JP7702871B2 - 腫瘍細胞外マトリックスにおける腫瘍性タンパク質に特異的なペプチドｐｅｔ／ｓｐｅｃｔプローブ - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１７日に出願された米国仮出願第６２／７９３，７８９号の優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府資金
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＣＡ２１１７６２およびＣＡ１９４５１８の下で政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有している。

癌の検出および治療は、癌細胞と正常細胞との間を区別できないことによって妨げられている。癌または腫瘍のイメージングのための優れた検出ツールが癌の早期診断のために必要とされている。腫瘍細胞の分子認識は、誘導される外科的切除を容易にするであろう。外科的切除を改善するために、標的化イメージングツールは、主要な腫瘍だけでなく、腫瘍の端に沿って、そして体全体に分散する小さな腫瘍細胞クラスターにおいて、腫瘍細胞を特異的に標識しなければならない。腫瘍微小環境に蓄積する分子を標識するように設計される標的化イメージングツールは、それらが主要な腫瘍細胞集団および腫瘍再発に関与する浸潤性細胞を有する領域の両方を特定できるため、治療標的化剤としても有効であり得る。腫瘍細胞および／またはその微小環境を直接的に標的とする能力は、現在の治療の特異性および感度の両方を増加させ、したがって、体全体にわたって細胞に影響を及ぼす化学療法剤の非特異的副作用を軽減させるであろう。

ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングは、正常組織と比較して前立腺癌の上昇した糖代謝に基づいて、主に［^１８Ｆ］－ＦＤＧによる前立腺癌の臨床検査に適用されている。しかし、［^１８Ｆ］－ＦＤＧ ＰＥＴは、良性の前立腺癌を侵攻性のものと区別する能力が実証されていない。ＰＳＭＡ特異的ＰＥＴプローブが、最近、前立腺癌のために開発されている。臨床試験によって、ＰＳＭＡ陽性前立腺腫瘍の効果的な検出におけるＰＳＭＡプローブの能力が実証されている。しかし、最近の試験は、ＰＳＭＡプローブが良性組織を前立腺癌と区別できない可能性があると警告した。ＰＥＴプローブは、侵攻性の癌を検出してリスク層別化し、癌の正確な臨床管理のための非侵襲的診断モダリティの臨床的要求を満たすことが必要とされている。

本明細書に記載の実施形態は、腫瘍および／または癌細胞外マトリックスにおける腫瘍性タンパク質に対するペプチドポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）／単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）プローブに関するものであり、対象の組織における癌の位置および／もしくは分布、対象における癌の侵攻性、ならびに／または癌治療および／もしくは癌療法を必要とする対象に投与される癌治療および／もしくは癌療法の有効性を検出するために使用することができる。

いくつかの実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式を含むことができ、

式中、Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、およびそれらのレトロインベルソ型アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｃは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ造影剤であり、Ｌは、ペプチドをＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤に共有結合させる任意選択的なリンカーである。

いくつかの実施形態において、リンカーは、非ペプチドリンカーである。非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族、ヘテロ脂肪族、環状、および／または複素環式リンカーであることができる。非ペプチドリンカーは、例えば、ペプチドと造影剤を共有結合させる、アルキレン、アルキレンオキシド、アリーレン、またはアルキレンアリーレンリンカーを含むことができる。

ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤は、金属キレート剤または金属フラーレンのうちの少なくとも１つおよび陽電子またはガンマ線放出放射性核種を含むことができる。金属キレート剤は、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４、７，１０－テトラアザドデカンテトラメチル酢酸（ＤＯＴＭＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチル酢酸（ＤＯ３ＭＡ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）、Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシ－５－（エチレン－ベータ－カルボキシ）ベンジル）エチレンジアミンＮ，Ｎ’－二酢酸（ＨＢＥＤ－ＣＣ）、およびそれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含むことができる。陽電子またはガンマ線放出放射性核種は、例えば、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、または^８９Ｓｒを含むことができる。

いくつかの実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式を有することができ、

式中、
Ｐ_１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、およびそれらのレトロインベルソ型アミノ酸配列からなる群から選択され、
Ｒ^１は、任意選択的であり、存在する場合、－（ＣＨ_２）_ｎ－、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ、もしくはアリーレンなどのアルキレン、アルキレンオキシド、アリーレン、またはアルキレンアリーレンリンカーを含むことができ、ｎは、１～１８の整数であり、
Ｍは、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、もしくは^８９Ｓｒからなる群から選択される金属、またはそれらの塩である。

さらに他の実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを対象に全身投与して、対象における癌の分布および／または位置、ならびに癌の侵攻性を検出することができる。癌には、例えば、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽細胞腫、肉腫、骨癌、脳癌、頭頸部癌、または皮膚癌のうちの少なくとも１つが含まれ得る。

ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の合成を示す（ｓｈｏｗｉｎｇ）概略を示す（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ）。 ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の注射後、４時間および２２時間で、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３腫瘍を担持する２匹の代表的なマウスの肉眼による明視野および３ＤボリュームレンダリングＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。 ＺＤ２－ＤＡ－^６４Ｃｕ（ＤＯＴＡ）注射（Ｎ＝４）後、４時間および２２時間で、筋肉、肝臓、心臓、ならびにＬＮＣａＰおよびＰＣ３腫瘍における定量的トレーサー取り込みを示す。 注射後２４時間で、異なる組織におけるＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の生体分布を示すグラフを示す。データは平均±ｓｅｍ（Ｎ＝３）として表される。 ＬＮＣａＰおよびＰＣ３前立腺腫瘍切片におけるＥＤＢ－ＦＮの免疫蛍光染色を示す画像を示す。スケールバー：５０μｍ。 ＺＤ２－（Ｇａ－ＮＯＴＡ）（４）の合成手順を示す概略を示す。 （Ａ～Ｂ）は、ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｐａｎｃ１０．０５、およびＰａｎｃ－１ヒト膵臓癌細胞（Ａ）ならびにマウスにおける腫瘍異種移植片（Ｂ）でのＥＤＢ－ＦＮの発現を示すウエスタンブロット（Ａ）および蛍光共焦点画像（Ｂ）を示す。組織スライドは、ＢＣ－１抗ＥＤＢ－ＦＮモノクローナル抗体ならびにＡＦ－４８８およびＤＡＰＩで標識された二次抗体で染色される。 ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｐａｎｃ１０．０５、およびＰａｎｃ－１ヒト膵臓癌異種移植片標本におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５のＥＤＢ－ＦＮとの特異的結合を示す画像を示す。ＢＣ－１／ＺＤ２の列は、ＺＤ２－Ｃｙ５．５の結合が、ＢＣ－１抗体との標本のプレインキュベーションによってブロックされたことを示す。 ヒト膵臓癌、膵臓上皮内新生物、および正常膵臓の標本におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５のＥＤＢ－ＦＮとの結合パターンを示す蛍光画像を示す。 ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）を３００μＣｉ／マウスの用量で静脈内注射した後、１時間および２時間で、Ｃａｐａｎ－１およびＢＸＰＣ３ヒト膵臓癌異種移植片を担持するマウスの２次元冠状ＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。Ｔ：腫瘍、Ｂ：膀胱。 ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）を３００μＣｉ／マウスの用量で静脈内注射した後１時間で、Ｃａｐａｎ－１およびＢＸＰＣ３ヒトＰａＣａ異種移植片を担持するマウスの３次元ＰＥＴ画像を示す。Ｔ：腫瘍、Ｋ：腎臓、Ｂ：膀胱。 ＺＤ２－ＨＢＥＤ－ＣＣの合成を示す概略を示す。 ＺＤ２－ＡＨ－ＨＢＥＤ－ＣＣの合成を示す概略を示す。 ＺＤ２－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の合成を示す概略を示す。 ＺＤ２－ＡＨ－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の合成を示す概略を示す。 ＢＸＰＣ３およびＣａｐａｎ－１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を担持するマウスの、ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）によるＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。 ＢＸＰＣ３およびＣａｐａｎ－１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を担持するマウスの、ＺＤ２－ＡＨ－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）によるＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。

従来の分子生物学技術を含む方法が本明細書に記載されている。かかる技術は、当技術分野で一般に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２などの方法論条約に詳細に記載されている（定期的な更新を伴う）。他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学用語の一般的に理解されている定義は、例えば、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に認めることができる。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」、および「有すること」という用語は、包括的で開かれた意味で使用され、追加の要素が含まれ得ることを意味する。本明細書で使用される「など」、「例えば」という用語は、非限定的であり、例示のみを目的とする。「含む」および「含むがそれに限定されない」は、互換的に使用される。

本明細書で使用される「または」という用語は、文脈が明らかに他を示さない限り、「および／または」を意味すると理解されるべきである。

「薬剤」という用語は、本明細書では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料からなる抽出物を示すために使用される。

「癌」または「腫瘍」という用語は、初期腫瘍および任意の転移を含む、対象における任意の新生物増殖を指す。癌は、液体または固体の腫瘍タイプであることができる。液体腫瘍は、血液学的起源の腫瘍を含み、例えば、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、ワルデンシュトレーム症候群、慢性リンパ性白血病、その他の白血病）、およびリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）が含まれる。固形腫瘍は器官に起こり得、肺、脳、乳房、前立腺、卵巣、結腸、腎臓、および肝臓の癌が含まれる。

「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、異常な（すなわち、増加した）速度で分裂する細胞を指すことができる。癌細胞には、扁平上皮癌、非小細胞癌（例えば、非小細胞肺癌）、小細胞癌（例えば、小細胞肺癌）、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、未分化癌、気管支原性癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、胆管細胞癌、乳頭癌、移行細胞癌腫、絨毛癌、セモノーマ、胚性癌腫、乳癌、胃腸癌、結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、および頭頸部領域の扁平上皮癌などの癌腫；線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、および中皮肉腫などの肉腫；骨髄腫、白血病（例、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、網状細胞肉腫、またはホジキン病）などの血液学癌、ならびに神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、シュワン腫および表皮腫を含む神経系の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはアミノ酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、高分子の天然源に存在する、それぞれ他のＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質から分離された分子を指す。本明細書で使用されるような単離されたという用語はまた、細胞材料、または組換えＤＮＡ技術によって生成される場合の培養培地、あるいは化学的に合成される場合の化学的前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない核酸もしくはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」または「単離されたペプチド」は、核酸フラグメントまたはペプチドフラグメントを意味し、フラグメントとして天然に存在しておらず、天然の状態で見出されない。

