JP7709703B2 - 膵臓がんの検出方法及び検出試薬 - Google Patents

Description

本発明は、組織因子経路インヒビター２（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２；ＴＦＰＩ２）を測定対象とする膵臓がんの検出方法及び検出試薬に関する。

膵臓がんは１年間で全世界約４５万人、日本約４万人の新規罹患者が発症している（ＧＬＯＢＯＣＡＮ２０１８）。膵臓がんの５年相対生存率は男性７．９％，女性７．５％、１０年相対生存率は男性４．６％，女性４．８％とされ、最も予後不良ながん種とされている。

代表的な膵臓がんマーカーであるＣＡ１９－９は膵臓がんや胆道がん等で陽性率が高く、化学療法の有効性評価や再発モニタリングに有用とされている。しかしながら、（１）早期ステージでの陽性率が低い、（２）大腸がん，肺がん，乳がん等でも陽性を示す、（３）Ｌｅｗｉｓ陰性血液型の患者では検出不能、（４）胆道閉塞，胆管炎，肝硬変や糖尿病等でも上昇することが課題とされている。他の膵がんバイオマーカーとしてはＤＵＰＡＮ－２、ＳＰａｎ－１等があり、ＤＵＰＡＮ－２はＬｅｗｉｓ式血液型抗原陰性によるＣＡ１９－９偽陰性例に有用とされるが、いずれのマーカーも早期膵がんの検出性能は低く、膵がん診療に資する新規バイオマーカーの開発が切望されている。

アポリポプロテインＡ２（ａｐｏＡ２）アイソフォームは健常者に比べ早期膵がん患者で血中量が低下していることが確認され、ＣＡ１９－９と比べて高い精度でＩ期、ＩＩ期膵がんを検出できる可能性が報告されており（非特許文献１）、臨床応用に向けた大規模臨床研究が進められている。
組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、３つのクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含む胎盤由来セリンプロテアーゼインヒビターである。ＴＦＰＩ２は卵巣がん細胞株において明細胞がん細胞株から特異的に産生され、卵巣がん患者組織における遺伝子発現は明細胞がん患者のみで特異的に亢進することを明らかにし（特許文献１）、血中ＴＦＰＩ２の測定により卵巣明細胞がんを検出する方法を開示した（特許文献２および３、非特許文献２および３）。また検体中のＴＦＰＩ２量を測定することにより、腎癌を検出する方法が開示されている（特許文献４）。

ＴＦＰＩ２は多くのがん種でＴＦＰＩ２ ＤＮＡプロモーターにメチル化修飾を受けていることが明らかとなり、メチル化修飾を指標とした遺伝子診断ターゲットとしての臨床研究が進められている（非特許文献４～７）。膵がんにおいては様々な膵がん細胞株におけるＴＦＰＩ２ ＤＮＡプロモーターのメチル化修飾を調べた結果、細胞株によって完全なメチル化、部分的なメチル化あるいは非メチル化修飾を受けており、膵がん組織においてもＴＦＰＩ２ ＤＮＡプロモーターはメチル化と非メチル化が混在していることが示されている（非特許文献８）。しかし今日まで、体液中のＴＦＰＩ２タンパク質が膵がん検出に適用できるかは不明であった。

特許第５２２４３０９号公報 特許第６０７４６７６号公報 国際公開第２０１６／０８４９１２号パンフレット 国際公開第２０１９／１４２６３６号パンフレット

Ｈｏｎｄａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ， ５， １５９２１． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．， ２０１３， １２ （１０）， ｐｐ ４３４０－４３５０ ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１．１０ （２０１６）： ｅ０１６５６０９． Ｔａｋａｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９７（１）， １６（２０１０） Ｈｉｂｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３０（４）， １２０５（２０１０） Ｓｕｎ， Ｆ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ５８（４）， １０１０（２０１３） Ｎｉｇｒｏ， Ｃ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， １３３（５）， １２７８（２０１３）． Ｓａｔｏ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２４．５，（２００５）：８５０．

本発明は、膵臓がんの検出方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。

本発明者らは鋭意検討の結果、血中ＴＦＰＩ２値は健常人と比較して膵臓がん患者で有意に増大することを見出し、ＴＦＰＩ２が高い特異度をもって膵臓がんを検出しうることに想到し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］採取された体液において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、膵臓がんを検出する方法。
［２］前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、膵臓がんが検出されたとする、［１］に記載の方法。
［３］前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、［４］に記載の方法。
［６］質量分析法を用いて測定を行う、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］さらに、前記体液においてＴＦＰＩ２以外の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素の量を測定することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、膵臓がんを検出するための試薬。

