JP7704442B2 - 標的核酸の非対称増幅方法 - Google Patents

Description

本出願は、核酸分子の多重非対称増幅に関する。特に、本出願は、試料中の１つ以上の標的核酸を同時に非対称的に増幅する方法を提供し、この方法は、試料中に存在する複数の標的核酸を同時に非対称的に増幅することができ、同時に多量の一本鎖生成物を生成することができる。

非対称ＰＣＲは、非特許文献１によって最初に記載され、等しくない量のプライマー対を使用して大量の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成する方法を指す。非対称ＰＣＲによって生成された一本鎖ＤＮＡを、シーケンシングに使用し、プローブとして、又はリアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ検出、及びプローブ融解曲線分析における検出シグナルを改善するために使用することができる。しかしながら、従来の非対称ＰＣＲでは、特定の一本鎖生成物の生成を最大化し、非特異的増幅を最小限に抑えるために、慎重な最適化が必要になることがよくある。複数の標的核酸配列を同時に非対称に増幅する必要がある場合、プライマー対の増加はプライマーダイマー等の非特異的増幅の増加につながり、設計及び最適化の難しさを更に高める。

従来の非対称ＰＣＲ増幅では、制限プライマー濃度の低下により、その融点はＰＣＲ反応のアニーリング温度よりも低くなり、その結果、非対称ＰＣＲ増幅が非効率的になる。これに応えて、非特許文献２は、プライマーを設計する際に、実際のプライマー濃度をプライマー融点（Ｔ_ｍ）値に影響を与える要因として使用し、また、低濃度の制限プライマーのＴ_ｍが増加し、アニーリング温度よりも高くなることが予想され、これにより、非対称ＰＣＲの増幅効率が向上して大量の一本鎖生成物が生成される、ＬＡＴＥ－ＰＣＲ（指数関数後比例ＰＣＲ：Linear-After-The-Exponential-PCR）を提案した。この方法は、非対称ＰＣＲの増幅効率が低いという問題を解決し、非対称ＰＣＲの最適化を容易にする。しかしながら、この方法では、プライマー対の増加によって引き起こされる非特異的増幅が増加するという問題を解決できないため、多重非対称ＰＣＲ増幅を達成することは依然として困難である。

非特許文献３はホモタグアシスト非ダイマーシステム（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System）（ＨＡＮＤシステム）を記載する。このシステムでは、同じタグ配列が標的特異的な上流及び下流の両方のプライマーの５’末端に付加されてテイル化（tailed）／タグ付き標的特異的プライマーを形成する。ＰＣＲ増幅では、最初のＰＣＲ増幅は、まず、より低いアニーリング温度で低濃度のテイル化／タグ付き特異的プライマーによって開始され、数サイクル後、高いアニーリング温度で、高濃度のユニバーサルプライマーを使用して、最初のＰＣＲ増幅の増幅産物の後続する増幅を行う。特異的プライマーは全て同じタグ配列を含んでいるため、最初のＰＣＲ増幅によって生成される全ての生成物（プライマーダイマーを含む）は、末端に相補的なタグ配列を持つ。局所濃度が高いため、プライマーダイマー等の小さなフラグメント生成物の一本鎖は自己アニーリングを起こしやすく、安定した「パンハンドル（pan-handle）」構造を形成し、ユニバーサルプライマーの更なるアニーリングを防ぎ、それによってプライマーダイマーの増幅を阻害する。低濃度の相同的にタグ付けされた標的特異的プライマーと高濃度のユニバーサルプライマーの使用を組み合わせることにより、ＨＡＮＤシステムはプライマーダイマーの増幅を効果的に抑制し、効率的な多重ＰＣＲ増幅を達成し、高い増幅効率及び検出感度を維持することができる。しかしながら、ＨＡＮＤシステムを使用したＰＣＲ増幅は対称増幅であり、一本鎖生成物を生成できないため、遺伝子チップ及びプローブ融解曲線分析の技術分野でのＨＡＮＤシステムの適用が制限される。

Gyllensten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:7652-7656) Sanchez et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:1933-1938) Brownie et al. (Nucleic Acids Research 1997, 26:3235-3241)

したがって、複数の標的核酸の同時の増幅及び検出の臨床上の要件を満たすため、効率的な多重ＰＣＲ増幅と非対称ＰＣＲ増幅を同時に実現することができる、複数の標的核酸を同時に非対称に増幅可能な新たな方法を開発する必要がある。

本出願では、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される核酸化学実験室の操作工程は全て、対応する分野で広く使用されている日常的な工程である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に示す。

本明細書で使用される場合、「標的核酸配列」、「標的核酸」及び「標的配列」という用語は、検出される標的核酸又はその配列を指す。本出願では、「標的核酸配列」、「標的核酸」及び「標的配列」という用語は同じ意味を持ち、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「標的核酸特異的配列」及び「標的特異的配列」という用語は、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅が可能な条件下で、標的核酸に選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニーリングすることができる配列を指し、標的核酸配列に対する相補配列を含む。本出願では、「標的核酸特異的配列」及び「標的特異的配列」という用語は同じ意味を持ち、互換的に使用される。標的核酸特異的配列又は標的特異的配列は、標的核酸に特異的であることが容易に理解できる。言い換えれば、標的核酸特異的配列又は標的特異的配列は、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング、又は増幅が可能な条件下では、特定の標的核酸に対してのみハイブリダイズ又はアニーリングが可能であり、他の核酸配列にはハイブリダイズ又はアニーリングすることができない。例えば、本出願において、「標的核酸特異的フォワードヌクレオチド配列」は、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅が可能な条件下で、標的核酸に選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニーリングすることができるフォワード核酸を指し、標的核酸と相補的な配列を含む。

本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つの核酸配列が塩基対合の原理（ワトソン－クリックの原理）に従って互いに水素結合を形成し、それによってデュプレックスを形成できることを意味する。本出願において、「相補的」という用語は、「実質的に相補的」及び「完全に相補的」を含む。本明細書で使用される場合、「完全に相補的」という用語は、１つの核酸配列中の全ての塩基が、ミスマッチ又はギャップを伴わずに別の核酸鎖の塩基と対になることができることを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、１つの核酸配列中の塩基の大部分が別の核酸鎖の塩基と対になることができることを意味し、ミスマッチ又はギャップ（例えば、１つ以上のヌクレオチドのミスマッチ又はギャップ）の存在が許容される。典型的には、「相補的」（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）である２つの核酸配列は、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅が可能な条件下で選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニーリングし、デュプレックスを形成する。したがって、「非相補的」という用語は、２つの核酸配列が、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング、又は増幅によってデュプレックスを形成できる条件下でハイブリダイズ又はアニーリングできないことを意味する。本明細書で使用される場合、「完全に相補的ではない」という用語は、或る核酸配列の塩基が別の核酸鎖の塩基と完全に対になることができず、少なくとも１つのミスマッチ又はギャップが存在することを意味する。

本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、ＤＮＡ分子中の或る特定のヌクレオチドが別のヌクレオチドによって置換されることを意味する。一般に、置換は転移及び転換の２つのカテゴリに分けることができ、転移は、１つのプリンヌクレオチドの別のプリンヌクレオチドへの置換、又は１つのピリミジンヌクレオチドの別のピリミジンヌクレオチドへの置換（例えば、ＡのＧによる置換、ＧのＡによる置換、ＣのＴによる置換、ＴのＣによる置換）を指し、転換は、プリンヌクレオチドのピリミジンヌクレオチドへの置換、又はピリミジンヌクレオチドのプリンヌクレオチドへの置換（例えば、ＡのＴ又はＣによる置換、ＧのＴ又はＣによる置換、ＴのＡ又はＧによる置換、ＣのＡ又はＧによる置換）を指す。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」及び「アニーリング」という用語は、相補的な一本鎖核酸分子が二本鎖核酸を形成するプロセスを指す。本出願では、「ハイブリダイゼーション」と「アニーリング」は同じ意味を持ち、互換的に使用される。典型的には、完全に相補的又は実質的に相補的な２つの核酸配列は、ハイブリダイズ又はアニーリングすることができる。２つの核酸配列のハイブリダイゼーション又はアニーリングに必要な相補性は、使用されるハイブリダイゼーション条件、特に温度に依存する。

本明細書で使用される場合、「核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件」は、当業者によって一般に理解される意味を有し、従来の方法によって決定することができる。例えば、相補配列を有する２つの核酸分子は、適切なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。かかるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションバッファーの温度、ｐＨ、組成、及びイオン強度等の要因を含み得、相補的である２つの核酸分子の長さ及びＧＣ含有量に基づいて決定され得る。例えば、２つの相補的な核酸分子の長さが比較的短い場合、及び／又はＧＣ含有量が比較的低い場合、低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件を使用することができる。２つの相補的な核酸分子の長さが比較的長い場合、及び／又はＧＣ含有量が比較的高い場合、高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件を使用することができる。かかるハイブリダイゼーション条件は、当業者には既知であり、例えば、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)、及びMLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. NY (1999)に見られる。本出願では、「ハイブリダイゼーション」と「アニーリング」は同じ意味を持ち、互換的に使用される。したがって、「核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件」と「核酸アニーリングが可能な条件」という表現も同じ意味を持ち、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「核酸増幅が可能な状態」という表現は、当業者によって一般に理解される意味を有し、これは、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が、１つの核酸鎖をテンプレートとして使用して、別の核酸鎖を合成し、デュプレックスを形成することができる条件を指す。かかる条件は、当業者には既知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションバッファーの温度、ｐＨ、組成、濃度及びイオン強度等の要因に関連している可能性がある。適切な核酸増幅条件は、日常的な方法で決定することができる（例えば、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照されたい）。本発明の方法において、「核酸増幅が可能な条件」は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の作用条件であることが好ましい。

本明細書で使用される場合、「核酸ポリメラーゼが伸長反応を行うことができる条件」という表現は、当業者によって一般に理解される意味を有し、これは、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）がテンプレートとして核酸鎖を使用して、別の核酸鎖（プライマー又はプローブ等）を伸長し、デュプレックスを形成することができる条件を指す。かかる条件は、当業者には既知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションバッファーの温度、ｐＨ、組成、濃度、及びイオン強度等の要因に関連している可能性がある。適切な核酸増幅条件は、日常的な方法で決定することができる（例えば、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照されたい）。本発明の方法において、「核酸ポリメラーゼが伸長反応を行うことができる条件」は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の作用条件であることが好ましい。本出願では、「核酸ポリメラーゼが伸長反応を行うことができる条件」と「核酸伸長が可能な条件」という表現は同じ意味を持ち、互換的に用いられる。

様々な酵素の作用条件は、当業者が日常的な方法で決定することができ、一般に、温度、緩衝液のｐＨ、組成、濃度、イオン強度等の要因を含み得る。或いは、酵素の製造元が推奨する条件を使用することもできる。

本明細書で使用される場合、「核酸変性」という用語は、当業者によって一般に理解される意味を有し、二本鎖核酸分子が一本鎖に解離するプロセスを指す。「核酸変性が可能な条件」という表現は、二本鎖核酸分子が一本鎖に解離する条件を指す。かかる条件は、従来法によって当業者が決定することができる（例えば、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照されたい）。例えば、核酸は、加熱、アルカリ処理、尿素処理、酵素法（例えば、ヘリカーゼを使用する方法）等の従来の技術によって変性させることができる。本出願では、核酸は、好ましくは加熱下で変性される。例えば、核酸を８０℃～１０５℃に加熱することにより変性することができる。

本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ反応」という用語は、当業者によって一般的に理解される意味を持ち、核酸ポリメラーゼとプライマーを用いて標的核酸を増幅する反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を指す。本明細書で使用される場合、「多重増幅」という用語は、同じ反応システムにおける複数の標的核酸の増幅を指す。本明細書で使用される場合、「非対称増幅」という用語は、標的核酸を増幅して得られる増幅産物において、相補的な２つの核酸鎖の量が異なり、一方の核酸鎖の量が他方の核酸鎖の量よりも多いことを指す。

本明細書で使用され、当業者によって一般に理解されるように、「フォワード」及び「リバース」という用語は、プライマー対の２つのプライマーを記述及び区別する際に便宜上使用されるにすぎず、それらは相対的であり、特別な意味を持たない。

本明細書で使用される場合、「蛍光プローブ」という用語は、蛍光基を有し、蛍光シグナルを生成することができるオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書で使用される場合、「融解曲線分析」という用語は、当業者によって一般に理解される意味を有し、二本鎖核酸分子の融解曲線を決定することによって二本鎖核酸分子の存在又は同一性を分析する方法を指し、これは、加熱中の二本鎖核酸分子の解離特性を評定するために一般的に使用される。融解曲線分析を行う方法は、当業者には既知である（例えば、The Journal of Molecular Diagnostics 2009, 11(2):93-101を参照されたい）。本出願では、「融解曲線分析」と「融解分析」という用語は同じ意味を持ち、互換的に使用される。

本出願の或る特定の好ましい実施の形態において、融解曲線分析は、レポーター基及びクエンチャー基で標識された検出プローブを使用して実施することができる。簡潔には、周囲温度では、検出プローブは塩基対合を介してその相補配列とデュプレックスを形成することができる。この場合、検出プローブ上のレポーター基（フルオロフォア等）とクエンチャー基は互いに分離されており、クエンチャー基はレポーター基からのシグナル（例えば、蛍光シグナル）を吸収することができず、この時点で、最も強いシグナル（例えば、蛍光シグナル）が検出され得る。温度が上昇すると、デュプレックスの２つの鎖が解離し始め（すなわち、検出プローブはその相補配列から徐々に解離する）、解離した検出プローブは一本鎖のフリーコイル（free coil）状態で存在する。この場合、解離した検出プローブ上のレポーター基（例えば、フルオロフォア）とクエンチャー基は互いに近接しており、これによりレポーター基（例えば、フルオロフォア）によって放出されるシグナル（例えば、蛍光シグナル）は、クエンチャー基によって吸収される。したがって、温度が上昇するにつれて、検出されるシグナル（例えば、蛍光シグナル）は徐々に弱くなる。デュプレックスの２つの鎖が完全に解離すると、全ての検出プローブは一本鎖のフリーコイル状態になる。この場合、検出プローブ上のレポーター基（例えば、フルオロフォア）によって放出される全てのシグナル（例えば、蛍光シグナル）は、クエンチャー基によって吸収される。したがって、レポーター基（例えば、フルオロフォア）によって放出されるシグナル（例えば、蛍光シグナル）は、本質的に検出不可能である。したがって、加熱又は冷却のプロセス中に検出プローブを含有するデュプレックスによって放出されるシグナル（例えば、蛍光シグナル）を検出することにより、検出プローブとその相補配列とのハイブリダイゼーション及び解離プロセスを観察することができ、シグナル強度が温度に伴って変化する際に曲線が形成される。さらに、得られた曲線の導出分析により、シグナル強度の変化率を縦座として、温度を横座とする曲線（つまり、デュプレックスの融解曲線）を得ることができる。融解曲線のピークは融解ピークであり、対応する温度はデュプレックスの融点（Ｔ_ｍ）である。一般に、検出プローブと相補配列との一致度が高いほど（例えば、ミスマッチの塩基が少なく、対合した塩基が多いほど）、デュプレックスのＴ_ｍが高くなる。したがって、デュプレックスのＴ_ｍを検出することにより、デュプレックス内の検出プローブに対する相補配列の存在と同一性を判断することができる。本明細書で使用される場合、「融解ピーク」、「融点」、及び「Ｔ_ｍ」という用語は同じ意味を持ち、互換的に使用される。