「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。本用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、ならびに記載される実施形態に適用可能として、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語もまた、本明細書において互換的に使用される。

「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、
当該技術分野で認識されている用語であり、注射などの経腸および局所投与以外の投与方法が含まれ、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。

「患者」、「対象」、「哺乳動物宿主」などの用語は、本明細書では交換可能に使用され、ヒトおよび獣医対象を含む哺乳動物を指す。

「ポリペプチド」という用語は、天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）を介し連結されたそれらの合成の天然に存在しない類似体に関連するアミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびそれらの合成の天然に存在しない類似体、グリコシル化ポリペプチド、ならびにすべての「模倣」および「ペプチド模倣」ポリペプチド形態からなるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。本用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列を指すか、またはこれらのいずれかのフラグメント、部分、もしくはサブユニットを指すことができる。「タンパク質」という用語は、通常、大きいポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、通常、短いポリペプチドを指す。

ポリペプチドまたはタンパク質の「部分」は、ポリペプチドの少なくとも約３つの連続するアミノ酸残基を意味する。ポリペプチドの一部は、ポリペプチドのすべてのアミノ酸残基を含み得ることが理解される。

ポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」、および「変異体」は、ペプチド（または核酸）が野生型配列と同一ではないが、野生型ポリペプチド（または核酸）と相同性を有するように、１つ以上のアミノ酸（または１つ以上のヌクレオチド）で改変または変更され得るポリペプチドである。

ポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「変異」は、ペプチド（または核酸）が本明細書に列挙される配列と同一ではないが、野生型ポリペプチド（または核酸）と相同性を有するような、１つ以上のアミノ酸（または１つ以上のヌクレオチド）の改変または変更である。

本明細書で使用される「組換え」は、タンパク質が原核生物または真核生物の発現系に由来することを意味する。

本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢性投与」、および「末梢に投与される」という語句は、治療される対象の特定の組織、器官、または領域（例えば、脳）への直接的ではない、化合物、薬剤、または他の物質の投与を意味し、それは動物の系に入り、そして代謝および他の同様のプロセスに供され、例えば、皮下投与である。

「野生型」という用語は、タンパク質もしくはその一部をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列、またはタンパク質配列もしくはその一部をそれぞれ指し、通常インビボで存在する。

本明細書全体を通じて、組成物が特定の構成要素を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、組成物はまた、列挙された構成要素から本質的に構成されるか、またはそれから構成されることが企図される。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセス工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載されている場合、プロセスはまた、列挙された処理工程から本質的に構成されるか、またはそれから構成される。さらに、本明細書に記載の組成物および方法が実施可能である限り、工程の順序または特定の操作を実施するための順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上の工程または操作を同時に実施することができる。

本明細書に記載の実施形態は、対象における癌の分布および／もしくは位置、ならびに／または癌細胞の転移、移動、および／もしくは浸潤を検出、監視、および／またはイメージングするために、対象における癌細胞の侵攻性および／もしくは悪性度を検出および／または監視するために、ならびに／あるいは癌治療および／もしくは癌療法を必要とする対象に投与される癌治療および／もしくは癌療法の有効性を決定および／または監視するために、使用することができる腫瘍および／または癌細胞外マトリックスにおける腫瘍性タンパク質に対するペプチドポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）／単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）プローブに関する。

本明細書に記載のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、癌胎児性フィブロネクチン（ｏｎｆＦＮ）アイソフォーム、エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）、またはエクストラドメイン－Ａフィブロネクチン（ＥＤＡ－ＦＮ）に特異的に結合し、かつ／または複合体形成するペプチド配列を有する標的化ペプチドを含む。癌、特に悪性癌は、癌細胞の生存、増殖、および転移を促進する固有の腫瘍微小環境を有する。ｏｎｆＦＮの存在は、前立腺癌、乳癌、および膵臓癌を含む、様々なヒト癌タイプで認められている。ｏｎｆＦＮ、ＥＤＢ－ＦＮ、および／またはＥＤＡ－ＦＮの高い発現は、癌の侵攻性と相関し、患者生存と逆相関した。ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＢ－ＦＮに特異的に結合する標的化ペプチドを含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを使用して、対象の組織における癌細胞を検出、監視、および／またはイメージングすることができ、同様に、癌細胞の侵攻性、悪性度、転移、移動、分散、および／または浸潤を決定できることが認められた。

標的化ペプチドを含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、静脈内または非経口投与などによって対象に全身投与することができ、細胞外マトリックスタンパク質ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮを容易に標的として、対象における癌細胞の位置、分布、および／または侵攻性、同様に腫瘍の縁を明確にすることができる。

いくつかの実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式を含むことができ、

式中、Ｐは、標的化ペプチドであり、Ｃは、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤であり、Ｌは、ペプチドを造影剤に共有結合させる任意選択的なリンカーである。

いくつかの実施形態において、標的化ペプチドは、ＥＤＢ－ＦＮに特異的に結合することができる。ＥＤＢ－ＦＮに特異的に結合する標的化ペプチドは、ＴＶＲＴＳＡＤ（配列番号１）、ＮＷＧＤＲＩＬ（配列番号２）、ＮＷＧＫＰＩＫ（配列番号３）、ＳＧＶＫＳＡＦ（配列番号４）、ＧＶＫＳＹＮＥ（配列番号５）、ＩＧＫＴＮＴＬ（配列番号６）、ＩＧＮＳＮＴＬ（配列番号７）、ＩＧＮＴＩＰＶ（配列番号８）、およびＬＹＡＮＳＰＦ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する直鎖ペプチド、ＣＴＶＲＴＳＡＤＣ（配列番号１０）、ＣＮＷＧＤＲＩＬＣ（配列番号１１）、ＣＮＷＧＫＰＩＫＣ（配列番号１２）、ＣＳＧＶＫＳＡＦＣ（配列番号１３）、ＣＧＶＫＳＹＮＥＣ（配列番号１４）、ＣＩＧＫＴＮＴＬＣ（配列番号１５）、ＣＩＧＮＳＮＴＬＣ（配列番号１６）、ＣＩＧＮＴＩＰＶＣ（配列番号１７）、またはＣＬＹＡＮＳＰＦＣ（配列番号１８）のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、システインリンカーを伴う直鎖ペプチド、またはそれらの直鎖ペプチドのレトロインベルソ型アミノ酸配列を有するレトロインベルソ型ペプチドを含むことができる。

他の実施形態において、標的化ペプチドは、ＥＤＡ－ＦＮに特異的に結合することができる。ＥＤＡ－ＦＮに特異的に結合する標的化ペプチドは、ＷＮＹＰＦＲＬ（配列番号１９）、ＳＮＴＳＹＶＮ（配列番号２０）、ＳＦＳＹＴＳＧ（配列番号２１）、ＷＳＰＡＰＭＳ（配列番号２２）、ＴＲＥＨＰＡＱ（配列番号２３）、またはＡＲＩＩＤＮＡ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有する直鎖ペプチド、ＣＷＮＹＰＦＲＬＣ（配列番号２５）、ＣＳＮＴＳＹＶＮＣ（配列番号２６）、ＣＳＦＳＹＴＳＧＣ（配列番号２７）、ＣＷＳＰＡＰＭＳＣ（配列番号２８）、ＣＴＲＥＨＰＡＱＣ（配列番号２９）、またはＣＡＲＩＩＤＮＡＣ（配列番号３０）のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、システインリンカーを伴う直鎖ペプチド、またはそれらの直鎖ペプチドのレトロインベルソ型アミノ酸配列を有するレトロインベルソ型ペプチドを含むことができる。

標的化ペプチドは、様々な変更、置換、挿入、および欠失が供され得、かかる変更はその使用において特定の利点を提供する。これに関して、ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮに結合し、かつ／または複合体形成する標的化ペプチドは、列挙されるペプチドの配列と同一であるよりもむしろ実質的に相同的であることができ、１つ以上の変更がなされ、それはＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮに特異的に結合し、かつ／または複合体形成するように機能する能力を維持する。

標的化ペプチドは、様々な形態のポリペプチド誘導体のいずれかであることができ、アミド、タンパク質とのコンジュゲート、環化ポリペプチド、重合化ポリペプチド、レトロインベルソ型ペプチド、類似体、フラグメント、化学修飾したポリペプチド、および同様な誘導体を含む。

レトロインベルソ型ペプチドは、アミノ酸配列が逆になり、アミノ酸サブユニットのα中心のキラリティーも逆になる直鎖ペプチドである。これらのタイプのペプチドは、元のＬ－アミノ酸ペプチドと同様の側鎖トポロジーを維持し、それらをタンパク質分解に対してより耐性にするのに役立つように、Ｄ－アミノ酸を逆配列で含めることによって設計される。Ｄ－アミノ酸は、生物学的系に存在する天然タンパク質に存在する天然Ｌ－アミノ酸の立体配座鏡像を示す。Ｄ－アミノ酸を含むペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含むペプチドを超える利点を有する。一般に、これらのタイプのペプチドは、タンパク質分解の影響を受けにくく、使用される場合により長い有効期間を有する。さらに、Ｄ－アミノ酸のみまたは中間にＬ－アミノ酸を含む配列ブロックとして選択された配列領域におけるＤ－アミノ酸の挿入は、タンパク質分解に耐性があることに加えて、生物活性があり、増加した生物学的利用能を有する標的化ペプチドの設計を可能にする。さらに、適切に設計された場合、レトロインベルソ型ペプチドは、Ｌ－ペプチドと同様の結合特性を有することができる。

「類似体」という用語は、１つ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書に記載のＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮに特異的に結合し、かつ／または複合体形成する、本明細書に具体的に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有する任意のペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別のものとの置換、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などの１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の別のものとの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別のものとの置換が含まれる。

