JP7712296B2

JP7712296B2 - 糸状菌におけるジャスモン酸類の生成

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Publication number: JP7712296B2
Application number: JP2022566666A
Authority: JP
Inventors: チェン、フイ; ユウ、オリバー
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2021-05-04
Publication date: 2025-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-04
Also published as: CN115715283A; US20230175033A1; EP4146619A4; WO2021226038A1; EP4146619A1; JP2025129445A; JP2023524960A

Description

関連出願
本出願は、２０２０年５月４日に出願された「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＪＡＳＭＯＮＡＴＥＳＩＮＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳＦＵＮＧＩ」と題する米国仮出願第６３／０１９，４２９号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の分野は、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌におけるジャスモン酸類の製造に関する。

ジャスモン酸（ＪＡ）、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）、並びにジャスモン酸生合成経路における他の前駆体及び誘導体を含むジャスモン酸類は、経済的に非常に重要なα－リノレン酸由来化合物である。これらは、ネクロトロフ病原体及び草食性昆虫に対する植物防御において中心的な役割を果たす植物ホルモンのクラスである。それらはまた、トマトの葉におけるカフェオイルプトレシン等の多数の二次代謝産物の生合成を誘導する強力なエリシターである。例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１９２３７－１９２４２（２００５）；Ｖｉｊａｙａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：７２０９－７２１４（１９９８）；及びＣｈｅｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５８０：２５４０－２５４６（２００６）を参照されたい。

ジャスミンのフローラルハートを連想させる臭気を与えるジャスモン酸メチルは、モモ、アプリコット、ブドウ及び他のフレーバのためのそのフローラルのノートに使用される。１９７３年以来、香料抽出物製造業者協会により、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）と分類されている。更に、ジャスモン酸メチルは、新規クラスの抗がん剤として大きな可能性を有することも示されている。具体的には、がん細胞のミトコンドリアにおいてシトクロムＣ放出を誘導することによって、ジャスモン酸メチルは、正常細胞に害を及ぼさずにがん細胞を死滅させることができる。Ｒｏｔｅｍｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６５：１９８４－１９９３（２００５）を参照されたい。

農業、香味及び芳香産業、並びに潜在的には医学におけるジャスモン酸類の重要性のために、ジャスモン酸類を大規模に製造することにかなりの関心が寄せられている。ジャスモン酸類は有機化学によって合成することができるが、「天然」フレーバに対する消費者の要求は、バイオベースのプロセスによって製造されたジャスモン酸類の市場を生み出している。より重要なことには、化学的に合成されたジャスモン酸類は、生物学的に活性な異性体及び不活性な異性体の混合物であるが、バイオベースのジャスモン酸類は、生物学的に活性な異性体が支配的である。残念なことに、他の植物ホルモンと同様に、ジャスモン酸及びジャスモン酸メチルの両方は、高等植物において微量でしか存在しないため（例えば、誘導された新鮮なトマトの葉の１ｋｇにおいて１０μｇ未満）、ジャスモン酸類の商業的供給源としての高等植物の開発を妨げる。Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５８０：２５４０－２５４６（２００６）を参照されたい。

これに対して、ラシオディプロディア・セオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）（同義は、ボトリオディプロディア・セオブロマエ（Ｂｏｔｒｙｏｄｉｐｌｏｄｉａｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）及びディプロディア・ゴシピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａｇｏｓｓｙｐｉｎａ）を含む）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）等の糸状菌を用いたバイオプロダクションプロセスでは、大量のジャスモン酸を合成することができる（例えば１～１．５ｇ／Ｌ）。米国特許第６，３３３，１８０号及びＥｎｇｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，１１：ｅ０１６７６２７を参照されたい。実際、天然生成物としてのジャスモン酸は、１９７１年に真菌ラシオディプロディア・セオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）の培養物から最初に単離された。Ａｌｄｒｉｄｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ，ｐｐ．１６２３－１６２７（１９７１）を参照されたい。

しかし、ジャスモン酸は、静置フラスコ培養又は静置トレイ培養でのみ生成されることも見出された。一方、大規模発酵製造は、生産を最大にするためにロッキング又はオービタルシェイキングで動作する発酵槽を使用する。

したがって、当該技術分野では、改良されたジャスモン酸類バイオプロダクション方法、特に、拡張可能であり、撹拌条件下で高い生産力価を達成することができるものが依然として必要とされている。

