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JP7702159B2 - 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents
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核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 Download PDF

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Description

本開示は、核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用に関する
。
Ｂ型ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎とも呼ばれる）は、全世界、特に中国に深刻な脅威を与
えている感染症である。現在全世界で公認されているＢ型肝炎予防薬としては、インター
フェロンとヌクレオシドアナログの２種類があるが、この２種類の薬物は、使用後薬剤耐
性が発生しやすい又は使用に制限がある等の様々な欠点があり、例えば、インターフェロ
ンは、副作用が発生しやすく、ヌクレオシド類薬物は、薬剤耐性及び投薬中止後の再発と
いう問題がある。したがって、遺伝子レベルでウイルスの遺伝子発現をサイレンシングし
、ＨＢＶの生成と複製を遮断することにより、根本からウイルスの代謝と肝細胞への感染
を低下させることができれば、最も理想的なＢ型肝炎の治療手段となることは疑いない。
また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）
は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）という機構に基づき、
興味あるいずれかの目的とする遺伝子（例えば、がん等の疾患を誘発する遺伝子）の発現
を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。
低分子ＲＮＡ薬物の開発では、ｓｉＲＮＡの安定化修飾及びその送達系は、２つのキー
技術である。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（１）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ
複合体を提供する。
Figure 0007702159000001
 式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり
、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり
、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０ア
ルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 0007702159000002
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、ＮｕはｓｉＲＮＡである。
前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレ
オチドであり、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、
ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌ
クレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領
域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列とは
、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配
列番号１５６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が
３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は
、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２
－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基
及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換
され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロ
アリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ
１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロ
ゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基
、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置
換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１
０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シア
ノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ
１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキ
ル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（
フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－
Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル
基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｓ
Ｏ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２
、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ
２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－
Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し
てもよい。
各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子
は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ
２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン
基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置
換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテ
ロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｏ
Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハ
ロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル
基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン
置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ
１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シ
アノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（
Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アル
キル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）
（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、
－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキ
ル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキ
ル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－
ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ
２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳ
Ｏ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１
－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有
してもよい。
Figure 0007702159000003
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、Ｍ１は標的基を表す。
いくつかの実施形態において、本開示は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それ
ぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’か
ら５’に向かって、ヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合
が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡ
のセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含む複合体の調製方法を
提供する。前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾
のヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記セン
ス鎖は、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、３つ以下のヌクレ
オチド差異があるヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５６に
示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、３つ以下のヌクレオチド差異があるヌクレオ
チド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも
一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである。
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３
２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチ
ド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチ
ド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分
子とも呼ばれる。
Figure 0007702159000004
 式中、
Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡに結合できる部分である。いくつかの実施形態にお
いて、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合することができる部分で
ある。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応させてリン酸ジエステル結合によりＮ
ｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合することができる部分であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された
基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメ
チル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロ
ピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立
して選択される１つであり、
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、
Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＢＶ遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを
提供し、当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチ
センス鎖は、いずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み
、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配
列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一
部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを
含み、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列と長さが
等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレ
オチド配列Ｂを含み、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号１５６に示されるヌクレオチ
ド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである。
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し
、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレ
オチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌク
レオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドで
ある。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な
担体を含む薬物組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該
ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。当該ｓｉＲ
ＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖は、いずれ
もフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記センス鎖は、
ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記
ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本
鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオ
チド配列Ａは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレ
オチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み
、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列と長さが等し
く、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである。
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し
、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレ
オチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌク
レオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドで
ある。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物
及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の
治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物
及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、
Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防方法を提供す
る。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／
又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、前記Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させ
ることを含む、ＨＢＶ遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物
及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特
許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用によ
り本明細書に組み込まれる。
被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソーム（Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）における安定性の半定量的検出結果を示す。 被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果を示す。 被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示す。 被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示す。 被験ｓｉＲＮＡ複合体のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性結果を示す。 被験ｓｉＲＮＡ複合体のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性結果を示す。 投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示す。 投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体５及び７によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体１、６によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体５及び６によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体５、６、９、１０によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体１、２、３、４によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ４４Ｂｒｉモデルマウスにおける複合体１によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を示す。 ｓｉＲＮＡ複合体１、６によるＡＡＶ－ＨＢＶモデルマウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験を示す。 ｓｉＲＮＡ複合体１、６によるＡＡＶ－ＨＢＶモデルマウスにおけるｓｉＲＮＡのＨＢＶ ＤＮＡの抑制効率に対する時間関連性試験を示す。 複合体６のＡＡＶ－ＨＢＶ低濃度マウスモデルにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験を示す。 複合体５及び６のＭ－Ｔｇモデルにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験を示す。 複合体６、１１のＭ－Ｔｇモデルにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験を示す。 複合体１の１．２８ｃｏｐｙモデルにおける血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験を示す。 複合体１の１．２８ｃｏｐｙモデルにおけるＨＢＶ ＤＮＡの抑制効率に対する時間関連性試験を示す。 それぞれ複合体１の標的ＧＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ、ＰＳＳＭにおけるＩＣ５０値を示す。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される
発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を
制限するためのものではないと理解すべきである。
（定義）
本開示において、ＨＢＶ遺伝子とは、ＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００
３９７７．１に示される遺伝子を指す。
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ、Ｔは、ヌクレオチドの塩
基配列を表し、小文字ｄは、当該文字ｄの右側に隣接する１つのヌクレオチドがデオキシ
リボヌクレオチドであることを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌ
クレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左
側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字
ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により
結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５
’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチド、特に、ビニルリン
酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’－リン酸ヌ
クレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又は５’－チオリン酸エステル修飾ヌ
クレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）であることを表す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’
位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオ
チド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換さ
れたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、「ヌクレオチドアナログ」とは、核
酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グ
アニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチ
ミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架
橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又
は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２
’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されて
もよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の
鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であ
るアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウ
ラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩
基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミ
ジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合す
るとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、ま
たその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミス
マッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合し
て存在しないことを意味する。
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的である」とは、関連する２つ
のヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆
相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在する
ことを指し、「完全に相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチ
が存在しないことを指す。
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差
異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化し
たことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであり、このとき、前
者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位
置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつ
かの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその
等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
文脈において、特に本開示の複合分子の調製方法又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説
明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチド
の種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレ
オシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
ｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指
す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である
。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品を購入可能である。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有
する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「
複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を
指す。さらには、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分が
ｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下に、本開示のｓｉＲＮ
Ａ複合体を単に「複合体」ということもある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、ｓｉＲ
ＮＡ複合体の総称、第１種のｓｉＲＮＡ複合体又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体であると理
解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに
複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる特定の化合物であ
ると理解すべきである。
本明細書で用いられる場合、２つのアルファベット文字間又は記号間のものでないダッ
シュ（「－」）は、置換基の結合点の位置を示すために用いられている。例えば、－Ｃ１
－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基により結合する。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は
状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに前記記載が事象又は状況が発生
した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は
、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換
基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及
び／又は本質的に不安定な、いかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されな
いと、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分
岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～８個又は１～６
個の炭素原子である。例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルは、１～６個の炭素原子の直鎖と分岐
鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を命名する場合、当該数の炭素
を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチ
ル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意
味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキル
のサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキ
ルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二
重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと
、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－
イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－
イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－
エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－
１，３－ジエン－２－イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施
形態において、アルケニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において
、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニル
のサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アル
キルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なア
ルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－
イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－
３－イン－１－イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態に
おいて、アルキニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～
１０、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセッ
トであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭
素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、
ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチル
オキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキ
シ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～
１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系
から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成されたラジカルを指す。前記芳
香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６～１８個の炭素原子の炭素のみを含有
し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理
論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、
フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリ
ールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３～７個の環状炭素原子を
有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素－炭素二
重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル
、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノ
ルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ
、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む
。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又
は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル
基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル
、２－フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～
６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において
特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋
環系を含んでもよい。複素環式ラジカルにおけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい
。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽
和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合す
ることができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１
，３］ジスルホニル、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、
イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、
オクタヒドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オ
キサピリミジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、
ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、
トリスルホニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オ
キソチオモルホリニル及び１，１－ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定さ
れない。
「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択さ
れる１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す
。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であって
もよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケ
ル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又
は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数
の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の
原子を介して分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル
、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリ
ル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリ
ル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサゾリル、１
，４－ベンゾジオキサゾリル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾジアゾリル、ベンゾジオキ
サフェニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｅｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル
（ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎｏｎｙｌ）、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェ
ニル、ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６
］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ［ｄ］ピ
リミジニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピ
リミジニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ
］シンノリニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ
］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［
３，２－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロヘプタ［ｄ］ピ
リミジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル
、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリ
ル、インダゾリル、イミダゾリル、インドール、イソインドール、インドリニル、イソイ
ンドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，
６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジノニル、１，６－ナフチリジノニル
、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６
ａ，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル
－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタロイル、
プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル
、ピリジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、
ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、
キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾ
リニル、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジ
ニル、６，７，８，９テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ
］ピリミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チ
アゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，
３－ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリ
ジニル及びチオフェニルを含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能性に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンチン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンチン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物
又は有袋動物を指す。本開示の主題としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル
又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及
び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療方法」、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここ
で互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し
、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根
絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛
を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を
根絶又は改善することにより、患者に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「予防」と「防止」は互換的に使用されてもよい。これら
の用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されな
い。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、
複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の１又は
複数の病理学的症状が報告された患者に投与することができる。
＜修飾ｓｉＲＮＡ＞
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオ
チド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここで
は説明を省略する。
ＣＮ１０２１４０４５８Ｂには、ＨＢＶ遺伝子を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが開示さ
れており、当該ｓｉＲＮＡの複数種の化学修飾戦略について研究している。当該研究によ
り、修飾戦略が異なると、ｓｉＲＮＡの安定性、生物活性及び細胞毒性等の指標に与える
影響が全く異なることが見出された。当該研究では、７種類の有効な修飾方法を実証し、
そのうちの１つの修飾方法で得られたｓｉＲＮＡは未修飾ｓｉＲＮＡに比べて、血液安定
性を向上させるとともに、未修飾ｓｉＲＮＡと基本的に同等の抑制活性を維持する。
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる修飾ｓｉＲＮＡを提供する。前記
ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチ
ドは、いずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフ
ルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記センス鎖がヌクレ
オチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオ
チド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を
形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオチド配列
Ａは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差
異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み、前記ヌ
クレオチド配列Ｂは、配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つ
ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである。
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し
、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレ
オチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌク
レオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドで
ある。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ａにおけるフルオロ修飾ヌク
レオチドは５個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂにおけるフルオロ修飾ヌクレオチド
は７個以下である。
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチ
ド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ａの３’端の１番
目のヌクレオチドは、位置が配列番号１５５の３’端の１番目のヌクレオチドに対応する
ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記
アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ａと配列番号１５５に示されるヌ
クレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチ
ド配列Ｂと配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド
差異がある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｂと配列番号１５６に示されるヌ
クレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’ＢがＡ
、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ
’Ｂの位置での差異であり、Ｚ’ＢがＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態
において、ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異に
より、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌ
クレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ａと前記ヌクレオチド配列Ｂは、
基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的
であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指
し、前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミス
マッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に
ミスマッチがないことを指す。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列であり、ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列であり
、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺＡ－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号２）
ここで、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ
Ａは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドであり、
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオ
チドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレ
オチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであ
る。
いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列
ＩＩを含み、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩは、逆相補的に二本鎖領域を形
成し、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオ
チド配列ＩＩは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺＡ－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号２）
ここで、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ
Ａは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドであり、
いくつかの実施形態において、ＺＡはＡであり、Ｚ’ＢはＵである。
５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖において配列番号１の第
７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖
において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３
’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖において配列番号２の第２、６、１
４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセン
ス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが
１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０～２６ヌクレオチドである
。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比
が、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９
／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、
２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２
５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２
／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、
２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮ
Ａのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は１９／２１、２１／２３又は２３／２５である
。
本開示の１つの実施形態によれば、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じで
あり、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記ヌクレオ
チド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレ
オチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して、１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオ
チド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ａの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列Ｉ
Ｖは、ヌクレオチド配列Ｂの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌ
クレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、相補的であってもよく、相補
的でなくてもよく、ｓｉＲＮＡの安定性を向上させるために、いくつかの実施形態におい
て、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、少なくとも一部で相補的であり
、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、８
０％以上又は９０％以上の塩基が相補的であり、いくつかの実施形態において、ヌクレオ
チド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である
。前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマ
ッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミ
スマッチがないことを指し、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌ
クレオチド配列ＩＶは完全に逆相補的である。これにより、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖と
アンチセンス鎖は、長さが等しく、その長さ比が２０／２０、２１／２１、２２／２２又
は２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチ
センス鎖の長さ比が２１／２１又は２３／２３である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは
、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌ
クレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が
２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレ
オチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列が
ＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣであり、このとき、センス鎖とアン
チセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長
さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配
列ＩＩＩの塩基配列がＣＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣＧであり、
このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチ
ド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に
向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶ
の塩基配列がＵＣＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２
３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配
列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチ
ド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＣであり、
このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長
さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられ
ると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖とアンチセンス鎖は、長さが異なり、前記
ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長
さが１～３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖
の３’オーバーハング末端を構成する。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ
のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２０、１９／２１，１９／２２、２０／
２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２
２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつ
かの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これ
により、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１
９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。
前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよ
い。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデ
オキシリボヌクレオチド（ＴＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）
であり、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する
位置のヌクレオチドと相補的である。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３に示されるヌク
レオチド配列を含み、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺＡ－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番号３）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み
、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺＡ－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣ－３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ
Ａは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドである。
本開示のいくつかの具体的な実施例によれば、本開示に記載されたｓｉＲＮＡはｓｉＨ
Ｂａ１又はｓｉＨＢａ２である。
ｓｉＨＢａ１
センス鎖：５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号５）
アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番
号６）
ｓｉＨＢａ２
センス鎖：５’－ＧＡＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号７）
アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣＧＧ－３’（配
列番号８）
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの全部は、修飾ヌクレオチ
ドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体がＢ型肝
炎ウイルス遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。例え
ば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈ
ａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９
－２０）：８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖におい
て、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフ
ルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フル
オロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの
第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ
修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フル
オロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の文脈においてフルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２
’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（１０７）に示される構造を有する
ヌクレオチドを指す。非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２
’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ
を指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド
のリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌク
レオチドアナログから独立して選択されるいずれか１つである。
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド
は、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド
、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置
換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌ
クレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０８）に
示される、メトキシ修飾ヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態にお
いて、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（１０９）に示される２’
－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの実
施形態において、２’－アミノ修飾ヌクレオチド（２’－ＮＨ２）は式（１１０）に示さ
れる。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１１
１）に示される。
Figure 0007702159000005
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが
、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、
ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す
。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌク
レオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環
式ヌクレオチドであってもよい。
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員
環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含
んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮ
Ａヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１１２）に示
されるＬＮＡ、式（１１３）に示されるＥＮＡ、式（１１４）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ
等であってもよい。
Figure 0007702159000006
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつ
かの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１１５）に示されるアンロックド核
酸（ＵＮＡ）、又は式（１１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい
。
Figure 0007702159000007
上記式（１１５）及び式（１１６）中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル
）から選択される。
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化し
た化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１１７）又は
（１１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行し
た化合物であってもよい。
Figure 0007702159000008
上記式（１１７）～式（１１８）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又は
Ｔ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、
ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択されるいずれか１つである。いくつかの実施
形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドで
あり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’－ヒドロキシ
基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」
、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－
フルオロリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ
基がフッ素で置換された、式（１０７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキ
シ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒ
ドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基」は
、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキ
シで置換された、式（１０８）に示される構造を有する化合物を指す。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａ
とヌクレオチド配列Ｂに位置し、前記ヌクレオチド配列Ａにおけるフルオロ修飾ヌクレオ
チドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第
７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列
Ｂにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２
、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖におい
て、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフ
ルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フル
オロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖に
おいて、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４
、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖におい
て他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡ
である。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌク
レオチド配列Ａの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾
ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌク
レオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１
４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオ
チドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレ
オチドである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡ
である。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけ
るヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチ
ドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチド
であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖にお
けるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ
修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメト
キシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレ
オチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり
、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌク
レオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチド
であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオ
チドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレ
オチド配列Ａの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓ
ｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また
、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオ
チド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであ
り、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチド
である。
言い換えれば、当該ｓｉＲＮＡのリン酸－糖骨格中のリボース基は、それぞれ以下の修
飾基を有する。５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌ
クレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のグリコシル基が２’－フルオロリボース基で
あり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’－メトキシ
リボース基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセ
ンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のグリコシル基
が２’－フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオ
チドのグリコシル基が２’－メトキシリボース基であり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレ
オチド配列Ａの第５、７、８及び９位のグリコシル基が２’－フルオロリボース基であり
、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’－メトキシリボ
ース基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス
鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のグリコシル基が２’－フル
オロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコ
シル基が２’－メトキシリボース基であり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレ
オチド配列Ａの第７、８及び９位のグリコシル基が２’－フルオロリボース基であり、ｓ
ｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’－メトキシリボース
基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に
おけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のグリコシル基が２’－フルオロ
リボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル
基が２’－メトキシリボース基である。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢａ１Ｍ
１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２、ｓｉＨＢａ２Ｍ１又はｓｉＨＢａ２Ｍ２である。
ｓｉＨＢａ１Ｍ１
センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣ
ｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆ
ＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１０）
ｓｉＨＢａ１Ｍ２
センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣ
ｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１１）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆ
ＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１２）
ｓｉＨＢａ２Ｍ１
センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵ
ｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１３）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆ
ＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号１４）
ｓｉＨＢａ２Ｍ２
センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵ
ｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆ
ＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号１６）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文
字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであること
を表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ
修飾ヌクレオチドであることを表す。上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけ
でなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核
酸の安定性を向上させ、核酸により強いヌクレアーゼ加水分解耐性という性能を持たせる
。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチ
センス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少
なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において
、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合
の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いく
つかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１０１）に示さ
れる構造を有するチオリン酸エステル基である。
Figure 0007702159000009
このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性
と高い親和力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン
酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２
番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレ
オチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より選ばれ
る少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エス
テル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの
実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置
に結合されて存在する。
いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも
一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢａ１Ｍ
１Ｓ、ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓ、ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓ又はｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓである。
ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵ
ｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１７）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍ
ＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号１８）
ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵ
ｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１９）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍ
ＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号２０）
ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣ
ｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２１）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍ
ＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号２２）
ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓ
センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣ
ｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２３）
アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍ
ＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号２４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文
字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し
、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオ
チドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸
エステル基により結合されていることを表す。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオ
チドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
慣用の前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、
当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい
。
Figure 0007702159000010
また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ
Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ
． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８～４８
には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。
Figure 0007702159000011
 ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ
又はＴから選択される塩基を表す。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（１０２）に示される
、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチド
は、式（１０３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏ
ｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（１０５）に示
される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢａ１Ｍ
１Ｐ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｐ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｐ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｐ１、ｓｉＨ
Ｂａ１Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ
２ＳＰ１のいずれか１つである。
ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣ
ｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣ
ｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号２６）
ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣ
ｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣ
ｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号２８）
ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵ
ｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣ
ｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号３０）
ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｐ１
センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵ
ｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３１）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣ
ｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号３２）
ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵ
ｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３３）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣ
ｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号３４）
ｓｉＨＢａ１Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵ
ｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３５）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣ
ｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号３６）
ｓｉＨＢａ２Ｍ１ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣ
ｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３７）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣ
ｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号３８）
ｓｉＨＢａ２Ｍ２ＳＰ１
センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣ
ｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３９）
アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣ
ｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号４０）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文
字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであること
を表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ
修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌ
クレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該文
字Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン
酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
本開示の発明者は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡが、顕著に向上した血漿とリソ
ソーム安定性を有し、オフターゲット効果を低減させるだけでなく、非常に高い遺伝子抑
制活性を維持することを意外に見出した。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例
えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、
既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノ
マーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入する
ことができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌク
レオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物
組成物を提供する。
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であっても
よく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば
、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ
ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏ
ｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａ
ｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）
、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （ＰＡＭＡＭ） ｄ
ｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン
（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（
１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ
、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌ
ａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（ア
ミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｙ
ｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチ
ルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈ
ａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、こ
れらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可
能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、ｓｉＲ
ＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～５００）であってもよい。いく
つかの実施形態においては、上記重量比が１：（１～５０）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が
含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又
は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、
保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄ
ｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液
であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース
、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組
成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸
透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログ
ラムとなるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有
量を容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく
、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前
記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定され
ず、噴霧により肺に投与し、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓
）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前
記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよ
い。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な
担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂
質及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化脂質を含む。ここで、前記有機アミン
、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、それぞれＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全
体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその
薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１
種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載さ
れた式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
Figure 0007702159000012
 式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素
又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞ
れ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式
又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、
分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置
換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、
ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが
、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
Figure 0007702159000013
 式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖
を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、
Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０
１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アル
キル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、
例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結
合を有する。
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、
Ｒ１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
Figure 0007702159000014
 式（２０４）～式（２１３）中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり
、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子と
の結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子との結合
を実現するために置換されてもよい。
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されて
もよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン
及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
Figure 0007702159000015
 前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロー
ルの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジ
ルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂
質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３
～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよ
い。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクシ
ョン試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し
、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均
径は約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又
は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４
０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１
４０、１５０又は１６０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクシ
ョン試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン
、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５
０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４～約１：１８、約１：５～
約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は
約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は
約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１，１：１２、１：１３
、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在して
もよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示
により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物
は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示によ
り提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従
い調製されてもよい。
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混
合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５
ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、
薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジル
アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３０
０、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択され
る１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。
緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよ
く、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば、５．０～５．２であってもよ
く、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～
０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン
酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリ
ウムであってよい。
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくと
も２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓ
ｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）、例えば、１：４であってよい。
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提
供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５～８で
あり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０
．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的
パラメーターとしては、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～
１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであっ
てもよい。
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われ
てもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば
、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、
限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法とし
ては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過し
て除菌してもよい。
＜第１種のｓｉＲＮＡ複合体＞
１つの態様において、本開示は、上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに結合される複合
基を含む第１種のｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリ
ンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結
合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基が１～６個である。いくつかの
実施形態において、前記標的基が２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に
非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複
合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又
は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配
列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位
は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端にある。
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒ
ドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、
３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リ
ン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される
場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合
、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａ
ｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒ
ｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－
ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖ
ｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ
，２０１５，１０ （５）：１１８１～７．を参照することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能
な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合
が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法について
は、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響を
できるだけ低下させることができる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、二本鎖オリゴヌクレ
オチド投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記
載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書
に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆
汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、
ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタ
マーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトー
ス、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と
、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク
、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長
因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその
誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガ
ンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンド
は、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少
なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである
。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体
と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンド
は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。
これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表
面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの標的細胞
への送達を媒介する。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表
面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガン
ドであってもよい。いくつかの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タ
ンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、Ａ
ＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。いく
つかの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施
形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくと
も１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの
実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよ
い。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつか
の実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態におい
て、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は
単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少な
くとも１つは、グルコース及びその誘導体群、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及
びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその
誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその
誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノ
ピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グ
ルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラ
ノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノ
ース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノー
ス、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノ
ース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフ
ラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ
－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニ
ルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン
、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グ
ルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジ
デオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デ
オキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸
、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１
－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ ２，３，４－ｔ
ｒｉｓ－Ｏ－ａｃｅｔｙｌ－１－ｔｈｉｏ－６－Ｏ－ｔｒｉｔｙｌ－α－Ｄ－ｇｌｕｃｏ
ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，
７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラ
ノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チ
オリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから独立して選択されてもよい。前
記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく
、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記第１種のｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容
できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラク
トース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい
。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれ二本鎖オリゴヌクレオチド分子と、標
的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成さ
れたオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチド分子とガラクトース又
はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であ
ることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容でき
る標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に
記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合
する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態
において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ－アセチルガラクトサミン
を含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。
標的基は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標
的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、
標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の
開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、
適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
Figure 0007702159000016
 式中、
ｋは１～３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記
ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合
される。
Figure 0007702159000017
 ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であ
り、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合
され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
Figure 0007702159000018
 ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒ
ドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原
子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してア
ミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタ
ンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（ＬＡ）３トリヒドロキシ
メチルアミノメタン－ＬＢ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を
結合して形成された第１種のｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示さ
れる。
Figure 0007702159000019
 式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
同様に、ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’
端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあ
ってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は
、リンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－により３個のＮ－ア
セチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子と
ＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示される第１
種のｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３－ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
Figure 0007702159000020
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス
鎖の３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、
適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
Figure 0007702159000021
 式中、
ｌは０～３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す
。
いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０
７）に示される構造を有する。
Figure 0007702159000022
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス
鎖の３’末端に結合される。
上記複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。
例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合体の調製方法が詳しく記載さ
れている。当業者によく知られている方法により、本開示の第１種のｓｉＲＮＡ複合体を
得ることができる。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示され
る構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０
１５，１６，９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
＜第２種のｓｉＲＮＡ複合体＞
いくつかの実施形態において、本開示は、式（１）に示される構造を有する第２種のｓ
ｉＲＮＡ複合体を提供する。
Figure 0007702159000023
 式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり
、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり
、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０ア
ルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 0007702159000024
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、ＮｕはｓｉＲＮＡである。
Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修
飾のヌクレオチドであり、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含
み、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド
配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部
で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１５５に示される
ヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌ
クレオチド配列２と配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且
つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は
、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２
－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基
及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換
され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロ
アリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ
１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロ
ゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基
、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化
、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０ア
ルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シアノ基
、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－
Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基
）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェ
ニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（
Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、
－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、
－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２
（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－
ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（
Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１
０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有しても
よい。
各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子
は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ
２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン
基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置
換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテ
ロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｏ
Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハ
ロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル
基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン
化、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０
アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シアノ
基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１
－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フ
ェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ
（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基
、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基
、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ
２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、
－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２
（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ
１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有して
もよい。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６の基又はその任意の組合せからな
る群から選択されてもよく、Ａ１～Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
Figure 0007702159000025
 ただし、ｊ１は１～２０の整数であり、ｊ２は１～２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７～Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択される。
Figure 0007702159000026
 ＲｂはＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Figure 0007702159000027
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミノやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつ
かの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク
質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を
有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であっ
てもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記複合体におけるＭ１リガンドの個
数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２
であり、これにより、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３であり、Ｍ１リガンドと肝表面
のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体が細胞内取込み
（エンドサイトーシス）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実
験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝表面
のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容
易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの
実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１
＋ｎ３＝２～３である。
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２～１０の整数から選
択される場合、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タ
ンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をよ
り簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施
形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつか
の実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基
、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシからそれぞれ独立して
選択される１つである場合、いずれも本明細書で開示された複合体の性質を変化させるこ
となく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつか
の実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ
独立してＨ、メチル基及びエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１
０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、そのうち、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２
であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又
はＳＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現す
るために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状
構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合す
ることができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合
成プロセスにより本開示のｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨
格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれ
る必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中のＮに結
合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリ
ン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’
又はＢ６’であってもよい。
Figure 0007702159000028
 ただし、
Figure 0007702159000029
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
ｑ２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ
２は１～５の整数である。
Ｌ１は、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮを結合し、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複
合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は
、式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施
形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から
選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ
１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである
。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも
２つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、
４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、
Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、
１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、
２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の
原子である。
いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態にお
いて、ｊ１は３～５の整数である。ｊ２は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態に
おいて、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ１－Ｃ４のアルキル基であり、いくつかの
実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａ
は、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態にお
いて、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５のアルキル基であり、いく
つかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の
１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２
、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮとの結合
を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受
容体との結合にさらに適合させる。
いくつかの実施形態において、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、式（３）、（４
）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３
）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１
）又は（２２）に示される構造を有する。
Figure 0007702159000030
Figure 0007702159000031
Figure 0007702159000032
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡ（以上の各式におい
てＮｕに示される）配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５
９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチ
ドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮ
Ａのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において
、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結
合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前
の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓ
ｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において
、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡの
センス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、
細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し
、ＨＢＶのｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）遺伝子発現を抑制することができる。
式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可
能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’
位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９
におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌク
レオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において
、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端のヌクレオチドの３’ヒドロ
キシ基を脱水素した酸素原子に結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡの
センス鎖における１つのヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基中の水素を置換することによ
りヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５
’末端のヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに
結合される。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列は、１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチド配列２
と配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、１つ以下のヌクレオチド差異がある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列２と配列番号２に示されるヌクレ
オチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’ＢがＡ、Ｃ
又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂ
の位置での差異であり、Ｚ’ＢがＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態にお
いて、ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異により
、第２種のｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、
これらの特定のヌクレオチド差異を含む第２種のｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲
内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、
基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。前記基本的に逆相補的
であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指
し、前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミス
マッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に
ミスマッチがないことを指す。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前
記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記
ヌクレオチド配列４は、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレ
オチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、位置が対応する。いくつかの実施形態におい
て、ヌクレオチド配列４と標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドは、少なくとも一
部で相補的であり、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列４と標的ｍＲＮＡの
対応する位置のヌクレオチドは、完全に相補的である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の
５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に
結合される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド
配列４は、長さが等しく、逆相補的である。したがって、前記センス鎖及びアンチセンス
鎖の長さは、１９～２３ヌクレオチドであってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、
長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３の塩基がＡであり、この
とき、前記二本鎖領域の長さは、２０ヌクレオチドであってもよく、即ち、前記センス鎖
とアンチセンス鎖の長さの比が、２０／２０であってもよく、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチド
であり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列３の塩基が順にＧ及びＡで
あり、このとき、前記二本鎖領域の長さは、２１ヌクレオチドであってもよく、即ち、前
記センス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２１／２１であってもよく、或いは、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチド
であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＣ、Ｇ
及びＡであり、このとき、前記二本鎖領域の長さは、２２ヌクレオチドであってもよく、
即ち、前記センス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２２／２２であってもよく、或いは
、
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチド
であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＣ、Ｃ
、Ｇ及びＡであり、このとき、前記二本鎖領域の長さは、２３ヌクレオチドであってもよ
く、即ち、前記センス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、２３／２３であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３は、長さが２ヌクレオチドであ
り、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列３の塩基が順にＧ及びＧで
ある。
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが同じであり、相補的であ
るので、ヌクレオチド配列３の塩基が与えられると、ヌクレオチド配列４の塩基も決定さ
れると理解すべきである。
いくつかの実施形態において、式（１）においてＮｕに示されるｓｉＲＮＡには、長さ
が１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセ
ンス鎖の３’オーバーハング端を構成するヌクレオチド配列５がさらに含まれる。いくつ
かの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１又は２ヌクレオチドである
。このように、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、１
９／２０、１９／２１、２０／２１、２０／２２、２１／２２、２１／２３、２２／２３
、２２／２４、２３／２４又は２３／２５であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５は、長さが２ヌクレオチドであ
り、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミ
ンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチド、又は標的ｍＲ
ＮＡと相補的な２つのヌクレオチドである。したがって、いくつかの実施形態において、
Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１
／２３であり、このとき、当該ｓｉＲＮＡを含む複合体は、より良好なＡＰＯＣ３ ｍＲ
ＮＡサイレンシング活性を有する。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、配列番号１に示されるヌクレオチド配
列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配
列を含み、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺＡ－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ’ＢＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣ－３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ
Ａは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢａ１又はｓｉＨ
Ｂａ２である。
ｓｉＨＢａ１
センス鎖：５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号５）
アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番
号６）
ｓｉＨＢａ２
センス鎖：５’－ＧＡＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号７）
アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣＧＧ－３’（配
列番号８）
前述したように、式（１）においてＮｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは
、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において
、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドであり、いく
つかの実施形態において、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全
部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示の第２
種のｓｉＲＮＡ複合体がＨＢＶ遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させ
ることがない。
いくつかの実施形態において、複合体におけるｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌ
クレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、
ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又
はヌクレオチドアナログ、或いは、ヌクレオチド上の塩基が修飾された塩基であるヌクレ
オチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡ複合体が遺伝子発現を抑制する
機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。例えば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．
Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕ
ｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）：８４２－５５に開示さ
れた修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１
つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステ
ル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記ア
ンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及
び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修
飾基を有するリボース基である。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌ
クレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖と
前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は
非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体により、動物
実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られている
ことを見出した。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列１
とヌクレオチド配列２に位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配
列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から
３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチド
がフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオ
チドは５個以下であり、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列２における
フルオロ修飾ヌクレオチドは７個以下である。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖におい
て、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフ
ルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フル
オロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖に
おいて、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４
、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖におい
て他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
フルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドのそれぞれの定義と選択可
能な範囲は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示されるｓｉ
ＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列１の第５、７、８及び９位のヌクレオチドが
フルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメ
トキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示され
るｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列２の第２、６、８、９、１４及
び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス
鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖にお
けるヌクレオチド配列１の第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチド
であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドで
あり、また、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのアンチセン
ス鎖におけるヌクレオチド配列２の第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ
修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメト
キシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖にお
けるヌクレオチド配列１の第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオ
チドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチ
ドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのアンチ
センス鎖におけるヌクレオチド配列２の第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフル
オロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドが
メトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチドは、リン酸基修飾を有する。いくつか
の実施形態において、リン酸基修飾は、以下の式（１０１）に示されるチオリン酸（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）修飾であり、即ち、１つの硫黄原子でリン酸ジエステル結
合における非架橋酸素原子を置換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジ
エステル結合を置換する。当該修飾により、ｓｉＲＮＡの構造を安定化させ、塩基対合の
高い特異性と高い親和力を維持することができる。
Figure 0007702159000033
いくつかの実施形態において、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステ
ル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌ
クレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと
３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なく
とも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は
、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態
において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合さ
れて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のう
ち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間。
いくつかの実施形態において、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖配列の
５’末端のヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌ
クレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修
飾ヌクレオチドは、式（１０２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチド、式
（１０３）に示される、ビニルリン酸エステル（Ｅ－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ
、Ｅ－ＶＰ）を含むヌクレオチド、又は式（１０５）に示される、５’－チオリン酸修飾
を含むヌクレオチドである。
本開示の発明者は、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体が、顕著に向上した血漿中安定
性、低いオフターゲット効果を有するとともに、明らかに低下していないＨＢＶ ｍＲＮ
Ａサイレンシング活性をさらに示し、さらに高い脂質抑制作用を有することを意外にも見
出した。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体
においてＮｕに示されるｓｉＲＮＡは、表１に示されるｓｉＲＮＡであってもよい。
Figure 0007702159000034
Figure 0007702159000035
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチ
ド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエ
ステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電
荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基として存在してもよく、ヒドロキシ基又は
スルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。