「保存的置換」という語句はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用を含み、ただし、かかるペプチドは必要な結合活性を示す。

「化学的誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化される１つ以上の残基を有する対象ペプチドを指す。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ－アシルまたはＯ－アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ－ベンジルヒスチジンを形成し得る。２０の標準アミノ酸のうちの１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むポリペプチドが化学誘導体にも含まれる。例えば、４－ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用でき、５－ヒドロキシリシンはリジンの代わりに使用でき、３－メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに使用でき、ホモセリンはセリンの代わりに使用でき、オルニチンはリジンの代わりに使用できる。本明細書に記載のペプチドにはまた、配列が本明細書に示されるペプチドの配列に対して１つ以上の付加および／もしくは欠失または残基を有する任意のペプチドが、必要な結合特異性または活性を維持する限り含まれる。

「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基配列が本明細書に示されるポリペプチドよりも短いアミノ酸残基配列を有する任意の対象ペプチドを指す。

任意のポリペプチドまたは化合物はまた、薬学的に許容される塩の形態で使用され得る。ポリペプチドと塩を形成することができる酸には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの無機酸が含まれる。

ポリペプチドと塩を形成することができる塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、モノ－、ジ－、およびトリ－アルキルおよびアリール－アミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）ならびに任意選択的に置換されたエタノールアミン類（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）などの有機塩基が含まれる。

標的化ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を含む、ポリペプチド分野の当業者に知られている技術のいずれかによって合成することができる。固相メリフィールド型合成などの合成化学技術は、純度、抗原特異性、望ましくない副産物からの解放、製造の容易さなどの理由のために使用され得る。利用可能な多くの技術の要約は、固相ペプチド合成に関して、Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７６、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，「Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｖｏｌ．２，ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８３、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２：２２１－９６，１９６９、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５：１６１－２１４，１９９０、および米国特許第４，２４４，９４６号、ならびに従来の溶液合成に関して、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９６５に認めることができ、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。かかる合成で使用可能な適切な保護基は、上記のテキストおよびＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

一般に、企図される固相合成法は、成長するペプチド鎖への１つ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の連続的な付加を含む。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、好適な、選択的に除去可能な保護基によって保護される。異なる選択的に除去可能な保護基が、リジンなどの反応性側基を含むアミノ酸のために利用される。

例として固相合成を使用し、保護または誘導体化されたアミノ酸は、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を介して不活性固体支持体に結合することができる。次に、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、固相支持体に既に結合した残基とのアミド結合を形成するのに適した条件下で反応させる。次に、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去することができ、そして次のアミノ酸（適切に保護されている）が付加され、以下同様である。すべての所望のアミノ酸が適切な配列で連結された後、残りの末端および側基保護基（および固体支持体）を順次または同時に除去して、最終的な直鎖ポリペプチドを得ることができる。

さらに、本明細書に記載の標的化ペプチドは、同様の配位子結合能力を有する、より親和性の高い小分子、ペプチド、抗体、および／または抗体フラグメントを開発するための出発点として使用することができる。例えば、コンピュータによるスクリーニングを使用するペプチドのファーマコフォアからの小分子の開発およびスクリーニングは、容易に実施することができ、そのように特定された分子の結合親和性は、小分子薬剤を選択する本明細書に記載のアッセイを使用して、標的化ペプチドに対して容易にスクリーニングすることができる。

追加の残基もまた、ペプチドを他のポリペプチド、タンパク質、検出可能部分、標識、固体マトリックス、または担体に都合よく連結および／または固定することができる「リンカー」を提供する目的のために、ペプチドのいずれかの末端に付加され得る。

アミノ酸残基リンカーは通常少なくとも１残基であり、４０残基以上、より多くの場合１～１０残基であり得る。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などである。さらに、対象標的化ペプチド薬剤は、末端ＮＨ_２アシル化、例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化によって、末端カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどの末端修飾によって、修飾される配列で異なることができる。よく知られているように、末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を低下させるのに有用であり、したがって、溶液中、特にプロテアーゼが存在し得る生物学的流体中でポリペプチドの半減期を延長するのに役立つ。これに関して、ポリペプチド環化もまた有用な末端修飾であり、環化によって形成される安定な構造のために、そして本明細書に記載されるような環状ペプチドについて観察される生物学的活性の観点からも特に好ましい。

リンカーがペプチドリンカーである場合、ポリペプチドリンカーは、従来の分子生物学的／組換えＤＮＡ法を使用して、単一の組換えポリペプチドとして生成され得る。

例えば、標的化ペプチドは、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することができるリジンを含むことができる。標的化ペプチドはまた、チオール選択的化学を介した化学的カップリング（例えば、マレイミド活性化化合物）を促進するシステインを含むことができる。さらに、標的化ペプチドは、ジアゾニウムカップリング反応を使用して修飾することができるチロシンを含むことができる。例示的な実施形態において、アミノ酸残基リンカーは、システイン－グリシン（ＣＧ）リンカーである。

他の実施形態において、化学結合剤基を使用することができる。結合剤基は、標的化ペプチドまたは標的化ペプチドが結合している化合物もしくは分子のいずれで置換基の化学反応性を増加させ、したがってカップリング効率を増加させるように働くことができる。結合剤化学には、チオール基に結合させるために使用できるマレイミジル結合剤、遊離アミン基に結合できるイソチオシアネートおよびスクシンイミジル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ））結合剤、フェノールに結合させるために使用することができるジアゾニウム、ならびにカルボジイミド活性化を使用してカルボン酸基などの遊離酸と結合させるために使用することができるアミンを含むことができる。

有用な官能基が、存在する特定のアミノ酸に基づいて標的化ペプチドに存在し、追加の基を設計することができる。ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の様々な二官能性または多官能性試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．のカタログに記載されているものなど）が、結合剤基として使用できることは、当業者には明らかであろう。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介して遂行することができる。

他のタイプの結合化学も利用できる。例えば、多糖類をペプチドにコンジュゲートさせるための方法は、カップリング試薬としてスクアリン酸ジエステル（１，２－ジエトキシシクロブテン－３，４－ジオン）を使用する（Ｔｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２：１４８－１５３（１９９１））、αまたはε－アミノ基を介したＮａＩＯ_４活性化オリゴ糖へのカップリング（Ｂｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７，１９１－２０２（１９９７））、多糖が還元末端を有し、カルボキシル基を含まないペプチド結合剤を介したカップリング（米国特許第５，３４２，７７０号）、およびヒト熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５に由来する合成ペプチド担体によるカップリング（米国特許第５，７３６，１４６号）によって例示されるが、これらに限定されない。多糖類、タンパク質、および脂質をペプチドにコンジュゲートさせるためのさらなる方法は、米国特許第７，６６６，６２４号に記載されている。

いくつかの実施形態において、リンカーは、非ペプチドリンカーである。非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族、ヘテロ脂肪族、環状、および／または複素環式リンカーであることができる。非ペプチドリンカーは、例えば、ペプチドと造影剤を共有結合させる、アルキレン、アルキレンオキシド、アリーレン、またはアルキレンアリーレンリンカーを含むことができる。

他の実施形態において、リンカーは、ＰＥＧ分子リンカーであることができる。ＰＥＧ分子は、様々な長さおよび分子量を有することができ、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ１０，０００、またはそれらの組み合わせを含む。

ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤は、標的化ペプチドに直接的にコンジュゲートするか、またはリンカーを介して標的化ペプチドに連結させることができる。造影剤の役割は、標的化ペプチドを含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブがＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮに結合することによって形成される複合体の可視化を可能にすることによって、検出または診断方法の検出ステップを容易にすることである。造影剤は、測定することができ、その強度が分析される組織に結合したＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブの量に関連する（好ましくは比例する）シグナルを生じるように選択することができる。

特定の実施形態において、造影剤は、キレート剤および金属イオンを含む。キレート剤は、一般に、リンカーと共有結合を形成することができる１つ以上の基を有する。当技術分野で知られている多くの異なるキレート剤を、本明細書で使用することができる。一態様において、キレート剤は、イメージング剤と配位することができる孤立電子対を有する少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、硫黄、リン）を含む非環状または環状化合物を含む。金属キレート剤は、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラメチル酢酸（ＤＯＴＭＡ）、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチル酢酸（ＤＯ３ＭＡ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラキス（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）、Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシ－５－（エチレン－ベータ－カルボキシ）ベンジル）エチレンジアミンＮ，Ｎ’－二酢酸（ＨＢＥＤ－ＣＣ）、およびそれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含むことができる。「誘導体」という用語は、本明細書では、キレート剤の対応する塩およびそのエステルとして定義される。

金属イオンの選択は、検出技術（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）に応じて異なることができる。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングに有用な金属イオンには、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、または^８９Ｓｒが含まれる。

いくつかの実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式を有することができ、

式中、
Ｐ_１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、ＷＮＹＰＦＲＬ（配列番号１９）、ＳＮＴＳＹＶＮ（配列番号２０）、ＳＦＳＹＴＳＧ（配列番号２１）、ＷＳＰＡＰＭＳ（配列番号２２）、ＴＲＥＨＰＡＱ（配列番号２３）、ＡＲＩＩＤＮＡ（配列番号２４）、およびそれらのレトロインベルソ型アミノ酸配列からなる群から選択され、
Ｒ^１は、任意選択的であり、存在する場合、アルキレン、アルキレンオキシド、アリーレン、またはアルキレンアリーレンリンカーを含み、例えば、
－（ＣＨ_２）_ｎ－、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ、またはアリーレンなどが挙げられ、ｎは１～１８の整数であり、
Ｍは、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、もしくは^８９Ｓｒからなる群から選択される金属、またはそれらの塩である。

他の実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式、

さらに他の実施形態において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、以下の式、

および^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、もしくは^８９Ｓｒからなる群から選択されるか、またはそれらの塩であるＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ放射性核種を有することができる。