本発明は、クオラムセンシング分子及び／又はエリシターを使用して糸状菌におけるジャスモン酸類生成を誘導することによって上記の問題に対処する。このような糸状菌の菌糸形態とジャスモン酸類生成レベルとの間に相関関係が見出された。具体的には、高レベルのジャスモン酸類生成は、糸状菌が菌糸体マットを形成することができる場合にのみ観察されたが、糸状菌が浮遊ペレット形態又は菌糸体粒子に凝集している場合には観察されなかった。クオラムセンシング分子の使用は、糸状菌が振盪条件下（例えば、撹拌システムによる）で生育する場合であっても菌糸体マットの形成を可能にする。ジャスモン酸類生成エリシターは、潜在的生合成経路を誘導又は覚醒させることができる小分子である。この場合、ジャスモン酸類生成エリシターは、糸状菌によるジャスモン酸類生成に関与する潜在的生合成経路を誘導又は覚醒させる能力のために選択される。

したがって、一態様では、本発明は、１つ又は複数のジャスモン酸類（例えば、ジャスモン酸及び／又はジャスモン酸メチル）の製造方法を提供し、当該方法は、糸状菌生物の株を撹拌下において栄養培地中で培養することと、栄養培地からジャスモン酸類生成物を単離することと、を含む。糸状菌の代表的な属としては、ラシオディプロディア（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、及びジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）が挙げられる。様々な実施形態では、糸状菌生物は、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）、ラシオディプロディア・セオブロマエ（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、及びジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）からなる群から選択することができる。代表的な実施形態では、糸状菌生物は、ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｍ２１０７２８８の下に寄託されたラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）ＤＷＨ－２である。

様々な実施形態において、栄養培地は、少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、栄養培地は、少なくとも１つのジャスモン酸類生成エリシターを含むことができる。特定の実施形態では、栄養培地は、少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子及び少なくとも１つのジャスモン酸類生成エリシターを含むことができる。いくつかの実施形態では、栄養培地は、２つ以上の真菌クオラムセンシング分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、栄養培地は、２つ以上のジャスモン酸類生成エリシターを含むことができる。２つ以上の真菌クオラムセンシング分子の使用、又は２つ以上のジャスモン酸類生成エリシターの使用、あるいは少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子及び少なくとも１つのジャスモン酸類生成エリシターの併用は、より高い力価でジャスモン酸類生成に対して相乗効果を生じさせることができる。

本教示による使用に適した真菌クオラムセンシング分子の例としては、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール、γ－ヘプタラクトン、ファルネセン酸（ｆａｒｎｅｓｏｉｃａｃｉｄ）、１－フェニル－エタノール、２－フェニルエタノール、マルチコラン酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌａｎｉｃａｃｉｄ）、マルチコロス酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｓｉｃａｃｉｄ）、マルチコール酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ビチロラクトン－Ｉ、γ－ブチロラクトン、α－（１，３）－グルカン、ａ－因子フェロモン、α－因子フェロモン、３－オクタノン、３－オクタノール、及び１－オクテン－３－オールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真菌クオラムセンシング分子には、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール、及びγ－ヘプタラクトンが含まれる。特定の実施形態では、栄養培地は、ファルネソール、チロソール、又はその両方を含み得る。典型的な実施形態では、真菌クオラムセンシング分子（複数可）は、栄養培地中に約１０～５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在し得る。

本教示による使用に適したジャスモン酸類生成エリシターの例としては、様々な植物ホルモン、酸化ストレス因子、及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。代表的な植物ホルモンには、エチレン（ＥＴ）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、サリチル酸（ＳＡ）、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。様々なオーキシン、例えば４－クロロインドール－３－酢酸（４－Ｃｌ－ＩＡＡ）、２－フェニル酢酸（ＰＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、及びインドール－３－プロピオン酸（ＩＰＡ）、並びにジベレリン、例えばジベレリンＡ１（ＧＡ１）、ジベレリン酸（ＧＡ３）、ｅｎｔ－ジベレラン、及びｅｎｔ－カウレンも含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、ジャスモン酸類生成エリシターは、アブシジン酸（ＡＢＡ）等の植物防御ホルモンである。