本発明により、膵臓がんを簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。

健常人群、膵臓がん患者、良性（膵嚢胞性腫瘍）におけるＴＦＰＩ２測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２量を表す。 健常人群と膵臓がん群の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示した図。縦軸は感度、横軸は１－特異度を表す。 膵がん発症部位を比較した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２量を表す。 膵がん患者の性差を比較した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２量を表す。 膵臓がん患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９の相関を示した図。縦軸はＣＡ１９－９測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す。 膵臓がん患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９の相関を示した図。縦軸はＣＡ１９－９測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す（●：Ｓｔａｇｅ１の症例、▲：Ｓｔａｇｅ２，３の症例）。 膵臓がん患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＥＡの相関を示した図。縦軸はＣＥＡ測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す（●：Ｓｔａｇｅ１の症例、▲：Ｓｔａｇｅ２，３の症例）。 膵臓がん患者群におけるＴＦＰＩ２とＳＰａｎ－１の相関を示した図。縦軸はＳＰａｎ－１測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す（●：Ｓｔａｇｅ１の症例、▲：Ｓｔａｇｅ２，３の症例）。 膵臓がん患者群におけるＴＦＰＩ２とＤＵＰＡＮ－２の相関を示した図。縦軸はＤＵＰＡＮ－２測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す（●：Ｓｔａｇｅ１の症例、▲：Ｓｔａｇｅ２，３の症例）。

＜１＞本発明の膵臓がんを検出する方法
本発明の第一の態様は、膵臓がんを検出する方法であり、検体においてＴＦＰＩ２量を測定することを含む。これは、健常人と比べて、血液等の膵臓がん患者生体試料中においてＴＦＰＩ２の存在が上昇することに基づく方法である。検体におけるＴＦＰＩ２量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。この方法により、後述する実施例が示す通り、高い精度で膵臓がんを検出することができる。特に既存の膵臓がんマーカーと比べて、本発明の方法は、非進行性膵臓がん（ステージ１～３）に対して優れた検出性能を有するものであり、とりわけ早期の膵臓がん（ステージ１）に対しても優れた検出性能を有するものである。
なお、本発明の方法は、膵臓がんを検出する段階までを含むものであり、膵臓がんの診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、膵臓がんを診断したり治療方針を立てたりする。

本発明において測定されるＴＦＰＩ２は、特に限定はなく、例えばインタクトＴＦＰＩ２（以降、「Ｉ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド（以降、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、又はそれらの両方であってもよい。
配列番号１に、ヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列を示す。配列番号１において、開始メチオニンから２２残基目のグリシンまではシグナルペプチドである。
「インタクトＴＦＰＩ２」とは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドをいう。

また、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」は、特許文献３に記載されるように、インタクトＴＦＰＩ２のＮ末端側に位置するクニッツドメイン１を含むペプチド断片をいう。より具体的には、ＮＴ－ＴＦＰＩ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの配列を少なくとも含むペプチド、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、このポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～５個をいう。また、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を認識する抗体の抗原決定基を有しないことが好ましい。

本発明における検体（被検試料）は被験者（被験体）から採取された体液であり、例えば全血、血球、血清、血漿などの血液成分、尿、脳脊髄液、腹水などが挙げられる。被験者（被験体）は、通常、膵臓がんが疑われる人、膵臓がんと診断された患者等が挙げられるが、特に限定されない。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、簡便かつ非侵襲的に行うことができるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよい。

本発明の膵臓がん検出方法において、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素を検出する方法とを組合わせて用いてもよい。その組み合わせ方は、特に制限されない。本発明の膵臓がん検出方法における、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素を検出する方法との組み合わせ方の一例として、
（Ａ）測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素を検出する方法とを、同時に（並行して）または別個に行ない、膵臓がんを検出する方法、
（Ｂ）測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、他の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素を検出する方法で、膵臓がんを検出する方法、
（Ｃ）測定対象検体に対し、まず他の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、膵臓がんを検出する方法、があげられるが、（Ｂ）または（Ｃ）の方法は検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。（Ａ）の方法は速やかに膵がんを検出できる点でより好ましい。
なお、ここでＴＦＰＩ２、他の膵臓がんマーカー、又は膵酵素を検出することは、それらの量を測定することを含む。

