回洗浄し、５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。

血液は、心臓穿刺によりＥＤＴＡ含有チューブに回収された。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscience、カタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。

腫瘍及び血液から分離された細胞を、実施例１９に詳述の抗体パネル及び試薬を使用して、フローサイトメトリー用に染色した（Ｓｔａｉｎ１）。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後１００μｌの抗体ミックス１（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscience、カタログ番号00-5523-00）で透過処理した。簡単に説明すると、２００μｌの固定液を各ウェルに加え、４℃の暗所で一晩放置した。次に、細胞を２００μｌの透過処理緩衝液で洗浄した。次に、細胞を再度回転させ、Ｆｃブロック（全て１：１００希釈）の存在下において、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞をBD FACS CantoIIフローサイトメーターで分析した。

FlowJoX、Excell及びGraphPadPrismソフトウェアを使用してデータを分析した。群を比較するための統計分析を、一元配置分散分析を使用して実行し、続いてGraphPadPrismソフトウェアパッケージを使用して、各ペアのテューキーの多重比較検定を実行した。データを母集団の割合として表した。

その結果は、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト抗体（Ｇ１／３Ｈ３）が、７日目と１４日目の両方で肝臓、脾臓、血液中のＴ細胞レベルの増加を誘導し、これらのＴ細胞が、アイソタイプ対照抗体（G1/4420）と比較して、増殖と活性化のレベルの増加を示したことを示した。架橋依存性ＣＤ１３７アゴニスト抗体（G1/Lob12.3）は、肝臓、脾臓又は血液中におけるＴ細胞レベル、増殖又は活性化のいずれにおいても顕著な増加を示さなかった。ＯＸ４０アゴニスト抗体（G1/OX86）は、いずれの組織においてもＴ細胞レベルの増加を誘導しなかったが、試験７日目には、肝臓、脾臓、血液中のＴ細胞増殖レベルの上昇を示し、１４日目にはアイソタイプ対照レベルに戻った。ＯＸ４０及び架橋依存性ＣＤ１３７アゴニスト抗体（G1/OX86及びG1/Lob12.3）の組み合わせは、７日目に肝臓Ｔ細胞浸潤レベルの増加を示し、７日目に肝臓で、７日目及び１４日目に脾臓（顕著でない）及び血液中で、Ｔ細胞増殖が増加し、１４日目で肝臓及び血液中、７日目及び１４日目に脾臓でＴ細胞活性化が増加した。ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２は、７日目に肝臓Ｔ細胞浸潤レベル（顕著ではない）及び血中Ｔ細胞レベルの増加を示し、１４日目までにアイソタイプ対照レベルに戻り、７日目で肝臓（顕著ではない）、脾臓及び血液中のＴ細胞増殖を増加し、これは、１４日目までにアイソタイプ対照レベルに戻ったことも示した。これらの結果は、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト（G1/3H3）のみが、肝臓、さらに脾臓及び血液において、上昇し持続的なＴ細胞浸潤、増殖及び活性化を誘導したことを示しており、本発明のＯＸ４０／ＣＤ１３７標的化抗体分子は、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト抗体よりも低い肝毒性リスクを有する可能性があることを示唆する。これらの結果は、クローン３Ｈ３によって誘導された架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト作用と、この試験でこの架橋非依存性クローンで観察された肝臓Ｔ細胞炎症の増加との関連の可能性を高めている。

実施例２８ － ＣＴ２６同系腫瘍マウスにおける異なる抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンを含有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体の比較
実施例２７において、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト抗体（G1/3H3）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、上昇し持続的なＴ細胞浸潤、増殖及び活性化レベルを誘導することが観察された。この増加した活性がＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２との関連で有益な抗腫瘍活性を有するかどうかを試験するために、ＣＴ２６同系腫瘍モデルを使用して、インビボで、２つの異なる抗マウスＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の活性を比較した。１つはＣＤ１３７アゴニストが架橋依存性クローンＬｏｂ１．２３であり、もう１つはＣＤ１３７アゴニストが架橋非依存性クローン３Ｈ３である。ＣＴ２６同系腫瘍モデルは、ＯＸ４０及びＣＤ１３７アゴニスト抗体の両方に感受性であることが以前に示されており、ＣＴ２６腫瘍から分離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＯＸ４０及びＣＤ１３７の両方を発現する。