本明細書に記載のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、例えば、全身的、局所的、および／または非経口的な投与方法によって対象に投与することができる。これらの方法には、例えば、注射、注入、沈着、移植、もしくは局所投与、または分子プローブによる組織へのアクセスが望まれる他の任意の投与方法が含まれる。一例において、分子プローブの投与は、対象における分子プローブの静脈内注射によるものであることができる。プローブの単回または複数回投与を行うことができる。本明細書で使用される「投与される」とは、対象における癌細胞を標識するのに有効な量および期間での分子プローブの提供または送達を意味する。

本明細書に記載の標的化ペプチドを含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、患者に、分子プローブまたはその薬学的に許容される水溶性塩を含む、検出可能な量の医薬組成物で対象に投与することができる。

「検出可能な量」は、投与される分子プローブの量が、癌細胞もしくは癌細胞微小環境における他の細胞によって発現されるＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮへのプローブの結合もしくは複合体形成の検出を可能にするのに十分であることを意味する。「イメージング有効量」は、投与されるＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブの量が、癌細胞もしくは癌細胞微小環境における他の細胞のＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮへの分子プローブの結合もしくは複合体形成のイメージングを可能にするのに十分であることを意味する。

投与されるＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブの製剤化は、選択された投与経路によって異なるであろう（例えば、溶液、乳濁液、カプセルなど）。好適な薬学的に許容される担体は、化合物の生物学的活性を過度に阻害しない不活性成分を含み得る。薬学的に許容される担体は、生体適合性、例えば、非毒性、非炎症性、非免疫原性であり、対象への投与時に他の望ましくない反応を欠いているべきである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、同上、に記載されているものなど、標準的な製剤技術を使用することができる。非経口投与に好適な医薬担体には、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液などが含まれる。

溶解または分散された有効成分を含む薬理学的組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。典型的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製されるが、溶液または懸濁液に適した固体形態も、使用前に液体に調製することができる。製剤は、選択される投与経路に従って異なる（例えば、溶液、乳濁液、カプセル）。

任意のポリペプチドまたは化合物はまた、薬学的に許容される塩の形態で使用され得る。ポリペプチドと塩を形成することができる酸には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの無機酸が含まれる。

ポリペプチドと塩を形成することができる塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、モノ－、ジ－、およびトリ－アルキルおよびアリール－アミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）ならびに任意選択的に置換されたエタノールアミン類（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）などの有機塩基が含まれる。

本明細書に記載のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、対象の器官、組織、または体領域において、ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮを発現する癌細胞の存在、位置、および／もしくは分布を検出ならびに／あるいは決定する方法で使用することができる。動物の組織、例えば、前立腺組織におけるプローブの存在、位置、および／または分布を視覚化することができる（例えば、上記のインビボイメージングモダリティを用いて）。本明細書で使用される「分布」は、面積または体積にわたって点在される空間特性である。この場合、「癌細胞の分布」は、動物の組織、例えば、前立腺組織に含まれる面積または体積にわたって点在されている癌細胞の空間特性である。そして、分子プローブの分布は、組織における癌細胞の存在または非存在と相関し得る。分布は、癌細胞の存在または非存在のための手がかりであり得、あるいは移動もしくは分散する癌細胞、癌転移の存在もしくは非存在を明確に検出するか、または対象における腫瘍縁を明確にするために当業者によって他の要因および症状と組み合わされ得る。

一態様において、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを対象に投与して、対象における悪性または転移性癌細胞の分布を評価し、分布を特定の位置に相関させ得る。外科医は、外科的切除において定位技術および術中ＭＲＩ（ｉＭＲＩ）を日常的に使用する。これによって、彼らは、腫瘍端または腫瘍中心など、腫瘍の異なる領域から組織を特異的に特定してサンプリングすることが可能になる。多くの場合、彼らはまた、肉眼では正常であるように見えるが、組織学的検査時に分散する腫瘍細胞よって浸潤される腫瘍端の外側にある腫瘍縁で組織の領域をサンプリングする。

悪性または転移性細胞に関連するＥＤＢ－ＦＮおよび／もしくはＥＤＡ－ＦＮに特異的に結合し、かつ／または複合体形成するＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを術中イメージング技術で使用して、外科的切除を誘導し、外科医による腫瘍縁の位置の「知識と経験による推測」を排除することができる。過去の試験は、より広範囲の外科的切除が患者の生存を改善することを決定している。したがって、診断用分子イメージング剤として機能するプローブは、患者の生存率を増加させる可能性を有する。

いくつかの実施形態において、癌細胞の除去を特定および容易にするために、顕微鏡術中イメージング（ＩＯＩ）技術を、本明細書に記載の全身投与または局所投与されたＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブと組み合わせることができる。対象への投与時のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、患者の器官または体領域において、癌細胞、すなわち、ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮ発現に関連する癌細胞の存在、位置、および／または分布を標的とし、検出および／または決定することができる。一例において、プローブをＩＯＩと組み合わせて、腫瘍縁に浸潤しており、かつ／または浸潤し始めている悪性細胞を特定することができる。本方法は、手術中にリアルタイムで実施することができる。本方法は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ造影剤などの検出可能な部分を含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブの局所的または全身的適用を含むことができる。次に、イメージングモダリティを使用して、画像データを検出し、続いて収集することができる。得られた画像データを使用して、少なくとも部分的に、外科的および／または放射線学的治療を決定し得る。あるいは、この画像データを使用して、少なくとも部分的に、自動化外科用デバイス（例えば、レーザー、メス、マイクロマシン）を制御するか、または手術のマニュアル誘導を支援し得る。さらに、画像データを使用して、治療薬の送達を計画および／または制御し得る（例えば、マイクロ電子機器またはマイクロマシンによる）。

本明細書に記載の別の実施形態は、対象における癌細胞の侵攻性または悪性度を決定する方法に関する。ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブの癌との結合強度は、癌の侵攻性と相関したことが認められた。増強された結合は、より侵攻性の癌と相関し、一方、低下または減少した結合は、侵攻性がより低いか、または良性の腫瘍と相関した。一例において、前立腺腫瘍切片とのプローブの結合は、腫瘍の侵攻性に基づいてグリーソンスコアと相関し、分子プローブの増強された結合強度は、侵攻性または悪性の前立腺癌と相関し、プローブのより低い結合を示した良性前立腺過形成から区別された。本明細書に記載の方法および分子プローブを使用して、癌治療または癌療法の投与前、投与中、または治療レジメン後の対象における癌の侵攻性を監視および／または比較することができる。

本明細書に記載の別の実施形態は、対象に投与される癌治療または癌療法の有効性を監視する方法に関する。本明細書に記載の方法およびＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを使用して、癌治療または癌療法の投与前、投与中、または治療レジメン後の対象における癌の侵攻性、浸潤、移動、分散、および転移を監視および／または比較することができる。

本明細書で使用される「癌治療」または「癌療法」は、例えば、癌細胞を死滅させるか、癌細胞にアポトーシスを誘導するか、癌細胞の増殖を低下させるか、転移の発生率または数を低下させるか、腫瘍サイズを低下させるか、腫瘍増殖を阻害するか、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を低下させるか、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進させるか、癌の進行を防止もしくは阻害するか、または癌を有する動物の寿命を延ばすかによって、動物における癌に負の影響を及ぼすことができる任意の薬剤または治療レジメンを含むことができる。癌治療は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法などであるがこれらに限定されない、１つ以上の療法を含むことができる。例えば、対象における癌の体積、増殖、移動、および／または分散の低下は、所与の療法の有効性を示し得る。これは、癌治療の直接的な臨床効能エンドポイント測定を提供することができる。したがって、別の態様において、癌治療の有効性を監視する方法が提供される。より具体的には、本出願の実施形態は、癌療法の有効性を監視する方法を提供する。

癌治療の有効性を監視する方法は、本明細書に記載のように動物にインビボでＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを投与するステップと、次に動物におけるプローブの分布を視覚化する（例えば、本明細書に記載のようにインビボイメージングモダリティを用いて）ステップと、次にプローブの分布を癌治療の有効性と相関させるステップと、を含むことができる。投与ステップは、治療レジメンの経過前、経過中、および経過後に発生させて、選択された治療レジメンの有効性を決定できることが企図される。癌治療の有効性を評価する１つの方法は、癌療法の前後でプローブの分布を比較することである。

いくつかの実施形態において、ＥＤＢ－ＦＮおよび／またはＥＤＡ－ＦＮに結合および／または複合体形成されたＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブは、対象において検出され、対象における癌細胞の侵攻性、位置、および／または分布を検出および／または提供する。次に、対象における癌細胞の侵攻性、位置、および／または分布を対照と比較して、癌治療および／または癌療法の有効性を決定することができる。対照は、癌治療および／または癌治療の投与前の対象における癌細胞の位置および／または分布であることができる。癌治療および／または癌療法の投与前の対象における癌細胞の位置および／または分布は、対象にプローブを投与し、癌治療および／または癌療法の投与前の対象において癌細胞と結合および／または複合体形成したプローブを検出することによって決定することができる。

特定の実施形態において、本明細書に記載の方法およびＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブを使用して、転移性または侵攻性の癌を治療するために、対象に投与される治療薬の有効性を測定することができる。この実施形態において、プローブは、治療レジメンの投与前、投与中、または投与後に対象に投与することができ、癌細胞の分布を画像化して、治療レジメンの有効性を決定することができる。一例において、治療レジメンは、転移性癌の外科的切除を含むことができ、プローブを使用して、術前および術後の転移性癌の分布を明確にして、外科的切除の有効性を決定することができる。任意選択的に、本方法およびプローブは、外科的腫瘍切除などの術中外科的処置において使用されて、手術中の癌細胞の質量または体積をより容易に明確化および／または画像化することができる。

他の実施形態において、標的化ペプチドは、治療薬にコンジュゲートされ、転移性癌などの癌を治療するために対象に投与することができる。この実施形態において、治療薬にコンジュゲートされた標的化ペプチドを対象に投与することができ、転移性細胞を治療薬で標的とすることができる。

