JP7709837B2 - ナノ複合体粒子、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、及び、アナライト測定用キット - Google Patents
ナノ複合体粒子、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、及び、アナライト測定用キットInfo
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- JP7709837B2 JP7709837B2 JP2021033134A JP2021033134A JP7709837B2 JP 7709837 B2 JP7709837 B2 JP 7709837B2 JP 2021033134 A JP2021033134 A JP 2021033134A JP 2021033134 A JP2021033134 A JP 2021033134A JP 7709837 B2 JP7709837 B2 JP 7709837B2
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Description
本発明は、例えば免疫学的測定等の用途に好ましく使用可能な新規なナノ複合体粒子、それを利用した標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、及び、アナライト測定用キットに関する。
免疫学的測定法（「イムノアッセイ」ともいう。）は、免疫反応の一つである、抗原－抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。抗原－抗体間反応は感度や反応の選択性が高いため、上記分野で広く用いられている。イムノアッセイは、その測定原理により、様々な測定法がある。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。なお、イムノアッセイの他には、物理・化学的測定法、生物学的測定法等がある。
イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体又は複合体の濃度変化）から、抗原又は抗体を定性的又は定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原又は複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。
そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。
そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。
ところで、標識物質として着色した微粒子を用いた場合、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することができるため、より簡便な測定ができることが期待される。このような着色した微粒子としては、金属及び金属酸化物のコロイド状粒子、色素で着色したラテックス粒子等が挙げられる（特許文献１、特許文献２等）。しかし、上記コロイド状粒子は、粒子径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の鮮明な濃い色調のものを得難い、つまり視認性が不十分であるという問題がある。
また、上記着色したラテックス粒子は、色素による着色の効果が低く、目視判定性が不十分であるという問題がある。なお、この問題を解消するために色素の着色量を増やそうとすると、色素がラテックスの表面を覆い、ラテックス粒子本来の表面状態が損なわれるため、抗原又は抗体を結合させるのが困難になるという問題があった。また、メンブレンフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まったり、ラテックス粒子が非特異凝集を起こしたりして、色素の着色料を増やして濃く着色することが、必ずしも、性能の向上に結び付かない、という問題もあった。
また、上記着色したラテックス粒子は、色素による着色の効果が低く、目視判定性が不十分であるという問題がある。なお、この問題を解消するために色素の着色量を増やそうとすると、色素がラテックスの表面を覆い、ラテックス粒子本来の表面状態が損なわれるため、抗原又は抗体を結合させるのが困難になるという問題があった。また、メンブレンフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まったり、ラテックス粒子が非特異凝集を起こしたりして、色素の着色料を増やして濃く着色することが、必ずしも、性能の向上に結び付かない、という問題もあった。
上記標識物質の視認性を向上させるために、標識物質が結合した抗体（標識抗体）と抗原が反応し複合体を形成した後に、これらの標識物質に対しさらに他の金属を修飾させることで標識物質の検出感度を増幅させるイムノクロマトグラフ方法が開示されている。また、金コロイド及び着色ラテックスを併用した例も開示されている（特許文献３）。
しかし、これらの方法では、操作が煩雑であり、安定した増幅が難しい。また、特別な装置が必要である等、測定コストがかかることから、適用可能な用途及び使用環境は限定されると考えられる。
しかし、これらの方法では、操作が煩雑であり、安定した増幅が難しい。また、特別な装置が必要である等、測定コストがかかることから、適用可能な用途及び使用環境は限定されると考えられる。
これらの従来技術における課題を解決するものとして、金属ナノ粒子が結合された樹脂粒子が開示されている。
例えば、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが開示されている（特許文献４）。
ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子
自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ。また、金ナノ粒子自身が抗原
又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を
結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
例えば、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが開示されている（特許文献４）。
ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子
自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ。また、金ナノ粒子自身が抗原
又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を
結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
また、本出願人は、特定の割合の金属粒子が樹脂粒子の表層部に存在する樹脂－金属複合体を見出し、先に提案した（例えば、特許文献５）。この樹脂－金属複合体は、特に免疫学的測定材料の用途において、耐久性及び視認性に優れ、かつ、特別な装置や作業工程の追加を必要とせずに高感度な判定を可能とするものである。
以上より、金属ナノ粒子が結合された樹脂粒子は、視認性に優れ、特別な装置や作業工程の追加も必要としないことから、免疫学的測定用の試薬として期待されるものである。
しかながら、血液等の検体に極めて少ない量しか存在しないが、当該血液を保有する患者の健康に甚大な影響を及ぼすウイルス等の抗原を検出するためには、標識物質単独の視認性の向上に加え、別の技術的アプローチも必要である。
しかながら、血液等の検体に極めて少ない量しか存在しないが、当該血液を保有する患者の健康に甚大な影響を及ぼすウイルス等の抗原を検出するためには、標識物質単独の視認性の向上に加え、別の技術的アプローチも必要である。
すなわち、発明の目的は、免疫学的測定において、視認性に優れるだけでなく、通常であれば検出限界以下の、血液、尿、唾液、環境水等の検体に極めて少ない量しか存在しない抗原や抗体などのアナライトに対しても、磁気的に濃縮をかけることで検出することが可能なナノ複合体粒子を提供することにあり、例えば免疫学的測定において、高感度な判定を可能とする免疫学的測定用ナノ複合体粒子を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、金属ナノ粒子及び磁性ナノ粒子が、樹脂ナノ粒子に固定化されたナノ複合体粒子によって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明のナノ複合体粒子は、
樹脂ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～１００ｎｍの複数の金属ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～５０ｎｍの複数の磁性ナノ粒子と、
を備え、
平均粒子径が５０～１１００ｎｍであり、
前記金属ナノ粒子及び前記磁性ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする。
樹脂ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～１００ｎｍの複数の金属ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～５０ｎｍの複数の磁性ナノ粒子と、
を備え、
平均粒子径が５０～１１００ｎｍであり、
前記金属ナノ粒子及び前記磁性ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする。
本発明のナノ複合体粒子は、前記金属ナノ粒子が、金、銀、銅、パラジウム、白金、スズ、ロジウム、イリジウム又はこれらの合金の粒子であってもよい。
本発明のナノ複合体粒子は、前記磁性ナノ粒子が、鉄、コバルト、ニッケル、マンガン、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＡＦｅ２Ｏ４（ここで、ＡはＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ又はＺｎを意味する）、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＮｉ、またはＦｅＣｏであってもよい。
本発明のナノ複合体粒子は、前記樹脂ナノ粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であってもよい。
本発明のナノ複合体粒子は、前記金属ナノ粒子の中の少なくとも一部の粒子が、前記樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布していてもよい。また、前記金属ナノ粒子の６０ｗｔ％～１００ｗｔ％が、前記表層部に存在していてもよい。また、前記磁性ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子及び／又は前記金属ナノ粒子の表面に固定化されていてもよい。
本発明の標識物質は、上記いずれかに記載のナノ複合体粒子を備えたことを特徴とする。また、前記ナノ複合体粒子の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものであってもよい。
本発明の免疫学的測定法及び免疫学的測定用試薬は、上記の標識物質を用いることを特徴とする。
本発明のアナライトの測定法は、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法であって、
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程(I)～(IV)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかのナノ複合体粒子で標識した標識抗体と、を接触させて、アナライトと標識抗体とを含む複合体を得る工程、
工程(II)：アナライトと標識抗体とを含む複合体を、磁力により回収する工程、
工程(III)：前記工程(II)において回収された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、前記ラテラルフロー型クロマト用テストストリップの前記判定部にて、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(IV)：前記ナノ複合体粒子の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程(I)～(IV)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかのナノ複合体粒子で標識した標識抗体と、を接触させて、アナライトと標識抗体とを含む複合体を得る工程、
工程(II)：アナライトと標識抗体とを含む複合体を、磁力により回収する工程、
工程(III)：前記工程(II)において回収された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、前記ラテラルフロー型クロマト用テストストリップの前記判定部にて、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(IV)：前記ナノ複合体粒子の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
本発明のアナライト測定用キットは、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットであって、
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかのナノ複合体粒子で標識した標識抗体を含む検出試薬と、を含む。
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、上記いずれかのナノ複合体粒子で標識した標識抗体を含む検出試薬と、を含む。
本発明のナノ複合体粒子は、金属ナノ粒子及び磁性ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子に固定化しているため、特許文献４及び５に例示される、金属ナノ粒子が結合された樹脂粒子の特長である、視認性に優れ特別な装置や作業工程の追加も必要としない点に加え、通常であれば検出限界以下の、血液、尿、唾液、環境水等の検体に極めて少ない量しか存在しない抗原（抗体）に対しても、抗原－抗体反応を起こした後に磁気的に濃縮をかけることで、検出することが可能となる。そのため、例えば、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の、高感度な判定を可能とする免疫学的測定用標識物質、免疫学的測定用試薬などの目的で好ましく適用できる。
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係るナノ複合体粒子の断面模式図である。ナノ複合体粒子１００は、樹脂ナノ粒子（以下、単に「樹脂粒子」ともいう。）１０と、金属ナノ粒子２０と、磁性ナノ粒子７０を備えている。ナノ複合体粒子１００は、樹脂ナノ粒子１０に金属ナノ粒子２０が固定化されている。樹脂ナノ粒子１０は、金属ナノ粒子２０よりも相対的に大きな粒子である。つまり、ナノ複合体粒子１００では、相対的に粒子径の大きな樹脂ナノ粒子１０に、相対的に粒子径の小さな多数の金属ナノ粒子２０が固定されている。図１に示すように、ナノ複合体粒子１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂ナノ粒子１０の粒子径Ｄ２と金属ナノ粒子２０の粒子径Ｄ３との関係は、Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３である。
また、ナノ複合体粒子１００には、複数の磁性ナノ粒子７０が固定化されている。つまり、ナノ複合体粒子１００では、樹脂ナノ粒子１０及び／又は金属ナノ粒子２０に、多数の磁性ナノ粒子７０が固定されている。図１に示すように、ナノ複合体粒子１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂ナノ粒子１０の粒子径Ｄ２と磁性ナノ粒子７０の粒子径Ｄ４との関係は、Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ４である。
