JP7709178B2

JP7709178B2 - リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後予測方法

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Publication number: JP7709178B2
Application number: JP2023566393A
Authority: JP
Inventors: 淳平山▲崎▼
Original assignee: Hokkaido University NUC; Anicom Holdings Inc
Current assignee: Hokkaido University NUC; Anicom Holdings Inc
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2025-07-16
Anticipated expiration: 2042-12-09
Also published as: JPWO2023106415A1; WO2023106415A1; EP4446425A1; EP4446425A4

Description

本発明は、リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する方法に関する。
本願は、２０２１年１２月９日にアメリカ合衆国に出願された６３／２８７，５３４号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。

獣医臨床において、犬のリンパ腫は、発生頻度が高い重要な疾患である。具体的には、犬のリンパ腫の発生率は１０７／１００，０００ｄｏｇ－ｙｅａｒｓであり、ヒトと比べて５倍以上も高い。好発犬種として、ゴールデンレトリーバーやボクサーがあげられる。犬のリンパ腫は、全腫瘍の２４％、血液腫瘍の＞８０％を占める。犬のリンパ腫では、治療を行わない場合、多くは３か月以内に死亡するが、大部分は、現在の多剤併用化学療法の発展により、臨床的寛解へと達することができる。

犬の悪性リンパ腫の代表的な化学療法として、ＣＨＯＰ（チョップ）療法が挙げられる。ＣＨＯＰ療法は、３種類の抗がん剤（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）に副腎皮質ホルモン（プレドニゾロン）を組み合わせた治療である。特に、ウィスコンシン大学（ＵＷ）プロトコールと呼ばれるリンパ腫に対する現在最も標準的とされるプロトコールが使用されており、当該プロトコールでは、初めの２ヶ月は毎週、その後４ヶ月は２週に１回の治療を行う、つまり、全部で６ヶ月間の治療である。犬のリンパ腫は、ＣＨＯＰ療法に良好に反応する。ただし、化学療法で臨床的寛解となっても、最終的には再発を免れずに死に至る状況にあり、寛解率は＞８５％、中央生存期間は１年間とされている。通常は、治療終了後３～４ヶ月で再燃し、１年生存率５０％、２年生存率２０％、３年生存率１０％弱である。

現在、犬のリンパ腫における予後因子としては、解剖学的発生部位やリンパ球の表現型、臨床ステージなどの大まかな分類によるものの報告が主である。犬のリンパ腫における予後因子として報告されているものを表１に示す。

これらの予後因子は、犬の様々なリンパ腫全てにおける予後因子である場合もあり、各タイプのリンパ腫をさらに細分化する予後パラメータに乏しい。例えば、多中心型リンパ腫という均一な集団における予後因子は、未だ確立されていない。この背景として、多中心型リンパ腫の発生メカニズムや治療反応メカニズムの解明がなされていないことが挙げられる。

ＣｐＧ配列（Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が連続する塩基配列）は、その単純な確率よりも出現頻度は低く、その多くがメチル化されている。ＤＮＡメチル化とは、シトシンの５位への炭素のメチル基転移の修飾である。ＣｐＧが密に存在する場所はＣｐＧアイランドと呼ばれており、哺乳類の遺伝子の約半数がプロモーター領域にＣｐＧアイランドを持つと考えられている。プロモーター領域のＣｐＧアイランド中のシトシンのメチル化は、プロモーター領域のクロマチン構造の変化をもたらすことにより、近傍遺伝子の遺伝子発現の低下と相関する。正常な細胞におけるゲノムでは、プロモーター領域のＣｐＧアイランドではメチル化が起こっていないことが多いが、腫瘍細胞ではこれらの性質が劇的に変化し、ＣｐＧアイランドではメチル化の増加、Ｎｏｎ－ＣｐＧアイランドでは逆にメチル化の減少（メチル化率の低下）が多く見受けられることが知られている。すなわち、ＤＮＡメチル化は、腫瘍の発症やその悪性度のバイオマーカーとなり得る。