治療薬は、抗腫瘍、化学療法、抗ウイルス、抗有糸分裂、抗腫瘍形成、および／または免疫療法の効果を発揮する抗増殖剤を含むことができ、例えば、細胞増殖抑制または細胞破壊効果によって、腫瘍細胞で直接的に、例えば、新生物細胞の発生、成熟、または拡散を防止し、生物学的反応の変更などのメカニズムを間接的に介さない。商業的使用、臨床評価、および前臨床開発において利用可能な多数の抗増殖剤がある。議論の便宜上、抗増殖剤は以下のクラス、サブタイプ、および種に分類される。ＡＣＥ阻害剤、アルキル化剤、血管新生阻害剤、アンギオスタチン、アントラサイクリン／ＤＮＡインターカレーター、抗癌抗生物質または抗生物質タイプの薬剤、代謝拮抗剤、抗転移化合物、アスパラギナーゼ、ビスホスホネート、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、炭酸カルシウム、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ＤＨＡ誘導体、ＤＮＡトポイソメラーゼ、エンドスタチン、エピポドフィロトキシン、ゲニステイン、ホルモン性抗癌剤、親水性胆汁酸（ＵＲＳＯ）、免疫調節剤または免疫学的薬剤、インテグリン拮抗薬、インターフェロン拮抗薬または薬剤、ＭＭＰ阻害剤、多様な抗新生物剤、モノクローナル抗体、ニトロソウレア、ＮＳＡＩＤ、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、ｐＢＡＴＴ、放射線／化学増感剤／保護剤、レチノイド、内皮細胞の増殖および移動の選択的阻害剤、セレン、ストロメリシン阻害剤、タキサン、ワクチン、およびビンカアルカロイド。

いくつかの抗増殖剤が分類される主なカテゴリーには、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質タイプの薬剤、ホルモン性抗癌剤、免疫学的薬剤、インターフェロンタイプの薬剤、および多様な抗新生物剤のカテゴリーが含まれる。いくつかの抗増殖剤は、複数または未知のメカニズムを介して機能し、そのため、２つ以上のカテゴリーに分類することができる。

いくつかの実施形態において、標的化ペプチドは連結分子を使用して治療薬に結合することができる。連結分子は、リンカーであり得る。あるいは、連結分子は、非ペプチドリンカーであり得る。

実施例１
本発明者らは、ＺＤ２^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡコンジュゲートをＥＤＢ－ＦＮのためのＰＥＴプローブとして開発し、その有効性を侵攻性ＰＣ３および遅増殖性ＬＮＣａＰヒト前立腺腫瘍異種移植片を担持するマウスにおけるＰＥＴイメージングについて評価した。本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮは侵攻性ＰＣ３腫瘍で高度に発現され、遅増殖性で非転移性のＬＮＣａＰ腫瘍では無視できる程度で発現されたことを示した。ＥＤＢ－ＦＮを標的とした造影剤ＺＤ２－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を用いたＭＲＩは、ＬＮＣａＰ腫瘍よりもＰＣ３腫瘍で強いコントラスト増強を示した。^６４Ｃｕの使用は、その半減期が１２．７４時間であるため特に魅力的であり、特に膀胱からの最小限のバックグラウンド推測で、前立腺における癌検出のための延長されたイメージング時間枠を提供する。ＰＥＴプローブは、ＺＤ２ペプチドを大環状配位子であるＤＯＴＡにコンジュゲートし、それに続く^６４ＣｕＣｌ_２との錯体形成によって合成した。癌の検出および腫瘍侵攻性の特徴付けにおけるＰＥＴプローブの能力を、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ腫瘍を担持するマウスで評価した。

材料および方法
ＺＤ２－ＰＥＧ－ＤＯＴＡおよびキレートの合成
化学合成に使用される試薬は、特に明記されていない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸および２－クロロトリチルクロリド樹脂は、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）から入手した。スペーサーであるＦｍｏｃ－８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨ）は、Ｃｈｅｍｐｅｐ（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，ＦＬ）から入手した。１，４，７，１０－テトラアザ－シクロドデカン－１，４，７－トリス－ｔｅｒｔ－ブチルアセテート－１０－酢酸（ＤＯＴＡ－トリス（ｔ－Ｂｕ））は、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔ－ｌａｎｄ，ＯＲ）から購入した。

ＺＤ２ペプチド（配列：ＴＶＲＴＳＡＤ）、ＮＨ_２－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨの２反復、およびＤＯＴＡを含有する前駆体ＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡは、対応する保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨ、および標準Ｆｍｏｃ－ペプチド化学を使用した固相の樹脂上のｔ－Ｂｕ－ＤＯＴＡを順次加えることによって合成した。次に、トリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／Ｈ_２Ｏ（９６．５：１：２．５）を使用して生成物を樹脂から切断し、室温で３時間撹拌し、エーテル中で沈殿させて、粗生成物を得た。最終生成物は、セミ分取Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで、分取ＨＰＬＣを使用して精製した。ＺＤ２－ＰＥＧ－ＤＯＴＡは、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ－ＳＴＲ分光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって、Ｒ２，５－ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして用いた線形モードで特性評価した（Ｍ＋１：１４２５．８、実測；１４２５．７、計算）。

細胞培養および動物モデル
動物試験は、Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＣＷＲＵ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（施設内動物管理使用委員会）によって承認されており、すべての対象がインフォームドコンセントフォームに署名した。ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で、３７℃および５％ＣＯ_２に維持した加湿インキュベータ内で培養した。雄の無胸腺ヌードマウス（４～６週齢）は、Ｃａｓｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）から入手し、ＣＷＲＵ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育した。高濃度Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中の３００万個の細胞を、腫瘍接種に使用した。ＬＮＣａＰ細胞を、マウスの左側腹部に皮下接種した。４週間後、ＰＣ３細胞をＰＥＴイメージングのために同じマウスの右側腹部に接種した。

放射性標識
放射性同位体^６４Ｃｕ（ＩＩ）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。ＺＤ２－ＰＥＧ－ＤＯＴＡのＣｕ（ＩＩ）とのキレート化は、放射性標識と同様の条件で０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液中の非放射性ＣｕＣｌ_２を用いて最初に試験した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡおよびＣｕＣｌ_２溶液の等モルを混合し、４５℃で３０分間撹拌した。ＺＤ２－ＤＡ－（Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の形成は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって検証された（Ｍ＋１：１４８７．８、実測；１４８６．０４、計算）。放射性標識のために、１０ｍＣｉの^６４Ｃｕ（ＩＩ）を２００μＬの０．１Ｎ ＨＣｌに溶解した。２０マイクロリットルの^６４Ｃｕ（ＩＩ）溶液（約１ｍＣｉ）を１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で４８０μＬのＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、大過剰、ＰＢＳ）と混合した。次に、容器は、断続的に振とうしながら４５℃で３０分間加熱して維持した。溶液の最終ｐＨは、注射前にＮａＯＨ溶液を使用して中性に調整した。

ＰＥＴイメージング
すべてのインビボイメージング試験は、ＣＷＲＵ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物研究委員会）が承認したプロトコルおよびガイドラインに従って実行された。マウスは、酸素中２％イソフルランで麻酔し、約２００μＣｉ［約７．４ＭＢｑ］のＺＤ２－ＤＡ－^６４Ｃｕ（ＤＯＴＡ）を、尾静脈を介して注射した。マウスは、４時間および２２時間の取り込み期間のＰＥＴスキャン（Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）の後に１０分間の静的ＰＥＴスキャンを受けた。画像は、３Ｄヒストグラムおよびズーム係数１．０で３Ｄ－ＯＳＥＭを使用して再構成した（２回の反復とそれに続く１８回反復のＭＡＰ）。ＣＴスキャン（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）を、解剖学的同時登録のためにＰＥＴ処置後に実施した。ＡＭＩＤＥバージョン１．０．５５７およびＡＭＩＲＡソフトウェアを使用してＰＥＴ／ＣＴ画像ｇを分析した。ＲＯＩをＰＣ３およびＬＮＣａＰ腫瘍について描画して、非特異的（筋肉）結合に対する特異的結合の比を計算した。

生体分布
注射後２２時間の最後のマイクロＰＥＴ／ＣＴイメージングの後、３匹のマウスを安楽死させ、器官および血液を収集して秤量し、放射能をガンマカウンターで決定した。組織１グラムあたりの注射量の割合は、注射量の２％を含む標準を使用して計算した。

組織学的分析
画像取得後、マウスを安楽死させた。腫瘍を採取し、最適な切断温度メディウムに包埋し、－８０℃で凍結し、５μｍで凍結切片化し、冷アセトンで透過処理した。組織を、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（１％）によって室温で１時間ブロックした。抗ＥＤＢ－ＦＮ ＢＣ１抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ腫瘍の組織切片とともにインキュベートした。広範に洗浄した後、二次抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体を１時間インキュベートした。組織切片を、４’６－ジアミジノ－２－フェニル－インドール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加したＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止封入剤によって対比染色した。染色された組織は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化した。

結果
ＺＤ２^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡコンジュゲートは、固相ペプチド化学を使用してＺＤ２ペプチドを大環状キレートＤＯＴＡにコンジュゲートさせ、続いて^６４ＣｕＣｌ２との錯体形成によって合成した（図１）。８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸の２回反復を有する短いスペーサーを、ペプチドとキレート剤との間に導入した。標的化配位子ＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡは、分取高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって特性評価した［ｍ／ｚ＝１４２５．８（Ｍ＋１）、実測；１４２５．５、計算］。標的化ＰＥＴプローブの調製は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）中のＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡおよび希ＨＣｌ（０．１Ｎ）中の非放射性ＣｕＣｌ_２の等モルの４５℃で３０分間の錯体形成によって実証され、同じ条件を放射性標識のために使用した。ＺＤ２－ＤＡ－（Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の形成は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって検証された［ｍ／ｚ＝１４８７．８（Ｍ＋１）、実測；１４８６．０４、計算］。