なお、図１では、磁性ナノ粒子７０の形状を多角形で示し、また、金属ナノ粒子２０よりも小さく示しているが、あくまでも説明の便宜のためであり、その形状や大きさは限定されるものではない。また、図１では、樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０の表面に磁性ナノ粒子７０が結合している態様を示しているが、あくまでも例示であり、磁性ナノ粒子７０の存在状態は限定されるものではなく、例えば樹脂ナノ粒子１０の内部に埋包されていてもよい。
また、ナノ複合体粒子１００には、複数の磁性ナノ粒子７０が固定化されている。つまり、ナノ複合体粒子１００では、樹脂ナノ粒子１０及び／又は金属ナノ粒子２０に、多数の磁性ナノ粒子７０が固定されている。図１に示すように、ナノ複合体粒子１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂ナノ粒子１０の粒子径Ｄ２と磁性ナノ粒子７０の粒子径Ｄ４との関係は、Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ４である。
なお、図１では、磁性ナノ粒子７０の形状を多角形で示し、また、金属ナノ粒子２０よりも小さく示しているが、あくまでも説明の便宜のためであり、その形状や大きさは限定されるものではない。また、図１では、樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０の表面に磁性ナノ粒子７０が結合している態様を示しているが、あくまでも例示であり、磁性ナノ粒子７０の存在状態は限定されるものではなく、例えば樹脂ナノ粒子１０の内部に埋包されていてもよい。
ナノ複合体粒子１００は、平均粒子径が５０～１１００ｎｍであり、ナノ複合体粒子１００を構成する金属ナノ粒子２０は平均粒子径が１～１００ｎｍであり、磁性ナノ粒子７０は平均粒子径が１～５０ｎｍである。ナノ複合体粒子１００の平均粒子径が５０ｎｍ未満の場合、金属ナノ粒子２０の担持量が少なくなる傾向があるため、同サイズの金属ナノ粒子より着色が弱くなる傾向にあり、また、磁気濃縮効率が低下する傾向にある。ナノ複合体粒子１００の平均粒子径が１１００ｎｍを超えると、標識物質又は試薬とした際に、メンブレンフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散安定性が低下する傾向がある。ナノ複合体粒子１００の平均粒子径は、標識物質又は試薬とした際の分散安定性を向上させるとともに、ナノ複合体粒子１００を免疫学的測定に用いる場合に高い検出感度を得る観点、さらには高い磁気濃縮効率を得る観点から、好ましい下限は１００ｎｍ、より好ましくは２５０ｎｍ、さらに好ましくは３００ｎｍである。一方、好ましい上限は７００ｎｍであり、さらに好ましくは６００ｎｍである。ここで、ナノ複合体粒子１００の粒子径は、樹脂ナノ粒子１０の粒子径に、後述する一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）あるいは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）といった電子顕微鏡法、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、又は遠心沈降法により測定することができる。
また、金属ナノ粒子２０の平均粒子径（つまり、図１における粒子径Ｄ３の平均）は、１ｎｍ未満の場合や１００ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収が発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。
金属ナノ粒子２０として金粒子を使用する場合、金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましい下限は、１ｎｍであり、より好ましくは３ｎｍである。一方、好ましい上限は、７０ｎｍであり、より好ましくは５０ｎｍである。
金属ナノ粒子２０として白金粒子を使用する場合、白金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましい下限は、１ｎｍであり、より好ましくは２ｎｍであり、さらに好ましくは３ｎｍである。一方、好ましい上限は、５０ｎｍであり、より好ましくは２０ｎｍであり、さらに好ましくは１５ｎｍである。
ここで、金属ナノ粒子２０の平均粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）あるいは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により測長される。
金属ナノ粒子２０として金粒子を使用する場合、金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましい下限は、１ｎｍであり、より好ましくは３ｎｍである。一方、好ましい上限は、７０ｎｍであり、より好ましくは５０ｎｍである。
金属ナノ粒子２０として白金粒子を使用する場合、白金粒子の平均粒子径は、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましい下限は、１ｎｍであり、より好ましくは２ｎｍであり、さらに好ましくは３ｎｍである。一方、好ましい上限は、５０ｎｍであり、より好ましくは２０ｎｍであり、さらに好ましくは１５ｎｍである。
ここで、金属ナノ粒子２０の平均粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）あるいは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により測長される。
また、磁性ナノ粒子７０の平均粒子径は、１ｎｍ未満の場合、ナノ複合体粒子１００に発現する磁力が弱いため、検体中でアナライト及びナノ複合体粒子１００で標識した標識抗体（以下、「標識抗体粒子」という。）を接触し、アナライトと標識抗体粒子とを含む複合体（以下、「アナライト－標識抗体複合体」という。）を形成した後に、アナライト－標識抗体複合体を磁気により回収する効率、つまり磁気濃縮の効率が低下する傾向にある。一方、５０ｎｍを超える場合、ナノ複合体粒子１００の比重が大きいため、検体中での運動性や拡散性が低く、検体中でのアナライトと標識抗体粒子との接触効率やアナライト－標識抗体複合体を磁気により回収する効率が低下する傾向にある。好ましい下限は、３ｎｍであり、より好ましくは５ｎｍであり、さらに好ましくは７ｎｍである。一方、好ましい上限は、３０ｎｍであり、より好ましくは２０ｎｍであり、さらに好ましくは１５ｎｍである。
ここで、磁性ナノ粒子７０の平均粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）あるいは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により測長される。
ここで、磁性ナノ粒子７０の平均粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）あるいは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により測長される。
金属ナノ粒子２０は、磁性元素（Mn、Fe、Co、Ni）を含有するナノ粒子を含まない（ただし、不可避不純物として粒子が磁性を帯びない程度に微量の磁性元素を含むことは許容される）。つまり、金属ナノ粒子２０は、磁性材料を除く金属のナノ粒子である。また、金属ナノ粒子２０は、金属ナノ粒子２０と樹脂ナノ粒子１０とのナノサイズでの複合化のしやすさの観点から、材質が金、銀、銅、パラジウム、白金、スズ、ロジウム、イリジウム又はこれらの合金の粒子であることが好ましい。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。ここで、例えば金合金としては、金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。また、例えば白金合金としては、白金と白金以外の金属種からなり、白金を１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬として用いる場合、より好ましくは、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易な金、白金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。更に好ましくは、金及び白金である。
例えば、金属ナノ粒子２０として金粒子を使用した、金－樹脂複合体は、他の金属種の粒子を有する金属－樹脂複合体と比較して、抗体などのリガンドと結合させた状態で凝集を生じにくく、極めて分散性に優れている。さらに、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易である。特に、金粒子の粒子径や金粒子同士の粒子間距離を制御することで、赤色、紫色、青色等、様々な発色を呈する。そのため、金－樹脂複合体をイムノク口マトグラフの標識物質として使用する場合に、様々な色の標識物質を得ることができる。
例えば、金属ナノ粒子２０として白金粒子を使用した、白金－樹脂複合体は、他の金属種の粒子を有する金属－樹脂複合体と比較して、抗体などのリガンドと結合させた状態で凝集を生じにくく、極めて分散性に優れている。また、白金粒子は、酸化などの変質に強く、保存安定性にも優れている。さらに、白金粒子は、例えば２５０ｎｍ～９００ｎｍまでの範囲の幅広い波長で局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現し、さらに電子遷移による光エネルギー吸収の発現により、黒色に近い強い発色を呈するので、白金－樹脂複合体を標識物質として用いることによって、免疫学的測定において、高い視認性が得られ、アナライトの検出感度も高めることができる。この場合、白金粒子を用いることによって、他の金属種の粒子に比べ、少ない担持量で優れた検出感度が得られる。従って、仮に平均粒子径が同等であれば、白金－樹脂複合体は、他の金属種の粒子を有する樹脂複合体に比べて有意に高い検出感度を示すので好ましい。
金属ナノ粒子２０は、単一の金属種のみからなるものでもよいし、当該金属種と他の金属種との合金であってもよい。ここで、単一の金属種のみからなる金属ナノ粒子２０の場合、当該金属種以外の不可避不純物が含まれていてもよい。また、他の金属との合金の場合、当該他の金属種は特に制限されないが、例えば、金との合金の場合は、銀、銅、パラジウム、白金、スズ、ロジウム、イリジウムが好ましい。また、白金との合金の場合は、金、銀、銅、パラジウム、スズ、ロジウム、イリジウムが好ましい。
また、磁性ナノ粒子７０は、磁性ナノ粒子７０と樹脂ナノ粒子１０とのナノサイズでの複合化のしやすさ、及び、ナノ複合体粒子１００としての磁力の強さの観点から、前記磁性ナノ粒子７０が、鉄、コバルト、ニッケル、マンガン、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＡＦｅ２Ｏ４（ここで、ＡはＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ又はＺｎを意味する）、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＮｉ、またはＦｅＣｏであることが好ましい。より好ましくは飽和磁束密度が高い軟磁性材料であるＦｅ３Ｏ４、ＦｅＣｏであり、さらに好ましくはＦｅ３Ｏ４である。
なお、磁性ナノ粒子７０としては、例えば、酸化鉄磁性ナノ粒子（Iron Oxide Nanoparticles、シグマアルドリッチジャパン合同会社）などの市販品を好ましく利用できる。
なお、磁性ナノ粒子７０としては、例えば、酸化鉄磁性ナノ粒子（Iron Oxide Nanoparticles、シグマアルドリッチジャパン合同会社）などの市販品を好ましく利用できる。
また、樹脂ナノ粒子１０は、その構造や組成は限定しないが、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。例えば、アニオン性イオンを吸着可能なポリマーが挙げられる。アニオン性イオンを吸着可能なポリマーとして、特に、含窒素ポリマーが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易な、金属ナノ粒子２０の前駆体である［ＡｕＣｌ４］－、［ＰｔＣｌ６］２－などのアニオン性イオンを化学吸着しやすいため、好ましい。本実施の形態では、含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子２０を形成する為、生成した金属ナノ粒子２０の一部は、後述する内包粒子３０又は一部露出粒子４０となる。［ＡｕＣｌ４］－を使用した場合は金粒子を形成するし、［ＰｔＣｌ６］２－を使用した場合は白金粒子を形成する。その他、銀、銅、パラジウム、スズ、ロジウム、イリジウムなどアニオン性イオンも使用することができる。
また、アクリル酸重合体のようなカルボン酸基含有ポリマー及びポリスチレンスルホン酸のようなスルホン酸基含有ポリマー（以下、併せて「カチオン性イオンを吸着可能なポリマー」という。）は、含有するカルボン酸基及びスルホン酸基により、Ａｕ＋、Ｐｔ２＋のようなカチオン性イオンを化学吸着することができるため、好ましい。例えば、化学吸着したＡｕ＋、Ｐｔ２＋を還元し、金属ナノ粒子２０ （この場合、金粒子や白金粒子）を形成することで、上記含窒素ポリマー粒子と同様な構造を作製することが可能である。その他、銀、銅、パラジウム、スズ、ロジウム、イリジウムなどの金属の前駆体であるカチオン性イオンを使用することができる。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂ナノ粒子１０として、例えばポリスチレン等も使用することができる。しかし、この場合、比較的前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属ナノ粒子２０の大部分は、表面吸着粒子５０となる。表面吸着粒子５０は、樹脂ナノ粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂ナノ粒子１０から金属ナノ粒子２０が脱離しやすい傾向にある。上記含窒素ポリマーは、主鎖又は側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン、メラミン樹脂等がある。好ましくは、ポリ－２－ビニルピリジン、ポリ－３－ビニルピリジン、ポリ－４－ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。また、上記カチオン性イオンを吸着可能なポリマーは、主鎖又は側鎖に、カルボン酸基、スルホン酸基等を有する樹脂であり、例えば、ポリアクリル酸、カルボン酸ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、セルロース等幅広く利用することができる。
上記含窒素ポリマーなどのアニオン性イオンを吸着可能なポリマー及びカチオン性イオンを吸着可能なポリマーは、公知の重合性モノマーとの共重合体であっても良い。ここで、共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互共重合体、重合体同士が架橋したものが例示される。また、２種類以上のモノマーを共重合させて樹脂ナノ粒子１０を形成しても良いし、樹脂ナノ粒子１０の表面に存在する官能基にモノマーを反応させ、それを重合活性末端としてさらに重合させても良い。その共重合組成は限定しないが、前記金属イオンを吸着することが可能な置換基を含有するモノマーが１０ｍｏｌ％以上であることが好ましい。より好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。
重合性モノマーとしては、ナノ複合体粒子１００の用途に応じて制限なく選択することができる。例えば、樹脂ナノ粒子１０の形状、サイズの均一性および分散安定性の向上の用途では、界面活性剤としての特性を有する重合性モノマーを使用することができる。このような重合性モノマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートが挙げられる。また、樹脂ナノ粒子１０の機械的強度や形状の安定性の向上の用途では、ジビニルベンゼン、スチレン等の疎水性の重合性モノマーを使用することができる。
また、上記樹脂ナノ粒子１０が、エステル結合等の加水分解可能な基を有する場合、これを酸処理やアルカリ処理をすることで、部分的に加水分解を行っても良い。加水分解により、樹脂ナノ粒子１０の表面にカルボキシル基等のカチオン性イオンを吸着可能な基が発生し、金属イオンを吸着する効果が得られるので、好ましい。酸としては、公知の酸を使用することができる。加水分解反応の促進の観点から、強酸性の塩酸、硫酸などが好ましい。アルカリとしては、公知のアルカリを使用することができる。加水分解反応の促進の観点から、強アルカリ性の水酸化カリウム、水酸化ナトリウム水溶液などが好ましい。
