JP7710754B2

JP7710754B2 - 小胞体ストレス誘発物質で処理された細胞由来のエキソソームおよびその用途

Info

Publication number: JP7710754B2
Application number: JP2023536117A
Authority: JP
Inventors: ユ，ギョンロク; オ，ミギョン; チュ，ハンソル
Original assignee: ソウルナショナルユニヴァーシティアールアンドディービーファウンデーション
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2025-07-22
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: WO2022131742A1; KR20220085036A; JP2023554034A

Description

本出願は、２０２０年１２月１４日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－０１７４５７６号を優先権として主張し、当該明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明は、小胞体ストレスを誘導した間葉系幹細胞由来のエキソソームの治療的用途に関する。

間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）は、免疫調節特性を有することが知られているが、これは、免疫抑制、血管調節および傍分泌因子（ｐａｒａｃｒｉｎｅｆａｃｔｏｒ）の活動によって媒介される。知られた傍分泌セクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）には、免疫調節サイトカイン、成長因子および小さい膜小胞の分泌が含まれる。しかしながら、間葉系幹細胞の直接的な使用は、その表現型や機能的安定性を持続させること、または高い分離や取り扱い費用などの問題点が存在する。

間葉系幹細胞セクレトーム（ＭＳＣｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）のうちエキソソームは、細胞間コミュニケーションにおいて傍分泌因子の伝達を媒介し、免疫調節に重要な役割をする。エキソソームは、細胞外空間に放出されるサイズが３０～１５０ｎｍの小さい膜脂質小胞であり、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはその他の構成要素を標的細胞に伝達し、免疫調節経路の活性化を促進する。特に、間葉系幹細胞から分泌するエキソソームは、幹細胞が有する再生医学的な治療効能を示すことが知られている。エキソソームの機能と伝達する要素は、細胞類型によって異なっており、細胞ストレスは、エキソソームが伝達する要素に影響を及ぼすことができる。

小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）は、細胞恒常性を保証するためのシグナル伝達経路の調整に重要な役割をするが、新しく合成されたタンパク質は、ＥＲ膜を介して折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）および転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を経験する。しかしながら、ストレスの多い病理学的および生理的条件でＥＲが恒常性を維持できなくなった場合、ＵＰＲ（ＵｎｆｏｌｄｅｄＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｐｏｎｓｅ）が活性化し、細胞機能に影響を及ぼすことができる。長期的なＥＲの機能障害またはストレスは、代謝性疾患および炎症関連疾患を含む様々な病気の病因に関与する。タプシガルギン（ＴＳＧ，ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）は、細胞質カルシウム濃度を高め、ＥＲカルシウム貯蔵を枯渇させて、ＥＲストレスを誘発することが知られている。

韓国登録特許第１０－１９８０４５３号は、幹細胞由来のエキソソーム生成促進用組成物に関し、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）またはＡＩＣＡＲ（５－Ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を用いて幹細胞由来のエキソソームの生産量やエキソソーム内タンパク質およびＲＮＡの含有量を増加させる組成物および方法を開示している。しかしながら、タプシガルギンなど小胞体ストレス誘発物質が処理された幹細胞から分泌されるエキソソームに関する研究や記載は開示されていない。

Ｋｉｍ，Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｗ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｇ．＆Ｋｉｍ，Ｓ．Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ－ＰｒｉｍｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＳｔｉｍｕｌａｔｅＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌａｇｅｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＭａｔｒｉｘＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴｅｎｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｃｉｅｎｃｅｓ２０，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２００３０４７２（２０１９）。Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．ｅｔａｌ．ＨｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｒｅｄｕｃｅｃｏｌｉｔｉｓｉｎｍｉｃｅｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＮＯＤ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｏＣＯＸ２．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４５，１３９２－１４０３．ｅ１３９１－１３９８，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．０８．０３３（２０１３）。Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｙ．ｅｔａｌ．Ｘｅｎｏ－ＦｒｅｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＨｕｍａｎＷｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｏｌｉｔｉｓｂｙＵｐｒｅｇｕｌａｔｅｄＩｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ＤｉｏｘｙｇｅｎａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＣｌｉｎＭｅｄ９，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９０９２９１３（２０２０）。

本発明者らは、間葉系幹細胞を直接使用する治療の代案として間葉系幹細胞のセクレトームを提供するために鋭意努力した結果、タプシガルギンなど小胞体ストレス誘発物質で小胞体にストレスを誘発した間葉系幹細胞から分泌されたエキソソームの場合、Ｔ細胞とマクロファージの活性化および分極化に関与することを確認し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物およびその用途を提供することにある。

本発明は、小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記小胞体ストレス誘発物質は、タプシガルギン（ＴＳＧ，ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、ブレフェルジンＡ（ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ，ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）およびＭＧ１３２から成る群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ）、胎盤、末梢血液、卵管、角膜基質、肺、筋肉および胎児肝から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の組織から収得された間葉系幹細胞であってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記エキソソームのサイズは、１０～２００ｎｍであってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記炎症性疾患は、急性または慢性炎症疾患、慢性気管支炎、鼻炎、関節炎、自己免疫疾患、移植拒否および炎症性腸疾患から成る群から
選ばれるいずれか１つ以上であってもよい。

本発明は、また、小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む免疫調節用組成物を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記免疫調節は、抗炎症性サイトカイン（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）、調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ）およびＭ２型マクロファージ（Ｍ２－ｔｙｐｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のレベルを増加させ、前炎症性サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ）およびＭ１型マクロファージ（Ｍ１－ｔｙｐｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のレベルを減少させる免疫調節であってもよい。

本発明は、また、小胞体ストレス誘発物質を間葉系幹細胞に処理する段階を含む間葉系幹細胞由来のエキソソームの生産促進方法を提供する。

本発明は、また、炎症性疾患の患者に小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む組成物を投与する段階を含む炎症性疾患の治療方法を提供する。