２８．１ ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける異なる抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンを含有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の抗腫瘍活性
２つの異なるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２、FS20m-232-91AA/3H3（配列番号１６９及び１６７）及びFS20m-232-91AA/Lob12.3（表３８を参照されたい）の抗腫瘍活性を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおいてインビボで決定し、アイソタイプ対照抗体（G1/4420；表３８を参照されたい）の活性と比較した。さらに、２つのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２によって血中に誘導されたＴ細胞の増殖及び活性化のレベルを分析し、アイソタイプ対照抗体によって誘導されたものと比較した。８～１０週齢及び体重約２０ｇの各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートは１０匹のマウスがいた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２６３８）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。ＣＴ２６細胞（約３～５×１０^６）を１５０℃の保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ内の１０％ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含む２０ｍｌ ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用して、マウスを麻酔し、各動物に１×１０^６細胞を左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞接種後１０日目に、マウスの健康状態及び腫瘍増殖をモニターし、試験コホートに分類してランダム化した。この時点で腫瘍を有しないマウスは全て試験から除外された。

注射の２４時間前に、抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイリングで分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、２００μｌ／マウスに腹腔内（ＩＰ）注射して、２０ｇのマウスについて１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。注射は、腫瘍接種後１０日目、１２日目及び１４日目に（２日ごとに１回投与）実施された。動物を盲検法で週３回、麻酔下で健康スクリーニングし、その間に腫瘍の正確な測定が行われた。腫瘍体積は、カリパス測定により決定された（実施例１７に記載されたように）。細胞接種後３５日めで試験を終了し、腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的エンドポイントに達した時点で、動物を試験から除外した。処置群、試験された分子、用量及び投与スケジュールを表３９に要約する。２１日目の腫瘍体積は、GraphPadPrismソフトウェアを使用して、二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定によって統計的に検定された。生存率の統計的検定は、GraphPad Prismソフトウェアを使用した対数順位検定（マンテル－コックス）によって実行された。

図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、２つのＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体のいずれかによる処置は、アイソタイプ対照抗体による処置と比較して腫瘍増殖を遅延させ、生存を増加させた。腫瘍増殖又は生存における違いは、それぞれFS20m-232-91AA/3H3 ｍＡｂ^２及びFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２で処置したマウス間で観察されなかった。このデータは、実施例２７に記載されるように、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト（G1/3H3）について観察されたＴ細胞活性化及び増殖の増加にもかかわらず、抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンが、架橋非依存性クローン３Ｈ３（FS20m-232-91AA/3H3）であるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２での抗腫瘍活性は、抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンが架橋依存性クローンＬｏｂ１２．３（FS20m-232-91AA/Lob12.3）であるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２と比較して増加しないことを示唆する。

２８．２ ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける異なる抗ＣＤ１３７ Ｆａｂクローンを含有するＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２の末梢薬力学的応答の評価
上記の実施例２８．１の試験の延長において、３回目の投与の５日後（すなわち腫瘍接種後１９日目）に、血液を５匹のマウスの尾静脈からＥＤＴＡ含有チューブに回収した。凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscience、カタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。

腫瘍及び血液から分離された細胞を、実施例１９に詳述の抗体パネル及び試薬を使用して、フローサイトメトリー用に染色した（Ｓｔａｉｎ１）。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後１００μｌの抗体ミックス１（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscience、カタログ番号00-5523-00）で透過処理した。簡単に説明すると、２００μｌの固定液を各ウェルに加え、４℃の暗所で一晩放置した。次に、細胞を２００μｌの透過処理緩衝液で洗浄した。次に、細胞を再度回転させ、Ｆｃブロック（全て１：１００希釈）の存在下において、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞をBD FACS CantoIIフローサイトメーターで分析した。

FlowJoX、Excell及びGraphPadPrismソフトウェアを使用してデータを分析した。群を比較するための統計分析を、一元配置分散分析を使用して実行し、続いてGraphPadPrismソフトウェアパッケージを使用して、各ペアのテューキーの多重比較検定を実行した。