また、アクリル酸重合体のようなカルボン酸基含有ポリマー及びポリスチレンスルホン酸のようなスルホン酸基含有ポリマー（以下、併せて「カチオン性イオンを吸着可能なポリマー」という。）は、含有するカルボン酸基及びスルホン酸基により、Ａｕ＋、Ｐｔ２＋のようなカチオン性イオンを化学吸着することができるため、好ましい。例えば、化学吸着したＡｕ＋、Ｐｔ２＋を還元し、金属ナノ粒子２０ （この場合、金粒子や白金粒子）を形成することで、上記含窒素ポリマー粒子と同様な構造を作製することが可能である。その他、銀、銅、パラジウム、スズ、ロジウム、イリジウムなどの金属の前駆体であるカチオン性イオンを使用することができる。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂ナノ粒子１０として、例えばポリスチレン等も使用することができる。しかし、この場合、比較的前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属ナノ粒子２０の大部分は、表面吸着粒子５０となる。表面吸着粒子５０は、樹脂ナノ粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂ナノ粒子１０から金属ナノ粒子２０が脱離しやすい傾向にある。上記含窒素ポリマーは、主鎖又は側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン、メラミン樹脂等がある。好ましくは、ポリ－２－ビニルピリジン、ポリ－３－ビニルピリジン、ポリ－４－ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。また、上記カチオン性イオンを吸着可能なポリマーは、主鎖又は側鎖に、カルボン酸基、スルホン酸基等を有する樹脂であり、例えば、ポリアクリル酸、カルボン酸ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、セルロース等幅広く利用することができる。
上記含窒素ポリマーなどのアニオン性イオンを吸着可能なポリマー及びカチオン性イオンを吸着可能なポリマーは、公知の重合性モノマーとの共重合体であっても良い。ここで、共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互共重合体、重合体同士が架橋したものが例示される。また、２種類以上のモノマーを共重合させて樹脂ナノ粒子１０を形成しても良いし、樹脂ナノ粒子１０の表面に存在する官能基にモノマーを反応させ、それを重合活性末端としてさらに重合させても良い。その共重合組成は限定しないが、前記金属イオンを吸着することが可能な置換基を含有するモノマーが１０ｍｏｌ％以上であることが好ましい。より好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。
重合性モノマーとしては、ナノ複合体粒子１００の用途に応じて制限なく選択することができる。例えば、樹脂ナノ粒子１０の形状、サイズの均一性および分散安定性の向上の用途では、界面活性剤としての特性を有する重合性モノマーを使用することができる。このような重合性モノマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートが挙げられる。また、樹脂ナノ粒子１０の機械的強度や形状の安定性の向上の用途では、ジビニルベンゼン、スチレン等の疎水性の重合性モノマーを使用することができる。
また、上記樹脂ナノ粒子１０が、エステル結合等の加水分解可能な基を有する場合、これを酸処理やアルカリ処理をすることで、部分的に加水分解を行っても良い。加水分解により、樹脂ナノ粒子１０の表面にカルボキシル基等のカチオン性イオンを吸着可能な基が発生し、金属イオンを吸着する効果が得られるので、好ましい。酸としては、公知の酸を使用することができる。加水分解反応の促進の観点から、強酸性の塩酸、硫酸などが好ましい。アルカリとしては、公知のアルカリを使用することができる。加水分解反応の促進の観点から、強アルカリ性の水酸化カリウム、水酸化ナトリウム水溶液などが好ましい。
また、ナノ複合体粒子１００は、樹脂ナノ粒子１０における金属ナノ粒子２０の分散状態は限定しない。例えば、樹脂ナノ粒子１０の表面に金属ナノ粒子２０が二次元的に分布しても良いし、樹脂ナノ粒子１０の内部に金属ナノ粒子２０が内包されていても良い。前者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０の表面に、複数の金属ナノ粒子２０が、相互に接触して連続的な膜を形成しても良い。また、後者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０をシェルとし、金属ナノ粒子２０をコアとする、コア－シェル構造を形成しても良い。また、金属ナノ粒子２０の一部が樹脂ナノ粒子１０の表層部６０において三次元的に分布していてもよい。この場合、三次元的に分布した金属ナノ粒子２０の一部が部分的に樹脂ナノ粒子１０外に露出していてもよく、残りの一部が樹脂ナノ粒子１０に内包されていてもよい。具体的には、図１に示すように、金属ナノ粒子２０には、樹脂ナノ粒子１０に完全に内包された金属ナノ粒子（以下、「内包粒子」３０ともいう。）、樹脂ナノ粒子１０内に埋包された部位及び樹脂ナノ粒子１０外に露出した部位を有する金属ナノ粒子（以下、「一部露出粒子」４０ともいう。）及び樹脂ナノ粒子１０の表面に吸着している金属ナノ粒子（以下、「表面吸着粒子」５０ともいう。）が存在し得る。
例えば、ナノ複合体粒子１００を免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬に使用する場合、樹脂ナノ粒子１０の表面又は一部露出粒子４０もしくは表面吸着粒子５０の表面に、抗原、抗体又はブロッキング剤を固定化して使用する。その際、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０には、前記抗原、抗体又はブロッキング剤が固定化される一方で、内包粒子３０には、固定化されにくいと考えられる。しかし、一部露出粒子４０、表面吸着粒子５０及び内包粒子３０のいずれも局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現することから、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０のみならず、内包粒子３０も、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の視認性向上に寄与する。さらに、一部露出粒子４０及び内包粒子３０は、表面吸着粒子５０と比較して樹脂ナノ粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等が奏されるため、物理的吸着力が強く、樹脂ナノ粒子１０から脱離しにくい。また、一部露出粒子４０もしくは表面吸着粒子５０に吸着した抗原、抗体又はブロッキング剤は、金属と配位結合するため、脱離しにくい。そのため、ナノ複合体粒子１００を使用した免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
例えば、ナノ複合体粒子１００を免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬に使用する場合、樹脂ナノ粒子１０の表面又は一部露出粒子４０もしくは表面吸着粒子５０の表面に、抗原、抗体又はブロッキング剤を固定化して使用する。その際、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０には、前記抗原、抗体又はブロッキング剤が固定化される一方で、内包粒子３０には、固定化されにくいと考えられる。しかし、一部露出粒子４０、表面吸着粒子５０及び内包粒子３０のいずれも局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現することから、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０のみならず、内包粒子３０も、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の視認性向上に寄与する。さらに、一部露出粒子４０及び内包粒子３０は、表面吸着粒子５０と比較して樹脂ナノ粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等が奏されるため、物理的吸着力が強く、樹脂ナノ粒子１０から脱離しにくい。また、一部露出粒子４０もしくは表面吸着粒子５０に吸着した抗原、抗体又はブロッキング剤は、金属と配位結合するため、脱離しにくい。そのため、ナノ複合体粒子１００を使用した免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
ナノ複合体粒子１００において、内包粒子３０は、その表面の全てが、樹脂ナノ粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、一部露出粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂ナノ粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、表面吸着粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂ナノ粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
また、ナノ複合体粒子１００への金属ナノ粒子２０（内包粒子３０、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０の合計）の担持量は、ナノ複合体粒子１００に対して、３～８０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、ナノ複合体粒子１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属ナノ粒子２０の担持量が３ｗｔ％未満では、抗体又は抗原の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。一方、金属ナノ粒子２０の担持量が８０ｗｔ％を超えると、金属ナノ粒子２０の粒子径が著しく増大し、金属ナノ粒子２０による光吸収特性が低下する傾向にある。金属ナノ粒子２０の担持量は、より好ましい下限値は１０ｗｔ％、さらに好ましくは１５ｗｔ％である。一方、より好ましい上限値は７０ｗｔ％、さらに好ましくは６０ｗｔ％である。
また、ナノ複合体粒子１００への磁性ナノ粒子７０の担持量は、ナノ複合体粒子１００に対して、１～５０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、ナノ複合体粒子１００は、磁力の強さ及び検体中での運動性や拡散性のバランスに優れる。つまり、磁性ナノ粒子７０の担持量が１ｗｔ％未満では、ナノ複合体粒子１００の磁力が弱いため、アナライト－標識抗体複合体を形成した後に、アナライト－標識抗体複合体を磁気により回収する効率、つまり磁気濃縮の効率が低下する傾向にある。一方、５０ｗｔ％を超える場合、ナノ複合体粒子１００の比重が大きいため、検体中での運動性や拡散性が低く、検体中でのアナライトと標識抗体粒子との接触効率やアナライト－標識抗体複合体を磁気により回収する効率が低下する傾向にある。また、例えば、テストストリップを用いて行われるアナライトの測定において、アナライト－標識抗体複合体の展開速度が低下し測定の効率が悪くなる傾向にある。金属ナノ粒子２０の担持量は、より好ましい下限値は５ｗｔ％、さらに好ましくは１０ｗｔ％である。一方、より好ましい上限値は４０ｗｔ％、さらに好ましくは３０ｗｔ％である。
また、金属ナノ粒子２０の１０～９０ｗｔ％が、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０であることが好ましい。この範囲であれば、金属ナノ粒子２０上への抗体又は抗原の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０が占める割合のより好ましい下限値は２０ｗｔ％であり、より好ましい上限値は８０ｗｔ％である。
また、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の耐久性の観点から、表面吸着粒子５０が２０ｗｔ％以下であることが好ましい。
また、ナノ複合体粒子１００を免疫学的測定に使用する場合に、優れた検出感度を得るためには、金属ナノ粒子２０の６０～１００ｗｔ％が表層部６０に存在することが好ましい。より好ましい下限は７５ｗｔ％であり、さらに好ましくは８５ｗｔ％である。
また、表層部６０に存在する金属ナノ粒子２０の５～９０ｗｔ％が、一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０であることが、金属ナノ粒子２０上への抗体又は抗原の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属ナノ粒子２０の１０～９５ｗｔ％が内包粒子３０であることがよい。
また、表層部６０に存在する金属ナノ粒子２０の５～９０ｗｔ％が、一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０であることが、金属ナノ粒子２０上への抗体又は抗原の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属ナノ粒子２０の１０～９５ｗｔ％が内包粒子３０であることがよい。
ここで、前記「表層部」とは、ナノ複合体粒子１００の最も外側の位置（つまり、一部露出粒子４０又は表面吸着粒子５０の突出端部）を基準にして、樹脂ナノ粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲、より好ましくは４０％の範囲を意味する。また、前記「三次元的に分布」とは、金属ナノ粒子２０が、樹脂ナノ粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。上記のとおり、内包粒子３０も局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現することから、一部露出粒子４０及び表面吸着粒子５０のみならず、内包粒子３０も、免疫学的測定用標識物質及び免疫学的測定用試薬の視認性向上に寄与する。このような視認性向上という観点では、ナノ複合体粒子１００は、内包粒子３０が、樹脂ナノ粒子１０の表面から深さ方向に一定の範囲内に集中して分布し、樹脂ナノ粒子１０の中心付近には内包粒子３０が実質的に存在しないことが好ましい。より具体的には、内包粒子３０による局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を効果的に発現させるためには、例えば、樹脂ナノ粒子１０の粒子径Ｄ２が８００ｎｍであるとき、樹脂ナノ粒子１０の表面から深さ方向に例えば０～２００ｎｍの範囲内に内包粒子３０の７０ｗｔ％以上、好ましくは８０ｗｔ％以上、より好ましくは９０～１００ｗｔ％が、存在していることがよい。特に、内包粒子３０の全て（１００ｗｔ％）が分布する領域（内包粒子分布領域）が、樹脂ナノ粒子１０の表面から例えば０～１００ｎｍの範囲内である場合は、内包粒子３０による局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収の発現を最大化できるので好ましい。また、ナノ複合体粒子１００は、内包粒子３０を有しなくもよい。例えば、ナノ複合体粒子１００において、金属ナノ粒子２０のすべてが、樹脂ナノ粒子１０の径方向に重なり合うことなく、樹脂ナノ粒子１０の表面に固定されていてもよい。この場合、金属ナノ粒子２０は、一部露出粒子４０と表面吸着粒子５０とから構成される。
また、ナノ複合体粒子１００は、樹脂ナノ粒子１０における磁性ナノ粒子７０の分散状態は限定しない。例えば、樹脂ナノ粒子１０の表面に磁性ナノ粒子７０が二次元的あるいは三次元的に分布しても良いし、樹脂ナノ粒子１０の内部に磁性ナノ粒子７０が内包されていても良い。
前者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０の表面に、複数の磁性ナノ粒子７０が、相互に接触して連続的な膜を形成しても良い。