増幅方法
一態様において、本発明は、試料中の１つ以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（１）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸に対して標的特異的プライマー対を提供する工程であって、
ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、
標的特異的プライマー対が標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、フォワードプライマーが第２のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、フォワードヌクレオチド配列が第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、リバースプライマーが第１のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、リバースヌクレオチド配列が第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、
核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、第１のユニバーサル配列が第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることができ、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドが独立して欠失又は置換されていることを含み、第１のユニバーサル配列がフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない工程と、
（２）核酸増幅が可能な条件下で、ユニバーサルプライマー及び標的特異的プライマー対を使用して、ＰＣＲ反応を介して試料中の標的核酸を増幅する工程と、
を含む、方法を提供する。

本発明の方法において、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ、標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列及びリバースヌクレオチド配列を含み、これにより、ＰＣＲ反応中に、標的特異的プライマー対（フォワードプライマー及びリバースプライマー）が標的核酸にアニーリングしてＰＣＲ増幅を開始し、その結果、フォワードプライマー及びリバースプライマーにそれぞれ相補的な２つの核酸鎖（核酸鎖Ａ及び核酸鎖Ｂ）を含む初期増幅産物が得られる。

さらに、リバースプライマーとユニバーサルプライマーの両方が第１のユニバーサル配列を含むため、リバースプライマーに相補的な核酸鎖Ｂをユニバーサルプライマーに相補的にすることもできる。したがって、ＰＣＲ反応の間、ユニバーサルプライマーは核酸鎖Ｂにアニーリングし、通常はＰＣＲ増幅を開始することができる（すなわち、通常、核酸鎖Ｂの相補鎖を合成する）。同時に、第１のユニバーサル配列は核酸ハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることができるため、ＰＣＲ反応中、ユニバーサルプライマー（第１のユニバーサル配列を含む）は、フォワードプライマー（第２のユニバーサル配列を含む）に相補的な核酸鎖Ａにもアニーリングすることができる。しかしながら、第２のユニバーサル配列が第１のユニバーサル配列と異なるため（この場合、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換される）、ユニバーサルプライマー（特にそれらの３’末端）は核酸鎖Ａと完全に相補的ではなく、ユニバーサルプライマーによる核酸鎖ＡのＰＣＲ増幅の阻害をもたらす（すなわち、核酸鎖Ａの相補鎖の合成が阻害される）。

したがって、ＰＣＲ反応が進行するにつれて、ユニバーサルプライマーがそれぞれ初期増幅産物の核酸鎖Ａ及び核酸鎖Ｂにアニーリングし、更にＰＣＲ増幅を開始し、核酸鎖Ｂの相補鎖の合成が正常に進行する一方で、核酸鎖Ａの相補鎖の合成が阻害される。したがって、ＰＣＲ増幅が進むにつれて、核酸鎖Ａの相補鎖（核酸鎖Ｂ）の合成効率は、核酸鎖Ｂの相補鎖（核酸鎖Ａ）の合成効率よりも顕著に低くなり、その結果、核酸鎖Ｂの相補鎖（核酸鎖Ａ）が大量に合成されて増幅されるが、核酸鎖Ａの相補鎖（核酸鎖Ｂ）の合成及び増幅が阻害され、大量の一本鎖生成物（フォワードプライマー／第２のユニバーサルプライマー配列に相補的な配列、及びリバースプライマー／ユニバーサルプライマーの配列を含む核酸鎖Ａ）が生じ、これにより、標的核酸の非対称増幅を可能にする。したがって、或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、試料中の１つ以上の標的核酸の非対称増幅が可能である。

さらに、リバースプライマーにおける第１のユニバーサル配列は、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、フォワードプライマーにおける第２のユニバーサル配列の相補配列とハイブリダイズ又はアニーリングすることができるため、ＰＣＲ反応の間、フォワードプライマー及びリバースプライマーの非特異的増幅により形成されたプライマーダイマーは、変性後に、その５’末端及び３’末端が相補的であり、互いにアニーリングすることができる一本鎖核酸を生成し、該一本鎖核酸は、アニーリング段階の間に自己アニーリングを起こして安定したパンハンドル構造を形成しやすく、ユニバーサルプライマーがアニーリングし、一本鎖核酸を伸長させるのを防ぎ、それによってプライマーダイマーの更なる増幅を阻害する。したがって、本発明の方法では、プライマーダイマーの非特異的増幅を効果的に抑制することができる。したがって、本発明の方法は、例えば、本発明の方法では、ユニバーサルプライマーは、１つ以上の標的核酸の多重増幅を達成するため、１つ以上の標的特異的プライマー対と組み合わせて使用することができる。

したがって、或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的核酸、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、又はそれ以上の標的核酸を同時に増幅することができる。或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的核酸を同時に非対称的に増幅することができる。かかる実施の形態において、したがって、増幅される各標的核酸について、工程（１）において１つの標的特異的プライマー対が提供される。したがって、かかる実施の形態においては、工程（１）において、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的特異的プライマー対、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、又はそれ以上の標的特異的プライマー対が提供される。

異なる標的核酸に対して、異なるフォワードプライマーとリバースプライマーを使用できることは容易に理解できる。しかしながら、異なる標的核酸間に配列の類似性がある場合、異なる標的特異的プライマー対が同じフォワードプライマー又はリバースプライマーを有することがある。

多重非対称増幅を容易にし、プライマーダイマーの非特異的増幅を効果的に抑制するために、幾つかの好ましい実施の形態においては、ユニバーサルプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの作用濃度よりも高い作用濃度を有する。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの作用濃度よりも少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１８倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍又はそれ以上高い作用濃度を有する。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの作用濃度よりも１倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～５０倍又はそれ以上高い作用濃度を有する。

本発明の方法において、フォワードプライマーとリバースプライマーの作用濃度は、同一であっても異なっていてもよい。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーとリバースプライマーの作用濃度は同じである。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーとリバースプライマーの作用濃度は異なる。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーの作用濃度は、リバースプライマーの作用濃度よりも低い。

或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマーは、第１のユニバーサル配列からなる。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマーは、第１のユニバーサル配列の５’末端に位置する追加配列を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態において、追加配列は、１つ以上のヌクレオチド、例えば１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。本出願では、ユニバーサルプライマーはＰＣＲ増幅に使用されるため、好ましくは、第１のユニバーサル配列は、ユニバーサルプライマーの３’部分に位置するか、又はユニバーサルプライマーの３’部分を構成する。

本出願の実施の形態において、ユニバーサルプライマーは、ＰＣＲ反応を行うことができる限り、任意の長さであってもよい。例えば、ユニバーサルプライマーは、５ｎｔ～５０ｎｔ、例えば、５ｎｔ～１５ｎｔ、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、又は４０ｎｔ～５０ｎｔの長さであり得る。

本出願の或る特定の実施の形態において、ユニバーサルプライマー（又はその任意の成分）が、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含み得るか、又はそれらからなり得る。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマー（又はその任意の成分）は、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか、又は天然ヌクレオチドからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマー（又はその任意の成分）は、修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン又は５－ヒドロキシメチルシトシン等の修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。或る特定の好ましい実施の形態において、ユニバーサルプライマー（又はその任意の成分）は、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１－（２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－３－ニトロピロール、５－ニトロインドール又はロック核酸（ＬＮＡ）等の非天然ヌクレオチドを含む。本出願の或る特定の実施の形態においては、工程（１）において、少なくとも１つの標的特異的プライマー対、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、又はそれ以上の標的特異的プライマー対が提供される。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（１）において、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的特異的プライマー対が提供される。或る特定の好ましい実施の形態において、上記方法は１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的核酸を同時に増幅することができる。或る特定の好ましい実施の形態において、上記方法は１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的核酸を同時に非対称に増幅することができる。

例えば、或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、試料中の２つの標的核酸を増幅するために使用することができ、工程（１）において、ユニバーサルプライマー、第１の標的特異的プライマー対、及び第２の標的特異的プライマー対が提供され、ユニバーサルプライマーは、上記で定義した通りであり、第１の標的特異的プライマー対は、第１の標的核酸を増幅することができる第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーを含み、第２の標的特異的プライマー対は、第２の標的核酸を増幅することができる第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、第１のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー、第２のフォワードプライマー、及び第２のリバースプライマーは、上記で定義した通りである。同様に、或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、試料中の３つ以上の標的核酸を増幅するために使用することができ、工程（１）において、ユニバーサルプライマー、及び３個以上の標的核酸を増幅することができる３個以上の標的特異的プライマー対が提供される。

或る特定の好ましい実施の形態においては、フォワードプライマーにおいて、フォワードヌクレオチド配列は、第２のユニバーサル配列の３’末端に直接連結される。或る特定の好ましい実施の形態においては、フォワードプライマーにおいて、フォワードヌクレオチド配列は、ヌクレオチドリンカーによって第２のユニバーサル配列の３’末端に連結される。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーは、５’から３’に、第２のユニバーサル配列及びフォワードヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーは、５’から３’に、第２のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、ヌクレオチドリンカーは、１つ以上のヌクレオチド、例えば１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。

或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列の５’末端に位置する追加配列を更に含む。したがって、或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーは、５’から３’に、追加配列と、第２のユニバーサル配列と、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマーは、５’から３’に、追加配列と、第２のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、追加配列は、１つ以上のヌクレオチド、例えば１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。

本出願において、フォワードプライマーは、標的核酸のＰＣＲ増幅に使用されるため、好ましくは、フォワードヌクレオチド配列は、フォワードプライマーの３’部分に位置するか、又はフォワードプライマーの３’部分を構成する。

本出願の実施の形態において、フォワードヌクレオチド配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズし、標的核酸を増幅することができる限り、その長さによって制限されない。例えば、フォワードヌクレオチド配列は、１０ｎｔ～１００ｎｔ、例えば１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有することができる。

本出願の実施の形態において、フォワードプライマーは、上記で定義された条件を満たす限り、その長さによって制限されない。例えば、フォワードプライマーは、１５ｎｔ～１５０ｎｔ、例えば、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～１１０ｎｔ、１１０ｎｔ～１２０ｎｔ、１２０ｎｔ～１３０ｎｔ、１３０ｎｔ～１４０ｎｔ、１４０ｎｔ～１５０ｎｔの長さを有することができる。

本出願の或る特定の実施の形態において、フォワードプライマー（又はその任意の成分）が、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含み得るか、又はそれらからなり得る。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマー（又はその任意の成分）は、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか、又は天然ヌクレオチドからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマー（又はその任意の成分）は、修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン又は５－ヒドロキシメチルシトシン等の修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。或る特定の好ましい実施の形態において、フォワードプライマー（又はその任意の成分）は、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１－（２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－３－ニトロピロール、５－ニトロインドール又はロック核酸（ＬＮＡ）等の非天然ヌクレオチドを含む。

或る特定の好ましい実施の形態においては、リバースプライマーにおいて、リバースヌクレオチド配列は、第１のユニバーサル配列の３’末端に直接連結される。或る特定の好ましい実施の形態においては、リバースプライマーにおいて、リバースヌクレオチド配列は、ヌクレオチドリンカーによって第１のユニバーサル配列の３’末端に連結される。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマーは、５’から３’に、第１のユニバーサル配列及びリバースヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマーは、５’から３’に、第１のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、リバースヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、ヌクレオチドリンカーは、１つ以上のヌクレオチド、例えば１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。

或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマーは、第１のユニバーサル配列の５’末端に位置する追加配列を更に含む。したがって、或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマーは、５’から３’に、追加配列と、第１のユニバーサル配列と、リバースヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマーは、５’から３’に、追加配列と、第１のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、リバースヌクレオチド配列とを含むか、又はそれらからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、追加配列は、１つ以上のヌクレオチド、例えば１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドを含む。

本出願において、リバースプライマーは、標的核酸のＰＣＲ増幅に使用されるため、好ましくは、リバースヌクレオチド配列は、リバースプライマーの３’部分に位置するか、又はリバースプライマーの３’部分を構成する。

本出願の実施の形態において、リバースヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、標的核酸を増幅することができる限り、その長さによって制限されない。例えば、リバースヌクレオチド配列は、１０ｎｔ～１００ｎｔ、例えば１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有してもよい。

本出願の実施の形態において、リバースプライマーは、上記で定義された条件を満たす限り、その長さによって制限されない。例えば、リバースプライマーは、１５ｎｔ～１５０ｎｔ、例えば、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～１１０ｎｔ、１１０ｎｔ～１２０ｎｔ、１２０ｎｔ～１３０ｎｔ、１３０ｎｔ～１４０ｎｔ、１４０ｎｔ～１５０ｎｔの長さを有してもよい。

本出願の或る特定の実施の形態において、リバースプライマー（又はその任意の成分）が、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含み得るか、又はそれらからなり得る。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマー（又はその任意の成分）は、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか、又は天然ヌクレオチドからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマー（又はその任意の成分）は、修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン又は５－ヒドロキシメチルシトシン等の修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。或る特定の好ましい実施の形態において、リバースプライマー（又はその任意の成分）は、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１－（２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－３－ニトロピロール、５－ニトロインドール又はロック核酸（ＬＮＡ）等の非天然ヌクレオチドを含む。