ここで検出する他の膵臓がんマーカーは、例えば従来知られているマーカーから適宜選択すればよく、一例として、がん抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、ヒト膵がん関連抗原（ＳＰａｎ－１）、ヒト癌関連糖鎖抗原（ＤＵＰＡＮ－２）、がん抗原５０（ＣＡ５０）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）が挙げられる。また、ここで検出する膵酵素は、例えば従来知られているマーカーから適宜選択すればよく、一例として、アミラーゼ（膵型アミラーゼ）、エラスターゼ、リパーゼ、トリプシンが挙げられる。このうち、特に膵臓がんマーカーとして最も汎用されているＣＡ１９－９は臨床的有用性が確立している点で、ここで使用する膵臓がんマーカーとして好ましい。また、ここで検出される腫瘍マーカーまたは膵酵素は、１種のみであってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。
早期の膵臓がんを検出することができるという観点からは、ＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９又はＳＰａｎ－１との組み合わせを検出することが好ましい。一方、他のマーカーでは検出できない膵臓がんを検出することができるという観点からは、ＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９又はＳＰａｎ－１との組み合わせに加えて、さらにＤＵＰＡＮ－２を組み合わせて検出することがより好ましい。

また、本発明における検体の採取時期は、特に限定されない。例えば、黄疸等の臨床症状または画像診断等で膵臓がん疑いとなって精密検査が施行される術前時から、生検または術後の病理検査により膵臓がんと確定診断後の経過観察時にかけていつでもよく、確定診断前後、治療開始前後など、いずれの段階で採取した検体であっても、本発明の方法に供することができる。

本発明の検出方法では、測定により得たＴＦＰＩ２量が、予め設定した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、膵臓がんが検出されたと判定することが好ましい。ここで、ＴＦＰＩ２量は、インタクトＴＦＰＩ２量、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量、又はインタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計のいずれでもよいが、インタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計が測定のしやすさと十分な感度・特異度との両立の観点からより好ましい。

判定に用いる基準値は、測定値もしくは換算濃度値のいずれでもよい。なお、換算濃度値は、ＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。
膵臓がんと判定する基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、健常人と膵臓がんをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。例えば、ＴＦＰＩ２の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は後述の実施例で示す通り２００ ｐｇ／ｍＬと設定してもよいがその限りではない。

以降、ＴＦＰＩ２の測定方法について説明する。
本発明において、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２量又はインタクトＴＦＰＩ２量を個別に測定してもよく、またその値を合計して合計量としてもよい。また、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の合計量を一度に測定できる測定系で測定してもよい。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ－ＴＦＰＩ２量を測定してもよい。

本発明の方法において、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）抗原決定基の異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。

抗原抗体反応を利用してＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体は抗原決定基の異なる２種類を用いる。

（Ｂ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３に抗原決定基を有する抗体であることが好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体は抗原決定基の異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。

（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１に抗原決定基を有する抗体を検出抗体とする。

本発明の膵臓がんを検出する方法においては、前述した（Ｃ）や（Ｄ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を判定の基準に用いてもよいが、（Ａ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を判定の基準に用いても十分な感度と特異度が得られるうえ、抗体の取得しやすさや測定が一段階で簡便なことから、後者がより好ましい。

ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチドまたはタンパク質、インタクトＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。前記タンパク質または前記オリゴペプチドやポリペプチドは生体内のＴＦＰＩ２の立体構造を反映していない、あるいは調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の生体内のＴＦＰＩ２に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、本抗体を用いて測定系を構築しても結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。

一方、免疫原としてＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いることで、免疫動物の体内でＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現され免疫応答が惹起されるため、検体中のＴＦＰＩ２に対して高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるためより好ましい。

免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。

さらに、血中にはＴＦＰＩ２の相同体として知られるＴＦＰＩ１も存在する。したがって、ＴＦＰＩ１と交叉せずＴＦＰＩ２のみを特異的に認識する抗体を用いることが望ましい。

本発明の別の側面は、ＴＦＰＩ２量を測定する試薬の、膵臓がんを検出するための試薬の製造における使用である。ここで、前記ＴＦＰＩ２量を測定する試薬は、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計を測定する試薬であることが好ましい。また、前記ＴＦＰＩ２量を測定する試薬は、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であり、より好ましくはＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である。

従って、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体の、膵臓がんを検出するための試薬の製造における使用ともいうことができる。