イヌのリンパ腫においても、異常なＤＮＡメチル化が報告されている。例えば、ゲノム全体のメチル化量の定量値が、健常な細胞よりも少ないことが報告されている（非特許文献１）。また、ＦＨＩＴ遺伝子（非特許文献２）、ＤＬＣ１遺伝子（非特許文献３）、ＴＦＰＩ－２遺伝子（非特許文献４）、ＡＢＣＢ１遺伝子（非特許文献５）、ｐ１６遺伝子（非特許文献６）及びＤＡＰＫ１遺伝子（非特許文献７）のＤＮＡメチル化率も、リンパ腫においてメチル化量の定量値が、健常な細胞と異なっていることが報告されている。しかしながら、これらのＤＮＡメチル化には、リンパ腫の化学療法の予後との関連を示す明確なものはない。

Pelham et al., Research in Veterinary Science, 2003, vol.74, p.101-104. Hiraoka et al., Journal of Veterinary Medical Science, 2009, vol.71(6) p.769-777. Bryan et al., BMC Genetics, 2009, 10:73. Ferraresso et al., PLOS ONE, 2014, vol.9(4), e92707. Tomiyasu et al., The Veterinary Journal, 2014, vol.199, p.103-109. Fujiwara-Igarashi et al., Research in Veterinary Science, 2014, vol.97, p.60-63. Sato et al., Veterinary and Comparative Oncology, 2018, vol.16, p.409-415. Yamazaki et al., Veterinary Journal, 2018, vol.231, p.48-54.

本発明は、リンパ腫に罹患したイヌについて、化学療法後の予後が良好であるか否かの可能性を予測する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、犬の多中心型リンパ腫症例について、ＤＮＡメチル化変化部位を定量解析したところ、化学療法後の予後が良好であった群と予後が不良であった群においてメチル化率に顕著な差がある２種のＣｐＧサイトを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する方法であって、
予測対象のイヌから採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２からなる群より選択される１種以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値に基づいて、前記リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する予測工程と、
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、化学療法後の予後が良好であったイヌと、化学療法後の予後が不良であったイヌとを識別するための値である、
リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後予測方法。
［２］前記リンパ腫が、多中心型である、前記［１］の予後予測方法。
［３］前記リンパ腫のサブステージが、ａ又はｂである、前記［２］の予後予測方法。
［４］前記化学療法が、ＣＨＯＰ療法である、前記［１］～［３］のいずれかの予後予測方法。
［５］前記予測工程において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、前記リンパ腫に罹患したイヌが前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する、前記［１］～［４］のいずれかの予後予測方法。
［６］前記予め設定された基準値が４５％である、前記［５］の予後予測方法。
［７］前記予測工程において、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、前記リンパ腫に罹患したイヌが前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する、前記［１］～［６］のいずれかの予後予測方法。
［８］前記予め設定された基準値が１０％である、前記［７］の予後予測方法。
［９］前記測定工程において、前記ＣｐＧサイトのメチル化率の測定を、バイサルファイトパイロシークエンス法により行う、前記［１］～［８］のいずれかの予後予測方法。

本発明に係るリンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後予測方法により、被検動物であるリンパ腫に罹患したイヌから採取された生体試料について、ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧサイトのメチル化率を調べることによって、化学療法後の予後を予測することができる。

図１は、実施例１において、イヌＤＬＢＣＬ２４症例におけるゲノムワイドなＤＮＡメチル化解析を行い、予後不良群でメチル化が高いＣｐＧサイトとして同定された４５のＣｐＧサイトの正常血液でのメチル化率（％）をＸ軸に、予後良好群及び予後不良群のメチル化率（％）をＹ軸にプロットした図である。図２Ａは、実施例２において、イヌＤＬＢＣＬ１４症例におけるバイサルファイトパイロシークエンスにより求めたＣｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率（％）を示した図である。４３％を境界値として、高メチル化群とメチル化群に分類した。図２Ｂは、実施例２において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３の高メチル化群と低メチル化群の生存曲線を示した図である。図２Ｃは、実施例２において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３の高メチル化群と低メチル化群の無増悪期間曲線を示した図である。図３Ａは、実施例３において、イヌＤＬＢＣＬ９６症例のＣｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率（％）を示した図である。図３Ｂは、実施例３において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２の高メチル化群と低メチル化群の生存曲線を示した図である。図４Ａは、実施例３において、イヌＤＬＢＣＬ９６症例のうち、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２が両方とも低メチル化群である群（低メチル化群１）と、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２のいずれか一方が低メチル化群で、他方が高メチル化群である群（低メチル化群２）と、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２が両方とも高メチル化群である群（高メチル化群）の生存曲線を示した図である。図４Ｂは、実施例３において、低メチル化群１と低メチル化群２における、寛解した症例と寛解していない（非寛解）症例が、全症例数（９６症例）に占める割合（％）を示した図である。

ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトのシトシン塩基は、５位の炭素がメチル化修飾を受け得る。本発明及び本願明細書において、ＣｐＧサイトのメチル化率とは、一つの生物個体から採取された生体試料中のＣｐＧサイトのうち、メチル化されているシトシン塩基（メチル化シトシン）量とメチル化されていないシトシン塩基（非メチル化シトシン）量とを測定し、両者の和に対するメチル化シトシン量の割合（％）を意味する。

本発明に係るリンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後予測方法（以下、「本発明に係る予後予測方法」ということがある。）は、リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する方法であって、下記の測定工程と予測工程を有する。
予測対象のイヌから採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２からなる群より選択される１種以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値に基づいて、前記リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する予測工程。

本発明に係る予後予測方法は、犬の多中心型リンパ腫症例の予後と相関するＤＮＡメチル化変化部位を特定し、これをバイオマーカーとして、当該ＤＮＡメチル化変化部位のメチル化率の定量解析によって、化学療法の予後を予測する方法である。当該方法を、リンパ腫の診断時、又は診断後化学療法開始前に実施することにより、診断時に化学療法の予後良好群を特定することができる。

本発明に係る予後予測方法において、予後予測する対象のリンパ腫は、リンパ球細胞のいずれかが腫瘍化した疾患であればよく、特に限定されるものではない。イヌのリンパ腫としては、例えば、体表にあるリンパ節が腫大する多中心型リンパ腫、消化器やこれに付随するリンパ節が腫大する消化器型リンパ腫、胸腺や縦隔が腫大する胸腺型（縦隔型）リンパ腫、皮膚や口腔粘膜が腫大する皮膚型リンパ腫、これら以外の生体部位が腫大する節外型リンパ腫等が挙げられる。本発明に係る予後予測方法において、予後予測する対象のリンパ腫としては、イヌのリンパ腫の８割を占める多中心型リンパ腫が好ましい。多中心型リンパ腫は、主に、下顎リンパ節、浅頸リンパ節、腋窩リンパ節、膝窩リンパ節が腫大するが、本発明に係る予後予測方法における予測対象の多中心型リンパ腫は、いずれのリンパ節が腫大するものであってもよい。また、本発明に係る予後予測方法における予測対象のリンパ腫は、原発性であってもよく、転移性であってもよい。

本発明に係る予後予測方法において、予後予測する対象のリンパ腫の悪性度は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係る予後予測方法は、サブステージがａ（臨床兆候が見られない状態）であるリンパ腫に罹患した被験イヌの化学療法の予後予測をしてもよく、サブステージがｂ（明らかな臨床兆候が見られる状態）であるリンパ腫に罹患した被験イヌの化学療法の予後予測をしてもよい。

本発明に係る予後予測方法において、予後予測する対象の化学療法は、リンパ腫に罹患したイヌに対してなされる化学療法であれば、特に限定されるものではない。本発明においては、リンパ腫に罹患したイヌの標準的な化学療法であることから、ＣＨＯＰ療法の予後予測を行うことが好ましい。ＣＨＯＰ療法は、常法により行うことができる（＜on line＞ https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/chop-regimen）。

本発明に係る予後予測方法において、予測対象のイヌ（被験イヌ）の犬種は、特に限定されるものではない。被験イヌの犬種としては、例えば、アメリカンコッカースパニエル、ウェルシュコーギーペンブローク、エアデールテリア、キャバリアキングチャールズスパニエル、ゴールデンレトリーバー、シーズー、ジャーマンシェパード、ジャックラッセルテリア、スタンダードプードル、スピッツ、チャイニーズクレステッドドッグ、チワワ、トイプードル、バーニーズマウンテンドッグ、バセンジー、ビーグル、ブルテリア、フレンチブルドッグ、ボクサー、ボーダーコリー、ポメラニアン、マスチフ、マルチーズ、ミニチュアシュナウザー、ミニチュアダックスフンド、ミニチュアピンシャー、ヨークシャーテリア、ラブラドールレトリバー、ワイヤーヘアードフォックステリア、柴等が挙げられる。また、雑種でもよい。本発明に係る予後予測方法における被験イヌとしては、リンパ腫の好発犬種である、ゴールデンレトリーバーやボクサー等が好ましい。