後者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０をシェルとし、磁性ナノ粒子７０をコアとする、コア－シェル構造を形成しても良い。また、磁性ナノ粒子７０の一部が樹脂ナノ粒子１０の内部において三次元的に分布していてもよい。この場合、三次元的に分布した磁性ナノ粒子７０の一部が部分的に樹脂ナノ粒子１０外に露出していてもよく、残りの一部が樹脂ナノ粒子１０に内包されていてもよい。
より好ましくは、保存安定性の観点で、磁性ナノ粒子７０が、前記樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０からなる金属－樹脂複合体（つまり、ナノ複合体粒子１００から磁性ナノ粒子７０を除いたもの）の表面に固定化されていることがよい。
また、樹脂ナノ粒子１０の表面に磁性ナノ粒子７０を固定化する場合、磁性ナノ粒子７０と樹脂ナノ粒子１０との接触状態は、特に制限はなく、静電相互作用などによる物理吸着でもよいし、水素結合、配位結合、共有結合等の化学吸着でもよい。好ましくは、結合安定性の観点から、樹脂ナノ粒子１０又は金属ナノ粒子２０と磁性ナノ粒子７０とが公知のリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）との化学結合を介して接触していることがよい。
ここでリンカーは公知の物質又は結合が適用できる。例えば、アミド結合、エーテル結合、飽和又は不飽和の炭素－炭素結合が挙げられる。
前者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０の表面に、複数の磁性ナノ粒子７０が、相互に接触して連続的な膜を形成しても良い。
後者の一形態として、樹脂ナノ粒子１０をシェルとし、磁性ナノ粒子７０をコアとする、コア－シェル構造を形成しても良い。また、磁性ナノ粒子７０の一部が樹脂ナノ粒子１０の内部において三次元的に分布していてもよい。この場合、三次元的に分布した磁性ナノ粒子７０の一部が部分的に樹脂ナノ粒子１０外に露出していてもよく、残りの一部が樹脂ナノ粒子１０に内包されていてもよい。
より好ましくは、保存安定性の観点で、磁性ナノ粒子７０が、前記樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０からなる金属－樹脂複合体（つまり、ナノ複合体粒子１００から磁性ナノ粒子７０を除いたもの）の表面に固定化されていることがよい。
また、樹脂ナノ粒子１０の表面に磁性ナノ粒子７０を固定化する場合、磁性ナノ粒子７０と樹脂ナノ粒子１０との接触状態は、特に制限はなく、静電相互作用などによる物理吸着でもよいし、水素結合、配位結合、共有結合等の化学吸着でもよい。好ましくは、結合安定性の観点から、樹脂ナノ粒子１０又は金属ナノ粒子２０と磁性ナノ粒子７０とが公知のリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）との化学結合を介して接触していることがよい。
ここでリンカーは公知の物質又は結合が適用できる。例えば、アミド結合、エーテル結合、飽和又は不飽和の炭素－炭素結合が挙げられる。
［ナノ複合体粒子の製造方法］
ナノ複合体粒子１００の製造方法は、特に限定されないが、以下、好ましい方法として、まず、樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０からなる金属－樹脂複合体を作製し、次に、金属－樹脂複合体に磁性ナノ粒子７０を固定する方法について説明する。
ナノ複合体粒子１００の製造方法は、特に限定されないが、以下、好ましい方法として、まず、樹脂ナノ粒子１０及び金属ナノ粒子２０からなる金属－樹脂複合体を作製し、次に、金属－樹脂複合体に磁性ナノ粒子７０を固定する方法について説明する。
金属－樹脂複合体は、例えば、乳化重合法により製造した樹脂ナノ粒子１０の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂ナノ粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。さらに、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属ナノ粒子２０を生成させ、金属－樹脂複合体を得ることができる。
例えば、金属ナノ粒子２０として金粒子を生成させる場合は、金イオンを含有する溶液としては、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）水溶液等が挙げられる。また、金イオンの代わりに金錯体を用いても良い。
また、金属ナノ粒子２０として白金粒子を生成させる場合は、白金イオンを含有する溶液としては、塩化白金酸（Ｈ２ＰｔＣｌ６）水溶液、塩化白金（ＰｔＣｌ２）溶液等が挙げられる。また、白金イオンの代わりに白金錯体を用いても良い。
また、金属ナノ粒子２０として白金粒子を生成させる場合は、白金イオンを含有する溶液としては、塩化白金酸（Ｈ２ＰｔＣｌ６）水溶液、塩化白金（ＰｔＣｌ２）溶液等が挙げられる。また、白金イオンの代わりに白金錯体を用いても良い。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。
このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属ナノ粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。
このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属ナノ粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
また、還元剤は、公知の物を用いることができる。還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、エリソルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、ロッシェル塩等が挙げられる。これらのうち、水素化ホウ素ナトリウム又は、ジメチルアミンボラン、クエン酸が好ましい。
還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整したりすることができる。ｐＨ調整は、例えば、ホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸、硫酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを用いて行うことができる。
さらに、還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、生成する金属ナノ粒子２０の粒径をコントロールすることができる。
還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整したりすることができる。ｐＨ調整は、例えば、ホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸、硫酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを用いて行うことができる。
さらに、還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、生成する金属ナノ粒子２０の粒径をコントロールすることができる。
また、前記金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属ナノ粒子２０を生成させる際、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加しても良いし、還元剤を前記金属イオン吸着樹脂粒子に添加しても良いが、内包粒子３０及び一部露出粒子４０の生成しやすさの観点から、前者が好ましい。
また、金属－樹脂複合体の、水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ－Ｌ－リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４ （ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を添加してもよい。
さらに、ホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸、硫酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することができる。
さらに、ホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸、硫酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することができる。
次に、作製した金属－樹脂複合体に磁性ナノ粒子７０を固定化することによって、ナノ複合体粒子１００を作製する。上記の通り、磁性ナノ粒子７０と樹脂ナノ粒子１０との接触状態は、特に制限はない。以下に、樹脂ナノ粒子１０又は金属ナノ粒子２０と磁性ナノ粒子７０とが公知のリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）との化学結合を介して接触させる方法を例示する。
リンカーとしてアミド結合を用いる場合、金属－樹脂複合体あるいは磁性ナノ粒子７０の一方にアミノ基を付与し、他方にカルボキシル基を付与し、それらを反応させてアミド結合を形成させる。
例えば、金属－樹脂複合体をＰｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ、Ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーでコーティングして表面にアミノ基を有する金属－樹脂複合体（以下、「アミノ基含有複合粒子」という。）を合成する。一方、磁性ナノ粒子７０をクエン酸、酒石酸、アスコルビン酸等のヒドロキシ酸でキャッピングして表面にカルボキシル基を有する磁性ナノ粒子７０（以下、「カルボキシル基含有磁性粒子」という。）を合成する。そして、アミノ基含有複合粒子及びカルボキシル基含有磁性粒子を反応させてアミド結合を形成する。ここで、アミド結合の形成は公知の方法を使用することができる。例えば、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ’，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドを架橋剤として使用してもよい。
また、磁性ナノ粒子７０をアミノアルキルトリアルコキシシラン等の公知のアミノ基含有シランカップリング剤で処理をして、表面をアミノ基で修飾した磁性ナノ粒子７０として用いてもよい。また、前記表面をアミノ基で修飾した磁性ナノ粒子７０を公知の酸無水物で処理をしてカルボキシル基含有磁性粒子として用いてもよい。
例えば、金属－樹脂複合体をＰｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ、Ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーでコーティングして表面にアミノ基を有する金属－樹脂複合体（以下、「アミノ基含有複合粒子」という。）を合成する。一方、磁性ナノ粒子７０をクエン酸、酒石酸、アスコルビン酸等のヒドロキシ酸でキャッピングして表面にカルボキシル基を有する磁性ナノ粒子７０（以下、「カルボキシル基含有磁性粒子」という。）を合成する。そして、アミノ基含有複合粒子及びカルボキシル基含有磁性粒子を反応させてアミド結合を形成する。ここで、アミド結合の形成は公知の方法を使用することができる。例えば、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ’，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドを架橋剤として使用してもよい。
また、磁性ナノ粒子７０をアミノアルキルトリアルコキシシラン等の公知のアミノ基含有シランカップリング剤で処理をして、表面をアミノ基で修飾した磁性ナノ粒子７０として用いてもよい。また、前記表面をアミノ基で修飾した磁性ナノ粒子７０を公知の酸無水物で処理をしてカルボキシル基含有磁性粒子として用いてもよい。
以上の構成を有するナノ複合体粒子１００は、例えば、金属ナノ粒子２０の表面に抗原又は抗体を吸着させることにより、特に、低濃度域（高感度領域）での目視判定性に優れた免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。さらに、磁性ナノ粒子７０が、前記樹脂ナノ粒子１０及び／又は金属ナノ粒子２０に固定化されているため、通常であれば検出限界以下の、血液、尿、唾液、環境水等の検体に極めて少ない量しか存在しない抗原（抗体）に対しても、抗原－抗体反応を起こした後に磁気的に濃縮をかけることで、検出することが可能となる。そのため、例えば、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の、高感度な判定を可能とする免疫学的測定用標識物質、免疫学的測定用試薬などの目的で好ましく適用できる。また、免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の形態に特に限定はないが、例えば、ナノ複合体粒子１００を水もしくは、ｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用できる。
上記金属ナノ粒子２０の表面に抗原又は抗体を吸着させる方法としては特に限定せず、公知の物理吸着及び化学吸着による方法を用いることができる。金属ナノ粒子２０と抗原又は抗体との結合が強固になるため、化学吸着による方法が好ましい。物理吸着と化学吸着を併用しても良い。
物理吸着としては、例えば、抗原又は抗体を含む緩衝液中にナノ複合体粒子１００を浸漬させ、インキュベートする方法、緩衝液中にナノ複合体粒子１００を浸漬させ、更に抗原又は抗体を加える方法等が挙げられる。
化学吸着としては、抗原又は抗体にＳＨ基を導入し、ナノ複合体粒子１００と反応させて金属－ＳＨ結合を形成する方法、ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入した後、スクシンイミジル化し抗原又は抗体のアミノ基と反応させ化学結合を形成する方法等が挙げられる。ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入する化合物は、例えばアミノ基、ＳＨ基、カルボニル、アミド、イミドなどの金属と配位結合性のある官能基とカルボキシル基の両方を有する化合物が適している。金属との配位結合が強固であるという理由から、官能基としてはＳＨ基が好ましく、ＳＨ基とカルボキシル基を両末端に持つ化合物としては、例えばメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプトラウリン酸などが挙げられる。また、金属と配位結合性のある官能基とカルボキシル基を一分子内に複数有する高分子化合物は、ナノ複合体粒子１００と安定した結合を得られやすい。例えばグルタミン酸やアスパラギン酸のポリペプチドであるポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸は、ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入するための高分子化合物としてより好ましい。
物理吸着としては、例えば、抗原又は抗体を含む緩衝液中にナノ複合体粒子１００を浸漬させ、インキュベートする方法、緩衝液中にナノ複合体粒子１００を浸漬させ、更に抗原又は抗体を加える方法等が挙げられる。
化学吸着としては、抗原又は抗体にＳＨ基を導入し、ナノ複合体粒子１００と反応させて金属－ＳＨ結合を形成する方法、ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入した後、スクシンイミジル化し抗原又は抗体のアミノ基と反応させ化学結合を形成する方法等が挙げられる。ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入する化合物は、例えばアミノ基、ＳＨ基、カルボニル、アミド、イミドなどの金属と配位結合性のある官能基とカルボキシル基の両方を有する化合物が適している。金属との配位結合が強固であるという理由から、官能基としてはＳＨ基が好ましく、ＳＨ基とカルボキシル基を両末端に持つ化合物としては、例えばメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプトラウリン酸などが挙げられる。また、金属と配位結合性のある官能基とカルボキシル基を一分子内に複数有する高分子化合物は、ナノ複合体粒子１００と安定した結合を得られやすい。例えばグルタミン酸やアスパラギン酸のポリペプチドであるポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸は、ナノ複合体粒子１００の表面にカルボキシル基を導入するための高分子化合物としてより好ましい。