次に、前立腺癌ＰＥＴイメージングにおけるＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の有効性を、ＰＣ３およびＬＮＣａＰヒト前立腺癌異種移植片の両方を担持する雄ヌードマウスで調査した。既に、本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮが、侵攻性ＰＣ３腫瘍において高度に発現され、遅増殖性で非転移性のＬＮＣａＰ腫瘍では無視できる程度で発現されることを示した。腫瘍モデルを使用して、高リスクおよび低リスクの前立腺腫瘍を代表させ、侵攻性前立腺癌を検出および層別化するプローブの能力を試験した。放射性標識は、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で、２０μＬの^６４Ｃｕ（ＩＩ）溶液（０．１Ｎ ＨＣｌ、約１ｍＣｉまたは３７ＭＢｑ）を４８０μＬのＺＤ２－ＤＡ－ＤＯＴＡ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、大過剰、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）と混合することによって実施し、断続的に振とうしながら４５℃で３０分間維持した。次に、反応混合物をＰＢＳで１：２の比率に希釈し、ｐＨ試験紙で試験して、中性ｐＨを静脈内注射のために確実にした。放射性トレーサーは、マウスあたり７．４ＭＢｑ（２００μＣｉ）の用量で静脈内注射した。マウスのＰＥＴ画像は、注射後４時間および２２時間に、ＰＣ３およびＬＮＣａＰの両方の腫瘍異種移植片を担持する４匹のマウスの群で取得された。

図２は、ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）の注射後４時間および２２時間での、２匹の腫瘍担持マウスの代表的な三次元（３Ｄ）ボリュームレンダリングおよび体軸ＰＥＴ／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を示す。侵攻性ＰＣ３腫瘍では、遅増殖性ＬＮＣａＰ腫瘍よりも強いシグナルが目視で明らかだった。ＰＣ３腫瘍の位置およびサイズは、ＰＥＴ画像で明確に描写された。トレーサーの取り込みまたはシグナル強度は、４時間および２２時間で、関心対象の領域（ＲＯＩ）において定量的に分析した。図３に示すように、ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）は、ＬＮＣａＰ腫瘍よりもＰＣ３腫瘍で高いプローブ取り込みをもたらした。２２時間で、ＰＥＴは、侵攻性の低いＬＮＣａＰ腫瘍（３２１３±１５１１Ｂｑ／ｍＬ）と比較して侵攻性の高いＰＣ３腫瘍（７７１１±１９９４Ｂｑ／ｍＬ）で、２倍を超える高いＰＥＴトレーサーの蓄積を明らかにした（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０５、両側スチューデントのｔ検定）。実質的な放射性トレーサーの取り込みを示した他の器官は、肝臓、胃、および腎臓であり、肝臓および腎臓の経路を介した放射性トレーサーの排除を示した。

放射性トレーサーの生体分布は、注射後２４時間でマウスを怖がらせた後に測定した（図４）。生体分布パターンは、ＰＥＴイメージングの結果と一致しており、腫瘍、肝臓、および腎臓に強い取り込みを有した。脳および筋肉などの他の器官は、放射性トレーサーの低い取り込みを示し、これは放射性トレーサーの望ましい特性である。ＰＣ３およびＬＮＣａＰ腫瘍における放射性トレーサーの取り込みの比較は、ＰＣ３における放射性トレーサーの蓄積（１．^６４ＩＤ％／ｇ）は、ＬＮＣａＰ腫瘍（０．８６ＩＤ％／ｇ）におけるそれよりも高いことが示され（Ｎ＝３、Ｐ＝０．３２、両側スチューデントのｔ検定）、プローブが非転移性ＬＮＣａＰ腫瘍よりも侵攻性ＰＣ３腫瘍に優先的に蓄積することを確証した。

前立腺腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの発現は、ＰＥＴイメージング後の抗ＥＤＢ－ＦＮモノクローナル抗体ＢＣ１によるＰＣ３およびＬＮＣａＰ腫瘍の組織切片の免疫蛍光染色によって決定された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート化抗マウス抗体を使用して、ＢＣ１抗体およびＥＤＢ－ＦＮを染色した。図５は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査型顕微鏡で取得した腫瘍切片の蛍光画像を示す。強い蛍光染色がＰＣ３腫瘍切片では目視で明らかだったが、一方、ＬＮＣａＰ腫瘍ではほとんど染色は観察されなかった。一貫して、本発明者らは、ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＤＢ ｍＲＮＡレベルが、ＰＣ３細胞におけるそれよりも低かったことを既に示している。２つの異なる前立腺腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルは、ＰＥＴ分子イメージングによる観察とよく相関した。結果は、ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）が前立腺癌におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の高感度かつ定量的な可視化に有効であることを示唆する。

この例では、前立腺癌の検出および特性評価のために、ペプチドプローブＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）によるＥＣＭ腫瘍性タンパク質ＥＤＢ－ＦＮのＰＥＴイメージングの可能性を示した。既に本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮは、迅速増殖性ＰＣ３腫瘍で高度に発現され、遅増殖性ＬＮＣａＰ腫瘍で低く発現されることを示している。ＺＤ２ペプチド標的化ＭＲＩ造影剤は、ＬＮＣａＰ腫瘍におけるよりもＰＣ３腫瘍において強いシグナルを生じることができた。ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）によるＰＥＴ分子イメージングＥＤＢ－ＦＮの結果は、特に注射後２２時間で、ＺＤ２ペプチド標的化ＭＲＩ造影剤を使用したＭＲ分子イメージングと一致している。腫瘍におけるプローブ取り込みを比較すると、強いＰＥＴシグナルが、遅増殖性ＬＮＣａＰ腫瘍におけるよりも高いＥＤＢ－ＦＮ発現を有する迅速増殖性ＰＣ３腫瘍で検出された。しかし、有意なシグナル強度が、ＰＥＴ画像のＬＮＣａＰ腫瘍で依然として観察された。これは、^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡモノアミドの比較的低いキレート化安定性に起因し得る。キレートから放出される遊離^６４Ｃｕ（ＩＩ）は、動物モデルにおける前立腺腫瘍に蓄積し得ることが示されている。ＬＮＣａＰ腫瘍における比較的高いシグナル強度は、プローブから放出された遊離^６４Ｃｕ（ＩＩ）の蓄積に起因し得る。それにもかかわらず、プローブのＺＤ２ペプチドの標的化効果は、ＬＮＣａＰ腫瘍におけるよりもＰＣ３腫瘍において有意に高いシグナル強度を依然としてもたらした。ＭＲ分子イメージングと比較して、ＰＥＴイメージングは、前立腺癌におけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの高感度で定量的な視覚化および測定を生じ、侵攻性前立腺癌のより正確なリスク層別化を提供する。

一般に、比較的短い半減期のプローブによるＰＥＴイメージングは、限定されたイメージングウィンドウのために、前立腺における原発腫瘍をイメージングする際に膀胱からの有意なシグナル推測に悩まされる。比較的長い半減期の^６４Ｃｕは、膀胱を空にして、膀胱からの潜在的なシグナル干渉を最小限にする十分な時間を可能にし、前立腺における原発性腫瘍の早期検出のために重要である。実質的なシグナルが、注射後２２時間に、膀胱でのシグナルをほとんど伴わずに、腫瘍において依然として目視で明らかだった。有意なシグナル強度が、ＺＤ２－ＤＡ－（^６４Ｃｕ－ＤＯＴＡ）によって肝臓で観察され、Ｃｕ－ＤＯＴＡモノアミドの安定性が比較的低いことにも起因し得た。キレートからの遊離^６４Ｃｕ－（ＩＩ）の放出は、肝臓における放射性同位体の非特異的な蓄積につながり得る。

抗体および抗体フラグメントが、前立腺癌を含む癌の検出のためにＥＤＢ－ＦＮを標的として開発されている。この試験は、ＥＤＢ－ＦＮに特異的な小ペプチド標的化ＰＥＴプローブが、前立腺癌イメージングのための可能性も有することを示した。抗体ベースのプローブと比較して、小ペプチドＰＥＴプローブはいくつかの利点を有し、費用効果のある生成、拡散および灌流による優れた腫瘍浸透、および循環からの非結合プローブの迅速な排泄が含まれる。

実施例２
本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮは、ヒト膵臓癌（ＰａＣａ）標本およびマウスＰａＣａモデルからのＰａＣａ組織で高度に発現されており、どちらの事例でも正常な膵臓組織では発現していないことを示した。ＰａＣａ腫瘍ＥＣＭにおけるＥＤＢ－ＦＮの存在は、高感度の分子イメージングおよびＰａＣａ診断のために標的化トレーサーの迅速かつ特異的な結合を可能にする。ＥＤＢフラグメントのペプチド配列は、すべての哺乳動物種で保存されている。

ＥＤＢ－ＦＮに特異的に結合するペプチドＺＤ２（Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｓｐ）を特定した。ＺＤ２ペプチドは、高悪性度の前立腺腫瘍に対して強い結合親和性、低悪性度の腫瘍に対して弱い結合親和性、および正常組織において非結合性を示した。この実施例では、ＺＤ２ペプチドを使用して、膵臓癌の正確な検出およびリスク層別化のためのＥＤＢ－ＦＮの高感度で定量的な分子イメージングのためのＰＥＴプローブを開発することができることを示す。ＮＯＴＡをＺＤ２ペプチドにリンカー６－アミノヘキサン酸を使用してコンジュゲートさせることによって、ＺＤ２ペプチド標的化Ｇａ（ＩＩＩ）ＰＥＴプローブを設計および合成した。侵攻性で迅速増殖性のＰＣ３および遅増殖性ＬＮＣａＰ前立腺癌異種移植片を担持する雄ヌードマウスにおけるＰＥＴイメージングについて、標的化Ｇａ（ＩＩＩ）トレーサーの有効性を評価した。