また、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体の、膵臓がんの検出における使用ともいうことができる。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。

本発明で用いるＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、例えば、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。

なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離されたがん細胞などが挙げられる。

本発明で用いられる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。

なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。

本発明の方法において、質量分析法を利用してＴＦＰＩ２量を測定する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等の主要タンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。または、抗ＴＦＰＩ２抗体を用いた免疫的手法によりＴＦＰＩ２のみを特異的に回収することも可能である。

測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。

＜２＞本発明の膵臓がんを検出するための試薬
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体として抗原決定基の異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。

本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する、抗原決定基の異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。

（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤、タンパク質吸着抑制用化学合成ポリマーなどでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。

（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。

次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＴＦＰＩ２を検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＴＦＰＩ２を定量する。

本発明の試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、測定の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として血清や血漿を２０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＴＦＰＩ２量の測定を行う場合、当該検体２０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。

本発明の試薬は、用手法での測定にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた測定にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた測定は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく測定が可能で、かつ短時間に検体中のＴＦＰＩ２が定量可能であるため、好ましい。

本発明の膵臓がんを検出する方法は、膵臓がんを治療する方法に適用することができる。すなわち、本発明により、被験体における膵臓がんを治療する方法であって、
（ｉ）ＴＦＰＩ２量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして被験体の同定を受ける工程、及び
（ｉｉ）ＴＦＰＩ２量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして同定された前記被験体に対して、治療を施す工程
を含む、方法が提供される。

前記膵臓がんを治療する方法の好ましい態様において、前記ＴＦＰＩ２量は、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である。
また、前記工程（ｉ）の同定において、ＴＦＰＩ２量の測定は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われる。より好ましくは、前記抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である。

また、前記工程（ｉ）の同定において、ＴＦＰＩ２量の測定は、質量分析法を用いて行われてもよい。
前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的切除、薬物療法、放射線療法等が挙げられ、前記薬物としてはチロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴｏＲ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤等が挙げられるが特に限定されない。

以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞ ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
特許文献３の方法に従い、ＤＮＡ免疫法により得られたＴＦＰＩ２抗体を用いてＴＦＰＩ２測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト含有担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。

＜実施例２＞ 臨床検体の評価
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表１に示す。健常人血清２４１例（男性１０２例、女性１３９例）と膵嚢胞腫瘍（膵良性腫瘍）患者血清１例（男性）、膵臓がん患者血清２３例（男性１７例、女性６例）のうち、男性健常人を除く症例は横浜市立大学にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。男性健常人はインフォームドコンセントの承諾及び東ソー株式会社社内倫理委員会の承認を受けた社内ボランティア検体を用いた。

評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液１００μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。

市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。膵良性腫瘍および膵臓がん患者の血中ＣＡ１９－９値は採血日直近の電子カルテ記載の測定値を引用した。

健常人、膵臓がん患者、膵良性腫瘍患者における血中ＴＦＰＩ２値のＢｏｘＰｌｏｔを図１に、健常人と膵臓がん患者のＲＯＣ解析結果を図２に示す。ＴＦＰＩ２は健常人と比較して膵臓がん患者にて統計的有意差を持って高値を示し（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）、膵良性腫瘍患者では健常人と同様に低値を示すことが明らかとなった。ＴＦＰＩ２のＲＯＣ曲線から算出した曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９２３０となった。本結果より、ＴＦＰＩ２は良好な膵臓がん検出性能を有することが示された。

＜実施例３＞ＴＦＰＩ２の膵がん発症部位と性差における比較
実施例２の臨床検体について、膵がん患者を膵頭部、膵体部および膵尾部と膵がん発症部位で区分した血中ＴＦＰＩ２値のＢｏｘＰｌｏｔを図３に、膵がん患者を性差で区分した血中ＴＦＰＩ２値のＢｏｘＰｌｏｔを図４に示す。膵がん発症部位並びに性差で血中ＴＦＰＩ２値に群間の差異は認められなかった。

＜実施例４＞膵がん検出におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９の相補性
実施例２の臨床検体について、ＴＦＰＩ２は実施例２のＲＯＣ解析結果よりＹｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ（特異度＋感度－１）が最大値となる２００ｐｇ／ｍＬを、ＣＡ１９－９は臨床現場で使用されている３７Ｕ／ｍＬをそれぞれカットオフ値と設定した場合の陽性率を表２に示す。ＴＦＰＩ２はＣＡ１９－９に比べて単独の陽性率は劣るものの、ＣＡ１９－９とＴＦＰＩ２を組み合わせることで陽性率が上昇することが示された。ＣＡ１９－９はＬｅｗｉｓ式血液型抗原陰性の患者における偽陰性が課題とされるが、ＴＦＰＩ２を同時に（並行して）測定することで膵がん患者の陽性率向上が期待される。