いくつかの実施形態では、酸化ストレス因子は、栄養培地に添加された活性酸素種（ＲＯＳ）であってもよい。典型的な活性酸素種には、過酸化水素、過酸化物塩、ペルオキシ酸、及びスーパーオキシド塩が含まれる。酸化ストレスはまた、レドックス活性であることが知られている有機化合物の添加によって誘導され得る。ビオロゲンはレドックス活性複素環の周知のファミリーであり、ビオロゲンパラコート（メチルビオロゲン、又はＭＶ）は、スーパーオキシド発生剤として作用すると考えられる機構によって酸化ストレスを誘導するために広く使用され、ミトコンドリアマトリックスの内側の中の複合体Ｉとの相互作用を介してＲＯＳを生成する。

代表的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤には、バルプロ酸（ＶＡ）及び酪酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、ジャスモン酸類生成エリシター（複数可）は、栄養培地中に約１０～５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。

様々な実施形態において、栄養培地は、少なくとも１つの炭素源及び少なくとも１つの窒素源を含み得る。適切な炭素源の例としては、スクロース、デンプン、マルトース、グルコース及びフルクトースが挙げられるが、これらに限定されない。窒素源は、有機窒素源、無機窒素源のどちらか一方、又はその両方であってもよい。有機窒素源の例としては、牛肉エキス、ペプトン、コーンパルプ、酵母エキス及び麦芽エキスが挙げられるが、これらに限定されない。無機窒素源の例としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、尿素及び硝酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示は様々な修正及び代替形態が可能であるが、その特定の実施形態は図面に例として示されており、本明細書で詳細に説明される。しかし、本明細書に提示される図面及び詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、反対に、その意図は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神及び範囲内にある全ての修正、均等物、及び代替物を網羅することであることを理解されるべきである。

本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかになるであろう。

ジャスモン酸（ＪＡ）及びそのメチルエステルであるジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）の化学構造を示す図である。

異なる培養条件下：（パネルＡ）２５０ｒｐｍで振盪；（パネルＢ）静置、で生育された真菌株ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）の形態を示す図である。両方の条件について温度は３０℃であった。

本教示に従って使用され得る例示的な真菌クオラムセンシング分子、具体的には、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール、及びγ－ヘプタラクトンの化学構造を示す図である。

Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のＪＡ標準（ＭＯ，ＵＳＡ）のＨＰＬＣ（左上）及びＵＶ（右上）のスペクトル、並びにＪＡを生成した真菌培養物の酢酸エチル抽出物のスペクトル（それぞれ左下及び右下）を示す図である。ＪＡ標準物を１ｇ／Ｌ濃度でメタノール中に調製した。

接種９日後の振盪条件下での真菌培養物の形態及びＪＡ生成レベルに対するファルネソールの効果を示す図である。ＣＫは、培地に０．１％エタノールを添加した対照培養物を表し、「Ｆａｒ」は、１００ｍｇ／Ｌファルネソールを添加した培養物を表す。左側の写真は、対照とファルネソール誘発培養物との間の異なる形態を示す。右側のグラフは、ファルネソール誘発培養物が３００ｍｇ／Ｌを超えるＪＡ生成力価を達成したことを示す。

接種７日後の振盪条件下での真菌培養物の形態及びＪＡ生成レベルに対するチロソールの効果を示す図である。ＣＫ３は、培地に０．１％エタノールを添加した対照培養物を表し、「Ｔｙｒ３」は、１００ｍｇ／Ｌチロソールを添加した培養物を表す。左側の写真は、対照とチロソール誘発培養物との間の異なる形態を示す。右側のグラフは、チロソール誘発培養物が３００ｍｇ／Ｌを超えるＪＡ生成力価を達成したことを示す。

代表的な植物ホルモン、酸化ストレス因子及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、本教示に従って使用することができる様々なジャスモン酸類生成エリシターの化学構造を示す図である。