実験
材料
ペプチド合成のための保護アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＬＬＣ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）は、Ａｎａｓｐｅｃ Ｉｎｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｆｍｏｃ－６－アミノヘキサン酸は、Ｃｈｅｍ－ＩＭＰＥＸ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＷＤ，ＩＬ，ＵＳＡ）から購入した。ｔ－ブチルブロモアセテートは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。他のすべての化学試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入した。^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてＴＭＳを使用して、５００ＭＨｚ Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ＮＭＲ分光計（供給者および住所）で取得した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量スペクトルは、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ－ＳＴＲ分光計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で、マトリックスとして２，５－ジヒドロキシ安息香酸を用いた線形モードで取得した。ＺＯＲＢＡＸ ３００ ＳＢ－Ｃ１８カラムセミ分取ＨＰＬＣを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００を、以下の条件で配位子の精製のために使用した：溶離液Ａ、Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡ（０．１％）；Ｂ、ＭｅＣＮ／ＴＦＡ（０．１％）；０％Ｂで１５分、０～５０％Ｂで３０分、５０％Ｂで５分、５０％～１００％Ｂで２分、１００％Ｂで５分、流速２ｍＬ／分、２１０ｎｍでＵＶ検出。Ｇａは、０．１Ｍ ＨＣｌで溶離された^６８Ｇｅ／^６８Ｇａジェネレータ（ＩＴＧ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇａｒｃｈｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

合成
１，４－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルメチル）－１，４，７－トリアザノナンの合成
１，４，７－トリアザシクロノナン（１．５ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）を氷浴中の無水ＣＨＣｌ_３（１５ｍＬ）に溶解し、ＣＨＣｌ_３（３０ｍＬ）中のブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（４．９８ｇ、２５．５６ｍｍｏｌ）を１．５時間かけてゆっくり加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、溶媒を除去した。残留物をＤＩ水（１５ｍＬ）で処理し、１Ｍ ＨＣｌでｐＨ３に調整し、エーテル（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機相を除去し、水相を１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８～９に調整し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ×３）で再度抽出した。最後に、有機相を蒸発させて生成物を得た。収率：３６％、^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４８（ｓ，１８Ｈ），２．７９（ｓ，４Ｈ），３．０３～３．０７（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，４Ｈ），３．３７（ｓ，４Ｈ），９．４６（ｓ，Ｈ）．

ＮＯＴＡ－ビス（ｔ－Ｂｕエステル）の合成
１，４－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルメチル）－１，４，７－トリアザノナン（０．３ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸（０．４１５ｇ、３ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、水（３ｍＬ）のＫ_２ＣＯ_３（０．５３ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮した。次に、残留物を水に溶解し、１Ｍ ＨＣｌによってｐＨ４に調整した。回転蒸発によって水を除去し、生成物をフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチルが６．５：３．５）によって精製した。収率：^６４％、^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）：δ＝１．４８（ｓ，１８Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ），３．０８（ｍ，４Ｈ），３．３５（ｓ，４Ｈ），３．４７（ｓ，４Ｈ）．

ＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡの合成
ＺＤ２－ＨＡは、固相化学を使用して合成した。１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の６－アミノヘキサン酸（１．５当量）、ＨＢＴＵ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１．５当量）の混合物をペプチド合成（０．５ｍｍｏｌペプチド）の最後に樹脂に加え、ニンヒドリンが変色しなくなるまで振とうした（カイザー試験）。次に、樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ×３）およびＤＣＭ（１０ｍＬ×３）を使用して洗浄した。続いて、ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＢＳ（９６．５：２．５：１）のカクテルを使用して、ＺＤ２－ＨＡを樹脂から３時間切断した。ＺＤ２－ＨＡを冷エチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離して凍結乾燥した。生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価した：［Ｍ］について計算したｍ／ｚ、Ｃ_４７Ｈ_８３Ｎ_１５Ｏ_１８、１１４６．２５；実測（Ｍ＋Ｈ^＋）、１１４７．５６。

非放射性Ｇａ－ＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡの合成
１０ｍＬのＮａＡｃ－Ａｃ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）に溶解したＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡ（０．１１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｇａ（ＮＯ_３）_３（０．０７６ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で一晩撹拌し、最後に、生成物は分取ＨＰＬＣを使用して精製し、凍結乾燥して、綿状の白色粉末を得た。収率：４３％。生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価した：［Ｍ］について計算したｍ／ｚ、Ｃ_４７Ｈ_８１ＧａＮ_１５Ｏ_１８、１２１２．５１；実測（Ｍ＋Ｈ^＋）、１２１３．５４。

結果および考察
化学および放射化学
ＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡの合成を図６に示した。ＮＯＴＡ－ビス（ｔ－Ｂｕエステル）は、出発物質としてＴＡＣＮから、２回の置換によって調製した。次に、前駆体ＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡは、固相ペプチドを使用してＮＯＴＡ－ビス（ｔ－Ｂｕエステル）およびＺＤ２－ＨＡとコンジュゲートすることによって成功裏に合成され、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製されている。精製されたＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｍ／ｚ＝１１４７．５６）およびＨＰＬＣ（純度：約９８％）によって特性評価した。^ＮａｔＧａ－ＺＤ２－ＨＡ－ＮＯＴＡも調製され、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｍ／ｚ＝１２１３．５４）およびＲＰ－ＨＰＬＣ（純度：約９６％）によって特性評価した。

非放射性ＺＤ２－（Ｇａ－ＮＯＴＡ）を、図６に示す手順に従って最初に合成した。大環状配位子ＮＯＴＡを使用したのは、比較的穏やかな条件下で^６８Ｇａ（ＩＩＩ）と安定したキレートを容易に形成できるためであり、ペプチドの結合特性を保持するために重要である。ＺＤ２ペプチドを、標準的な固相ペプチド合成を使用して合成し、次いで６－アミノヘキサン酸（ＨＡ）をスペーサーとしてペプチドのＮ末端にコンジュゲートさせた。ＮＯＴＡ－ビス（ｔ－Ｂｕエステル）を、樹脂上のアミノ基に最後にコンジュゲートさせ、標的化配位子ＺＤ２－ＮＯＴＡを、ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＢＳ（９６．５：２．５：１）のカクテルで樹脂を処理することによって得た。最終生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。精製されたＺＤ２－ＮＯＴＡは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって特性評価し（ｍ／ｚ＝１１４７．５６［Ｍ＋１］、実測；１１４６．２５、計算）、約９８％（ＨＰＬＣ）の純度を有した、図７Ａ、Ｂ。次に、ＺＤ２－（^ＮａｔＧａ－ＮＯＴＡ）は、配位子を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）中の過剰なＧａＣｌ_３と室温で反応させることによって調製した。ＺＤ２－（^ＮａｔＧａ－ＮＯＴＡ）を、分取ＨＰＬＣを使用して精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって特性評価し（ｍ／ｚ＝１２１３．５４［Ｍ＋１］、実測；１２１２．５１、計算）、約９６％（ＨＰＬＣ）の純度を有した、図４３Ｃ、Ｄ。ペプチドおよびＺＤ２－（^ＮａｔＧａ－ＮＯＴＡ）は高い水溶性であり、非特異的な組織結合を最小限に抑えるための有利な特性である。

放射性トレーサーＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）は、Ｄｒ．Ａｖｒｉｌと共同でＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ（ＵＨ）の放射性医薬品研究室において、ＺＤ２－ＮＯＴＡを酢酸ナトリウム緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）中のＧａＣｌ_３と９０℃で１５分間反応させることによって放射性合成した。反応液のｐＨは、ＮａＯＨで最終的に調整した。放射化学的収率は、放射性検出器およびＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ１８カラムを備えたＨＰＬＣ（水＋０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡの勾配、２２０ｎｍでのＵＶ）で決定した場合、約７７％だった。放射性標識トレーサーは、イメージング前にＣ－１８カラムを備えた逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）のＨＰＬＣクロマトグラムを図８に示し、生成物パラメータを表３にまとめる。メインピーク周辺の小さなピークは、おそらく^６８Ｇａ（ＩＩＩ）とペプチドの錯体形成による可能性があり、放射性標識ペプチド生成物で一般的に観察される。放射性標識の収量は、臨床トレーサーの収量に匹敵している。生成物の純度も臨床グレードの生成物と同等である。

ヒト膵臓癌細胞および腫瘍異種移植片におけるＥＤＢ－ＦＮの発現
ＥＤＢ－ＦＮの発現は、ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ－１、Ｐａｎｃ１０．０５、およびＰａｎｃ－１細胞を含む４つの異なるヒト膵臓癌細胞株で、ウエスタンブロッティングによって最初に実証された。これらのヒトＰａＣａ細胞株は、前臨床試験においてマウスＰａＣａ癌モデルを展開するために一般的に使用されている。試験したすべての癌細胞株は、ＥＤＢ－ＦＮの高発現を有する、図９Ａ。腫瘍モデルは、ＡＴＣＣの説明に従って、雌ヌードマウスの脇腹における癌細胞の皮下移植によって発達させた。ＥＤＢ－ＦＮの発現は、ＢＣ－１抗ＥＤＢ－ＦＮモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色を使用して、ヒトＰａＣａ細胞の腫瘍異種移植片において実証される。図９Ｂに示すように、ＥＤＢ－ＦＮの実質的な発現は４つのＰａＣａサブタイプすべてで観察され、正常な膵臓および筋肉では発現は観察されず、報告された結果と一致した。ＥＤＢ－ＦＮの高発現が、ＰａＣａ腫瘍のＥＣＭで観察された。結果は、ＥＤＢ－ＦＮがＰａＣａ細胞および腫瘍によって高度に発現され、ＰａＣａの分子イメージングおよび検出のための有望な腫瘍性タンパク質標的であることを示す。

ＰａＣａ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮに結合するＺＤ２ペプチド
ＺＤ２ペプチド（Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｔｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｓｐ）標的化蛍光トレーサーＺＤ２－Ｃｙ５．５は、ＰａＣａ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮとのペプチドの結合を評価するために報告された方法に従って合成した。膵臓癌におけるＥＤＢ－ＦＮとのＺＤ２ペプチドの結合特異性は、上記の腫瘍異種移植片の腫瘍スライドとのＺＤ２－Ｃｙ５．５のインキュベーションによって試験されている。図１０に示されるように、ＺＤ２－Ｃｙ５．５（赤）の強い結合が、図９Ｂにおける免疫蛍光染色と同様に、試験した４つの腫瘍組織すべてにおいて観察された。ＺＤ２－Ｃｙ５．５の正常な膵臓および筋肉との有意な結合は観察されなかった。ＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮとのＺＤ２－Ｃｙ５．５の強い結合は、ＢＣ－１抗ＥＤＢ－ＦＮモノクローナル抗体（ＢＣ－１／ＺＤ２）によってブロックされた。ＢＣ－１抗体、続いてＺＤ２－Ｃｙ５．５（ＢＣ－１／ＺＤ２）とプレインキュベートしたＰａＣａ標本では、赤色蛍光染色はほとんど観察されなかった。結果は、ＺＤ２－Ｃｙ５．５およびＢＣ－１の両方が腫瘍組織において同じＥＤＢ－ＦＮタンパク質標的に特異的に結合することを示唆する。ＺＤ２ペプチドは、ＰａＣａ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの特異的結合のための有望な標的化剤である。