本出願の実施の形態において、フォワードプライマーにおける第２のユニバーサル配列は、ユニバーサルプライマーにおける第１のユニバーサル配列とは相違し、その相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含む。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間の相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチド（例えば、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチド）がそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１個、２個、３個、４個、又は５個のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端の最後のヌクレオチドが欠失又は置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間の相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する最後の２つのヌクレオチドが欠失又は置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間の相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端の最後のヌクレオチドが欠失し、最後から２番目のヌクレオシドが置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間の相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端の最後のヌクレオチドが置換され、最後から２番目のヌクレオシドが欠失されていることを含むか、又はそこに相違がある。或る特定の好ましい実施の形態において、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する最後の３個、最後の４個又は最後の５個のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含むか、又はそこに相違がある。本出願において、置換は、転移又は転換であり得る。或る特定の好ましい実施の形態において、置換は転移である。或る特定の好ましい実施の形態において、置換は転換である。

本出願の実施の形態において、第１のユニバーサル配列は、フォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない。或る特定の好ましい実施の形態において、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する少なくとも１つのヌクレオチド、例えば、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のヌクレオチドは、フォワードプライマーの相補配列に相補的であってはならない。したがって、ＰＣＲ反応中、第１のユニバーサル配列／ユニバーサルプライマーが、フォワードプライマーに相補的な核酸鎖（核酸鎖Ａ）にアニーリングできたとしても、核酸鎖（核酸鎖Ａ）の相補鎖の伸長合成が依然として阻害される。

本発明の方法において、試料は、核酸を含む任意の試料であり得る。例えば、或る特定の好ましい実施の形態において、試料は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）を含むか、又はＤＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態において、試料はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むか、又はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態において、試料は、核酸の混合物（例えば、ＤＮＡの混合物、ＲＮＡの混合物、又はＤＮＡとＲＮＡの混合物）を含むか、又は核酸の混合物である。

本発明の方法において、増幅される標的核酸は、その配列の組成又は長さによって制限されない。例えば、標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）又はＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。さらに、増幅される標的核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。

試料又は標的核酸がｍＲＮＡである場合、好ましくは、本発明の方法を実施する前に、逆転写反応を行って、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを得る。逆転写反応の詳細な説明は、例えば、Joseph Sam-brook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)に見られる。

本発明の方法において、試料又は標的核酸は、限定されるものではないが、原核生物、真核生物（例えば、原生動物、寄生虫、真菌、酵母、植物、哺乳動物及びヒトを含む動物）、又はウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＥＢウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルス等）、又はウイロイドを含む任意の供給源から得ることができる。試料又は標的核酸は、ゲノム核酸、人工的に単離又は断片化された核酸、合成核酸等の任意の形態の核酸でもあり得る。

本発明の方法では、任意の核酸ポリメラーゼ（特にテンプレート依存性核酸ポリメラーゼ）を使用して、ＰＣＲ反応を実施することができる。或る特定の好ましい実施の形態において、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。或る特定の好ましい実施の形態において、核酸ポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、限定されるものではないが、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィレス（Thermus thermophiles）（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーミス・フラバス（Thermis flavus）、サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、サーマス・アントラニルダンニイ（Thermus antranildanii）、サーマス・カルドフルス（Thermus caldophllus）、サーマス・クリアロフィラス（Thermus chliarophilus）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・イグニテラエ（Thermus igniterrae）、サーマス・ラクテウス（Thermus lacteus）、サーマス・オシマイ（Thermus oshimai）、サーマス・ルバー（Thermus ruber）、サーマス・ルベンス（Thermus rubens）、サーマス・スコトドクタス（Thermus scotoductus）、サーマス・シルバヌス（Thermus silvanus）、サーマス・サーモフルス（Thermus thermophllus）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、サーモコッカス・バロッシ（Thermococcus barossi）、サーモコクト・ゴルゴナリウス（Thermococto gorgonarius）、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・マリティマ・サーモシフォ・アフリカヌス（Thermotoga maritima Thermosiphoafricanus）、パイロコッカス・ウォセイ（Pyrococcus woesei）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）、パイロディクティウム・オカルタム（Pyrodictium occultum）、アクイフェックス・パイロフィルス（Aquifexpyrophilus）及びアクイフェックス・エオリエウス（Aquifex aeolieus）等の様々な細菌種から得ることができる。特に、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであることが好ましい。

或る特定の好ましい実施の形態において、標的核酸は三段階のプロセスで増幅される。かかる実施の形態において、核酸増幅の各ラウンドは、第１の温度での核酸変性、第２の温度での核酸アニーリング、及び第３の温度での核酸伸長の３つの工程を必要とする。或る特定の好ましい実施の形態において、標的核酸は二段階のプロセスで増幅される。かかる実施の形態において、核酸増幅の各ラウンドは、第１の温度での核酸変性、並びに第２の温度での核酸のアニーリング及び伸長という２つの工程を必要とする。核酸変性、核酸アニーリング、及び核酸伸長に適した温度は、日常的な方法で当業者が容易に決定することができる（例えば、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)を参照されたい）。

或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法の工程（１）及び工程（２）は、以下の工程（ａ）～工程（ｆ）：
（ａ）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸についての標的特異的プライマー対を提供する工程であって、
ユニバーサルプライマー及び標的特異的プライマー対が、上に定義される通りである工程と、
（ｂ）試料をユニバーサルプライマー及び標的特異的プライマー対と、核酸ポリメラーゼ（例えば、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼ等、特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）と混合する工程と、
（ｃ）核酸変性が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｄ）核酸アニーリング又はハイブリダイゼーションが可能な条件下で、前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｅ）核酸伸長が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｆ）任意に、工程（ｃ）～工程（ｅ）を１回以上繰り返す工程と、
を含むプロトコルによって行うことができる。

かかる実施の形態においては、工程（ｃ）において、試料中の全ての核酸分子が解離して一本鎖状態になり、次いで、工程（ｄ）において、相補的な核酸分子（例えば、フォワードプライマーと標的核酸又はリバースプライマーの伸長生成物、リバースプライマーと標的核酸又はフォワードプライマーの伸長生成物、ユニバーサルプライマーと第１のユニバーサル配列の相補配列を含む増幅産物、ユニバーサルプライマーと第２のユニバーサル配列の相補配列を含む増幅産物）が、共にアニーリング又はハイブリダイズしてデュプレックスを形成し、次いで、工程（ｅ）において、核酸ポリメラーゼ（特にテンプレート依存性核酸ポリメラーゼ）が、相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマー／リバースプライマー及びユニバーサルプライマーを伸長する。このプロセスでは、上で述べたように、核酸ポリメラーゼは、核酸鎖Ｂをテンプレートとして用いることができ、通常はユニバーサルプライマーを伸長し、核酸鎖Ｂの相補鎖を合成することができる。しかしながら、ユニバーサルプライマー（特にその３’末端）は核酸鎖Ａと完全に相補的となり得ないため、核酸鎖Ａをテンプレートとして用いた核酸ポリメラーゼによるユニバーサルプライマーの伸長が阻害される（すなわち、核酸鎖Ａの相補鎖の合成が阻害される）。したがって、工程（ｃ）～工程（ｅ）のサイクルを経て、標的核酸配列の増幅（非対称増幅）が達成され、それにより本発明の方法の工程（１）及び工程（２）を完成することができる。

工程（ｃ）のインキュベーション時間及び温度は、従来法により、当業者が決定することができる。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｃ）において、工程（ｂ）の生成物を８０℃～１０５℃の温度（例えば、８０℃～８５℃、８５℃～９０℃、９０℃～９５℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃、１０１℃、１０２℃、１０３℃、１０４℃、又は１０５℃）でインキュベートし、それによって核酸の変性を可能にする。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｃ）において、工程（ｂ）の生成物を、１０秒～５分、例えば、１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、又は２分～５分インキュベートする。

工程（ｄ）のインキュベーション時間及び温度は、従来法により、当業者が決定することができる。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｄ）において、工程（ｃ）の生成物を３５℃～７０℃の温度（例えば、３５℃～４０℃、４０℃～４５℃、４５℃～５０℃、５０℃～５５℃、５５℃～６０℃、６０℃～６５℃、又は６５℃～７０℃）でインキュベートし、それによって核酸のアニーリング又はハイブリダイゼーションを可能にする。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｄ）において、工程（ｃ）の生成物を、１０秒～５分、例えば、１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、又は２分～５分インキュベートする。

工程（ｅ）のインキュベーション時間及び温度は、従来法により、当業者が決定することができる。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｅ）において、工程（ｄ）の生成物を３５℃～８５℃の温度（例えば、３５℃～４０℃、４０℃～４５℃、４５℃～５０℃、５０℃～５５℃、５５℃～６０℃、６０℃～６５℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、７５℃～８０℃、８０℃～８５℃）でインキュベートし、それによって核酸の伸長を可能にする。或る特定の好ましい実施の形態においては、工程（ｅ）において、工程（ｄ）の生成物を、１０秒～３０分、例えば、１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、２分～５分、５分～１０分、１０分～２０分、又は２０分～３０分インキュベートする。

或る特定の実施の形態において、工程（ｄ）及び工程（ｅ）は、異なる温度で行われてもよく、すなわち、核酸のアニーリング及び伸長は異なる温度で行われる。或る特定の実施の形態において、工程（ｄ）及び工程（ｅ）は、同じ温度で行われてもよく、すなわち、核酸のアニーリング及び伸長は同じ温度で行われる。この場合、工程（ｄ）と工程（ｅ）を１つの工程として組み合わせることができる。

本発明の方法では、工程（ｃ）～工程（ｅ）を、少なくとも１回、例えば、少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、又は少なくとも５０回繰り返してもよい。しかしながら、工程（ｃ）～工程（ｅ）を１回以上繰り返す場合、各サイクルの工程（ｃ）～工程（ｅ）で使用される条件が同じである必要はないことが容易に理解できる。例えば、或る条件を使用して、サイクルの前の部分（例えば、最初の５サイクル、最初の１０サイクル、最初の２０サイクル）の工程（ｃ）～工程（ｅ）を実施し、続いて別の条件を使用して残りのサイクルの工程（ｃ）～工程（ｅ）を実施することができる。

本発明の方法は、標的核酸の多重非対称増幅を可能にして、大量の一本鎖核酸生成物を生成することを可能にする。したがって、本発明の方法は、或る特定の状況において特に有利である。例えば、本発明の方法の増幅産物は、シーケンシング、遺伝子チップ検出、又は融解曲線分析に使用することができる。したがって、幾つかの好ましい実施の形態において、本発明の方法は、（３）工程（２）の生成物をシーケンシングする工程を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、（３）遺伝子チップを使用して工程（２）の生成物を検出する工程を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、（３）工程（２）の生成物に対して融解曲線分析を行う工程を更に含む。

検出方法
一態様において、本出願は、（ｉ）本発明の方法を用いて試料中の１つ以上の標的核酸を増幅する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物に対して融解曲線分析を実施する工程を含む、試料中の１つ以上の標的核酸を検出する方法を提供する。

或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法は、
（１）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸に対して標的特異的プライマー対及び検出プローブを提供する工程であって、
ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、
標的特異的プライマー対が標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、フォワードプライマーが、第２のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、フォワードヌクレオチド配列が第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、リバースプライマーが、第１のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、リバースヌクレオチド配列が第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、第１のユニバーサル配列が第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、第１のユニバーサル配列がフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的であってはならず、
検出プローブが、標的核酸に特異的なプローブヌクレオチド配列を含み、レポーター基及びクエンチャー基で標識され、レポーター基がシグナルを放出することができ、クエンチャー基が、レポーター基によって放出されたシグナルを吸収又は消光することができ、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズするときに放出されるシグナルが、その相補配列にハイブリダイズされていない場合に放出されるシグナルとは異なる工程と、
（２）核酸増幅が可能な条件下で、ユニバーサルプライマー、及び標的特異的プライマー対を使用して、ＰＣＲ反応を介して試料中の標的核酸を増幅する工程と、
（３）検出プローブを使用して工程（２）の生成物に対して融解曲線分析を実施し、融解曲線分析の結果に従って標的核酸が試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
を含む。

本発明の或る特定の実施の形態において、試料、標的核酸、ユニバーサルプライマー、及び／又は標的特異的プライマー対は、上に定義する通りである。

本発明の或る特定の実施の形態においては、工程（２）において、試料をユニバーサルプライマー及び標的特異的プライマー対と、核酸ポリメラーゼと混合し、ＰＣＲ反応を行う。次いで、ＰＣＲ反応が完了した後、工程（２）の生成物に検出プローブを添加し、融解曲線分析を実施する。

本発明の或る特定の実施の形態においては、工程（２）において、試料をユニバーサルプライマー、標的特異的プライマー対及び検出プローブと、核酸ポリメラーゼと混合し、ＰＣＲ反応を行う。次いで、ＰＣＲ反応が完了した後、融解曲線分析を実施した。

本発明の或る特定の実施の形態において、検出プローブが、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロック核酸）、又はそれらの任意の組合せを含んでもよく、又はそれらからなってもよい。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか、又は天然ヌクレオチドからなる。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン又は５－ヒドロキシメチルシトシン等の修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１－（２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－３－ニトロピロール、５－ニトロインドール又はロック核酸（ＬＮＡ）等の非天然ヌクレオチドを含む。

本発明の方法では、検出プローブは、その長さによって制限されない。例えば、検出プローブは、１５ｎｔ～１０００ｎｔ、例えば１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～２００ｎｔ、２００ｎｔ～３００ｎｔ、３００ｎｔ～４００ｎｔ、４００ｎｔ～５００ｎｔ、５００ｎｔ～６００ｎｔ、６００ｎｔ～７００ｎｔ、７００ｎｔ～８００ｎｔ、８００ｎｔ～９００ｎｔ、９００ｎｔ～１０００ｎｔの長さである。