測定工程においては、被験イヌから採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２からなる群より選択される１種以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する。すなわち、本発明においては、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２の少なくとも一方のＣｐＧサイトのメチル化率を、リンパ腫罹患イヌの化学療法の予後に対するバイオマーカーとする。各ＣｐＧサイトの塩基配列を表２に示す。表の塩基配列中、下線が引かれたシトシンが、対象のＣｐＧサイトである。

Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２は、いずれも、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が、リンパ腫に罹患して化学療法がなされたイヌのうち、化学療法後の予後が良好であったイヌ群と、化学療法後の予後が不良であったイヌ群とで、有意差があったものである。

本発明に係る予後予測方法に供される生体試料は、被験イヌから採取された生体試料であって、当該被験イヌのゲノムＤＮＡが含まれているものであれば特に限定されるものではなく、リンパ液、血液、血漿、血清、涙液、唾液等であってもよく、消化管粘膜や、肝臓等のその他の組織から採取された組織片であってもよい。本発明に係る予後予測方法に供される生体試料としては、リンパ腫の状態をより強く反映していることから、リンパ液であることが好ましく、腫大しているリンパ節から採取されたリンパ液であることがより好ましい。その他、低侵襲であり被験イヌへの負担が抑えられる点から、血液、血漿、血清、涙液、唾液等であることも好ましい。前記リンパ液などの体液や組織片等の生体試料を採取する場合、それぞれの生体試料に応じた採取具を用いて採取すればよい。

また、当該生体試料は、ＤＮＡが抽出可能な状態であればよく、各種前処理が施されているものであってもよい。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよい。生体試料からのＤＮＡの抽出は常法により行うことができ、各種市販のＤＮＡ抽出・精製キットを使用することもできる。

ＣｐＧサイトのメチル化率を測定する方法としては、特定のＣｐＧサイトについてメチル化シトシン塩基とメチル化されていないシトシン塩基を区別して定量可能な方法であれば、特に限定されるものではない。当該技術分野において公知の方法をそのまま又は必要に応じて適宜改変することによりＣｐＧサイトのメチル化率を測定できる。ＣｐＧサイトのメチル化率の測定方法としては、例えば、バイサルファイトシークエンス法や、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ：Methylation Specific polymerase chain reaction）等が挙げられる。

本発明に係る予後予測方法では、予測工程として、前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値に基づいて、前記リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する。当該基準値は、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２の各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、化学療法後の予後が良好であったイヌと、化学療法後の予後が不良であったイヌとを識別するための値である。各ＣｐＧサイトのメチル化率が基準値以下のイヌを低メチル化群、基準値超のイヌを高メチル化群ということがある。

本発明に係る予後予測方法では、前記予測工程において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、被験イヌは、低メチル化群であり、前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する。同様に、前記予測工程において、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、被験イヌは、低メチル化群であり、前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する。

各ＣｐＧサイトのメチル化率の基準値は、例えば、リンパ腫に罹患しており、化学療法が施されたイヌのうち、少なくとも一度は寛解して予後が良好であった群のバイオマーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率と、一度も寛解せず予後が不良であった群の当該ＣｐＧサイトのメチル化率とを比較し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。

例えば、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率の基準値としては、２５～５５％の範囲内で設定することができる。例えば、当該基準値を４５％とした場合、被験イヌのＣｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が４５％以下である場合に、当該被験イヌが化学療法を受けた場合に予後は良好である可能性が高いと判定する。被験イヌのＣｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が４５％超である場合に、当該被験イヌが化学療法を受けた場合に予後は良好でない可能性が高いと判定する。

例えば、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率の基準値としては、５～３０％の範囲内で設定することができる。例えば、当該基準値を１０％とした場合、被験イヌのＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が１０％以下である場合に、当該被験イヌが化学療法を受けた場合に予後は良好である可能性が高いと判定する。被験イヌのＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が１０％超である場合に、当該被験イヌが化学療法を受けた場合に予後は良好でない可能性が高いと判定する。

