JP7704040B2

JP7704040B2 - 蛍光ナノ粒子

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Publication number: JP7704040B2
Application number: JP2022011009A
Authority: JP
Inventors: 義一栗原
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2025-07-08
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: JP2023109473A

Description

本発明は、蛍光ナノ粒子に関する。

病理診断では、免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）やｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）と呼ばれる、標本の分子情報の発現を確認するための分子を標的とした染色を施し、遺伝子やタンパク質の発現異常といった機能異常を診断する観察が行われている。免疫染色には、例えば、酵素を用いた色素染色法（ＤＡＢ染色等）が用いられる。

しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素標識による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗原等の量を見積もることが難しいという課題がある。そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識による染色の代わりに、蛍光標識を用いる蛍光標識法も行われている。

この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある。蛍光標識法は、蛍光色素で修飾された抗体を用いて対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測るものである。

従来、蛍光標識に用いるものとして、蛍光色素を含む樹脂粒子に標的物質に結合する物質としてのストレプトアビジンを直接的に結合させた蛍光ナノ粒子を含む染色液が知られている。たとえば、特許文献１は、ストレプトアビジンが結合した蛍光ナノ粒子を開示している。

特表２００８－５４３９８２号公報

上記の特許文献１に記載されているような蛍光ナノ粒子を用いて、高精度な染色を行うためには、蛍光ナノ粒子が凝集せず、良好な分散性を有することが好ましい。本発明の目的は、良好な分散性を有する蛍光ナノ粒子を提供することである。

本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、樹脂および前記樹脂に内包された蛍光色素を含むナノ粒子と、前記ナノ粒子に結合した、カルボキシル基またはその塩を有する糖と、前記糖を介して前記ナノ粒子に結合した、標的物質に結合する結合物質と、を有する。

本発明によれば、良好な分散性を有する蛍光ナノ粒子を提供することができる。

図１Ａは、蛍光ナノ粒子を示す模式図であり、図１Ｂは、蛍光ナノ粒子による標識の一例を示す模式図である。図２は、本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子の製造方法を示す図である。図３Ａ～図３Ｃは実施例に係る蛍光ナノ粒子を用いた染色結果を示す図であり、図３Ｄ、図３Ｅは比較例に係る蛍光ナノ粒子を用いた染色結果を示す図である。

［蛍光ナノ粒子］
図１Ａは本発明の実施の形態に係る蛍光ナノ粒子１０を模式的に示す図である。蛍光ナノ粒子１０は、樹脂２０および樹脂２０に内包された蛍光色素３０を含むナノ粒子４０と、ナノ粒子４０に結合した、カルボキシル基またはその塩を有する糖５０と、糖５０を介してナノ粒子４０に結合した、標的物質１００（図１Ｂ参照）に結合する結合物質６０とを有する。蛍光ナノ粒子１０は、観察対象を蛍光染色（蛍光標識）するために用いられる。

図１Ｂは、蛍光ナノ粒子１０による標識の一例を示す模式図である。図１Ｂでは、細胞７０中の抗原に、一次抗体８０が結合し、一次抗体８０に二次抗体９０が結合している。そして、二次抗体９０は標的物質１００で修飾されている。

蛍光ナノ粒子１０の結合物質６０は、上記の標的物質１００に結合することで、観察対象（例えば抗原）を標識する。蛍光ナノ粒子１０による標識は輝点として観察可能であるため、観察対象を定量的に評価することに適する。このような蛍光ナノ粒子１０が、分散性が悪く、凝集する傾向があると、輝点が凝集した状態で観察されてしまい、定量的に評価することに支障をきたす。以下、蛍光ナノ粒子の各構成要素について説明する。

（ナノ粒子）
ナノ粒子は蛍光ナノ粒子の母体である。ナノ粒子は、マトリックスとなる樹脂と、蛍光色素とを含む。

ナノ粒子を構成する樹脂の種類は特に制限されない。たとえば、ナノ粒子を構成する樹脂として、次のような熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を用いることができる。熱可塑性樹脂の例には、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂が含まれる。熱硬化性樹脂の例には、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、メラミン樹脂、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂が含まれる。