本教示は、１つ又は複数のジャスモン酸類を製造する方法に関する。本方法は、一般に、撹拌下において栄養培地中で糸状菌生物の株を培養することと、栄養培地からジャスモン酸類生成物を単離することと、を含む。ジャスモン酸類（複数可）は、ジャスモン酸、ジャスモン酸メチル、７－イソ－ジャスモン酸、９，１０－ジヒドロジャスモン酸、２，３－ジデヒドロジャスモン酸、３，４－ジデヒドロジャスモン酸、３，７－ジデヒドロジャスモン酸、４，５－ジデヒドロジャスモン酸、４，５－ジデヒドロ－７－イソ－ジャスモン酸、ククルビン酸、６－エピ－ククルビン酸、６－エピ－ククルビン酸－ラクトン、１２－ヒドロキシ－ジャスモン酸、１２－ヒドロキシ－ジャスモン酸－ラクトン、１１－ヒドロキシ－ジャスモン酸、８－ヒドロキシ－ジャスモン酸、ホモ－ジャスモン酸、ジホモ－ジャスモン酸、１１－ヒドロキシ－ジホモ－ジャスモン酸、８－ヒドロキシ－ジホモ－ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸－Ｏ－β－グルコピラノシド、ククルビン酸－Ｏ－β－グルコピラノシド、５，６－ジデヒドロジャスモン酸、６，７－ジデヒドロジャスモン酸、７，８－ジデヒドロジャスモン酸、メチルジヒドロイソジャスモネート（ｍｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｉｓｏｊａｓｍｏｎａｔｅ）、ジャスモン酸のアミノ酸コンジュゲート、並びにそれらの低級アルキルエステル、塩及び立体異性体から選択され得る。

最も広い意味で、本教示による栄養培地は、少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子又は少なくとも１つのジャスモン酸類生成エリシター、少なくとも１つの炭素源、及び少なくとも１つの窒素源を含む。本明細書に含まれる実験結果によって実証されるように、本発明者等は、予想外にも、栄養培地中に１つ又は複数の真菌クオラムセンシング分子及び／又はジャスモン酸類生成エリシターを添加することにより、撹拌条件下であっても好ましい真菌形態を形成できることを見出した。可変真菌形態（菌糸体マット）の形成は、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌におけるジャスモン酸類生成を増強することが示された。

クオラムセンシング（ＱＳ）は、細胞外環境における小さな拡散性化学シグナル伝達分子の生成及び放出に依存する、集団密度に基づく群ベース挙動の協調を可能にする微生物間のコミュニケーションの方法である（Ｍｅｈｍｏｏｄｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１９Ｍａｙ；２４（１０）：１９５０）。クオラムセンシングは、海洋細菌アリイビブリオ・フィシェリ（Ａｌｉｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）で最初に報告された（Ｎｅａｌｓｏｎｅｔａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０４，３１３－３２２）。ファルネソールは、二形性真菌カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）で発見された最初の真菌クオラムセンシング分子であった（Ｈｏｒｎｂｙ，ｅｔａｌ．（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，２９８２－２９９２）。

これまでに、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール及びγ－ヘプタラクトンを含む多くの真菌クオラムセンシング分子が同定されている。別の真菌クオラムセンシング分子であるマルチコール酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｉｃａｃｉｄ）は、ペニシリウム・スクレロチオラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）におけるスクレロチオリン生成を改善することが報告されている（ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０Ｊｕｌ２０；１４８（２－３）：９１－８）。γ－ヘプタラクトンは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）における生育及び二次代謝産物生成を調節することが示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２Ｎｏｖ；９６（３）：７７３－８１）。更に、ファルネソールは、二形性真菌オフィオストーマ・ピセエ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｐｉｃｅａｅ）における形態学的移行及びより高い細胞外エステラーゼ活性を誘導することが示されている（ＤｅＳａｌａｓｅｔａｌ．，ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５Ｊｕｌ；８１（１３）：４３５１－７）。

しかし、クオラムセンシング分子の生物学的活性は非常に多様であり得る。例えば、ファルネソールは、高い細胞密度で酵母型から糸状への移行を遮断し、胚芽管／菌糸形成を阻害することによって酵母細胞の分散を促進するが、チロソールはバイオフィルム発生の初期段階で菌糸生成を刺激し、胚芽管形成を促進する（Ｐａｄｄｅｒｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｓ．２０１８Ｍａｙ；２１０：５１－５８）。それらの異なる生物学的活性にもかかわらず、ファルネソール及びチロソールの両方は、予想外にも、ＪＡ生成糸状菌における形態変化及びジャスモン酸生成に対して同様の効果を示すことが見出された。