次に、ナノ複合体粒子１００を標識物質として使用したアナライトの測定方法、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ及びアナライト検出・定量キットについて説明する。
［ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ］
まず、図２を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ（以下、単に「テストストリップ」と記すことがある）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
まず、図２を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマト用テストストリップ（以下、単に「テストストリップ」と記すことがある）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態のアナライトの測定方法に好ましく使用できるものである。
テストストリップ２００は、メンブレン１１０を備えている。メンブレン１１０には、試料の展開方向において順に、試料添加部１２０、判定部１３０及び吸液部１４０が設けられている。
＜メンブレン＞
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（アナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（アナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
テストストリップ２００は、操作をより簡便にするため、メンブレン１１０を支持する支持体を備えていることが好ましい。支持体としては、例えばプラスチック等を用いることができる。
＜試料添加部＞
テストストリップ２００は、アナライト１６０を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。
テストストリップ２００は、アナライト１６０を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。
＜判定部＞
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。
また、判定部１３０は、標識抗体１５０とアナライト１６０とを含む複合体１７０が、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１に接触するような構成である限り特に限定されない。例えば、メンブレン１１０に、直接、捕捉リガンド１３１が固定されていてもよいし、あるいは、メンブレン１１０に固定されたセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッドに捕捉リガンド１３１が固定されていてもよい。
＜吸液部＞
吸液部１４０は、例えば、セルロ－ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。
吸液部１４０は、例えば、セルロ－ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。
テストストリップ２００は、必要に応じて、さらに、コントロール部等の任意の部位を含んでいてもよい。
＜コントロール部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも下流側に、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも下流側に、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作製され、同様の構成を採ることができる。
［アナライトの測定方法］
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト１６０の測定方法について説明する。
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のアナライト１６０の測定方法について説明する。
本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、試料中に含まれるアナライト１６０を検出又は定量するアナライト１６０の測定方法である。本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、メンブレン１１０、及び当該メンブレン１１０にアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００を用いる。そして、本実施の形態のアナライト１６０の測定方法は、下記工程(I)～(IV)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体をナノ複合体粒子１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程(II)：アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、磁力により回収する工程、
工程(III)：工程(II)において回収された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、テストストリップ２００の判定部１３０にて捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程(IV)：ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
工程(I)：試料に含まれる前記アナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体をナノ複合体粒子１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程(II)：アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、磁力により回収する工程、
工程(III)：工程(II)において回収された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、テストストリップ２００の判定部１３０にて捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程(IV)：ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
工程(I)：
工程(I)は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。なお、前述の通り、本発明のナノ複合体粒子１００は、特に通常であれば検出限界以下の、血液、尿、唾液、環境水等の検体に極めて少ない量しか存在しない抗原（抗体）に対しても、抗原－抗体反応を起こした後に磁気的に濃縮をかけることで、検出することが可能となることから、低濃度の抗原（抗体）を有する検体中で、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させることが、好ましい態様である。もちろん、中～高濃度の抗原（抗体）を有する検体中で接触させることができることは、言うまでもない。
工程(I)は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。なお、前述の通り、本発明のナノ複合体粒子１００は、特に通常であれば検出限界以下の、血液、尿、唾液、環境水等の検体に極めて少ない量しか存在しない抗原（抗体）に対しても、抗原－抗体反応を起こした後に磁気的に濃縮をかけることで、検出することが可能となることから、低濃度の抗原（抗体）を有する検体中で、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させることが、好ましい態様である。もちろん、中～高濃度の抗原（抗体）を有する検体中で接触させることができることは、言うまでもない。
工程(II)：
工程(II)は、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、磁力により回収する工程である。例えば、前記抗原（抗体）を有する検体中に公知の磁石を用いて磁力を加えることで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を検体中で局所的に濃縮し、回収することができる。なお、回収の際に遠心分離法を併用してもよい。
工程(II)は、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、磁力により回収する工程である。例えば、前記抗原（抗体）を有する検体中に公知の磁石を用いて磁力を加えることで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を検体中で局所的に濃縮し、回収することができる。なお、回収の際に遠心分離法を併用してもよい。
工程(III)：
工程(III)は、工程(II)において回収された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、テストストリップ２００の試料添加部１２０に供し、テストストリップ２００上で展開する。このようにして、テストストリップ２００の判定部１３０において、複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。
工程(III)は、工程(II)において回収された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、テストストリップ２００の試料添加部１２０に供し、テストストリップ２００上で展開する。このようにして、テストストリップ２００の判定部１３０において、複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。
なお、捕捉リガンド１３１は、標識抗体１５０には特異的に結合しないために、アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０が判定部１３０に到達した場合、当該アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０は、判定部１３０を通過する。ここで、テストストリップ２００に、標識抗体１５０に特異的に結合する別の捕捉リガンドが固定されたコントロール部（図示省略）が形成されている場合、判定部１３０を通過した標識抗体１５０は、展開を続け、コントロール部で当該別の捕捉リガンドと結合する。その結果、アナライト１６０と複合体１７０を形成していない標識抗体１５０は、コントロール部で捕捉される。
工程(III)の後、必要に応じて工程(IV)の前に、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の生化学検査で汎用される緩衝液で、テストストリップ２００を洗浄する洗浄工程を実施してもよい。洗浄工程によって、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部に捕捉されなかった標識抗体１５０（アナライト１６０と結合しておらず、複合体１７０を形成していない標識抗体１５０）を除去することができる。
洗浄工程を実施することで、工程(IV)において、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部におけるナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収による発色を測定する際に、バックグラウンドの発色強度を低減させることができ、シグナル／バックグラウンド比を高め、一層、検出感度や定量性を向上させることができる。
工程(IV)：
工程(IV)は、ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(III)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。
工程(IV)は、ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(III)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、ナノ複合体粒子１００の局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。
なお、テストストリップ２００にコントロール部が形成されている場合、工程(III)によって、コントロール部にて、標識抗体１５０が別の捕捉リガンドによって捕捉され複合体が形成される。そのため、工程(IV)では、テストストリップ２００おいて、判定部１３０だけでなく、コントロール部においても局在型表面プラズモン共鳴及び／又は電子遷移による光エネルギー吸収による発色を生じさせることができる。このように、判定部１３０とともにコントロール部においても発色強度を測定することで、テストストリップ２００に供した試料が正常に展開して、反応部及び判定部１３０に到達したか否かを確認できる。
＜試料及びアナライト＞
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト１６０として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト１６０がインフルエンザウィルスＮＰ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等の捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
本実施の形態のアナライトの測定方法における試料は、アナライト１６０として、蛋白質などの抗原となり得る物質を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）や食品の抽出液等が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、アナライト１６０がインフルエンザウィルスＮＰ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等の捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
また、前記試料は、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。
前記アナライト１６０としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。アナライト１６０としては、例えば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）、核酸（一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）又は核酸を有する物質、糖（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）又は糖鎖を有する物質、脂質などその他の分子が挙げられ、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１に特異的に結合するものである限り特に限定されないが、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９－９、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウィルスヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、それらの変異株や、それらの構成成分を含む）等が挙げられる。これらの中でも非イオン性界面活性剤により可溶化される抗原が好ましく、ウイルスの核タンパク質のように自己集合体を形成する抗原がより好ましい。
＜標識抗体＞
