JP7714992B2

JP7714992B2 - Pharmaceutical composition containing a bispecific antibody as an active ingredient

Info

Publication number: JP7714992B2
Application number: JP2021162451A
Authority: JP
Inventors: 史朗柴山; 智也手塚; マーク・スロスビー; コルネリス・アドリアン・デ・クルイフ; ピーテル・フォッコ・ヴァン・ロー; リンス・クロースター; ロベルタス・コルネリス・ローヴァーズ
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2025-07-30
Anticipated expiration: 2041-10-01
Also published as: JP2022060182A

Description

本発明は、PD-1およびCD19に各々特異的に結合することができる二重特異性抗体（以下、「PD-1/CD19二重特異性抗体」と略記することがある。）またはその抗体断片（以下、これらを「PD-1/CD19二重特異性抗体等」と略記することがある。）を有効成分として含む医薬組成物ならびにそれらの医薬治療用途等に関する。 The present invention relates to pharmaceutical compositions containing, as an active ingredient, a bispecific antibody capable of specifically binding to PD-1 and CD19, respectively (hereinafter sometimes abbreviated as "PD-1/CD19 bispecific antibody") or an antibody fragment thereof (hereinafter sometimes abbreviated as "PD-1/CD19 bispecific antibody, etc."), as well as their medicinal and therapeutic uses.

PD-1は免疫グロブリンファミリーに属する免疫抑制受容体であり、抗原レセプターからの刺激により活性化したＢ細胞の免疫活性化シグナルを抑制する機能を持つ分子である。PD-1ノックアウトマウスの解析等から、PD-1シグナルは、自己免疫性拡張型心筋症、ループス様症候群、自己免疫性脳脊髄炎、全身性ループスエリテマトーデス、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎などの自己免疫疾患の抑制に重要な役割を果たすことが知られている。したがって、PD-1シグナルを増強する物質は自己免疫疾患等の予防または治療剤となり得ることが指摘されている。 PD-1 is an immunoinhibitory receptor belonging to the immunoglobulin family, and is a molecule that functions to suppress immune activation signals from B cells activated by stimulation from antigen receptors. Analysis of PD-1 knockout mice and other studies has shown that PD-1 signaling plays an important role in suppressing autoimmune diseases such as autoimmune dilated cardiomyopathy, lupus-like syndrome, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, graft-versus-host disease, type 1 diabetes, and rheumatoid arthritis. Therefore, it has been suggested that substances that enhance PD-1 signaling could be used as preventive or therapeutic agents for autoimmune diseases and other conditions.

一方、CD19は、Ｂ細胞に発現する膜タンパクであり、Ｂ細胞受容体複合体と共にＢ細胞へ刺激を伝える分子である。 On the other hand, CD19 is a membrane protein expressed on B cells and, together with the B cell receptor complex, is a molecule that transmits stimuli to B cells.

自己免疫疾患の予防または治療を目的としたPD-1二重特異性抗体について、これまでに幾つかの報告はあるが（特許文献１ないし３）、その一方の標的はＴ細胞受容体複合体のメンバーであるＣＤ３である。 Several reports have been published on PD-1 bispecific antibodies for the prevention or treatment of autoimmune diseases (Patent Documents 1 to 3), but one of the targets is CD3, a member of the T cell receptor complex.

また、がん治療を目的とする、PD-1およびCD19を標的とする二重特異性抗体に関する報告もあるが（特許文献４）、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制または治療を目的とする、PD-1/CD19二重特異性抗体に関する報告はない。 In addition, while there have been reports of bispecific antibodies targeting PD-1 and CD19 for the purpose of cancer treatment (Patent Document 4), there have been no reports of PD-1/CD19 bispecific antibodies for the purpose of preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, or treating autoimmune diseases.

国際公開第2003/011911号International Publication No. 2003/011911 国際公開第2004/072286号International Publication No. 2004/072286 国際公開第2013/022091号International Publication No. 2013/022091 中国特許出願公開第106939050号明細書Chinese Patent Application Publication No. 106939050

本発明の目的は、自己免疫疾患等に対する予防、症状進展抑制、再発抑制または治療のための新たな薬剤を提供することにある。 The object of the present invention is to provide a new drug for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, or treatment of autoimmune diseases, etc.

本発明の発明者らは鋭意検討した結果、かかる課題を解決し得る物質として、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体に着目し、本発明を完成した。 After extensive research, the inventors of the present invention focused on the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention as a substance that could solve these problems, and completed the present invention.

さらに、本発明の発明者らは、当該PD-1/CD19二重特異性抗体が、PD-1およびそのリガンドであるPD-L1との相互作用を許容する特徴を有することを確認した。くわえて、本発明の発明者らは、当該PD-1/CD19二重特異性抗体を構成するCD19に特異的に結合する第二アームの重鎖への所定の一つまたは複数のアミノ酸置換または付加により、その精製工程において、副産物との分離が容易なPD-1/CD19二重特異性抗体を見出した。 Furthermore, the inventors of the present invention confirmed that the PD-1/CD19 bispecific antibody has the characteristic of allowing interaction between PD-1 and its ligand PD-L1. In addition, the inventors of the present invention discovered a PD-1/CD19 bispecific antibody that can be easily separated from by-products during the purification process by substituting or adding one or more specific amino acids to the heavy chain of the second arm that specifically binds to CD19 constituting the PD-1/CD19 bispecific antibody.

すなわち、本発明は、以下のとおりである。 In other words, the present invention is as follows:

［１］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有し、PD-1およびCD19に各々特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（Ａ）（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の相補性決定領域１（以下、「重鎖可変領域の相補性決定領域１」を、VH-CDR1と略記することがある。）、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の相補性決定領域２（以下、「重鎖可変領域の相補性決定領域２」を、VH-CDR2と略記することがある。）および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の相補性決定領域３（以下、「重鎖可変領域の相補性決定領域３」を、VH-CDR3と略記することがある。）を有する重鎖可変領域（以下、「重鎖可変領域」を、「VH」と略記することがある。）、
（Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つのVHを有し、
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つのVHを有し、ここで、PD-1に特異的に結合する第一アームにおける、VH-CDR1、VH-CDR2およびVH-CDR3から選択される何れか一つまたは複数のVH-CDRにおいて、各々その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されていてもよく、および／または、CD19に特異的に結合する第二アームにおける、VH-CDR1、VH-CDR2およびVH-CDR3から選択される何れか一つまたは複数のVH-CDRにおいて、各々その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されていてもよい、当該PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２］ PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（Ａ）（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つのVHを有し、
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つのVHを有する、前項[１]記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つである、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つである、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つである、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つである、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つである、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１２］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１３］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１４］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１５］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１６］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１７］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１８］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１９］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２０］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２１］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２２］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２３］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２４］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２５］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２６］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２７］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２８］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［２９］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３０］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３１］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３２］（ｉ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有し、
（ｉｉ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、
（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有する、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３３］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのフレームワーク領域（以下、「フレームワーク領域」を、FRと略記することがある。）のうち、フレームワーク領域１（以下、FR1と略記することがある。）、フレームワーク領域２（以下、FR2と略記することがある。）およびフレームワーク領域３（以下、FR3と略記することがある。）が、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1あるいはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるアミノ酸配列に各々対応する、前項［１］～［３２］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３４］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのフレームワーク領域４（以下、「フレームワーク領域４」を、FR4と略記することがある。）が、生殖細胞系列型Ｊ遺伝子JH6cあるいはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるアミノ酸配列（但し、VH-CDR3領域に含まれるアミノ酸配列を除く。）からなる、前項［３３］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３５］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされ、当該体細胞突然変異により、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置１３のリシンがグルタミンに、位置１６のアラニンがバリンに、または位置１９のリシンがメチオニンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されたあるいは置換されていてもよいFR1からなる、前項［３３］または［３４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３６］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされ、当該体細胞突然変異により、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置３７のバリンがロイシンに置換されたあるいは置換されていてもよいFR2からなる、前項［３３］～［３５］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３７］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされ、当該体細胞突然変異により、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置７７のセリンがスレオニンに、または位置８４のシステインがセリンもしくはアスパラギンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されたあるいは置換されていてもよいFR3からなる、前項［３３］～［３６］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３８］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHのFR4が、生殖細胞系列型Ｊ遺伝子JH6cの体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子（但し、VH-CDR3領域をコードする遺伝子領域を除く。）にコードされ、そのFR4のアミノ酸配列（Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser）（配列番号６１）中のリシン（Lys）がグルタミンもしくはアスパラギンに、および／または＊印のスレオニン（Thr）がロイシンに置換されたあるいは置換されていてもよい、前項［３３］～［３７］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［３９］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHのFRのうち、FR1、FR2およびFR3が、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV5-51あるいはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるアミノ酸配列に各々対応する、前項［１］～［３８］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４０］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV5-51の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされ、当該体細胞突然変異により、配列番号２２のアミノ酸配列中の位置１のグルタミン酸がグルタミンに、位置１４のプロリンがセリンに、位置２７のチロシンがフェニルアラニンに、または位置３０のスレオニンがイソロイシンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されたあるいは置換されていてもよいFR1からなる、前項［３９］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４１］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV5-51の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされたFR2からなる、前項［３９］または［４０］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４２］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHのFRが、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV5-51の体細胞突然変異を受けていてもよい当該遺伝子にコードされ、当該体細胞突然変異により、配列番号２２のアミノ酸配列中の位置７６のイソロイシンがフェニルアラニンに、位置７７のセリンがスレオニンもしくはアスパラギンに、位置７８のスレオニンがバリンに、位置８４のセリンがアスパラギンに、位置９３のメチオニンがイソロイシンもしくはロイシンに、または位置９７のアラニンがバリンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されたあるいは置換されていてもよいFR3からなる、前項［３９］～［４１］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４３］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、95％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列からなる、前項［１］～［４２］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４４］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］～［４３］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４５］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、95％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列からなる、前項［１］～［４４］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４６］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列であって、当該配列において１１４番目のグルタミンがアルギニンに置換された、または置換されていてもよいアミノ酸配列からなる、前項［１］～［４５］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４７］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］～［４５］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４８］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［４９］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、
PD-1に特異的に結合する第一アームのVHが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、95％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、95％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列からなる、PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５０］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５１］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５２］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５３］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５４］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［１］または［２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５５］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［８］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５６］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３１または配列番号６３のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［９］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５７］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１０］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５８］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３３または配列番号６５のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１１］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［５９］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３４または配列番号６６のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６０］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１３］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６１］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３１または配列番号６３のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６２］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１５］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６３］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３３または配列番号６５のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１６］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６４］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号２のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３４または配列番号６６のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１７］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６５］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１８］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６６］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３１または配列番号６３のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［１９］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６７］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２０］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６８］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３３または配列番号６５のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２１］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［６９］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号３のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３４または配列番号６６のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７０］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２３］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７１］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３１または配列番号６３のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７２］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２５］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７３］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３３または配列番号６５のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２６］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７４］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号４のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３４または配列番号６６のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２７］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７５］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３０または配列番号６２のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２８］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７６］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３１または配列番号６３のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［２９］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７７］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３２または配列番号６４のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［３０］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７８］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３３または配列番号６５のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［３１］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［７９］ PD-1に特異的に結合する第一アームにおけるVHが、配列番号５のアミノ酸配列からなり、CD19に特異的に結合する第二アームにおけるVHが、配列番号３４または配列番号６６のアミノ酸配列からなる、前項［１］、［２］または［３２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８０］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよび／またはCD19に特異的に結合する第二アームが、各々、
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の相補性決定領域１（以下、「軽鎖可変領域の相補性決定領域１」を、VL-CDR1と略記することがある。）、
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の相補性決定領域２（以下、「軽鎖可変領域の相補性決定領域２」を、VL-CDR2と略記することがある。）、および
（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の相補性決定領域３（以下、「軽鎖可変領域の相補性決定領域３」を、VL-CDR3と略記することがある。）を有する軽鎖可変領域（以下、「軽鎖可変領域」を、「VL」と略記することがある。）を有する、前項［１］～［７９］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８１］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよび／またはCD19に特異的に結合する第二アームが、各々、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、前項［１］～［８０］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８２］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有し、PD-1およびCD19に各々特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、
（Ａ）PD-1に特異的に結合する第一アームが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有し、ならびに
（Ｂ）CD19に特異的に結合する第二アームが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８３］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有し、PD-1およびCD19に各々特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、当該PD-1に特異的に結合する第一アームが、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、PD-1に特異的に結合する第一アームのPD-1への結合もしくは（２）当該VHおよびVLからなるPD-1に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域のPD-1への結合に交差競合する、当該PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８４］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有し、PD-1およびCD19に各々特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、当該PD-1に特異的に結合する第一アームによるPD-1への結合が、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、PD-1に特異的に結合する第一アームまたは（２）当該VHおよびVLからなるPD-1に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域によって交差競合される、当該PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８５］さらに、当該CD19に特異的に結合する第二アームが、（１）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、CD19に特異的に結合する第二アームのCD19への結合もしくは（２）当該VHおよびVLからなるCD19に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域のCD19への結合に交差競合する、前項［８３］または［８４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８６］さらに、当該CD19に特異的に結合する第二アームによるCD19への結合が、（１）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、CD19に特異的に結合する第二アームもしくは（２）当該VHおよびVLからなるCD19に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域によって交差競合される、前項［８３］または［８４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８７］ CD19に特異的に結合する第二アームが、
（Ａ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｂ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｃ）（ａ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、
（Ｄ）（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVH、ならびに
（Ｅ）（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、
（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を有するVHから選択される何れか一つのVHを有する、前項［８３］または［８４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８８］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％、90％、95％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列からなる、前項［８３］または［８４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［８９］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる、前項［８３］または［８４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９０］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよび／またはCD19に特異的に結合する第二アームが、
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および
（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を有するVLを有する、前項［８３］～［８９］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９１］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよび／またはCD19に特異的に結合する第二アームが、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する、前項［８３］～［８９］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９２］ PD-1/CD19二重特異性抗体が、IgG抗体である前項［１］～［９１］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９３］前項［９２］記載のIgG抗体が、IgG₁抗体またはIgG₄抗体である前項［９２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９４］前項［９２］記載のIgG抗体が、IgG₁抗体である前項［９２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９５］前項［９２］記載のIgG抗体が、IgG₄抗体である前項［９２］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９６］前項［９４」記載のIgG₁抗体における２個の重鎖定常領域中のＥＵナンバリングシステムにおける235番目のロイシンが各々グリシンに置換され、および／または236番目のグリシンが各々アルギニンに置換された前項［９４］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９７］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖における定常領域中のＥＵナンバリングシステムによる351番目のロイシンおよび366番目のスレオニンがともにリシンに置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換された前項［９４］または［９６］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９８］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖における定常領域中のＥＵナンバリングシステムによる351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンおよび366番目のスレオニンがともにリシンに置換された前項［９４］または［９６］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［９９］前項［９４］および［９６］～［９８］の何れか一項記載のIgG₁抗体の２個の重鎖定常領域中のEUナンバリングシステムによる447番目のリシンが各々欠如している前項［９４］および［９６］～［９８］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１００］前項［９５］記載のIgG₄抗体における２個の重鎖定常領域中のEUナンバリングシステムによる228番目のセリンが各々プロリンに置換された前項［９５］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０１］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖が、そのＣ末端に、さらに、Ｇｌｙ（グリシン）、Gly-Lys-Lys-Ala（配列番号６７）、Gly-Lys-Ala-Lys-Ala（配列番号６８）、Gly-Arg-Arg-Ala（配列番号６９）またはGly-Arg-Ala-Arg-Ala（配列番号７０）を有する前項［９４］および［９６］～［９９］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０２］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖が、配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を含む、前項［１］～［９４］、［９６］、［９８］、［９９］および［１０１］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０３］ CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖が、配列番号２４、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を含む、前項［１］～［９４］、［９６］、［９８］、［９９］、［１０１］および［１０２］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０４］ PD-1に特異的に結合する第一アームのVLを有する軽鎖および／またはCD19に特異的に結合する第二アームのVLを有する軽鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を含む、前項［１］～［１０３］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０５］ PD-1に特異的に結合する第一アームおよびCD19に特異的に結合する第二アームを有し、PD-1およびCD19に各々特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗体断片であって、
（Ａ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を含み、
（Ｂ）PD-1に特異的に結合する第一アームのVLを有する軽鎖が、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLおよび配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を含み、
（Ｃ）CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHならびに配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を含み、および
（Ｄ）CD19に特異的に結合する第二アームのVLを有する軽鎖が、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLおよび配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を含む、当該PD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０６］ PD-1に特異的に結合する第一アームが、PD-1およびPD-L1間の相互作用を許容する、前項［１］～［１０５］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０７］ PD-1に特異的に結合する第一アームの重鎖および軽鎖からなる複合体の等電点が、約7.4～約7.7（好ましくは、約7.5～約7.6）である、前項［１］～［１０６］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０８］ CD19に特異的に結合する第二アームの重鎖および軽鎖からなる複合体の等電点が、約8.3～約8.8（好ましくは、約8.4～約8.6）である、前項［１］～［１０７］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１０９］投与中あるいは投与後24時間以内において、血中あるいは組織中のサイトカイン産生が十分に低減された、前項［１］～［１０８］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１０］ PD-1に特異的に結合する第一アームがPD-1およびPD-L1間の相互作用を許容し、かつ、サイトカイン産生が十分に低減された、前項［１］～［１０８］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１１］サイトカインが、少なくともIL-2、IFN-γまたはTNF-αである、前項［１０９］または［１１０］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１２］同じＢ細胞上に各々発現するPD-1およびCD19に結合することにより、Ｂ細胞の活性化を抑制する、前項［１］～［１１１］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１３］Ｔ細胞（好ましくは、メモリーＴ細胞）の活性化を抑制する、前項［１］～［１１１］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１４］Ｂ細胞上に発現するCD19およびＴ細胞上に発現するPD-1に各々結合することにより、Ｔ細胞の活性化を抑制する、前項［１１３］記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１５］ PD-1およびCD19が、各々ヒトPD-1およびヒトCD19である、前項［１］～［１１４］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１６］当該PD-1/CD19二重特異性抗体が、モノクローナル抗体である前項［１］～［１１５］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１１７］当該PD-1/CD19二重特異性抗体が、単離抗体である、前項［１］～［１１６］の何れか一項記載のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。
［１－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む医薬組成物。
［１－２］さらに、少なくとも一つの薬学的に許容できる担体を含む、前項［１－１］記載の医薬組成物。 [1] A bispecific antibody or antibody fragment thereof, which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD-1 and CD19, respectively, wherein the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) (a) a heavy chain variable region complementarity-determining region 1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (hereinafter, "heavy chain variable region complementarity-determining region 1" may be abbreviated as VH-CDR1);
(b) a heavy chain variable region having a complementarity-determining region 2 of the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (hereinafter, "complementarity-determining region 2 of the heavy chain variable region" may be abbreviated as VH-CDR2) and (c) a heavy chain variable region having a complementarity-determining region 3 of the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (hereinafter, "complementarity-determining region 3 of the heavy chain variable region" may be abbreviated as VH-CDR3) (hereinafter, "heavy chain variable region" may be abbreviated as "VH");
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
the second arm specifically binding to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, wherein any one to five amino acid residues in any one or more VH-CDRs selected from VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 in the first arm that specifically binds to PD-1 are optionally substituted with other amino acids, and/or any one to five amino acid residues in any one or more VH-CDRs selected from VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 in the second arm that specifically binds to CD19 are optionally substituted with other amino acids.
[2] The first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
the second arm specifically binding to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [1], comprising a VH selected from the group consisting of: (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[3] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof is selected from the group consisting of: (b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[4] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof is selected from the group consisting of: (b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[5] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof is selected from the group consisting of: (b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[6] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof is selected from the group consisting of: (b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[7] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof is selected from the group consisting of: (b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[8] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
[9] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
[10] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
[11] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
[12] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[13] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
[14] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
[15] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
[16] (i) the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
[17] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[18] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
[19] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
[20] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
[21] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
[22] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[23] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
[24] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
[25] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
[26] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
[27] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[28] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
[29] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
[30] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
[31] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
[32] (i) The VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
(ii) the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is
(a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], which has (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and (c) a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[33] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [32], wherein, among the framework regions (hereinafter, "framework regions" may be abbreviated as FR) of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1, framework region 1 (hereinafter, may be abbreviated as FR1), framework region 2 (hereinafter, may be abbreviated as FR2), and framework region 3 (hereinafter, may be abbreviated as FR3) respectively correspond to the amino acid sequences encoded by the germline V gene IGHV7-4-1 or a somatically mutated version of said gene.
[34] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [33], wherein framework region 4 of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 (hereinafter, "framework region 4" may be abbreviated as FR4) consists of an amino acid sequence encoded by the germline J gene JH6c or a somatically mutated version of this gene (excluding the amino acid sequence contained in the VH-CDR3 region).
[35] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [33] or [34], wherein the FR of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is encoded by the germline V gene IGHV7-4-1, which may be somatically mutated, and comprises FR1 in which, due to the somatic mutation, the lysine at position 13 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is substituted with glutamine, the alanine at position 16 with valine, or the lysine at position 19 with methionine, or any combination of these substitutions.
[36] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [33] to [35], wherein the FR of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is encoded by a germline V gene IGHV7-4-1 that may have undergone somatic mutation, and comprises FR2 in which valine at position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 has been substituted with leucine, or an optional substitution, as a result of the somatic mutation.
[37] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [33] to [36], wherein the FR of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is encoded by a germline V gene IGHV7-4-1 that may have undergone somatic mutation, and comprises FR3 in which, due to the somatic mutation, the serine at position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is substituted with threonine, or the cysteine at position 84 is substituted with serine or asparagine, or any combination thereof.
[38] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [33] to [37], wherein FR4 of the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is encoded by a germline J gene JH6c that may be somatically mutated (excluding the gene region encoding the VH-CDR3 region), and wherein the lysine (Lys) in the amino acid sequence of FR4 (Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser) (SEQ ID NO: 61) is or may be substituted with glutamine or asparagine and/or with leucine.
[39] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [38], wherein, among the FRs of the VH of the second arm that specifically binds to CD19, FR1, FR2, and FR3 correspond to the amino acid sequences encoded by the germline V gene IGHV5-51 or a somatically mutated version of said gene, respectively.
[40] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [39], wherein the FR of the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is encoded by a germline V gene IGHV5-51 that may be somatically mutated, and comprises FR1 that is or may be substituted, due to the somatic mutation, for glutamic acid at position 1 with glutamine, for proline at position 14 with serine, for tyrosine at position 27 with phenylalanine, or for threonine at position 30 with isoleucine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or any combination thereof.
[41] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [39] or [40], wherein the FR of the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of FR2 encoded by the germline V gene IGHV5-51, which may be somatically mutated.
[42] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [39] to [41], wherein the FR of the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is encoded by a germline V gene IGHV5-51, which may be somatically mutated, and comprises FR3 that is or may be substituted, due to somatic mutation, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, by replacing isoleucine at position 76 with phenylalanine, serine at position 77 with threonine or asparagine, threonine at position 78 with valine, serine at position 84 with asparagine, methionine at position 93 with isoleucine or leucine, or alanine at position 97 with valine, or by any combination of these substitutions.
[43] the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [42], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of said VH.
[44] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [43], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5.
[45] the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [44], wherein the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of said VH.
[46] the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [45], wherein the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 34, in which glutamine at position 114 is or may be substituted with arginine.
[47] the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [45], wherein the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[48] the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, and SEQ ID NO:66.
[49] A bispecific antibody or an antibody fragment thereof, comprising: a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19;
a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof, wherein the VH of a first arm that specifically binds to PD-1 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, or an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of said VH; and the VH of a second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, and SEQ ID NO:66, or an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of said VH.
[50] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[51] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[52] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[53] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[54] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1] or [2], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[55] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [8], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 62.
[56] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [9], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 63.
[57] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [10], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 64.
[58] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [11], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 65.
[59] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [12], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 66.
[60] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [13], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 62.
[61] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [14], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 63.
[62] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [15], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 64.
[63] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [16], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 65.
[64] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [17], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 66.
[65] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [18], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 62.
[66] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [19], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 63.
[67] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [20], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 64.
[68] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [21], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 65.
[69] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [22], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 66.
[70] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [23], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 62.
[71] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [24], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 63.
[72] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [25], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 64.
[73] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [26], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 65.
[74] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [27], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 66.
[75] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [28], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 62.
[76] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [29], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 63.
[77] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [30], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 64.
[78] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [31], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 65.
[79] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [1], [2], or [32], wherein the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 66.
[80] The first arm that specifically binds to PD-1 and/or the second arm that specifically binds to CD19 each comprises:
(a) a light chain variable region complementarity-determining region 1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (hereinafter, "light chain variable region complementarity-determining region 1" may be abbreviated as VL-CDR1);
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [79], comprising: (b) a light chain variable region (hereinafter, "light chain variable region" may be abbreviated as "VL") having a light chain complementarity-determining region 2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 (hereinafter, "light chain variable region complementarity-determining region 2" may be abbreviated as VL-CDR2), and (c) a light chain variable region (hereinafter, "light chain variable region" may be abbreviated as "VL") having a light chain complementarity-determining region 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 (hereinafter, "light chain variable region complementarity-determining region 3" may be abbreviated as VL-CDR3).
[81] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [80], wherein the first arm that specifically binds to PD-1 and/or the second arm that specifically binds to CD19 each have a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.
[82] A bispecific antibody or an antibody fragment thereof, which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD-1 and CD19, respectively;
a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof, wherein (A) the first arm that specifically binds to PD-1 has a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25; and (B) the second arm that specifically binds to CD19 has a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, and SEQ ID NO:66, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
[83] A PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof, comprising a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to both PD-1 and CD19, wherein the first arm that specifically binds to PD-1 cross-competes with (1) the binding to PD-1 of the first arm that specifically binds to PD-1, which has a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, or (2) the binding to PD-1 of the variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to PD-1, comprising the VH and VL.
[84] A PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof, which comprises a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD-1 and CD19, respectively, wherein the binding of the first arm that specifically binds to PD-1 is cross-competed by either (1) a first arm that specifically binds to PD-1, the first arm having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, or (2) a variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to PD-1, comprising the VH and VL.
[85] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [83] or [84], wherein the second arm that specifically binds to CD19 cross-competes with (1) the binding to CD19 of the second arm that specifically binds to CD19, which second arm has a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, or (2) the binding to CD19 of the variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to CD19, which VH and VL are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[86] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [83] or [84], wherein the binding to CD19 of the second arm that specifically binds to CD19 is cross-competed by (1) a second arm that specifically binds to CD19, the second arm having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or (2) the variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to CD19, the variable region comprising the VH and VL.
[87] The second arm that specifically binds to CD19 is
(A) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(B) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(C) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(D) (a) VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
(b) a VH having a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (E) (a) a VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [83] or [84], comprising a VH selected from: (b) a VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
[88] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [83] or [84], wherein the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66, or an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of said VH.
[89] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [83] or [84], wherein the VH of the second arm that specifically binds to CD19 consists of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 66.
[90] The first arm that specifically binds to PD-1 and/or the second arm that specifically binds to CD19,
(a) VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [83] to [89], which has a VL having (b) a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and (c) a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
[91] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [83] to [89], wherein the first arm that specifically binds to PD-1 and/or the second arm that specifically binds to CD19 has a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.
[92] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the above [1] to [91], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody is an IgG antibody.
[93] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [92], wherein the IgG antibody according to the preceding paragraph [92] is an _IgG1 antibody or an _IgG4 antibody.
[94] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [92], wherein the IgG antibody according to the preceding paragraph [92] is an _IgG1 antibody.
[95] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [92], wherein the IgG antibody according to the preceding paragraph [92] is an _IgG4 antibody.
[96] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [94], wherein the leucine at position 235 in the EU numbering system in the two heavy chain constant regions of the _IgG1 antibody according to the preceding paragraph [94] has each been substituted with glycine and/or the glycine at position 236 in the EU numbering system has each been substituted with arginine.
[97] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [94] or [96], wherein the leucine at position 351 and the threonine at position 366, according to the EU numbering system, in the constant region of the heavy chain having the VH of the first arm that specifically binds to PD-1, are both substituted with lysine, and the leucine at position 351 is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 is substituted with glutamic acid in the constant region of the heavy chain having the VH of the second arm that specifically binds to CD19.
[98] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [94] or [96], wherein the leucine at position 351 according to the EU numbering system is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 is substituted with glutamic acid in the constant region of the heavy chain having the VH of the first arm that specifically binds to PD-1, and the leucine at position 351 and the threonine at position 366 are both substituted with lysine in the constant region of the heavy chain having the VH of the second arm that specifically binds to CD19.
[99] The PD- _1/ CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [94] and [96] to [98], wherein the lysine at position 447 according to the EU numbering system in each of the two heavy chain constant regions of the IgG1 antibody according to any one of the preceding paragraphs [94] and [96] to [98] is absent.
[100] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding paragraph [95], wherein the serine at position 228 according to the EU numbering system in each of the two heavy chain constant regions of the _IgG4 antibody according to the preceding paragraph [95] is substituted with proline.
[101] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [94] and [96] to [99], wherein the heavy chain comprising the VH of the second arm that specifically binds to CD19 further comprises Gly (glycine), Gly-Lys-Lys-Ala (SEQ ID NO: 67), Gly-Lys-Ala-Lys-Ala (SEQ ID NO: 68), Gly-Arg-Arg-Ala (SEQ ID NO: 69), or Gly-Arg-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 70) at its C-terminus.
[102] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [94], [96], [98], [99], and [101], wherein the heavy chain having the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 comprises a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
[103] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding paragraphs [1] to [94], [96], [98], [99], [101], and [102], wherein the heavy chain having the VH of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a heavy chain constant region consisting of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, and SEQ ID NO: 75.
[104] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [103], wherein the light chain having a VL in a first arm that specifically binds to PD-1 and/or the light chain having a VL in a second arm that specifically binds to CD19 comprises a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
[105] A bispecific antibody or an antibody fragment thereof, which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD-1 and CD19, respectively,
(A) a heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1, comprising a VH consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and SEQ ID NO:5, and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(B) a light chain having a VL of the first arm that specifically binds to PD-1 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29;
(C) the PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof, wherein the heavy chain having a VH in the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, and SEQ ID NO:66, and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (D) the light chain having a VL in the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:29.
[106] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [105], wherein the first arm that specifically binds to PD-1 permits interaction between PD-1 and PD-L1.
[107] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [106], wherein the complex consisting of the heavy chain and light chain of the first arm that specifically binds to PD-1 has an isoelectric point of about 7.4 to about 7.7 (preferably about 7.5 to about 7.6).
[108] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [107], wherein the complex comprising the heavy chain and light chain of the second arm that specifically binds to CD19 has an isoelectric point of about 8.3 to about 8.8 (preferably about 8.4 to about 8.6).
[109] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [108], which sufficiently reduces cytokine production in the blood or tissues during administration or within 24 hours after administration.
[110] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [108], wherein the first arm that specifically binds to PD-1 allows interaction between PD-1 and PD-L1, and cytokine production is sufficiently reduced.
[111] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [109] or [110], wherein the cytokine is at least IL-2, IFN-γ, or TNF-α.
[112] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [111], which inhibits B cell activation by binding to PD-1 and CD19, each expressed on the same B cell.
[113] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of items [1] to [111], which suppresses the activation of T cells (preferably memory T cells).
[114] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to the preceding item [113], which inhibits T cell activation by binding to both CD19 expressed on B cells and PD-1 expressed on T cells.
[115] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the above items [1] to [114], wherein PD-1 and CD19 are human PD-1 and human CD19, respectively.
[116] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the above items [1] to [115], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody is a monoclonal antibody.
[117] The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof according to any one of the preceding items [1] to [116], wherein the PD-1/CD19 bispecific antibody is an isolated antibody.
[1-1] A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[1-2] The pharmaceutical composition according to the above item [1-1], further comprising at least one pharmaceutically acceptable carrier.

［２－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－２］自己免疫疾患が、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ANCA関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG₄関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（グレーブス病（甲状腺機能亢進症））、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、サルコイドーシス、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、全身性肥満細胞症または封入体筋炎である前項［２－１］記載の剤。
［２－３］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、移植片対宿主病（GVHD）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－４］インスリン製剤（例えば、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミルおよびインスリンアスパルト等）、スルホニルウレア剤（例えば、グリベンクラミド、グリクラジドおよびグリメピリド等）、速攻型インスリン分泌促進薬（例えば、ナテグリニド等）、ビグアナイド製剤（例えば、メトホルミン等）、インスリン抵抗性改善薬（例えば、ピオグリタゾン等）、α-グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボースおよびボグリボース等）、糖尿病性神経症治療薬（例えば、エパルレスタット、メキシレチンおよびイミダプリル等）、GLP-1アナログ製剤（例えば、リラグルチド、エクセナチド、リキシセナチドおよびセマグルチド等）およびDPP-4阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチンおよびアログリプチン等）から選択される何れか一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とし、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、Ｉ型糖尿病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－５］ステロイド薬（例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾンおよびベタメタゾン等）、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモドおよびアレムツズマブから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とし、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、多発性硬化症の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－６］ステロイド薬（例えば、前項［２－５］記載のステロイド薬）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスおよびフィンゴリモド等）およびべリムマブから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とし、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、全身性エリテマトーデスの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－７］ステロイド薬（例えば、前項［２－５］記載のステロイド薬）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビンおよびタクロリムス等）、抗サイトカイン薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブおよびセルトリズマブ等）およびアバタセプトから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とし、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、関節リウマチの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－８］前項［２－４］～［２－７］において挙げられる何れか一以上の薬剤とともに投与されることを特徴とし、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－９］前項［２－４］～［２－７］において挙げられる何れか一以上の薬剤を投与される患者に投与されることを特徴とする、前項［２－４］～［２－８］記載の各疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－１０］前項［２－４］～［２－７］において挙げられる何れか一以上の薬剤の投与後に投与されることを特徴とする、前項［２－４］～［２－８］記載の各疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［２－１１］前項［２－４］～［２－７］において挙げられる何れか一以上の薬剤の投与前に投与されることを特徴とする、前項［２－４］～［２－８］記載の各疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。 [2-1] An agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating an autoimmune disease, comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[2-2] Autoimmune diseases include Behçet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclerosis, progressive systemic sclerosis), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu's arteritis), malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, rheumatoid vasculitis, large vasculitis, ANCA-associated vasculitis (e.g., granulomatosis with polyangiitis and eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), Cogan's syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, polymyalgia rheumatica, fibromyalgia, antiphospholipid syndrome, eosinophilic fasciitis, IgG ₄ Associated diseases (e.g., primary sclerosing cholangitis, autoimmune pancreatitis, etc.), Guillain-Barré syndrome, myasthenia gravis, chronic atrophic gastritis, autoimmune hepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, primary biliary cirrhosis, Goodpasture's syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, megaloblastic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pernicious anemia, autoimmune neutropenia, idiopathic thrombocytopenic purpura, Graves' disease (Graves' disease (hyperthyroidism)), Hashimoto's disease, autoimmune adrenal insufficiency, primary hypothyroidism, Addison's disease (chronic hypoadrenalism), idiopathic Addison's disease, type 1 diabetes, slowly progressive type 1 diabetes (adult latent autoimmune diabetes), localized the agent according to the preceding item [2-1], which is selected from the group consisting of scleroderma, psoriasis, psoriatic arthritis, bullous pemphigoid, pemphigus, pemphigoid, herpes gestationis, linear IgA bullous dermatosis, epidermolysis bullosa acquisita, alopecia areata, vitiligo, vitiligo vulgaris, neuromyelitis optica, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, multifocal motor neuropathy, sarcoidosis, giant cell arteritis, amyotrophic lateral sclerosis, Harada's disease, autoimmune optic neuropathy, idiopathic azoospermia, habitual abortion, inflammatory bowel disease (e.g., ulcerative colitis, Crohn's disease), celiac disease, ankylosing spondylitis, severe asthma, chronic urticaria, transplantation immunity, familial Mediterranean fever, eosinophilic sinusitis, dilated cardiomyopathy, systemic mastocytosis, and inclusion body myositis.
[2-3] An agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating graft-versus-host disease (GVHD), comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[2-4] Insulin preparations (e.g., human insulin, insulin glargine, insulin lispro, insulin detemir, insulin aspart, etc.), sulfonylureas (e.g., glibenclamide, gliclazide, glimepiride, etc.), rapid-acting insulin secretagogues (e.g., nateglinide, etc.), biguanides (e.g., metformin, etc.), insulin sensitizers (e.g., pioglitazone, etc.), α-glucosidase inhibitors (e.g., acarbose, voglibose, etc.), drugs for treating diabetic neuropathy (e.g., epalres, an agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating type I diabetes, the agent comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the items [1] to [117] above, which is administered in combination with one or more drugs selected from the group consisting of PD-1/CD19 bispecific antibodies (e.g., PD-1/CD19 alpha-amyloid globulin ...
[2-5] Steroid drugs (e.g., cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, hydrocortisone sodium succinate, fludrocortisone acetate, prednisolone, prednisolone acetate, prednisolone sodium succinate, prednisolone butylacetate, prednisolone sodium phosphate, halopredone acetate, methylprednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone, triamcinolone acetate, triamcinolone acetonide, dexamethasone, dexamethasone acetate, dexamethasone sodium phosphate, dexamethasone palmitate, paracetamol acetate) an agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating multiple sclerosis, the agent comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the above items [1] to [117], which is administered in combination with one or more drugs selected from the group consisting of cyclosporine, fluticasone, and betamethasone, interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetate, mitoxantrone, azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporine, methotrexate, cladribine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticotropin, mizoribine, tacrolimus, fingolimod, and alemtuzumab.
[2-6] An agent for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating systemic lupus erythematosus, which is administered in combination with one or more drugs selected from a steroid drug (e.g., a steroid drug described in the preceding item [2-5]), an immunosuppressant (e.g., cyclosporine, tacrolimus, fingolimod, etc.), and belimumab, and which contains as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[2-7] An agent for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating rheumatoid arthritis, the agent comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117], which is administered in combination with one or more drugs selected from a steroid drug (e.g., a steroid drug described in the preceding item [2-5]), an antirheumatic drug (e.g., methotrexate, sulfasalazine, bucillamine, leflunomide, mizoribine, tacrolimus, etc.), an anticytokine drug (e.g., infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, golimumab, certolizumab, etc.), and abatacept.
[2-8] An agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating an autoimmune disease, which is administered in combination with any one or more of the agents listed in the preceding items [2-4] to [2-7], and which comprises as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[2-9] A preventive, symptom progression suppressive, recurrence suppressive, and/or therapeutic agent for each of the diseases described in the preceding items [2-4] to [2-8], which is administered to a patient receiving any one or more of the drugs described in the preceding items [2-4] to [2-7].
[2-10] The agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating each of the diseases described in the preceding items [2-4] to [2-8], which is administered after the administration of any one or more of the drugs described in the preceding items [2-4] to [2-7].
[2-11] The agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating each of the diseases described in the preceding items [2-4] to [2-8], which is administered before the administration of any one or more of the drugs described in the preceding items [2-4] to [2-7].