或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、３’－ＯＨ末端を有する。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブの３’末端は、その伸張を阻害するためにブロックされる。核酸（検出プローブ等）の３’末端を、様々な方法でブロックすることができる。例えば、検出プローブの３’末端は、検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨを修飾することによってブロックすることができる。或る特定の実施の形態において、検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨに化学部分（例えば、ビオチン又はアルキル基）を付加することによって、検出プローブの３’末端をブロックすることができる。或る特定の実施の形態において、検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨを除去することによって、又は最後のヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドに置き換えることによって、検出プローブの３’末端をブロックすることができる。

上述のように、検出プローブが、レポーター基及びクエンチャー基で標識され、レポーター基がシグナルを放出することができ、クエンチャー基が、レポーター基によって放出されたシグナルを吸収又は消光することができ、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズするときに放出されるシグナルが、その相補配列にハイブリダイズされていない場合に放出されるシグナルとは異なる。

或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、自己消光プローブである。かかる実施の形態において、検出プローブが他の配列にハイブリダイズされていない場合、クエンチャー基は、レポーター基のシグナルを吸収又は消光することができる位置に配置され（例えば、クエンチャー基はレポーター基に隣接して配置される）、それによりレポーター基から放出されたシグナルを吸収又は消光する。この場合、検出プローブはシグナルを放出しない。さらに、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズされる場合、クエンチャー基は、レポーター基のシグナルを吸収又は消光できない位置にある（例えば、クエンチャー基がレポーター基から遠く離れた位置にある）ため、レポーター基から放出されたシグナルを吸収又は消光することができない。この場合、検出プローブはシグナルを放出する。

かかる自己消光検出プローブの設計は、当業者の能力の範囲内である。例えば、レポーター基は検出プローブの５’末端で標識することができ、クエンチャー基は３’末端で標識することができるか、又はレポーター基は検出プローブの３’末端で標識することができ、クエンチャー基は５’末端で標識することができる。したがって、検出プローブが単独で存在する場合、レポーター基とクエンチャー基は互いに接近して相互作用するため、レポーター基によって放出されたシグナルはクエンチャー基によって吸収され、検出プローブはシグナルを放出せず、また、検出プローブがその相補配列とハイブリダイズする場合、レポーター基とクエンチャー基は互いに分離されているため、レポーター基によって放出されたシグナルはクエンチャー基によって吸収できず、検出プローブがシグナルを放出する。

しかしながら、レポーター基及びクエンチャー基は、検出プローブの両端に標識される必要はないことを理解すべきである。レポーター基及び／又はクエンチャー基はまた、検出プローブが、その相補配列にハイブリダイズされた場合に、その相補配列にハイブリダイズされていない場合に放出されるシグナルとは異なるシグナルを放出する限り、検出プローブ内で内部的に標識することができる。例えば、レポーター基は検出プローブの上流（又は下流）で標識することができ、クエンチャー基は検出プローブの下流（又は上流）で標識することができ、２つは十分な距離（例えば、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、又はそれより長い距離）で隔てられる。したがって、検出プローブが単独で存在する場合、プローブ分子のフリーコイル形成又はプローブの二次構造（例えば、ヘアピン構造）の形成により、レポーター基とクエンチャー基は互いに接近して相互作用するため、レポーター基によって放出されるシグナルはクエンチャー基によって吸収され、その結果、検出プローブはシグナルを放出せず、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズする場合、レポーター基とクエンチャー基は、レポーター基によって放出されたシグナルをクエンチャー基が吸収できないように十分な距離で互いに隔てられ、それにより検出プローブがシグナルを放出する。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基は、１０ｎｔ～８０ｎｔ又はそれ以上、例えば、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔの距離で隔てられる。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基とクエンチャー基は、８０ｎｔ以下、７０ｎｔ以下、６０ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、４０ｎｔ以下、３０ｎｔ以下、又は２０ｎｔ以下の距離で隔てられている。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基とクエンチャー基は、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ又は少なくとも２０ｎｔの距離で隔てられている。

したがって、検出プローブが、相補配列にハイブリダイズされた場合に、その相補配列にハイブリダイズされていない場合に放出されるシグナルとは異なるシグナルを放出する限り、レポーター基及びクエンチャー基は、検出プローブ上の任意の適切な位置に標識することができる。しかしながら、或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基のうち少なくとも一方は、検出プローブの末端（例えば、５’又は３’末端）に位置する。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基のうち一方は、検出プローブの５’末端に又は５’末端から１ｎｔ～１０ｎｔに位置し、レポーター基及びクエンチャー基は、クエンチャー基が、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズする前にレポーター基によって放出されたシグナルを吸収又は消光することができるように、適切な距離だけ離れている。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基のうち一方は、検出プローブの３’末端に又は３’末端から１ｎｔ～１０ｎｔに位置し、レポーター基及びクエンチャー基は、クエンチャー基が、検出プローブがその相補配列にハイブリダイズする前にレポーター基によって放出されたシグナルを吸収又は消光することができるように、適切な距離だけ離れている。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基は、上で定義した距離（例えば、１０ｎｔ～８０ｎｔ以上の距離）離れていてもよい。或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基及びクエンチャー基のうち一方が検出プローブの５’末端に位置し、他方が３’末端に配置される。

本発明の方法において、レポーター基及びクエンチャー基は、当該技術分野で知られている任意の適切な基又は分子とすることができ、それらの特定の例としては、限定されるものではないが、Ｃｙ２（商標）（５０６）、ＹＯ－ＰＲＯ（商標）－ｌ（５０９）、ＹＯＹＯ（商標）－ｌ（５０９）、カルセイン（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ（商標）（５１９）、Ａｌｅｘａ（商標）（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ（商標）（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ（商標）（５３３）、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－ｌ（５３３）、ＴＯＴＯｌ（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３（商標）（５７０）、Ａｌｅｘａ（商標）５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（商標）（５７５）、フィコエリスリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（商標）（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）（５９０）、Ｃｙ３．５（商標）（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ（商標）（６１５）、Ａｌｅｘａ（商標）５９４（６１５）、テキサスレッド（６１５）、ナイルレッド（６２８）、ＹＯ－ＰＲＯ（商標）－３（６３１）、ＹＯＹＯ（商標）－３（６３１）、Ｒ－フィコシアニン（６４２）、Ｃ－フィコシアニン（６４８）、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３（６６０）、Ｔ０Ｔ０３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５（商標）（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、バイオサーチブルー（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、フルオレセイン（５２０）、フルオレセイン－Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）が挙げられる。括弧内の数字は、単位がｎｍである最大発光波長を示す。

さらに、レポーター基とクエンチャー基の様々な適切な組合せが当該技術分野で知られており、例えば、Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971)；White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970)；Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971)；Griffiths, Color AND Constitution of Oiganic Molecules (Academic Press, New York, 1976)；Bishop, editor, Indicators (Peigamon Press, Oxford, 1972)；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992)；Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949)；Haugland, RP, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996)；米国特許第３，９９６，３４５号、及び米国特許第４，３５１，７６０号を参照されたい。

或る特定の好ましい実施の形態において、レポーター基は蛍光基である。かかる実施の形態において、レポーター基によって放出されるシグナルは蛍光であり、クエンチャー基は、蛍光を吸収／消光することができる分子又は基（例えば、蛍光を吸収することができる別の蛍光分子、又は蛍光を消光することができるクエンチャー）である。或る特定の好ましい実施の形態において、フルオロフォアとしては、限定されるものではないが、ＡＬＥＸ－３５０、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＴＡＭＲＡ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＲＯＸ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ ６７０、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５、Ｑｕａｓａｒ ７０５等の様々な蛍光分子が挙げられる。或る特定の好ましい実施の形態において、クエンチャー基としては、限定されるものではないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ（例えば、ＢＨＱ－１又はＢＨＱ－２）、ＥＣＬＩＰＳＥ、及び／又はＴＡＭＲＡ等の様々なクエンチャーが挙げられる。

本発明の方法において、検出プローブはまた、例えば、ヌクレアーゼ活性（例えば、５’ヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）に対する耐性を付与するように修飾することもできる。例えば、ヌクレアーゼ活性に耐性のある修飾を検出プローブの骨格に導入することができ、その例としては、ホスホロチオエートエステル結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネートエステル結合、アリールホスホネートエステル結合、水素化ホスフェートエステル結合、アルキルホスホルアミデートエステル結合、アリールホスホルアミデートエステル結合、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾、２’－Ｏ－アルキル修飾、２’－Ｏ－アリル修飾、２’－Ｏ－ブチル修飾、及び１－（４’－チオ－ＰＤ－リボフラノシル）修飾が挙げられる。

本発明の方法において、検出プローブは、直鎖状であってもよく、又はヘアピン構造を有していてもよい。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは直鎖状である。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブはヘアピン構造を有する。ヘアピン構造は、天然であってもよく、又は人工的に導入することができる。さらに、ヘアピン構造を有する検出プローブは、当該技術分野の従来の方法を用いて構築することができる。例えば、検出プローブは、２つの相補的なオリゴヌクレオチド配列を検出プローブの両端（５’末端及び３’末端）に付加することによってヘアピン構造を形成することができる。かかる実施の形態において、２つの相補的なオリゴヌクレオチド配列は、ヘアピン構造のアーム（ステム）を構成する。ヘアピン構造のアームは、任意の所望の長さにすることができ、例えば、アームは、２ｎｔ～１５ｎｔ、例えば３ｎｔ～７ｎｔ、４ｎｔ～９ｎｔ、５ｎｔ～１０ｎｔ、６ｎｔ～１２ｎｔの長さを有し得る。

或る特定の実施の形態において、工程（２）の生成物を徐々に加熱することができ、検出プローブ上のレポーター基によって放出されるシグナルをリアルタイムで監視することができ、これにより、温度の変化に伴って変動する工程（２）の生成物のシグナル強度の曲線を取得する。例えば、工程（２）の生成物を、４５℃以下の温度（例えば、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下）から７５℃以上の温度（例えば、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃）まで徐々に加熱することができ、検出プローブ上のレポーター基によって放出されたシグナルをリアルタイムで監視し、温度の変化に応じて変動するレポーター基のシグナル強度の曲線を取得する。加熱速度は、当業者が慣習的に決定することができる。例えば、加熱速度は次の通りであり得る：工程ごとに温度を０．０１℃～１℃（例えば、０．０１℃～０．０５℃、０．０５℃～０．１℃、０．１℃～０．５℃、０．５℃～１℃、０．０４℃～４℃、例えば０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃又は１．０℃）上昇させ、各工程を０．５秒～１５秒（例えば、０．５秒～１秒、１秒～２秒、２秒～３秒、３秒～４秒、４秒～５秒、５秒～１０秒、１０秒～１５秒）維持するか、又は温度を毎秒０．０１℃～１℃（例えば、０．０１℃～０．０５℃、０．０５℃～０．１℃、０．１℃～０．５℃、０．５℃～１℃、０．０４℃～０．４℃、例えば０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）上昇させる。

或る特定の実施の形態において、工程（２）の生成物を徐々に冷却することができ、検出プローブのレポーター基によって放出されるシグナルをリアルタイムで監視することができ、これにより、温度の変化に伴って変動する工程（２）の生成物のシグナル強度の曲線を取得する。例えば、工程（２）の生成物は、７５℃以上の温度（例えば、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃）から４５℃以下の温度（例えば、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下）まで徐々に冷却することができ、検出プローブ上のレポーター基によって放出されたシグナルを監視し、これにより温度の変化に応じて変動するレポーター基のシグナル強度の曲線を取得する。冷却速度は、当業者が慣習的に決定することができる。例えば、冷却速度は次の通りであり得る：工程ごとに温度を０．０１℃～１℃（例えば、０．０１℃～０．０５℃、０．０５℃～０．１℃、０．１℃～０．５℃、０．５℃～１℃、０．０４℃～４℃、例えば０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃又は１．０℃）低下させ、各工程を０．５秒～１５秒（例えば、０．５秒～１秒、１秒～２秒、２秒～３秒、３秒～４秒、４秒～５秒、５秒～１０秒、１０秒～１５秒）維持するか、又は温度を毎秒０．０１℃～１℃（例えば、０．０１℃～０．０５℃、０．０５℃～０．１℃、０．１℃～０．５℃、０．５℃～１℃、０．０４℃～０．４℃、例えば０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）低下させる。

続いて、得られた曲線を微分して、工程（２）の生成物の融解曲線を得ることができる。融解曲線の融解ピーク（融点）に従い、融解ピーク（融点）に対応する標的核酸の存在を判断することができる。

本発明の方法において、使用される検出プローブは、それぞれ独立して、同一又は異なるレポーター基を使用することができる。或る特定の好ましい実施の形態において、使用される検出プローブは、同じレポーター基を有する。この場合、（２）の生成物に対して融解曲線分析を実行し、融解曲線の融解ピーク（融点）に従って或る特定の標的核酸の存在を判断することができる。或る特定の好ましい実施の形態において、使用される検出プローブは、異なるレポーター基を有する。この場合、工程（２）の生成物を融解曲線分析に供すると、各レポーター基のシグナルをリアルタイムで監視することができ、これにより、１つのレポーター基のシグナルに対応する複数の融解曲線を取得する。その後、レポーター基のシグナル種及び融解曲線の融解ピーク（融点）に応じて、或る特定の標的核酸の存在を判断することができる。したがって、本発明の方法は、１つ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はそれ以上）の標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成することができる。

理論上の制限に縛られることなく、同じ１つのレポーター基（同じ融解曲線）について、融解曲線分析の分解能又は精度は０．５℃以上に達する可能性がある。言い換えれば、融解曲線分析では、同じ融解曲線の融点の差がわずか０．５℃以下（例えば、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃）の２つの融解ピークを区別することができる。したがって、本発明の方法の或る特定の実施の形態において、様々な標的核酸によって形成される様々なデュプレックスとそれらの検出プローブとの間の融点差は、同じレポーター基を用いて少なくとも０．５℃であり得るため、異なるデュプレックス（したがって、異なる標的核酸）を、融解曲線分析によって区別及び識別することができる。しかしながら、区別及び識別を容易にするために、幾つかの場合には、２つのデュプレックスの融点の差がより大きいことが好ましい。したがって、本発明の方法の或る特定の実施の形態において、２つのデュプレックス間の融点の差は、融点差が融解曲線分析によって区別及び識別できる限り、任意の所望の値（例えば、少なくとも０．５℃、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも８℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、又は少なくとも２０℃）とすることができる。