本発明に係る予後予測方法の予測工程においては、被験イヌの化学療法の予後について、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率のみから予測してもよく、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率のみから予測してもよいが、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率とＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率の両方に基づいて予測するほうが、より信頼性の高い予測が可能となる。例えば、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が基準値超であり、かつＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が基準値超である場合、当該被験イヌは化学療法を行っても予後は不良となると予測される。また、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が基準値以下であり、かつＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が基準値以下である場合、当該被験イヌは化学療法を行っても予後は良好になると予測される。

本発明に係る予後予測方法は、獣医師による、リンパ腫に罹患したイヌに対して化学療法を行うかどうかの判断を補助するための重要な情報を提供することができる。このため、本発明に係る予後予測方法を、リンパ腫に罹患しているイヌに対して、化学療法を行う前に行うことが好ましい。本発明に係る予後予測方法によって予後が良好であると予測された被験イヌに対しては化学療法を行い、予後が不良であると予測された被験イヌに対しては化学療法を行わないことで、治療効率をより高めることができる。

次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１］
本発明の発明者自身が樹立したＤＮＡメチル化のゲノムワイドな解析法であるＣａｎｉｎｅＤＲＥＡＭ（非特許文献８）によって、プロモーター領域だけではなく、遺伝子内のエクソンやイントロン、遺伝子外部分のＣｐＧサイトをも含むイヌゲノムにおける網羅的かつ多数（約１００，０００）のＣｐＧ配列の解析を、犬の多中心型リンパ腫２４症例を対象に行ったところ、予後良好群と予後不良群を識別することが可能なＣｐＧ配列を２箇所特定した（Test cohort）。

（１）被験イヌ
自然発症イヌ多中心型高悪性度リンパ腫（ＭＨＧＬ）の２４症例を被験イヌとした。ＭＨＧＬは、病理学専門医が細胞診検査の所見（高分裂速度及び中から大型細胞）に基づき診断し、ＷＨＯ家畜リンパ腫臨床グレーディングシステムよりグレーディングを行った。全ての症例は、最低限１回のＣＨＯＰ抗がん剤治療を治療された。

（２）ゲノムＤＮＡの抽出
ＤＮＡ抽出用キット「ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、各症例の細胞診検査スライドからゲノムＤＮＡを抽出した。

（３）イヌＤＲＥＡＭ法
ゲノムワイドＤＮＡメチル化は、次世代シークエンシングで解析を行った。サンプルから抽出したゲノムＤＮＡ（２μｇ）を２ｐｇの人工キャリブレータ（メチル化レベル０、２５、５０、７５、１００％）に混合した。得られた混合物を、１００ＵのＳｍａＩ酵素で２５℃、３時間を処理して切断させ、次いで５０ＵのＸｍａＩ酵素で３７℃、１６時間反応させた。切断されたＤＮＡは、磁力ビーズ「ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅＸＰ」（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で精製した。ＸｍａＩで切断されたＤＮＡの３’突出末端に、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＡＴＰを０．４ｍＭずつ加え、制限断片に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性欠乏ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で３’ｄＡ末端を添加した。

その後、イルミナＰａｉｒｅｄ－ｅｎｄシークエンシングアダプターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）にて結合させた。ライゲーションミックスのサイズは、ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅＸＰを用いてＤｕａｌ－ＳＰＲＩサイズセレクションを行い、２５０から４５０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片を抽出した。精製したＤＮＡは、イルミナｐａｉｒ－ｅｎｄＰＣＲプライマーとＫＡＰＡＨｉｆｉＨｏｔｓｔａｒｔＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、１１サイクル数にて増幅した。増幅したシークエンスライブラリーを前記磁力ビーズで精製し、イルミナＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）でシークエンスを行った。シークエンスしたリードを、犬のゲノム（ｃａｎＦａｍ３．１）のＳｍａＩ/ＸｍａＩサイトにマッピングし、ＳｍａＩ/ＸｍａＩサイトにおいてメチル化及び非メチル化ＣｐＧのシグネチャーを計算した。その後、単独のＳｍａＩ/ＸｍａＩサイトのメチル化頻度を計算した。メチル比はＣＣＧＧＧから始まるタグの数をＳｍａＩ/ＸｍａＩサイトにマップしたタグの総数を割った。