［３－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片および少なくとも一つの薬学的に許容できる担体を含む、静脈内注射用製剤。
［３－２］自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療のための前項［３－１］記載の静脈内注射用製剤。
［３－３］点滴用である、前項［３－１］または［３－２］記載の静脈内注射用製剤。 [3-1] A formulation for intravenous injection, comprising a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117] and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
[3-2] The intravenous preparation according to the above item [3-1] for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence and/or treating an autoimmune disease.
[3-3] The intravenous injection preparation according to the above [3-1] or [3-2], which is for infusion.

［４－１］自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療のための前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－２］自己免疫疾患が、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ANCA関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG₄関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（グレーブス病（甲状腺機能亢進症））、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、サルコイドーシス、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、全身性肥満細胞症または封入体筋炎である、前項［４－１］記載の使用。
［４－３］移植片対宿主病（GVHD）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療のための前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－４］Ｉ型糖尿病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療において、インスリン製剤（例えば、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミルおよびインスリンアスパルト等）、スルホニルウレア剤（例えば、グリベンクラミド、グリクラジドおよびグリメピリド等）、速攻型インスリン分泌促進薬（例えば、ナテグリニド等）、ビグアナイド製剤（例えば、メトホルミン等）、インスリン抵抗性改善薬（例えば、ピオグリタゾン等）、α-グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボースおよびボグリボース等）、糖尿病性神経症治療薬（例えば、エパルレスタット、メキシレチンおよびイミダプリル等）、GLP-1アナログ製剤（例えば、リラグルチド、エクセナチド、リキシセナチドおよびセマグルチド等）およびDPP-4阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチンおよびアログリプチン等）から選択される何れか一以上の薬剤とともに投与される、前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－５］多発性硬化症の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療において、ステロイド薬（例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾンおよびベタメタゾン等）、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモドおよびアレムツズマブから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与される、前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－６］全身性エリテマトーデスの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療において、ステロイド薬（例えば、前項［２－５］記載のステロイド薬）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスおよびフィンゴリモド等）およびべリムマブから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与される、前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－７］関節リウマチの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療において、ステロイド薬（例えば、前項［２－５］記載のステロイド薬）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビンおよびタクロリムス等）、抗サイトカイン薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブおよびセルトリズマブ等）およびアバタセプトから選択される何れか一以上の薬剤とともに投与される、前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。
［４－８］自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療において、前項［４－４］～［４－７］において挙げられる何れか一以上の薬剤とともに投与される、前項［１－１］または［１－２］記載の医薬組成物の使用。 [4-1] Use of the pharmaceutical composition according to the above item [1-1] or [1-2] for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of an autoimmune disease.
[4-2] Autoimmune diseases include Behçet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclerosis, progressive systemic sclerosis), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu's arteritis), malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, rheumatoid vasculitis, large vasculitis, ANCA-associated vasculitis (e.g., granulomatosis with polyangiitis and eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), Cogan's syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, polymyalgia rheumatica, fibromyalgia, antiphospholipid syndrome, eosinophilic fasciitis, IgG ₄ Associated diseases (e.g., primary sclerosing cholangitis, autoimmune pancreatitis, etc.), Guillain-Barré syndrome, myasthenia gravis, chronic atrophic gastritis, autoimmune hepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, primary biliary cirrhosis, Goodpasture's syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, megaloblastic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pernicious anemia, autoimmune neutropenia, idiopathic thrombocytopenic purpura, Graves' disease (Graves' disease (hyperthyroidism)), Hashimoto's disease, autoimmune adrenal insufficiency, primary hypothyroidism, Addison's disease (chronic hypoadrenalism), idiopathic Addison's disease, type 1 diabetes, slowly progressive type 1 diabetes (adult latent autoimmune diabetes), localized The use according to the preceding item [4-1], wherein the condition is scleroderma, psoriasis, psoriatic arthritis, bullous pemphigoid, pemphigus, pemphigoid, herpes gestationis, linear IgA bullous dermatosis, epidermolysis bullosa acquisita, alopecia areata, vitiligo, vitiligo vulgaris, neuromyelitis optica, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, multifocal motor neuropathy, sarcoidosis, giant cell arteritis, amyotrophic lateral sclerosis, Harada's disease, autoimmune optic neuropathy, idiopathic azoospermia, recurrent abortion, inflammatory bowel disease (e.g., ulcerative colitis, Crohn's disease), celiac disease, ankylosing spondylitis, severe asthma, chronic urticaria, transplantation immunity, familial Mediterranean fever, eosinophilic sinusitis, dilated cardiomyopathy, systemic mastocytosis, or inclusion body myositis.
[4-3] Use of the pharmaceutical composition according to the above item [1-1] or [1-2] for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of graft-versus-host disease (GVHD).
[4-4] In the prevention, suppression of progression of symptoms, suppression of recurrence and/or treatment of type I diabetes, insulin preparations (e.g., human insulin, insulin glargine, insulin lispro, insulin detemir, insulin aspart, etc.), sulfonylureas (e.g., glibenclamide, gliclazide, glimepiride, etc.), rapid-acting insulin secretagogues (e.g., nateglinide, etc.), biguanides (e.g., metformin, etc.), insulin sensitizers (e.g., pioglitazone, etc.), α-glucanamides (e.g., α-glucanamides ... Use of the pharmaceutical composition according to the preceding item [1-1] or [1-2], which is administered together with one or more drugs selected from glucosidase inhibitors (e.g., acarbose, voglibose, etc.), diabetic neuropathy therapeutic drugs (e.g., epalrestat, mexiletine, imidapril, etc.), GLP-1 analogues (e.g., liraglutide, exenatide, lixisenatide, semaglutide, etc.), and DPP-4 inhibitors (e.g., sitagliptin, vildagliptin, alogliptin, etc.).
[4-5] In the prevention, suppression of symptom progression, suppression of relapse, and/or treatment of multiple sclerosis, steroid drugs (e.g., cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, hydrocortisone sodium succinate, fludrocortisone acetate, prednisolone, prednisolone acetate, prednisolone sodium succinate, prednisolone butylacetate, prednisolone sodium phosphate, halopredone acetate, methylprednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone, triamcinolone acetate, triamcinolone acetonide, dextromethorphan, phenytoin ... Use of the pharmaceutical composition according to the preceding item [1-1] or [1-2], wherein the pharmaceutical composition is administered in combination with one or more drugs selected from the group consisting of dexamethasone, dexamethasone acetate, dexamethasone sodium phosphate, dexamethasone palmitate, paramethasone acetate, and betamethasone), interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetate, mitoxantrone, azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporine, methotrexate, cladribine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticotropin, mizoribine, tacrolimus, fingolimod, and alemtuzumab.
[4-6] Use of the pharmaceutical composition according to the preceding item [1-1] or [1-2], which is administered together with one or more drugs selected from a steroid drug (e.g., a steroid drug according to the preceding item [2-5]), an immunosuppressant (e.g., cyclosporine, tacrolimus, fingolimod, etc.), and belimumab, in the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of systemic lupus erythematosus.
[4-7] Use of the pharmaceutical composition according to the preceding item [1-1] or [1-2], administered together with one or more drugs selected from steroid drugs (e.g., the steroid drugs described in the preceding item [2-5]), antirheumatic drugs (e.g., methotrexate, sulfasalazine, bucillamine, leflunomide, mizoribine, tacrolimus, etc.), anticytokine drugs (e.g., infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, golimumab, certolizumab, etc.), and abatacept, in the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of rheumatoid arthritis.
[4-8] Use of the pharmaceutical composition according to the preceding item [1-1] or [1-2], administered together with any one or more of the drugs listed in the preceding items [4-4] to [4-7], in the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of an autoimmune disease.

［５－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片の有効量を患者に投与することからなる、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療方法。 [5-1] A method for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating an autoimmune disease, comprising administering to a patient an effective amount of a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].

［６－１］自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に使用される、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。 [6-1] A PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of items [1] to [117] above, for use in the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of an autoimmune disease.

［７－１］自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療のための医薬の製造における、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片の使用。 [7-1] Use of a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of items [1] to [117] in the manufacture of a pharmaceutical for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating an autoimmune disease.

［８－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。
［８－２］自己反応性Ｂ細胞介在性疾患が、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症または悪性貧血である、前項［８－１］記載の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療剤。 [8-1] An agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence, and/or treating autoreactive B cell-mediated disease, comprising as an active ingredient a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[8-2] The prophylactic, symptom progression-suppressive, recurrence-suppressive, and/or therapeutic agent according to the preceding item [8-1], wherein the autoreactive B cell-mediated disease is systemic lupus erythematosus, Graves' disease, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, asthma, cryoglobulinemia, primary biliary sclerosis, or pernicious anemia.

［９－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
［９－２］自己反応性Ｂ細胞抑制が、イムノグロブリン産生抑制である、前項［９－１］記載の自己反応性Ｂ細胞抑制剤。
［９－３］当該イムノグロブリンが、IgGまたはIgMである、前項［９－２］記載の自己反応性Ｂ細胞抑制剤。 [9-1] An autoreactive B cell inhibitor comprising, as an active ingredient, a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[9-2] The autoreactive B cell inhibitor according to the above item [9-1], wherein the autoreactive B cell inhibition is immunoglobulin production inhibition.
[9-3] The autoreactive B cell inhibitor according to the above item [9-2], wherein the immunoglobulin is IgG or IgM.

［１０－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、Ｔ細胞活性化抑制剤。
［１０－２］当該Ｔ細胞活性化抑制が、サイトカイン産生抑制である、前項［１０－１］記載のＴ細胞活性化抑制剤。
［１０－３］当該Ｔ細胞活性化抑制が、メモリーＴ細胞抑制である、前項［１０－１］または［１０－２］記載のＴ細胞活性化抑制剤。 [10-1] A T cell activation inhibitor comprising, as an active ingredient, a PD-1/CD19 bispecific antibody or an antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].
[10-2] The T cell activation inhibitor according to the preceding item [10-1], wherein the inhibition of T cell activation is inhibition of cytokine production.
[10-3] The T cell activation inhibitor according to the above [10-1] or [10-2], wherein the inhibition of T cell activation is inhibition of memory T cells.

［１１－１］前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片の有効量を患者に投与することを含む、自己反応性Ｂ細胞抑制またはＴ細胞活性化抑制方法。 [11-1] A method for suppressing autoreactive B cells or T cell activation, comprising administering to a patient an effective amount of a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of the preceding items [1] to [117].

［１２－１］自己反応性Ｂ細胞抑制またはＴ細胞活性化抑制に使用される、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片。 [12-1] A PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of items [1] to [117] above, used to suppress autoreactive B cells or T cell activation.

［１３－１］自己反応性Ｂ細胞抑制剤またはＴ細胞活性化抑制剤の製造における、前項［１］～［１１７］の何れか一項から選択されるPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片の使用。 [13-1] Use of a PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof selected from any one of items [1] to [117] in the manufacture of an autoreactive B cell inhibitor or a T cell activation inhibitor.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体は、PD-1およびPD-L1間の相互作用を許容し、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療の効果の増強あるいは持続が期待できる。 The PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention allows interaction between PD-1 and PD-L1, and is expected to prevent autoimmune diseases, inhibit the progression of symptoms, inhibit recurrence, and/or enhance or sustain the therapeutic effects.

共通軽鎖の可変領域および定常領域のアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of the variable and constant regions of the common light chain are shown. 共通軽鎖の可変領域の各CDRのアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of each CDR of the common light chain variable region are shown. 生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1およびIGHV5-51によって各々コードされるアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences encoded by the germline V genes IGHV7-4-1 and IGHV5-51, respectively, are shown. PD-1に特異的に結合する抗体（以下、抗PD-1抗体と略記することがある。）の各クローンのVHと、生殖細胞系列型遺伝子IGHV7-4-1およびJH6cとの配列アラインメントを示す。図中、各クローンのアミノ酸配列中の“-”は、対応する生殖細胞系列型遺伝子IGHV7-4-1あるいはJH6cのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸を表わし、アミノ酸の略字が記載されている部分は、同生殖細胞系列型遺伝子のアミノ酸配列と相違するアミノ酸を表わす。The figure shows the sequence alignment of the VH of each clone of an antibody that specifically binds to PD-1 (hereinafter sometimes abbreviated as "anti-PD-1 antibody") with the germline genes IGHV7-4-1 and JH6c. In the figure, a "-" in the amino acid sequence of each clone indicates an amino acid that is identical to the amino acid sequence of the corresponding germline gene IGHV7-4-1 or JH6c, and an amino acid abbreviation indicates an amino acid that differs from the amino acid sequence of the same germline gene. CD19に特異的に結合する抗体（以下、「抗CD19抗体」と略記することがある。）の各クローンのVHと、生殖細胞系列型遺伝子IGHV5-51にコードされるアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。図中の各表記は、図４のものと同じ意味を表わす。The figure shows the alignment of the VH of each clone of an antibody that specifically binds to CD19 (hereinafter sometimes abbreviated as "anti-CD19 antibody") with the amino acid sequence encoded by the germline gene IGHV5-51. Each symbol in the figure has the same meaning as in Figure 4. 抗PD-1抗体各クローンのVHのアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of the VH of each anti-PD-1 antibody clone are shown. 抗PD-1抗体各クローンのVH中の各CDRのアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of each CDR in the VH of each anti-PD-1 antibody clone are shown. 抗CD19抗体各クローンのVHのアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of the VH of each anti-CD19 antibody clone are shown. 抗CD19抗体各クローンのVH中の各CDRのアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of each CDR in the VH of each anti-CD19 antibody clone are shown. PD-1/CD19二重特異性抗体の各重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。The amino acid sequences of the heavy chain constant regions of the PD-1/CD19 bispecific antibody are shown. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンのPD-1およびCD19に対する結合活性を各々確認したBiacore測定結果を示す。1 shows the results of Biacore analysis confirming the binding activity of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone to PD-1 and CD19. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンCD19-1(Bi)～CD19-3(Bi)のCD19に対する結合性を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis was performed to confirm the binding of each of the PD-1/CD19 bispecific antibody clones, CD19-1(Bi) to CD19-3(Bi), to CD19. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンCD19-4(Bi)およびCD19-5(Bi)のCD19に対する結合性を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis was performed to confirm the binding of each of the PD-1/CD19 bispecific antibody clones, CD19-4 (Bi) and CD19-5 (Bi), to CD19. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンCD19-1(Bi)～CD19-3(Bi)のPD-1に対する結合性を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis was performed to confirm the binding of each of the PD-1/CD19 bispecific antibody clones CD19-1(Bi) to CD19-3(Bi) to PD-1. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンCD19-4(Bi)およびCD19-5(Bi)のPD-1に対する結合性を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis was performed to confirm the binding of each of the PD-1/CD19 bispecific antibody clones, CD19-4 (Bi) and CD19-5 (Bi), to PD-1. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンCD19-6(Bi)のPD-1およびCD19各々に対する結合性を確認したフローサイトメトリーを示す。1 shows flow cytometry results confirming the binding of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone CD19-6(Bi) to PD-1 and CD19, respectively. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンのPD-1およびCD19への同時結合性を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone confirms the simultaneous binding to PD-1 and CD19. PD-1/CD19二重特異性抗体各クローンのPD-1/PD-L1相互作用への影響を各々確認したフローサイトメトリーを示す。Flow cytometry analysis of the effect of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone on PD-1/PD-L1 interaction is shown. インビトロにおけるヒトＢ細胞活性化時のIgM産生に対するPD-1/CD19二重特異性抗体各クローンの作用結果を各々示す。なお、図中の「Ctrl」はコントロール群を表わす。The effect of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone on IgM production during in vitro human B cell activation is shown. "Ctrl" in the figure indicates the control group. インビボにおけるヒトＢ細胞活性化時のIgG₂産生に対するPD-1/CD19二重特異性抗体各クローン（CD19－１(Bi)～CD19－４(Bi)）の作用結果を各々示す。なお、図中の「Ctrl」はコントロール群を表わす。The effect of each PD-1/CD19 bispecific antibody clone (CD19-1(Bi) to CD19-4(Bi)) on _IgG2 production during in vivo human B cell activation is shown. "Ctrl" in the figure indicates the control group. インビボにおけるヒトＢ細胞活性化時のIgG₂産生に対するPD-1/CD19二重特異性抗体クローンCD19－５(Bi)およびCD19－６(Bi)の作用結果を各々示す。なお、図中の「Ctrl」はコントロール群を表わす。The effects of the PD-1/CD19 bispecific antibody clones CD19-5 (Bi) and CD19-6 (Bi) on _IgG2 production during in vivo human B cell activation are shown. "Ctrl" in the figure indicates the control group. ヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン産生に対するPD-1/CD3二重特異性抗体クローンCD19－６(Bi)の作用結果を示す。なお、図中の「Medium」はコントロール群を表わす。This figure shows the effect of the PD-1/CD3 bispecific antibody clone CD19-6 (Bi) on cytokine production from human peripheral blood mononuclear cells. "Medium" in the figure represents the control group.