本教示によって使用され得る真菌クオラムセンシング分子は、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール、γ－ヘプタラクトン、ファルネセン酸、１－フェニル－エタノール、２－フェニルエタノール、マルチコラン酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌａｎｉｃａｃｉｄ）、マルチコロス酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｓｉｃａｃｉｄ）、マルチコール酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ブチロラクトン－Ｉ、γ－ブチロラクトン、α－（１，３）－グルカン、ａ－因子フェロモン、α－因子フェロモン、３－オクタノン、３－オクタノール、及び１－オクテン－３－オールのうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真菌クオラムセンシング分子には、ファルネソール、チロソール、トリプトフォール、及びγ－ヘプタラクトンが含まれる。特定の実施形態では、栄養培地は、ファルネソール、チロソール、又はその両方を含み得る。典型的には、真菌クオラムセンシング分子（複数可）は、栄養培地中に約１０～５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在し得る。

ジャスモン酸類生成エリシターは、潜在的生合成経路を誘導又は覚醒させることができる小分子であり、この例では、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌によるＪＡ生成に関与するものである。本教示による使用に適したジャスモン酸類生成エリシターの例としては、様々な植物ホルモン、酸化ストレス因子、及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。代表的な植物ホルモンには、エチレン（ＥＴ）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、サリチル酸（ＳＡ）、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。様々なオーキシン、例えば４－クロロインドール－３－酢酸（４－Ｃｌ－ＩＡＡ）、２－フェニル酢酸（ＰＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、及びインドール－３－プロピオン酸（ＩＰＡ）、並びにジベレリン、例えばジベレリンＡ１（ＧＡ１）、ジベレリン酸（ＧＡ３）、ｅｎｔ－ジベレラン、及びｅｎｔ－カウレンも含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、ジャスモン酸類生成エリシターは、アブシジン酸（ＡＢＡ）等の植物防御ホルモンである。

例示的な実施形態では、酸化ストレス因子は、栄養培地に添加された活性酸素種（ＲＯＳ）であり得る。典型的な活性酸素種には、過酸化水素、過酸化物塩、ペルオキシ酸、及びスーパーオキシド塩が含まれる。酸化ストレスはまた、レドックス活性であることが知られている有機化合物の添加によって誘導され得る。ビオロゲンはレドックス活性複素環の周知のファミリーであり、ビオロゲンパラコート（メチルビオロゲン、又はＭＶ）は、スーパーオキシド発生剤として作用すると考えられる機構によって酸化ストレスを誘導するために広く使用され、ミトコンドリアマトリックスの内側の中の複合体Ｉとの相互作用を介してＲＯＳを生成する。

様々な実施形態において、本方法は、バッチ又は連続動作モードで実施することができる。バッチ発酵では、栄養培地、培養物及び基質を組み合わせ、ジャスモン酸類生成物が一定になるまで発酵させる。連続プロセスでは、栄養培地中の基質は、基質及び生成物がそれぞれ添加され、再循環培地から除去されるという条件で、発酵リアクターを通して連続的に再循環され得る。

本プロセスを実施する際、真菌株の培養及び発酵インキュベーションは、１つ又は複数の真菌クオラムセンシング分子及び／又はジャスモン酸類生成エリシターに加えて、通常の栄養物質（炭素源、窒素源、無機塩及び成長因子）の存在下において水性媒体中で達成される。栄養培地に含めることができる無機塩の例には、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びカリウムのホスファート及び／又はスルファート塩が含まれるが、これらに限定されない。当業者に知られているように、１種又は複数のビタミンＢ、鉄、マンガン、コバルト、銅、亜鉛等の１種又は複数の微量ミネラルなどの追加の栄養素を添加することもできる。１０－オキソ－トランス－８－デセン酸及びヘルシニン（ｈｅｒｃｙｎｉｎｅ）等の真菌成長ホルモンも栄養培地に含まれ得る。

典型的なプロセスでは、糸状菌生物を最初に接種量で培養して栄養培地中で成熟培養物を生成する。培養物を発酵槽栄養培地に接種し、それ自体を確立させる。次いで、基質を添加し、一定濃度のジャスモン酸類生成物が存在するまで発酵を継続する。

糸状菌生物の培養及び発酵インキュベーションは、約１５０ｒｐｍ～約１５００ｒｐｍの撹拌下で行うことができる。培養温度は、約２０℃～約３５℃である。培養及びインキュベーションは、約４．５～約９、好ましくは６のｐＨ範囲の好気的条件下で進行することができる。ジャスモン酸類生成物は、基質の添加後、少なくとも２日間の培養後に単離することができる。