本発明は、また、炎症性疾患の予防または治療に使用するための小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む組成物の用途を提供する。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のエキソソームは、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ；ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０）およびＴＳＧ１０１を含む膜結合タンパク質含有量が低いため、母ＭＳＣより免疫原性が低く、ＭＨＣ不一致受容体で同種免疫反応の活性化による拒否を起こさないことが知られている。

これより、本発明者らは、ＭＳＣ由来のエキソソームを免疫介在性炎症性疾患の治療に適用するために、小胞体（ＥＲ）ストレス誘導剤であるタプシガルギン（ＴＳＧ，ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）で処理されたヒトＷｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ由来のＭＳＣ（ＷＪ－ＭＳＣ）から分泌されるエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）が向上した免疫調節特性を確認した。

ＴＳＧでＷＪ－ＭＳＣを刺激する場合、エキソソームの分泌が増加し、ＩＬ－１０、ＣＯＸ２またはＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）のような免疫調節や抗炎症因子の収率および発現が増加し、前炎症因子（ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ－１β）の発現レベルが減少したり、類似に維持された。上記のような結果は、ＴＳＧ－Ｅｘｏでも類似に確認され、これは、ＴＳＧ誘導エキソソーム放出が炎症または老化関連分泌メカニズム（ＳＡＳＰ）と異なる分泌メカニズムを有することを示唆した。

また、ＴＳＧ－Ｅｘｏは、ヒトＭＳＣ由来にもかかわらず、マウス大腸炎モデルに投与されたとき、明確な免疫拒否反応が観察されず、これは、ＴＳＧ－Ｅｘｏが異種システムでも宿主により免疫耐性があり、将来臨床適用に有利であることを意味した。ＴＳＧ－Ｅｘｏは、マウス大腸炎モデルで炎症反応を減らし、腸管バリア完全性（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持することによって、大腸炎を実質的に緩和させた。ＴＳＧ－Ｅｘｏで処理された大腸炎マウス結腸でＴｒｅｇｓおよびＭ２型マクロファージの有意な増加は、ＴＳＧ－Ｅｘｏの抗炎症効果を示唆する。また、Ｃｏｎ
Ａ刺激ＭＮＣ（単核細胞）とともに処理するとき、エキソソームの抗炎症因子がＭＮＣに効率的に伝達されたので、エキソソームおよびエキソソーム処理されたＭＮＣに類似の発現が発生した。ＴＳＧ－Ｅｘｏは、対照群エキソソームより優れたＴ細胞／マクロファージの分極化調節を示したことから、エキソソームのセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）は、エキソソームの治療効果の予測に対する信頼できる指標となりうる。

ＴＳＧ－Ｅｘｏは、ヒト末梢血液由来のＴ細胞の増殖とＴｈ１およびＴｈ１７分化抑制効果が顕著に向上したのに対し、調節性Ｔ細胞およびＭ２型マクロファージは、対照群エキソソーム処理群に比べて豊富であった。これは、腸のＴｒｅｇｓとマクロファージがＭＳＣエキソソームの抗炎症効果に対する媒介体となりうることを示唆する。ＴｒｅｇｓおよびＭ２型マクロファージの上向き調節は、疾患活動性スコア、組織学的スコアおよび好中球活動減少によって提案されたように、腸恒常性を維持した。

このようなデータは、ＴＳＧ処理がＷＪ－ＭＳＣのエキソソーム放出を誘導するのに十分であり、ＴＳＧ－Ｅｘｏの免疫調節特性を促進したことを意味するので、ＴＳＧ処理ＭＳＣまたはＴＳＧ－Ｅｘｏが大腸炎治療のための新しい治療方法を提供できることを示す。

したがって、本発明は、小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することができる。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ）、胎盤、末梢血液、卵管、角膜基質、肺、筋肉および胎児肝から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の組織から収得された間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、前記間葉系幹細胞は、ウォートンゼリーから収得された間葉系幹細胞であってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記エキソソームのサイズは、１０～２００ｎｍであってもよい。好ましくは、前記エキソソームのサイズは、３０～１５０ｎｍであってもよく、より好ましくは、５０～１２０ｎｍであってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記炎症性疾患は、急性または慢性炎症疾患、慢性気管支炎、鼻炎、関節炎、自己免疫疾患、移植拒否および炎症性腸疾患から成る群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよい。好ましくは、前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患であってもよく、前記炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病またはベーチェット病であってもよい。

本発明は、また、小胞体ストレス誘発物質を間葉系幹細胞に処理する段階を含む間葉系幹細胞由来のエキソソームの生産促進方法を提供することができる。

前記生産促進は、エキソソームの数やエキソソームのタンパク質およびｍＲＮＡ生産促進を意味し得る。

本発明は、また、炎症性疾患の患者に小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む組成物を投与する段階を含む炎症性疾患の治療方法を提供することができる。

本発明は、また、炎症性疾患の予防または治療に使用するための小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを含む組成物の用途を提供することができる。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ）、胎盤、末梢血液、卵管、角膜基質、肺、筋肉および胎児肝から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の組織から収得された間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、前記間葉系幹細胞は、ウォートンゼ
リーから収得された間葉系幹細胞であってもよい。

以下、本願明細書に使用された用語の定義は、以下の通りである。

本発明の「予防」とは、炎症性疾患を抑制したり、その発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明の「改善」または「治療」とは、本発明の小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームにより炎症性疾患に関連したパラメーター、例えば、症状の程度が好転したり有益になるようにするすべての行為を意味する。

本発明の薬学的組成物は、非経口の様々な剤形であってもよい。前記組成物を剤形化する場合には、１つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水またはＰＢＳ）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムヒドロキシド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥剤制または坐剤などが含まれる。非水性溶剤および懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用できる。

本発明の組成物は、非経口で投与することができ、非経口投与時に腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射する注射剤の形態で当業界において公知となった方法によって剤形化することができる。

前記注射剤の場合には、必ず滅菌しなければならず、バクテリアおよび真菌のような微生物の汚染から保護しなければならない。注射剤の場合、好適な担体の例としては、これらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、好適な担体としては、ハンクス溶液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。前記注射剤を微生物の汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような多様な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含んでもよい。また、前記注射剤は、多くの場合、糖またはナトリウムクロリドのような等張剤をさらに含んでもよい。