これらの樹脂の内、特に、メラミン樹脂、尿素樹脂が好ましい。特に、メラミン樹脂は、キシレン等の有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、ナノ粒子に内包させた蛍光色素の溶出を抑制することができる点で好ましい。

ナノ粒子は、その表面に直接的または間接的に糖および結合物質を有する。したがってナノ粒子は、これらを結合させるための官能基を備えることが好ましい。このような官能基としては、本発明の属する技術分野において様々な物質を結合させる場合と同様の官能基を利用することができるが、例えば、エポキシ基またはアミノ基が好ましい。

官能基を有するナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、ナノ粒子を構成する熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を合成するためのモノマーとして、所定の官能基をあらかじめ側鎖に有する（コ）モノマーを（共）重合させるか、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂の合成後に、それを構成している樹脂モノマー単位が有する官能基を試薬処理して前記所定の官能基に変換する方法を用いることができる。

熱可塑性樹脂を用いてナノ粒子を製造する場合の実施形態の例には、スチレンと共にグリシジルメタクリレートをモノマーとして用いて共重合させることにより、表面にエポキシ基を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造する実施形態、あるいはスチレンと共にスチレンカルボン酸やスチレンスルホン酸を共重合させて、表面にカルボン酸、スルホン酸を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造する実施形態、あるいはスチレンと共にアミノスルホン酸を共重合させて表面にアミノ基を有するポリスチレン系樹脂のナノ粒子を製造する実施形態が含まれる。なお、前記グリシジルメタクリレートが有するエポキシ基は、所定の処理によりアミノ基に変換することもできる。

一方、熱硬化性樹脂を用いてナノ粒子を製造する場合の実施形態の例には、メラミン樹脂原料（例えば三和ケミカル社製ＭＸ－０３５）をモノマーとして用いて共重合させることにより、メラミン系樹脂のナノ粒子を製造する実施形態が含まれる。

（蛍光色素）
蛍光色素は、ナノ粒子に内包されている。蛍光色素は、蛍光色素を含む溶媒中で上記の樹脂のモノマーを重合させることでナノ粒子に内包される。

ナノ粒子に内包されている蛍光色素は、ナノ粒子に物理的または化学的な力で結合しされていると考えられる。

蛍光色素の量は、蛍光ナノ粒子の全重量に対して、１％～１０％であることが好ましい。蛍光色素の量が少ないと組織や細胞などの自家蛍光に対して十分な蛍光を確保することが出来ず、また撮影時の退色が問題となってくる。また、蛍光色素の量が多いと蛍光分子同士の分子間相互作用により濃度消光が起きて輝度が低下する。

蛍光色素の例には、ローダミン系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ系色素分子、スクアリリウム系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子、半導体ナノ粒子、または、これらの組合せが含まれる。

ローダミン系色素分子などの蛍光色素は、比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香族炭化水素系色素分子に属するペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）やピレン（ｐｙｒｅｎｅ）、ペリレンジイミド（ｐｅｒｙｌｅｎｅｄｉｉｍｉｄｅ）が好ましい。

ローダミン系色素分子の例には、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、テキサスレッド、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＬＤ７００ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、それらの誘導体などが含まれる。

ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の例には、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、それらの誘導体などが含まれる。

スクアリリウム系色素分子の例には、ＳＲｆｌｕｏｒ６８０－Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｂｉｓ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｂｉｓ、２－（４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（４－（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，５，６，７－ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－９－ｙｌ）－４－（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２，３，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ－９（５Ｈ）－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、それらの誘導体などが含まれる。

芳香族炭化水素系色素分子の例には、Ｎ, Ｎ－Ｂｉｓ－（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）－ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ’－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ’－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４,９,１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃｄｉｉｍｉｄｅ、４，４’－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc ａｃｉｄ、２，１０－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ、２，１０－Ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ, ３，３'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７－ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２－ｃｄｅ－］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－５－１０－Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－５,１０－ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２－ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－１６,１７－ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ, ４，４’，４’’，４’’’－[[２，９－ｂｉｓ[２，６－ｂｉｓ(１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ’ｅ’ｆ’]ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、４，４’，４’’，４’’’－［［２，９－ｂｉｓ［２，６－ｂｉｓ（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ‘ｅ’ｆ‘]ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－］、それらの誘導体などが含まれる。