或る特定の好ましい実施の形態において、本発明の方法の工程（１）～工程（３）は、以下の工程（ａ）～工程（ｇ）：
（ａ）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸について、標的特異的プライマー対及び検出プローブを提供する工程であって、
ユニバーサルプライマー、標的特異的プライマー対及び検出プローブが、上に定義される通りである工程と、
（ｂ）試料をユニバーサルプライマー、標的特異的プライマー対及び検出プローブと、核酸ポリメラーゼ（例えば、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ；例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）と混合する工程と、
（ｃ）核酸変性が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｄ）核酸アニーリング又はハイブリダイゼーションが可能な条件下で、前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｅ）核酸伸長が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
（ｆ）任意に、工程（ｃ）～工程（ｅ）を１回以上繰り返す工程と、
（ｇ）前の工程の生成物に対して融解曲線分析を実施する工程と、
を含むプロトコルによって行うことができる。

工程（ａ）～工程（ｇ）については、上記で詳しく説明した。

プライマーセット及びキット
一態様において、本発明は、プライマーセットであって、ユニバーサルプライマーと、１つ以上の標的特異的プライマー対とを含み、
ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、
各標的特異的プライマー対が標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、フォワードプライマーが第２のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、フォワードヌクレオチド配列が第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、リバースプライマーが第１のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、リバースヌクレオチド配列が第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、第１のユニバーサル配列が、第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、第１のユニバーサル配列がフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的であってはならない、プライマーセットを提供する。

或る特定の好ましい実施の形態において、プライマーセットは、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的特異的プライマー対、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、又はそれ以上の標的特異的プライマー対を含む。

かかるプライマーセットは、上記で詳細に説明した本発明の方法を実施するために使用できることが容易に理解されるであろう。したがって、ユニバーサルプライマー、標的特異的プライマー対、標的核酸、及び試料について上記で詳細に説明した様々な技術的特徴を、本出願のプライマーセットを含む技術的解決策にも適用することができる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態において、プライマーセットは、上で定義されるように、ユニバーサルプライマー、及び／又は標的特異的プライマー対を含む。

或る特定の好ましい実施の形態において、プライマーセットを使用して、試料中の１つの標的核酸を増幅することができ、このプライマーセットは、ユニバーサルプライマーと、第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーを含む第１の標的特異的プライマー対とを含み、
ユニバーサルプライマーは第１のユニバーサル配列を含み、
第１のフォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列と、第１の標的核酸に特異的な第１のフォワードヌクレオチド配列とを含み、第１のフォワードヌクレオチド配列は、第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングの条件下で、第１のユニバーサル配列が、第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドが、それぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、
第１のリバースプライマーは、第１のユニバーサル配列と、第１の標的核酸に特異的な第１のリバースヌクレオチド配列とを含み、第１のリバースヌクレオチド配列は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、
第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーは、第１の標的核酸を特異的に増幅することができ、
第１のユニバーサル配列は、第１のフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない。

或る特定の好ましい実施の形態において、上記プライマーセットを試料中の２つの標的核酸を増幅するために使用することができ、このプライマーセットは、ユニバーサルプライマーと、第１の標的特異的プライマー対及び第２の標的特異的プライマー対とを含み、ユニバーサルプライマーは、上記で定義した通りであり、第１の標的特異的プライマー対は、第１の標的核酸を増幅することができる第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーを含み、第２の標的特異的プライマー対は、第２の標的核酸を増幅可能な第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、第１のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー、第２のフォワードプライマー、及び第２のリバースプライマーは、上に定義される通りである。同様に、或る特定の好ましい実施の形態において、本発明のプライマーセットは、試料中の３個以上の標的核酸を増幅するために使用することができ、このプライマーセットは、ユニバーサルプライマー、及び３個以上の標的核酸を増幅することができる、３個以上の標的特異的プライマー対を含む。

さらに、便宜上、本発明のプライマーセットを、本発明の方法（増幅方法又は検出方法）を実施するのに必要な１つ以上の試薬と組み合わせてキットを作製することができる。かかるキットは、上記で詳細に説明した本発明の方法を実施するために使用できることが容易に理解されるであろう。したがって、様々な構成要素について上記で詳述した様々な技術的特徴は、キットの様々な構成要素に等しく適用される。さらに、かかるキットはまた、本発明の方法を実施するのに必要な他の試薬を含んでもよい。

したがって、別の態様において、本出願は、上に記載されるプライマーセットと、核酸ポリメラーゼ、核酸増幅用試薬、シーケンシングを行うための試薬、遺伝子チップ検出を行うための試薬、融解曲線分析を行うための試薬、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の構成要素とを含むキットを提供する。

或る特定の好ましい実施の形態において、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等のテンプレート依存性核酸ポリメラーゼである。或る特定の好ましい実施の形態において、核酸ポリメラーゼは上に定義される通りである。

核酸増幅を行うための試薬は、従来法により当業者が決定することができ、限定されるものではないが、酵素（例えば、核酸ポリメラーゼ）用の作用バッファー、ｄＮＴＰ（標識又は非標識）、水、イオン（例えば、Ｍｇ^２＋）を含む溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。

シーケンシングを行うための試薬は、従来法により当業者が決定することができ、限定されるものではないが、酵素（例えば、核酸ポリメラーゼ）用の作用バッファー、ｄＮＴＰ（標識又は非標識）、ｄｄＮＴＰ（標識又は非標識）、水、イオン（例えば、Ｍｇ^２＋）を含む溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、リガーゼ、核酸リンカー、シーケンシングプライマー、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

遺伝子チップ検出を行うための試薬は、従来法により当業者が決定することができ、限定されるものではないが、酵素（例えば、核酸ポリメラーゼ）用の作用バッファー、ｄＮＴＰ（標識又は非標識）、水、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、標識試薬、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

融解曲線分析を行うための試薬は、従来法により当業者が決定することができ、限定されるものではないが、検出プローブが挙げられる。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは、自己消光プローブ、例えば、自己消光蛍光プローブである。或る特定の好ましい実施の形態において、検出プローブは上に定義される通りである。

本出願において詳細に記載される原理に基づいて、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術的解決策の様々な技術的特徴を変更、置き換え、又は組み合わせることができる。かかる技術的解決策及びその修正は全て、本出願の請求項又は均等物の範囲に含まれる。

本発明の有益な効果
従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、以下の有益な効果を有する：
（１）従来のＨＡＮＤシステム及び従来のＨＡＮＤシステムを用いる増幅方法と比較して、本発明の技術的解決策は、複数の標的核酸の同時の非対称増幅（多重非対称増幅）を実現することができる。
（２）従来の多重非対称ＰＣＲ増幅方法と比較して、本発明の技術的解決策は、プライマーダイマーの非特異的増幅を効果的に抑制し、増幅の特異性及び検出感度を大幅に改善することができる。

したがって、本発明は、複数の標的核酸を同時に、非対称的に増幅することができ、効果的な多重ＰＣＲ増幅と非対称ＰＣＲ増幅とを同時に達成することができ、複数の標的核酸の増幅と検出を同時に実施するための臨床上の要件を満たすことができる新たな方法を開発する。

本発明の実施形態を以下で図面及び実施例を参照して詳細に説明するが、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。

本発明の方法の基本原理を説明するため、本発明の方法の例示的な実施形態を模式的に示す図である。 図１Ａは、この実施形態で用いたプライマーセットを模式的に示しており、これは、ユニバーサルプライマーと、第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーを含む第１の標的特異的プライマー対とを含み、 ユニバーサルプライマーは第１のユニバーサル配列（Ｔａｇ１）を含み、 第１のフォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列（Ｔａｇ２）と、第１の標的核酸に特異的な第１のフォワードヌクレオチド配列とを含み、第１のフォワードヌクレオチド配列は第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、 第１のリバースプライマーは、第１のユニバーサル配列と、第１の標的核酸に特異的な第１のリバースヌクレオチド配列とを含み、第１のリバースヌクレオチド配列は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、 第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーは、第１の標的核酸を特異的に増幅することができ、 第１のユニバーサル配列は、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違は、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、第１のユニバーサル配列は、第１のフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない。 図１Ｂは、図１Ａのプライマーセットを増幅に使用すると、プライマーダイマーの非特異的増幅が抑制される原理を模式的に示し、図中、第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーの非特異的増幅によって形成されたプライマーダイマーは、変性後に、互いに相補的であってアニーリングすることができる５’末端及び３’末端を有する一本鎖核酸を生成し、一本鎖核酸は、アニーリング段階で安定したパンハンドル構造を形成し、ユニバーサルプライマーが一本鎖核酸をアニーリング及び伸長することを防ぎ、それによってプライマーダイマーの更なる増幅を阻害する。 図１Ｃは、図１Ａのプライマーセットを用いた多重非対称増幅の原理を模式的に示す。この実施形態において、最初に、低濃度の第１の標的特異的プライマー対を用いてＰＣＲ増幅を開始し、初期増幅産物を生成し、これは、第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマー／ユニバーサルプライマーにそれぞれ相補的な２本の核酸鎖（核酸鎖Ａ及び核酸鎖Ｂ）を含み、続いて、高濃度のユニバーサルプライマーを使用して、初期増幅産物のその後のＰＣＲ増幅を行う。 第１のリバースプライマーとユニバーサルプライマーの両方が第１のユニバーサル配列を含むため、第１のリバースプライマーに相補的な核酸鎖Ｂをユニバーサルプライマーに相補的にすることもできる。したがって、ＰＣＲ反応の間、ユニバーサルプライマーは核酸鎖Ｂにアニーリングし、通常はＰＣＲ増幅を開始することができる（すなわち、通常、核酸鎖Ｂの相補鎖を合成する）。 同時に、第１のユニバーサル配列は核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることができるため、ＰＣＲ反応中、ユニバーサルプライマー（第１のユニバーサル配列を含む）は、第１のフォワードプライマー（第２のユニバーサル配列を含む）に相補的な核酸鎖Ａにもアニーリングすることができる。しかしながら、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間に相違があるため（この場合、第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されている）、ユニバーサルプライマー（特にその３’末端）は核酸鎖Ａと完全に相補的ではなく、ユニバーサルプライマーによる核酸鎖ＡのＰＣＲ増幅の阻害をもたらす（すなわち、核酸鎖Ａの相補鎖の合成が阻害される）。 したがって、ＰＣＲ増幅が進むにつれて、核酸鎖Ａの相補鎖（核酸鎖Ｂ）の合成効率は、核酸鎖Ｂの相補鎖（核酸鎖Ａ）の合成効率よりも顕著に低くなり、その結果、核酸鎖Ｂの相補鎖（核酸鎖Ａ）が大量に合成及び増幅され、一方、核酸鎖Ａの相補鎖（核酸鎖Ｂ）の合成及び増幅が阻害され、標的一本鎖生成物（第１のフォワードプライマー／第２のユニバーサル配列に相補的な配列を含む核酸鎖Ａと、第１のリバースプライマー／ユニバーサルプライマーの配列とを含む）を大量にもたらし、非対称増幅を達成する。さらに、上記で定義されたユニバーサルプライマーは、上記で定義された少なくとも２つ以上の標的特異的プライマー対と組み合わせて使用することもでき、各標的特異的プライマー対は、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、１つの標的核酸を特異的に増幅することができ、フォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、リバースプライマーは、第１のユニバーサル配列と、標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、これにより、本発明の実施形態（プライマーセット）を、少なくとも２つ以上の標的核酸の多重非対称増幅を達成するために使用することができる。 図１Ｃに示す例示的な実施形態において、上記で定義されたユニバーサルプライマーが、２つの標的特異的プライマー対と組み合わせて使用され、第１の標的特異的プライマー対は、第１のフォワードプライマーと第１のリバースプライマーとを含み、第１の標的核酸を特異的に増幅することができ、第１のフォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列と、第１の標的核酸に特異的な第１のフォワードヌクレオチド配列とを含み、第１のリバースプライマーは、第１のユニバーサル配列と、第１の標的核酸に特異的な第１のリバースヌクレオチド配列とを含み、第２の標的特異的プライマー対は、第２のフォワードプライマーと第２のリバースプライマーとを含み、第２の標的核酸を特異的に増幅することができ、第２のフォワードプライマーは、第２のユニバーサル配列と、第２の標的核酸に特異的な第２のフォワードヌクレオチド配列とを含み、第２のリバースプライマーは、第１のユニバーサル配列と、第２の標的核酸配列に特異的な第２のリバースヌクレオチド配列とを含む。したがって、プライマーセットを使用して、第１の標的核酸及び第２の標的核酸を同時に非対称増幅することができる。 実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す図であり、図中、黒色及び灰色の破線は、ＨＡＮＤシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表し、黒色及び灰色の点線は、従来の非対称ＰＣＲシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表し、黒色及び灰色の実線は、本発明のシステムを用いてヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表す。 実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示す図であり、図中、黒色及び灰色の破線は、ＨＡＮＤシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果をそれぞれ表し、黒色及び灰色の点線は、従来の非対称ＰＣＲシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果を表し、黒色及び灰色の実線は、本発明のシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果をそれぞれ表す。 実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いて得られた増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図であり、図中、レーンＭは分子量マーカーを表し、レーン１～レーン３はＨＡＮＤシステム（レーン１）、本発明のシステム（レーン２）、及び従来の非対称ＰＣＲシステム（レーン３）をそれぞれ使用してヒトゲノムＤＮＡを増幅した生成物を表し、レーン４～レーン６は、ＨＡＮＤシステム、本発明のシステム及び従来の非対称ＰＣＲシステムをそれぞれ使用して陰性対照を増幅した生成物を表す。 実施例２において異なるフォワードプライマーを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を示す図であり、図中、灰色破線、黒色実線、黒色破線、灰色実線又は黒色点線は、それぞれ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ａ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔ又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を表す。 実施例３において本発明のシステムを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を示す図であり、図中、黒色実線（試料１）、黒色破線（試料２）、灰色実線（試料３）、灰色破線（試料４）は、それぞれ、試料１～試料４を増幅するために本発明のシステムを用いた後の融解曲線分析の結果を表す。 実施例４において本発明のシステムを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を示す図であり、図中、黒色実線（試料５）、黒色破線（試料６）、黒色点線（試料７）、灰色実線（試料８）、灰色破線（試料９）、灰色点線（試料１０）は、それぞれ、試料５～試料１０を増幅するために本発明のシステムを用いた後の融解曲線分析の結果を表す。 実施例５において、本発明のシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色点線、黒色破線、灰色点線、灰色破線、黒色実線、及び灰色実線は、それぞれ、ＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０１ｎｇ／μＬ、又は０．００５ｎｇ／μＬの試料を増幅した後の融解曲線分析の結果を表す。 実施例５において、従来の多重非対称ＰＣＲシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色点線、黒色破線、灰色点線、灰色破線、黒色実線、及び灰色実線は、それぞれ、ゲノムＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０１ｎｇ／μＬ、又は０．００５ｎｇ／μＬの試料を増幅した後の融解曲線分析の結果を表す。