PD-1（Programmed Cell Death-1）は、ヒトにおいては、GenBank登録番号NP_005009で示されるアミノ酸配列から成る膜型タンパク質である。本明細書において「PD-1」と記載される場合、特に限定しない限り、そのすべてのアイソフォーム、および本発明にかかる「PD-1に特異的に結合する第一アーム」のエピトープが保存された、それら改変体をも含むものとして使用される場合がある。本発明において、PD-1として好ましくは、ヒトPD-1である。 PD-1 ( Programmed Cell Death -1 ) is a membrane-bound protein consisting of the amino acid sequence shown in GenBank accession number NP_005009 in humans. Unless otherwise specified, the term "PD-1" used herein may encompass all isoforms and variants thereof that conserve the epitope of the "first arm that specifically binds to PD-1" according to the present invention. In the present invention, human PD-1 is preferred as PD-1.

CD19は、ヒトにおいては、GenBank登録番号NP_001171569あるいはNP_001761で示されるアミノ酸配列から成る、Ｂ細胞に発現する膜タンパク質であり、Ｂ細胞受容体複合体と共にＢ細胞へ刺激を伝える分子である。本明細書において「CD19」と記載される場合、特に限定しない限り、本発明にかかる「CD19に特異的に結合する第二アーム」のエピトープが保存された、それら改変体をも含むものとして使用される場合がある。本発明において、CD19として好ましくはヒトCD19である。 CD19 is a membrane protein expressed in B cells and consists of the amino acid sequence shown in GenBank accession number NP_001171569 or NP_001761 in humans. It is a molecule that transmits stimuli to B cells together with the B cell receptor complex. Unless otherwise specified, when the term "CD19" is used herein, it may also be used to include variants that conserve the epitope of the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention. In the present invention, human CD19 is preferred as CD19.

本明細書において「単離」とは、宿主細胞から抽出された、複数ないし無数の成分が含まれる夾雑物の中から同定、分離および／または精製されることにより、実質的に単一の純粋な成分となることを意味する。 As used herein, "isolated" means extracted from host cells and identified, separated, and/or purified from contaminants, including multiple or numerous components, to provide a substantially single, pure component.

本明細書において「モノクローナル抗体」とは、同一の特定の抗原に対して結合する、実質的に均一である抗体集団から得られた抗体を意味する。 As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies that bind to the same specific antigen.

本明細書において「二重特異性抗体」とは、二つの異なる抗原分子あるいはエピトープに対する結合特異性を一分子に備え持つ抗体を意味し、「二重特異性モノクローナル抗体」とは、さらに、実質的に均一である抗体集団から得られた二重特異性抗体を意味する。 As used herein, the term "bispecific antibody" refers to an antibody that has binding specificities for two different antigen molecules or epitopes in a single molecule, and the term "bispecific monoclonal antibody" further refers to a bispecific antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population.

本発明は、PD-1およびCD19に各々特異的に結合することができる二重特異性抗体（本明細書において、「PD-1/CD19二重特異性抗体」と略記することがある。）に関する。本発明において、PD-1/CD19二重特異性抗体として好ましくは、PD-1/CD19二重特異性モノクローナル抗体であり、より好ましくは、単離PD-1/CD19二重特異性モノクローナル抗体であり、さらに好ましくは、単離ヒトPD-1／ヒトCD19二重特異性モノクローナル抗体である。ここで、「単離ヒトPD-1／ヒトCD19二重特異性モノクローナル抗体」とは、ヒトPD-1とヒトCD19に対する、単離された二重特異性モノクローナル抗体を意味する。 The present invention relates to a bispecific antibody capable of specifically binding to PD-1 and CD19, respectively (sometimes abbreviated herein as a "PD-1/CD19 bispecific antibody"). In the present invention, the PD-1/CD19 bispecific antibody is preferably a PD-1/CD19 bispecific monoclonal antibody, more preferably an isolated PD-1/CD19 bispecific monoclonal antibody, and even more preferably an isolated human PD-1/human CD19 bispecific monoclonal antibody. Here, "isolated human PD-1/human CD19 bispecific monoclonal antibody" refers to an isolated bispecific monoclonal antibody against human PD-1 and human CD19.

ここで、二重特異性抗体の形態には、例えば、ダイアボディ、二重特異性sc(Fv)₂、二重特異性F(ab′)₂、二重特異性ミニボディ、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ(二重特異性DART)、二重特異性(FvCys)₂、二重特異性F(ab′-ジッパー)₂、二重特異性(Fv-ジッパー)₂、二重特異性三鎖抗体および二重特異性mAb²等がある。 Here, examples of bispecific antibody forms include diabodies, bispecific sc(Fv) ₂ , bispecific F(ab′) ₂ , bispecific minibodies, bispecific hybrid antibodies, covalent diabodies (bispecific DARTs), bispecific (FvCys) ₂ , bispecific F(ab′-zipper) ₂ , bispecific (Fv-zipper) 2 , bispecific three-chain antibodies, and bispecific mAb ₂ ^.

ダイアボディとは、異なる抗原を認識するVH、VL同士がペプチドリンカーで連結された一本鎖ペプチドの二量体である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, No.14: p.6444-6448参照）。 Diabodies are single-chain peptide dimers in which VH and VL domains that recognize different antigens are linked by a peptide linker (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), Vol. 90, No. 14: pp. 6444-6448).

二重特異性sc(Fv)₂とは、異なる抗原を認識する２つの抗体の２組のVH／VLがペプチドリンカーを介して連続する一本鎖の形態で産生されるよう改変された低分子化抗体である（J. Biological Chemistry (1994), Vol. 269: p.199-206参照）。 Bispecific sc(Fv) ₂ is a minibody engineered to produce two pairs of VH/VL antibodies that recognize different antigens in the form of a single chain connected via a peptide linker (see J. Biological Chemistry (1994), Vol. 269: pp. 199-206).

二重特異性F(ab′)₂とは、異なる２つの抗原を認識する抗体のFab′断片が、ジスルフィド結合等により共有結合した低分子化抗体である。 Bispecific F(ab') ₂ is a minibody in which Fab' fragments of antibodies that recognize two different antigens are covalently linked via disulfide bonds or the like.

二重特異性ミニボディとは、各々異なる抗原を認識するscFvに抗体の定常領域CH3ドメインが連結されるよう改変された低分子抗体断片を、そのCH3ドメイン上のジスルフィド結合等によって共有結合した低分子化抗体である（Biochemistry (1992), Vo.31, No.6, p.1579-1584参照）。 A bispecific minibody is a minibody in which small antibody fragments, each of which recognizes a different antigen, are covalently linked via disulfide bonds or other means in the CH3 domains of the antibody constant region, with the CH3 domains being modified to link the scFvs. (See Biochemistry (1992), Vol. 31, No. 6, pp. 1579-1584.)

二重特異性ハイブリッド抗体とは、異なる２つの抗原を認識する抗体の重鎖／軽鎖複合体がジスルフィド結合等によって共有結合したインタクトな抗体である。 A bispecific hybrid antibody is an intact antibody in which heavy and light chain complexes of antibodies that recognize two different antigens are covalently linked by disulfide bonds or other means.

本発明において、好ましい二重特異性抗体の形態としては、二重特異性ハイブリッド抗体である。 In the present invention, a preferred form of bispecific antibody is a bispecific hybrid antibody.

二重特異性ハイブリッド抗体は、例えば、ハイブリッドハイブリドーマ法（US4474893参照）で作製されたハイブリドーマから産生させることができる。また、異なる抗原を認識する抗体の重鎖および軽鎖を各々コードする計４種類のcDNAを哺乳動物細胞に共発現ならびに分泌させて製造することができる。 Bispecific hybrid antibodies can be produced, for example, from hybridomas created using the hybrid hybridoma method (see US4474893). They can also be produced by co-expressing and secreting four types of cDNAs in mammalian cells, each encoding the heavy and light chains of antibodies that recognize different antigens.

本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、KohlerおよびMilsteinら， Nature (1975)， Vol. 256, p.495-97、Hongoら, Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, p.253-260、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2)およびHammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p.563-681(Elsevier, N.Y., 1981)参照）、組換えDNA法（例えば、US4816567参照）、ファージディスプレイ方法（例えば、LadnerらのUS5223409、US5403484およびUS5571698、DowerらのUS5427908およびUS5580717、McCaffertyらのUS5969108およびUS6172197ならびにGriffithsらのUS5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915およびUS6593081参照）で作製することができる。 The monoclonal antibodies used in the present invention can be produced by hybridoma methods (e.g., Kohler and Milstein et al., Nature (1975), Vol. 256, pp. 495-97; Hongo et al., Hybridoma (1995), Vol. 14, No. 3, pp. 253-260; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Vol. 2) and Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), recombinant DNA techniques (see, for example, US4,816,567), and phage display methods (see, for example, US5,223,409, US5,403,484, and US5,571,698 to Ladner et al., US5,427,908 and US5,580,717 to Dower et al., US5,969,108 and US6,172,197 to McCafferty et al., and US5,885,793, US6,521,404, US6,544,731, US6,555,313, US6,582,915, and US6,593,081 to Griffiths et al.).

抗体あるいはモノクローナル抗体は、ヒトに投与される場合には、その抗原性を低減あるいは消失させるために、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいは完全ヒト型抗体の形態で作製することができる。 When administered to humans, antibodies or monoclonal antibodies can be produced in the form of chimeric antibodies, humanized antibodies, or fully human antibodies to reduce or eliminate their antigenicity.

「キメラ抗体」は、可変領域配列と定常領域配列が別々の哺乳動物に由来する抗体を意味し、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来するものがある。キメラ抗体は、上記のハイブリドーマ法、組換えDNA法あるいはファージディスプレイ方法で単離された抗体産生ハイブリドーマから、公知の手法により単離された抗体可変領域をコードする遺伝子を、公知の方法を用いて、ヒト由来の抗体定常領域をコードする遺伝子に連結させ、作製することができる（例えば、CabillyらのUS4816567参照）。 A "chimeric antibody" refers to an antibody whose variable region sequences and constant region sequences are derived from different mammals; for example, the variable region sequences may be derived from a mouse antibody and the constant region sequences from a human antibody. Chimeric antibodies can be produced by linking genes encoding antibody variable regions isolated by known techniques from antibody-producing hybridomas isolated by the above-mentioned hybridoma method, recombinant DNA method, or phage display method to genes encoding antibody constant regions derived from humans using known methods (see, for example, US Pat. No. 4,816,567 by Cabilly et al.).

「ヒト化抗体」とは、マウスのような別の哺乳動物の生殖細胞型に由来する相補性決定領域（CDR）配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を意味する。ヒト化抗体の場合も、上記方法で単離された抗体産生ハイブリドーマから、公知の手法により単離された抗体CDR領域をコードする遺伝子を、公知の方法を用いて、ヒト由来の抗体フレームワーク領域をコードする遺伝子に連結させ、作製することができる（例えば、WinterのUS5225539およびUS5530101ならびにQueenらのUS5585089号およびUS6180370参照）。 The term "humanized antibody" refers to an antibody in which complementarity-determining region (CDR) sequences derived from the germline of another mammal, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences. Humanized antibodies can also be produced by linking genes encoding antibody CDR regions isolated by known techniques from antibody-producing hybridomas isolated using the above-described method to genes encoding antibody framework regions of human origin using known methods (see, for example, Winter's US Pat. Nos. 5,225,539 and 5,530,101 and Queen et al.'s US Pat. Nos. 5,585,089 and 6,180,370).

「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」とは、フレームワーク領域およびCDR領域からなる可変領域ならびに定常領域の両方ともにヒト生殖細胞型免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。本発明において使用されるヒト抗体は、ヒト抗体を産生するように形質転換されたマウス、例えば、Humabマウス（例えば、LonbergとKayらによるUS5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299およびUS5770429参照）、KMマウス（例えば、IshidaらのWO2002/43478参照）、Xenoマウス（例えば、US5939598、US6075181、US6114598、US6150584およびUS6162963参照）またはTcマウス（例えば、Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), p.722-727参照）を用いた方法で作製することができる。また、免疫によりヒト抗体応答が起こるように、ヒト免疫細胞を再構築したSCIDマウス（例えば、WilsonらのUS5476996およびUS5698767参照）を用いても調製できる。さらに、本発明において使用されるヒト抗体は、上記したファージディスプレイ方法でも作製することができる。 "Human antibody" or "fully human antibody" means an antibody in which both the variable and constant regions, consisting of framework and CDR regions, are derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibody used in the present invention can be produced from a mouse transformed to produce a human antibody, such as a Humab mouse (see, e.g., US5545806, US5569825, US5625126, US5633425, US5789650, US5877397, US5661016, US5814318, US5874299, and US5770429 by Lonberg and Kay et al.), a KM mouse (see, e.g., WO2002/43478 by Ishida et al.), a Xeno mouse (see, e.g., US5939598, US6075181, US6114598, US6150584, and US6162963), or a Tc mouse (see, e.g., Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), Human antibodies can be produced by methods using SCID mice (see pp. 722-727). Alternatively, SCID mice in which human immune cells have been reconstituted (see, for example, Wilson et al., US Pat. No. 5,476,996 and US Pat. No. 5,698,767) can be used to generate a human antibody response upon immunization. Furthermore, human antibodies used in the present invention can also be produced by the phage display method described above.

本明細書において、PD-1/CD19二重特異性抗体の「抗体断片」とは、全長抗体の一部であって、PD-1に対する抗原結合部分およびCD19に対する抗原結合部分を有する抗体であり、例えば、F(ab′)₂などが挙げられる。ここで、抗原結合部分とは、抗体がその抗原に結合することができる最少単位を意味し、例えば、VHおよびVLにある各々３つずつのCDRとそれらCDRの組合せにより目的の抗原が認識できるようCDRを配置するフレームワーク領域から構成される。 As used herein, the term "antibody fragment" of a PD-1/CD19 bispecific antibody refers to a portion of a full-length antibody that comprises an antigen-binding portion for PD-1 and an antigen-binding portion for CD19, such as F(ab') ₂ . Here, the antigen-binding portion refers to the smallest unit of an antibody capable of binding to its antigen, and is composed, for example, of three CDRs each in VH and VL, and framework regions that position the CDRs so that the combination of these CDRs recognizes the antigen of interest.

本明細書において、「共通軽鎖」とは、異なる２種以上の重鎖と会合し、各々の抗原に対して結合能を示し得る軽鎖を意味する(De Wildt RMら、J. Mol. Biol. (1999), Vol. 285, p.895-901、De Kruifら、J. Mol. Biol. (2009), Vol. 387, p.548-58、WO2004/009618、WO2009/157771およびWO2014/051433参照)。そのような共通軽鎖として好ましくは、例えば、ヒトκ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01（IMGTデータベースによる命名法）生殖細胞系列型遺伝子によりコードされる軽鎖（以下、IGVK1-39/JK1共通軽鎖と略記することがある。）であり、より好ましくは、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有する当該軽鎖、さらに好ましくは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する当該軽鎖である。また、共通軽鎖の定常領域として好ましくは、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域が挙げられる。本発明において使用される共通軽鎖の可変領域および定常領域の各々アミノ酸配列を図１に示し、その可変領域の各CDRのアミノ酸配列を図２に示す。 As used herein, the term "common light chain" refers to a light chain that can associate with two or more different heavy chains and exhibit binding ability to each of their antigens (see De Wildt RM et al., J. Mol. Biol. (1999), Vol. 285, pp. 895-901; De Kruif et al., J. Mol. Biol. (2009), Vol. 387, pp. 548-58; WO2004/009618; WO2009/157771; and WO2014/051433). A preferred example of such a common light chain is a light chain encoded by the germline gene of the human κ light chain IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (nomenclature according to the IMGT database) (hereinafter, sometimes abbreviated as IGVK1-39/JK1 common light chain). More preferred is a light chain having a VL comprising a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and even more preferred is a light chain having a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. A preferred example of the constant region of the common light chain is a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. The amino acid sequences of the variable and constant regions of the common light chain used in the present invention are shown in Figure 1, and the amino acid sequences of each CDR of the variable region are shown in Figure 2.

本明細書において「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG）を称するものとして使用される。本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましいアイソタイプはIgGであり、より好ましくはIgG₁またはIgG₄である。ここで、IgG₁としては、Fc受容体への結合が消失あるいは減弱したものが好ましい。具体的には、その重鎖定常領域の任意のアミノ酸を置換、欠損あるいは挿入することによって、Fc受容体への結合が消失あるいは減弱されたIgG₁抗体を得ることができる。例えば、二重特異性抗体の各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、EUナンバリングシステムによる235番目のロイシンがグリシンに置換され、および／または236番目のグリシンがアルギニンに置換された抗体が挙げられる。また、抗体の不均一性を低減させるために、Ｃ末端のアミノ酸、例えば、EUナンバリングシステムによる447番目のリシンを欠損した抗体が好ましい。さらに、二重特異性抗体がIgG₄である場合、抗体分子内におけるスワッピングを抑制するように、その重鎖定常領域の任意のアミノ酸が置換、欠損あるいは挿入した改変体がより好ましい。例えば、ヒンジ領域に位置する、ＥＵナンバリングシステムによる228番目のセリンをプロリンに置換した抗体が好ましい。なお、本明細書において、抗体の可変領域のCDRとフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置はKabatナンバリングシステムにしたがって規定される場合がある（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987)および(1991)参照）。また、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたＥＵナンバリングシステム（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242参照）に従って表わされる。 As used herein, the term "isotype" refers to the antibody class (e.g., IgM or IgG) encoded by the heavy chain constant region gene. The preferred isotype for the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention is IgG, more preferably _IgG1 or _IgG4 . Here, _IgG1 antibodies with eliminated or weakened Fc receptor binding are preferred. Specifically, IgG1 antibodies with eliminated or weakened Fc receptor binding can be obtained by substituting, deleting, or inserting any amino acid in the heavy chain constant region. Examples of such antibodies include those in which leucine at position ₂₃₅ (EU numbering system) is substituted with glycine and/or glycine at position 236 (EU numbering system) is substituted with arginine in each of the two heavy chain constant regions or hinge regions of the bispecific antibody. Furthermore, to reduce antibody heterogeneity, antibodies lacking the C-terminal amino acid, such as lysine at position 447 (EU numbering system), are preferred. Furthermore, when the bispecific antibody is _IgG4 , variants in which any amino acid in the heavy chain constant region has been substituted, deleted, or inserted are more preferred to suppress swapping within the antibody molecule. For example, antibodies in which serine at position 228 according to the EU numbering system, located in the hinge region, has been substituted with proline are preferred. Note that, herein, the amino acid positions assigned to the CDRs and frameworks of antibody variable regions may be defined according to the Kabat numbering system (see Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., (1987) and (1991)) and the amino acids in the constant region are represented according to the EU numbering system based on Kabat amino acid positions (see Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242).