FS20m-232-91AA/3H3は、アイソタイプ対照抗体（G1/4420）及びFS20m-232-91AA/Lob12.3と比較して、血中Ｔ細胞レベルの統計的に有意な増加を誘導した。FS20m-232-91AA/3H3によって誘導されるこれらの増加したＴ細胞レベルは、G1/4420アイソタイプ対照及びFS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２について観察されたそれらの細胞タイプの相対的割合と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的割合の統計的に有意な減少及びＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的割合の統計的に有意な増加を伴った。両方のＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖も誘導したが、FS20m-232-91AA/3H3により誘導したレベルは、FS20m-232-91AA/Lob12.3 ｍＡｂ^２で誘導したレベルより顕著に高かった。FS20m-232-91AA/3H3 ｍＡｂ^２は、アイソタイプ対照と比較して、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルの増加を誘導した。アイソタイプ対照処置コホートと比較して、FS20m-232-91AA/Lob12.3又はFS20m-232-91AA/3H3で処置したマウスにおける活性化Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの変化は、FS20m-232-91AA/Lob12.3で処置したマウスにおける活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルの変化と同様に、少量で、統計学的に有意ではなかった。これらの結果は、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニストクローン３Ｈ３が、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２との関連で、架橋依存性ＣＤ１３７アゴニストクローンＬｏｂ１２．３と比較して、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２との関連で、活性であり、増加したＴ細胞レベル及び増殖を誘導することができ、したがって、実施例２７に記載されたＢＡＬＢ／ｃマウス試験において観察されたように、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）としてクローン３Ｈ３によって誘導されたＴ細胞レベルの増加及び増殖と一致することを示す。

抗腫瘍活性データと共に、これらの結果は、ＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２との関連で、架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニストによって誘導されるＴ細胞レベルの増加及び増殖の抗腫瘍応答に関して付加的な利益がないことを示唆する。これらの結果は、肝臓Ｔ細胞炎症の増加が、クローン３Ｈ３によって誘導された架橋非依存性ＣＤ１３７アゴニスト作用について観察された実施例２７の結果と併せて、ＯＸ４０に対する結合に依存するＣＤ１３７アゴニスト作用であるＯＸ４０／ＣＤ１３７ ｍＡｂ^２を使用することが、癌と戦うための免疫系を刺激する安全及び効果的な方法を提供し得ることを示唆する。

配列表
FS30-10-16 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＩＤＰＴＧＳＫＴ（配列番号２）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＡＲＤＬＬＶＹＧＦＤＹ（配列番号３）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-16 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＳＹＤＭＳ（配列番号７）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＤＩＤＰＴＧＳＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＤＬＬＶＹＧＦＤＹ（配列番号９）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-16 ｍＡｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-16 ｍＡｂの重鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号１３）

FS30-10-16 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-16 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号１５）

FS30-10-3 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＩＤＰＴＧＳＫＴ（配列番号２）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＡＲＤＬＮＶＹＧＦＤＹ（配列番号１６）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-3 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＳＹＤＭＳ（配列番号７）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＤＩＤＰＴＧＳＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＤＬＮＶＹＧＦＤＹ（配列番号１７）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-3 ｍＡｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-3 ｍＡｂの重鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号１９）

FS30-10-3 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-3 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号２０）

FS30-10-12 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＩＤＰＴＧＳＫＴ（配列番号２）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＡＲＤＬＴＶＹＧＦＤＹ（配列番号２１）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-12 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＳＹＤＭＳ（配列番号７）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＤＩＤＰＴＧＳＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＤＬＴＶＹＧＦＤＹ（配列番号２２）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号６）

FS30-10-12 ｍＡｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-12 ｍＡｂの重鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号２４）

FS30-10-12 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-10-12 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号２０）

FS30-35-14 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＡＹＮ（配列番号２５）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＩＳＰＹＧＧＡＴ（配列番号２６）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＡＲＮＬＹＥＬＳＡＹＳＹＧＡＤＹ（配列番号２７）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＹＹＹＳＳＰＩＴ（配列番号２８）

FS30-35-14 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＡＹＮＩＨ（配列番号２９）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＤＩＳＰＹＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＮＬＹＥＬＳＡＹＳＹＧＡＤＹ（配列番号３１）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＹＹＹＳＳＰＩＴ（配列番号２８）

FS30-35-14 ｍＡｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７０）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-35-14 ｍＡｂの重鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号１７１）

FS30-35-14 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-35-14 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号３２）