本発明を実施するための特定のモデル
ここで、本発明は、以下の実施例を参照して説明され、これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、これに限定するものではない。これらの実施例は、本発明の原理及び技術的効果を説明するためにのみ使用されるが、本発明の全ての可能性を表すものではないことを理解すべきである。本発明は、これらの実施例で言及される材料、反応条件、又はパラメータに限定されない。当業者は、本発明の原理に従って、他の類似の材料又は反応条件を使用して、他の技術的解決策を実施することができる。かかる技術的解決策は、本発明に記載された基本原理及び概念から逸脱せず、本発明の範囲に含まれる。

実施例１
この実施例では、ヒト２１番染色体上の遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２を含むＤＮＡフラグメントを増幅される標的核酸として使用することにより、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステム（プライマーセット）を調べて、一本鎖核酸生成物を作製した。この実施例で使用したプライマー及びプローブの配列を表１に示した。この実施例で使用した機器は、ＳＬＡＮ ９６リアルタイム蛍光ＰＣＲ機（Xiamen Zeesan Biotech Co., Ltd.、廈門）であった。

簡単に説明すると、この実施例では、ＰＣＲ増幅及び融解曲線分析に２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用した。ＰＣＲ反応システムは、１×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー（TaKaRa、北京）、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa、北京）、０．２μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｐプローブ、５μＬのヒトゲノムＤＮＡ（ｒｓ２２５２９９２遺伝子型はＡ／Ａホモ接合型であった）又は陰性対照（水）、及びプライマーを含み、
（１）ＨＡＮＤシステムに、０．０３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｆ１、０．０３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｒ、０．３μＭ Ｔａｇプライマー（すなわち、ユニバーサルプライマー）を添加し、
（２）従来の非対称ＰＣＲシステムに０．０３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｆ１及び０．３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｒを添加し、
（３）本発明の方法に基づくＰＣＲシステムに、０．０３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｆ２、０．０３μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｒ、０．３μＭ Ｔａｇプライマーを添加した。

ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の予備変性、１０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、６５℃～５６℃で１５秒間のアニーリング（各サイクルで１℃低下）、７６℃で２０秒間の伸長）、５０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７６℃で２０秒間の伸長）であり、ＣＹ５チャンネルの蛍光シグナルをアニーリング段階の間に集めた。ＰＣＲ増幅後、以下のプログラムに基づいて融解曲線分析を行った：９５℃で１分間の変性；３７℃で３分間のインキュベーション；次いで、温度を０．０４℃／秒の加熱速度で４０℃から８５℃に上昇させ、ＣＹ５チャネルの蛍光シグナルを収集した。最後に、各ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。実験結果を図２～図４に示した。

図２は、実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示し、図中、黒色及び灰色の破線は、ＨＡＮＤシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表し、黒色及び灰色の点線は、従来の非対称ＰＣＲシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表し、黒色及び灰色の実線は、本発明のシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した増幅曲線をそれぞれ表した。結果は、３つのシステム全てがヒトゲノムＤＮＡを効果的で特異的に増幅し、対応する増幅シグナルを生成でき（黒色破線、黒色点線、及び黒色実線）、各システムの陰性対照には増幅シグナルがなかった（灰色破線、灰色点線、及び灰色実線）ことを示した。さらに、従来の非対称ＰＣＲシステムの増幅曲線（黒色点線）は、高濃度の標的特異的プライマーによる標的核酸の直接増幅によって引き起こされる最小のＣｔ値を有することが注目された。

図３は、実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色及び灰色の破線は、ＨＡＮＤシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果をそれぞれ表し、黒色及び灰色の点線は、従来の非対称ＰＣＲシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果をそれぞれ表し、黒色及び灰色の実線は、本発明のシステムを使用してヒトゲノムＤＮＡ及び陰性対照を増幅した後の融解曲線分析の結果をそれぞれ表した。

図４は、実施例１において、ＨＡＮＤシステム、従来の非対称ＰＣＲシステム、及び本発明のシステムを用いて得られた増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示し、図中、レーンＭは分子量マーカーを表し、レーン１～レーン３はＨＡＮＤシステム（レーン１）、本発明のシステム（レーン２）、及び従来の非対称ＰＣＲシステム（レーン３）をそれぞれ使用してヒトゲノムＤＮＡを増幅した生成物を表し、レーン４～レーン６は、ＨＡＮＤシステム、本発明のシステム、及び従来の非対称ＰＣＲシステムをそれぞれ使用して陰性対照を増幅した生成物を表した。

図３及び図４の結果は、ＨＡＮＤシステムを増幅に使用した場合、増幅産物は基本的に二本鎖核酸であり、一本鎖核酸生成物を生成できず（図４、レーン１）、したがって、融解曲線分析の過程で、プローブは増幅産物に効果的にハイブリダイズできず、有効な融解ピークを生成できなかった（図３、黒色破線）ことを示した。したがって、ＨＡＮＤシステムを増幅に使用した場合、効率的なプローブ融解曲線分析を増幅産物に対して実行することができなかった。しかしながら、本発明のシステム及び従来の非対称ＰＣＲシステムを増幅に使用すると、大量の一本鎖核酸生成物が生成され（図４、レーン２及びレーン３）、したがって、融解曲線分析の過程で、プローブは効率的に増幅産物にハイブリダイズし、特定の融解ピークを生成することができた（図３、黒色実線及び黒色点線）。さらに、図３及び図４の結果は、水をテンプレートとして使用する陰性対照システムのどれも有効な融解ピークを生成できず（図３、灰色破線、灰色点線、及び灰色実線）、これは、ＰＣＲプロセスで所望の増幅産物が生成されなかったためである（図４、レーン４～レーン６）ことも示している。

この実施例の結果は、本発明のシステムを使用して、標的核酸の非対称増幅を得ることができ、したがってプローブ融解曲線分析と組み合わせて使用できることを実証した。

実施例２
この実施例では、ヒト２１番染色体上の遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２のＤＮＡフラグメントを増幅される標的核酸として用い、第２のユニバーサル配列と第１のユニバーサル配列との間の相違（すなわち、第１のユニバーサル配列に対する第２のユニバーサル配列の異なるバリアントタイプ）が非対称増幅に及ぼす影響を調べた。この実施例で用いたプライマー及びプローブの配列を表２に示し、ここで用いたユニバーサルプライマー（Ｔａｇプライマー）の３’末端のヌクレオチドはＡであり、５種類のフォワードプライマーを設計し、すなわち、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃの第２のユニバーサル配列の３’末端のヌクレオチドはＣであり、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇの第２のユニバーサル配列の３’末端のヌクレオチドはＧであり、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔの第２のユニバーサル配列の３’末端のヌクレオチドはＴであり、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ａの第２のユニバーサル配列の３’末端のヌクレオチドはＡであり、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄの第２のユニバーサル配列の３’末端の最後から２番目のヌクレオチドＧを欠失させた。ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔ及びｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄを本発明のシステムにそれぞれ使用し、それらの相補配列は、増幅中に、それぞれユニバーサルプライマーとミスマッチＡ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ａ－Ａ及びＧＡ－ＴＡを形成した。対照プライマーｒｓ２２５２９９２－Ｆ－ＡをＨＡＮＤシステムに使用し、その相補配列は増幅中にユニバーサルプライマーと完全に一致した。この実施例で使用した機器は、ＳＬＡＮ ９６リアルタイム蛍光ＰＣＲ機であった。

簡単に説明すると、この実施例では、ＰＣＲ増幅及び融解曲線分析に２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用した。ＰＣＲ反応システムは、１×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．４μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｐプローブ、０．０４μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｒプライマー、１．６μＭ Ｔａｇプライマー、５μＬのヒトゲノムＤＮＡ（ｒｓ２２５２９９２遺伝子型はＴ／Ｃヘテロ接合型であった）又は陰性対照（水）、及び０．０４μＭの指定のフォワードプライマー（すなわち、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ａ、又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃ、又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇ、又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔ、又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄプライマー）を含んだ。

ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の予備変性、１０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、６５℃～５６℃で１５秒間のアニーリング（各サイクルで１℃低下）、７６℃で２０秒間の伸長）、５０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、及び７６℃で２０秒間の伸長）であった。ＰＣＲ増幅が完了した後、融解曲線分析を行い、そのプログラムは以下の通りであった：９５℃で１分間の変性；３７℃で３分間のインキュベーション；次いで、０．０４℃／秒の加熱速度によって５０℃から８５℃に上昇させた温度で融解曲線分析を行い、ＣＹ５チャネルの蛍光シグナルを収集した。融解曲線分析の結果を図５に示した。

図５は、実施例２において異なるフォワードプライマーを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を示し、図中、灰色破線、黒色実線、黒色破線、灰色実線又は黒色点線は、それぞれ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ａ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇ、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔ又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を表した。

図５の実験結果は、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ａプライマー（ユニバーサルプライマーと相補配列が完全に一致したもの）を増幅に用いた場合、反応システム全体がＨＡＮＤシステムと同等であり、増幅産物は一本鎖核酸産物を含んでおらず、したがって、融解曲線（灰色破線）に標的融解ピークは観察されなかったのに対し、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｃ（黒色実線）、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｇ（黒色破線）、ｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｔ（灰色実線）又はｒｓ２２５２９９２－Ｆ－Ｄ（黒色点線）のプライマーを増幅に用いたところ、ユニバーサルプライマーはフォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではなかったため（Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ａ－Ａ又はＧＡ－ＴＡミスマッチがユニバーサルプライマーの３’末端に形成されていた）、２つの核酸鎖の増幅効率が異なり、非対称増幅が形成され、それによって一本鎖核酸産物が得られ、それに対応して、増幅産物の融解曲線に標的融解ピークが観察されたことを示した。この実験結果は、様々なミスマッチ／置換が本発明のシステムに適用可能であったことを示す。また、異なるミスマッチタイプが増幅効率の違いに寄与する可能性があることも注目に値する（融解ピーク高さの違いによって反映される）。したがって、本発明のシステムを非対称増幅に用いる場合、実際のニーズに応じてフォワードプライマー／第２のユニバーサル配列において適切なミスマッチ型を選択することができた。

実施例３
この実施例では、遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２及びｒｓ４８１６５９７のタイピングを例にとり、本発明のシステムが単一の反応管で二重非対称増幅を実現し、プローブの融解曲線分析に使用できることを説明した。この実施例で使用したプライマー及びプローブの配列を表３に示した。この実施例で使用した機器は、ＳＬＡＮ ９６リアルタイム蛍光ＰＣＲ機であった。

簡単に説明すると、この実施例では、ＰＣＲ増幅及び融解曲線分析に２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用し、ＰＣＲ反応システムは、１×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５μＭ ｒｓ４８１６５９７－Ｆ、０．０５μＭ ｒｓ４８１６５９７－Ｒ、０．４μＭ ｒｓ４８１６５９７－Ｐ、０．０４μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｆ、０．０４μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｒ、０．４μＭ ｒｓ２２５２９９２－Ｐ、１．６μＭ Ｔａｇプライマー、５μＬのヒトゲノムＤＮＡ、又は陰性対照（水）を含んだ。この実施例では、４つの試料が検出され（試料１、試料２、試料３及び試料４；各ＰＣＲ反応システムを使用して試料の１つを検出した）、試料１のｒｓ２２５２９９２部位及びｒｓ４８１６５９７部位の遺伝子型はＴ／Ｃ、Ｃ／Ｃと配列決定され、試料２のｒｓ２２５２９９２部位及びｒｓ４８１６５９７部位の遺伝子型はＴ／Ｃ、Ｔ／Ｃと配列決定され、試料３のｒｓ２２５２９９２部位及びｒｓ４８１６５９７部位の遺伝子型はＴ／Ｔ、Ｃ／Ｃと配列決定され、試料４のｒｓ２２５２９９２部位及びｒｓ４８１６５９７部位の遺伝子型はＣ／Ｃ、Ｃ／Ｃと配列決定された。

ＰＣＲ増幅プログラムは以下の通りであった：９５℃で５分間の予備変性；１０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、６５℃～５６℃で１５秒間のアニーリング（各サイクルで１℃低下）、７６℃で２０秒間の伸長）；５０サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、及び７６℃で２０秒間の伸長）；次いで、融解曲線分析を行い、そのプログラムは、以下の通りであった：９５℃で１分間の変性、３７℃で３分間のインキュベーション、次いで、０．０４℃／秒の加熱速度で４０℃から８５℃に上昇させた温度で融解曲線分析を行い、ＣＹ５チャネルの蛍光シグナルを収集した。融解曲線分析の結果を図６に示した。

図６は、実施例３において本発明のシステムを用いて増幅した後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色実線（試料１）、黒色破線（試料２）、灰色実線（試料３）、灰色破線（試料４）は、それぞれ、試料１～試料４を増幅するために本発明のシステムを用いた後の融解曲線分析の結果を表した。