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体のFc領域は、二つの異なる重鎖が会合し易いように、その領域の任意のアミノ酸が置換されていてもよい。好ましい態様としては、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖上の定常領域のＥＵナンバリングシステムによる351番目のロイシンがリシンに置換され、かつ366番目のスレオニンがリシンに置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換されたPD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。また、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖における定常領域中のEUナンバリングシステムによる351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンがリシンに置換され、かつ366番目のスレオニンがリシンに置換されたPD-1/CD19二重特異性抗体も挙げられる。 The Fc region of a PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention may have any amino acid substitution in that region to facilitate association of the two different heavy chains. A preferred embodiment includes, for example, a PD-1/CD19 bispecific antibody in which the leucine at position 351 according to the EU numbering system is substituted with lysine and the threonine at position 366 is substituted with lysine in the constant region of a heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1, and the leucine at position 351 is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 is substituted with glutamic acid in the constant region of a heavy chain having a VH of a second arm that specifically binds to CD19. Also included are PD-1/CD19 bispecific antibodies in which the leucine at position 351 (EU numbering system) is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 is substituted with glutamic acid in the constant region of a heavy chain having a VH in a first arm that specifically binds to PD-1, and the leucine at position 351 is substituted with lysine and the threonine at position 366 is substituted with lysine in the constant region of a heavy chain having a VH in a second arm that specifically binds to CD19.

PD-1に特異的に結合する第一アーム
本明細書において、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」（以下、「第一アーム」と略記することがある。）は、抗体あるいは抗体断片の一部に含まれるか、あるいは一部ではなく、それ自体単体として存在するか否かにかかわらず、少なくとも、PD-1に特異的に結合する抗体のVHを含み、かつPD-1に特異的に結合することができる抗体部分を意味し、例えば、このような第一アームは、抗PD-1抗体のVHおよび当該抗PD-1抗体を構成する共通軽鎖のVLからなり、さらに、第一アームには、当該VHおよびVLを含む抗体のFab部も含まれる。ここで、「PD-1に特異的に結合する」とは、少なくとも、1x10^-5M、好ましくは1x10^-7M、より好ましくは1x10^-9Mより高い親和性（解離定数（Kd値））を有する結合活性でPD-1に対して直接結合することができ、少なくとも、CD28、CTLA-4およびICOSなどの、所謂、CD28ファミリー受容体に属するほかの受容体メンバーには実質的に結合しない特徴として使用される。また、「PD-1に特異的に結合する抗体」あるいは「抗PD-1抗体」における「抗体」とは、全長抗体、すなわち、ジスルフィド結合で連結された２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長の抗体を意味するが、好ましくは、そのモノクローナル抗体である。 First Arm That Specifically Binds to PD-1 : As used herein, a "first arm that specifically binds to PD-1" (hereinafter sometimes abbreviated as "first arm") refers to an antibody portion that comprises at least the VH of an antibody that specifically binds to PD-1 and is capable of specifically binding to PD-1, regardless of whether it is contained in a portion of an antibody or antibody fragment or whether it exists as a standalone entity rather than as a portion of the antibody or antibody fragment. For example, such a first arm comprises the VH of an anti-PD-1 antibody and the VL of the common light chain that constitutes the anti-PD-1 antibody, and further includes the Fab portion of an antibody comprising the VH and VL. Herein, the term "specifically binds to PD-1" refers to the ability to directly bind to PD-1 with a binding activity having an affinity (dissociation constant (Kd value)) of at least 1 x ¹⁰ M, preferably 1 ^x ¹⁰ M, and more preferably 1 x 10 M, and does not substantially bind to at least other receptor members belonging to the so-called CD28 family of receptors, such as CD28, CTLA-4, and ICOS. Furthermore, the "antibody" in "antibody that specifically binds to PD-1" or "anti-PD-1 antibody" refers to a full-length antibody, i.e., a full-length antibody consisting of two heavy chains and two light chains linked by disulfide bonds, preferably a monoclonal antibody.

ここで、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」としては、例えば、（ａ）ＨＹＪ^１ＬＨで表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｊ^１は、Ｇ（グリシン）またはＡ（アラニン）を表わし、その他のアルファベットは、各々アミノ酸の一文字略号を表わす。］からなるVH-CDR1、（ｂ）ＷＪ^２ＮＴＮＴＵ^２ＮＰＴＸ^２ＡＱＧＦＴＧで表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｊ^２は、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）を表わし、Ｕ^２は、Ｅ（グルタミン酸）またはＧ（グリシン）を表わし、Ｘ^２は、Ｆ（フェニルアラニン）またはＹ（チロシン）を表わし、その他のアルファベットは、各々上記と同じ意味を表わす。］からなるVH-CDR2、ならびに（ｃ）ＧＤＪ^３ＶＶＰＴＴＩＷＮＹＹＵ^３Ｘ^３ＭＺ^３Ｖで表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｊ^３は、Ｍ（メチオニン）またはＬ（ロイシン）を表わし、Ｕ^３は、Ｈ（ヒスチジン）またはＹ（チロシン）を表わし、Ｘ^３は、Ｆ（フェニルアラニン）またはＹ（チロシン）を表わし、Ｚ^３は、Ｄ（アスパラギン酸）またはＥ（グルタミン酸）を表わし、その他のアルファベットは、各々上記と同じ意味を表わす。］からなるVH-CDR3を有するVHを有するものが挙げられる。 Here, examples of a "first arm that specifically binds to PD-1" include: (a) a VH-CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by ^HYJ1LH (in the sequence, ^J1 represents G (glycine) or A (alanine), and the other letters represent the single-letter abbreviations for each amino acid); (b) an amino acid sequence represented by ^{WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG} (in the sequence, ^J2 represents L (leucine) or ^I (isoleucine), ^U2 represents E (glutamic ^acid ) or G (glycine), ^X2 represents F (phenylalanine) or Y (tyrosine), and the other letters have the same meanings as above). and (c) a VH having a VH-CDR3 consisting of an amino ^acid sequence represented ^by ^{GDJ3VVPTTIWNYYYU3X3MZ3V} (wherein ^J3 represents M (methionine) or L (leucine), ^U3 represents ^H (histidine) or Y (tyrosine), ^X3 represents F (phenylalanine) or Y (tyrosine), ^Z3 represents D (aspartic acid) or E (glutamic acid), and the other letters have the same meanings as above).

また、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」の別の態様としては、例えば、
（1b）配列番号６のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号７のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号８のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（2b）配列番号９のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号１０のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号１１のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（3b）配列番号１２のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号１３のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号１４のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（4b）配列番号１５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号１６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号１７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、ならびに
（5b）配列番号１８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号１９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号２０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVHから選択される何れか一つのVHを有するものが挙げられる。 Furthermore, other embodiments of the "first arm that specifically binds to PD-1" include, for example,
(1b) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;
(2b) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
(3b) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(4b) VH comprising VH-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, VH-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and VH-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and (5b) VH comprising VH-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, VH-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and VH-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

さらに、本発明における、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」には、上記（1b）～（5b）から選択される何れか一つのVHにおける各々のVH-CDRにおいて、その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、かつ、当該アミノ酸に置換されていない元の第一アームによるPD-1への結合活性と実質的に同等の結合活性を有するものも含まれる。例えば、VH-CDR1の場合には、１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、VH-CDR2またはVH-CDR3の場合には、各々１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換されたものが挙げられる。また、図４に示されるように、PD-1に特異的に結合する第一アームに各々対応する抗PD-1抗体クローンの各CDRにおいて、各クローン間で相違する各アミノ酸またはそれらの任意の複数の組み合わせは当該クローン間において相互に置換可能である。ここで、保存的アミノ酸による置換は、類似する側鎖を有する残基の可換性を意味し、例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群においては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群においては、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群においては、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群においては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群においては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群においては、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸による置換の例としては、バリン、ロイシンおよびイソロイシン間での置換、フェニルアラニンおよびチロシン間での置換、リシンおよびアルギニン間での置換、アラニンおよびバリン間での置換ならびにアスパラギンおよびグルタミン間での置換が挙げられる。また、ここで、上記の「当該アミノ酸に置換されていない元の第一アームによるPD-1への結合活性と実質的に同等の結合活性を有する」とは、当該アミノ酸に置換された第一アームのPD-1への結合活性が、当該アミノ酸に置換されていない元の第一アームの結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。 Furthermore, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention also includes a first arm in which any one to five amino acid residues in each VH-CDR of any one of VHs selected from (1b) to (5b) above have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and which has substantially the same binding activity to PD-1 as the original first arm without the amino acid substitutions. For example, in the case of VH-CDR1, one amino acid residue has been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and in the case of VH-CDR2 or VH-CDR3, one to five amino acid residues have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids). Furthermore, as shown in Figure 4, in each CDR of anti-PD-1 antibody clones corresponding to the first arm that specifically binds to PD-1, each amino acid that differs between clones, or any combination of amino acids thereof, can be mutually substituted between the clones. Here, conservative amino acid substitution refers to the replacement of residues with similar side chains, such as glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine in the group of amino acids with aliphatic side chains, serine and threonine in the group of amino acids with aliphatic hydroxyl side chains, asparagine and glutamine in the group of amino acids with amide-containing side chains, phenylalanine, tyrosine and tryptophan in the group of amino acids with aromatic side chains, lysine, arginine and histidine in the group of amino acids with basic side chains, and cysteine and methionine in the group of amino acids with sulfur-containing side chains.Preferred examples of conservative amino acid substitution include the substitution between valine, leucine and isoleucine, the substitution between phenylalanine and tyrosine, the substitution between lysine and arginine, the substitution between alanine and valine, and the substitution between asparagine and glutamine. Furthermore, the phrase "having binding activity to PD-1 substantially equivalent to that of the original first arm not substituted with the amino acid" means that the binding activity of the first arm substituted with the amino acid to PD-1 is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of the original first arm not substituted with the amino acid.

さらに、本発明における「PD-1に特異的に結合する第一アーム」には、そのVHにおいて、上述の特定のアミノ酸配列を有する各VH-CDRを含み、そのVHのフレームワークのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれる。例えば、上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHは、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子がIGHV7-4-1であって、生殖細胞系列型Ｊ遺伝子がJH6cであるVDJ組換遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされ得る。ここで、生殖細胞系列型のＶ遺伝子IGHV7-4-1によって各々コードされるアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸配列に対応する（図３）。 Furthermore, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention also includes a VH that comprises VH-CDRs with the specific amino acid sequences described above, and the amino acid sequence of the framework of the VH is encoded by a specific germline gene or a somatically mutated version of that gene. For example, a VH selected from (1b) to (5b) above can be encoded by a VDJ recombined gene in which the germline V gene is IGHV7-4-1 and the germline J gene is JH6c, or a somatically mutated version of that gene. Here, the amino acid sequence encoded by the germline V gene IGHV7-4-1 corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (Figure 3).

本発明のPD-1に特異的に結合する第一アームのVHのフレームワークは、生殖細胞系列型のＶＤＪ組換遺伝子が体細胞突然変異を受けた当該遺伝子によってコードされる場合がある。例えば、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子がIGHV7-4-1である、上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHのFR1、FR2、FR3は、図４に示すアミノ酸位置において、IGHV7-4-1遺伝子がコードするアミノ酸配列と相違するため、当該各位置において体細胞突然変異を受けている。例えば、FR1については、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置１３のリシンがグルタミンに、位置１６のアラニンがバリンに、または位置１９のリシンがメチオニンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されていてもよい。FR2については、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置３７のバリンがロイシンに置換されてもよい。FR3については、配列番号２１のアミノ酸配列中の位置７７のセリンがスレオニンに、位置８４のシステインがセリンもしくはアスパラギンに各々置換されるか、あるいは任意の複数の組み合わせで置換されてもよい。また、上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHのFR4については、Ｊ遺伝子JH6cに由来するFR4のアミノ酸配列（Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser）（配列番号４１）中のリシン（Lys）がグルタミンもしくはアスパラギンに、および／または＊印のスレオニン（Thr）がロイシンに置換されていてもよい。上記何れかのアミノ酸置換の組み合わせを有する各々FR1、FR2、FR3およびFR4も、PD-1に特異的に結合する第一アームの機能に実質的な影響を与えず、フレームワークとして使用することができる。 The framework of the VH of the first arm of the present invention that specifically binds to PD-1 may be encoded by a germline VDJ recombined gene that has undergone somatic mutation. For example, when the germline V gene is IGHV7-4-1, FR1, FR2, and FR3 of the VH shown in any of (1b) to (5b) above differ from the amino acid sequence encoded by the IGHV7-4-1 gene at the amino acid positions shown in Figure 4 and therefore have undergone somatic mutation at those positions. For example, in FR1, the lysine at position 13 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 may be substituted with glutamine, the alanine at position 16 with valine, or the lysine at position 19 with methionine, or any combination thereof. In FR2, the valine at position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 may be substituted with leucine. In FR3, the serine at position 77 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 may be substituted with threonine, and the cysteine at position 84 may be substituted with serine or asparagine, or any combination of these substitutions may be used. Furthermore, in FR4 of a VH represented by any of (1b) to (5b) above, the lysine (Lys) in the amino acid sequence of FR4 derived from the J gene JH6c (Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser) (SEQ ID NO: 41) may be substituted with glutamine or asparagine, and/or the threonine (Thr) marked with an asterisk (*) may be substituted with leucine. FR1, FR2, FR3, and FR4 each having any of the above combinations of amino acid substitutions can also be used as a framework without substantially affecting the function of the first arm to specifically bind to PD-1.

さらに、本発明における「PD-1に特異的に結合する第一アーム」には、上述の特定のアミノ酸配列を有する各CDRを含み、かつ、そのVHのFRのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるものも含まれる。例えば、そのような第一アームとして、配列番号１～５から選択されるアミノ酸配列からなるVHを有するものが挙げられる。 Furthermore, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention also includes those that contain CDRs with the specific amino acid sequences described above, and whose VH FR amino acid sequences are encoded by a specific germline gene or a gene that has undergone somatic mutation. For example, such a first arm may have a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5.

さらに、そのような「PD-1に特異的に結合する第一アーム」には、例えば、配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり、好ましくは少なくとも90％同一であり、より好ましくは少なくとも95％同一であり、さらに好ましくは少なくとも98％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも99％同一であるアミノ酸配列からなるVHを有し、かつ、元の第一アームのVHのアミノ酸配列との相違がPD-1への結合活性に実質的に影響しないもの（以下、相同第一アームと略記することがある。）も含まれる。ここで、アミノ酸配列に関する同一性の比較において使用される「％同一」とは、２つの配列を整列させ、参照するアミノ酸配列（ここで、最大のパーセントの同一性を達成するために必要な場合には、ギャップを導入した後の参照するアミノ酸配列）と同一であるアミノ酸配列の百分率と定義される。また、ここで、「元の第一アームのVHのアミノ酸配列との相違がPD-1への結合活性に実質的に影響しない」とは、相同第一アームのPD-1への結合活性が元の第一アームの当該結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。 Furthermore, such a "first arm that specifically binds to PD-1" also includes, for example, one having a VH consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical, preferably at least 90% identical, more preferably at least 95% identical, even more preferably at least 98% identical, and even more preferably at least 99% identical to any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, and in which differences from the amino acid sequence of the VH of the original first arm do not substantially affect the binding activity to PD-1 (hereinafter, sometimes abbreviated as a "homologous first arm"). Herein, "% identical" when used in comparing amino acid sequence identity is defined as the percentage of amino acid sequence that is identical to a reference amino acid sequence (wherein the reference amino acid sequence is the reference amino acid sequence after aligning the two sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent identity). Furthermore, herein, "the difference from the amino acid sequence of the VH of the original first arm does not substantially affect the binding activity to PD-1" means that the binding activity of the homologous first arm to PD-1 is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of the original first arm.

さらに別の態様において、本発明における「PD-1に特異的に結合する第一アーム」には、（１）上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHあるいは配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび本明細書における共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有する第一アームのPD-1への結合または（２）当該VHおよびVLからなるPD-1に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域のPD-1への結合に交差競合する抗PD-1抗体の可変領域（ここで、当該可変領域は、それを構成するVHおよびVLを含む。）を有するものも含まれ、また、そのPD-1への結合が、（３）上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHあるいは配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有する第一アームまたは（４）当該VHおよびVLからなるPD-1に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域により交差競合される抗PD-1抗体の可変領域を有するものも含まれる。ここで、「PD-1への結合に交差競合する」とは、本明細書において例示された第一アームと同一のあるいは一部重複するエピトープに結合することによって、当該第一アームのPD-1への結合をその程度に関わらず阻害する、あるいは当該例示された第一アームと同一のあるいは一部重複するエピトープに結合する抗体によるPD-1への結合が、当該例示された第一アームによってその程度に関わらず阻害されることを意味し、交差競合するかどうかは競合結合アッセイによって評価することができる。例えば、ビアコア分析、ELISAアッセイ、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光エネルギー転移測定法（FRET）や蛍光微量測定技術（FMAT（登録商標））を用いて判断することができる。 In yet another embodiment, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention includes (1) a first arm that has a VH selected from any of (1b) to (5b) above or a VH consisting of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5 and a VL of the common light chain described herein (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25), and (2) an anti-PD-1 antibody that cross-competes with the binding to PD-1 of the variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to PD-1 and that is composed of the VH and VL. The present invention also includes antibodies having the variable region of the D-1 antibody (wherein the variable region includes the VH and VL that constitute it), and antibodies having the variable region of an anti-PD-1 antibody whose binding to PD-1 cross-competes with (3) a first arm having a VH selected from (1b) to (5b) above or a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5 and the VL of the common light chain, or (4) a variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to PD-1 and comprises the VH and VL. Here, "cross-competes for binding to PD-1" means that the binding of the first arm to PD-1 is inhibited, regardless of the extent, by binding to the same or a partially overlapping epitope as the first arm exemplified herein, or that the binding of an antibody to PD-1 that binds to the same or a partially overlapping epitope as the first arm exemplified herein is inhibited, regardless of the extent, by the first arm exemplified herein. Whether or not cross-competition occurs can be assessed by competitive binding assays. For example, this can be determined using Biacore analysis, ELISA assays, flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence energy transfer assay (FRET), or fluorescence micrometric assay technology (FMAT®).