前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４ ＋
、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、いくつかの
実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成され
たアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種で
ある。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンによ
り形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び
／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであっ
てもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なく
とも一部が塩として存在してもよい。１つの態様において、リン酸ジエステル結合又はチ
オリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナト
リウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナト
リウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマ
ーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入するこ
とができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌク
レオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌク
レオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
＜第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により上記第２種のｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
いくつかの実施形態において、第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製す
ることができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮ
Ａのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向か
ってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カッ
プリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及び
アンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記における各ヌクレオチドは、
それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡは、
センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記ア
ンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチ
ド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列
１と配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド
差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列２と配列番号１５６に示されるヌクレオチ
ド配列とは、長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである。
前記ヌクレオチド配列１に、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌク
レオチド配列２に、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３
２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチ
ド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチ
ド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分
子とも呼ばれる。
Figure 0007702159000036
 式中、
Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡに結合できる部分である。いくつかの実施形態にお
いて、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合することができる部分で
ある。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりｓ
ｉＲＮＡの任意の官能基に複合することができる部分であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された
基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメ
チル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロ
ピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立
して選択される１つである。
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、
Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（１）のｓｉＲＮＡ複合体の合成に
適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、
Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡと
Ａ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、ｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と
亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基、及びヒドロキシ基又はアミノ基
と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基を含み、或いは、前記共有結
合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は
、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実
施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボン酸又はカルボン酸
塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の
他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基によ
り形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合
、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態
において、前記固相担体は樹脂である。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲｋ又は式（
Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（
Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
Figure 0007702159000037
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒ
ｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 0007702159000038
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホ
スホルアミダイト官能基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位
置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリ
ング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン
酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合さ
せることができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）の化合
物は、ヌクレオチドに複合することができ、式（１）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得
に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲ
ＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配
列において末端のヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程にお
いてリン酸ジエステル結合結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化
合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。
いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前
記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第
２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カ
ルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボ
ン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ
基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により
結合された、又はアミド結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前
記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の
固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン
酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記
固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレ
オシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセン
ス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護さ
れ、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイ
ト基とカップリングさせる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒド
ロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、
カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相
担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として
固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従
いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はア
ンチセンス鎖を得る。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ－Ｍ＋で
表されてもよく、ここで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウ
ムカチオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。いくつかの
実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、
例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮し
、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成さ
れたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンに
より形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成
されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリ
エチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である
。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１
０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む
。
Figure 0007702159000039
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ｑ２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであ
り、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 0007702159000040
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は
２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。いくつかの実施形
態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施
形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシ
トリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，
４’－トリメトキシフェニルメチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態におい
て、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔ
ｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
Ｌ１の定義は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１リガンドを窒素含有骨格上のＮ原子に結合
し、オリゴヌクレオチド複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実
施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルア
ミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複
合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌク
レオチド配列の末端に結合された、ｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて
、特に説明がない限り、以下に複合体の調製に関する記載において、「脱保護」、「カッ
プリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で
公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた、同様にこれ
らの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説
明する。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態に
おいて、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキ
シ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１
に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの
実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒド
ロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護され
たヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１－Ｃ１０アル
キル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基及びＣ６－Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は
、ハロゲン及びＣ１－Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態に
おいて、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モ
ノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル
基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１－Ｃ６アル
キルフェニル基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる
群から選択される。
Figure 0007702159000041
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロ
メチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基
、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキ
ルフェニル基から独立して選択される１つであり、本開示の複合分子を簡略化する目的で
、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
前述したように、第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合
成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合
、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆
も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさ
らに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合
される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１
）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１リガンドに変換される）、複合分子が結合
されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又は
センス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成
し、式（１）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
いくつかの実施形態において、第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング
反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖
又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）
に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト
固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序によ
り、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖
又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護され
たヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を
有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレ
オシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノ
マーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、
複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイ
ト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、
３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又は
センス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピン
グ、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製
して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲ
ＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から
５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成
し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫
化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアン
チセンス鎖を得る工程と、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式
（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合され
たアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれ
る式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除
去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセ
ンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の
３’末端に結合され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキ
シ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有す
る第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カッ
プリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシ
ドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得
ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３
’－５’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合
成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成す
ること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のｓｉ
ＲＮＡ複合体を得ることを含む。
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱
保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件と
しては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５～３５℃であり、
反応時間が３０～３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０～１５０秒であり
、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選
択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸で
ある。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比が１０：１～１０００：１であり、
いくつかの実施形態において、５０：１～５００：１である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適し
た任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成
方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０～
５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５～３５℃である。式（３２１）の化合
物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態に
おいて、１：２～１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比が
１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：３～１：１０であ
り、反応時間が２００～３０００秒であり、いくつかの実施形態において、５００～１５
００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラ
ゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、い
くつかの実施形態において、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリン
グ反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭ
Ｆ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態にお
いて、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量
が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである
。
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製さ
れた複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’
の方向に従いｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合分子は、得られ
たセンス鎖の３’末端に結合される。
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマ
ーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の
種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、
酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬及び用量を含み、本分野で通常用いられ
る各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成
では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実
施形態においては、１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒であり、いくつかの
実施形態において、５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロ
ロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いく
つかの実施形態においては、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４
’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は、２：１～１００：１であり、いくつかの実
施形態において、３：１～５０：１である。
カップリング反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態におい
て、１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモ
ル比が１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態において、１：５～１：１５であり
、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１～１：１００で
あり、いくつかの実施形態において、１：５０～１：８０であり、反応時間とカップリン
グ試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態におい
て、１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒であり、いくつかの実施形態において
、１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング
試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００～１００：１であり
、いくつかの実施形態において、１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等
モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ－メチル
イミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０～１０：１０：
１であり、いくつかの実施形態において、１：１：２～２：２：１である。
酸化反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５
～３５℃であり、反応時間が１～１００秒であり、いくつかの実施形態において、５～５
０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である（いくつかの実施
形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相
担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１～１００：１であってもよく、いくつか
の実施形態において、５：１～５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化
反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行わ
れる。硫化反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、
１５～３５℃であり、反応時間が５０～２０００秒であり、いくつかの実施形態において
、１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒ
ドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列と
のモル比が１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態において、１０：１～５
００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリ
ジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、ｓｉＲＮＡ
のセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知
であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸
基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド
上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行わ
れてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水
と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－をヒドロキシ基
に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（１）に示される複合体を生成する
。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃
アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．
８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくともいくつかの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合
、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素
酸塩と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。
この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列には、遊離の２’－ヒドロキシ基の対応す
るヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とす
るｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ／μｍｏｌである。このよ
うに式（１）のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマト
グラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製
を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩
することができる。
このように得られたｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結
合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナト
リウムイオンに結合されており、ｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在
する。熟知のイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウ
ムイオンを置換し、他の形式のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、
前述したとおりである。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御す
ることができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロ
マトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析によ
り分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ
鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し
、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このよう
に第２種のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
前記複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィー
タンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成された第２種のｓｉＲＮＡ
複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計の第２種のｓｉＲ
ＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、合成しようとするｓｉＲＮ
Ａの配列と一致し、例えば表１に示される配列の１つであると確認することもできる。
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基
とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ
、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法
により得ることができる。
Figure 0007702159000042
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において
、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
Figure 0007702159000043
 式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊
離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この
場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２
の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られ
る。
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が８～４
８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温
度が１０～４０℃であり、反応時間が２０～３０時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハ
ロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ
，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態におい
て、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エー
テル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記
ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロ
エタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロ
ロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３
～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において
、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモ
ル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例
えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３
）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において
、２：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組
合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第
３級アミン類有機塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミン
類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記
第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～２０：１
であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の
形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換
溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここ
で詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエ
チルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０
．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態において、０．４～０．６Ｍであり、式（３
１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が３～６Ｌ／ｍｏｌ
であり、いくつかの実施形態において４～５Ｌ／ｍｏｌである。
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することがで
きる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法に
より式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：
２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロ
ロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出する、又は、（２）逆相
精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．
１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実
施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ
、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で
、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応
により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させる
ことをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官
能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（
３２１）の化合物が得られる。
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのい
くつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ
官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担
体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。後に核酸固相合成を行いやすくするために
、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、いくつかの実施形態において、粒子径１００～
４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～
０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と
固相担体との用量比は１０～４００μｍｏｌ化合物／１グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ
）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体
との用量比は５０～２００μｍｏｌ／ｇである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いく
つかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル
類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムア
ミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり
、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで
あり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２
－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤
は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が２０
～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌであ
る。
前記縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾ
ール４（３Ｈ）－オン及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキ
サフルオロホスフェートであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｏ－ベンゾトリ
アゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。前記縮合剤と式
（３２１）に示される化合物とのモル比が１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態
において１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び
／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，
Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に
示される化合物とのモル比が１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１
：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合生成
物をキャッピング反応条件下で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒
と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。
前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避け
るために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前
記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態
において、１５～３５℃であり、反応時間が１～１０ｈであり、いくつかの実施形態にお
いて、３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合
成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬Ａ（ｃａｐＡ）及びキャッピング試薬Ｂ（ｃａｐＢ）からなり、キャッピング試薬Ａは、Ｎ－メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールの体積との比は１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１～１：１０であり、いくつかの実施形態において１：２～１：６である。
いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリ
ル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであ
り、いくつかの実施形態において、１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物
のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１
０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ
－メチルイミダゾールを用いる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エ
ーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつか
の実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に
対して、前記有機溶剤の用量が１０～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態におい
て、５～３０Ｌ／ｍｏｌである。
前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例え
ばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシ
ル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化
合物との質量比が０．００１：１～１：１であり、いくつかの実施形態において、０．０
１：１～０．１：１である。
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することがで
きる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物
、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物
を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールか
ら選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶
剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に
示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化
合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１
の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（
３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が０～５０℃であ
り、例えば１５～３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル
比が１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）の
化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１～１：１００であってもよく、例えば１：
５０～１：８０であり、反応時間が２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～
１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）
（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、本分野で
公知の方法により合成してもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチ
ルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又
は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング
反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ
、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリル
である。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の
用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カ
ップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホ
ルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態にお
いて、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製
品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応
条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を
、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピン
グ反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１
の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官
能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用で
きる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈ
ａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