FS30-5-37 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号３３）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号３４）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＡＲＳＹＤＫＹＷＧＳＳＩＹＳＧＬＤＹ（配列番号３５）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号４）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号５）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＹＹＳＹＹＰＶＴ（配列番号３６）

FS30-5-37 ｍＡｂのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ ＣＤＲ１－ＳＹＡＭＳ（配列番号３７）
ＶＨ ＣＤＲ２－ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）
ＶＨ ＣＤＲ３－ＳＹＤＫＹＷＧＳＳＩＹＳＧＬＤＹ（配列番号３９）
ＶＬ ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）
ＶＬ ＣＤＲ２－ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）
ＶＬ ＣＤＲ３－ＱＱＹＹＳＹＹＰＶＴ（配列番号３６）

FS30-5-37 ｍＡｂの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-5-37 ｍＡｂの重鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号４１）

FS30-5-37 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）
ＣＤＲ ＩＭＧＴ番号付け（太字の斜体）、ＣＤＲ Kabat番号付け（下線付きの斜体）

FS30-5-37 ｍＡｂの軽鎖可変ドメインの核酸配列（配列番号４３）

ＷＴ ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＷＴ ＡＢループ－ＲＤＥＬＴＫＮＱ（配列番号４４）
ＷＴ ＣＤループ－ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号４５）
ＷＴ ＥＦループ－ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ（配列番号４６）

ＷＴ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４７）
ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループは下線が付されている

ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号４８）

ＬＡＬＡ変異を有するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）
ＬＡＬＡ変異は下線が付されている

ＬＡＬＡ変異及びＰ１１４Ａ変異を有するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）
ＬＡＬＡ変異は下線が付され、Ｐ１１４Ａ変異は太字で下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-49 第１の配列－ＹＷＤＱＥ（配列番号５１）
FS20-22-49 第２の配列－ＤＥＱＦＡ（配列番号５２）
FS20-22-49 第３の配列－ＱＹＲＷＮＰＡＤＹ（配列番号５３）

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号５５）

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメインＡＢ、ＣＤ及びＥＦループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-49 ＡＢループ－ＲＤＥＹＷＤＱＥ（配列番号５６）
FS20-22-49 ＣＤループ－ＳＮＧＤＥＱＦＡＹ（配列番号５７）
FS20-22-49 ＥＦループ－ＤＱＹＲＷＮＰＡＤＹ（配列番号５８）

Ｆｃａｂ FS20-22-38 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-38 第１の配列－ＹＷＤＱＥ（配列番号５１）
FS20-22-38 第２の配列－ＡＥＫＹＱ（配列番号５９）
FS20-22-38 第３の配列－ＱＹＲＷＮＰＧＤＹ（配列番号６０）

Ｆｃａｂ FS20-22-38 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６１）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-38 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号６２）

Ｆｃａｂ FS20-22-41 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-41 第１の配列－ＹＷＤＱＥ（配列番号５１）
FS20-22-41 第２の配列－ＤＥＱＦＡ（配列番号５２）
FS20-22-41 第３の配列－ＱＹＲＷＮＰＧＤＹ（配列番号６０）

Ｆｃａｂ FS20-22-41 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６３）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-41 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号６４）

Ｆｃａｂ FS20-22-47 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-47 第１の配列－ＹＷＤＱＥ（配列番号５１）
FS20-22-47 第２の配列－ＤＥＱＦＡ（配列番号５２）
FS20-22-47 第３の配列－ＱＹＲＷＳＰＧＤＹ（配列番号６５）

Ｆｃａｂ FS20-22-47 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-47 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号６７）

Ｆｃａｂ FS20-22-85 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-22-85 第１の配列－ＹＷＤＱＥ（配列番号５１）
FS20-22-85 第２の配列－ＤＥＱＦＡ（配列番号５２）
FS20-22-85 第３の配列－ＱＹＲＷＮＰＦＤＤ（配列番号６８）

Ｆｃａｂ FS20-22-85 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６９）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-22-85 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号７０）

Ｆｃａｂ FS20-31-58 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-58 第１の配列－ＹＹＳＧＥ（配列番号７１）
FS20-31-58 第２の配列－ＱＰＥＮＤ（配列番号７２）
FS20-31-58 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＳＰＲＴ（配列番号７３）

Ｆｃａｂ FS20-31-58 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-58 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号７５）