例えば、上記（5b）に示されるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有する第一アームによるPD-1への結合に交差競合するものとして、例えば、上記（1b）～（4b）から選択される何れかで示されるVHおよび当該共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を有するVL）を有する第一アーム、さらには、配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有する第一アームが挙げられる。 For example, examples of antibodies that cross-compete for binding to PD-1 by a first arm having a VH shown in (5b) above and a VL of the common light chain include a first arm having a VH selected from (1b) to (4b) above and a VL of the common light chain (preferably a VL having a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28), and a first arm having a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 and a VL of the common light chain (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25).

また、例えば、上記（1b）～（4b）から選択される何れかで示されるVHあるいは配列番号１～４から選択されるアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有する第一アームによるPD-1への結合に交差競合するものとして、例えば、上記（5b）に示されるVHおよび当該共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を有するVL）を有する第一アーム、さらには、配列番号５のアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有する第一アームが挙げられる。 Furthermore, examples of antibodies that cross-compete with the binding to PD-1 of a first arm having a VH selected from (1b) to (4b) above or a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 and a VL of the common light chain include a first arm having a VH shown in (5b) above and a VL of the common light chain (preferably a VL having a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28), and a first arm having a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a VL of the common light chain (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25).

ここで、本発明における「PD-1に特異的に結合する第一アーム」として好ましくは、上記（1b）～（5b）で示されるVHを有する第一アームが挙げられ、さらに、この好ましい第一アームには、上述したように、そのVHの各CDRにおいて、その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、かつ、そのアミノ酸置換がPD-1への結合活性に実質的に影響しないものも含まれ、また、さらに、上述したように、VHのフレームワークのアミノ酸配列が、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV7-4-1もしくは同Ｊ遺伝子JH6cまたはそれらの体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれる。そして、当該第一アームとしてより好ましくは、配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有するものが挙げられる。 Preferably, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention is a first arm having a VH as shown in (1b) to (5b) above. Furthermore, as described above, this preferred first arm also includes one in which any one to five amino acid residues in each CDR of the VH have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and the amino acid substitutions do not substantially affect the binding activity to PD-1. Furthermore, as described above, this preferred first arm also includes one in which the amino acid sequence of the VH framework has a VH encoded by the germline V gene IGHV7-4-1 or the J gene JH6c, or a gene somatically mutated version of either. More preferably, this first arm includes one having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5.

さらに、本発明における「PD-1に特異的に結合する第一アーム」は、本明細書における共通軽鎖のVLを含むものが好ましく、そのような共通軽鎖として好ましくは、例えば、IGVK1-39/JK1共通軽鎖であり、より好ましくは、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有する軽鎖であり、さらに好ましくは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する軽鎖である。また、共通軽鎖の定常領域として好ましくは、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域が挙げられる。 Furthermore, the "first arm that specifically binds to PD-1" of the present invention preferably comprises a VL of the common light chain described herein. A preferred example of such a common light chain is the IGVK1-39/JK1 common light chain, more preferably a light chain having a VL comprising a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and even more preferably a light chain having a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. Furthermore, a preferred example of the constant region of the common light chain is a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

また、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」は、PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を許容するものがより好ましい。ここで、「PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を許容する」とは、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体が可溶型PD-L1またはPD-L2の濃度の20倍過剰に存在する状況下においても、当該PD-L1とPD-1との相互作用、当該ＰＤ－Ｌ２とPD-1との相互作用、またはそれら両相互作用が、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体が存在しない時の当該相互作用に比べて50％以上維持され、好ましくは70％以上維持され、より好ましくは80％以上維持されることを意味する。また、「PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を許容する」という定義は、「PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を実質的に阻害しない」という意味と同義で使用されることがある。 Furthermore, it is more preferable that the "first arm that specifically binds to PD-1" allows for an interaction between PD-1 and PD-L1, an interaction between PD-1 and PD-L2, or both of these interactions. Here, "allowing for an interaction between PD-1 and PD-L1, an interaction between PD-1 and PD-L2, or both of these interactions" means that, even in the presence of a PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention at a concentration 20-fold excess over soluble PD-L1 or PD-L2, the interaction between the PD-L1 and PD-1, the interaction between the PD-L2 and PD-1, or both of these interactions, is maintained at 50% or more, preferably 70% or more, and more preferably 80% or more of the level of the interaction in the absence of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention. Additionally, the definition "allowing interaction with PD-1 and PD-L1, interaction with PD-1 and PD-L2, or both of these interactions" is sometimes used synonymously with the meaning "not substantially inhibiting interaction with PD-1 and PD-L1, interaction with PD-1 and PD-L2, or both of these interactions."

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体を構築するために取得された抗PD-1モノクローナル抗体の各クローンと、それらのVHのアミノ酸配列およびその配列番号との対応関係を図６に、ならびに当該抗PD-1モノクローナル抗体の各クローンのVH中の各CDRのアミノ酸配列とその配列番号との対応関係を図７に示す。 Figure 6 shows the anti-PD-1 monoclonal antibody clones obtained to construct the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention, along with the amino acid sequences of their VHs and their corresponding SEQ ID NOs. Figure 7 also shows the amino acid sequences of each CDR in the VH of each anti-PD-1 monoclonal antibody clone and their corresponding SEQ ID NOs.

CD19に特異的に結合する第二アーム
本明細書において、「CD19に特異的に結合する第二アーム」（以下、「第二アーム」と略記することがある。）とは、抗体あるいは抗体断片の一部に含まれるか、あるいは一部ではなく、それ自体単体として存在するか否かにかかわらず、少なくとも、CD19に特異的に結合する抗体のVHを含み、かつCD19に特異的に結合することができる抗体部分を意味し、例えば、そのような第二アームは、抗CD19抗体のVHおよび当該抗CD19抗体を構成する共通軽鎖のVLからなり、さらに、第二アームには、当該VHおよびVLを含む抗体のFab部も含まれる。ここで、「CD19に特異的に結合する」とは、少なくとも、1x10^-5M、好ましくは1x10^-7M、より好ましくは1x10^-9Mより高い親和性（解離定数（Kd値））を有する結合活性でCD19に対して直接結合することができ、他のタンパク質には実質的に結合しない特徴として使用される。また、「CD19に特異的に結合する抗体」あるいは「抗CD19抗体」における「抗体」とは、全長抗体、すなわち、ジスルフィド結合で連結された２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長の抗体を意味するが、好ましくは、そのモノクローナル抗体である。 Second Arm That Binds Specifically to CD19 : Herein, a "second arm that binds specifically to CD19" (hereinafter sometimes abbreviated as "second arm") refers to an antibody portion that contains at least the VH of an antibody that specifically binds to CD19 and is capable of specifically binding to CD19, regardless of whether it is contained in a portion of an antibody or antibody fragment or whether it exists as a standalone entity rather than as a portion of the antibody or antibody fragment. For example, such a second arm consists of the VH of an anti-CD19 antibody and the VL of the common light chain that constitutes the anti-CD19 antibody, and further includes the Fab portion of an antibody comprising the VH and VL. Herein, "specifically binds to CD19" is used to refer to the ability to directly bind to CD19 with a binding activity having an affinity (dissociation constant (Kd value)) of at least 1 x ¹⁰ M, preferably 1 x ¹⁰ M, and more preferably 1 x ¹⁰ M, and to substantially not bind to other proteins. Furthermore, the "antibody" in "antibody that specifically binds to CD19" or "anti-CD19 antibody" refers to a full-length antibody, i.e., a full-length antibody consisting of two heavy chains and two light chains linked by disulfide bonds, preferably a monoclonal antibody.

ここで、「CD19に特異的に結合する第二アーム」としては、例えば、（ａ）ＳＹＷＩＪ^４で表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｊ^４は、Ｇ（グリシン）またはＡ（アラニン）を表わし、その他のアルファベットは、各々アミノ酸の一文字略号を表わす。］からなるVH-CDR1、（ｂ）ＩＩＵ^４ＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧで表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｕ^４は、Ｗ（トリプトファン）またはＹ（チロシン）を表わし、その他のアルファベットは、各々上記と同じ意味を表わす。］からなるVH-CDR2、および（ｃ）Ｘ^４ＴＩＶＺ^４Ｊ^５Ｕ^５Ｘ^５Ｚ^５ＡＪ^６ＤＵ^６で表わされるアミノ酸配列［配列中、Ｘ^４は、Ｋ（リシン）、Ｑ（グルタミン）、Ｈ（ヒスチジン）もしくはＲ（アルギニン）を表わし、Ｚ^４は、Ｇ（グリシン）もしくはＡ（アラニン）を表わし、Ｊ^５は、Ｔ（スレオニン）もしくはＶ（バリン）を表わし、Ｕ^５は、Ｖ（バリン）、Ｉ（イソロイシン）もしくはＴ（スレオニン）を表わし、Ｘ^５は、Ｍ（メチオニン）、Ｙ（チロシン）、Ｇ（グリシン）もしくはＨ（ヒスチジン）を表わし、Ｚ^５は、Ｔ（スレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｌ（ロイシン）もしくはＷ（トリプトファン）を表わし、Ｊ^６は、Ｆ（フェニルアラニン）もしくはＳ（セリン）を表わし、Ｕ^６は、Ｉ（イソロイシン）、Ｆ（フェニルアラニン）もしくはＹ（チロシン）を表わし、その他のアルファベットは、各々上記と同じ意味を表わす。］からなるVH-CDR3を有するVHを有するものが挙げられる。 Here, examples of the "second arm that specifically binds to CD19" include: (a) a VH-CDR1 consisting of an amino acid sequence represented by ^SYWIJ4 (in the sequence, ^J4 represents G (glycine) or A (alanine), and the other letters represent the single-letter abbreviations for each amino acid); (b) an amino acid sequence represented by ^{IIU4PGDSDTRYSPSFQG} (in the sequence, ^U4 represents W (tryptophan) or Y (tyrosine), and the other letters have the same meanings as above); and (c) an amino acid sequence represented by X ⁴ TIVZ ⁴ J ⁵ U ⁵ X ⁵ Z ⁵ AJ ⁶ DU ⁶ (in the sequence, X ⁴ represents K (lysine), Q (glutamine), H (histidine), or R (arginine), Z ⁴ represents G (glycine) or A (alanine), J ⁵ represents T (threonine) or V (valine), U ⁵ represents V (valine), I (isoleucine), or T (threonine), X ⁵ represents M (methionine), Y (tyrosine), G (glycine), or H (histidine), Z ⁵ represents T (threonine), N (asparagine), L (leucine), or W (tryptophan), and J 5 represents wherein ^U6 represents F (phenylalanine) or S (serine), ^U6 represents I (isoleucine), F (phenylalanine), or Y (tyrosine), and the other letters have the same meanings as above.

また、「CD19に特異的に結合する第二アーム」の別の態様としては、例えば、
（1d）配列番号３５のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号３６のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号３７のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（2d）配列番号３８のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号３９のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号４０のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（3d）配列番号４１のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号４２のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号４３のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、
（4d）配列番号４４のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号４５のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号４６のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVH、ならびに
（5d）配列番号４７のアミノ酸配列からなるVH-CDR1、配列番号４８のアミノ酸配列からなるVH-CDR2および配列番号４９のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含むVHから選択される何れか一つのVHを有するものが挙げられる。 Furthermore, other embodiments of the "second arm that specifically binds to CD19" include, for example,
(1d) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;
(2d) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(3d) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
(4d) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and (5d) VH comprising VH-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, VH-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and VH-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.

さらに、本発明における、「CD19に特異的に結合する第二アーム」には、上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHにおける各々のVH-CDRにおいて、その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、かつ、当該アミノ酸に置換されていない元の第二アームによるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有するものも含まれる。例えば、VH-CDR1の場合には、１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、VH-CDR2またはVH-CDR3の場合には、各々１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換されたものが挙げられる。また、図５に示されるように、CD19に特異的に結合する第二アームに各々対応する抗CD19抗体クローンの各CDRにおいて、各クローン間で相違する各アミノ酸またはそれらの任意の複数の組み合わせは、当該クローン間において相互に置換可能である。ここで、「当該アミノ酸に置換されていない元の第二アームによるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有する」とは、当該アミノ酸置換された第二アームのCD19への結合活性が、当該アミノ酸に置換されていない元の第二アームの結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。なお、第二アームの各VH-CDRにおける「保存的アミノ酸による置換」には、例えば、上述の第一アームにおけるアミノ酸置換の例が挙げられる。 Furthermore, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention also includes a VH-CDR in any one of VHs selected from (1d) to (5d) above, in which any one to five amino acid residues have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and which has substantially the same binding activity to CD19 as the original second arm without the amino acid substitutions. For example, in the case of VH-CDR1, one amino acid residue has been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and in the case of VH-CDR2 or VH-CDR3, one to five amino acid residues have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids). Furthermore, as shown in Figure 5, in each CDR of anti-CD19 antibody clones corresponding to the second arm that specifically binds to CD19, each amino acid that differs between clones, or any combination thereof, can be mutually substituted between the clones. Here, "having binding activity to CD19 substantially equivalent to that of the original second arm without the amino acid substitution" means that the CD19 binding activity of the second arm with the amino acid substitution is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of the original second arm without the amino acid substitution. Examples of "conservative amino acid substitutions" in each VH-CDR of the second arm include the amino acid substitutions in the first arm described above.

また、さらに、本発明における、「CD19に特異的に結合する第二アーム」には、そのVHにおいて、上述の特定のアミノ酸配列を有する各CDRを含み、そのVHのFRのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれる。例えば、上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHは、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子がIGHV5-51であるVDJ組換え遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされ得る。ここで、生殖細胞系列型のＶ遺伝子IGHV5-51によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列に対応する（図３）。 Furthermore, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention also includes a VH that comprises CDRs with the specific amino acid sequences described above, and the amino acid sequence of the FR of the VH is encoded by a specific germline gene or a somatically mutated version of the gene. For example, any one of the VHs selected from (1d) to (5d) above can be encoded by a VDJ recombined gene whose germline V gene is IGHV5-51 or a somatically mutated version of the gene. Here, the amino acid sequence encoded by the germline V gene IGHV5-51 corresponds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (Figure 3).

本発明のCD19に特異的に結合する第二アームのVHのフレームワークは、生殖細胞系列型のVDJ組換遺伝子が体細胞突然変異を受けた当該遺伝子によってコードされる場合がある。例えば、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子がIGHV5-51である、上記（1d）～（5d）から選択される何れかで示されるVHのFR1およびFR3は、図５に示すアミノ酸位置において、IGHV5-51遺伝子がコードするアミノ酸配列と相違するため、当該各位置において体細胞突然変異を受けている。例えば、FR1については、配列番号２２のアミノ酸配列中の位置１のグルタミン酸がグルタミンに、位置１４のプロリンがセリンに、位置２７のチロシンがフェニルアラニンに、または位置３０のスレオニンがイソロイシンに各々置換されるか、あるいはそれらの任意の複数の組み合わせで置換されていてもよい。FR3については、配列番号２２のアミノ酸配列中の位置７６のイソロイシンがフェニルアラニンに、位置７７のセリンがスレオニンもしくはアスパラギンに、位置７８のスレオニンがバリンに、位置８４のセリンがアスパラギンに、位置９３のメチオニンがイソロイシンもしくはロイシンに、または位置９７のアラニンがバリンに各々置換されるか、あるいは任意の複数の組み合わせで置換されてもよい。上記何れかのアミノ酸置換の組み合わせを有する各々FR1およびFR3も、CD19に特異的に結合する第二アームの機能に実質的な影響を与えず、フレームワークとして使用することができる。 The framework of the VH of the second arm that specifically binds to CD19 of the present invention may be encoded by a germline VDJ recombined gene that has undergone somatic mutation. For example, when the germline V gene is IGHV5-51, FR1 and FR3 of the VH shown in any of (1d) to (5d) above differ from the amino acid sequence encoded by the IGHV5-51 gene at the amino acid positions shown in Figure 5 and therefore have undergone somatic mutation at those positions. For example, in FR1, the glutamic acid at position 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 may be substituted with glutamine, the proline at position 14 with serine, the tyrosine at position 27 with phenylalanine, or the threonine at position 30 with isoleucine, or any combination thereof. With regard to FR3, the isoleucine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 may be substituted with phenylalanine, the serine at position 77 with threonine or asparagine, the threonine at position 78 with valine, the serine at position 84 with asparagine, the methionine at position 93 with isoleucine or leucine, or the alanine at position 97 with valine, or any combination thereof. FR1 and FR3 having any of the above combinations of amino acid substitutions can also be used as a framework without substantially affecting the function of the second arm to specifically bind to CD19.

さらに、本発明における「CD19に特異的に結合する第二アーム」には、上述の特定のアミノ酸配列を有する各CDRを含み、かつ、そのVHのFRのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれる。例えば、そのような第二アームとして、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有するものが挙げられる。 Furthermore, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention also includes a VH that contains CDRs having the specific amino acid sequences described above, and the amino acid sequence of the FR of the VH is encoded by a specific germline gene or a gene that has undergone somatic mutation. For example, such a second arm may have a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34.

さらに、そのような「CD19に特異的に結合する第二アーム」には、例えば、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり、好ましくは少なくとも90％同一であり、より好ましくは少なくとも95％同一であり、さらに好ましくは少なくとも98％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも99％同一であるアミノ酸配列からなるVHを有し、かつ、元の第二アームのVHのアミノ酸配列との相違がCD19への結合活性に実質的に影響しないもの（以下、相同第二アームと略記することがある。）も含まれる。ここで、「元の第二アームのVHのアミノ酸配列との相違がCD19への結合活性に実質的に影響しない」とは、相同第二アームのCD19への結合活性が元の第二アームの当該結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。 Furthermore, such "second arms that specifically bind to CD19" also include those having a VH consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical, preferably at least 90% identical, more preferably at least 95% identical, even more preferably at least 98% identical, and even more preferably at least 99% identical to any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34, and in which differences from the amino acid sequence of the VH of the original second arm do not substantially affect the binding activity to CD19 (hereinafter sometimes abbreviated as "homologous second arms"). Here, "differences from the amino acid sequence of the VH of the original second arm do not substantially affect the binding activity to CD19" means that the binding activity of the homologous second arm to CD19 is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of the original second arm.