ヒトＰａＣａ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの発現
ヒト膵臓癌におけるＥＤＢ－ＦＮ発現は、ヒト膵臓癌標本をＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色することによって示される。図１１に示すように、強い赤色蛍光がヒトＰａＣａ標本で観察され、正常な膵臓ではほとんど蛍光が観察されないが、ある程度の蛍光強度が前癌性膵臓上皮内新生物で示された。蛍光強度は、ＰａＣａにおける高いＥＤＢ－ＦＮ発現、前癌組織における低い発現、および正常な膵臓における無発現を示唆する。

ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）によるＰａＣａのＰＥＴイメージング
ＥＤＢ－ＦＮの高感度分子イメージングおよびＰａＣａの検出におけるＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）の有効性
を、Ｃａｐａｎ１およびＢＸＰＣ３ヒトＰａＣａ異種移植片を担持するマウスモデルにおいてマイクロＰＥＴ／ＣＴで評価した。腫瘍モデルは、Ｃ．１と同様に雌ヌードマウスで展開した。上記の方法を使用して合成されたトレーサーは、マウスあたり３００μＣｉの用量で静脈内注射した。図１２は、トレーサーの注射後１時間および２時間で、腫瘍を示す代表的な２Ｄ冠状ＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。トレーサーの強い取り込みが、腫瘍および膀胱において両時点で観察された。正常な組織および器官、特に脳、肝臓、および肺において、取り込みは注射後１時間でほとんど観察されなかった。バックグラウンドノイズが注射後２時間でわずかに増加したが、おそらく放射能の低下およびスキャン時間の延長に起因する。両方の腫瘍のシグナル強度は、注射後１時間および２時間の筋肉におけるシグナル強度の約５倍だった。三次元ＰＥＴ画像はまた、腫瘍への強い取り込みを、腎臓および膀胱以外の周囲の正常組織および器官への非特異的な取り込みをほとんど伴わずに示した、図１３。腎臓および膀胱の高いシグナル強度は、トレーサーが主に腎臓濾過を介して排泄されることを示す。これらの結果は、ＥＤＢ－ＦＮの分子イメージングおよびＰａＣａの早期検出におけるＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＮＯＴＡ）の有効性および高い特異性を実証し、さらにＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮの特異的発現を検証する。ＺＤ２ペプチド標的化^６８Ｇａキレートは、臨床診療における膵臓癌の高感度な早期検出のために有望である。

実施例３
ＺＤ２－ＨＢＥＤ－ＣＣの合成
ＺＤ２ペプチドは、標準的な固相化学を使用して合成した。次に、ＨＢＥＤ－ＣＣ－トリス（ｔＢｕ）エステルを樹脂上のＺＤ２ペプチドのＮ末端にコンジュゲートさせた。その後、ＴＦＡ／水／ＴＩＢＳ（９６．５／２．５／１）のカクテルを使用して、ペプチドを樹脂から切断した。生成物をエチルエーテル中で沈殿させ、分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価した。（Ｍ＋１）ｍ／ｚ、実測で１２６４．０２；Ｃ５５Ｈ８２Ｎ１２Ｏ２２について計算で１２６４．３２。

ＺＤ２－ＡＨ－ＨＢＥＤ－ＣＣの合成
ＺＤ２ペプチドは、標準的な固相化学を使用して合成した。次に、Ｆｍｏｃ－６－アミノヘキサン酸を樹脂上のＺＤ２ペプチドのＮ末端にコンジュゲートさせた。その後、ＨＢＥＤ－ＣＣ－トリス（ｔＢｕ）エステルをペプチドと反応させ、ＴＦＡ／水／ＴＩＢＳ（９６．５／２．５／１）のカクテルを使用して樹脂からの切断を続けた。生成物ＺＤ２－ＡＨ－ＨＢＥＤ－ＣＣをエチルエーテル中で沈殿させ、分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価した。（Ｍ＋１）ｍ／ｚ、実測で１３７７．１；Ｃ６１Ｈ９３Ｎ１３Ｏ２３について計算で１３７７．４８。

ＺＤ２－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の合成
配位子、リンカーのないＺＤ２－ＨＢＥＤ－ＣＣ、および硝酸ガリウムをＰＢＳ中で９０℃、２分間混合した。次に、生成物ＺＤ２－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）を分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析で特性評価した。（Ｍ＋１）ｍ／ｚ、実測で１３２９．８；Ｃ５５Ｈ７９ＧａＮ１２Ｏ２２について計算で１３２９．４７。

ＺＤ２－ＡＨ－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の合成
配位子、リンカーのあるＺＤ２－ＨＢＥＤ－ＣＣ、および硝酸ガリウムをＰＢＳ中で９０℃、２分間混合した。次に、生成物ＺＤ２－ＡＨ－（Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）を分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析で特性評価した。（Ｍ＋１）ｍ／ｚ、実測で１４４２．９；Ｃ６１Ｈ９０ＧａＮ１３Ｏ２３について計算で１４４２．５５。

腫瘍を有するマウスのＰＥＴイメージング
すべてのインビボイメージング試験は、ＣＷＲＵ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物研究委員会）が承認したプロトコルおよびガイドラインに従って実行された。ＢｘＰＣ３またはＣａｐａｎ－１ヒト膵臓異種移植片を担持するマウスを、酸素中の２％イソフルランで麻酔した。トレーサーＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）またはＺＤ２－ＡＨ－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）を、１００～３００μＣｉ［５．３～１３．０ＭＢｑ］の用量で尾静脈から注射した。次に、マウスは、３０分または６０分の取り込み期間後に、１０分または２０分の静的ＰＥＴスキャン（Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）を受けた。すべてのＰＥＴ処置の後に、解剖学的同時登録のためにＣＴスキャンを続けた。ＰＥＴ／ＣＴ画像は、Ｉｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅバージョン３．０およびＨｏｒｏｓソフトウェアを使用して分析した。関心対象領域（ＲＯＩ）は、腫瘍、主要器官、および筋肉について描画して、特異的および非特異的な組織取り込みの比率を計算した。画像は、３Ｄ－ＯＳＥＭを２回反復、続いてＭＡＰを１８回反復で用いて、ズーム係数１．０の３Ｄ再構成で処理した。

ＥＤＢ－ＦＮの高感度分子イメージングおよび膵臓癌の検出におけるＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の有効性を、Ｃａｐａｎ－１およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌異種移植片を担持するマウスモデルにおいてマイクロＰＥＴ／ＣＴで評価した。図は、注射後３０分または６０分で、腫瘍を担持するマウスの代表的な２Ｄならびに３Ｄ全身ＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。トレーサーの強い取り込みが、全身ＰＥＴ画像に示されているように、注射後３０分または６０分で、腫瘍、腎臓、および膀胱に観察された。両腫瘍におけるトレーサーの取り込みは、脳、心臓、肝臓、および筋肉を含む正常な器官および組織よりも有意に高かった。腎臓および膀胱における高いシグナル強度は、トレーサーが腎臓濾過を介して主に排泄されることを示す。

定量分析は、ＢｘＰＣ３およびＣａｐａｎ－１の両腫瘍における取り込みが、注射後３０分または６０分で、脳、心臓、肝臓、および筋肉を含む正常組織よりも有意に高かったことを明らかにした。ＺＤ２－ＡＨ－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）では、腫瘍の取り込みは、ＢｘＰＣ３およびＣａｐａｎ－１腫瘍において、注射後６０分でそれぞれ筋肉の約１８．３倍および１３倍だった（ｐ＜０．０１）。リンカーのないＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）では、腫瘍の取り込みは、ＢｘＰＣ３およびＣａｐａｎ－１腫瘍において、注射後６０分でそれぞれ筋肉の約１０．２倍および７．３倍だった（ｐ＜０．０１）。腫瘍の取り込みは、両腫瘍モデルにおける正常組織よりも有意に高く残存した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＺＤ２－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）およびＺＤ２－ＡＨ－（^６８Ｇａ－ＨＢＥＤ－ＣＣ）の両方が、肝臓を含む正常組織における最小限の取り込みで、膵臓癌腫瘍に対して高度に特異的であることを実証する。

本発明の上記の説明から、当業者は、改善、変更、および修正を認識するであろう。当技術分野内のかかる改善、変更、および修正は、添付の特許請求の範囲によって網羅されることが意図されている。本出願で引用されるすべての参考文献、刊行物、および特許は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明を説明しているように、以下が請求される。

Claims (4)

1. 以下の式を含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブであって、
   式中、Ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｃが、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤であり、Ｌが、前記ペプチドを前記ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ造影剤に共有結合させる任意の６－アミノヘキサン酸リンカーであり、
   前記造影剤が、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシ－５－（エチレン－ベータ－カルボキシ）ベンジル）エチレンジアミンＮ，Ｎ’－二酢酸（ＨＢＥＤ－ＣＣ）、およびそれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む、金属キレート剤と、キレート金属を含み、
   前記ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブが、膵臓癌細胞を含む癌細胞を検出、監視、および／またはイメージングするのに使用するためのものである、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴプローブ。
2. 前記キレート金属が、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、または ^８９Ｓｒからなる群から選択される、請求項１に記載のプローブ。
3. 癌細胞および／または癌細胞侵攻性を検出、監視、および／またはイメージングするのに使用するための、請求項１に記載のプローブ。
4. 癌侵攻性を決定するのに使用するための、請求項３に記載のプローブ。

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