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物感受性、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定することができる。本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与することができる。上記した要素を全部考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定することができる。

本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が多様である。一日投与量としては、非経口投与時に、小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１～５０ｍｇ、さらに好ましくは、０．１～３０ｍｇの量で投与されるように、また、経口投与時は、本発明の小胞体ストレス誘発物質で処理された間葉系幹細胞由来のエキソソームを基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１～１００ｍｇ、さらに好ましくは、０．０１～１０
ｍｇの量で投与されるように、１～数回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などに応じて増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。

本発明によって小胞体ストレス誘発物質を処理した間葉系幹細胞由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）は、抗炎症性サイトカイン、調節性Ｔ細胞およびＭ２型マクロファージのレベルが増加し、前炎症サイトカイン、ヘルパーＴ細胞およびＭ１型マクロファージのレベルが減少するなど免疫調節能力が増加し、大腸炎マウスモデルで効果的に炎症を緩和させた。したがって、本発明は、炎症性疾患の予防または治療用組成物および免疫調節用組成物として効果的に用いられ得る。

図１ａは、ＷＪ－ＭＳＣの細胞表面マーカーおよびエキソソーム（Ｅｘｏｓ）分離として、フローサイトメトリーによるＭＳＣ特異的抗原ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６およびＣＤ３４、ＣＤ４５の発現レベルを示す。図１ｂは、ＷＪ－ＭＳＣの細胞表面マーカーおよびエキソソーム（Ｅｘｏｓ）分離として、超遠心分離基盤のＥｘｏｓ分離の計画を示す。図２は、ナイーブ（ｎａｉｖｅ；ＣＴＬ－Ｅｘｏ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）の特徴を示す。（Ａ）エキソソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージ（スケールバー＝１００ｎｍ）；（Ｂ）ＷＪ－ＭＳＣおよびエキソソームでＣＤ６３およびβアクチンのウェスタンブロット分析；（Ｃ）ｑＮａｎｏによるエキソソームのサイズ分布および濃度；（Ｄ）ＢＣＡタンパク質分析によるエキソソームのタンパク質濃度；を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図３は、ナイーブ（ｎａｉｖｅ；ＣＴＬ－Ｅｘｏ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）の免疫調節因子を示す。（Ｅ）ｑＲＴ－ＰＣＲによる免疫調節因子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル；（Ｆ）ウェスタンブロット分析によるＴＧＦβ、ＩＤＯおよびＣＯＸ２のレベル；（Ｇ）ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣＴＬ－Ｅｘｏ（＋ＣＴＬ－Ｅｘｏ）またはＴＳＧ－Ｅｘｏ（＋ＴＳＧ－Ｅｘｏ）とともに４８時間共培養したＣｏｎＡ刺激ＭＮＣの免疫調節因子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル；（Ｈ）フローサイトメトリーによるＣｏｎＡ刺激ＭＮＣの初期アポトーシス（Ｅａｒｌｙａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または後期アポトーシス（Ｌａｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ）のレベル；を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図４は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）の活性化した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するＴ細胞の増殖調節を示す。（Ａ）総Ｔ細胞の増殖の代表的なヒストグラム；（Ｂ）総Ｔ、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖率に対する定量分析；（Ｃ）ＣＦＳＥ標識細胞の蛍光プロファイルによる５個の個別ＰＢＭＣ部分での細胞分裂；を示す。図５は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）分化およびマクロファージ分極化を調節することを示す。（Ｄ）フローサイトメトリーによるＣＤ４＋ＩＦＮγ＋Ｔｈ１、ＣＤ４＋ＩＬ－１７Ａ＋Ｔｈ１７およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの百分率；（Ｅ）フローサイトメトリーによるＭ１マクロファージ（ＣＤ８０、ＣＤ８６）またはＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６、ＣＤ１６３）表面マーカーの発現レベル；を示す。図６は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）分化を調節するものであり、フローサイトメトリーによるＴｈ１、Ｔｈ、１７およびＴｒｅｇ細胞の百分率を示す。図７は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がマクロファージ分極化を調節するものであり、Ｍ０，Ｍ１およびＭ２の代表イメージ（スケールバー＝１００μｍ）を示す。図８は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がマクロファージ分極化を調節することを示し、フローサイトメトリーによるＭ１およびＭ２マクロファージ表面マーカーの発現を示す。図９は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がマウスでＤＳＳで誘導された大腸炎を改善することを示す。（Ａ）ＤＳＳ誘導大腸炎実験の概略イメージ；（Ｂ）体重；および（Ｃ）疾患活動性指数（ＤＡＩ）のスコアの変化；を示す（１グループ当たりｎ＝３マウス；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１０は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）がマウスでＤＳＳで誘導された大腸炎を改善することを示す。（Ｄ、Ｅ）１０日目にマウスを犠牲にさせて測定した結腸の長さ；（Ｆ）結腸セクションのＨ＆Ｅ染色（スケールバー＝１００μｍ）；（Ｇ）組織学的スコア；（Ｈ）結腸ＭＰＯ活性；を示す（１グループ当たりｎ＝３マウス；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）が生体内で調節性Ｔ細胞とＭ２マクロファージ分極化を誘導することを示す。（Ａ）ｑＲＴ－ＰＣＲによる結腸組織でＴｈ１、Ｔｈ、２、Ｔｈ、１７およびＴｒｅｇ関連サイトカイン；（Ｂ）マクロファージ表現型関連遺伝子の発現レベル；を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１２は、ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）が生体内で結腸の固有層内Ｍ２マクロファージ分極化を誘導することを示す。フローサイトメトリーで分析（Ｃ）および（Ｄ）定量化した３％ＤＳＳ－大腸炎マウス結腸の固有層細胞でＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの百分率；（Ｅ）フローサイトメトリーで分析および定量化したＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージでＣＤ２０６およびアルギナーゼ１の発現；を対照群で標準化された相対平均蛍光強度（ＲｅｌＭＦＩ）で示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１３は、ヒトＷＪ－ＭＳＣに処理された小胞体ストレス誘発物質の種類（タプシガルギン（ＴＳＧ、Ｔｈ、ａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ツニカマイシン（Ｔｕ，Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ，ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ，ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）およびＭＧ１３２（ＭＧ））による小胞体ストレスマーカー、前炎症性および抗炎症性サイトカインの分泌パターンを示す。小胞体ストレス誘発物質の処理によって小胞体ストレスマーカー（ＧＲＰ９４）および抗炎症性サイトカイン（ＣＯＸ２、ＩＤＯ、ＩＬ－１０）の発現レベルが増加したが、前炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の発現レベルが減少することを確認することができた。図１４は、小胞体ストレス誘発物質（ＴＳＧ、Ｔｕ、ＢＦＡ、ＤＴＴ、ＭＧ）が処理されたヒトＷＪ－ＭＳＣの免疫調節効果としてＴ細胞の増殖抑制を確認した結果を示す。小胞体ストレス誘発物質が処理されたＭＳＣは、処理しないＭＳＣに比べて、総Ｔ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖抑制効果がさらに増加することを確認することができた。図１５は、小胞体ストレス誘発物質（ＴＳＧ、Ｔｕ、ＢＦＡ、ＤＴＴ、ＭＧ）が処理されたヒトＷＪ－ＭＳＣから分泌されたエキソソームの免疫調節効果としてＴ細胞の増殖抑制を確認した結果を示す。小胞体ストレス誘発物質のうちＴＳＧ、ＴｕまたはＢＦＡが処理されたＭＳＣは、処理しないＭＳＣに比べて、総Ｔ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖抑制効果がさらに増加することを確認することができた。