さらに別の態様において、本発明における「CD19に特異的に結合する第二アーム」には、（１）上記（1d）～（5d）から選択される何れかで示されるVHまたは配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび本明細書における共有軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有する第二アームのCD19への結合または（２）当該VHおよびVLからなるCD19に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域のCD19への結合に交差競合する抗CD19抗体の可変領域（ここで、当該可変領域は、それを構成するVHおよびVLを含む。）を有するものも含まれ、また、そのCD19への結合が、（３）上記（1d）～（5d）から選択される何れかで示されるVHあるいは配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび当該共有軽鎖のVLを有する第二アームまたは（４）当該VHおよびVLからなるCD19に特異的に結合するモノクローナル抗体の可変領域により交差競合される抗CD19抗体の可変領域を有するものも含まれる。ここで、「CD19への結合において交差競合する」とは、本明細書において例示された第二アームと同一のあるいは一部重複するエピトープに結合することによって、当該第二アームのCD19への結合を、その程度に関わらず阻害する、あるいは当該例示された第二アームと同一のあるいは一部重複するエピトープに結合する抗体によるCD19への結合が、当該例示された第二アームによってその程度に関わらず阻害されることを意味する。ここで、交差競合するかどうかは、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」に関する説明において記載された方法に準じて、同様に測定することができる。 In yet another embodiment, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention includes (1) a second arm having a VH selected from any one of (1d) to (5d) above or a VH consisting of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 and a VL of a shared light chain described herein (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25) that specifically binds to CD19, or (2) an anti-CD19 antibody that cross-competes with the binding to CD19 of the variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to CD19 and that consists of the VH and VL. The present invention also includes those having the variable region of an anti-CD19 antibody (wherein the variable region includes the VH and VL constituting the same), and those having the variable region of an anti-CD19 antibody whose binding to CD19 is cross-competed with (3) a second arm having a VH selected from the above (1d) to (5d) or a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 and the VL of the shared light chain, or (4) a variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to CD19 and is composed of the VH and VL. Here, "cross-competing for binding to CD19" means inhibiting the binding of the second arm to CD19, regardless of the level, by binding to the same or a partially overlapping epitope as the second arm exemplified herein, or inhibiting the binding of an antibody to CD19 that binds to the same or a partially overlapping epitope as the second arm exemplified herein, regardless of the level, by the second arm exemplified herein. Here, whether or not cross-competition occurs can be determined in the same manner as described in the explanation for the "first arm that specifically binds to PD-1."

ここで、本発明における「CD19に特異的に結合する第二アーム」として好ましくは、上記（1d）～（5d）で示されるVHを有する第二アームが挙げられ、さらに、この好ましい第二アームには、上述したように、そのVHの各CDRにおいて、その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換され、かつ、そのアミノ酸置換がCD19への結合活性に実質的に影響しないものも含まれ、また、さらに、上述したように、VHのフレームワークのアミノ酸配列が、生殖細胞系列型Ｖ遺伝子IGHV5-51またはそれらの体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれる。そして、当該第二アームとしてより好ましくは、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有するものが挙げられる。 Preferably, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention is a second arm having a VH shown in (1d) to (5d) above. Furthermore, as described above, this preferred second arm also includes one in which any one to five amino acid residues in each CDR of the VH have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and the amino acid substitutions do not substantially affect the binding activity to CD19. Furthermore, as described above, this preferred second arm also includes one in which the amino acid sequence of the VH framework has a VH encoded by the germline V gene IGHV5-51 or a gene somatically mutated therein. More preferably, the second arm includes one having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34.

さらに、別の態様において、本発明における「CD19に特異的に結合する第二アーム」として好ましくは、配列番号３０～３４の各アミノ酸配列における114番目のアミノ酸がアルギニンに置換された、または置換されていてもよい、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有する第二アームが挙げられ、より好ましくは、配列番号３０～３４の各アミノ酸配列における114番目のグルタミンがアルギニンに置換された、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有する第二アームであり、それらは各々配列番号６２～６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有する第二アームに相当する。これらアミノ酸置換により、当該第二アームを有する重鎖および軽鎖からなる複合体（以下、第二アーム重鎖／軽鎖複合体）の等電点（pI値）を増加させることができ、それにより、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体の精製工程において、特に、第二アーム重鎖／軽鎖複合体のホモダイマーからの当該二重特異性抗体の分離が容易となる。なお、本発明において、第二アーム重鎖／軽鎖複合体の等電点として好ましくは、約8.3～約8.9であり、より好ましくは、約8.4～約8.8である。また、第一アームを有する重鎖および軽鎖からなる複合体（以下、第一アーム重鎖／軽鎖複合体）の等電点として好ましくは、約7.4～約7.7であり、より好ましくは、約7.5～約7.6である。 In another aspect, a preferred "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention is a second arm having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 30 to 34, in which the amino acid at position 114 in each of the amino acid sequences is or may be substituted with arginine, and more preferably a second arm having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 30 to 34, in which the glutamine at position 114 in each of the amino acid sequences is substituted with arginine, each of which corresponds to a second arm having a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 62 to 66. These amino acid substitutions can increase the isoelectric point (pI value) of a complex consisting of a heavy chain and a light chain comprising the second arm (hereinafter referred to as the second arm heavy chain/light chain complex), thereby facilitating separation of the bispecific antibody from the homodimer of the second arm heavy chain/light chain complex in the purification process of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention. In the present invention, the isoelectric point of the second arm heavy chain/light chain complex is preferably about 8.3 to about 8.9, and more preferably about 8.4 to about 8.8. The isoelectric point of the complex consisting of a heavy chain and a light chain having a first arm (hereinafter referred to as the first arm heavy chain/light chain complex) is preferably about 7.4 to about 7.7, and more preferably about 7.5 to about 7.6.

さらに、本発明における「CD19に特異的に結合する第二アーム」は、本明細書における共通軽鎖のVLを含むものが好ましく、そのような共通軽鎖として好ましくは、例えば、IGVK1-39/JK1共通軽鎖であり、より好ましくは、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有する軽鎖であり、さらに好ましくは、例えば、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有する軽鎖である。また、共通軽鎖の定常領域として好ましくは、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域が挙げられる。 Furthermore, the "second arm that specifically binds to CD19" of the present invention preferably comprises a VL of the common light chain herein. A preferred example of such a common light chain is the IGVK1-39/JK1 common light chain, more preferably a light chain having a VL comprising a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and even more preferably a light chain having a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. Furthermore, a preferred example of the constant region of the common light chain is a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体を構築するための抗CD19抗体の各クローンと、それらのVHのアミノ酸配列およびその配列番号との対応関係を図８に、ならびに当該抗CD19抗体の各クローンのVH中の各CDRのアミノ酸配列とその配列番号との対応関係を図９に示す。 Figure 8 shows the correspondence between the amino acid sequences of the VHs of the anti-CD19 antibody clones used to construct the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention and their corresponding SEQ ID NOs. Figure 9 also shows the correspondence between the amino acid sequences of the CDRs in the VHs of the anti-CD19 antibody clones and their corresponding SEQ ID NOs.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましい態様としては、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（A）上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVHにおける、VH-CDR1、VH-CDR2およびVH-CDR3の何れか一つまたは複数のCDRにおいて、各々その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、その保存的アミノ酸）に置換されていてもよいVH、および
（B）配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有し、ならびに
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（C）上記（1d）～（5d）から選択される何れかで示されるVHにおける、VH-CDR1、VH-CDR2およびVH-CDR3から選択される何れか一つまたは複数のCDRにおいて、各々その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、保存的アミノ酸）に置換されていてもよいVH、および
（D）配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有することを特徴とする、PD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。 In a preferred embodiment of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention, for example, the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) a VH selected from the above (1b) to (5b), in which any 1 to 5 amino acid residues in any one or more CDRs of VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 may be substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids); and (B) a VL comprising VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and
the second arm specifically binding to CD19 is
(C) a VH selected from (1d) to (5d) above, in which any 1 to 5 amino acid residues in any one or more CDRs selected from VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 may be substituted with other amino acids (preferably conservative amino acids); and (D) a VL comprising VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

より好ましくは、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（A）上記（1b）～（5b）から選択される何れかで示されるVH、および
（B）配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有し、ならびに
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（C）上記（1d）～（5d）から選択される何れかで示されるVH、および
（D）配列番号２６のアミノ酸配列からなるVL-CDR1、配列番号２７のアミノ酸配列からなるVL-CDR2および配列番号２８のアミノ酸配列からなるVL-CDR3を含むVLを有することを特徴とする、PD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。 More preferably, for example, the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) a VH selected from the above (1b) to (5b), and (B) a VL comprising a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and
the second arm specifically binding to CD19 is
(C) a VH selected from (1d) to (5d) above, and (D) a VL comprising a VL-CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

また、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましい別の態様としては、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（A）配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列からなるVH、および
（B）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有し、ならびに、
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（C）配列番号３０～３４および６２～６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、または当該VHのアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列からなるVH、および
（D）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有することを特徴とする、PD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。 In another preferred embodiment of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention, for example, the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, or a VH consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical to the amino acid sequence of the VH; and (B) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and
the second arm specifically binding to CD19 is
(C) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 30 to 34 and 62 to 66, or a VH consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical to the amino acid sequence of the VH; and (D) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

この別の態様としてより好ましくは、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（A）配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、および
（B）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有し、ならびに、
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（C）配列番号３０～３４および６２～６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、および
（D）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有することを特徴とする、PD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。 In this other embodiment, more preferably, for example, the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, and (B) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and
the second arm specifically binding to CD19 is
(C) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 and 62 to 66, and (D) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

さらに、この別の態様としてさらに好ましくは、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームが、
（A）配列番号１～５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、および
（B）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有し、ならびに、
CD19に特異的に結合する第二アームが、
（C）配列番号６２～６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVH、および
（D）配列番号２５のアミノ酸配列からなるVLを有することを特徴とする、PD-1/CD19二重特異性抗体が挙げられる。 Furthermore, in this other embodiment, it is more preferable that, for example, the first arm that specifically binds to PD-1 is
(A) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, and (B) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and
the second arm specifically binding to CD19 is
(C) a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 62 to 66, and (D) a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましいアイソタイプとしてはIgG抗体であり、さらに好ましくは、IgG₁もしくはIgG₄抗体であり、さらにより好ましくはIgG₁抗体である。同抗体がIgG₁抗体である場合には、各々二つの重鎖定常領域あるいはヒンジ領域上において、EUナンバリングシステムによる235番目のロイシンがグリシンに置換され、および／または236番目のグリシンがアルギニンに置換されたIgG₁抗体が好ましい。さらに、それら二重特異性抗体の重鎖Ｃ末端のアミノ酸、例えば、EUナンバリングシステムによる447番目のリシンを欠損した抗体がより好ましい。また、PD-1/CD19二重特異性抗体がIgG₄抗体である場合には、そのヒンジ領域に位置する、EUナンバリングシステムによる228番目のセリンをプロリンに置換した抗体が好ましい。 The preferred isotype of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention is an IgG antibody, more preferably an _IgG1 or _IgG4 antibody, and even more preferably an _IgG1 antibody. When the antibody is an _IgG1 antibody, an IgG1 antibody in which leucine at position 235 according to the EU numbering system is substituted with glycine and/or glycine at position 236 is substituted with arginine in each of the two heavy chain constant regions or hinge regions is preferred. Furthermore, antibodies in which an amino acid at the C-terminus of the heavy chain of such bispecific antibodies, for example, lysine at position 447 according to the EU numbering system, is deleted are even more preferred. Furthermore, when the PD- ₁ /CD19 bispecific antibody is an _IgG4 antibody, an antibody in which serine at position 228 according to the EU numbering system in the hinge region is substituted with proline is preferred.

さらに、これらPD-1/CD19二重特異性抗体がIgG₁抗体である場合に好ましい態様としては、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖における定常領域中のEUナンバリングシステムによる351番目のロイシンがリシンに置換され、かつ366番目のスレオニンがリシンに置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換されたIgG₁抗体が挙げられる。また、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖における定常領域中のEUナンバリングシステムによる351番目のロイシンがアスパラギン酸に置換され、かつ368番目のロイシンがグルタミン酸に置換され、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖における定常領域中の351番目のロイシンがリシンに置換され、かつ366番目のスレオニンがリシンに置換されたIgG₁抗体も同様に好ましい。 Furthermore, when these PD-1/CD19 bispecific antibodies are _IgG1 antibodies, preferred embodiments include IgG1 antibodies in which the leucine at position 351 (EU numbering system) is substituted with lysine and the threonine at position 366 (EU numbering system) in the constant region of a heavy chain having a VH in a first arm that specifically binds to PD-1 is substituted with lysine, and the leucine at position 351 (EU numbering system) is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 (EU numbering system) is substituted with glutamic _acid in the constant region of a heavy chain having a VH in a first arm that specifically binds to PD-1 is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 (EU numbering system) is substituted with glutamic acid, and the leucine at position 351 (EU numbering system) is substituted with lysine and the threonine at position 366 (EU numbering system) in the constant region of a heavy chain having a VH in a second arm that specifically binds to _CD19 is also preferred.

重鎖定常領域における上記したすべてのアミノ酸置換を取り入れたPD-1/CD19二重特異性IgG₁抗体の好ましい態様としては、例えば、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖が、配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を有し、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖が、配列番号２４および配列番号７１～７５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を有する抗体が挙げられる。それらの一部のアミノ酸配列を図１０に例示する。 A preferred embodiment of a PD-1/CD19 bispecific _IgG1 antibody incorporating all of the above-mentioned amino acid substitutions in the heavy chain constant region includes, for example, an antibody in which the heavy chain having a first arm VH that specifically binds to PD-1 has a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and the heavy chain having a second arm VH that specifically binds to CD19 has a heavy chain constant region consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NOs: 71 to 75. Some of these amino acid sequences are shown in Figure 10.

ここで、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖は、そのＣ末端において、そのＣ末端アミノ酸とのアミド結合を介して、さらに、Gly（グリシン）、Gly-Lys-Lys-Ala（配列番号６７）、Gly-Lys-Ala-Lys-Ala（配列番号６８）、Gly-Arg-Arg-Ala（配列番号６９）またはGly-Arg-Ala-Arg-Ala（配列番号７０）を有していてもよい。これらアミノ酸またはペプチドの付加により、当該第二アーム重鎖／軽鎖複合体の等電点（pI値）を増加させることができ、それにより、上述した第二アームのVHにおけるアミノ酸置換の事例と同様に、特に、第二アーム重鎖／軽鎖複合体のホモダイマーからの当該二重特異性抗体の分離が容易となる。なお、そのＣ末端に当該アミノ酸またはペプチドが付加された第二アーム重鎖／軽鎖複合体についても、その等電点として好ましくは、約8.3～約8.9であり、より好ましくは、約8.4～約8.8である。 Here, a heavy chain having a second arm VH that specifically binds to CD19 may further have Gly (glycine), Gly-Lys-Lys-Ala (SEQ ID NO: 67), Gly-Lys-Ala-Lys-Ala (SEQ ID NO: 68), Gly-Arg-Arg-Ala (SEQ ID NO: 69), or Gly-Arg-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 70) at its C-terminus via an amide bond with the C-terminal amino acid. Addition of these amino acids or peptides can increase the isoelectric point (pI value) of the second arm heavy chain/light chain complex, which, as with the amino acid substitution in the second arm VH described above, particularly facilitates separation of the bispecific antibody from the homodimer of the second arm heavy chain/light chain complex. The isoelectric point of a second arm heavy chain/light chain complex having such an amino acid or peptide added to its C-terminus is preferably about 8.3 to about 8.9, more preferably about 8.4 to about 8.8.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体の態様として最も好ましくは、本明細書実施例１２において作製された、クローンCD19-1(Bi)、クローンCD19-2(Bi)、クローンCD19-3(Bi)、クローンCD19-4(Bi)およびクローンCD19-5(Bi)ならびに実施例１３において作製されたクローンCD19-6(Bi)が挙げられる。 The most preferred embodiments of the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention include clone CD19-1(Bi), clone CD19-2(Bi), clone CD19-3(Bi), clone CD19-4(Bi), and clone CD19-5(Bi), which were produced in Example 12 of the present specification, and clone CD19-6(Bi), which was produced in Example 13.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましい特徴としては、PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を許容することが挙げられる。ここで、「PD-1およびPD-L1との相互作用、PD-1およびPD-L2との相互作用、またはそれら両相互作用を許容する」とは、「PD-1に特異的に結合する第一アーム」に関する説明において記載された定義と同じ意味を表わす。 Preferred characteristics of the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention include allowing interaction between PD-1 and PD-L1, interaction between PD-1 and PD-L2, or both of these interactions. Here, "allowing interaction between PD-1 and PD-L1, interaction between PD-1 and PD-L2, or both of these interactions" has the same meaning as defined in the explanation of "a first arm that specifically binds to PD-1."

さらに、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましい特徴としては、サイトカイン産生が十分に低減されたものが挙げられる。ここで、「サイトカイン産生が十分に低減された」とは、例えば、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体を点滴等により静脈内投与中、あるいは投与してから24時間以内において、例えば、血中あるいは組織中のIL-2、IFN-γおよび／またはTNF-αを含むサイトカインの濃度が増加しないか、増加しても、ステロイド投与により抑制可能な程度であることを意味する。 Furthermore, a preferred feature of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention is that cytokine production is sufficiently reduced. Here, "sufficiently reduced cytokine production" means, for example, that during intravenous administration of the PD-1/CD19 bispecific antibody of the present invention by infusion or the like, or within 24 hours after administration, the concentrations of cytokines, including, for example, IL-2, IFN-γ, and/or TNF-α, in the blood or tissues do not increase, or, if they increase, are at a level that can be suppressed by steroid administration.

さらに、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体として好ましい特徴としては、Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の活性化に対して抑制効果を有するものが挙げられる。同抑制効果は、Ｔ細胞を含む末梢血単核球からのサイトカイン（例えば、IL-2）産生抑制効果として評価することができる。 Furthermore, a preferred feature of the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention is that they have an inhibitory effect on the activation of T cells (e.g., memory T cells). This inhibitory effect can be evaluated as an inhibitory effect on cytokine (e.g., IL-2) production from peripheral blood mononuclear cells, which contain T cells.

PD-1/CD19二重特異性抗体の製造および精製方法
本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体およびその抗体断片は、WO2014/051433、WO2013/157953あるいはWO2013/157954に開示された方法でも製造することができる。 Methods for producing and purifying PD-1/CD19 bispecific antibodies The PD-1/CD19 bispecific antibodies and antibody fragments thereof of the present invention can also be produced by the methods disclosed in WO2014/051433, WO2013/157953, or WO2013/157954.

具体的には、（１）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、（２）CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、および（３）共通軽鎖をコードするポリヌクレオチドが各々挿入された発現ベクターを、哺乳動物細胞に遺伝子導入して形質転換させ、両重鎖および共有軽鎖を共に発現ならびに分泌させて製造することができる。 Specifically, (1) an expression vector into which a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH in the first arm that specifically binds to PD-1, (2) a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH in the second arm that specifically binds to CD19, and (3) a polynucleotide encoding a common light chain have been inserted is transfected into mammalian cells to transform them, and both heavy chains and the common light chain can be expressed and secreted to produce the antibodies.