様々な実施形態では、ジャスモン酸類生成物は、酢酸エチル等の抽出溶媒で抽出してジャスモン酸類抽出物を形成することによって栄養培地から単離することができる。抽出溶媒を除去して、濃縮されたジャスモン酸類抽出物を得ることができる。ジャスモン酸類抽出物中に存在するジャスモン酸は、メチルアルコールを用いたエステル化によってジャスモン酸メチルに変換することができる。得られたジャスモン酸メチルは、当業者に公知の技術を用いて更に濃縮することができる。例えば、分画は、異なる異性体を分離するために、例えばシリカゲルを用いて行うことができる。

本教示に従って製造されたジャスモン酸及びジャスモン酸メチル等のジャスモン酸類は、農業、食品、香料、及び医薬品の様々な用途に使用することができる。例えば、ジャスモン酸は、草食動物に対する作物植物の天然有害生物防除ツールとして試験されてきた。ジャスモン酸メチルは、香料、パーソナルケア製品、家庭用ケア製品、経口消耗品等の製品における食品及び香味成分として使用することができる。更に、ジャスモン酸メチルはまた、その報告された抗うつ効果、抗攻撃効果及び抗炎症効果を考慮すると、医薬用途のために開発される大きな可能性を有する。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい材料及び方法を以下に説明する。

本開示は、以下の非限定的な例を考慮することにより、より完全に理解されるであろう。これらの例は、主題技術の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解されるべきである。上記の説明及びこれらの例から、当業者は、主題技術の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、主題技術の様々な変更及び修正を行って、主題技術を様々な用途及び条件に適合させることができる。

例
例１：異なる培養条件下でのラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）の形態。
ジャスモン酸（ＪＡ）を生成するための２つの異なる条件下で、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）ＤＷＨ－２（ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｍ２１０７２８８で寄託）の培養物を生育させた。一方の培養物を撹拌条件下（２５０ｒｐｍ）で振盪器において生育させた。別の培養物を、静置生育のためにインキュベータ内で生育させた。

図２に示すように、振盪条件下では、真菌菌糸体は、培養物全体にわたって粥様の稠度で自由に分散した（すなわち、それらは菌糸塊を形成した）。対照的に、静置条件下では、真菌菌糸体はマットに凝集した。

更に、ＨＰＬＣ分析により、振盪条件下では、ＪＡはほとんど又は全く生成されなかったが、静置条件下では、培養物は、中国特許第１０７２２７２６４号に報告されたものと同様の約１ｇ／Ｌの力価でＪＡを生成したことが実証された。

上記の結果に照らして、特に真菌の形態に関して、ＪＡ生成が、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌における菌糸凝集と相関することが実証された。

例２：ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）によるＪＡ生成に対するファルネソールの添加の効果
ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）ＤＷＨ－２（ＣＣＴＣＣ寄託番号Ｍ２１０７２８８で寄託）の培養物を、３０℃のインキュベータ内のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ製、ＭＯ，ＵＳＡ）プレート上で維持した。

Ｌ．イラネンシス（Ｌ．ｉｒａｎｅｎｓｉｓ）培養物を含むＰＤＡプレートの正方形片（約１ｃｍｘ１ｃｍ）を切断し、ファルネソールを含むか（Ｆａｒ）、又はファルネソールを含まない（ＣＫ）栄養培地５０ｍｌに接種するために使用した。

具体的には、ファルネソール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡから購入）を７０％エタノールに溶解して、濃度１００ｇ／Ｌの原液を作製した。培養培地中の最終作業濃度は、ファルネソールを含有するサンプルについては１００ｍｇ／Ｌ（１，０００倍希釈）である。栄養培地は以下を含んでいた。グルコース（５０ｇ／Ｌ）；ＫＮＯ_３（８．９ｇ／Ｌ）；ＫＨ_２ＰＯ_４２．０（ｇ／Ｌ）；ＫＣｌ０．３（ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．６（ｇ／Ｌ）；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．６ｇ／Ｌ）；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．０３ｇ／Ｌ）；ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．００３ｇ／Ｌ）；ＣｕＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．００３ｇ／Ｌ）；Ｎａ_２ＭｏＯ_４２Ｈ_２Ｏ０．００３（ｇ／Ｌ）；及び酵母エキス（１．０ｇ／Ｌ）。