半導体ナノ粒子を構成する半導体の種類は、蛍光を放出できるものであれば特に限定されない。半導体ナノ粒子を構成する半導体は、例えばII－VI族化合物半導体、III－Ｖ族化合物半導体、またはIV族半導体である。半導体ナノ粒子を構成する半導体の例には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＳｉおよびＧｅが含まれる。

（糖）
糖はナノ粒子の表面に結合している。図１Ａに示されるように、糖５０は水酸基（－ＯＨ）を有するので、これが良好な分散性を有する蛍光ナノ粒子が得られる一因と推定される。

また、本実施の形態において、糖は、カルボキシル基またはその塩を有する。カルボキシル基またはその塩は、条件によって、負の電荷を帯びることができる。これにより、蛍光ナノ粒子の間に反発力が生じさせることができる。これも良好な分散性を有する蛍光ナノ粒子が得られる一因と推定される。

また、カルボキシル基またはその塩は、糖５０をナノ粒子４０へ結合させることと、糖５０に結合物質６０を結合させることにも役立つ（図１Ａ参照）。具体的には、糖が有するカルボキシル基またはその塩と、ナノ粒子／結合物質が有する官能基との間に結合が形成される。結合の例には、アミド結合が含まれる。

糖の種類は、カルボキシル基またはその塩を有する糖であれば特に限定されない。カルボキシル基またはその塩を有する糖の例には、カルボキシアルキルデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシエチルデキストラン、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、サクシニルキトサン、サクシニルカルボキシメチルキトサン、またはこれらの塩が含まれる。

（結合物質）
図１Ａに示されるように、本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子１０は、糖５０を介してナノ粒子４０に結合した結合物質６０を有する。結合物質６０の種類は、観察対象に直接または間接的に結合した標的物質１００に結合することができれば特に制限されない。

結合物質の量は、標的物質に十分に結合させるという観点から、粒径や結合物質の大きさにもよるが蛍光ナノ粒子１分子に対して、５０個～１０００個程度であることが好ましい。

結合物質の例には、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗体、核酸が含まれる。

標的物質およびそれに結合する結合物質の組み合わせの例には、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ニュートラアビジン、抗原－抗体、核酸－核酸、抗体－核酸の組み合わせが含まれる。標的物質と結合物質との間の結合は、特異的な結合であることが好ましい。ここで特異的な結合とは、本発明の属する技術分野における一般的な用語として解釈することが可能であるが、結合定数（Ｋ_Ａ）またはその逆数である解離定数（Ｋ_Ｄ）によって定義することも可能である。

すなわち、本発明で用いられる結合物質は、染色対象が有する標的物質に対する結合定数（Ｋ_Ａ）が１×１０^５～１×１０^１５の範囲にあることが好ましい。結合定数（Ｋ_Ａ）が当該範囲内にある場合は、その標的物質は、結合物質と特異的に結合する物質として取り扱うことができる。

（平均粒子径）
蛍光ナノ粒子の平均粒子径は、汎用の蛍光顕微鏡でも好適に輝点の観察を可能とする観点から、好ましくは３０～３００ｎｍであり、より好ましくは４０ｎｍ～２００ｎｍである。平均粒子径が３００ｎｍを超える場合、染色後の観察の際に細胞１個当たりの輝点数が減って輝点観察がしにくくなり、逆に平均粒子径が３０ｎｍ未満の場合、細胞１個当たりの輝点数が増えて輝点観察がしにくくなるからである。

また、蛍光ナノ粒子１０の平均粒子径は、分散性を良好にするという観点（後述する分散性の指標であるＰｄＩが０．１以下となるという観点）から、３０ｎｍ以上であることが好ましく、４０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。

なお、平均粒子径は走査型電子顕微鏡で撮影した画像（ＳＥＭ画像）に写っている各粒子（１００個以上）の長径を測定し、その平均値とすることができる。

（効果）
本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に、カルボキシル基またはその塩を有する糖が結合しているため、分散性が高い。したがって、本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子を用いることで高精度な蛍光染色（蛍光標識）を行うことが可能となり、観察対象を高精度に観察または定量することも可能となる。