［実施例１］
ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム特徴の確認
＜１－１＞ＷＪ－ＭＳＣ準備および培養
Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ由来の間葉系幹細胞（ＷＪ－ＭＳＣｓ）を非特許文献３に基づいて分離および培養し、表面マーカー発現プロファイルに基づいてさらに特性化しようとした。

具体的には、妊婦の書面同意とソウルアサン病院の機関検討理事会（プロトコル番号２０１５－３０３０）の承認を受けて、正常な臨月分娩後、へその緒からＷｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙの組織を収得した。ＷＪ－ＭＳＣは、非特許文献１に基づいて分離し、マイコプラズマテストを行った。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で１０％ＦＢＳ（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｔｕｌａｒｅ，ＣＡ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄＮＳ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ，ＮＪ）および１％抗生剤／抗菌剤（Ｇｉｂｃｏ）とともに、ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）で培養した。８０～９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅに到達すると、細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で分離し、さらに継代培養した。

フローサイトメトリーの結果、ＷＪ－ＭＳＣがＭＳＣ特異的細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ１４６を陽性で発現し、造血幹細胞特異的マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５を陰性で発現することを立証した（図１ａ）。

＜１－２＞ＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソーム分離および特性化
エキソソーム特異的マーカーとともに、前炎症性および抗炎症性サイトカイン分泌パターンがＭＳＣまたはＭＳＣ由来のエキソソームの免疫調節特性を決定することにより、炎症遺伝子の発現を確認しようとした。

ＷＪ－ＭＳＣ由来エキソソーム（Ｅｘｏ（ｓ））は、標準超遠心分離（図１ｂ）によりナイーブ（ＣＴＬ－Ｅｘｏ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）の培養上清液から分離された。ＷＪ－ＭＳＣ細胞（３×１０^６）を１００ｍｍ培養皿で１μＭタプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ，ＴＳＧ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で２４時間刺激した。その後、培地を１０％Ｅｘｏ枯渇ＦＢＳが補充された培地に交替した。Ｅｘｏ枯渇ＦＢＳは、１００，０００ｘｇで１８時間超遠心分離して得た。７２時間培養後、培養液を収集し、３００ｘｇで１０分間、２，５００ｘｇで２５分間、１０，０００ｘｇで１時間４℃で遠心分離した。上清液を０．２２μｍフィルターを用いてろ過し、１００，０００ｘｇで２時間超遠心分離した。その後、Ｅｘｏペレットを滅菌ＰＢＳで１００，０００ｘｇで２時間遠心分離して洗浄した後、２００μｌのＰＢＳに懸濁させて、使用前まで－８０℃で保管した。Ｅｘｏ生成を抑制するために、細胞を１０μＭＧＷ４８６９（ＳａｎｔａｃｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を含む培養培地で１２時間処理した。その後、培地を１０％Ｅｘｏ枯渇ＦＢＳが補充された培地に交替した。７２時間後、培養上清液を超遠心分離してＥｘｏを分離し、使用時まで－８０℃で保管した（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ－ＣＭ；濃縮ＣＭ）。すべてのマウス実験に対してＧＷ４８６９処理されたＭＳＣ（Ｅｘｏ分泌抑制）に由来する濃縮ＣＭを溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群として使用した。Ｅｘｏの量は、総タンパク質の測定のために、ＢＣＡ分析キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で決定した。Ｅｘｏサイズと数は、製造社の指針に基づいてｑＮａｎｏ（ＩｚｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ；Ｊｅｏｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で決定した。

ウェスタンブロット分析は、ＷＪ－ＭＳＣ溶解物およびＥｘｏは、プロテアーゼ抑制剤とともに、ＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に溶解した。同量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、ＣＤ６３（ＳＢＩ）、ＣＯＸ２（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＩＤＯ（ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＴＧＦβおよびＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）１次抗体で分析した。バンドは、強化した化学発光（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて感知され、イメージは、ＬＡＳ－３０００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてキャプチャーした。