＜実施例５＞ 膵がん患者血清におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９の相関性
実施例２の臨床検体について、膵臓がん患者血清におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９の相関と相関係数を図５に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９は有意な相関関係になく（相関係数＝０．２２）、各々が独立した指標となることが示唆された。

＜実施例６＞ 早期膵臓がん症例の検体評価
本実施例で使用した臨床検体の内訳を表３に示す。比較的ステージが進行していない膵臓がん患者血清１２例について、いずれも横浜市立大学にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。

実施例２と同様の評価用装置及び評価方法にて、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。膵臓がん患者の血中ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＳＰａｎ－１、ＤＵＰＡＮ－２値は採血日直近の電子カルテ記載の測定値を引用した。

＜実施例７＞ 早期膵臓がん検出における各膵臓がんマーカーの陽性率
実施例６の臨床検体について、非進行性の膵臓がん患者における各膵臓がんマーカーの陽性率を表４に示す。ＴＦＰＩ２のカットオフ値は実施例４と同様に２００ｐｇ／ｍＬとし、他の膵臓がんマーカーは臨床現場で使用されているカットオフ値を用いた。ＴＦＰＩ２による非進行性膵臓がん症例の陽性率は７５％（９／１２例）となり、他の膵臓がんマーカーと比較して優れた検出性能を有することが示された。また、早期（Ｓｔａｇｅ１）に限定した場合もＴＦＰＩ２による陽性率は７５％（６／８例）となり、他の膵臓がんマーカーと比較して優れた検出性能を有することが示された。

＜実施例８＞ 早期膵臓がん検出におけるＴＦＰＩ２と他の膵臓がんマーカーとの相補性
実施例６の臨床検体について、非進行性の膵臓がん患者血清におけるＴＦＰＩ２と他の膵臓がんマーカーとの相関を図６～９に示す（図中の黒い丸印（●）はＳｔａｇｅ１の症例を、黒い三角印（▲）はＳｔａｇｅ２，３の症例をそれぞれ示す）。また膵臓がんマーカー間の相関係数（ｒ）を表５に示す。ＴＦＰＩ２と他の膵臓がんマーカーとの間に有意な相関関係は認められず（ｒ＝－０．６８９～０．０６８）、互いに独立した指標となることが示唆された。ＴＦＰＩ２以外のマーカー間にも総じて相関関係は認められなかったが、ＣＡ１９－９とＳＰａｎ－１については相関係数が１に近い値を示し、高い相関性が認められた。

他の膵臓がんマーカーを単独で検出した場合の陽性率、及びＴＦＰＩ２と他の膵臓がんマーカーとを組み合わせて検出した場合の陽性率を表６に示す。他の膵臓がんマーカーにＴＦＰＩ２を組み合わせることで陽性率が向上し、特にＴＦＰＩ２とＣＡ１９－９又はＳＰａｎ－１との組合せで高い検出性能を示すことが確認された。
また、ＣＡ１９－９とＳＰａｎ－１は似た挙動を示し、図６～９の各相関図に矢印で示した１例はＤＵＰＡＮ－２のみで陽性を示した。これらのことから、早期膵臓がん患者の検出においては、ＴＦＰＩ２及びＤＵＰＡＮ－２に、ＣＡ１９－９又はＳＰａｎ－１を加えた３項目の膵臓がんマーカーを測定することでより多くの症例を検出可能となることが期待される。

本発明により、簡便かつ患者負担が比較的少ない体液検査で膵臓がん患者を検出する方法が提供される。これは、有効な腫瘍マーカーが存在せず画像診断に依存している膵臓がん診療への貢献が期待され、産業上非常に有用である。

Claims (8)

1. 採取された体液において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、膵臓がんを検出する方法。
2. 前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、膵臓がんが検出されたとする、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 質量分析法を用いて測定を行う、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. さらに、前記体液においてＴＦＰＩ２以外の膵臓がんマーカー及び／又は膵酵素の量を測定することを含む、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、膵臓がんを検出するための試薬。