図６の結果は、試料１（黒色実線）における遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２及びｒｓ４８１６５９７の遺伝子型がそれぞれＴ／Ｃ及びＣ／Ｃであり、試料２（黒色破線）における遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２及びｒｓ４８１６５９７の遺伝子型がそれぞれＴ／Ｃ及びＴ／Ｃであり、試料３（灰色実線）における遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２及びｒｓ４８１６５９７の遺伝子型がそれぞれＴ／Ｔ及びＣ／Ｃであり、試料４（灰色破線）における遺伝子多型部位ｒｓ２２５２９９２及びｒｓ４８１６５９７の遺伝子型がそれぞれＣ／Ｃ及びＣ／Ｃであり、陰性対照（灰色実線）には融解ピークがなく、各試料のジェノタイピング結果は、シーケンシングによって得られた結果と一致していたことを示した。これらの結果は、本発明のシステムが、単一の反応システムにおいて２つの標的核酸を同時に非対称的に増幅でき、効果的で信頼性の高い融解曲線分析に十分な一本鎖核酸生成物をそれぞれ生成することができ、これにより、２つの標的核酸の同定（例えば、２つの遺伝子多型部位のジェノタイピング）を実現することを示した。したがって、融解曲線分析技術と組み合わせることで、本発明のシステムは、２つの標的核酸の検出及び同定（例えば、ジェノタイピング）を同時に実現することができた。

実施例４
この実施例では、８つの遺伝子多型部位（すなわち、ｒｓ９７９３９３、ｒｓ３４５２１０６４、ｒｓ２８３５９０６、ｒｓ７２７５５４７、ｒｓ４１８２９８、ｒｓ６０８７１８８０、ｒｓ４８１６５９７、及びｒｓ２２５２９９２）を例に取り、本発明のシステムが、単一の反応管で８プレックスの非対称増幅を実現することができ、プローブの融解曲線分析に用いることができることを実証した。この実施例で使用したプライマー及びプローブの配列を表４に示した。この実施例で使用した機器は、ＳＬＡＮ ９６リアルタイム蛍光ＰＣＲ機であった。

簡単に説明すると、この実施例では、ＰＣＲ増幅及び融解曲線分析に２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用し、ＰＣＲ反応システムは、１×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２４ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５μＬのヒトゲノムＤＮＡと、プライマー及びプローブとを含んだ。使用したプライマーとプローブの濃度を表４に示した。この実施例では、合計６つの試料を検出した（試料５～試料１０、各ＰＣＲ反応システムが１つの試料を検出した）。

ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の予備変性；４サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５２℃で１５秒間のアニーリング、７６℃で２０秒間の伸長）；５５サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、及び７６℃で２０秒間の伸長）であり、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、及びＣＹ５チャネルの蛍光シグナルをアニーリング段階で収集した。次いで、融解曲線分析を行い、そのプログラムは、以下の通りであった：９５℃で１分間の変性及び３７℃で３分間のインキュベーション；次いで、温度を０．０４℃／秒の加熱速度で４０℃から８５℃に上昇させ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、及びＣＹ５のチャネルの蛍光シグナルを収集した。実験結果を図７に示した。

図７は、実施例４において、本発明のシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色実線（試料５）、黒色破線（試料６）、黒色点線（試料７）、灰色実線（試料８）、灰色破線（試料９）、及び灰色点線（試料１０）は、それぞれ、本発明のシステムを使用して試料５～試料１０を増幅した後の融解曲線分析の結果を表した。

さらに、試料５～試料１０の８個の遺伝子多型部位のジェノタイピング結果をシーケンシングによっても同定した。結果は、本発明のシステムによって得られた各試料のジェノタイピング結果（図７及び表５）が、シーケンシングによって得られた結果と完全に一致することを示した。

これらの結果は、本発明のシステムが、単一の反応システムにおいて試料中の８個の標的核酸を同時に非対称的に増幅し、有効で信頼性の高い融解曲線分析に十分な一本鎖核酸生成物をそれぞれ生成し得ることを示し、これにより、複数の標的核酸の同定（例えば、複数の遺伝子多型部位のジェノタイピング）が可能になった。したがって、融解曲線分析技術と組み合わせることで、本発明のシステムは、複数の標的核酸の検出及び同定（例えば、ジェノタイピング）を同時に実現することができた。

実施例５
この実施例では、本発明のシステムと従来の多重非対称ＰＣＲシステムとの分析感度を比較するために、異なる濃度のヒトゲノムＤＮＡを含む試料のジェノタイピングを例にとった。この実施例で用いたゲノムＤＮＡは、８つの既知の遺伝子型の多型部位、具体的にはｒｓ９７９３９３：Ｔ／Ｇ；ｒｓ３４５２１０６４：Ｔ／Ｃ；ｒｓ２８３５９０６：Ｔ／Ｃ；ｒｓ７２７５５４７：Ｇ／Ｃ；ｒｓ１００５５４６：Ｃ／Ｃ；ｒｓ８５７９９８：Ｃ／Ｃ；ｒｓ４８１６５９７：Ｔ／Ｃ；ｒｓ２２５２９９２：Ｃ／Ｃ）を有していた。この実施例で使用したプライマー及びプローブの配列を表６に示した。この実施例で使用した機器は、ＳＬＡＮ ９６リアルタイム蛍光ＰＣＲ機であった。

簡単に説明すると、この実施例では、ＰＣＲ増幅及び融解曲線分析に２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用し、ＰＣＲ反応システムは、１×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２４ｍＭ ｄＮＴＰ、２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５μＬのヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０１ｎｇ／μＬ、又は０．００５ｎｇ／μＬの濃度）と、プライマー及びプローブとを含んだ。使用したプライマーとプローブの濃度を表６に示した。

ＰＣＲ増幅プログラムは以下の通りであった：９５℃で５分間の予備変性；６サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５２．５℃で１５秒間のアニーリング、７６℃で２０秒間の伸長）；５５サイクルの（９５℃で１５秒間の変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、７６℃で２０秒間の伸長）；ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、及びＣＹ５チャネルの蛍光シグナルをアニーリング段階で収集した。次いで、融解曲線分析を行い、そのプログラムは、以下の通りであった：９５℃で１分間の変性、及び３７℃で３分間のインキュベーション；次いで、温度を０．０４℃／秒の加熱速度で４０℃から８５℃に上昇させ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、及びＣＹ５チャネルの蛍光シグナルを収集した。実験結果を図８及び図９に示した。

図８は、実施例５において、本発明のシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色点線、黒色破線、灰色点線、灰色破線、黒色実線、及び灰色実線は、それぞれ、ＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０１ｎｇ／μＬ、又は０．００５ｎｇ／μＬの試料を増幅した後の融解曲線分析の結果を表した。

図９は、実施例５において、従来の多重非対称ＰＣＲシステムを用いた増幅後の融解曲線分析の結果を示し、図中、黒色点線、黒色破線、灰色点線、灰色破線、黒色実線、及び灰色実線は、それぞれ、ゲノムＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、０．０５ｎｇ／μＬ、０．０１ｎｇ／μＬ、又は０．００５ｎｇ／μＬの試料を増幅した後の融解曲線分析の結果を表した。

図８の結果は、ヒトゲノムＤＮＡの濃度が０．０５ｎｇ／μＬ（灰色破線）と低かったとしても、本発明のシステムは、８個の遺伝子多型部位全ての遺伝子型を安定して正確に検出できることを示した。対照的に、図９の結果は、従来の多重非対称ＰＣＲシステムでは、ヒトゲノムＤＮＡの濃度が１０ｎｇ／μＬ（黒色点線）及び１ｎｇ／μＬ（黒色破線）の場合にのみ８個の遺伝子多型部位全ての遺伝子型を検出でき、ヒトゲノムＤＮＡの濃度が０．１ｎｇ／μＬ（灰色点線）のとき、幾つかの遺伝子多型部位（例えば、ｒｓ３４５２１０６４部位、ｒｓ４８１６５９７部位）の遺伝子型は検出及び識別できなくなった（識別可能な融解ピークは生成されなかった）ことを示した。これは、従来の多重非対称ＰＣＲ反応システムでは、高濃度の複数種類のプライマーとプローブとが互いに相互作用し、幾つかの遺伝子多型部位の非対称増幅を効果的に行うことができず、融解曲線分析に十分な量の一本鎖生成物を生成できなかったためと考えられる。

上記の結果は、本発明のシステムの検出感度が、従来の多重非対称ＰＣＲシステムの検出感度よりも顕著に高いことを示した。これは主に、本発明のシステムが、増幅のために低濃度の標的特異的プライマー及び高濃度のユニバーサルプライマーを使用することから、プライマー間の干渉が効果的に低減され、ダイマーの非特異的増幅等が低減され、反応システム内の各標的核酸の増幅が平衡に達し、それによって反応システム全体の検出感度が向上するためである。

本発明の特定の実施形態が詳細に説明されるが、当業者は、開示された全ての教示に照らして、詳細に様々な修正及び変更を加えることができること、並びにこれらの変更が全て本発明の範囲内にあることを理解する。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれに相当するものによって与えられる。

Claims (19)