Figure 0007702159000044
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件として
は、温度が０～５０℃であり、例えば１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、
例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジク
ロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形
態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴ
ｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例
えば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応
活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カッ
プリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルア
ミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が０～５０℃であ
り、例えば１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒であり、例えば１０～１００秒
であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の
選択と用量は、以上のとおりである。
酸化反応条件としては、温度が０～５０℃であり、例えば、１５～３５℃であってもよ
く、反応時間が１～１００秒、例えば、５～５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えば
、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。い
くつかの実施形態において、酸化試薬と亜リン酸エステル基とのモル比が１：１～１００
：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態において、
前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶
剤で行われる。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
Figure 0007702159000045
 式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下
及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される
化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）の化合物と接触させ、その後単
離する、という調製方法により得ることができる。
Figure 0007702159000046
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりで
ある。
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が１～４８
時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反
応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、
エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチル
ホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記ア
ルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノー
ルの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポ
キシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
である。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつか
の実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタン
である。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、
いくつかの実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１
－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキ
シホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメ
トキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅ
ｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙ
ｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロ
キノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロホスフェートであり、更なる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，２
，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１
４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形
態において、２．５：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又は
Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジ
イソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示され
る化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～
１０：１である。
式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい
。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応
させて式（Ａ－１）の化合物を調製することができる。同様に、３－アミノ－１，２－プ
ロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ－２）
の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４～１３、いくつかの
実施形態において４～８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解でき
るように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ～２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対
応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、
前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、以下類推してもよい
。
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－
アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（
３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、こ
れらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当
業者が上記方法により容易に実現するものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチ
ル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１
：０．６で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：ア
セトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー
条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（
３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いる
ことができる。
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、
脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させた後、単離す
ることを含む調製方法により得ることができる。
Figure 0007702159000047
 式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基か
ら選択され、いくつかの実施形態において、Ｒ７の構造が式（３３０）に示される。
Figure 0007702159000048
 ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、
Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸か
ら選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢
酸である。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が０．１～２
４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間
が０．５～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハ
ロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ
，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、い
くつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エー
テル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ
－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１
５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形
態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１～１００：１で
あり、いくつかの実施形態において、１０：１～５０：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相
充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという
２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、
溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、
そのまま後の反応に用いることができる。
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級ア
ミン類有機塩基の存在下及び縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３
１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることが
できる。
Figure 0007702159000049
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１
４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０
１４，１３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式
（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特
許ＵＳ８１０６０２２Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６
）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細
書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が０～１００℃で
あり、反応時間が０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１
０～４０℃であり、反応時間が０．５～１６時間である。
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が
２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１で
ある。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エ
ーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポ
キシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
であり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつか
の実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
である。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであ
り、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノ
ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベ
ンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメ
チルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４－（４，６－ジメトキシトリアジン－
２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩であり、いくつかの実施形態において、４－（
４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩である。前記
アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１～１０：１であ
り、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１である。
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ
－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルモルホ
リンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１７）に示される化合物とのモル比が
３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１０：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１００：５～１００：７で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填
剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという２つ
のクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤
を直接に除去して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、その
まま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合
物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成する。この場合、各Ｓ１－
Ｌ１部分同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）
の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１
６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類
以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化
合物に対して、それを２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物と接触させ、式（３１７）の
化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１－Ｌ１部分を結合した後、続いて
（ｎ３＋ｎ１－１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ、（ｎ３及びｎ１の定
義と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１
－１）個の第二級アミン基に第２のＳ１－Ｌ１部分を結合することができる。
いくつかの実施形態において、式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及
び脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ
た後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 0007702159000050
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１
４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０～１５０℃であり、反応時間が５～７２時
間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が２０～８０℃であり、反応時間が１
０～３０時間である。
前記有機溶剤は、アルコールから選択され、いくつかの実施形態において、メタノール
、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、いくつかの実施形態において、メタノ
ールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１～２０Ｌ／ｍｏｌ
であり、いくつかの実施形態において、１．５～１０Ｌ／ｍｏｌである。
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０～４０質量％であってもよく、メチルアミンと式
（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１～５００：１であってもよく、いくつ
かの実施形態において、５０：１～２００：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリ
カゲル：（１）２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノ
ール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５～１：１：０．２５で勾配溶出す
る、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１
：１～１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することが
できる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗
製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及
び置換反応条件下で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（Ｔ
ｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメ
タン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルク
ロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることが
できる。
Figure 0007702159000051
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記置換反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が５～７２時間
であってもよく、いくつかの実施形態において、反応条件としては、反応温度が１０～４
０℃であり、反応時間が１０～３０時間である。
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フ
ェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品を
購入することができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニ
ルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロ
メタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、
いくつかの実施形態において、１：１～３：１である。
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメ
チルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルア
ミンの１種又は複数種であってもよい。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態にお
いて、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであってもよく、前記エーテル類溶剤は
、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエー
テルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロ
メタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつ
かの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１９）の化合物
に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、いくつかの実施形
態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメ
タン＝０．０１：１～０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石
油エーテル＝０．１：１：１：１～１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ
１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配
溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施
形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、
当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、
置換反応条件下で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ
た後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 0007702159000052
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エ
ーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつか
の実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
であり、いくつかの実施形態において、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン
化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
である。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１～５０Ｌ／ｍｏｌであ
り、いくつかの実施形態において、１～２０Ｌ／ｍｏｌである。
前記置換反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が５～７２時間
であってもよく、いくつかの実施形態において、前記置換反応条件としては、反応温度が
１０～４０℃であり、反応時間が１０～３０時間である。
式（３２０）の化合物は、市販品を購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて
得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０
、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化
合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１～１
０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～５：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメ
タン＝０．０１：１～０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石
油エーテル＝０．１：１：１：１～１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ
１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配
溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施
形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、
当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
本開示の第１種又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併
用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は
複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと
。
＜本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉ
ＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明で提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物
、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体の、前記Ｂ型肝炎ウイ
ルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使
用を提供する。
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明は、本発明で提供されるｓｉＲＮＡ、薬
物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体を患者に投与
することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供
する。
本発明の他のいくつかの実施形態によると、本発明は、本発明で提供されるｓｉＲＮＡ
、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体を、慢性
Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させることを含む、前記慢性Ｂ型肝炎ウイル
スに感染した肝炎細胞におけるＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患は、慢性肝疾患、炎症、線維
性疾患及び過形成性疾患から選択される。
本発明のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２
種のｓｉＲＮＡ複合体を、それを必要とする患者に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構
によりＢ型肝炎を治療する目的を達成することができる。したがって、本発明のｓｉＲＮ
Ａ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治
療に用いられ、又はＢ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることがで
きる。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組
成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部
、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示の修飾ｓ
ｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体
を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身
投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体全身よりも多くの本開示の修飾ｓｉＲ
ＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体が特
定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１
種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体が被験体のほぼ全身に送達さ
れる。本開示が血中脂質異常の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを
考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法
である。
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、
経口投与又は胃腸外経路（非経口経路）、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、
経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口
腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、
１週間、２週間、３週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第
２種のｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量
は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細
胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０
（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反
応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に
陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究に
より得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
本発明に記載された薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又
は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌ
Ｖｒマウスに対して、前記薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡの量とし
て、（ｉ）第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体について、そ
のｓｉＲＮＡ用量が０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、更なる実施形態
において、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態において、０．０
５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更なる実施形態において、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ
体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成
物について、そのｓｉＲＮＡ用量が０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、更
なる実施形態において、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態にお
いて、０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更なる実施形態において、０．１～３ｍ
ｇ／ｋｇ体重である。
また、本発明のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を、慢
性ＨＢＶに感染した肝炎細胞に導入することにより、さらにはＲＮＡ干渉機構により、慢
性ＨＢＶに感染した肝炎細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する目的を達成すること
もできる。いくつかの好ましい実施形態において、前記細胞はＨｅｐＧ２．２．１５細胞
である。
本発明で提供される方法により細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する。提供され
るｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複
合体のいずれを用いるかにかかわらず、ｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現
を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０５ｎ
Ｍ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度
を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の
細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位
における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
＜キット＞
本開示は、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２
種のｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡ
を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは
、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態におい
て、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いく
つかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓ
ｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。い
くつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及
び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
本開示のキットにおいて、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は
添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又
は第２種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は
、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又
は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又は複合体及び薬学的に許容できる任意の添
加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示
のキットで無菌水を提供することができる。
（発明の効果）
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、組成物又はｓｉＲ
ＮＡ複合体は、体内でより高い安定性、より低い毒性及び／又はより高い活性を有するこ
とができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲ
ＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつ
かの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉ
ＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、
８０％、９０％又は９５％の肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態に
おいて、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は
、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
又は９５％の動物モデルにおける肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形
態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合
体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％又は９５％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開
示により提供されるｓｉＲＮＡ、組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、明らかなオフターゲッ
ト効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の正常
発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制がオンターゲット遺
伝子効果に比べて５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％を下回る場合、当該オフタ
ーゲット効果が顕著ではないと考えられている。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、動物レベ
ルの毒性が低い。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿
中で７２ｈ分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイ
ザル血漿中で７２ｈ分解されず、サル血漿における優れた安定性を示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来
のリソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる
安定性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、特異的に
肝臓において顕著に富化して安定化し、高度な標的性を有することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、試験時点
が異なる複数回の試験のいずれにおいても、高いマウス体内ＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制活性を
示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、異なる動
物モデルのいずれにおいても、持続的で効率的な血清ＨＢｓＡｇ抑制効率を示し、規律的
な用量依存性を示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高
い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有する。
以下に調製例及び実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何
ら制限されない。
以下に実施例により本発明を詳しく説明する。特に説明がない限り、以下の実施例で用
いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載
を参照して行われる。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として
計算される。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒ
ｉ／Ｊ：北京大学医学部実験動物科学部から購入する。実験前にＳ／ＣＯＶ＞１０のマウ
スを選択し、以下、単に４４Ｂｒｉモデルマウスということもある。
ＨＢＶトランスジェニックマウス：Ｍ－Ｔｇ ＨＢＶと命名し、上海市公衆衛生センタ
ー動物部から購入、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ｒｅｎ Ｊ．ら、Ｊ． Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００６，７８：５５１～５６０に記載され、以下
単にＭ－Ｔｇモデルということもある。
ＡＡＶ－ＨＢＶトランスジェニックマウス：文献の方法（董小岩ら、Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ ２０１０，Ｍａｙ ２５，２６（５）：６７９～６８６）によりＡＡＶ－
ＨＢＶモデルマウスを調製した。ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ、Ｄ型（ａｙｗ）ウイルス（
北京五加和分子医学研究所有限公司から購入、１×１０１２ウイルスゲノム（ｖ．ｇ．）
／ｍＬ、ロット番号２０１６１２３０１１）を無菌ＰＢＳで５×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬ
に希釈し、１匹のマウスあたり希釈されたｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを２００μＬ注射し
た（即ち、１匹のマウスあたり１×１０１０ｖ．ｇ．注射した）。ウイルスを注射した後
の２８日目に、全てのマウスに対して眼窩採血（約１００μＬ）を行い血清を回収してＨ
ＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡを検出するために用い、以下、単にＡＡＶ－ＨＢＶモデルマ
ウスということもある。
低濃度ＡＡＶ－ＨＢＶトランスジェニックマウス：実験前に、ウイルスを無菌ＰＢＳで
１×１０１１（ｖ．ｇ．）／ｍＬに希釈し、１匹のマウスあたり１００μＬのウイルスを
注射し、即ち、１匹のマウスあたり１×１０１０ｖ．ｇ．注射したこと以外、上記とほぼ
同じモデリング方法を採用し、以下単にＡＡＶ－ＨＢＶ低濃度マウスモデルということも
ある。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６－ＨＢＶ：品種名：Ｂ６－Ｔｇ ＨＢ
Ｖ／Ｖｓｔ（１．２８ｃｏｐｙ、ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ）、北京維通達生物技術有限公司
から購入する。実験前にＣＯＩ＞１０４のマウスを選択し、以下単に１．２８ｃｏｐｙモ
デルということもある。
（調製例１）複合体１～１１の調製
本調製例では、複合体１（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体ともいう）、
複合体２（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ複合体ともいう）、複合体３（以下、Ｌ
１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰｓＴ複合体ともいう）、複合体４（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢ
ａ１Ｍ１ＳＰｓ複合体ともいう）、複合体５（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓともい
う）、複合体６（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓともいう）、複合体７（以下、Ｌ１
０－ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓともいう）、複合体８（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｓとも
いう）、複合体９（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓともいう）、複合体１０（以下、
Ｌ１０－ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓともいう）、複合体１１（以下、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ２Ｍ１
Ｓともいう）を合成した。前記複合体は、Ｌ－９複合分子がそれぞれ番号Ｌ１０－ｓｉＨ
Ｂａ１Ｍ１ＳＶＰ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰｓＴ
、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰｓ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ
１Ｍ２Ｓ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｓ、Ｌ１０－ｓｉＨ
Ｂａ１Ｍ２Ｓ、Ｌ１０－ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓ又はＬ１０－ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓのうちのｓ
ｉＲＮＡと複合した後に形成された複合体であった。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡ
の配列は、表３に示される。
（１－１）Ｌ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。
Figure 0007702159000053
（１－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成
Figure 0007702159000054
（１－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：
１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌ
の無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、
５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水
に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセ
トニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、
溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。
（１－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１
３ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．
０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０
８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタン
により１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状
製品ＧＡＬ－３を得た。
（１－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３
６ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、
９．０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－
ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素
保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応さ
せた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、
珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗
浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわ
せ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で
洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１
．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行
った。
（１－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４
．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶
解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡ
Ｓ番号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え
、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６
７－０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一
晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを
加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで１回あ
たり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節
し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ－５
を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ １２．０１ （ｂｒ，１Ｈ
），７．８３ （ｄ，Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．２
Ｈｚ，１Ｈ），４．９６ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．４
９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，１Ｈ），４．０７ － ３．９５ （ｍ，３Ｈ），３
．９２ － ３．８５ （ｍ，１Ｈ），３．７４ － ３．６７ （ｍ，１Ｈ），３．４
８ － ３．３９ （ｍ，１Ｈ），２．２０ （ｔ，Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ，２Ｈ），２
．１１ （ｓ，３Ｈ），２．００ （ｓ，３Ｈ），１．９０ （ｓ，３Ｈ），１．７７
（ｓ，３Ｈ），１．５５ － １．４５ （ｍ，４Ｈ）．
（１－１－２）Ｍ－１１－Ｔ３の合成：
Figure 0007702159000055
 Ｊ－０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌの
アセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて
氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加
え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ
、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後
の反応に用いた。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４
７７．３５、実測値：４７７．６５。
（１－１－３）Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒの合成：
Figure 0007702159000056
 Ｍ－１１－Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに
溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１
．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、飽和炭酸水素ナトリウ
ムで反応液を１回あたり２０ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有
機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油