その結果、透過電子顕微鏡分析は、精製されたエキソソームが直径５０～１２０ｎｍの丸い小胞を含むことを示した（図２Ａ）。エキソソーム特異的マーカーＣＤ６３は、ＣＴＬ－ＥｘｏとＴＳＧ－Ｅｘｏで発現したが、細胞質マーカーβアクチンは、いずれのエキソソームにおいても発現しなかった（図２Ｂ）。ｑＮａｎｏ分析結果、エキソソームの平均粒子径は、ＣＴＬ－ＥｘｏとＴＳＧ－Ｅｘｏの両方で１１０～１２０ｎｍであった（図２Ｃ）。ＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソームの生産は、ナイーブＷＪ－ＭＳＣ由来のエキソソームより５０％さらに高かった（図２Ｃ、Ｄ）。ＴＳＧ－Ｅｘｏは、ＣＴＬ－Ｅｘｏに比べて、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＣＯＸ２およびＩＤＯの発現レベルが有意に高かったが、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βを含む前炎症性サイトカインの発現が低かった（図３Ｅ）。ｍＲＮＡ発現結果と一致して、ＴＧＦβ、ＣＯＸ２およびＩＤＯタンパク質発現レベルは、ＴＳＧ－Ｅｘｏで有意に増加した（図３Ｆ）。

［実施例２］
ＴＳＧプライムされたエキソソームの免疫調節効果の確認－Ｔ細胞の増殖抑制
ＴＳＧプライムされたエキソソームの免疫調節能力を評価するために、活性化した単核細胞（ＭＮＣ）で抗炎症性サイトカインおよび前炎症性サイトカインの発現レベルを測定した。

定量的ＲＴ－ＰＣＲでトータルＲＮＡは、ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて細胞、Ｅｘｏｓまたは組織サンプルから抽出され、ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡで合成された。ＭＸ３００Ｐ熱循環器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて定量的ＰＣＲを測定した。ｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＡＰＤＨのレベルに正規化された。ｑＲＴ－ＰＣＲのプライマー配列は、下記の表１に記載された通りである。

アポトーシス分析のための単核細胞（ＭＮＣ）は、非特許文献２に基づいてＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）勾配遠心分
離を用いてｈＵＣＢから分離され、１０％Ｅｘｏ枯渇ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁された。臍帯血（ＵＣＢ）単位は、機関審議委員会の承認（ＩＲＢＮｏ．２０１９－０４６７－０００３）によって２０１９年４月から２０２０年６月まで韓国カトリック造血幹細胞銀行（ＣＨＳＣＢ）から獲得した。ＭＮＣを５μｇ／ｍｌＣｏｎＡ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）で刺激し、７２時間ナイーブ（ｎａｉｖｅ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のＥｘｏｓ（４μｇ）が存在または無存在の成長培地で９６ウェルプレート（１×１０^５／ウェル）にシードした。ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７ＡＡＤ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）染色を行い、製造会社の指針に基づいて細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を決定し、フローサイトメトリーで分析した。

次に、活性化した末梢血液由来の単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対するＴＳＧ－Ｅｘｏの免疫抑制効果をテストするために、健康な寄贈者のヒト末梢血液は、韓国赤十字社（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）からカトリック大学校の機関審議委員会（ＩＲＢＮｏ．２０１９－２８９１－０００３）の承認を受けて提供された。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配を通じて遠心分離して分離し、１０％Ｅｘｏ枯渇ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁された。

Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈で定量化された。分離されたＰＢＭＣを２μＭＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ、Ｔｈ、ｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。ＣＦＳＥ標識されたＰＢＭＣ（１×１０^５／ウェル）は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｇｉｂｃｏ）および組換えヒトＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下にナイーブ（ｎａｉｖｅ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のＥｘｏｓ（４μｇ）が存在または無存在の９６ウェルプレートで共培養された。６日間培養後、細胞をＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に蛍光標識されたヒトモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーで測定した。すべての細胞は、７ＡＡＤ陰性細胞でゲートされた。

その結果、ＣｏｎＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）で刺激されたＭＮＣをエキソソームで処理すると、ＣＯＸ２、ＮＯＳ２、ＩＤＯ、ＩＬ－１０およびＴＧＦβの発現レベルが増加するのに対し、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βの発現レベルが減少した。これは、ＣＴＬ－Ｅｘｏで処理したものよりも、ＴＳＧ－Ｅｘｏで処理した活性化したＭＮＣにおいてさらに目立った（図３Ｇ）。ＴＳＧ－Ｅｘｏは、ＭＮＣの初期アポトーシスを若干減少させたが、後期アポトーシスには影響を及ぼさなかった。これは、エキソソーム処理が細胞毒性を誘導しないことを示唆する（図３Ｈ）。ＣＦＳＥ希釈分析は、ＴＳＧ－Ｅｘｏの添加がＣＴＬ－Ｅｘｏより総Ｔ、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をさらに強力に抑制することを示した（図４Ａ、Ｂ）。ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたＰＢＭＣにおいて初期分裂周期１で細胞の割合が顕著に増加し、分裂周期４と５の細胞割合が顕著に減少した（図４Ｃ）。このような結果は、ＴＳＧプライムされたエキソソームが抗炎症性サイトカインの生産を増加させて、Ｔ細胞の増殖に相当な抑制効果があることを示唆する。

［実施例３］
ＴＳＧプライムされたエキソソームの免疫調節効果の確認－調節性Ｔ細胞およびＭ２型マクロファージ分極の向上
＜３－１＞ＴＳＧプライムされたエキソソームのＴヘルパー細胞（Ｔｈ）分化の確認
ＭＳＣエキソソームは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の分化を通じて免疫調節効果を媒介することができることが報告された。したがって、本発明者らは、特定のＴ細胞下位集合に対するＴＳＧ－Ｅｘｏの効果を確認するために、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）の分化を調べた。