フラスコを２５０ｒｐｍ及び３０℃に設定した振盪器に入れた。９日間の培養後、抽出物を採取し、それらのＪＡ含量をＨＰＬＣによって分析した。

粥様培養物の場合、０．５ｍｌの全培養物を更なる分析のためのサンプルとして採取した。マット様培養物の場合、０．５ｍｌの上清を使用した。各サンプルに、酸性化のために１０μｌの２ＮのＨＣｌを添加し、続いてＪＡ抽出のために０．５ｍｌの酢酸エチルを添加した。室温で３０分間振盪した後、サンプルを１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。酢酸エチル相をＨＰＬＣ分析に使用した。

ＨＰＬＣは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ３０００で、Ａｃｃｌａｉｍ（商標）１２０、Ｃ１８カラム（３μｍ１２０Ａ、３ｘ１５０ｍｍ）を使用して行った。移動相は、Ａ、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）及びＢ、アセトニトリル、勾配：０～５分、５％Ｂ、５～９分、５～８０％Ｂ；９～１３分、８０％Ｂ；１３～１４分、８０～５％Ｂ；１４～１７分、５％Ｂであった。ＪＡの検出器波長は２００ｎｍであった。図４は、真菌培養物からのＪＡが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）からのＪＡ標準と同じ保持時間及びＵＶスペクトルを有することを確認する。

振盪条件下でのＪＡ生成に対するファルネソールの添加の効果を図５で実証した。示されるように、ファルネソールの補充のない培養物は、粥様形態を示し、振盪条件下でジャスモン酸をほとんど生成しなかった（約１９ｍｇ／Ｌ）。対照的に、ファルネソールはＬ．イラネンシス（Ｌ．ｉｒａｎｅｎｓｉｓ）において菌糸凝集を誘導し、振盪条件にもかかわらずマット様微生物群の形成をもたらした。ファルネソールを添加したサンプルは、約３２７ｍｇ／Ｌの力価でジャスモン酸を生成することができた。

したがって、これらの結果は、ファルネソールの添加が、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌の真菌形態を制御するために使用され得ることを確認した。具体的には、ファルネソールを添加した場合、振盪条件下でラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）は菌糸体マットを形成することができた。マット様形態が糸状菌によるジャスモン酸生合成に重要であると思われることを考慮すると、ファルネソールの添加は、振盪条件下でより高い力価でのＪＡ生成をもたらした。

例３：ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）によるＪＡ生成に対するチロソールの添加の効果
ファルネソールの代わりにチロソールを用いて、例２に記載の手順を繰り返した。具体的には、Ｌ．イラネンシス（Ｌ．ｉｒａｎｅｎｓｉｓ）培養物を含むＰＤＡプレートの正方形片（面積約１ｃｍｘ１ｃｍ）を切断し、チロソールを含むか（Ｔｙｒ３）、又はチロソールを含まない（ＣＫ３）同じ栄養培地３０ｍｌに接種するために使用した。チロソール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡから購入）を７０％エタノールに溶解して、濃度１００ｇ／Ｌの原液を作製した。培養培地中の最終作業濃度は、チロソールを含有するサンプルについては１００ｍｇ／Ｌ（１，０００倍希釈）である。

フラスコを２５０ｒｐｍ及び３０℃に設定した振盪器に入れた。７日間の培養後、抽出物を採取し、それらのＪＡ含量をＨＰＬＣによって分析した。

振盪条件下でのＪＡ生成に対するチロソールの添加の効果を図６で実証した。示されるように、チロソールの補充のない培養物は、粥様形態を示し、振盪条件下でジャスモン酸をほとんど生成しなかった（約８１ｍｇ／Ｌ）。対照的に、チロソールはＬ．イラネンシス（Ｌ．ｉｒａｎｅｎｓｉｓ）において菌糸凝集を誘導し、振盪条件にもかかわらずマット様微生物群の形成をもたらした。チロソールを添加したサンプルは、約３１４ｍｇ／Ｌの力価でジャスモン酸を生成することができた。

したがって、これらの結果は、チロソールの添加が、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌の真菌形態を制御するために使用され得ることを確認した。具体的には、チロソールを添加した場合、振盪条件下でラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）は菌糸体マットを形成することができた。マット様形態が糸状菌によるジャスモン酸生合成に重要であると思われることを考慮すると、チロソールの添加は、振盪条件下でより高い力価でのＪＡ生成をもたらした。

