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JP7704336B2 - 角層の総タンパク量推定方法 - Google Patents
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Description

本発明は、角層の総タンパク量の推定方法に関する。
角層細胞の特定タンパク量や特定遺伝子発現量等に基づいて肌状態等を評価する方法が知られている。ここで、これらのタンパク量や遺伝子発現量は、試料の量に依存するため、例えば、試料中の総タンパク量に対する割合が評価に用いられている。例えば、本出願人は、特許文献1において、皮膚角層における、総タンパク量で補正した単位タンパク量あたりのNGAL発現量に基づいて皮膚粘弾性を評価する方法を提案している。また、皮膚の水分量が少ないほど、採取される総タンパク量が多くなるため、生理的指標としても用いることができる。
ここで、採取した角層細胞の総タンパク量の測定は、一般的にBCAタンパク質アッセイが用いられるが、測定には手間がかかり、簡便な総タンパク量の推定方法が求められている。
特開2016-114591号公報
本発明は、角層の総タンパク量を推定する推定方法を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、角層の観察画像から得られる角層構造を指標として、角層の総タンパク量を推定できることを見出してなされたものである。
具体的には、本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
1.角層画像の細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上を特定し、
細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値からなる群から選択される1以上を数値化し、
この数値化した値を指標として角層の総タンパク量を推定する、角層の総タンパク量推定方法。
2.前記細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上が、予め複数枚の学習用角層画像と各学習用角層画像における目視評価による細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上とを機械学習させた機械学習モデルを用いて特定される、1.に記載の角層の総タンパク量推定方法。
本発明の総タンパク量推定方法は、角層構造から得られる数値を指標とするものであり、非常に容易に、かつ精度良く、角層の総タンパク量を推定することができる。本発明の推定方法で推定された総タンパク量の値は、角層細胞における特定タンパク量や特定遺伝子の発現量等に基づいて肌状態を評価する際に、測定値を補正するために用いることができる。また、本発明の推定方法で推定された総タンパク量の値を、肌状態等を評価する指標として用いることができる。
本発明は、角層画像の細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上を特定し、
細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値からなる群から選択される1以上を数値化し、
この数値化した値を指標として角層の総タンパク量を推定する、角層の総タンパク量推定方法に関する。
画像を得るための角層の採取方法は、バイオプシー、テープストリッピング法のいずれであってもよいが、被験者の負担が少ないため、テープストリッピング法が好ましい。テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を回収する方法である。
テープストリッピング法で採取した角層細胞は、透過光観察(微分干渉法、位相差法、暗視野観察法などを含む)または反射光により撮像し、細胞の形態を観察する。角層細胞は、無染色の状態で観察することが好ましいが、必要に応じて染色することもできる。
細胞の観察は、細胞観察が可能な顕微鏡を用いて行うことができ、例えば、キーエンス株式会社製のデジタルマイクロスコープVHX-500、AnMo Electronics Corporation社製のデジタルマイクロスコープコープDino-Lite等を用いることができる。
観察条件は、細胞の詳細が確認できるものであれば制限されないが、例えば、1.0μm/pixel以上の解像度で約20万画素以上の条件等が挙げられる。
撮像した角層画像を、画像処理システムを用いて画像処理し、細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上を特定する。そして、この特定した細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域に基づいて、細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値からなる群から選択される1以上を数値化する。具体的には、細胞領域から細胞領域面積、重層剥離領域から重層剥離面積、細胞領域と重層剥離領域とから重層剥離率、1細胞領域から1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値を数値化することができる。角層画像は、カラー画像を用いてもよく、画像処理によりグレースケールにした画像を用いてもよく、両方を用いることもできる。