標識抗体１５０は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂ナノ粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０及び磁性ナノ粒子７０が固定化された構造を有するナノ複合体粒子１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)～(IV)において、標識抗体１５０からナノ複合体粒子１００が脱離しない程度に、抗体にナノ複合体粒子１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体にナノ複合体粒子１００が直接結合してなるものであってもよいし、ナノ複合体粒子１００が、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
標識抗体１５０は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂ナノ粒子１０に複数の金属ナノ粒子２０及び磁性ナノ粒子７０が固定化された構造を有するナノ複合体粒子１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)～(IV)において、標識抗体１５０からナノ複合体粒子１００が脱離しない程度に、抗体にナノ複合体粒子１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体にナノ複合体粒子１００が直接結合してなるものであってもよいし、ナノ複合体粒子１００が、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
また、本実施の形態において、「抗体」としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗コロナウイルス抗体（ここで、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、それらの変異株を含む）、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。なお、抗ウイルス抗体は、その構成成分に対する抗体も含む。
＜標識抗体の好ましい作製方法＞
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）ナノ複合体粒子１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ；
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）ナノ複合体粒子１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ；
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。
［工程Ａ］
工程Ａでは、ナノ複合体粒子１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状のナノ複合体粒子１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。
工程Ａでは、ナノ複合体粒子１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状のナノ複合体粒子１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。
第１のｐＨ条件は、ナノ複合体粒子１００の分散と抗体の活性を維持したままナノ複合体粒子１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２～１０の範囲内の条件が好ましく、さらに例えばｐＨ５～９の範囲内がより好ましい。ナノ複合体粒子１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えるとナノ複合体粒子１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
工程Ａは、第１のｐＨ条件に調整した結合用緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量のナノ複合体粒子１００を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。
［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。
第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２～１０の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５～９の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。
工程Ｂは、ブロッキング剤を第２のｐＨの条件に調整したブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体１５０に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能なブロッキング剤としては、特に制限はなく公知のものが使用でき、アニオン性の性質が強いものや、カチオン性の性質が強いもの、それ以外のものも使用できる。例えば、蛋白質であれば、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン、乳清（ホエイ）などを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体１５０が均一分散した分散液が得られる。
上記工程Ａおよび工程Ｂにおいて、金属ナノ粒子２０として白金ナノ粒子を有するナノ複合体粒子１００は、ｐＨによる凝集が起こりにくく、酸性～アルカリ性まで広い範囲のｐＨで処理が可能である。従って、白金ナノ粒子を用いた本発明のナノ複合体粒子１００は、標識抗体の作製条件の制限を受けにくいという利点もある。
以上のようにして、標識抗体１５０の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理などを実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８～９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８～９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
［アナライト測定用キット］
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばテストストリップ２００を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０の検出又は定量するためのキットである。
本発明の一実施の形態に係るアナライト測定用キットは、例えばテストストリップ２００を用いて、本実施の形態のアナライトの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０の検出又は定量するためのキットである。
本実施の形態のアナライト測定用キットは、
メンブレン１１０と、
メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００と、
アナライト１６０に特異的に結合する抗体をナノ複合体粒子１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のアナライト測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素（例えば展開液など）を含むものであってもよい。
メンブレン１１０と、
メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００と、
アナライト１６０に特異的に結合する抗体をナノ複合体粒子１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態のアナライト測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素（例えば展開液など）を含むものであってもよい。
本実施の形態に係るアナライト測定用キットを使用するにあたっては、試料中のアナライト１６０と検出試薬中の標識抗体１５０とを接触させて工程(I)及び工程(II)を実施した後、テストストリップ２００の試料添加部１２０に試料を供して、工程(III)、工程(IV)を順次実施してもよい。当然ながら、例えば中～高濃度の抗原（抗体）を有する検体中工程(I)を実施する場合、磁気的な濃縮をかけなくても、公知の遠心分離法等で、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を回収できる場合がある。その場合は、工程(II)を省略することができる。
また、ナノ複合体粒子１００の免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬以外の用途としては、固体触媒、顔料、塗料、導電性材料、電極、センサー素子、記録材料、磁性流体としての特性を活かしたスピーカー及びシール材料、磁気ハイパーサーミア（磁気温熱療法）、ＭＲＩの造影剤、ドラッグデリバリーシステム、特定の物質（医薬品、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、タンパク質、ペプチド、糖、核酸、ホルモン、病原体、毒素等）の選択的分離及び捕集、細胞の操作、血液の浄化（病原体の除去）として好ましく適用できる。
次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。
＜金属－樹脂複合体の吸光度測定＞
金属－樹脂複合体の吸光度は、石英ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した金属－樹脂複合体分散液（分散媒：水）を入れ、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ３６００）を用いて、金－樹脂複合体の場合５７０ｎｍ、白金－樹脂複合体の場合４００ｎｍの吸光度を測定した。
金属－樹脂複合体の吸光度は、石英ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した金属－樹脂複合体分散液（分散媒：水）を入れ、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ３６００）を用いて、金－樹脂複合体の場合５７０ｎｍ、白金－樹脂複合体の場合４００ｎｍの吸光度を測定した。
＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間乾燥を行った。乾燥前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間乾燥を行った。乾燥前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
固形分濃度（ｗｔ％）＝［乾燥後の重量（ｇ）／乾燥前の重量（ｇ）］×１００
また、上記乾燥処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間熱処理を行い、熱処理前後の重量を測定し、下記式よりナノ複合体粒子中の金属および金属酸化物の担持量（Ｍ）、又は、金属－樹脂複合体中の金属担持量（Ｍ１）をそれぞれ算出した。
担持量Ｍ又はＭ１（ｗｔ％）＝
［熱処理後の重量（ｇ）／熱処理前の重量（ｇ）］×１００
担持量Ｍ又はＭ１（ｗｔ％）＝
［熱処理後の重量（ｇ）／熱処理前の重量（ｇ）］×１００
磁性ナノ粒子の担持量（Ｍ２）は、上記Ｍ及びＭ１に基づき、下式により算出した。
Ｍ２（ｗｔ％）＝［（Ｍ－Ｍ１）／（１００－Ｍ１）］×１００
Ｍ２（ｗｔ％）＝［（Ｍ－Ｍ１）／（１００－Ｍ１）］×１００
＜樹脂ナノ粒子、金属－樹脂複合体粒子又はナノ複合体粒子の平均粒子径の測定＞
樹脂ナノ粒子、金属－樹脂複合体粒子又はナノ複合体粒子の分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の樹脂ナノ粒子、金属－樹脂複合体粒子又はナノ複合体粒子の面積平均径を測定した。
樹脂ナノ粒子、金属－樹脂複合体粒子又はナノ複合体粒子の分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の樹脂ナノ粒子、金属－樹脂複合体粒子又はナノ複合体粒子の面積平均径を測定した。
＜金属ナノ粒子の平均粒子径の測定＞
ナノ複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の金属ナノ粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
ナノ複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の金属ナノ粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
＜磁性ナノ粒子の平均粒子径の測定＞
ナノ複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の磁性ナノ粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
ナノ複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の磁性ナノ粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
＜ゼータ電位測定＞
ゼータ電位は、測定装置として、Ｍａｌｖｅｒｎ社製 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳを用い、電気泳動光散乱法により測定した。サンプルを純水で０．０１ｗｔ％に希釈し、塩酸又はＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ３～１０における各ｐＨ値に調整したものを測定サンプルとする。ｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ ＬＡＱＵＡ ｔｗｉｎ）を用いてｐＨ測定した後、ゼータ電位測定を行うことによって、ｐＨ３～１０の複数点のｐＨにおけるゼータ電位の変化の挙動を測定した。ｐＨ３～６の酸性領域におけるゼータ電位の最大値とｐＨ６～１０のアルカリ性領域におけるゼータ電位の最小値からゼータ電位の変化幅を算出した。また、ゼータ電位が０ｍＶに近い、０ｍＶより大きい任意の１点のゼータ電位、及び、０ｍＶより小さい任意の１点のゼータ電位を結ぶ１次関数を求め、ゼータ電位が０ｍＶとなるｐＨ、すなわちゼロ電荷点（ｚｅｒｏ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ）を算出した。
ゼータ電位は、測定装置として、Ｍａｌｖｅｒｎ社製 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳを用い、電気泳動光散乱法により測定した。サンプルを純水で０．０１ｗｔ％に希釈し、塩酸又はＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ３～１０における各ｐＨ値に調整したものを測定サンプルとする。ｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ ＬＡＱＵＡ ｔｗｉｎ）を用いてｐＨ測定した後、ゼータ電位測定を行うことによって、ｐＨ３～１０の複数点のｐＨにおけるゼータ電位の変化の挙動を測定した。ｐＨ３～６の酸性領域におけるゼータ電位の最大値とｐＨ６～１０のアルカリ性領域におけるゼータ電位の最小値からゼータ電位の変化幅を算出した。また、ゼータ電位が０ｍＶに近い、０ｍＶより大きい任意の１点のゼータ電位、及び、０ｍＶより小さい任意の１点のゼータ電位を結ぶ１次関数を求め、ゼータ電位が０ｍＶとなるｐＨ、すなわちゼロ電荷点（ｚｅｒｏ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ）を算出した。
［作製例１］
＜樹脂ナノ粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（１．５０ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５０ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３５９ｎｍの樹脂ナノ粒子Ａ－１を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂ナノ粒子分散液Ｂ－１を得た。