Ｆｃａｂ FS20-31-66 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-66 第１の配列－ＹＹＳＧＥ（配列番号７１）
FS20-31-66 第２の配列－ＱＰＥＮＤ（配列番号７２）
FS20-31-66 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＶＰＲＴ（配列番号７６）

Ｆｃａｂ FS20-31-66 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７７）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-66 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号７８）

Ｆｃａｂ FS20-31-94 Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-94 第１の配列－ＷＥＨＧＥ（配列番号７９）
FS20-31-94 第２の配列－ＩＲＥＨＤ（配列番号８０）
FS20-31-94 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＧＰＧＴ（配列番号８１）

Ｆｃａｂ FS20-31-94 Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-94 Ｆｃａｂ ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８３）

Ｆｃａｂ FS20-31-102 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-102 第１の配列－ＷＡＳＧＥ（配列番号８４）
FS20-31-102 第２の配列－ＱＰＥＶＤ（配列番号８５）
FS20-31-102 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＶＰＲＴ（配列番号７６）

Ｆｃａｂ FS20-31-102 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-102 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８７）

Ｆｃａｂ FS20-31-108 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-108 第１の配列－ＷＡＳＧＥ（配列番号８４）
FS20-31-108 第２の配列－ＥＫＥＩＤ（配列番号８８）
FS20-31-108 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＡＫＲＴ（配列番号８９）

Ｆｃａｂ FS20-31-108 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-108 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９１）

Ｆｃａｂ FS20-31-115 ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS20-31-115 第１の配列－ＷＡＳＧＥ（配列番号８４）
FS20-31-115 第２の配列－ＥＱＥＦＤ（配列番号９２）
FS20-31-115 第３の配列－ＰＹＷＲＷＧＡＫＲＴ（配列番号８９）

Ｆｃａｂ FS20-31-115 ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）
第１、第２、第３の配列に下線が付されている

Ｆｃａｂ FS20-31-115 ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９４）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-16の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９５）
可変ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ変異（下線付き太字）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-16の重鎖の核酸配列（配列番号９６）

FS30-10-16の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）
可変ドメイン（斜体）

FS30-10-16の軽鎖の核酸配列（配列番号９８）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-3の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９９）
可変ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ変異（下線付き太字）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-3の重鎖の核酸配列（配列番号１００）

FS30-10-3の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）
可変ドメイン（斜体）

FS30-10-3の軽鎖の核酸配列（配列番号１０２）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-12の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０３）
可変ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ変異（下線付き太字）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-10-12の重鎖の核酸配列（配列番号１０４）

FS30-10-12の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）
可変ドメイン（斜体）

FS30-10-12の軽鎖の核酸配列（配列番号１０２）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-35-14の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０５）
可変ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ変異（下線付き太字）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-35-14の重鎖の核酸配列（配列番号１０６）

FS30-35-14の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０７）
可変ドメイン（斜体）

FS30-35-14の軽鎖の核酸配列（配列番号１０８）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-5-37の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０９）
可変ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ変異（下線付き太字）

ＬＡＬＡ変異を有するFS20-22-49AA/FS30-5-37の重鎖の核酸配列（配列番号１１０）

FS30-5-37の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１１）
可変ドメイン（斜体）

FS30-5-37の軽鎖の核酸配列（配列番号１１２）

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメインの代替核酸配列（配列番号１１３）

ＬＡＬＡ変異を含む抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ G1AA/4420の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１４）
ＣＤＲの位置に下線が付されている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示されている。

ＬＡＬＡ変異を有しない抗ＦＩＴＣ ｍＡｂ G1/4420の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１５）
ＣＤＲの位置に下線が付されている。

４４２０ ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１６）
ＶＬドメイン（斜体）

ＬＡＬＡ変異を有するG1AA/HelD1.3抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１７）

HelD1.3 ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１８）
ＶＬドメイン（斜体）

G1/MOR7480.1の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１９）
ＶＨドメイン（斜体）

G1/MOR7480.1、G1AA/MOR7480.1及びG2/MOR7480.1 ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２０）
ＶＬドメイン（斜体）

G1/20H4.9の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２１）
ＶＨドメイン（斜体）

G1/20H4.9及びG1AA/20H4.9 ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２２）
ＶＬドメイン（斜体）

FS20-22-49AA/4420の重鎖のアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異あり）（配列番号１２３）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字及び下線）