ＤＲＥＡＭによる計算されたメチル化レベルは、スタンダードのスパイクに基づいて補正した。スタンダード毎にログ比ｌｎ（ｍ/ｕ）とｌｎ（ｓｍ/ｕ）を計算し、ｍ/ｕは予想したメチル化と非メチル化比であり、ｓｍとｕはそれぞれ、観察したメチル化と非メチル化比である。スタンダード毎に「予測」から「観察」のログ比を引いて計算した。補正係数（ｃ）の計算は、ｌｏｇ（［予測］－［観察］)の平均のアンチログで行い、個々のＣｐＧサイトの補正したメチル値を、１００％ ×［ｃ×ｓｍ/（ｃ×［ｓｍ＋ｕ］）］で計算した。
最低限２０シークエンシングリードを用いて、単一のＳｍａＩ/ＸｍａＩサイトのメチル化レベルを解析した。

（４）統計学的解析
ゲノムワイドＤＮＡメチル化解析では、群の間のＤＮＡメチルレベルは、ｔ－ｔｅｓｔで解析した。多重検定の補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ―Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いてＦＤＲ１０％でメチル化差を確認した。Ｔｅｓｔｃｏｈｏｒｔの生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で描出した。ＭＨＧＬ症例においてＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化パターンが異なる症例群の平均生存期間を比較した。生存曲線間の有意差をｌｏｇｒａｎｋｔｅｓｔで比較した。ＭＨＧＬと関係のない死亡の症例、追跡不可能の症例又は生きている症例のデータを打ち切りして除外した。

対照として、３種の正常末梢血液由来のゲノムＤＮＡについても、同様にしてＣｐＧメチル化率を測定した。

（６）結果
本実験では、２４症例の全てのサンプルにおいて共通してデータの得られた４０，１２８個のＣｐＧサイトを解析に用いた。ＣｐＧアイランドにおける１６，９９２個のＣｐＧサイトを用いてクラスタリング解析を行ったところ、症例が複数群に分かれることが判明した。

この複数群について、生存曲線と寛解期間を描いたところ、各群で有意な差が得られた。これらの結果から、ＣｐＧアイランドのゲノムワイドＤＮＡメチル化パターンにより、化学療法の予後良好群が抽出されることが判明した。

次に、この予後良好群を規定するＣｐＧサイトを探索するために、ボルケーノプロット解析を行い、予後良好群、予後不良群の直接の比較を行った。ボルケーノプロット解析では、その検出力を上げるために、２４症例の８０％以上である２０症例以上において共通して比較解析が可能であったＣｐＧアイランド３８，６９３サイトにおける予後良好群９症例、その他予後不良群１５症例のそれぞれの平均をとり、その差とｐ値を示した。

２０％以上のメチル化の差、及び０．０１以下の統計的有意差を示したＣｐＧサイトの数は、予後不良群でメチル化が高いＣｐＧサイトが５２０個、予後良好群でメチル化が高いＣｐＧサイトが４１４個と、計９３４ＣｐＧサイトが同定された。これらのうち、近傍に遺伝子が存在し、そのプロモーター領域に存在すると考えられるＣｐＧサイトから関連遺伝子数を算出したところ、予後不良群でメチル化が高いＣｐＧサイトは４５遺伝子であるのに対し、逆の傾向を示すＣｐＧサイトが５遺伝子であり、予後不良群で高メチル化を示す遺伝子が多いことが判明した。

次に、この４５遺伝子及び４５ＣｐＧサイトの解析を行った。図１は、これら４５ＣｐＧサイトの正常血液でのメチル化率（％）をＸ軸に、予後良好群及び予後不良群のメチル化率（％）をＹ軸にプロットした図である。図１に示すように、これらのほとんどのＣｐＧサイトは、正常血液においてメチル化率が２０％以下と低く、予後良好群においてもほとんどが２０％以下だが、予後不良群だけが２０％を超え、一部は４０～６０％のメチル化率を示した。また、Ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ解析によって、これらの４５遺伝子の中には、ＢＭＰ、ＷＮＴなどのシグナル伝達及び分化成熟に重要な遺伝子が多いことが判明した（表３）。