＜樹脂ナノ粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（１．５０ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５０ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３５９ｎｍの樹脂ナノ粒子Ａ－１を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂ナノ粒子分散液Ｂ－１を得た。
［実施例１］
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ－１（９１．５ｇ）に純水５４ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（１００ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を２４時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ－１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－１を得た。
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ－１（９１．５ｇ）に純水５４ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（１００ｇ）を加え、３０℃で３時間撹拌した。この混合液を２４時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ－１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－１を得た。
次に、純水１３９２ｇにＣ－１（２０．６ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（４０ｇ）を２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３６７ｎｍの白金－樹脂複合体粒子Ｄ－１を得た。Ｄ－１を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－１を得た。Ｅ－１中の白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１の吸光度は１．８６であった。また、Ｆ－１における白金ナノ粒子の平均粒子径は３．５ｎｍ、白金の担持量は３５．５ｗｔ％であった。
走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）によって観察したところ、この白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１において、白金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子に完全に内包された内包白金粒子と、樹脂ナノ粒子内に埋包された部位及び樹脂ナノ粒子外に露出した部位を有する一部露出白金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の白金ナノ粒子が、樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布していた。なお、白金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子の表面から、深さ方向に粒子半径の４０％の範囲には９７％存在した。
走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）によって観察したところ、この白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１において、白金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子に完全に内包された内包白金粒子と、樹脂ナノ粒子内に埋包された部位及び樹脂ナノ粒子外に露出した部位を有する一部露出白金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の白金ナノ粒子が、樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布していた。なお、白金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子の表面から、深さ方向に粒子半径の４０％の範囲には９７％存在した。
＜ナノ複合体粒子の合成＞
白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１にε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）をコーティングして、ＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体を得た。このＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体は、表面にアミノ基を有する。一方、磁性ナノ粒子である超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（平均粒子径約１５ｎｍ）とクエン酸を反応させ、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＳＰＩＯＮｓ）を得た。このクエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子は、表面にカルボキシル基を有する。このＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体及び、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたＥＤＣカップリング反応を行い、白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子がアミド結合により接触し、固定化されたナノ複合体粒子Ｇ－１を合成した。ナノ複合体粒子Ｇ－１の平均粒子径は３８０ｎｍであった。また、磁性ナノ粒子の担持量は、１０ｗｔ％であった。
白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１にε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）をコーティングして、ＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体を得た。このＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体は、表面にアミノ基を有する。一方、磁性ナノ粒子である超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（平均粒子径約１５ｎｍ）とクエン酸を反応させ、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＳＰＩＯＮｓ）を得た。このクエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子は、表面にカルボキシル基を有する。このＰＬＬ被覆白金－樹脂複合体及び、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたＥＤＣカップリング反応を行い、白金－樹脂複合体粒子Ｆ－１にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子がアミド結合により接触し、固定化されたナノ複合体粒子Ｇ－１を合成した。ナノ複合体粒子Ｇ－１の平均粒子径は３８０ｎｍであった。また、磁性ナノ粒子の担持量は、１０ｗｔ％であった。
［実施例２］
＜金－樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ－１（９１．５ｇ）に純水２５５ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（１４７ｇ）を加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ－１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、２．５ｗｔ％の金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－２を得た。
＜金－樹脂複合体粒子の合成＞
Ｂ－１（９１．５ｇ）に純水２５５ｇを加えた後、４００ｍＭ塩化金酸水溶液（１４７ｇ）を加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）によりＡ－１を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、２．５ｗｔ％の金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－２を得た。
次に、純水１５８０ｇにＣ－２（４３．３ｇ）を加え、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０．０ｇ）を２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３６３ｎｍの金－樹脂複合体粒子Ｄ－１を得た。Ｄ－１を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－２を得た。Ｅ－２中の金－樹脂複合体粒子Ｆ－２の吸光度は、１．５１であった。また、Ｆ－２における金ナノ粒子の平均粒子径は３０ｎｍ、金の担持量は４８．１ｗｔ％であった。
走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）によって観察したところ、この金－樹脂複合体粒子Ｆ－２において、金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂ナノ粒子内に埋包された部位及び樹脂ナノ粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金ナノ粒子が、樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布していた。なお、金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子の表面から、深さ方向に粒子半径の４０％の範囲には９７％存在した。
走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）によって観察したところ、この金－樹脂複合体粒子Ｆ－２において、金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂ナノ粒子内に埋包された部位及び樹脂ナノ粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金ナノ粒子が、樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布していた。なお、金ナノ粒子は、樹脂ナノ粒子の表面から、深さ方向に粒子半径の４０％の範囲には９７％存在した。
＜ナノ複合体粒子の合成＞
金－樹脂複合体粒子Ｆ－２にε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）をコーティングして、ＰＬＬ被覆金－樹脂複合体を得た。このＰＬＬ被覆金－樹脂複合体は、表面にアミノ基を有する。一方、磁性ナノ粒子である超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（平均粒子径約１５ｎｍ）とクエン酸を反応させ、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＳＰＩＯＮｓ）を得た。このクエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子は、表面にカルボキシル基を有する。このＰＬＬ被覆金－樹脂複合体及び、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたＥＤＣカップリング反応を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－２にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子がアミド結合により接触し、固定化されたナノ複合体粒子Ｇ－２を合成した。ナノ複合体粒子Ｇ－２の平均粒子径は３８０ｎｍであった。また、磁性ナノ粒子の担持量は、１１ｗｔ％であった。
金－樹脂複合体粒子Ｆ－２にε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）をコーティングして、ＰＬＬ被覆金－樹脂複合体を得た。このＰＬＬ被覆金－樹脂複合体は、表面にアミノ基を有する。一方、磁性ナノ粒子である超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（平均粒子径約１５ｎｍ）とクエン酸を反応させ、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＳＰＩＯＮｓ）を得た。このクエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子は、表面にカルボキシル基を有する。このＰＬＬ被覆金－樹脂複合体及び、クエン酸キャップＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたＥＤＣカップリング反応を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－２にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子がアミド結合により接触し、固定化されたナノ複合体粒子Ｇ－２を合成した。ナノ複合体粒子Ｇ－２の平均粒子径は３８０ｎｍであった。また、磁性ナノ粒子の担持量は、１１ｗｔ％であった。
［試験例］
（標識抗体分散液の調製）
抗CRPモノクローナル抗体（CalBioReagents社 ＃M353）２５μｇと１００ｍＭ ホウ酸水溶液（ｐＨ８．５）０．４５ｍＬを混合した後、５００μgのナノ複合体粒子Ｇ－１を含む分散液を添加した。室温で３０分間転倒撹拌を行い、ナノ複合体粒子Ｇ－１に抗CRPモノクローナル抗体を結合させた。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物にブロックエース（ＤＳバイオファーマ製）の１ｗｔ％水溶液０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行った。室温で３０分間転倒撹拌を行い、ブロック処理を行った。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８）０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理を行った。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤および、５ｗｔ％のスクロースを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８）０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行うことによって、抗CRPモノクローナル抗体をナノ複合体粒子Ｇ－１で標識した標識抗体分散液を得た。
（標識抗体分散液の調製）
抗CRPモノクローナル抗体（CalBioReagents社 ＃M353）２５μｇと１００ｍＭ ホウ酸水溶液（ｐＨ８．５）０．４５ｍＬを混合した後、５００μgのナノ複合体粒子Ｇ－１を含む分散液を添加した。室温で３０分間転倒撹拌を行い、ナノ複合体粒子Ｇ－１に抗CRPモノクローナル抗体を結合させた。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物にブロックエース（ＤＳバイオファーマ製）の１ｗｔ％水溶液０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行った。室温で３０分間転倒撹拌を行い、ブロック処理を行った。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８）０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理を行った。