1. 試料中の１つ以上の標的核酸を増幅する方法であって、
   （１）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸に対して標的特異的プライマー対を提供する工程であって、
   前記ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、前記第１のユニバーサル配列が、前記ユニバーサルプライマーの３’部分に位置するか、又は前記ユニバーサルプライマーの３’部分を構成し、
   前記標的特異的プライマー対が前記標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが第２のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、
   前記フォワードヌクレオチド配列が前記第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記フォワードヌクレオチド配列が、前記フォワードプライマーの３’部分に位置するか、又は前記フォワードプライマーの３’部分を構成し、
   前記リバースプライマーが前記第１のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、前記リバースヌクレオチド配列が前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記リバースヌクレオチド配列が、前記リバースプライマーの３’部分に位置するか、又は前記リバースプライマーの３’部分を構成し、
   核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、前記第１のユニバーサル配列が前記第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることができ、前記第２のユニバーサル配列と前記第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が、前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、前記第１のユニバーサル配列が前記フォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない、工程と、
   （２）核酸増幅が可能な条件下で、前記ユニバーサルプライマー及び前記標的特異的プライマー対を使用して、ＰＣＲ反応を介して前記試料中の前記標的核酸を増幅する工程と、
   を含む、方法。
2. 前記方法が、以下：
   （１）前記方法が、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的核酸を増幅するために使用される；
   （２）前記方法の工程（１）において、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的特異的プライマー対が提供される；
   （３）前記方法の工程（２）において、前記ユニバーサルプライマーが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの作用濃度よりも高い作用濃度を有する；
   （４）前記方法の工程（２）において、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーが同じ又は異なる作用濃度を有する；
   （５）前記試料又は標的核酸がｍＲＮＡを含み、前記方法の工程（２）を実施する前に、前記試料に対して逆転写反応が実施される；及び、
   （６）前記方法の工程（２）において、核酸ポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行う、
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、以下：
   （１）前記ユニバーサルプライマーが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーの作用濃度よりも１倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～５０倍又はそれ以上高い作用濃度を有する；
   （２）核酸ポリメラーゼが、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼである；
   （３）前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである；
   （４）前記核酸ポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである；
   （５）前記核酸ポリメラーゼがサーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィレス（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス、サーミス・フラバス、サーモコッカス・リテラリス、サーマス・アントラニルダンニイ、サーマス・カルドフルス、サーマス・クリアロフィラス、サーマス・フラバス、サーマス・イグニテラエ、サーマス・ラクテウス、サーマス・オシマイ、サーマス・ルバー、サーマス・ルベンス、サーマス・スコトドクタス、サーマス・シルバヌス、サーマス・サーモフルス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモコッカス・リトラリス、サーモコッカス・バロッシ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシフォ・アフリカヌス、パイロコッカス・ウォセイ、パイロコッカス・ホリコシイ、パイロコッカス・アビシ、パイロディクティウム・オカルタム、アクイフェックス・パイロフィルス及びアクイフェックス・エオリエウスから得られる；並びに、
   （６）前記核酸ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項２に記載の方法。
4. 前記方法が、以下：
   （１）前記ユニバーサルプライマーが前記第１のユニバーサル配列からなるか、又は前記第１のユニバーサル配列と追加配列とを含み、前記追加配列が前記第１のユニバーサル配列の５’末端に位置する；
   （２）前記ユニバーサルプライマーが５ｎｔ～１５ｎｔ、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、又は４０ｎｔ～５０ｎｔの長さを有する；及び、
   （３）前記ユニバーサルプライマー又はその任意の成分が、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれらからなる、
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記方法が、以下：
   （１）前記フォワードプライマーにおいて、前記フォワードヌクレオチド配列が前記第２のユニバーサル配列の３’末端に直接連結されているか、又はヌクレオチドリンカーを介して前記第２のユニバーサル配列の３’末端に連結される；
   （２）前記フォワードプライマーが、前記第２のユニバーサル配列の５’末端に位置する追加配列を更に含む；
   （３）前記フォワードプライマーが、５’から３’に、前記第２のユニバーサル配列とフォワードヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、前記第２のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、追加配列と、前記第２のユニバーサル配列と、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、追加配列と、前記第２のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、フォワードヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；
   （４）前記フォワードヌクレオチド配列が、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔの長さを有する；
   （５）前記フォワードプライマーが、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～１１０ｎｔの長さを有する；
   （６）前記フォワードプライマー又はその任意の成分が、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれらからなる；
   （７）前記リバースプライマーにおいて、前記リバースヌクレオチド配列が前記第１のユニバーサル配列の３’末端に直接連結されているか、又は前記リバースヌクレオチド配列がヌクレオチドリンカーを介して前記第１のユニバーサル配列の３’末端に連結される；
   （８）前記リバースプライマーが、前記第１のユニバーサル配列の５’末端に位置する追加配列を更に含む；
   （９）前記リバースプライマーが、５’から３’に、前記第１のユニバーサル配列とリバースヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、前記第１のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、リバースヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、追加配列と、前記第１のユニバーサル配列と、リバースヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；又は５’から３’に、追加配列と、前記第１のユニバーサル配列と、ヌクレオチドリンカーと、リバースヌクレオチド配列とを含むか、若しくはそれらからなる；
   （１０）前記リバースヌクレオチド配列が、１０ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔの長さを有する；
   （１１）前記リバースプライマーが、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～１１０ｎｔの長さを有する；
   （１２）前記リバースプライマー又はその任意の成分が、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれらからなる；
   （１３）前記第１のユニバーサル配列が、前記フォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない；並びに、
   （１４）前記第２のユニバーサル配列と前記第１のユニバーサル配列との間の相違が、前記第１のユニバーサル配列の３’末端の１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含むか、又は相違がそこにある、
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記方法が、以下：
   （１）前記ヌクレオチドリンカーが、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチドを含む；
   （２）前記追加配列が、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチドを含む；
   （３）前記天然に存在するヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである；及び、
   （４）前記第１のユニバーサル配列の３’末端にある１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個又はそれ以上のヌクレオチドが、前記フォワードプライマーの相補配列に相補的ではない；
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記方法が、以下：
   （１）前記試料がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組合せを含む；
   （２）増幅される前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組合せである；
   （３）増幅される前記標的核酸が一本鎖又は二本鎖である；及び、
   （４）前記試料又は標的核酸が、原核生物、真核生物又はウイルス又はウイロイドから得られる、
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１に記載の方法。
8. 前記方法が、以下：
   （１）前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである；
   （２）前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである；
   （３）前記真核生物が原生動物、寄生虫、真菌、酵母、植物、及び動物から選択される；
   （４）前記真核生物が、哺乳動物である；
   （５）前記真核生物が、ヒトである；並びに
   （６）前記ウイルスが、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＥＢウイルス、肝炎ウイルス、及びポリオウイルスから選択される；
   から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項７に記載の方法。
9. 前記方法の工程（１）及び工程（２）が、以下の工程（ａ）～工程（ｆ）：
   （ａ）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸についての標的特異的プライマー対を提供する工程であって、
   前記ユニバーサルプライマー及び前記標的特異的プライマー対が、請求項１に定義される通りである工程と、
   （ｂ）前記試料を前記ユニバーサルプライマー及び前記標的特異的プライマー対と、核酸ポリメラーゼと混合する工程と、
   （ｃ）核酸変性が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
   （ｄ）核酸アニーリング又はハイブリダイゼーションが可能な条件下で、前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
   （ｅ）核酸伸長が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
   （ｆ）工程（ｃ）～工程（ｅ）を繰り返さないか、又は１回以上繰り返す工程と、
   を含むプロトコルによって行われる、請求項１に記載の方法。
10. 前記方法が、以下：
    （１）工程（ｃ）において、工程（ｂ）の生成物を８０℃～１０５℃の温度でインキュベートし、それによって前記核酸変性を可能にする；
    （２）工程（ｃ）において、工程（ｂ）の生成物を１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、又は２分～５分間インキュベートする；
    （３）工程（ｄ）において、工程（ｃ）の生成物を３５℃～４０℃、４０℃～４５℃、４５℃～５０℃、５０℃～５５℃、５５℃～６０℃、６０℃～６５℃、又は６５℃～７０℃の温度でインキュベートし、それによって前記核酸アニーリング又はハイブリダイゼーションを可能にする；
    （４）工程（ｄ）において、工程（ｃ）の生成物を１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、又は２分～５分間インキュベートする；
    （５）工程（ｅ）において、工程（ｄ）の生成物を３５℃～４０℃、４０℃～４５℃、４５℃～５０℃、５０℃～５５℃、５５℃～６０℃、６０℃～６５℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、７５℃～８０℃、８０℃～８５℃の温度でインキュベートし、それによって前記核酸伸長を可能にする；
    （６）工程（ｅ）において、工程（ｄ）の生成物を１０秒～２０秒、２０秒～４０秒、４０秒～６０秒、１分～２分、２分～５分、５分～１０分、１０分～２０分又は２０分～３０分間インキュベートする；
    （７）工程（ｄ）及び工程（ｅ）を同じ温度又は異なる温度で実施する；及び、
    （８）工程（ｃ）～工程（ｅ）を少なくとも１回繰り返し、任意に、工程（ｃ）～工程（ｅ）を１回以上繰り返す場合、各サイクルの工程（ｃ）～工程（ｅ）で使用される条件が独立して同一又は異なる、
    から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記試料中の１つ以上の標的核酸を検出する方法であって、（ｉ）請求項１０に記載の方法を使用して、前記試料中の１つ以上の標的核酸を増幅する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物に対して融解曲線分析を実施する工程とを含む、方法。
12. 前記方法が、
    （１）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸に対して標的特異的プライマー対及び検出プローブを提供する工程であって、
    前記ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、前記第１のユニバーサル配列が、前記ユニバーサルプライマーの３’部分に位置するか、又は前記ユニバーサルプライマーの３’部分を構成し、
    前記標的特異的プライマー対が前記標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、第２のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、前記フォワードヌクレオチド配列が前記第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記フォワードヌクレオチド配列が、前記フォワードプライマーの３’部分に位置するか、又は前記フォワードプライマーの３’部分を構成し、前記リバースプライマーが、前記第１のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、前記リバースヌクレオチド配列が前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記リバースヌクレオチド配列が、前記リバースプライマーの３’部分に位置するか、又は前記リバースプライマーの３’部分を構成し、核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、前記第１のユニバーサル配列が前記第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、前記第２のユニバーサル配列と前記第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が、前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、前記第１のユニバーサル配列が前記フォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではなく、
    前記検出プローブが、前記標的核酸に特異的なプローブヌクレオチド配列を含み、レポーター基及びクエンチャー基で標識され、前記レポーター基がシグナルを放出することができ、前記クエンチャー基が、前記レポーター基によって放出されたシグナルを吸収又は消光することができ、前記検出プローブがその相補配列にハイブリダイズするときに放出されるシグナルが、その相補配列にハイブリダイズされていない場合に放出されるシグナルとは異なる工程と、
    （２）核酸増幅が可能な条件下で、前記ユニバーサルプライマー及び前記標的特異的プライマー対を使用して、ＰＣＲ反応を介して前記試料中の前記標的核酸を増幅する工程と、
    （３）前記検出プローブを使用して工程（２）の生成物に対して融解曲線分析を実施し、前記融解曲線分析の結果に従って前記標的核酸が前記試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法が、以下：
    （１）前記ユニバーサルプライマーが請求項４に定義される通りである；
    （２）前記標的特異的プライマー対が請求項５に定義される通りである；
    （３）工程（２）において、前記試料を前記ユニバーサルプライマー、前記標的特異的プライマー対、及び前記核酸ポリメラーゼと混合し、ＰＣＲ反応を実施し、次いで、前記ＰＣＲ反応が完了した後、前記検出プローブを工程（２）の生成物に追加し、前記融解曲線分析を実施するか、又は工程（２）において、前記試料を前記ユニバーサルプライマー、前記標的特異的プライマー対及び前記検出プローブと、前記核酸ポリメラーゼと混合し、ＰＣＲ反応を実施し、次いで、前記ＰＣＲ反応が完了した後、前記融解曲線分析を実施する；
    （４）前記検出プローブが、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれらからなる；
    （５）前記検出プローブが、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、９０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～２００ｎｔ、２００ｎｔ～３００ｎｔ、３００ｎｔ～４００ｎｔ、４００ｎｔ～５００ｎｔ、５００ｎｔ～６００ｎｔ、６００ｎｔ～７００ｎｔ、７００ｎｔ～８００ｎｔ、８００ｎｔ～９００ｎｔ、９００ｎｔ～１０００ｎｔの長さを有する；
    （６）前記検出プローブが３’－ＯＨ末端を有するか、又は前記検出プローブの３’末端がブロックされている；
    （７）前記検出プローブが自己消光プローブである；
    （８）前記検出プローブの前記レポーター基が蛍光基であり、前記クエンチャー基が前記蛍光を吸収／消光することができる分子又は基である；
    （９）前記検出プローブが、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を有する；
    （１０）前記検出プローブが直鎖状であるか又はヘアピン構造である；
    （１１）前記検出プローブのそれぞれが、独立して、同一又は異なるレポーター基を有する；
    （１２）工程（３）において、温度の変化に応じて変動する各レポーター基のシグナル強度の曲線を得るため、工程（２）の生成物を徐々に加熱又は冷却し、各検出プローブのレポーター基によって放出されるシグナルをリアルタイムで監視し、次いで、前記曲線を微分して、工程（２）の生成物の融解曲線を取得する；及び、
    （１３）前記融解曲線の融解ピーク（融点）に応じて、融解ピーク（融点）に対応する前記標的核酸の存在を判断する；
    から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記方法の工程（１）～工程（３）が、以下の工程（ａ）～工程（ｇ）：
    （ａ）１つ以上の標的核酸を含む試料を提供し、ユニバーサルプライマーを提供するとともに、増幅される各標的核酸に対して標的特異的プライマー対及び検出プローブを提供する工程であって、
    前記ユニバーサルプライマー、前記標的特異的プライマー対、及び前記検出プローブが請求項１２に定義される通りである工程と；
    （ｂ）前記試料を前記ユニバーサルプライマー、前記標的特異的プライマー対及び前記検出プローブと、核酸ポリメラーゼと混合する工程と、
    （ｃ）核酸変性が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
    （ｄ）核酸のアニーリング又はハイブリダイゼーションが可能な条件下で、前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
    （ｅ）核酸伸長が可能な条件下で前の工程の生成物をインキュベートする工程と、
    （ｆ）工程（ｃ）～工程（ｅ）を繰り返さないか、又は１回以上繰り返す工程と、
    （ｇ）前の工程の生成物に対して融解曲線分析を実施する工程と、
    を含むプロトコルによって行われる、請求項１２に記載の方法。
15. 前記方法が、以下：
    （１）前記天然に存在するヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである；
    （２）非天然ヌクレオチドが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロック核酸である；
    （３）前記検出プローブの３’末端が、前記検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨに化学部分を付加することによって、前記検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨを除去することによって、又は最後のヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドに置き換えることによってブロックされている；
    （４）前記検出プローブの３’末端が、前記検出プローブの最後のヌクレオチドの３’－ＯＨにビオチン又はアルキルを付加することによってブロックされている；
    （５）前記レポーター基と前記クエンチャー基の距離が１０ｎｔ～８０ｎｔ以上離れている；
    （６）前記レポーター基がＡＬＥＸ－３５０、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（商標） Ｇｏｌｄ ５４０、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＴＡＭＲＡ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＲＯＸ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、テキサスレッド、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ ６７０、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５、Ｑｕａｓａｒ ７０５から選択される；
    （７）前記クエンチャー基が、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ、ＥＣＬＩＰＳＥ、及び／又はＴＡＭＲＡから選択される；
    （８）前記検出プローブが、５’ヌクレアーゼ活性に対する耐性を有する；
    （９）前記検出プローブが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を有する；
    （１０）前記検出プローブが、ヌクレアーゼ活性に抵抗するための修飾を含む骨格を有する；
    （１１）前記検出プローブが、ホスホロチオエートエステル結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネートエステル結合、アリールホスホネートエステル結合、水素化リン酸エステル結合、アルキルホスホルアミデートエステル結合、アリールホスホルアミデートエステル結合、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾、２’－Ｏ－アルキル修飾、２’－Ｏ－アリル修飾、２’－Ｏ－ブチル修飾、及び１－（４’－チオ－ＰＤ－リボフラノシル）修飾から選択される修飾を含む骨格を有する；
    （１２）前記検出プローブが、その５’末端若しくは上流においてレポーター基で標識され、かつその３’末端若しくは下流においてクエンチャー基で標識される；並びに、
    （１３）前記検出プローブが同一のレポーター基を有し、工程（２）の生成物を融解曲線分析に供し、次いで、前記融解曲線の融解ピークに従って前記標的核酸の存在を判断するか、又は前記検出プローブが異なるレポーター基を有し、工程（２）の生成物を融解曲線分析に供し、次いで、前記レポーター基のシグナルタイプと前記融解曲線の融解ピークに従って、前記標的核酸の存在を判断する；
    から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１３に記載の方法。
16. プライマーセットであって、ユニバーサルプライマーと、１つ以上の標的特異的プライマー対とを含み、
    前記ユニバーサルプライマーが第１のユニバーサル配列を含み、前記第１のユニバーサル配列が、前記ユニバーサルプライマーの３’部分に位置するか、又は前記ユニバーサルプライマーの３’部分を構成し、
    各標的特異的プライマー対が標的核酸を増幅することができ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、
    前記フォワードプライマーが第２のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なフォワードヌクレオチド配列とを含み、前記フォワードヌクレオチド配列が前記第２のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記フォワードヌクレオチド配列が、前記フォワードプライマーの３’部分に位置するか、又は前記フォワードプライマーの３’部分を構成し、
    前記リバースプライマーが前記第１のユニバーサル配列と、前記標的核酸に特異的なリバースヌクレオチド配列とを含み、前記リバースヌクレオチド配列が前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置し、前記リバースヌクレオチド配列が、前記リバースプライマーの３’部分に位置するか、又は前記リバースプライマーの３’部分を構成し、
    核酸のハイブリダイゼーション又はアニーリングが可能な条件下で、前記第１のユニバーサル配列が、前記第２のユニバーサル配列の相補配列にハイブリダイズ又はアニーリングすることが可能であり、前記第２のユニバーサル配列と前記第１のユニバーサル配列との間に相違があり、その相違が前記第１のユニバーサル配列の３’末端に位置する１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ独立して欠失又は置換されていることを含み、前記第１のユニバーサル配列が前記フォワードプライマーの相補配列と完全に相補的ではない、プライマーセット。
17. 前記プライマーセットが、以下：
    （１）該プライマーセットが、１個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～５０個又はそれ以上の標的特異的プライマー対を含む；
    （２）前記ユニバーサルプライマーが請求項４に定義される通りである；及び、
    （３）前記標的特異的プライマー対が請求項５に定義される通りである；
    から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１６に記載のプライマーセット。
18. 請求項１６に記載のプライマーセットと、核酸ポリメラーゼ、核酸増幅用試薬、シーケンシング用試薬、遺伝子チップ検出用試薬、融解曲線分析用試薬、又はこれらの任意の組合せから選択される１つ以上の構成要素とを含むキット。
19. 前記キットが、以下：
    （１）前記核酸ポリメラーゼが、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼである；
    （２）前記核酸増幅用試薬が、酵素用の作用バッファー、ｄＮＴＰ、水、イオンを含有する溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、又はそれらの任意の組合せを含む；
    （３）前記シーケンシング用試薬が、酵素用の作用バッファー、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、水、イオンを含有する溶液、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、リガーゼ、核酸リンカー、シーケンシングプライマー、又はそれらの任意の組合せを含む；
    （４）前記遺伝子チップ検出用試薬が、酵素用の作用バッファー、ｄＮＴＰ、水、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、標識試薬、又はこれらの任意の組合せを含む；及び、
    （５）前記融解曲線分析用試薬が検出プローブを含む、
    から選択される１つ以上の技術的特徴を有する、請求項１８に記載のキット。