細胞領域面積とは、角層画像中の角層細胞領域の面積の総和である。
重層剥離面積とは、角層が2層以上重なって剥離した面積である。
重層剥離率とは、「細胞領域面積」に対する「重層剥離面積」の割合(重層剥離面積/細胞領域面積)である。
1細胞輝度平均値とは、角層画像内の個々の角層細胞の細胞領域内の平均輝度値を全細胞で平均した値である。
1細胞輝度標準偏差とは、角層画像内の個々の角層細胞の細胞領域内の輝度値標準偏差を全細胞で平均した値である。
1細胞輝度中央値とは、角層画像内の個々の角層細胞の細胞領域内の輝度値中央値を全細胞で平均した値である。
1細胞輝度最小値とは、角層画像内の個々の角層細胞の細胞領域内の輝度の最小値を全細胞で平均した値である。
輝度値の範囲は、8~16bit(RGB)が一般的であるが、その他の範囲でも構わない。
以下、細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値からなる群から選択される1以上を数値化したものを角層パラメータ値ともいう。
画像処理システムによる数値化は、公知の画像処理システムを用いて行うことができ、例えば、上記したデジタルマイクロスコープに付属の画像処理ソフトウェアや、市販の画像処理ソフトウェア等を用いることができる。また、予め複数枚の学習用角層画像と、各学習用角層画像における、目視評価による細胞領域(細胞が存在している領域)、目視評価による重層剥離領域(角層が2層以上重なって剥離した領域)、目視評価による1細胞領域(1つ1つの細胞の領域)の1以上を機械学習させた機械学習モデルを備える画像処理システムを用いることもできる。この機械学習モデルに数値化したい角層画像を入力し、この角層画像の細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上を出力し、機械学習モデルが出力した細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上に基づいて角層パラメータ値(細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値)を算出することで、目視評価に基づく角層パラメータ値と同等の角層パラメータ値を迅速に算出することができる。さらに、機械学習モデルを備える画像処理システムが出力した角層領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上を、人が目視で修正して角層パラメータ値を求めることもできる。
この数値化した角層パラメータ値を指標として角層の総タンパク量を推定する方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、角層パラメータ値を単回帰分析してもよく、重回帰分析してもよい。重回帰分析は、線形重回帰分析でもよく非線形重回帰分析でもよい。また、細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値以外の他のパラメータを重回帰分析の説明変数に含めてもよい。
<機械学習用サンプル>
女性412名(18~87才、平均46.8才)について、テープストリッピング法により、顔から角層細胞を採取した。
採取した角層細胞は、無染色の状態で、デジタルマイクロスコープ(キーエンス株式会社、VHX-5000)を用いて、8bit(RGBカラー)、0.41μm/pixelの解像度、1600x1200pixelの画素数で、透過光による撮影を行った。撮影は各サンプル2~3視野ずつ撮影を行い機械学習として用いた。
画像アノテーション用ソフトウェア Labelmeを用いて、細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域を目視により特定し、学習用角層画像を得た。
各学習用角層画像と、目視評価による細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域を機械学習させ、細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域を出力可能な機械学習モデルを得た。
<サンプル>
女性227名(28~87才、平均47.2才)について、テープストリッピング法により、顔から角層細胞を採取した。一人当たり、3~5枚のサンプルを採取し、合計966枚のサンプル画像を得た。
試料調製方法は、機械学習用サンプルと同じである。
サンプル画像を、機械学習モデルを備えた画像処理装置により解析し、各サンプル画像の細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値を数値化し、角層パラメータ値を求めた。