G2/MOR7480.1の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２４）
ＶＨドメイン（斜体）

G1AA/MOR7480.1の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２５）
ＶＨドメイン（斜体）ＬＡＬＡ（太字及び下線）

ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１２６）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）

ヒトＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）

カニクイザルＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１２８）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）

カニクイザルＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）

ヒトＯＸ４０細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）

カニクイザルＯＸ４０細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３１）

DO11.10-hOX40及びヒトＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１３２）

DO11.10-mOX40及びマウスＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１３３）

DO11.10-cOX40及びカニクイザルＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１３４）

ヒトＯＸ４０－ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１３５）
ＩＬ－２リーダー配列（下線付き）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン（太字）

マウスＯＸ４０－ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１３６）
ＩＬ－２リーダー配列（下線付き）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン（太字）

カニクイザルＯＸ４０－ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１３７）
ＩＬ－２リーダー配列（下線付き）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン（太字）

ＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ組換え抗原で使用するためのヒトＣＤ１３７配列のアミノ酸配列（配列番号１３８）

ＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ及びＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓ組換え抗原で使用するためのカニクイザルＣＤ１３７配列のアミノ酸配列（配列番号１３９）

ＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ組換え抗原で使用するためのマウスＣＤ１３７配列のアミノ酸配列（配列番号１４０）

ＣＤ１３７－ｍＦｃ－Ａｖｉ組換え抗原で使用するためのｍＦｃ－Ａｖｉのアミノ酸配列（配列番号１４１）
マウスＦｃドメイン（斜体）Ａｖｉタグ（太字）

短縮型Ｆｃａｂヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号１０１）
ＴＣＰＰＣＰ

Ｆｃａｂ FS20-22-49 ＣＨ３ドメインの代替核酸配列（配列番号１４３）

FS20-22-49/FS30-5-37重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４４）

FS20-22-49/FS30-5-37重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４５）

FS20-22-49/FS30-10-3重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４６）

FS20-22-49/FS30-10-3重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４７）

FS20-22-49/FS30-10-12重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４８）

FS20-22-49/FS30-10-12重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１４９）

FS20-22-49/FS30-10-16重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１５０）

FS20-22-49/FS30-10-16重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１５１）

FS20-22-49/FS30-35-14重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１５２）

FS20-22-49/FS30-35-14重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡなし）（配列番号１５３）

G1AA/FS30-10-16 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号１５４）

G1AA/FS30-10-16 ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）

G1AA/OX86 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号１５５）

G1/OX86及びG1AA/OX86 ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１５６）

FS20m-232-91AA/4420の重鎖のアミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号１５７）

FS20m-232-91AA/4420の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１６）

ヒトＣＤ１３７－Ａｖｉ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号１５８）
細胞外ドメインＣＤ１３７（太字）；Ａｖｉタグ（斜体）；Ｈｉｓタグ（下線）

G1/OX86 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（ＬＡＬＡなし）（配列番号１５９）

抗ＰＤ－１ ｍＡｂ G1AA/5C4の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６０）
可変ドメイン（太字）

抗ＰＤ－１ ｍＡｂ G1AA/5C4の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６１）
可変ドメイン（太字）

抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ G1AA/S1の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６２）
可変ドメイン（太字）

抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ G1AA/S1の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６３）
可変ドメイン（太字）

マウスＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１６４）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）

G1AA/20H4.9 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６５）
ＶＨドメイン（斜体）

G1AA/3H3 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６６）
ＶＨドメイン（斜体）

G1AA/3H3及びG1/3H3 ｍＡｂ並びにFS20m-232-91AA/3H3 ｍＡｂ^２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６７）
ＶＬドメイン（斜体）

G1/3H3 ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６８）
ＶＨドメイン（斜体）

重鎖のアミノ酸配列FS20m-232-91AA/3H3（ＬＡＬＡあり）（配列番号１６９）
ＶＨドメイン（斜体）

抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1AA/11D4の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７３）
ＶＨドメイン（斜体）

抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1/11D4の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７４）
ＶＨドメイン（斜体）

抗ＯＸ４０ ｍＡｂ G1AA/11D4及びG1/11D4の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７５）
ＶＬドメイン（斜体）

参考文献
本明細書で言及されている全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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Claims (19)

1. ＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合する抗体分子であって、
   （ａ）ＣＤ１３７のための相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
   （ｂ）前記抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＯＸ４０抗原結合部位
   を含み、
   前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
   （ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６；
   （ｉｉ）それぞれ配列番号１、２、１６、４、５及び６；
   （ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２、２１、４、５及び６；
   （ｉｖ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、４、５及び２８；若しくは
   （ｖ）それぞれ配列番号３３、３４、３５、４、５及び３６
   に記載される、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むか、又は
   前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
   （ｖｉ）それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１及び６；
   （ｖｉｉ）それぞれ配列番号７、８、１７、１０、１１及び６；
   （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号７、８、２２、１０、１１及び６；
   （ｉｘ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、１０、１１及び２８；若しくは
   （ｘ）それぞれ配列番号３７、３８、３９、１０、１１及び３６
   に記載される、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含み、かつ
   前記ＯＸ４０抗原結合部位が、それぞれ前記ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列、第２の配列及び第３の配列を含み、前記第１、第２及び第３の配列が、
   （ｉ）それぞれ配列番号５１、５９及び６０；
   （ｉｉ）それぞれ配列番号５１、５２及び６０；
   （ｉｉｉ）それぞれ配列番号５１、５２及び６５；
   （ｉｖ）それぞれ配列番号５１、５２及び６８；
   （ｖ）それぞれ配列番号７１、７２及び７３；
   （ｖｉ）それぞれ配列番号７１、７２及び７６；
   （ｖｉｉ）それぞれ配列番号７９、８０及び８１；
   （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号８４、８５及び７６；
   （ｉｘ）それぞれ配列番号８４、８８及び８９；又は
   （ｘ）それぞれ配列番号８４、９２及び８９
   の第１、第２及び第３の配列である、抗体分子。
2. （ｉ）前記第１の配列が、前記抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの１４から１８位に位置し；
   （ｉｉ）前記第２の配列が、前記抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの４５．１から７７位に位置し；及び／又は
   （ｉｉｉ）前記第３の配列が、前記抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの９３から１０１位に位置し；
   アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、請求項１に記載の抗体分子。
3. 配列番号６１、６３、６６、６９、７４、７７、８２、８６、９０又は９３に記載されるＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
4. 前記ＣＨ３ドメインが、前記ＣＨ３ドメイン配列のＣ末端のすぐ隣に追加のリジン残基（Ｋ）を含む、請求項３に記載の抗体分子。
5. （ｉ）それぞれ配列番号１２及び１４；
   （ｉｉ）それぞれ配列番号１８及び１４；
   （ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３及び１４；
   （ｉｖ）それぞれ配列番号１７０及び１７２；又は
   （ｖ）それぞれ配列番号４０及び４２
   に記載されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体分子。
6. （ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６に記載される、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；
   （ｉｉ）それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１及び６に記載される、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３；並びに／又は
   （ｉｉｉ）それぞれ配列番号１２及び１４に記載されるＶＨドメイン及びＶＬドメイン
   を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体分子。
7. ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に結合する、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体分子。
8. ヒトＣＤ１３７及びヒトＯＸ４０に同時に結合することができる、請求項７に記載の抗体分子。
9. （ｉ）細胞表面に発現されたＣＤ１３７の存在下で免疫細胞上の前記ＯＸ４０を活性化することができ、及び／又は細胞表面に発現されたＯＸ４０の存在下で免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することができる；
   （ｉｉ）免疫細胞上のＯＸ４０及びＣＤ１３７への前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上のＯＸ４０のクラスター化を引き起こし、及び／又は前記免疫細胞上のＣＤ１３７及びＯＸ４０への前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす；並びに／又は
   （ｉｉｉ）１つ以上のＦｃγ受容体への前記抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、
   請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体分子。
10. 請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。
11. 請求項１０に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクター。
12. 請求項１０に記載の１つ又は複数の核酸分子又は請求項１１に記載の１つ又は複数のベクターを含む組換え宿主細胞。
13. 請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子を産生する方法であって、前記抗体分子の産生のための条件下において、請求項１２に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
14. 前記抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
16. 請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子を含む、個体における癌又は感染症の処置のための、医薬組成物。
17. 第２の治療剤をさらに含む、請求項１６に記載の癌の処置のための医薬組成物。
18. 前記第２の治療剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体である、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記第２の治療剤は、ペンブロリズマブ又はニボルマブである、請求項１８に記載の医薬組成物。

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