以下、本実施の形態に係る発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本実施の形態に係る発明はこれらの実施例により限定されない。

［蛍光ナノ粒子の製造］
図２は、実施例に係る蛍光ナノ粒子の製造方法を模式的に示す。図２を参照しつつ蛍光ナノ粒子の製造について説明する。

蛍光ナノ粒子の製造は以下のように実施した。

（シード粒子の作製）
蛍光色素であるペリレンジイミド４．４ｍｇを水２０ｍＬに溶解して得られた溶液に乳化重合用乳化剤である「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５質量％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料である「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を固形分量として０．１４ｇ加えた。さらに、この溶液に酸触媒であるドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学（株）製）の１０質量％水溶液を０．７０ｍＬ加え、７０℃に加熱して５０分間撹拌し、さらに９０℃に昇温して２０分間撹拌して、メラミン樹脂の合成を行った。

得られた樹脂粒子の分散液からの樹脂粒子の分離、さらに樹脂粒子に付着する余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くための洗浄を次のように行った。上記分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を５回繰り返した。得られた樹脂粒子をシード粒子１とした。シード粒子の平均粒子径は２０ｎｍ、粒子径の変動係数は１２％であった。

（５０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）
蛍光色素であるペリレンジイミド１．９ｍｇを水２０ｍＬに加えて溶解して得られた溶液に乳化重合用乳化剤である「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５質量％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にシード粒子１を５．０×１０¹⁴個加え、得られた分散液にメラミン樹脂原料である「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を固形分量として０．０６ｇ加えた。この分散液に、酸触媒であるスルファミン酸（関東化学（株）製）の２．４７質量％水溶液と酸触媒であるドデシルベンゼンスルホン酸の１０質量％水溶液とを１：３の比率で混合して得られた酸溶液を０．７０ｍＬ加え、７０℃に加熱して５０分間攪拌し、さらに９０℃に昇温して２０分間撹拌して、メラミン樹脂の合成を行った。

得られた樹脂粒子の分散液からの樹脂粒子の分離、さらに樹脂粒子に付着する余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くための洗浄を次のように行った。上記分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を５回繰り返した。このようにして図２の上段に示されるように、蛍光色素３０を内包するナノ粒子４０を得た。

[蛍光ナノ粒子の平均粒子径の測定]
蛍光ナノ粒子の分散液を基板上で室温にて一晩静置して乾燥させ、ＳＥＭ（Ｓ－４８００、日立ハイテク社製）を用いて観察および画像撮影を行った。得られた画像から任意の粒子１０００個の粒子径を計測し、平均粒子径と粒子径の変動係数を算出した。上記のようにして得られたナノ粒子の粒子径は５３．６ｎｍ、粒子径の変動係数は１２％であった。

（６５ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）
上記の「（５０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）」において、蛍光色素ペリレンジイミドの量を２．５ｍｇ、エマルゲン４３０の５質量％水溶液の量を２．６ｍＬ、ニカラックＭＸ－０３５の量を０．０８ｇにて使用したこと以外は同様にして蛍光ナノ粒子を作製した。また、上記と同様の方法にて測定したナノ粒子の平均粒子径は６５．９ｎｍ、粒子径の変動係数は１０％であった。

（８０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）
上記の「（５０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）」において、蛍光色素ペリレンジイミドの量を３．０ｍｇ、エマルゲン４３０の５質量％水溶液の量を３．２ｍＬ、ニカラックＭＸ－０３５の量を０．１ｇにて使用したこと以外は同様にして蛍光ナノ粒子を作製した。上記と同様の方法にて測定したナノ粒子の平均粒子径は８３ｎｍ、粒子径の変動係数は９％であった。

（１３０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）
上記の「（５０ｎｍ狙いの蛍光ナノ粒子の製造）」において、蛍光色素ペリレンジイミドの量を４．９ｍｇ、エマルゲン４３０の５質量％水溶液の量を５．２ｍＬ、ニカラックＭＸ－０３５の量を０．１６ｇにて使用したこと以外は同様にして蛍光ナノ粒子を作製した。上記と同様の方法にて測定したナノ粒子の平均粒子径は１３２．６ｎｍ、粒子径の変動係数は９％であった。