Ｔｈ細胞は、エキソソームの存在下にヒトＰＢＭＣから精製されたＣＤ４＋細胞上のファミリー特異的なサイトカインで刺激することによって誘導された。具体的には、ＰＢＭＣリンパ球からＣＤ４＋Ｔ細胞の分離は、製造会社のプロトコルに基づいてヒトＣＤ４Ｔ細胞分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズおよびＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、特定Ｔｈ細胞の分化のために、特定のサイトカインを添加した：Ｔｈ１に対するＩＦＮγｍｌ）およびＩＬ－１２（２５ｎｇ／ｍｌ）；Ｔｈ１７に対するＩＬ－６（５０ｇ／ｍｌ）およびＴＧＦβｇ／ｍｌ）；Ｔｒｅｇに対するＴＧＦβｇ／ｍｌ）およびレチノイン酸（１０ｎＭ）。サイトカイン処理されたＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０^５／ウェル）は、２４ウェルプレートにナイーブ（ｎａｉｖｅ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のＥｘｏｓを添加し、５日間培養された。細胞内染色のために、染色前に５時間細胞刺激カクテル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を刺激した。細胞を細胞表面マーカーである抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ２５抗体で染色した後、固定／透過化し、蛍光標識された抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ－１７Ａおよび抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。染色細胞は、フローサイトメトリーで分析した。

その結果、ＴＳＧ－Ｅｘｏとの共培養は、ＣＴＬ－Ｅｘｏに比べてＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ１およびＩＬ－１７Ａ＋ＣＤ４＋Ｔｈ１７細胞の誘導を大きく減少させ、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を増加させた（図５Ｄおよび図６）。Ｍ１型マクロファージは、丸い形態を示したのに対し、Ｍ２型マクロファージは、スピンドル状の形態を示した（図７）。

＜３－２＞ＴＳＧプライムされたエキソソームのＭ２型マクロファージ分極向上の確認
ＭＳＣエキソソームは、Ｍ２型マクロファージ分極化の誘導を通じて免疫調節効果を媒介することができることが報告された。したがって、本発明者らは、特定のＴ細胞下位集合に対するＴＳＧ－Ｅｘｏの効果を確認するために、ＴＳＧ－Ｅｘｏがマクロファージの表現型を調節することができるか否かを調べた。

ＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ１型の場合）またはＭ－ＣＳＦ（Ｍ２型の場合）刺激１次ヒトマクロファージをＭ１型サイトカインまたはＭ２型サイトカインの存在下にエキソソームと共に培養した。具体的には、ＣＤ１４結合マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いてｈＵＣＢ由来のＭＮＣからＣＤ１４＋単核球を分離した。マクロファージを生成するために、単核球（５×１０^５／ウェル）をＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で６日間培養した。２４ウェルプレートにＭ１分極化のために、ＧＭ－ＣＳＦ由来のマクロファージは、４８時間ナイーブ（ｎａｉｖｅ）またはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来Ｅｘｏとともに、ＩＦＮγｎｇ／ｍｌ）＋ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激された。Ｍ２分極化のために、Ｍ－ＣＳＦ由来のマクロファージは、４８時間ナイーブまたはＴＳＧプライムされたＷＪ－ＭＳＣ由来のＥｘｏとともに、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ－１３（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。共培養後、細胞をＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に蛍光標識されたヒトモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。

その結果、Ｍ１型細胞表面マーカーＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋は、ＣＴＬ－Ｅｘｏで培養されたのに対し、ＴＳＧ－Ｅｘｏで培養されたＭ１型マクロファージにおいて顕著に減少した。しかしながら、Ｍ２型細胞表面マーカーＣＤ２０６＋およびＣＤ１６３＋の発現は、エキソソームと共に培養したときに増加し、この効果は、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理グループにおいてさらに大きかった（図５Ｅおよび図８）。このような結果は、ＴＳＧ－Ｅｘ
ｏがナイーブエキソソームよりＭ２型マクロファージ表現型をより効果的に誘導することを示唆する。したがって、ＭＳＣに対するＴＳＧ処理は、改善された免疫調節特性を有するエキソソームを生成することができる。

［実施例４］
ＴＳＧプライムされたエキソソームのＤＳＳで誘導された大腸炎緩和効果の確認
本発明者らは、３％ＤＳＳで誘発された大腸炎マウスモデルでＴＳＧ－Ｅｘｏの潜在的な保護効果を確認した（図９Ａ）。

具体的には、ＤＳＳで誘発された大腸炎マウスモデルの製造のために、７日間７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの飲水に３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ
ｓｏｄｉｕｍ；ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＳａｎｔａＡｎａ，ＣＡ）を投与して誘導した。マウスは、グループ別に１０匹ずつ全体４グループに分けた：（１）対照群（陰性対照群）、（２）ＧＷ４８６９処理ＭＳＣから抽出した濃縮ＣＭ（溶媒対照群、２００μｌ）を投与したＤＳＳ（陽性対照群）、（３）ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＭＳＣ由来のＥｘｏを投与したＤＳＳ、（４）ＴＳＧプライムされたＭＳＣ由来のＥｘｏｓを投与したＤＳＳ。（３）および（４）グループは、１日、３日および５日にマウスに２００μｌＰＢＳに希釈された２００μｇのＥｘｏを腹腔内注射した。１０日目にマウスを安楽死させた。体重減少（０－４）、便の濃度（０－４）、便の血液（０－４）、つや（ｃｏａｔｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）（０－４）、直腸脱出（０－３）、曲がった姿勢（０－３）、寝具汚染（０－２）、好奇心無し／警戒心無し（ｎｏｔｉｎｑｕｉｓｉｔｉｖｅ／ａｌｅｒｔ）（０－２）を含む疾患活動性指数（ｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｅｘ，ＤＡＩ）を用いて大腸炎の重症度を毎日評価した。すべての動物実験手続きは、カトリック大学校の動物研究倫理委員会（ＩＡＣＵＣｎｏ．２０１９－０３０１－０３）の承認を受けた。溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群としては、エキソソーム分泌を調節するｎＳＭａｓｅ２（ｎｅｕｔｒａｌｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ２）抑制剤であるＧＷ４８６９（１０μＭ）で処理されたＭＳＣの培養上清液（ＧＷ－ＣＭ）を使用した。

１０日目に犠牲になったマウスの結腸の長さを測定した。結腸組織は、４％ホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に固定し、パラフィンに埋めた後、５μｍに切片化した。組織学的分析のために、結腸の切片をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織病理学スコアは、炎症細胞浸潤程度（０－４）および組織損傷程度（０－４）によって盲検方式で決定された。

ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭＰＯ）ＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて大腸組織への好中球の浸透を測定した。結腸をＭＰＯ分析緩衝液で均質化し、上清液を１３，０００ｘｇで１０分間遠心分離して収集した。上清液をＭＰＯ分析緩衝液およびＭＰＯ基質と混合し、２５℃で１２０分間培養した後、ＴＮＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）プローブを添加した。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＷＴ）を用いて４１２ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、ＧＷ４８６９は、ＭＳＣでエキソソーム放出を成功裏に抑制した。ＧＷ－ＣＭ処理された大腸炎マウスは、持続的な体重減少と便の硬さ、血性下痢および一般的な活動のような顕著に上昇した疾患活動性指数（ＤＡＩ）を示した。しかしながら、エキソソーム処理は、特にＴＳＧ－Ｅｘｏ処理グループにおいて体重減少とＤＡＩを改善した（図９Ｂ、Ｃ）。さらに、ＤＳＳ投与による結腸の長さの短縮は、ＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスに比べて、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスにおいて顕著に改善された（図１０Ｄ、Ｅ）。組織学的検査は、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスが結腸組織完全性を維持することを示した；顕著な構造破壊、腺窩細胞（ｃｒｙｐｔ）の損失および炎症細胞の浸潤減少；およびＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスに比べてさらに低い組織学的スコアを有した（図１０Ｆ、Ｇ）。さらに、１０日目に犠牲になったマウスの好中球浸潤を示すＭＰＯ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）活性は、ＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスに比べて、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスにおいて顕著に減少した（図１０Ｈ）。このような結果は、ＴＳＧ－Ｅｘｏがナイーブエキソソームに比べてＤＳＳで誘導された大腸炎において腸炎症に対する保護活性が向上したことを示す。

［実施例５］
ＴＳＧプライムされたエキソソームの炎症がある結腸で調節性Ｔ細胞とＭ２マクロファージ分極化向上効果の確認
免疫細胞反応は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病因に重要な役割をする。特に、腸内微細環境でＴｒｅｇｓと他のＴ細胞の間の均衡は、大腸炎の緩和に重要な役割をし、マクロファージは、結腸においてＭ１／Ｍ２分極化を通じて炎症反応を媒介し、ＩＢＤの発病機序に重要な役割をする。したがって、炎症がある結腸においてＴＳＧプライムされたエキソソームの調節性Ｔ細胞およびＭ２型マクロファージの分極向上による免疫調節効果を確認しようとした。また、本発明者らは、次にＤＳＳで誘導された大腸炎マウスの免疫細胞プロファイルに対するＴＳＧプライムされたエキソソームの効果を調べた。

具体的には、３％ＤＳＳ－大腸炎マウス（１グループ当たりｎ＝２～４マウス）を１０日に犠牲にさせ、結腸組織を収得した後、結腸組織においてＴｈ１、Ｔｈ、２、Ｔｈ、１７およびＴｒｅｇ細胞のレベルを評価した。固有層（Ｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａ）細胞は、腸から分離された。結腸組織を小さい断片（３ｍｍ×３ｍｍ）に切断し、振とう培養器（ｓｈａｋｉｎｇｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２ｍＭＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳ緩衝液と共に、２２０ｒｐｍで３０分間培養した。３７℃で上皮を除去した後、組織を５％ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＤ（Ｓｉｇｍａ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩで２２０ｒｐｍで３７℃で６０分間振とう培養器で分解（ｄｉｇｅｓｔ）した。分解サンプルを４０μｍ細胞ストレーナーを介してろ過した後、３００ｘｇで５分間遠心分離した。分離した細胞をＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ２０６およびアルギナーゼ１（ａｒｇｉｎａｓｅ１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。

その結果、Ｔｈ１（Ｔ－ｂｅｔ）、Ｔｈ２（ＧＡＴＡ３）およびＴｈ１７（ＲＯＲγファミリー転写因子の発現レベルは、ＧＷ－ＣＭ処理マウスの結腸組織において増加したが、エキソソーム処理マウスにおいて減少した。特に、ＧＡＴＡ３発現は、ＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスに比べて、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスにおいてさらに有意に減少した。Ｆｏｘｐ３およびＴｒｅｇ転写因子は、ＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスと比較して、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスにおいて有意に増加した（図１１Ａ）。

また、ＣＸＣＬ９、ＭＣＰ１およびｉＮＯＳのＭ１型マーカー発現は、ＧＷ－ＣＭ処理マウスに比べて、ＣＴＬ－Ｅｘｏ－およびＴＳＧ－Ｅｘｏ処理マウスにおいて減少した。ＣＸＣＬ９レベルは、ＣＴＬ－Ｅｘｏ処理されたマウスに比べて、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理されたマウスにおいて顕著に減少した。Ａｒｇ１およびＣＤ２０６のＭ２型マーカー発現は、エキソソーム処理において増加し、この効果は、ＴＳＧ－Ｅｘｏ処理群において有意にさらに大きかった（図１１Ｂ）。

ＤＳＳで誘導された大腸炎マウスは、陰性対照群マウスと比較して、大腸の固有層でＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（マクロファージ）の割合が有意に増加したことが分かった（図１２Ｃ、Ｄ）。エキソソーム処理は、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合に影響を
及ぼさなかったが、図１２Ｃ、Ｄ）、結腸マクロファージにおいてＣＤ２０６およびアルギナーゼ１の発現レベルは、ＴＳＧプライムされたエキソソーム処理マウスにおいて有意に上昇した（図１２Ｅ）。このようなデータは、ＴＳＧプライムされたエキソソームが調節性Ｔ細胞を誘導し、Ｍ２型マクロファージを分極化することによって、粘膜炎症を弱化させることを示唆する。