例４：ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）によるＪＡ生成に対する１つ又は複数のジャスモン酸類生成エリシターの添加の効果
ファルネソールの代わりにジャスモン酸類生成エリシターを用いて、例２に記載の手順を繰り返した。具体的には、Ｌ．イラネンシス（Ｌ．ｉｒａｎｅｎｓｉｓ）培養物を含むＰＤＡプレートの正方形片（面積約１ｃｍｘ１ｃｍ）を切断し、ジャスモン酸類生成エリシターを含むか、又は含まない５０ｍｌの同じ栄養培地に接種するために使用した。ジャスモン酸類生成エリシターは、潜在的生合成経路を誘導又は覚醒させることができる小分子であり、この場合では、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）等の糸状菌によるＪＡ生成に関与するものである。典型的なジャスモン酸類生成エリシターは、植物ホルモン、酸化ストレス因子、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、又は抗生物質であり得る。図７は、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、サリチル酸（ＳＡ）、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）等の代表的な植物ホルモン；メチルビオロゲン（ＭＶ）及び過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）等の代表的な酸化ストレス因子；並びにバルプロ酸（ＶＡ）及び酪酸ナトリウム等の代表的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、本教示に従って使用することができる様々なジャスモン酸類生成エリシターの化学構造を示す。

インドール－３－酢酸ナトリウム塩（ＩＡＡ）、サリチル酸ナトリウム塩（ＳＡ）、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム塩（ＶＡ）、及び過酸化水素は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ナトリウム塩及びＨ_２Ｏ_２の原液を水で調製し、ＡＳＡの原液を７０％エタノールで調製した。培養培地中の最終作業濃度は、ＩＡＡ及び酪酸ナトリウムについては２００ｍｇ／Ｌであり、ＳＡ及びＡＳＡについては１００ｍｇ／Ｌ、ＶＡについては１０ｍｇ／Ｌ、並びにＨ_２Ｏ_２については２ｍＭであった。

フラスコを２５０ｒｐｍ及び３０℃に設定した振盪器に入れた。８日間の培養後、抽出物を採取し、それらのＪＡ含量をＨＰＬＣによって分析した。

対照（すなわち、ジャスモン酸類生成エリシターなし）では、５０ｍｇ／Ｌ未満のＪＡが生成された。ジャスモン酸類生成エリシターを添加した各培養物は、以下の表１に要約されるように、有意により高い力価でＪＡを生成した。

Claims

ジャスモン酸類の製造方法であって、
撹拌下において、少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子と、少なくとも１つの炭素源と、少なくとも１つの窒素源とを含む栄養培地中で糸状菌生物の株を培養することと、
前記栄養培地からジャスモン酸類生成物を単離することと、
を含み、
前記糸状菌生物が、ラシオディプロディア（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ）属であり、
前記真菌クオラムセンシング分子が、ファルネソール及びチロソールからなる群から選択される、
ジャスモン酸類の製造方法。
前記糸状菌生物が、ラシオディプロディア・イラネンシス（Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａｉｒａｎｅｎｓｉｓ）株である、請求項１に記載の方法。
前記栄養培地が、トリプトフォール、γ－ヘプタラクトン、ファルネセン酸、１－フェニル－エタノール、２－フェニルエタノール、マルチコラン酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌａｎｉｃａｃｉｄ）、マルチコロス酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｓｉｃａｃｉｄ）、マルチコール酸（ｍｕｌｔｉｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ビチロラクトン－Ｉ、γ－ブチロラクトン、α－（１，３）－グルカン、ａ－因子フェロモン、α－因子フェロモン、３－オクタノン、３－オクタノール、及び１－オクテン－３－オールからなる群から選択される１つ以上の真菌クオラムセンシング分子を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記栄養培地がファルネソール及びチロソールを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
前記炭素源が、スクロース、デンプン、マルトース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
前記窒素源が、牛肉エキス、ペプトン、コーンパルプ、酵母エキス、及び麦芽エキスからなる群から選択される有機窒素源である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
前記窒素源が、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、尿素、及び硝酸アンモニウムからなる群から選択される無機窒素源である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
前記撹拌が１５０ｒｐｍ～１５００ｒｐｍで行われる、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
前記培養が２０℃～３５℃の温度で行われる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
前記培養が少なくとも２日間行われる、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１つの真菌クオラムセンシング分子が１０～５００ｍｇ／Ｌで前記栄養培地中に存在する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
前記栄養培地が、１０－オキソ－トランス－８－デセン酸及びヘルシニンからなる群から選択される真菌成長ホルモンを更に含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
前記ジャスモン酸類生成物がジャスモン酸を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。