蛍光ナノ粒子に対する表面修飾は以下のように実施した。

実施例１デキストラン×ストレプトアビジン修飾ナノ粒子の製造
図２の中段は、ナノ粒子４０の表面に糖５０が結合し、さらに糖５０が有するカルボキシル基が、Ｎ－ヒドロキシスクシイミド（ＮＨＳ）によって活性化された様子を示す。このような状態のナノ粒子は以下のようにして得た。

まず、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ、名糖産業社製）１ｍｇをＭＥＳ緩衝液１ｍｌに溶解した。次に、Ｎ－ヒドロキシスクシイミド１１．５ｍｇおよび１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１９．２ｍｇを加えて、室温にて攪拌した。このようにして、ＣＭＤのカルボキシル基をＮＨＳで活性化した。

次に、活性化されたカルボキシル基を有するＣＭＤ中に、上記で製造したナノ粒子１ｍｇを加えて、室温にて攪拌した。このようにすることで、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基と、ナノ粒子の表面の、メラミン樹脂に由来するアミノ基との間でアミド結合を形成させて、ナノ粒子の表面にデキストランを結合させた。なお、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基のうちナノ粒子に結合しなかったものが、図２の中段に示されるようにナノ粒子の表面に存在すると考えられる。

結合物質の結合
図２の下段は、糖５０を介してナノ粒子に結合した結合物質６０を有する蛍光ナノ粒子１０を示す。このような蛍光ナノ粒子は以下のようにして得た。

上記で得たナノ粒子の反応液を１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。その後、１ｍＬのＭＥＳ緩衝液を加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。この操作を２回繰り返した後、沈殿物に酢酸緩衝液を１ｍＬ加えてストレプトアビジン０．１５ｍｇを加えて、室温にて攪拌した。このようにすることで、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基と、ストレプトアビジンが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、ストレプトアビジンをナノ粒子に結合させた。その後、１ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。この操作を２回繰り返した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に保存することで、実施例１の蛍光ナノ粒子を得た。

実施例２セルロース×ストレプトアビジン修飾ナノ粒子の製造
実施例１のデキストラン修飾ナノ粒子の製造において、ＣＭＤをカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業社製）１ｍｇに変更した以外は同様の方法にて作製した。

実施例３デキストラン×核酸修飾ナノ粒子の製造
実施例１のデキストラン修飾ナノ粒子の製造において、ＣＭＤ結合後、ＭＥＳ緩衝液による洗浄操作の後に、５’末端をアミノ基で修飾した３０ｍｅｒのＰｏｌｙ（ｄＣ）を２ｕＭとなるように加えて室温にて１時間撹拌した。その後、１ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。この操作を２回繰り返した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に保存することで、実施例３の蛍光ナノ粒子を得た。

（比較例１の蛍光ナノ粒子）
比較例１は、糖および結合物質が結合していない蛍光ナノ粒子とした。

（比較例２の蛍光ナノ粒子）
比較例２の蛍光ナノ粒子は、糖５０の代わりにポリエチレングリコールを有する点で、実施例１の蛍光ナノ粒子と異なる。このような比較例２の蛍光ナノ粒子は以下のようにして得た。

ポリエチレングリコールの結合
ナノ粒子１ｍｇを純水１ｍＬ中に懸濁し、１，２－Ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ（ＢＡＥＥ）２０μＬと混合し、７０℃で１時間反応させた。

次に、この反応液を１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。その後、１ｍＬの水を加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。この操作をさらに２回行い、合計で３回の水洗浄を行った。次に、沈降物に１ｍＬのＴＨＦを加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物を回収した。

得られた蛍光ナノ粒子を、ＴＨＦを用いて３ｎｍｏｌ／Ｌに調整した。

ナノ粒子の溶液に、最終濃度１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＮＨＳ－ＰＥＧ１２－マレイミドを混合して、室温℃で１時間反応した。