［実施例６］
ＥＲストレス誘導されたＷＪ－ＭＳＣまたはエキソソーム分析
＜６－１＞ＥＲストレス誘導されたＷＪ－ＭＳＣ特徴の確認
ヒトＭＳＣの免疫調節特性に対する小胞体ストレス（ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ）の影響を調べるために、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘導物質としてタプシガルギン（ＴＳＧ、Ｔｈ、ａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，Ｔｕ）、ブレフェルジンＡ（ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ、ＢＦＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ，ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）またはＭＧ１３２（ＭＧ）を前記実施例＜１－２＞と同じ方法でそれぞれ処理し、ＥＲストレスが誘導されたＷＪ－ＭＳＣにおいてＥＲストレスマーカーおよび炎症遺伝子の発現を確認した。

その結果、図１３に示されたように、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓマーカーであるＧＲＰ９４とＣＨＯＰは、ヒトＭＳＣにおいてＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘導物質を処理した後、有意に増加した。また、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘発物質を処理したＭＳＣは、処理しないＭＳＣより抗炎症性サイトカインＣＯＸ２、ＩＤＯおよびＩＬ－１０の発現レベルが有意に高かったが、ＩＬ－１β、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含む前炎症性サイトカインの発現がさらに低いことを確認した。

＜６－２＞ＥＲストレス誘導されたＷＪ－ＭＳＣの免疫調節効果の確認－Ｔ細胞の増殖抑制
Ｔ細胞の増殖で小胞体ストレス（ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ）誘発物質が処理されたＭＳＣの免疫調節特性を評価するために、ＰＢＭＣとＭＳＣを前記実施例＜１－２＞と同じ方法で共培養した。

その結果、図１４に示されたように、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘発物質（ＴＳＧ、Ｔｕ、ＢＦＡ、ＤＴＴ、ＭＧ）が処理されたＭＳＣは、処理しないＭＳＣに比べて、総Ｔ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖抑制効果がさらに増加したことを確認することができた。

このような結果は、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘発物質によりＥＲｓｔｒｅｓｓを受けたＭＳＣが抗炎症性サイトカインの生産を増加させて、Ｔ細胞の増殖抑制を強化するのに効果的な機能を示すことを示す。

＜６－３＞ＥＲストレス誘導されたＷＪ－ＭＳＣから分泌されたエキソソームの免疫調節効果の確認－Ｔ細胞の増殖抑制
ＥＲｓｔｒｅｓｓ誘発物質（ＴＳＧ、Ｔｕ、ＢＦＡ、ＤＴＴ、ＭＧ）を処理したＭＳＣから分泌されたエキソソームの免疫抑制効果を確認するために、ＰＢＭＣとエキソソームを前記［実施例２］と同じ方法で共培養した。

その結果、図１５に示されたように、ＴＳＧ、ＢＦＡ、Ｔｕが処理されたエキソソームが対照群（ｃｏｎｔ－ｅｘｏ）に比べて、総Ｔ、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をさらに強力に抑制することを確認することができた。

このような結果は、ＥＲ－ｓｔｒｅｓｓ誘発物質がＭＳＣにおいて改善された免疫調節特性を有するエキソソームを生成できることを示す。

［統計分析］
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖ８．０．１（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて一員分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙの多重比較テストを用いて行われた。すべてのデータは、平均±Ｓ．Ｄで表示された。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意なものと見なされた。

本発明によって小胞体ストレス誘発物質を処理した間葉系幹細胞由来のエキソソーム（ＴＳＧ－Ｅｘｏ）は、抗炎症性サイトカイン、調節性Ｔ細胞およびＭ２型マクロファージのレベルが増加し、前炎症性サイトカイン、ヘルパーＴ細胞およびＭ１型マクロファージのレベルが減少するなど免疫調節能力が増加し、大腸炎マウスモデルで効果的に炎症を緩和させた。したがって、本発明は、炎症性疾患の予防または治療用組成物および免疫調節用組成物として効果的に用いられ得るので、産業上の利用可能性がある。

配列目録ＦｒｅｅＴｅｘｔ
配列番号１は、ｈＣＯＸ－２の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２は、ｈＣＯＸ－２の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号３は、ｈＩＤＯの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号４は、ｈＩＤＯの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号５は、ｈＩＦＮγの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号６は、ｈＩＦＮγの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号７は、ｈＩＬ－１０の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号８は、ｈＩＬ－１０の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号９は、ｈＩＬ－１βの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号１０は、ｈＩＬ－１βの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号１１は、ｈＮＯＳ２の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号１２は、ｈＮＯＳ２の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号１３は、ｈＴＧＦβの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号１４は、ｈＴＧＦβの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号１５は、ｈＴＮＦαの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号１６は、ｈＴＮＦαの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号１７は、ｍＡｒｇ１の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号１８は、ｍＡｒｇ１の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号１９は、ｍＣＤ２０６の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２０は、ｍＣＤ２０６の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号２１は、ｍＣＸＣＬ９の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２２は、ｍＣＸＣＬ９の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号２３は、ｍＦｏｘｐ３の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２４は、ｍＦｏｘｐ３の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号２５は、ｍＧＡＴＡ３の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２６は、ｍＧＡＴＡ３の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号２７は、ｍｉＮＯＳの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号２８は、ｍｉＮＯＳの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号２９は、ｍＭＣＰ１の正方向プライマー配列に該当する。
配列番号３０は、ｍＭＣＰ１の逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号３１は、ｍＲＯＲγの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号３２は、ｍＲＯＲγの逆方向プライマー配列に該当する。
配列番号３３は、ｍＴ－ｂｅｔの正方向プライマー配列に該当する。
配列番号３４は、ｍＴ－ｂｅｔの逆方向プライマー配列に該当する。

Claims

小胞体ストレス誘発物質を、人間から採取された間葉系幹細胞に処理する段階を含む間葉系幹細胞由来のエキソソームの生産促進方法であって、前記小胞体ストレス誘発物質はタプシガルギン（ＴＳＧ）である、前記方法。
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ）、胎盤、末梢血液、卵管、角膜基質、肺、筋肉および胎児肝から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の組織から収得された間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記エキソソームのサイズは、１０～２００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。