［実施例２］
実施例１において化学療法の予後マーカーとして同定された候補ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化解析によって、新たな症例グループにおける予後の状態の予測が可能であるかを検討した。具体的には、実施例１と症例とは異なる１４症例の新たなＤＬＢＣＬ症例に対し、今度は局所解析に関して信頼性が高く、またＤＲＥＡＭに比べ安価かつ迅速、簡易な解析が可能なバイサルファイトパイロシークエンスを用いて解析した。対象ＣｐＧサイトとしては、実施例１のＤＲＥＡＭ解析によって、予後良好群と予後不良群のメチル化率の差及び有意差ともにトップランクのＣｐＧサイト（Ｃｈｒ４：２９５５９８９３）を選抜した。

図２Ａに、１４症例のＣｈｒ４：２９５５９８９３のバイサルファイトパイロシークエンスにより求めたメチル化率（％）を示した。ＤＲＥＡＭ解析における予後良好群のこのＣｐＧサイトの平均メチル化率＋ＳＤ値である４３％を境界値として、今回の１４症例を分類したところ、高メチル化群８例、低メチル化群６例に分けられた。次いで、高メチル化群と低メチル化群について、図２Ｂに生存曲線を、図２Ｃに無増悪期間曲線を描いた。この結果、生存期間、無増悪期間ともに予後良好群における低メチル化と相関することが再確認され、ＤＲＥＡＭ解析によって予後と関連するＣｐＧサイトの同定が可能であることが確認された。

［実施例３］
実施例１のイヌＤＲＥＡＭ法よりゲノムワイドＤＮＡメチル化解析から特定した、予後良好群と予後不良群のメチル化率の差及び有意差ともにトップランクの２個のＣｐＧサイトであるＣｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２について、確証実験として、犬の多中心型リンパ腫と診断された９６症例の細胞標本スライドからＤＮＡを抽出し、当該ＣｐＧ配列を対象にバイサルファイトパイロシークエンス法（バイサルファイト処理及びパイロシークエンシング法）を用いてＤＮＡメチル化レベルを定量した（Validation cohort）。

（１）被験イヌ
実施例１とは異なるＭＨＧＬの９６症例を被験イヌとした。ＭＨＧＬは、病理学専門医が細胞診検査の所見（高分裂速度及び中から大型細胞）に基づき診断し、ＷＨＯ家畜リンパ腫臨床グレーディングシステムよりグレーディングを行った。全ての症例は、最低限１回のＣＨＯＰ抗がん剤治療を治療された。

９６症例中、サブステージａ（臨床兆候が見られない状態）が６７症例（７０％）、サブステージｂ（明らかな臨床兆候が見られる状態）が２９症例（３０％）であった。また、被験イヌ９６症例の犬種を表４に示す。

（２）ゲノムＤＮＡの抽出
各症例の細胞診検査スライドからのゲノムＤＮＡの抽出は、実施例１と同様にして行った。

（３）バイサルファイト処理及びパイロシークエンシング
バイサルファイトパイロシークエンシング法により、特定したターゲットＣｐＧサイト（Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２）のＤＮＡメチル化率を、定量化して評価した。ゲノムＤＮＡを、「ＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＫｉｔ」（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、バイサルファイト処理を行った。次に、前記ターゲットＣｐＧサイトに特異的なプライマーを用いて、ｔｗｏ－ｓｔｅｐＰＣＲにより当該ＣｐＧサイトを含む領域を増幅した。ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率は、ＰＳＱ２４システムのＰｙｒｏ－ＧｏｌｄＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、パイロシークエンシングによってＤＮＡメチル化レベルのパーセンテージ（ＣｐＧメチル化率）を測定した。

（４）統計学的解析
ゲノムワイドＤＮＡメチル化解析では、群の間のＤＮＡメチルレベルは、ｔ－ｔｅｓｔで解析した。多重検定の補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ―Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いてＦＤＲ１０％でメチル化差を確認した。Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｃｏｈｏｒｔの生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で描出した。ＶａｌｉｄａｔｉｏｎｃｏｈｏｒｔのＭＨＧＬ症例において、特定したターゲットＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化パターンが異なる症例群の平均生存期間を比較した。生存曲線間の有意差をｌｏｇｒａｎｋｔｅｓｔで比較した。ＭＨＧＬと関係のない死亡の症例、追跡不可能の症例又は生きている症例のデータを打ち切りして除外した。