この反応液を１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。その後、ＥＤＴＡを２ｍｍｏｌ／Ｌ含有するＰＢＳを加えて沈降物を分散させた。そして、再度、１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行って上澄みを除去して沈降物のみを回収した。沈降物の分散処理から遠心分離までの一連の操作によるナノ粒子の洗浄をさらに３回行った。そして、上記マレイミドあるいはＮＨＳ基が粒子表面に存在したナノ粒子を得た。この沈殿物にりん酸緩衝液を１ｍＬ加えてストレプトアビジン０．１５ｍｇを加えて、室温にて攪拌した。このようにすることで、マレイミド基またはＮＨＳ基と、ストレプトアビジンが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、ストレプトアビジンをナノ粒子に結合させた。その後、１ｍＬのりん酸緩衝液を加え、再度１５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行い、上澄みを除去して沈降物のみを回収した。この操作を２回繰り返した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に保存することで、比較例２の蛍光ナノ粒子を得た。

［蛍光ナノ粒子の評価］
上記のようにして得た実施例および比較例の蛍光ナノ粒子の分散性を以下のよう評価した。

（ＰｄＩによる分散性の評価）
実施例および比較例の蛍光ナノ粒子のそれぞれについて、ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法によりＰｄＩを測定した。ＰｄＩは、以下の式で表される粒子径分布の広がりを示す無次元指標であり、分散性の評価に利用できる。

ＰｄＩ＝（標準偏差（σ）／平均粒子径（μ））^２

蛍光ナノ粒子の粒子径のばらつきが小さい場合、ＰｄＩは、粒子の分散性の度合いを示しており、値が小さいほど粒子が凝集せずに、分散していることを表している。一般に、ＰｄＩは０．１以下であれば、粒子の分散性が良好であると考えられる。

ＰｄＩの測定は具体的には以下のようにして行った。
蛍光ナノ粒子の分散液を１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて希釈し、ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のディスポーザブルセル（ＤＴＳ１０７０)に７５０ｕＬ加えた。ディスポーザブルセルを同社製のゼータサイザーナノにセットし、測定角度を１７３°として測定を実施した。測定回数は３回とし、３回の平均値ならびに標準偏差を算出した。

表１は、上記の様にして測定した、ＰｄＩと、ＳＥＭによる粒子の平均粒子径との関係を示す表である。

表１からわかるように、実施例１、２、３の蛍光ナノ粒子では、いずれの平均粒子径でもＰｄＩは０．１以下であり、分散性が良好であった。これは、実際の免疫染色で用いる中性緩衝液中での分散度合いを表しており、免疫染色実施時に凝集しづらい可能性を示唆している。また、実施例１、２の結果から、糖の種類は特定の種類に限定されず、カルボキシル化されている糖であれば分散性が良好な粒子を得られることが分かった。さらに、実施例１と、実施例３の結果からは結合物質６０がタンパク質に限定されず、核酸が修飾されていても同様に分散性が良好な粒子を得られることが分かった。

一方、比較例１においてはいずれの粒径においてもＰｄＩが０．１を大きく上回り中性緩衝液中での分散性に乏しいことを示唆する結果となった。また、比較例２の蛍光ナノ粒子では、平均粒子径が１３２．６ｎｍであるときのみＰｄＩが０．１以下であり、ＰＥＧを表面修飾することで分散性は改善傾向であったが、分散性が十分とは言えない結果であった。

一般的に、粒子は、平均粒子径が小さいほど比表面積が大きくなるため、凝集しやすくなる。比較例２のＰＥＧを表面修飾した蛍光ナノ粒子では、平均粒子径が９０ｎｍ以下の場合はＰｄＩが０．１超となり粒子が凝集してしまっていたが、実施例の蛍光ナノ粒子では、平均粒子径が９０ｎｍ以下であってもＰｄＩが０．１以下となり粒子がほとんど凝集しなかった。

（免疫染色による分散性の評価）
実施例および比較例の蛍光ナノ粒子を用いて蛍光免疫染色を行い、蛍光ナノ粒子の分散性の評価を行った。

具体的には、以下の手順で免疫染色を行った。

≪蛍光ナノ粒子を用いたＩＨＣ染色≫
蛍光ナノ粒子と、以下のように作製したビオチン標識２次抗体とを有する抗体試薬（病理診断用の染色試薬）を調製し、この染色試薬を用いて免疫染色を行った。

＜ビオチン修飾された２次抗体の作製＞
比較例１、２、実施例１、２にて使用する２次抗体は以下のように作製した。
まず、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「（＋）－Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ_６－ＮＨ－Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製、製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。