さらに、1細胞面積、1細胞周囲長、真円度、1細胞に外接する長方形面積、1細胞に外接する長方形の長短辺比、近似する4-6角形、1細胞輝度最大値についても数値化し、角層パラメータ値を求めた。
1細胞面積とは、角層画像内の個々の角層細胞の面積を全細胞で平均した値である。
1細胞周囲長とは、角層画像内の個々の角層細胞の周囲長を全細胞で平均した値である。
真円度とは、角層画像内の個々の角層細胞の領域の正円度合い(4π×(面積)/(周長の2乗)により算出される。)を全細胞で平均した値である。
1細胞に外接する長方形面積とは、角層画像内の個々の角層細胞全体を覆う最小面積の長方形の面積を全細胞で平均した値である。
1細胞に外接する長方形の長短辺比とは、角層画像内の個々の角層細胞全体を覆う最小面積の長方形の長辺と短辺の比(長辺/短辺)を全細胞で平均した値である。
近似する4-6角形とは、個々の角層細胞形状の重心を中心として、角層細胞領域内に正4~6角形を配置し、正4~6角形からはみ出した領域の面積が最小となるように角度と大きさを調整し、はみ出した領域の面積が最小となった際の、はみ出した領域の面積を角層細胞面積で割り返し、正n角形(nは4~6)の中でこの値が最小となるnを近似するn角形とし、角層画像内の個々の角層細胞のnを全細胞で平均した値である。
1細胞輝度最大値とは、角層画像内の個々の角層細胞の細胞領域内の輝度の最大値を全細胞で平均した値である。
なお、966枚のサンプルについて、目視評価による細胞領域と重層剥離領域を、それぞれ機械学習モデルを備えた画像処理装置により解析した細胞領域と重層剥離領域と比較した結果、目視評価による細胞領域面積/機械学習モデルを備えた画像処理装置により解析した細胞領域面積=95%、目視評価による重層剥離領域面積/機械学習モデルを備えた画像処理装置により解析した重層剥離領域面積=86%であり、目視評価による細胞領域、重層剥離領域と、機械学習モデルを備えた画像処理装置により解析した細胞領域、重層剥離領域は、同等であった。
<総タンパク量の測定>
画像撮像後のサンプルについて、BCAタンパク質アッセイ(BCA Protein Assay kit、Thermo fisher scientific社)により、総タンパク量を測定した。
「単回帰分析」
各角層パラメータ値(細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値)と、総タンパク量とを単回帰分析した。相関係数r、p値、単回帰直線の式(Y=aX+b、Xが各角層パラメータ値、Yが総タンパク量)を表1に示す。
本発明の角層パラメータ値である細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値は、総タンパク量と相関(|r|≧0.2)を有していた。
また、同様にして単回帰分析したところ、本発明の角層パラメータ値ではない1細胞面積、1細胞周囲長、真円度、1細胞に外接する長方形面積、1細胞に外接する長方形の長短辺比、近似する4-6角形、1細胞輝度最大値は、いずれも総タンパク量と相関が認められなかった(|r|がいずれも0.15未満)。
「重回帰分析」
総タンパク量との相関が認められた本発明の7個の角層パラメータ値を説明変数として、重回帰分析した。重回帰直線の式(Y=a+a+・・・+a+b、Xnが各角層パラメータ値、Yが総タンパク量)を表2に示す。
相関係数|r|は0.616、p値<0.0001であり、重回帰分析により高い相関が認められた。
さらに、総タンパク量との相関が認めらなかった7個の角層パラメータを含めた14個の角層パラメータ値を説明変数として、重回帰分析した。重回帰直線の式(Y=a+a+・・・+a1414+b、Xnが各角層パラメータ値、Yが総タンパク量)を表3に示す。
相関係数|r|は0.632、p値<0.0001であり、本発明の角層パラメータ値と他のパラメータ値を組み合わせることにより、高い相関が認められた。

Claims (2)

  1. 角層画像の細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域を特定し、
    この特定した角層画像の細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域に基づいて、細胞領域面積、重層剥離面積、重層剥離率、1細胞輝度平均値、1細胞輝度標準偏差、1細胞輝度中央値、1細胞輝度最小値からなる群から選択され、少なくとも1細胞輝度最小値を含む角層パラメータ値を数値化し、
    前記角層パラメータ値を指標として単回帰分析または重回帰分析を行うことにより、角層の総タンパク量の多寡を推定する、角層の総タンパク量推定方法。
  2. 前記細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上が、予め複数枚の学習用角層画像と各学習用角層画像における目視評価による細胞領域、重層剥離領域、1細胞領域の1以上とを機械学習させた機械学習モデルを用いて特定される、請求項1に記載の角層の総タンパク量推定方法。
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