（５）結果
図３Ａに、９６症例のＣｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率（％）を示した。図３Ａに示すように、どちらのＣｐＧサイトも、ＤＮＡメチル化レベルは不均一性を示した（症例によって様々なＤＮＡメチル化レベルを示した）。また、両ＣｐＧサイトもＤＮＡメチル化レベルの測定に関する成功率は９７％以上であった。

図３Ａの結果から、便宜的に、高メチル化群と低メチル化群を分ける基準値を、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３は４５％、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２は１０％とし、高メチル化群と低メチル化群について、図３Ｂに生存曲線を描いた。この結果、両ＣｐＧサイトはいずれも、高メチル化群の予後が、低メチル化群に比較して悪いこと、言い換えると、低メチル化群のほうが予後が良好であることが示された。これらの結果は、実施例１及び２における結果とも一致していた。

また、図３Ａの結果を用いて、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２の両方のメチル化率を組み合わせて予後予測を行った。イヌＤＬＢＣＬ９６症例のうち、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２が両方とも低メチル化群である群（低メチル化群１）は１７症例であり、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２のいずれか一方が低メチル化群で、他方が高メチル化群である群（低メチル化群２）は７４症例であり、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２が両方とも高メチル化群である群（高メチル化群）は３１症例であった。Ｃｈｒ４：２９５５９８９３とＣｈｒ１：１４２３２６９２の少なくとも一方が低メチル化群である群のうち、両方が低メチル化群である低メチル化群１は１８％であり、８２％がいずれか一方のみが低メチル化群である低メチル化群２であった。

図４Ａに、低メチル化群１、低メチル化群２、及び高メチル化群の生存曲線を示した。低メチル化群１は、低メチル化群２や高メチル化群に比べて、格段に良好な予後を示した。低メチル化群１の２年生存率は５０％であり、現在の標準的な予後よりも大幅に良好な予後が見込めた。

図４Ｂに、低メチル化群１と低メチル化群２における、寛解した症例と寛解していない（非寛解）症例が、全症例数（９６症例）に占める割合（％）を示す。この結果、低メチル化群１では、１７症例（１８％）中１４症例（１５％）が寛解しており、８２％といった高い寛解率を示した。

本結果は、臨床的に応用が容易なリスク評価、予後判定、治療反応性の予測などバイオマーカーとしての有用性を示唆している。この際、個々の部位のＤＮＡメチル化解析において最も信頼性の高いパイロシークエンス法を用いることで、特定領域のＤＮＡメチル化解析を多数の症例サンプルに適用可能であった。このため、コストを抑えた疾患特異的ＤＮＡメチル化候補領域の検討が可能であり、多数の症例に対する普遍性を重点的に検証することが可能である。

Claims

リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する方法であって、
予測対象のイヌから採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３及びＣｈｒ１：１４２３２６９２からなる群より選択される１種以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値に基づいて、前記リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後を予測する予測工程と、
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、化学療法後の予後が良好であったイヌと、化学療法後の予後が不良であったイヌとを識別するための値である、
リンパ腫に罹患したイヌの化学療法後の予後予測方法。
前記リンパ腫が、多中心型である、請求項１に記載の予後予測方法。
前記リンパ腫のサブステージが、ａ又はｂである、請求項２に記載の予後予測方法。
前記化学療法が、ＣＨＯＰ療法である、請求項１に記載の予後予測方法。
前記予測工程において、Ｃｈｒ４：２９５５９８９３のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、前記リンパ腫に罹患したイヌが前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する、請求項１に記載の予後予測方法。
前記予め設定された基準値が４５％である、請求項５に記載の予後予測方法。
前記予測工程において、Ｃｈｒ１：１４２３２６９２のメチル化率が、予め設定された基準値以下である場合に、前記リンパ腫に罹患したイヌが前記化学療法を受けた後の予後は良好である可能性が高いと判定する、請求項１に記載の予後予測方法。
前記予め設定された基準値が１０％である、請求項７に記載の予後予測方法。
前記測定工程において、前記ＣｐＧサイトのメチル化率の測定を、バイサルファイトパイロシークエンス法により行う、請求項１に記載の予後予測方法。