次に、３０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤および、５ｗｔ％のスクロースを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８）０．５ｍＬを添加し、１０秒間超音波分散処理を行うことによって、抗CRPモノクローナル抗体をナノ複合体粒子Ｇ－１で標識した標識抗体分散液を得た。
（イムノクロマトストリップの作製）
幅２５ｍｍのニトロセルロース製のメンブレン３の中央に、抗CRPモノクローナル抗体（CalBioReagents社 ＃M354）を塗布し、判定部としてのテストライン（ＴＬ）４を描画した。さらに、テストライン４の３ｍｍ下流側に抗マウスIgG抗体を塗布してコントロール部としてのコントロールライン５を描画した。５０℃で乾燥した後、図３に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、支持体１（ラミネートフィルム）、試料添加部２（ガラスファイバー不織布）および吸液部６（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップを作製した。
幅２５ｍｍのニトロセルロース製のメンブレン３の中央に、抗CRPモノクローナル抗体（CalBioReagents社 ＃M354）を塗布し、判定部としてのテストライン（ＴＬ）４を描画した。さらに、テストライン４の３ｍｍ下流側に抗マウスIgG抗体を塗布してコントロール部としてのコントロールライン５を描画した。５０℃で乾燥した後、図３に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、支持体１（ラミネートフィルム）、試料添加部２（ガラスファイバー不織布）および吸液部６（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップを作製した。
（展開液の調製）
５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．０ｗｔ％のウシ血清アルブミンおよび２．０ｗｔ％のセテス２０を含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液とした。
５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．０ｗｔ％のウシ血清アルブミンおよび２．０ｗｔ％のセテス２０を含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液とした。
［試験例１］
（イムノクロマト法による評価）
展開液を用いてＣＲＰ抗原（ＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＲＰ Ａｇ ＨＰ抗原）を所定濃度に希釈することにより、ＣＲＰ陽性コントロールの検体液を調製した。陰性コントロールの検体液には、抗原を非添加の展開液を使用した。検体液５０μｌに標識抗体分散液３μｌを混合し、そのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、試料を展開させた。検体液を滴下してから３０分経過後のテストライン４の発色強度を、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。テストライン４の発色強度について、１３ｍＡＢＳ以上を陽性（＋）、３ｍＡＢＳ以上１３ｍＡＢＳ未満を擬陽性（±）、３ｍＡＢＳ未満を陰性（－）と判定した。イムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、抗CRPモノクローナル抗体をナノ複合体粒子Ｇ－１で標識した標識抗体を用いたイムノクロマト法により、ＣＲＰ抗原濃度１．２ng/mlまで陽性判定可能であった。
（イムノクロマト法による評価）
展開液を用いてＣＲＰ抗原（ＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＲＰ Ａｇ ＨＰ抗原）を所定濃度に希釈することにより、ＣＲＰ陽性コントロールの検体液を調製した。陰性コントロールの検体液には、抗原を非添加の展開液を使用した。検体液５０μｌに標識抗体分散液３μｌを混合し、そのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、試料を展開させた。検体液を滴下してから３０分経過後のテストライン４の発色強度を、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。テストライン４の発色強度について、１３ｍＡＢＳ以上を陽性（＋）、３ｍＡＢＳ以上１３ｍＡＢＳ未満を擬陽性（±）、３ｍＡＢＳ未満を陰性（－）と判定した。イムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、抗CRPモノクローナル抗体をナノ複合体粒子Ｇ－１で標識した標識抗体を用いたイムノクロマト法により、ＣＲＰ抗原濃度１．２ng/mlまで陽性判定可能であった。
イムノクロマト法による評価結果を表１に示した。
［試験例２］
（磁気分離による１０倍濃縮）
所定濃度に希釈したＣＲＰ陽性コントロールおよび陰性コントロールの検体液１０ｍｌに対して、標識抗体分散液６０μｌを混合して、検体液と標識抗体の混合液を調製した。磁気分離カラムおよびマグネットを用いて磁気分離濃縮を行い、検体液と標識抗体の１０倍濃縮液１ｍｌを調製した。
（イムノクロマト法による評価）
１０倍濃縮液１ｍｌのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、上記の実施例と同様に評価を行った。磁気分離による１０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、磁気分離による１０倍濃縮を併用した場合、ＣＲＰ抗原濃度０．３ng/mlまで陽性判定可能であった。
（磁気分離による１０倍濃縮）
所定濃度に希釈したＣＲＰ陽性コントロールおよび陰性コントロールの検体液１０ｍｌに対して、標識抗体分散液６０μｌを混合して、検体液と標識抗体の混合液を調製した。磁気分離カラムおよびマグネットを用いて磁気分離濃縮を行い、検体液と標識抗体の１０倍濃縮液１ｍｌを調製した。
（イムノクロマト法による評価）
１０倍濃縮液１ｍｌのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、上記の実施例と同様に評価を行った。磁気分離による１０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、磁気分離による１０倍濃縮を併用した場合、ＣＲＰ抗原濃度０．３ng/mlまで陽性判定可能であった。
磁気分離による１０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を表２に示した。
［試験例３］
（磁気分離による４０倍濃縮）
所定濃度に希釈したＣＲＰ陽性コントロールおよび陰性コントロールの検体液４０ｍｌに対して、標識抗体分散液６０μｌを混合して、検体液と標識抗体の混合液を調製した。磁気分離カラムおよびマグネットを用いて磁気分離濃縮を行い、検体液と標識抗体の４０倍濃縮液１ｍｌを調製した。
（イムノクロマト法による評価）
４０倍濃縮液１ｍｌのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、上記の実施例と同様に評価を行った。磁気分離による４０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、磁気分離による４０倍濃縮を併用した場合、ＣＲＰ抗原濃度０．０８ng/mlまで陽性判定可能であった。
（磁気分離による４０倍濃縮）
所定濃度に希釈したＣＲＰ陽性コントロールおよび陰性コントロールの検体液４０ｍｌに対して、標識抗体分散液６０μｌを混合して、検体液と標識抗体の混合液を調製した。磁気分離カラムおよびマグネットを用いて磁気分離濃縮を行い、検体液と標識抗体の４０倍濃縮液１ｍｌを調製した。
（イムノクロマト法による評価）
４０倍濃縮液１ｍｌのうち３５μｌをイムノクロマトストリップの試料添加部２に滴下し、上記の実施例と同様に評価を行った。磁気分離による４０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を下表に示す。評価の結果、磁気分離による４０倍濃縮を併用した場合、ＣＲＰ抗原濃度０．０８ng/mlまで陽性判定可能であった。
磁気分離による４０倍濃縮を併用したイムノクロマト法による評価結果を表３に示した。
以上の結果から、本発明の樹脂ナノ粒子を用い、抗原－抗体反応の後で磁気的に濃縮をかけることによって、通常であれば検出限界以下の、検体に極めて少ない量しか存在しないアナライトを高感度に検出することが可能となることが確認された。
以上、本発明の実施の形態を例示の目的で詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態に制約されることはなく、種々の変形が可能である。
１ 支持体
２ 試料添加部
３ メンブレン
４ テストライン（ＴＬ）
５ コントロールライン
６ 吸液部
１０ 樹脂ナノ粒子
２０ 金属ナノ粒子
３０ 内包粒子
４０ 一部露出粒子
５０ 表面吸着粒子
６０ 表層部
７０ 磁性ナノ粒子
１００ ナノ複合体粒子
１１０ メンブレン
１２０ 試料添加部
１３０ 判定部
１３１ 捕捉リガンド
１４０ 吸液部
１５０ 標識抗体
１６０ アナライト
１７０ 複合体
２００ テストストリップ
２ 試料添加部
３ メンブレン
４ テストライン（ＴＬ）
５ コントロールライン
６ 吸液部
１０ 樹脂ナノ粒子
２０ 金属ナノ粒子
３０ 内包粒子
４０ 一部露出粒子
５０ 表面吸着粒子
６０ 表層部
７０ 磁性ナノ粒子
１００ ナノ複合体粒子
１１０ メンブレン
１２０ 試料添加部
１３０ 判定部
１３１ 捕捉リガンド
１４０ 吸液部
１５０ 標識抗体
１６０ アナライト
１７０ 複合体
２００ テストストリップ
Claims (12)
- 樹脂ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～１００ｎｍの複数の金属ナノ粒子と、
前記樹脂ナノ粒子よりも相対的に粒子径の小さな、平均粒子径が１～５０ｎｍの複数の磁性ナノ粒子と、
を備え、
平均粒子径が５０～１１００ｎｍであり、
前記金属ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子に固定化されているとともに、前記磁性ナノ粒子が、前記樹脂ナノ粒子及び／又は前記金属ナノ粒子の表面に固定化されていることを特徴とする、ナノ複合体粒子。 - 前記金属ナノ粒子が、金、銀、銅、パラジウム、白金、スズ、ロジウム、イリジウム又はこれらの合金の粒子である、請求項１に記載のナノ複合体粒子。
- 前記磁性ナノ粒子が、鉄、コバルト、ニッケル、マンガン、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＡＦｅ２Ｏ４（ここで、ＡはＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ又はＺｎを意味する）、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔ、ＦｅＮｉ、またはＦｅＣｏである、請求項１または２に記載のナノ複合体粒子。
- 前記樹脂ナノ粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ複合体粒子。
- 前記金属ナノ粒子の中の少なくとも一部の粒子が、前記樹脂ナノ粒子の表層部において三次元的に分布している、請求項１～４のいずれか１項に記載のナノ複合体粒子。
- 前記金属ナノ粒子の６０ｗｔ％～１００ｗｔ％が、前記表層部に存在する、請求項５に記載のナノ複合体粒子。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ複合体粒子を備えたことを特徴とする、標識物質。
- 前記ナノ複合体粒子の表面に、抗原または抗体を吸着させて使用するものである、請求項７に記載の標識物質。
- 請求項７又は８に記載の標識物質を用いることを特徴とする、免疫学的測定法。
- 請求項７又は８に記載の標識物質を用いることを特徴とする、免疫学的測定用試薬。
- 試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するアナライトの測定方法であって、
メンブレン、及び当該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用い、下記工程(I)～(IV)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１に記載のナノ複合体粒子で標識した標識抗体と、を接触させて、前記アナライトと前記標識抗体とを含む複合体を得る工程、
工程(II)：前記アナライトと前記標識抗体とを含む複合体を、磁力により回収する工程、
工程(III)：前記工程(II)において回収された、前記アナライトと前記標識抗体とを含む複合体を、前記ラテラルフロー型クロマト用テストストリップの前記判定部にて、前記捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(IV)：前記ナノ複合体粒子の局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とするアナライトの測定方法。 - ラテラルフロー型クロマト用テストストリップを用いて、試料中に含まれるアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キットであって、
メンブレン、及び当該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマト用テストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、請求項１に記載のナノ複合体粒子で標識
した標識抗体を含む検出試薬と、
を含むアナライトを検出又は定量するためのアナライト測定用キット。
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2021
- 2021-03-03 JP JP2021033134A patent/JP7709837B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110003392A1 (en) | 2009-06-12 | 2011-01-06 | Washington, University Of | System and Method for Magnetically Concentrating and Detecting Biomarkers |
| JP2020177035A (ja) | 2014-07-01 | 2020-10-29 | 日鉄ケミカル＆マテリアル株式会社 | 標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ |
| JP2019519558A (ja) | 2016-06-29 | 2019-07-11 | バイオ−オン ソシエタ ペル アチオニ | 機能性金属ナノ構造体を含有する生体適合性ポリマーナノ粒子、調製方法ならびに診断分野および／または治療分野における相対的使用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shouhu Xuan et al.，Preparation, Characterization, and Catalytic Activity of Core/Shell Fe3O4@Polyaniline@Au Nanocomposites，Langmuir，2009年，25(19)，11835-11843 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022134172A (ja) | 2022-09-15 |
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