この反応溶液を脱塩カラム「ＺｅｂａＳｐｉｎＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎｓ」に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン標識２次抗体の溶液とした。

＜核酸修飾された２次抗体の作製＞
実施例３にて使用する２次抗体は以下のように作製した。
まず、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、５’末端をマレイミドにて標識した３０ｍｅｒのＰｏｌｙ（ｄＧ）をＤＭＳＯを用いて０．４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。

この反応溶液を脱塩カラム「ＺｅｂａＳｐｉｎＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎｓ」に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液を標識２次抗体の溶液とした。

＜蛍光免疫染色法＞
（１）脱パラフィン処理工程
上記ビオチン標識２次抗体等を用いて、ヒト乳がん由来培養細胞ＺＲ－７５－１の免疫染色と形態観察染色とを以下のように行った。染色用のスライドとして、ＨＥＲ２ＩＨＣポジコンスライド（パソロジー研究所社製、以下切片スライド）を用いた。この切片スライドを脱パラフィン処理した。

（２）賦活化処理工程
切片スライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した切片スライドを１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の切片スライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した切片スライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。

（３）免疫染色処理工程
（３－１）１次抗体反応
ロシュ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」の溶液を上述のブロッキング処理した切片スライドに対して４℃で１晩反応させた。該反応後の切片スライドをＰＢＳで洗浄した。
（３－２）２次抗体反応
１次抗体反応を行った切片スライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン標識２次抗体もしくは核酸標識２次抗体と室温で３０分間反応させた。該反応後の切片スライドをＰＢＳで洗浄した。
（３－３）蛍光ナノ粒子との反応
２次抗体反応を行った切片スライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．１２ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した前述の蛍光ナノ粒子を、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９～７.４）、室温の条件下で２時間反応させた。該反応後の切片スライドをＰＢＳで洗浄した。

（４）形態観察染色工程
免疫染色後、ヘマトキシリン染色を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、切片スライドを流水で３分間洗浄した。

（５）封入処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（武藤化学社製「マリノール」）を用いて、組織切片を封入して観察用のスライドとした。

（６）観察
封入処理工程を終えたスライドに対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態のスライドを蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ８０」）により観察および撮像を行った。上記励起光の波長は、光学フィルターに通すことで５７５～６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長についても、光学フィルターを通すことで６１２～６９２ｎｍに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ²となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。

撮像結果を図３Ａから図３Ｅに示す。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃはそれぞれ実施例１、２、３の蛍光ナノ粒子を用いた場合の撮像結果を示し、図３Ｄおよび３Ｅはそれぞれ比較例１、２の蛍光ナノ粒子を用いた場合の撮像結果を示している。

図３Ａ、３Ｂ、３Ｃでは、蛍光ナノ粒子の凝集による輝点の凝集が見られなかった。これに対して、図３Ｅの矢印で示されているように、比較例の蛍光ナノ粒子を用いた場合では、輝点の凝集が見られた。図３Ｄは表面修飾を実施する前の粒子であるため蛍光は全く検出されなかった。

本実施の形態に係る蛍光ナノ粒子は、良好な分散性を有するため、蛍光イメージングなどに有用である。

１０蛍光ナノ粒子
２０樹脂
３０蛍光色素
４０ナノ粒子
５０糖
６０結合物質
７０細胞
８０一次抗体
９０二次抗体
１００標的物質

Claims

樹脂および前記樹脂に内包された蛍光色素を含むナノ粒子と、
前記ナノ粒子に結合した、カルボキシル基またはその塩を有する糖と、
前記糖を介して前記ナノ粒子に結合した、標的物質に結合する結合物質と、
を有する、
蛍光ナノ粒子。
前記樹脂は、メラミン樹脂または尿素樹脂である、請求項１に記載の蛍光ナノ粒子。
前記糖は、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、サクシニルキトサン、サクシニルカルボキシメチルキトサンまたはこれらの塩である、請求項１または２に記載の蛍光ナノ粒子。
前記結合物質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗体または核酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子。
ＰｄＩが０．１以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子。
平均粒子径が３０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子。