ポンプで一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒを得た。Ｍ
Ｓ ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測
値：７４１．５３。固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒは、精製することなく、引き続き次
のＭ－１８－Ｔｒの合成に使用した。
（１－１－４）Ｍ－１８－Ｔｒの合成：
Figure 0007702159000057
 工程（１－１－３）で得られたＭ－１１－Ｔ３－Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍ
ｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質
量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発
乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のジクロロメタン：メタノール混合溶剤を加え、５０
ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり
５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に
溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００～３００メッシュの順
相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミン
でシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％
）＝１：１：０．０５～１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を
減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋なＭ－１８－Ｔｒを
得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．４７ － ７．３９ （ｍ
，６Ｈ），７．３２ －７．２４ （ｍ，６Ｈ），７．１９ － ７．１２ （ｍ，３Ｈ
），２．６０ － ２．４７ （ｍ，４Ｈ），２．４６ － ２．１９ （ｍ，１３Ｈ）
，１．７０ － １．５５ （ｍ，４Ｈ），１．４０ （ｐ、Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ，２
Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測
値：４３２．６１。
（１－１－５）Ｌ－５－Ｔｒの合成：
Figure 0007702159000058
 工程（１－１－４）で得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工
程（１－１－１）で得られたＧＡＬ－５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）とを混合し
て４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９
６ｍｍｏｌ）及び４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホ
リン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反
応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナ
トリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１
ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１
００：５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９
ｇの純粋なＬ－５－Ｔｒを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．
８３ － ７．１０ （ｍ，４Ｈ），７．６７ － ７．６０ （ｍ，１Ｈ），７．４４
－ ７．３４ （ｍ，６Ｈ），７．３３ － ７．２４ （ｍ，６Ｈ），７．２０ －
７．１５ （ｍ，３Ｈ），５．２２ （ｓ，３Ｈ），４．９７ （ｄ，Ｊ ＝ １１．
３ Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０６ － ３
．０７ （ｍ，９Ｈ），３．９５ － ３．８３ （ｍ，３Ｈ），３．７７ － ３．６
４ （ｍ，３Ｈ），３．４５ － ３．３５ （ｍ，３Ｈ），３．１２ － ２．８７
（ｍ，８Ｈ），２．３０ － ２．１５ （ｍ，３Ｈ），２．１１ － １．９８ （ｍ
，２２Ｈ），１．９５ － １．８４ （ｍ，１１Ｈ），１．８１ － １．６１ （ｍ
，１４Ｈ），１．５４ － １．３６ （ｍ，１４Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１
９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
（１－１－６）Ｌ－８の合成：
Figure 0007702159000059
 工程（１－１－５）で得られたＬ－５－Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６
９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈
し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水相
をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００
～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの
酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固して４．２６ｇの純粋なＬ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳ
Ｏ） δ ７．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ，３Ｈ），７．２７ － ７．２３
（ｍ，１Ｈ），７．１３ － ７．１８ （ｍ，１Ｈ），５．２２ （ｄ，Ｊ ＝ ３．
１ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．３，３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．
４８ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０９ － ３．９８ （ｍ，９Ｈ），
３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．３，９．３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７５ － ３．６６
（ｍ，３Ｈ），３．４４ － ３．３８ （ｍ，３Ｈ），３．１７ － ３．３０ （
ｍ，４Ｈ），３．１０ － ２．９７ （ｍ，４Ｈ），２．３５ － ２．２０ （ｍ，
６Ｈ），２．１５ － ２．０８ （ｍ，９Ｈ），２．０７ － １．９８ （ｍ，１３
Ｈ），１．９４ － １．８７ （ｍ，９Ｈ），１．８１ － １．７４ （ｍ，９Ｈ）
，１．６５ － １．４２ （ｍ，１８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３
０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
（１－１－７ａ）Ａ－１の合成
Figure 0007702159000060
 ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５
ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和
物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、反応液を濾過
し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し、残りを
５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐ
Ｈ＝７～８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり
２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶
剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エ
ーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１
：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、５００ｍｌの
ジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１
回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ
、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩
減圧し、２０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，Ｄ
ＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ ６．５，２．３，１．１ Ｈｚ，１
Ｈ），７．４０ － ７．２８ （ｍ，７Ｈ），６．８９ － ６．８１ （ｍ，４Ｈ）
，４．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．３６ － ４．２４ （ｍ，１
Ｈ），４．２９ （ｓ，６Ｈ），３．９２ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．４，７．０ Ｈｚ，
１Ｈ），３．６７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．３，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），２．５２ （ｑ
，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，６Ｈ），１．０３ （ｔ，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，９Ｈ）．
ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６，［Ｍ－Ｈ］－、理論値：４０７．１５、実測値：４０
６．９２。
（１－１－７ｂ）Ｌ－７の合成：
Figure 0007702159000061
 工程（１－１－６）で得られたＬ－８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）と工程（
１－１－７ａ）で得られたＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）とを混合し、１
６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオ
キサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加
え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、
２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相
をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を
洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩
発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００～３０
０メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテ
ル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５
～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２
．３３６ｇの純粋なＬ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７
．９０ － ７．７８ （ｍ，４Ｈ），７．７５ － ７．６４ （ｍ，１Ｈ），７．３
８ － ７．１８ （ｍ，９Ｈ），６．９１ － ６．８３ （ｍ，４Ｈ），５．２５
－ ５．１０ （ｍ，４Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，３
Ｈ），４．４８ － ４．３０ （ｍ，４Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．９３ －
３．８４ （ｍ，３Ｈ），３．７６ － ３．６６ （ｍ，９Ｈ），３．４５ － ３
．３５ （ｍ，３Ｈ），３．２４ － ２．９８ （ｍ，１０Ｈ），２．３０ － ２．
２０ （ｍ，２Ｈ），２．１１ － １．８８ （ｍ，３１Ｈ），１．８０ － １．４
０ （ｍ，２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋
、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
（１－１－８）Ｌ－９複合分子の合成：
Figure 0007702159000062
 工程（１－１－７ｂ）で得られたＬ－７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク
酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を
加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗
浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発
乾固して２．７７４ｇの粗製品を得た。カラム精製には、６０ｇの２００～３００メッシ
ュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジ
クロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メ
タノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減
圧蒸発乾固して１．８７４ｇの純粋なＬ－９複合分子を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００
ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ，Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．９４
－ ７．８２ （ｍ，３Ｈ），７．４１ － ７．２９ （ｍ，５Ｈ），７．２２ （ｄ
，Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ，５Ｈ），６．８９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ，４Ｈ），５
．４９ － ５．３７ （ｍ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ，３Ｈ）
，４．９７ （ｄ，Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．２
Ｈｚ，３Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．４、９．
４ Ｈｚ，３Ｈ），３．７７ － ３．６５ （ｍ，９Ｈ），３．５０ － ３．３９
（ｍ，６Ｈ），３．１１ － ２．９０ （ｍ，５Ｈ），２．６１ － ２．５４ （ｍ
，４Ｈ），２．４７ － ２．４１ （ｍ，２Ｈ），２．２６ － ２．１７ （ｍ，２
Ｈ），２．１５ － １．９５ （ｍ，２２Ｈ），１．９２ － １．８４ （ｍ，９Ｈ
），１．８０ － １．７０ （ｍ，１０Ｈ），１．６５ － １．３５ （ｍ，１７Ｈ
）、１．３１ － １．１９ （ｍ，４Ｈ），０．９６ （ｔ，Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ，
９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１
６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
（１－１－９）Ｌ－１０化合物の合成：
Figure 0007702159000063
 この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物
を調製した。
工程（１－１－８）で得られたＬ－９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ
）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｈ
ＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶
解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（０．９０１ｇ、１００～２０
０メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃
でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応させた後に濾過し、ケ
ーキをＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３０ｍ
ｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空油ポンプで２ｈ乾燥
させ、その後、表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４－ジメチルアミ
ノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５
℃でシェーカーに放置し、回転数２００回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケ
ーキをアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、乾燥させるまで吸引濾過し
、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１．１００ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ－
１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。
Figure 0007702159000064
 ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積
％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとア
セトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニ
トリル溶液であった。
（１－２）複合体１～１１のセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の
条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は
、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体に
おける４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結
合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合
される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒で
あり、カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールの０．５Ｍアセトニト
リル溶液であった。
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒
であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶
液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物
：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試
薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体
に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：
ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫
化試薬がキサンタンヒドリドであった。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体
に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であった。反応をアセトニトリル：ピリジ
ン＝１：１の混合溶剤で行った。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配
列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏ
ｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）に
より、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）
であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１
）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤
Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相ク
ロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカ
ラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液
体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。
（１－３）複合体１～１１のアンチセンス鎖の合成
（１－３Ａ）複合体１、６、１１のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａ
ｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉ
ｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１及び複
合体２のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、
キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合
成と同じであった。
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド
モノマー（ＶＰ－Ｕｍ）（２’－ｍｅｔｈｏｘｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒａｃｉｌ ｎ
ｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ （ＶＰ－Ｕｍ））は、以下の方法に従い合成され
た。
Figure 0007702159000065
（１－３－１）ＶＰ－Ｕ－２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ－Ｕ－２分子を合成した。
Figure 0007702159000066
２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド（２’－ＯＭｅ－Ｕ、５１．３０ｇ、９１．
６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５
ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合
して４５０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪
拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後３００ｍｌの
飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり
３００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗
浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発させた後ＶＰ－Ｕ－１粗製品を得、そのまま後のＶＰ－
Ｕ－２の合成に用いた。
ＶＰ－Ｕ－１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分
間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ－トルエンスルホ
ン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール－ジクロロメタン混合溶剤である）を加え
、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエ
ンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄し
た。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわ
せ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発させた。２
００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、
石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５～１：
１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油
ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－２を得た。１Ｈ ＮＭＲ （
４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ，１Ｈ
），７．６４ （ｄｔｄ，Ｊ ＝ ５．１，４．０，２．２ Ｈｚ，４Ｈ），７．４１－
７．３０ （ｍ，６Ｈ），６．７９ （ｄ，Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ，１Ｈ），５．７３
（ｄ，Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ，１Ｈ），４．９４ （ｔ，Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ，１Ｈ）
，４．１２ （ｔｄ，Ｊ ＝ ４．６，３．９ Ｈｚ，１Ｈ），４．０５ （ｄｄ，Ｊ
＝ ４．８、４．０ Ｈｚ，１Ｈ），３．９６ （ｔ，Ｊ ＝ ４．７ Ｈｚ，１Ｈ），
３．６８ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ １１．８，７．０，４．６ Ｈｚ，１Ｈ），３．５７ －
３．４６ （ｍ，１Ｈ），３．３９ （ｓ，３Ｈ），１．０５ （ｓ，８Ｈ）． ＭＳ
ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：
４９７．４５。
（１－３－２）ＶＰ－Ｕ－４の合成：
Figure 0007702159000067
 ＶＰ－Ｕ－２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏ
ｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレ
ンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦ
に溶解させ、氷浴で降温させ、氷浴温度でｔ－ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍ
ｏｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させ
、その後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで
昇温して１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで
１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回
洗浄した後に乾燥させるまで溶剤を蒸発させた。２００～３００メッシュの順相シリカゲ
ルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１～
１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発
泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－４を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ Ｍ
Ｈｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．６
４ （ｄｔｄ，Ｊ ＝ ５．１，４．０，２．２ Ｈｚ，４Ｈ），７．４１ － ７．３
０ （ｍ，６Ｈ），６．８２ － ６．７１ （ｍ，２Ｈ），５．９０ （ｄｄｄ，Ｊ
＝ ２５．９、１５．０，１．０ Ｈｚ，１Ｈ），５．７３ （ｄ，Ｊ ＝ ７．６ Ｈ
ｚ，１Ｈ），４．３６ － ４．２１ （ｍ，３Ｈ），４．１８ （ｔ，Ｊ ＝ ４．９
Ｈｚ，１Ｈ），４．０５ （ｄｄｑ，Ｊ ＝ ９．７，８．５，６．９ Ｈｚ，２Ｈ）
，３．８７ （ｔ，Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ，１Ｈ），３．３９ （ｓ，３Ｈ），１．３２
（ｔｄ，Ｊ ＝ ６．９，０．７ Ｈｚ，６Ｈ），１．０５ （ｓ，８Ｈ）． ＭＳ
ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：
６２９．５１。
（１－３－３）ＶＰ－Ｕ－５の合成：
Figure 0007702159000068
 ＶＰ－Ｕ－４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフラ
ンに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ
）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま乾燥させるまで溶剤を蒸発
させ、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解した後で蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製
品を得た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカ
ラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０
．０５～１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾
固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－５を得た。１Ｈ
ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝ ７．８
Ｈｚ，１Ｈ），６．７７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １５．０，６．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．９９
－ ５．８２ （ｍ，２Ｈ），５．７３ （ｄ，Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ，１Ｈ），５．
２７ （ｄ，Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ，１Ｈ），５．１０ （ｄｄ，Ｊ ＝ ５．３，４．
７ Ｈｚ，１Ｈ），４．２９ （ｄｄｑ，Ｊ ＝ ９．８，８．６，７．０ Ｈｚ，２Ｈ
），４．１７ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ ６．２，５．２，１．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．１２
－ ３．９８ （ｍ，３Ｈ），３．３９ （ｓ，２Ｈ），１．３２ （ｔｄ，Ｊ ＝ ６
．９，０．６ Ｈｚ，６Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ，［Ｍ＋Ｈ］＋
、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
（１－３－４）ＶＰ－Ｕ－６の合成：
Figure 0007702159000069
 アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ－Ｕ－５（３９１ｍｇ、１．
０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ
－メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ
）（２－シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で
５時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより
精製し（２００～３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：アセトニトリル
（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１～１：３で勾配溶出した）、生成物溶
出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ－Ｕ－６を得た。３１
Ｐ ＮＭＲ （１６１ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １５０．３４，１５０．２９，
１７．０７，１５．５０． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２，［Ｍ＋Ｈ］＋、
理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ－Ｕ－６が目的生成物ＶＰ－Ｕｍで
あり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
（１－３Ｂ）複合体２、１０のアンチセンス鎖の調製
複合体２、１０のアンチセンス鎖と複合体１、１１のアンチセンス鎖の区別は、５’－
末端の１番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法
によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが２’－
メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（Ｕｍ）であり、脱保護、カップリング、キ
ャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ－Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１
３－２６０１－ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’－リン酸エステル修飾
を形成した。
Figure 0007702159000070
合成において用いられた汎用の固相担体、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化
又は硫化の反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった
。
（１－３Ｃ）複合体３、４、９のアンチセンス鎖の調製
ＣＰＲ－Ｉモノマーを結合した場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用い
たこと以外、複合体２、１９のアンチセンス鎖と同じ合成プロセスを採用した。５’－チ
オリン酸エステル修飾を有する複合体３、４、９のアンチセンス鎖を製造した。
（１－３Ｄ）複合体５、７、８のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａ
ｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉ
ｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体５、７、
８のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャ
ッピング、酸化又は硫化の反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成
と同じであった。
（１－４）複合体１～１１の合成
複合体１に対して、Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶
液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、これらを水
素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置で自作、抵抗
率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで
希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入
、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致して
おり、合成された複合体１が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であるこ
とが示された。
同様の方法により、上記合成された複合体２～１１のセンス鎖と対応するアンチセンス
鎖をアニールして二本鎖構造を形成させ、その分子量を検出した。具体的には以下のとお
りである。
複合体２の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０６５．５８、実測値Ｓ：７５１６．
６、ＡＳ：７０６４．５
複合体３の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７１３９．６８、実測値Ｓ：７５１５．
６、ＡＳ：７１３８．９
複合体４の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０８１．６４、実測値Ｓ：７５１５．
６、ＡＳ：７０８０．９
複合体５の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：６９６１．５２、実測値Ｓ：７５０３．
４、ＡＳ：６９６０．９
複合体６の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０３７．５１、実測値Ｓ：７５０３．
６、ＡＳ：７０３６．９
複合体７の理論値Ｓ：８２１８．８３、ＡＳ：７７０３．０５、実測値Ｓ：８２１８、
ＡＳ：７７０２．５
複合体８の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：６９８５．５８、実測値Ｓ：７５１６．
５、ＡＳ：６９８４．９
複合体９の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０４１．５２、実測値Ｓ：７５０３．
６、ＡＳ：７０４０．８
複合体１０の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０５７．５８、実測値Ｓ：７５０３
．６、ＡＳ：７０５７
測定値が理論値と一致しており、目的配列を有するｓｉＲＮＡ複合体が合成されたこと
が示された。
複合体１～１１の構造は、式（３）に示される。
（調製例２）複合体１２～２６及び比較複合体１の調製
１）前記ｓｉＲＮＡが、それぞれ表１に示される複合体１２～２６及び比較複合体１に
対応する配列であり、２）目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護
条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏ
ｌのＮ－メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチ
ルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボー
スにおける２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去したこと以外、調製例１と同じ方法により、表題
複合体を製造できると予期した。
表題複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表３に示される。比較複合体１に含まれ
るｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ遺伝子に対して抑制作用のない陰性対照ｓｉＲＮＡ（以下ＮＣと
もいう）であった。
Figure 0007702159000071
Figure 0007702159000072
Figure 0007702159000073
Figure 0007702159000074
Figure 0007702159000075
（調製例３）Ｐ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ（複合体２７）の調製
（３－１）Ｐ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｐ－１０化合物を合成した。
Figure 0007702159000076
（３－１－１）ＧＡＬ５－Ｃ４－１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに上記（１－１－１）に記載された方法によ
り得られたＧＡＬ－５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４－アミノ酸ｔｅｒｔ－ブ
チルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テト
ラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及
びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に溶解
させた後に室温で５時間攪拌反応させた。反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液を加え、酢酸エチルで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２０
０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５－Ｃ４－１を
得、そのまま次の反応を行った。
（３－１－２）ＧＡＬ５－Ｃ４－２の合成
工程（３－１－１）で得られたＧＡＬ５－Ｃ４－１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ
）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を
蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００～３００メッシュの順相シリ
カゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出した）
、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５－Ｃ４
－２を得た。
（３－１－３）Ｐ－６の合成：
工程（１－１－４）に記載された方法により得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４
．６９ｍｍｏｌ）と工程（３－１－２）で得られたＧＡＬ５－Ｃ４－２（８．２４ｇ、１
５．４８ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）を混合して４７ｍｌのアセトニト
リルに溶解させ、さらにＮ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加
え、最後に４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩
酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させ
た。２０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶
液で有機相を洗浄し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３
００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％
トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：
５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの
純粋なＰ－６を得た。
（３－１－４）Ｐ－７の合成：
上記（３－１－３）で得られたＰ－６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌ
のジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）
を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、
さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水
相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００～３００
メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝
１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固
して計４．８２ｇのＰ－７を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋
Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
（３－１－５）Ｐ－８の合成：
Figure 0007702159000077
 Ｐ－７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍ
ｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－
１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．
５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９
１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌ
の飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲル
の酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石
油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１
：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾
固して計２．７９３ｇの純粋なＰ－８を得た。
（３－１－６）Ｐ－９の合成：
Ｐ－８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３
ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ
）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミ
ン（ＤＩＰＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応さ
せた。５０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエ
チルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍ
ｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、８
０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシ
リカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミ
ンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成
物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋なＰ－９複合分子を得た
。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２
１．０５、実測値：１９２０．９７。
（３－１－７）Ｐ－１０の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＰ－９複合分子を用い、固相担体に結合されたＰ－９複合分
子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、Ｐ－１０を
調製した。
（３－２）Ｐ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＰ－１０化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、
複合体２７を調製した。構造が式（４）に示されるＰ１０－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合
体を得ることができると予期した。
（調製例４）Ｒ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２８）の調製
（４－１）Ｒ－５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｒ－５化合物を合成した。
Figure 0007702159000078
（４－１－１）ＧＡＬ－Ｃ７－１の合成
工程（１－１－１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－３（２６．４ｇ、８０
．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分
子篩粉を加え、さらに７－オクテン－１－オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加
え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸
トリメチルシリル（８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させ
た。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加
えて洗浄し、有機相を分離し、水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相
をあわせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム
で乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－Ｃ
７－１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
（４－１－２）ＧＡＬ－Ｃ７－２の合成
工程（４－１－１）で得られたＧＡＬ－Ｃ７－１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を
１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それ
ぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）
を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ
、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。反応液に２
００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節
し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を捨て、水相を固形ク
エン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有
機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマト
グラフィー（２００～３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール
＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固
形製品ＧＡＬ－Ｃ７－２を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１，［Ｍ＋Ｈ］＋、
理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
（４－１－３）Ｒ－１の合成：
工程（１－１－４）に記載された方法により得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４
．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ－Ｃ７－２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４
７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．
９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－
メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温
で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽
和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し
、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し
て粗製品を得、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル
をカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタ
ン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸
発乾固して７．８２ｇの純粋なＲ－１を得た。
（４－１－４）Ｒ－２の合成：
Ｒ－１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、
ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた
。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を
加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０
ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤
を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、
１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンで
カラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶
出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋なＲ－２を得た。
（４－１－５）Ｒ－３の合成：
Ｒ－２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍ
ｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－
１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．
５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９
１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌ
の飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲル
の酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石
油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１
：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純
粋なＲ－３を得た。
（４－１－６）Ｒ－４の合成：
Ｒ－３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１
４８ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８
ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＰＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌
反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジク
ロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を
得た。カラム精製には、３０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗ
ｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し
、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００
：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋
なＲ－４複合分子を得た。
（４－１－７）Ｒ－５の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＲ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＲ－４複合分
子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、Ｒ－５を調
製した。
（４－２）Ｒ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＲ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、複
合体２８を調製した。構造が式（７）に示されるＲ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体を
得ることができると予期した。
（調製例５）ＬＡ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２９）の調製
以下のプロセス経路により、ＬＡ－５化合物を合成できると予期した。
Figure 0007702159000079
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＬＡ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、
複合体２９を調製した。構造が式（１２）に示されるＬＡ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複
合体を得ることができると予期した。
（調製例６）ＬＢ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体３０）の調製
（６－１）ＬＢ－５化合物の合成
以下の方法に従い、ＬＢ－５化合物を合成した。
Figure 0007702159000080
（６－１－１）ＬＢ－１の合成：
工程（１－１－６）に記載された方法により得られたＬ－８（５．０ｇ、３．３８６ｍ
ｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミ
ノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジク
ロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．２ｇ、１
６．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。７０ｍｌのジクロロメタン
を加えて反応液を希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相を
ジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗
製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用
い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを
平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．
２～１：１：１：１で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋なＬＢ－
１を得た。
（６－１－２）ＬＢ－２の合成：
工程（６－１－１）に記載された方法により得られたＬＢ－１（４．６９７ｇ、２．７
５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）、３－アミノ－１，２－プロパンジオ
ール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－
イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）
及びＮ－メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を順に３０ｍｌのアセト
ニトリルと３ｍｌのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させる
まで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（２００～３００メッシュの順相シリカ
ゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７～１：０．５で勾配溶出した）により
精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ－２を
得た。
（６－１－３）ＬＢ－３の合成：
ＬＢ－２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた
。さらに４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を
加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし、乾
燥させるまで溶剤を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（２００～３００メッシュの
順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５～１：０．２で勾配溶出し
た）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成
物ＬＢ－３を得た。
（６－１－４）ＬＢ－４の合成：
ＬＢ－３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍ
ｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）
を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（２７０ｍｇ、２．０
７５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。０．５Ｍトリエチルアミンリン酸
塩で反応液を３回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出し、有機
相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、２００～３００メッシュの
順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エ
ーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノー
ル＝１００：５～１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの純粋
なＬＢ－４複合分子を得た。
（６－１－５）ＬＢ－５の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＬＢ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＬＢ－４複
合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、ＬＢ－
５を調製した。
（６－２）ＬＢ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＬＢ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、
複合体３０を調製した。構造が式（１３）に示されるＬＢ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複
合体を得ることができると予期した。
（調製例７）Ｖ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体３１）の調製
以下のプロセス経路により、Ｖ－８化合物を合成できると予期した。
Figure 0007702159000081
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＶ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、複
合体３１を調製した。構造が式（１４）に示されるＶ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体
を得ることができると予期した。
（調製例８）Ｗ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体３２）の調製
（８－１）Ｗ－８化合物の合成
以下の方法に従い、Ｗ－８化合物を合成した。
Figure 0007702159000082
（８－１－１）Ｗ－１の合成：
Ｗ－０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さら
にトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０℃程度まで冷却
し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応
させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固
形粗製品Ｗ－１を得た。
（８－１－２）Ｗ－２の合成：
Ｗ－１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８
ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌの飽和炭酸水素ナト
リウムで反応液を２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで
一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ－２を得た。処理されることなく、次の
脱保護反応を行った。
（８－１－３）Ｗ－３の合成：
Ｗ－２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、
さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応
させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１の
ＤＣＭ－メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄
し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡
乾燥させ、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカ
ラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：
メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５～１：１：０．２５で勾配
溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて
３．０６２ｇの純粋なＷ－３を得た。
（８－１－４）Ｗ－４の合成：
Ｗ－３（０．６７５ｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ－Ｃ７－２（２．６０ｇ、５．
４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピル
エチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３－ジエトキシホスホ
リル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、
６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタ
ンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍ
ｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾
過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３００メッシュの順相シリカゲ
ルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲ
ルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出し
、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋なＷ－４を得た。
（８－１－５）Ｗ－５の合成：
Ｗ－４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させ
た。１５０ｍｌのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得
た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンで
シリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメ
タン：メタノール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋なＷ－５を得た。
（８－１－６）Ｗ－６の合成：
Ｗ－５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）と工程（１－１－７ａ）に記載された方法
により得られたＡ－１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロロ
メタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３
Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロ
ピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応さ
せた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１
回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機
相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空
油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１８５ｇの２００～３０
０メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテ
ル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．１
～１：１：０．７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．５
７ｇの純粋なＷ－６を得た。
（８－１－７）Ｗ－７の合成：
Ｗ－６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８
９ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍ
ｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、
３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチ
ルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽
出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００
～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸
性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジク
ロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回
収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋なＷ－７複合分子を得た。ＭＳ ｍ／
ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実測
値：１７６３．２１。
（８－１－８）Ｗ－８の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＷ－７複合分子を用い、固相担体に結合されたＷ－７複合分
子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、Ｗ－８を調
製した。
（８－２）Ｗ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＷ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、複
合体３２を調製した。構造が式（１５）に示されるＷ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体
を得ることができると予期した。
（調製例９）Ｘ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体３３）の調製
以下のプロセス経路により、Ｘ－８化合物を合成できると予期した。
Figure 0007702159000083
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＸ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、複
合体３３を調製した。構造が式（２１）に示されるＸ８－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体
を得ることができると予期した。
（調製例１０）Ｚ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体３４）の調製
（１０－１）Ｚ－５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｚ－５化合物を合成した。
Figure 0007702159000084
（１０－１－１）Ｚ－１の合成：
工程（８－１－３）に記載された方法により得られたＷ－３（１．５０ｇ、３．３７ｍ
ｍｏｌ）と工程（３－１－２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５－Ｃ４－２（７
．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さら
にジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に３－
ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ
、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍ
ｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相
を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３００メッシ
ュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチル
アミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１～１５：１
で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋なＺ－１を得
た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９
８、実測値：１９８７．９０。
（１０－１－２）Ｚ－２の合成：
Ｚ－１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、
さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応さ
せた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。
２２０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンで
シリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１０：１～２：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して
３．４９ｇの純粋なＺ－２を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋
Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
（１０－１－３）Ｚ－３の合成：
Ｚ－２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と工程（１－１－７ａ）に記載された方法によ
り得られたＡ－１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタン
に溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－
オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチル
アミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。１００
ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり
３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、５０ｍｌ
の飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶
剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には
、２００ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルア
ミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラ
ムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１～１５：１で勾配溶出し、生成物
溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋なＺ－３を得た。ＭＳ ｍ／ｚ
：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２
１３６．２０。
（１０－１－４）Ｚ－４の合成：
Ｚ－３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（０．６３５ｇ、４．９１５ｍ
ｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４－ジメチルアミノピリジン
（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸
無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５
０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミン
リン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出し、
有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１８８ｇの２００～３
００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロ
メタン：メタノール＝１０：１～３：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減
圧蒸発乾固して１．９５ｇの純粋なＺ－４複合分子を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ１
５５Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９。
（１０－２）Ｚ－５の合成
Ｌ－９複合分子の代わりにＺ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＺ－４複合分
子を得たこと以外、調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、Ｚ－５を調
製した。
（３－２）Ｚ５－ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＺ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例１における工程（１－２）、（１－３Ａ）、（１－４）と同じ方法により、複
合体３４を調製した。構造が式（２２）に示されるＺ５－ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＶＰ複合体
を得ることができると予期した。
（調製例１１）本調製例は、複合体３５～４９の調製を説明するために用いられた
本調製例で複合体３５～４９を合成した。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は
、表３に示される。
（１１－１）ＦＩＮ－２複合分子の合成
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に記載さ
れた調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、ＦＩＮ－２複合分子を合成した。
（１１－１－１）ＰＲＯ－１０の合成
Figure 0007702159000085
（１１－１－１ａ）ＰＲＯ－７の合成
２．９３ｇのＰＲＯ－６（Ｌ－ヒドロキシプロリン、ＣＡＳ番号：５１－３５－４、Ｅ
ｎｅｒｇｙ社から購入、２２．４ｍｍｏｌ）を２２．５ｍｌの１，４－ｄｉｏｘａｎｅ（
１，４－ジオキサン、ＣＡＳ番号：１２３－９１－１）に溶解させ、３４ｍｌの１０％（
ｗ／ｗ）Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を加え、懸濁液状態にし、６．９５ｇのＦｍｏｃ－Ｃｌ（
クロロギ酸－９－フルオレニルメチル、ＣＡＳ番号：２８９２０－４３－６、Ｅｎｅｒｇ
ｙ社から購入、２６．８ｍｍｏｌ）を３４ｍｌの１，４－ｄｉｏｘａｎｅに溶解させ、氷
浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を１５０ｍｌ
の氷水に注入し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで１回あたり１００ｍｌで３回抽出し
、有機相を捨て、水相を濃ＨＣｌでｐＨ≦５になるように調節し、１００ｍｌの酢酸エチ
ルで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固
して７．８３ｇの白色泡状固形製品ＰＲＯ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ
，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｔ，Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．６７
（ｄ，Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．４８ － ７．３９ （ｍ，２Ｈ），７．３
８ － ７．２７ （ｍ，２Ｈ），５．１７ （ｓ，１Ｈ），４．２７ （ｓ，２Ｈ），
４．２３ － ４．１１ （ｍ，２Ｈ），３．５５ － ３．４１ （ｍ，３Ｈ），２．
３１ － ２．１０ （ｍ，１Ｈ），２．０８ － １．８８ （ｍ，１Ｈ）． ＨＲＭ
Ｓ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ） Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ５ ［Ｍ－
Ｈ］－３５２．１１９０、実測値３５２．１０３３．
（１１－１－１ｂ）ＰＲＯ－８の合成
７．８３ｇのＰＲＯ－７（２２．２ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＴＨＦ（ＣＡＳ番号：１０
９－９９－９）に溶解させ、油浴で６５℃に加熱し、還流状態で３６．６ｍｌの２ｍｏｌ
／ＬのＢＨ３－Ｍｅ２ＳのＴＨＦ溶液（ＣＡＳ番号１３２９２－８７－０、Ｊ＆Ｋ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、７３．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流反応を続けた。反
応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなる
までメタノールを加えてから３０分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、石油エーテル
で３回精製して７．１ｇの白色固形生成物ＰＲＯ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００
ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｔ，Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ，２Ｈ），７．
６７ （ｄ，Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４９ － ７．３９ （ｍ，２Ｈ），
７．３８ － ７．２６ （ｍ，２Ｈ），５．１８ （ｄｄ，Ｊ ＝ ６．１，３．８
Ｈｚ，１Ｈ），４．２８ （ｓ，２Ｈ），４．２３ － ４．１３ （ｍ，２Ｈ），３．
５５ － ３．３８ （ｍ，２Ｈ），２．３２ － ２．１１ （ｍ，１Ｈ），２．０８
－ １．８９ （ｍ，１Ｈ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値 Ｃ２０Ｈ２
１ＮＯ４ ［Ｍ＋Ｎａ］＋３６２．１３６８、実測値３６２．１０１２．
（１１－１－１ｃ）ＰＲＯ－９の合成
７．１ｇのＰＲＯ－８（２１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのピリジンに溶解させ、１４．２
ｇのＤＭＴｒ－Ｃｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、４２ｍｍｏｌ）を加え
、室温で５時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に
塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲ
ルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（
ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＤＭＴｒ－Ｃｌを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を
溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、８．２ｇの白色固形生成物Ｐ
ＲＯ－９を得た。ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値 Ｃ４１Ｈ３９ＮＯ６ ［Ｍ＋
Ｎａ］＋６６４．２６７５、実測値６６４．２３４８，Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット
番号ＪＪＳ１６０３２４－１）純度９４．２０％。
（１１－１－１ｄ）ＰＲＯ－１０の合成
８．２ｇのＰＲＯ－９（１２．８ｍｍｏｌ）を６４ｍｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド）に溶解させ、４０ｍｌのピペリジン（３８４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０
分間攪拌反応させた。反応液を３００ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり１５
０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を
無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シ
リカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、
１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＦｍｏｃを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を
溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、４．６５ｇの白色固形生成物
ＰＲＯ－１０を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４
０ （ｄ，Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．３５ － ７．１８ （ｍ，７Ｈ），６
．９３ － ６．８４ （ｍ，４Ｈ），４．５６ （ｄ，Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ，１Ｈ）
，４．１２ （ｓ，１Ｈ），３．７４ （ｓ，６Ｈ），３．４６ － ３．３７ （ｍ，
１Ｈ），２．８８ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ １８．５，１０．０，５．５ Ｈｚ，２Ｈ），２
．７５ （ｄｄ，Ｊ ＝ ８．７，５．８ Ｈｚ，１Ｈ），２．６２ （ｄｄ，Ｊ ＝
１１．０，２．７ Ｈｚ，１Ｈ），１．７４ － １．６５ （ｍ，１Ｈ），１．４０
（ｄｄｄ，Ｊ ＝ １２．９，８．５，５．９ Ｈｚ，１Ｈ），ＨＲＭＳ （ＥＳＩ）
ｍ／ｚ 理論値 Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ４ ［Ｍ＋Ｎａ］＋４４２．１９９４、実測値４４２
．１９９９，Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２９－１）純度９７．
０７％。
（１１－１－２）ＦＩＮ－１の合成
Figure 0007702159000086
 （１－１－１）に記載された方法により得られたＧＡＬ－５（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ
）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、順に３．９ｇのＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル
エチルアミン、ＣＡＳ番号：７０８７－６８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、３０ｍｍ
ｏｌ）及び３．８ｇのＨＢＴＵ（ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’－テトラメチ
ルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号：９４７９０－３７－２、Ａｌａ
ｄｄｉｎ社から購入、１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌し、工程（１１－１－
１ｄ）で得られたＰＲＯ－１０（４．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解さ
せた後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で２時
間攪拌した。反応液を１２０ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり６０ｍｌで３
回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ２０ｍｌの水、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有
機相を分離し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去し、シリカゲルカラムで精
製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからそれに試料を負荷し、１体
積％トリエチルアミン及び１体積％メタノールを含むジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液で溶
出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの淡黄色泡状固形製品
ＦＩＮ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３
（ｄ，Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．３２ （ｔ，Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ，４Ｈ
），７．２０ （ｔｄ，Ｊ ＝ ８．９，３．５ Ｈｚ，５Ｈ），６．９３ － ６．８
４ （ｍ，４Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．０４ － ４
．９０ （ｍ，２Ｈ），４．４９ （ｓ，１Ｈ），４．４０ （ｄ，Ｊ ＝ ４．４ Ｈ
ｚ，０．８Ｈ），４．３１ （ｄ，Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ，０．２Ｈ），４．１５ （ｓ
，１Ｈ），４．０３ （ｓ，３Ｈ），３．９３ （ｓ，１Ｈ），３．７４ （ｓ、７Ｈ）
、３．５９ （ｄｔ，Ｊ ＝ １２．０，６．０ Ｈｚ，１Ｈ），３．５０ － ３．４
０ （ｍ，１Ｈ），３．３９ － ３．２５ （ｍ，３Ｈ），３．１３ （ｄｄ，Ｊ ＝
８．９，５．２ Ｈｚ，１Ｈ），３．００ （ｄｑ，Ｊ ＝ ９．３，５．３，４．３
Ｈｚ，１Ｈ），２．２２ （ｓ，２Ｈ），２．０７ （ｓ，３Ｈ），１．９９ （ｓ，
３Ｈ），１．９０ （ｓ，４Ｈ），１．７４ （ｓ，３Ｈ），１．５０ （ｓ，３Ｈ），
１．３６ （ｓ，１Ｈ）。Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット番号ＬＪ１６０４２２）純度
９５．４５％。
（１１－１－３）ＦＩＮ－２の合成
Figure 0007702159000087
 工程（１１－１－２）で得られたＦＩＮ－１（３．０ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）をアセト
ニトリルと共沸させて水を除去し、減圧吸引乾燥させ、１０ｍｌのＤＭＦに溶解させ（分
子篩に浸して水を除去した）、窒素保護下で２．１３ｇのＰＡ（ビス（ジイソプロピルア
ミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィン、Ａｄａｍａｓ社から購入、商品番号１１３５
６Ｂ、７．０６ｍｍｏｌ）、３４６ｍｇのテトラゾール（ＣＡＳ番号：２８８－９４－８
、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌反応させ、１０ｍ
ｌのＤＭＦを追加し、１時間攪拌反応を続けた。溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化して
からＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、酢酸エチルで溶出させ、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧留去し、４．５ｇの無色シロップ状粗製品を得た。粗製品を５０体積％アセト
ニトリル水溶液で完全に溶解するまで溶解させ、Ｃ－１８、３３０ｇ、３００Å中圧精製
カラムでサンプルを精製し、カラムをまず１体積％ピリジンのアセトニトリル溶液でアル
カリ化し、勾配溶出させて製品のピークを回収し、溶剤を減圧留去して２．２ｇの白色粉
末製品ＦＩＮ－２複合分子を得た。３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １４８．０４，１４７．９４，１４７．６２，１４７．１９、リンスペクトル純度９
２％、Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ純度９０．５４％。
（１１－２）ＦＩＮ－２複合分子の固相担体への結合
核酸固相合成方法により、工程（１１－１－３）で得られたＦＩＮ－２複合分子を３回循
環させることにより、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ Ｎｉｔ
ｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）に結合し、複合基（
ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）のＲＮＡセンス鎖の３’末端への結合を実現した。
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に記載さ
れた調製方法を参照して上記結合を行い、具体的には、まず、上記汎用の固相担体から始
まり、固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件下及びカップ
リング試薬の存在下でＦＩＮ－２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング
反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子を得た。当該固相担
体に結合されたＦＩＮ複合分子におけるヒドロキシ保護基ＤＭＴｒを除去し、ＦＩＮ－２
複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行い、再び上
記脱保護－カップリング－キャッピング－酸化工程を１回繰り返し、３番目のＦＩＮ－２
複合分子を結合させ、固相担体に結合された複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を得た。
上記反応において、上述した脱保護、カップリング、キャッピング、酸化は、反応条件
、溶剤及び試薬用量が前述した工程（１－２）に記載された核酸固相合成方法と同じであ
った。
（１１－３）複合体３５～４９の合成
１）工程（１１－２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉ
ＲＮＡが表３に示される複合体３５～４９に対応する配列を有すること以外、調製例１に
おける工程（１－２）～（１－４）と同じ方法により、表題複合体を調製した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：Ｌ
ＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致して
おり、合成された複合体は、構造が式（３０７）に示される目的設計の化合物であること
が確認された。
（調製例１２）比較複合体２の調製
本調製例で比較複合体２を合成し、当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表３
に示される。当該複合体は、米国出願１５／５９７，２２５における化合物ＡＤ－６６８
１０と構造が同じであった。
（１２－１）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の合成
ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１に記載された調製方法により化合物３０、即ち、以上の
ようなリンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－及び標的基であ
るＮ－アセチルガラクトサミン分子（ここで、各ＬＡに１つのＮ－アセチルガラクトサミ
ン分子が結合できるので、１つのリンカーに３個のＮ－アセチルガラクトサミン分子が結
合できる）を含む複合分子（（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子とも呼ばれる）を合成し、前記
化合物３０の構造は、下式に示される。
Figure 0007702159000088
（１２－２）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の固相担体への結合
調製例１における工程（１－１－９）と同じ方法により、（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を
固相担体に結合し、固相担体に結合された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を得た。
（１２－３）比較複合体２の合成
１）工程（１２－２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉ
ＲＮＡが表１において番号ＡＤ－６６８１０に示される配列を有すること以外、調製例１
における工程（１－２）、（１－３Ｄ）、（１－４）と同じ方法により、比較複合体１を
調製した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：Ｌ
ＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致して
おり、合成された複合体は、構造が式（３０５）に示される目的設計の化合物であること
が確認された。
（実験例１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の毒性を証明している。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、マウス１匹あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ
／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして計算）の複合体１をそれぞれ単回皮下投与し（０．９％塩化ナ
トリウム水溶液であり、濃度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬであり、投与
体積が１０ｍＬ／ｋｇであり、濃度ごとに雌雄マウス各３匹に投与した）、その間に臨床
観察を行ったところ、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められて
おらず、投与した２４ｈ後、血液サンプルを採取して臨床病理学的検査を行い、動物を解
剖した。その結果、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められな
かった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
（実験例２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例２－１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：比較複合体２及び複合体４９、３
６、３７、３８、３９、４３、４５（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナ
トリウム水溶液として提供、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソー
ム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と
均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ
、２４ｈ、４８ｈに５μｌの試料を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性
させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）
を加え、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプル
とリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の上記複合体（２
０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５
．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させ
た後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷
凍して反応を停止させた。各複合体の参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記さ
れる。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動し続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図１に示した。
図１は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果
を示している。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解されずに
維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
図１の結果から、本開示の特定の修飾を有するｓｉＲＮＡは、リソソーム溶解液におい
て満足できる安定性を示すことが示された。
（実験例２－２）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
被験サンプルが複合体１、６及び配列１、配列２並びに陰性対照ＮＳであり、トリトソ
ームとの培養時間がそれぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４
ｈ、８ｈであったこと以外、実験例２－１と同じ方法を採用した。配列１及び配列２の配
列は、以下のとおりであり、本分野における通常の固相合成方法により得られた。
配列１：
センス鎖：ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ（配列番号１４３）
アンチセンス鎖：ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣ（配列番号１４４）
配列２：
センス鎖：ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍ
ＡｍＡｍＡｍ （配列番号１４５）
アンチセンス鎖：ＶＰ－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍ
ＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＣｍ（配列番号１４６）
非変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動の結果を図２に示した。
図２は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果
を示した。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解されずに維持
し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
（実験例２－３）ヒト血漿における安定性
複合体１、６及び配列２、配列３並びに陰性対照ＮＳ（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μ
Ｍの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８
μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。
３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬ
の試料（サンプル）を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、－８０℃の冷蔵庫に
冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた
。同時に、等モル量の被験サンプル（２μＭ、２μｌ）をとり、８μｌの１×ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し
、Ｃｏｎと記した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サン
プルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３
６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、
前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後
、１×Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分
間染色した後イメージングを行った。結果を図３に示した。配列３の配列は、以下のとお
りであり、本分野における通常の固相合成方法により得られた。
配列３：
センス鎖：ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍ
ＡｍＡｍＡｍ（配列番号１４７）
アンチセンス鎖：ＶＰＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵ
ｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ（配列番号１４８）
図３は、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示したも
のである。
図３の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿において７２ｈまでも分解
されず、優れたヒト血漿における安定性を示した。
（実験例２－４）複合体のサル血漿における安定性
複合体１、６及び配列２、配列３（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナ
トリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％カニク
イザル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳ
で希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４
、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、－８
０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプル
をそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとっ
て使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル（２μＭ、２μｌ）をとり、８μｌの
１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、１０μＬサル血漿処理されていないサンプル
として調製し、Ｃｏｎと記した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、
上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭの
ＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と
混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電
気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９
４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図４に示した。
図４は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示し
たものである。
図４の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿におい
て７２ｈまでも分解されず、優れたサル血漿における安定性を示した。
（２－５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安
定性を証明している
本実験例に用いられる陰性対照Ｘ２Ｍ２配列は、以下のとおりである。
センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧＡＧＧＣｍＡＵｍＡＣｍＵｍＵｍＣｍＡＡＡｄＴ
－Ｓ－ｄＴ－３’（配列番号１４９）
アンチセンス鎖：５’－ＵｆＵｍＵｆＧＡＡＧＵｆＡＵＧＣＣＵｆＣＡＡＧＧｄＴ－Ｓ
－ｄＴ－３’（配列番号１５０）
当該ｓｉＲＮＡは、固相ホスホルアミダイト法により合成された。０．９％塩化ナトリ
ウム水溶液で陰性対照及び複合体２をそれぞれ濃度２０μＭ（ｓｉＲＮＡの濃度として算
出される）の溶液として調製し、Ｘ２Ｍ２及び複合体２と記した。
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体２及びＸ２Ｍ２
（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．
０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ Ｌｉ
ｖｅｒ Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番
号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬ
であった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混
合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試
料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに－８０℃の
冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一
に混合した直後に取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体２及びＸ
２Ｍ２（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶
液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加え
て変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の
冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各電気泳動像に対して、対応する参照サンプルをＭ
と記した。１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び
参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉ
ｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動し続けた。電気泳動終了
後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２
０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５に示
した。
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅ
ｒ Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１
０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法によりＸ２Ｍ２及び複合体２のヒト由来
のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図６に示した。
図５及び図６の結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリ
ソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定
性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
（実験例３）本実験では、複合体１及び６のラット体内での薬物動力学的研究結果を示
している
本実験例では、それぞれ各実験群のラット（１群あたり１０匹のラットであり、雌雄が
それぞれ半分であった）に複合体１及び複合体６を単回皮下注射投与し、１０ｍｇ／ｋｇ
及び５０ｍｇ／ｋｇの用量で実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝
臓、腎臓組織の薬物濃度を検出した。
本実験例に用いられるＳＤラットは、北京維通利華実験動物技術有限公司により提供さ
れた。
まず、ＰＲＩＳＴＩＭＡ ７．２．０版データシステムにより、ＳＤラットをラットの
体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ各群に複合体を
投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し
、用量は１０及び５０ｍｇ／ｋｇであり、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌの複合
体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を投与し、体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与
前及び薬剤投与後の５分間（±３０秒）、３０分間（±１分間）、１時間（±２分間）、
２時間（±２分間）、６時間（±５分間）、２４時間（±１０分間）、４８時間（±２０
分間）、７２時間（±２０分間）、１２０時間（±３０分間）、１６８時間（±３０分間
）でそれぞれ頸静脈からラット全血を採取した後、２～８℃で遠心力１８００×ｇで１０
分間遠心して血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約７０μＬ放置し、残りのサンプ
ルを別のチューブに放置し、検出するまで、－７０～－８６℃で冷凍保存した。それぞれ
薬剤投与後の約２４、４８、７２、１２０、１６８時間で、対応するラットを、体重に応
じてペントバルビタールナトリウムで麻酔させ（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射した）、腹大動
脈から採血して安楽死させ、肉眼解剖を行うように、ラットの肝臓、腎臓組織を採取した
。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、１ｍＬの冷凍保存チューブに保存し、検出・
分析するまで、－６８℃以下で保存した。
ＨＰＬＣ－ＦＬＤ（蛍光検出高速液体クロマトグラフィー）によりラット血漿及び肝臓
、腎臓組織における実施例２４及び実施例２５の複合体の濃度を定量的に検出した。具体
的なステップは以下のとおりである。
（１）組織塊が８０ｍｇ以下となるまで組織を粉砕した後、組織と細胞溶解液（Ｔｉｓ
ｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、供給者：ｅｐｉｃｅｎｔｒ
ｅ、番号：ＭＴＣ０９６Ｈ）を加えて６６．７ｍｇ／ｍＬの組織ホモジネートとして調製
した。
（２）細胞を破砕するために組織ホモジネートを超音波（１５０Ｗ、３０ｓ）処理した
。
（３）組織サンプルについては、組織サンプル７５μＬを９６ウェルのＰＣＲプレート
に加え、５μＬのプロテアーゼＫ（供給者：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号：２５５３０－
０１５）、１０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混
合水溶液を加え、血漿サンプルについては、血漿２０μＬを９６ウェルのＰＣＲプレート
に加え、４５μＬの組織と細胞溶解液、５μＬのプロテアーゼＫ、２０μＬの１０ｗｔ％
アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合水溶液を加えた。
（４）プレートをシールし、ＰＣＲ器（供給者：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、型番：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００）に放置し、
６５℃で４５分間培養した。
（５）培養終了後、１０μＬの３Ｍ ＫＣｌの水溶液（供給者：Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒ
ｉｃｈ、番号：６０１３５－２５０ＭＬ）を加え、振とうして均一にし、４℃、３２００
ｒｃｆで１５分間遠心した。
（６）組織サンプルに対して、上清液を８０μＬとり、１２０μＬのハイブリッド混合
液（ハイブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ ＰＮＡプローブ（供給者：杭州泰
禾生物科技有限公司）、１ｍＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿
素水溶液、３．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）に加えた。
血漿サンプルに対して、上清液を４０μＬとり、１６０μＬのハイブリッド混合液（ハ
イブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ ＰＮＡプローブ、１ｍＬの２００ｍＭ
Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、７．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセ
トニトリル）に加えた。
（７）プレートをシールし、ＰＣＲ器に放置し、９５℃で１５分間培養し、直ちに氷の
上に５分間放置した。
（８）別の円錐底９６ウェルプレートに移し、振とうして均一にした。３２００ｒｃｆ
で１分間遠心した。
（９）サンプルを負荷して検出し、ＨＰＬＣ－ＦＬＤにより分析して定量した（液相系
供給者：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、クロマトグラフ型番：ｕｌｔｉｍａｔｅ ３００
０）。
分析結果は、図７～図１４に示した。図７～図１０は、それぞれ投与量が１０ｍｇ／ｋ
ｇ又は５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の
経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を
示し、図１１～図１４は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合
体６のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓
におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示している。具体的には、
図７は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット血漿におけるＰＫ／Ｔ
Ｋ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図８は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット肝臓及び腎臓における
ＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図９は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット血漿におけるＰＫ／Ｔ
Ｋ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１０は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体１のラット肝臓及び腎臓におけ
るＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１１は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット血漿におけるＰＫ／
ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１２は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット肝臓及び腎臓におけ
るＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１３は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット血漿におけるＰＫ／
ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１４は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体６のラット肝臓及び腎臓におけ
るＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図７～図１４の結果から分かるように、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）であっても、比較的
高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）であっても、複合体１及び６のラット血漿における濃度は、い
ずれも数時間で検出限界以下まで急速に低下したが、肝臓組織においては、いずれも少な
くとも１６８ｈ以内は、高い安定したレベルの組織濃度が維持された。このことから、本
開示のｓｉＲＮＡ複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定化でき、高度な標
的性を有することが示された。
（実験例４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体内での（ｉｎ ｖｉｖｏ）Ｈ
ＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体５及び７のＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－
Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効
率を調べた。
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を
用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選
択し、マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ複合体５及び複合
体７で番号を付けるとともに、ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じ
て投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋ
ｇの異なる用量で投与し、薬物を０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの０．９％塩
化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４
日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃ
ｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで
全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ ｍＲＮＡの発現量を検出
した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて
その説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキ
ット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ
ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β－アクチ
ン（β－ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ
－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ－アクチンを検出した。
検出プライマーの配列は、表４に示される。
Figure 0007702159000089
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ ｍＲＮＡの発現量は、ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残
量で表され、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ Ｘ遺伝子のコピー数／試験群β－アクチ
ンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ Ｘ遺伝子のコピー数／対照群β－アクチンのコピー数
）×１００％。図においてＨＢＶ Ｘ／β－ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ発現量と記した。
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率＝（１－ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残量）×１００％
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図１５に示した。
他の実験において、以下の条件でそれぞれ若干の実験を行った。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体１及び複合体６に変更して試験を行い、１４日目に
検出データを回収したこと以外、上記と同じ方法を採用した。結果を図１６に示した。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体５及び複合体６に変更して試験を行い、７日目に検
出データを回収したこと以外、上記と同じ方法を採用した。結果を図１７に示した。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体９、１０、５及び６に変更して試験を行い、７日目
に検出データを回収したこと以外、上記と同じ方法を採用した。結果を図１８に示した。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体１、２、３及び４に変更して試験を行い、１群あた
りの動物は５匹であり、２８日目に検出データを回収し、各複合体に対して、１ｍｇ／ｋ
ｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与した（投与体積を変化させず、複合体溶液の
濃度を相応に調整した）。結果をそれぞれ図１９に示した。
投与されたｓｉＲＮＡ複合体を複合体１に変更して試験を行い、１４日目に検出データ
を回収し、各複合体に対して、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与し
た（投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整した）。結果をそれぞれ図２
０に示した。
上記結果から分かるように、試験時点が異なる複数回の試験において、上記本開示の複
合体は、いずれも高いマウス体内ＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制活性を示した。
（実験例５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマウ
スにおける血清ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験を示し
ている
ＡＡＶ－ＨＢＶモデルマウスを用い、動物のモデリングに成功した後、血清におけるＨ
ＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体１、６、比較複合体
２の投与及びＮＳブランク対照とした。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出
し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、薬物を０．３ｍｇ／
ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は５
ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後７、１４、２１、２８
、５６、８４、１１２、１４０、１５４、１６８、１８２日目に、マウスに対して眼窩静
脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。その間、検出結果から、血
清におけるＨＢｓＡｇの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象
の検出を停止させた。
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡ
ｇ ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量
を検出した。ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ説明書を参照して血清中
ＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ ＤＮＡの発現レベルを検出した。
標準化されたＨＢｓＡｇの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与
前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇ
の含有量）×１００％。
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量
（ＵＩ）で表される。
標準化されたＨＢＶ ＤＮＡの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢＶ ＤＮＡの含有量／
薬剤投与前のＨＢＶ ＤＮＡの含有量）×１００％。
ＨＢＶ ＤＮＡ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢＶ ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨ
ＢＶ ＤＮＡの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢＶ ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ ＤＮ
Ａのコピー数で表される。
結果を図２１及び図２２に示した。
図２１の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いず
れの抑制作用も示さなかったのに対して、各ｓｉＲＮＡ複合体は、薬剤投与後の異なる時
点でＨＢｓＡｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。特に複合体１は
、１４０日間と長期間にわたって、高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子
の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
図２２の結果から分かるように、各実施例のｓｉＲＮＡ複合体は、同様に効率的なＨＢ
Ｖ ＤＮＡ発現抑制を示し、８４日間と長期間にわたって、いずれも高い抑制率を維持し
た。
それに対して、比較複合体２は、体内実験において各複合体と近いｍＲＮＡ抑制効果を
得たが、図２１～２２に示される抑制効果の持続時間が同じ投与レベルの複合体１及び６
より明らかに弱くなった。
以下の点を除いて上記と同じ方法により、さらに実験を４回行い、血清ＨＢｓＡｇを検
出した。
ＡＡＶ－ＨＢＶ低濃度マウスモデルを採用し、複合体６を用い、用量がそれぞれ３ｍｇ
／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、１４０日目まで試験を行った。結果を図２３に示した。
Ｍ－Ｔｇモデルを採用し、複合体５及び６を用い、対照群にＰＢＳを投与し、用量がそ
れぞれ３ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）及び１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）であり、７０日目まで試
験を行った。結果を図２４に示した。上海市公衆衛生センター動物部から購入、トランス
ジェニックマウスの作製方法は、Ｒｅｎ Ｊ．ら、Ｊ． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ． ２００６，７８：５５１～５６０に記載されたとおりである。
Ｍ－Ｔｇモデルを採用し、複合体１１及び複合体６を用い、対照群にＰＢＳを投与し、
用量がそれぞれ５、１、０．２ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇの比較複合体２であり、７
８日目まで試験を行った。結果を図２５に示した。
１．２８ｃｏｐｙモデルを採用し、複合体１を用い、用量が３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／
ｋｇであり、２１０日目まで試験を行った。結果を図２６及び図２７に示した。
上記異なる用量について、いずれも投与体積が同じである場合として、溶液の濃度を相
応に調整して対応する用量で投与した。
図２２～２７から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、複数種の動物モデルに
おいて、いずれも持続的で効率的な血清ＨＢｓＡｇ抑制効率を示し、規律的な用量依存性
を示した。
（実験例６）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとと
もに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
（６－１）本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸
技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０
．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ社）で細胞を培養し、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにお
いて培養した。
本実験例では、複合体１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏｎ
－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体１が
、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列は複合体１のアンチセンス鎖／セ
ンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチングした
目的配列（そのヌクレオチド配列は複合体１のアンチセンス鎖／センス鎖の１～８位のヌ
クレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓ
ｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ
ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃ
ｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６－２１５１に記載された方法により、検出プ
ラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェ
クションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮ
Ａ複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下
のとおりである。
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラ
スミドを構築した。そのうち、ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ
、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、複合体１におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全
てと完全に相補的な目的配列を含む。
（２）ＰＳＣＭは、複合体１におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全
てと完全に一致している目的配列を含む。
（３）ＧＳＳＭは、複合体１においてアンチセンス鎖の５’端から１～８位のヌクレオ
チド配列と完全に相補的であり、残部が複合体１においてアンチセンス鎖の５’端から９
～２１位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体１
においてアンチセンス鎖の５’端から９～２１位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ
又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ
又はＧである目的配列を含む。
（４）ＰＳＳＭは、複合体１においてセンス鎖の５’端から１～８位のヌクレオチド配
列と完全に相補的であり、残部が複合体１においてセンス鎖の５’端から９～１９位のヌ
クレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体１においてセン
ス鎖の５’端から９～１９位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、
目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである目的配
列を含む。ＧＳＳＭの標的配列の長さに等しくするために、目的配列の３’末端に２つの
ＣＣを加えた。
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクロ
ーニングした。
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）の使用説明書により、それぞれｓｉＲＮＡと、プラスミドごとに若干群の特定
の濃度の複合体１が対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。プラ
スミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅ
ｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いた。複合体１の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として
算出される）が１００ｎＭから、０．０００１ｎＭまで１１個の濃度に４倍希釈した。１
群あたり３個の複製ウェルがあった。
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検
出キット（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ
ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用明細書によりＨＥＫ２
９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出し
た。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照（ｃｏｎ）とした。ホタルルシフ
ェラーゼタンパク質レベル（Ｆｉｒ）に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レ
ベル（Ｒｅｎ）で標準化した。
異なるｓｉＲＮＡ濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウ
ェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓ
ｌｏｐｅ機能により用量－効果曲線をフィッティングし、用量－効果曲線から以下の算出
方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。
Figure 0007702159000090
 式中：
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳ
ｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
用量－効果曲線から、複合体１がＧＳＣＭを標的するＩＣ５０値を算出した。結果を図
２８Ａ～２８Ｄに示した。その結果から、ＧＳＣＭに対応して、複合体１のＩＣ５０が０
．０５１３ｎＭであり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対応して、複合体１は、ｓｉＲ
ＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められなかったことが示され、本開示のｓ
ｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を
有することが証明された。
上記結果から分かるように、複合体１は、オンターゲットプラスミドにおける標的ｍＲ
ＮＡの発現に対して優れた抑制効果を示し、低いＩＣ５０値を有するが、３本のオフター
ゲットプラスミドの発現に対して、いずれも抑制作用がなかった。複合体１は、優れた標
的ｍＲＮＡ抑制効率を有することを示すとともに、さらに低いオフターゲット効果を有す
ることが分かった。
以上に本発明のいくつかの実施形態を詳しく記載したが、本発明は、上記実施形態の具
体的な細部に限定されなく、本発明の技術的思想の範囲で、本発明の技術的解決手段に対
して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本発明の保
護範囲に属する。
このほかに説明すべきこととして、上記いくつかの実施形態に記載された各具体的な技
術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要
な重複を避けるために、本発明では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本発明の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本発明の精神
から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本発明に開示された内容とみなすべきで
ある。

Claims (17)

  1. センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであって、
    前記センス鎖がヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩとが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉが、ヌクレオチド配列Ａのみからなり、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、前記ヌクレオチド配列ＩＩが、ヌクレオチド配列Ｂのみからなり、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、
    ５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ－３’（配列番号１５５）、
    ５’－Ｚ’ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１５６）
    ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
    前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖が配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、
    ５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＺ Ａ －３’（配列番号１）、
    ５’－Ｚ’ Ｂ ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番号３）、
    ５’－Ｚ’ Ｂ ＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣ－３’（配列番号４）
    ただし、前記Ｚ’ Ｂ はアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ Ａ はＡ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’ Ｂ はＺ Ａ と相補的なヌクレオチドであり、
    前記非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、ｓｉＲＮＡ。
  2. 前記ヌクレオチド配列Ｉがヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩがヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さはそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ａの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列Ｂの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、逆相補的である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  3. 前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡである、或いは、
    前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が順にＧ及びＡである、或いは、
    前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも３個のヌクレオチド、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が順にＣ、Ｇ及びＡである、或いは、
    前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が順にＣ、Ｃ、Ｇ及びＡである、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。
  4. 前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  5. 前記ヌクレオチド配列Ｖの長さが２ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｖが、標的ｍＲＮＡと相補的である、又は、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｖが、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド若しくは連続した２個のウラシルリボヌクレオチドである、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ。
  6. 前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢａ１又はｓｉＨＢａ２である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
    ｓｉＨＢａ１
    センス鎖：５’－ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号５）
    アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ－３’（配列番号６）
    ｓｉＨＢａ２
    センス鎖：５’－ＧＡＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ－３’（配列番号７）
    アンチセンス鎖：５’－ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣＧＧ－３’（配列番号８）。
  7. ５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  8. 前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢａ１Ｍ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２、ｓｉＨＢａ２Ｍ１又はｓｉＨＢａ２Ｍ２である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
    ｓｉＨＢａ１Ｍ１
    センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号９）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１０）
    ｓｉＨＢａ１Ｍ２
    センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１１）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号１２）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ１
    センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１３）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号１４）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ２
    センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１５）又は、
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号１６）
    ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
  9. 前記ｓｉＲＮＡにおいて、少なくとも１つのリン酸基がチオリン酸エステル基であり、該チオリン酸エステル基が、
    前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
    前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  10. 前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓ、ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓ又はｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
    ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｓ
    センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１７）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号１８）
    ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｓ
    センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号１９）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号２０）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｓ
    センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２１）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号２２）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｓ
    センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２３）
    アンチセンス鎖：５’－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号２４）
    ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
  11. 前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
  12. 前記５’－リン酸ヌクレオチドが、式（１０２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、構造が式（１０３）～式（１０６）のいずれか１つに示されるヌクレオチドから選択され、
    ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す、請求項１１に記載のｓｉＲＮＡ。
  13. 前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｐ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｐ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｐ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｐ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＨＢａ１Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＨＢａ２Ｍ２ＳＰ１のいずれか１つである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
    ｓｉＨＢａ１Ｍ１Ｐ１
    センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２５）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号２６）
    ｓｉＨＢａ１Ｍ２Ｐ１
    センス鎖：５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２７）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＵｍ－３’（配列番号２８）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ１Ｐ１
    センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号２９）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号３０）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ２Ｐ１
    センス鎖：５’－ＧｍＡｍＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３１）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍ－３’（配列番号３２）
    ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ１
    センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３３）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号３４）
    ｓｉＨＢａ１Ｍ２ＳＰ１
    センス鎖：５’－ＣｍｓＣｍｓＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３５）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍｓＵｍｓＵｍ－３’（配列番号３６）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ１ＳＰ１
    センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３７）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号３８）
    ｓｉＨＢａ２Ｍ２ＳＰ１
    センス鎖：５’－ＧｍｓＡｍｓＣｍＣｍＵｍＵｍＧｆＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ－３’（配列番号３９）
    アンチセンス鎖：５’－Ｐ１－ＵｍｓＵｆｓＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍＵｍＣｍｓＧｍｓＧｍ－３’（配列番号４０）
    ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該文字Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
  14. 請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含み、前記ｓｉＲＮＡと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１～５００）である、薬物組成物。
  15. 請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体。
  16. Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための、
    請求項１に記載のｓｉＲＮＡ、及び／又は請求項１に記載のｓｉＲＮＡを含む薬物組成物、及び／又は請求項１に記載のｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ複合体を含む、組成物。
  17. 前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患又は肝過形成性疾患から選択される、請求項１６に記載の組成物。
JP2023160064A 2017-12-01 2023-09-25 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 Active JP7702159B2 (ja)

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