ここで、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体を発現する宿主細胞は、発現ベクターを遺伝子導入でき、導入された発現ベクターを発現することができるいかなる宿主細胞でもよい。好ましくは、SF-9およびSF-21細胞のような昆虫細胞、より好ましくは、CHO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞およびNS-0ミエローマ細胞を含むマウス細胞、COSおよびVero細胞のような霊長類細胞、MDCK細胞、BRL 3A細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化した初代細胞、W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080またはＰER.C6のような胚性の網膜細胞等の哺乳類細胞が挙げられる。なお、発現システムの選択においては、抗体が適切にグリコシル化されるように、哺乳類の細胞の発現ベクターおよび宿主を用いることがある。ヒト細胞株、好ましくはPER.C6は、ヒトにおけるグリコシル化パターンと一致する抗体を得るために有利に用いられる。 Host cells expressing the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention may be any host cells capable of transfecting with an expression vector and expressing the introduced expression vector. Preferred examples include insect cells such as SF-9 and SF-21 cells, and more preferred are mouse cells including CHO cells, BHK cells, SP2/0 cells, and NS-0 myeloma cells, primate cells such as COS and Vero cells, and mammalian cells such as MDCK cells, BRL 3A cells, hybridomas, tumor cells, immortalized primary cells, and embryonic retinal cells such as W138, HepG2, HeLa, HEK293, HT1080, or PER.C6. In selecting an expression system, mammalian cell expression vectors and hosts may be used to ensure appropriate glycosylation of the antibody. Human cell lines, preferably PER.C6, are advantageously used to obtain antibodies with glycosylation patterns consistent with those in humans.

発現ベクターの遺伝子導入によって形質転換された宿主細胞における蛋白質の産生は、例えば、Current Protocols in Protein Science (1995), Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8，Bendig, 1988を参考に実施することができ、さらに、宿主細胞の培養の生産性を最大にするための一般的な指針、手順および実用的な方法は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)を参考に実施できる。宿主細胞での抗体の発現は、例えば、EP0120694、EP0314161、EP0481790、EP0523949、US4816567およびWO2000/63403などの公開公報に記述されている。 Protein production in host cells transformed by gene introduction of an expression vector can be carried out with reference to, for example, Current Protocols in Protein Science (1995), Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8, Bendig, 1988. Furthermore, general guidelines, procedures, and practical methods for maximizing the productivity of host cell culture can be found in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). Expression of antibodies in host cells is described in, for example, published publications such as EP 0120694, EP 0314161, EP 0481790, EP 0523949, US 4816567, and WO 2000/63403.

ここで、宿主細胞の培養条件は、公知の方法により最適化でき、蛋白質の生産量を最適化することができる。培養は、例えば、培養シャーレ、ローラーボトルもしくは反応槽の中で、バッチ培養、流加培養、連続培養、中空糸による培養で実施できる。細胞培養により、大規模かつ連続的な組み換えタンパク質の生産を行うためには、細胞を懸濁液の中で増殖させることが好ましい。また、動物もしくはヒト由来血清または動物もしくはヒト由来の血清の構成要素がない条件下で細胞の培養をさせることが好ましい。 Here, the culture conditions of the host cells can be optimized using known methods to optimize the protein production yield. Culture can be carried out, for example, in culture dishes, roller bottles, or reactors, using batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or hollow fiber culture. For large-scale, continuous production of recombinant proteins by cell culture, it is preferable to grow cells in suspension. It is also preferable to culture the cells in the absence of animal- or human-derived serum or components of animal- or human-derived serum.

宿主細胞で発現され、その細胞または細胞培地から公知の方法により回収された抗体は、公知の方法を用いて精製することができる。精製方法には、免疫沈降法、遠心分離法、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等が含まれる。さらに、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーが好適に用いられる場合がある（例えば、US4801687およびUS5151504参照）。 Antibodies expressed in host cells and recovered from the cells or cell culture medium by known methods can be purified using known methods. Purification methods include immunoprecipitation, centrifugation, filtration, size exclusion chromatography, affinity chromatography, cation and/or anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, etc. In addition, protein A or protein G affinity chromatography may be suitably used (see, e.g., US4801687 and US5151504).

抗CD19モノクローナル抗体
本発明は、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体を構築するための「CD19に特異的に結合するモノクローナル抗体」（以下、「抗CD19モノクローナル抗体」と略記することがある。）およびそれらの抗体断片を含む。 Anti-CD19 Monoclonal Antibodies The present invention includes "monoclonal antibodies that specifically bind to CD19" (hereinafter sometimes abbreviated as "anti-CD19 monoclonal antibodies") and antibody fragments thereof for constructing the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention.

本発明の抗CD19モノクローナル抗体の一態様としては、VHおよび本発明における共通軽鎖のVLが会合することによって、CD19に特異的に結合することができるモノクローナル抗体である。ここで、「CD19に特異的に結合する」とは、少なくとも、1x10^-5M、好ましくは1x10^-7M、より好ましくは1x10^-9Mより高い親和性（解離定数（Kd値））を有する結合活性でCD19に対して直接結合することができ、ほかのタンパク質には実質的に結合しない特徴として使用される。ここで、「CD19に特異的に結合するモノクローナル抗体」における「抗体」とは、全長抗体、すなわち、ジスルフィド結合で連結された２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長の抗体を意味する。また、「CD19に特異的に結合するモノクローナル抗体の断片」とは、全長抗体の一部であって、少なくとも抗原結合部分を含む抗体であり、例えば、Fab、Fab′、Fv、scFvおよびF(ab′)₂などが挙げられる。 One embodiment of the anti-CD19 monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody that can specifically bind to CD19 through the association of VH and VL of the common light chain of the present invention. Here, "specifically binds to CD19" refers to the ability to directly bind to CD19 with an affinity (dissociation constant (Kd)) of at least ^1x10 M, preferably ^1x10 M, and more preferably ^1x10 M, and to not substantially bind to other proteins. Here, the "antibody" in "monoclonal antibody that specifically binds to CD19" refers to a full-length antibody, i.e., a full-length antibody consisting of two heavy chains and two light chains linked by disulfide bonds. Furthermore, "fragments of monoclonal antibodies that specifically bind to CD19" refer to portions of the full-length antibody that contain at least the antigen-binding portion, such as Fab, Fab', Fv, scFv, and F(ab') ₂ .

本発明の抗CD19モノクローナル抗体としては、例えば、「CD19に特異的に結合する第二アーム」のVHを構成する上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHまたは配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび本明細書における共通軽鎖の可変領域（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有するものが挙げられる。 Anti-CD19 monoclonal antibodies of the present invention include, for example, antibodies having a VH of the "second arm that specifically binds to CD19" selected from any one of (1d) to (5d) above, or a VH consisting of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 34, and a common light chain variable region as used herein (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25).

さらに、本発明の抗CD19モノクローナル抗体には、上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHにおける各々のCDRにおいて、その任意の１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、保存的アミノ酸）に置換され、かつ、当該アミノ酸に置換されていない元のVHを有する抗CD19モノクローナル抗体によるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有するVHをもつものも含まれる。例えば、そのCDR1の場合には、１個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、保存的アミノ酸）に置換され、CDR2またはCDR3の場合には、各々１～５個のアミノ酸残基が他のアミノ酸（好ましくは、保存的アミノ酸）に置換されたものが挙げられる。また、図５に示されるように、抗CD19モノクローナル抗体クローンの各CDRにおいて、各クローン間で相違する各アミノ酸またはそれらの任意の複数の組み合わせは、当該クローン間において相互に置換可能である。ここで、「当該アミノ酸に置換されていない元のVHを有する抗CD19モノクローナル抗体によるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有する」とは、当該アミノ酸に置換された抗PD-1モノクローナル抗体のCD19への結合活性が、当該アミノ酸に置換されていない元のVHを有する抗PD-1モノクローナル抗体の結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。 Furthermore, the anti-CD19 monoclonal antibodies of the present invention also include those having a VH selected from any one of (1d) to (5d) above, in which any one to five amino acid residues in each CDR of the VH have been substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and which have substantially the same binding activity to CD19 as that of an anti-CD19 monoclonal antibody having the original VH without such amino acid substitutions. For example, in the case of CDR1, one amino acid residue may be substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids), and in the case of CDR2 or CDR3, one to five amino acid residues may each be substituted with other amino acids (preferably, conservative amino acids). Furthermore, as shown in Figure 5, in each CDR of an anti-CD19 monoclonal antibody clone, each amino acid that differs between clones, or any combination thereof, may be mutually substituted between the clones. Here, "having binding activity to CD19 substantially equivalent to that of an anti-CD19 monoclonal antibody having the original VH without the amino acid substitution" means that the CD19 binding activity of the anti-PD-1 monoclonal antibody having the amino acid substitution is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of an anti-PD-1 monoclonal antibody having the original VH without the amino acid substitution.

さらに、本発明の抗CD19モノクローナル抗体には、そのVHにおいて、上述の特定のアミノ酸配列を有する各CDRを含み、そのVHのフレームワークのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものも含まれ、例えば、上記の「CD19に特異的に結合する第二アーム」に関する説明において挙げられた、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされる特定のVHを有するものなどである。 Furthermore, the anti-CD19 monoclonal antibodies of the present invention also include those whose VH comprises CDRs with the specific amino acid sequences described above, and whose VH framework amino acid sequence is encoded by a specific germline gene or a gene that has undergone somatic mutation, such as the specific VH encoded by a specific germline gene or a gene that has undergone somatic mutation, as listed above in the description of the "second arm that specifically binds to CD19."

さらに、本発明の抗CD19モノクローナル抗体のうち、上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHにおける各々のCDRを含み、そのVHのFRのアミノ酸配列が、特定の生殖細胞系列型遺伝子もしくはその体細胞突然変異を受けた当該遺伝子にコードされるVHを有するものとしては、例えば、配列番号３０～３４から選択されるアミノ酸配列からなるVHを有するものが挙げられる。さらに、そのような抗CD19モノクローナル抗体には、例えば、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり、好ましくは少なくとも90％同一であり、より好ましくは少なくとも95％同一であり、さらに好ましくは少なくとも98％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも99％同一であるアミノ酸配列からなるVHを有し、かつ、元のVHを有する抗CD19モノクローナル抗体によるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有するものも含まれる。ここで、「元のVHを有する抗CD19モノクローナル抗体によるCD19への結合活性と実質的に同等の結合活性を有する」とは、当該何れか一つのアミノ酸配列からなるVHを有する抗CD19モノクローナル抗体のCD19への結合活性の95％以上であり、好ましくは98％以上であり、より好ましくは99％以上であることを意味する。 Furthermore, among the anti-CD19 monoclonal antibodies of the present invention, those comprising each CDR of any one of the VHs selected from (1d) to (5d) above, and having a VH in which the amino acid sequence of the FR of the VH is encoded by a specific germline gene or a gene that has undergone somatic mutation, include, for example, those having a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 34. Furthermore, such anti-CD19 monoclonal antibodies also include those having a VH consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical, preferably at least 90% identical, more preferably at least 95% identical, even more preferably at least 98% identical, and even more preferably at least 99% identical to any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34, and that have binding activity to CD19 substantially equivalent to that of an anti-CD19 monoclonal antibody having the original VH. Here, "having binding activity to CD19 substantially equivalent to that of an anti-CD19 monoclonal antibody having the original VH" means that the binding activity to CD19 is 95% or more, preferably 98% or more, and more preferably 99% or more of the binding activity of an anti-CD19 monoclonal antibody having a VH consisting of any one of the amino acid sequences.

さらに別の態様において、本発明の抗CD19モノクローナル抗体には、（１）上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHまたは配列番号３０～３４から選択されるアミノ酸配列からなるVHおよび本明細書における共通軽鎖のVL（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有する抗CD19モノクローナル抗体のCD19への結合に交差競合する抗PD-1モノクローナル抗体、ならびに（２）CD19への結合が上記（1d）～（5d）から選択される何れか一つのVHまたは配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有する抗CD19モノクローナル抗体により交差競合される抗CD19モノクローナル抗体も含まれる。 In yet another embodiment, the anti-CD19 monoclonal antibodies of the present invention include (1) anti-PD-1 monoclonal antibodies that cross-compete for binding to CD19 with anti-CD19 monoclonal antibodies having a VH selected from the above (1d) to (5d) or a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 and a VL of the common light chain described herein (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25), and (2) anti-CD19 monoclonal antibodies whose binding to CD19 is cross-competed with anti-CD19 monoclonal antibodies having a VH selected from the above (1d) to (5d) or a VH consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 and a VL of the common light chain.

また、さらに別の態様において、本発明の抗CD19モノクローナル抗体には、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列における114番目のアミノ酸がアルギニンに置換された、または置換されていてもよいアミノ酸配列からなるVHおよび本明細書における共通軽鎖の可変領域（好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列からなるVL）を有するものが挙げられ、より好ましくは、配列番号３０～３４から選択される何れか一つのアミノ酸配列における114番目のグルタミンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有するものであり、それらは各々配列番号６２～６６から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなるVHおよび当該共通軽鎖のVLを有する抗CD19モノクローナル抗体に相当する。 In yet another embodiment, the anti-CD19 monoclonal antibody of the present invention includes an anti-CD19 monoclonal antibody having a VH consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at position 114 in any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 is substituted or may be substituted with arginine, and a variable region of the common light chain described herein (preferably a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25). More preferably, the anti-CD19 monoclonal antibody has a VH consisting of an amino acid sequence in which the glutamine at position 114 in any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 30 to 34 is substituted with arginine, and a VL of the common light chain, which correspond to an anti-CD19 monoclonal antibody having a VH consisting of an amino acid sequence in which any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 62 to 66 and a VL of the common light chain, respectively.

PD-1/CD19二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド
PD-1/CD19二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドは、（１）PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、（２）CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチド、および（３）共通軽鎖をコードするポリヌクレオチドから構成される。ここで、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチドは、PD-1に特異的に結合する第一アームのVHをコードするポリヌクレオチドおよび当該VHを有する重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドから構成され、同様に、CD19に特異的に結合する第二アームのVHを有する重鎖をコードするポリヌクレオチドは、CD19に特異的に結合する第二アームのVHをコードするポリヌクレオチドおよび当該VHを有する重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドから構成される。 Polynucleotides encoding PD-1/CD19 bispecific antibodies
A polynucleotide encoding a PD-1/CD19 bispecific antibody is composed of (1) a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1, (2) a polynucleotide encoding a heavy chain having a VH of a second arm that specifically binds to CD19, and (3) a polynucleotide encoding a common light chain. Here, the polynucleotide encoding the heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1 is composed of a polynucleotide encoding a VH of a first arm that specifically binds to PD-1 and a polynucleotide encoding a constant region of the heavy chain having said VH. Similarly, the polynucleotide encoding the heavy chain having a VH of a second arm that specifically binds to CD19 is composed of a polynucleotide encoding a VH of a second arm that specifically binds to CD19 and a polynucleotide encoding a constant region of the heavy chain having said VH.

PD-1/CD19二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドとは、これらPD-1/CD19二重特異性抗体を構成する部分を各々コードするポリヌクレオチドを有するものであればいかなるものであってもよく、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、RNA、DNA-RNAハイブリッドのいずれでもよい。一つのアミノ酸をコードするコドンは１～６種類知られており、例えば、PheにはTTTまたはTTC、LeuにはTTA、TTG、CTT、CTC、CTAまたはCTG、IleにはATT、ATCまたはATA、MetにはATG、ValにはGTT、GTC、GTAまたはGTG、SerにはTCT、TCC、TCAまたはTCG、ProにはCCT、CCC、CCAまたはCCG、ThrにはACT、ACC、ACAまたはACG、AlaにはGCT、GCC、GCAまたはGCG、TyrにはTATまたはTAC、ＨｉｓにはCATまたはCAC、GlnにはCAAまたはCAG、AsnにはAATまたはAAC、LysにはAAAまたはAAG、AspにはGATまたはGAC、GluにはGAAまたはGAG、CysにはTGTまたはTGC、TrpにはTGG、ArgにはCGT、CGC、CGAまたはCGG、SerにはAGTまたはAGC、ArgにはAGAまたはAGG、およびGlyにはGGT、GGC、GGAまたはGGGが各々対応しているので、PD-1/CD19二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドには、各アミノ酸に対応する各コドンが任意に組み合わされたポリヌクレオチドが含まれる。PD-1に特異的に結合する第一アームのVHをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、例えば、クローンPD1-1～PD1-5のVHを各々コードする配列番号５０～５４から選択される何れか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられ、CD19に特異的に結合する第二アームのVHをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、例えば、クローンCD19-5、CD19-1、CD19-4、CD19-2およびCD19-3のVHを各々コードする配列番号５６～６０および配列番号７６～８０から選択される何れか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、共通軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号５５の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。 A polynucleotide encoding a PD-1/CD19 bispecific antibody may be any polynucleotide encoding each of the constituent parts of the PD-1/CD19 bispecific antibody, and may be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, RNA, or a DNA-RNA hybrid. One to six codons are known to encode a single amino acid, for example, TTT or TTC for Phe, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, or CTG for Leu, ATT, ATC, or ATA for Ile, ATG for Met, GTT, GTC, GTA, or GTG for Val, TCT, TCC, TCA, or TCG for Ser, CCT, CCC, CCA, or CCG for Pro, ACT, ACC, ACA, or ACG for Thr, GCT, GCC, GCA, or GCG for Ala, TAT or TAC for Tyr, CAT or CAC for His, and CAT for Gln. Codons corresponding to each amino acid are CAA or CAG, Asn to AAT or AAC, Lys to AAA or AAG, Asp to GAT or GAC, Glu to GAA or GAG, Cys to TGT or TGC, Trp to TGG, Arg to CGT, CGC, CGA or CGG, Ser to AGT or AGC, Arg to AGA or AGG, and Gly to GGT, GGC, GGA or GGG, and therefore polynucleotides encoding PD-1/CD19 bispecific antibodies include polynucleotides in which each codon corresponding to each amino acid is combined in any order. A preferred example of a polynucleotide encoding the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 is a polynucleotide consisting of any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 50 to 54, which encode the VH of clones PD1-1 to PD1-5, respectively. A preferred example of a polynucleotide encoding the VH of the second arm that specifically binds to CD19 is a polynucleotide consisting of any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 56 to 60 and 76 to 80, which encode the VH of clones CD19-5, CD19-1, CD19-4, CD19-2, and CD19-3, respectively. A preferred example of a polynucleotide encoding the variable region of the common light chain is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55.

医薬用途
本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、自己免疫疾患または移植片対宿主病（GVHD）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に有用である。 Pharmaceutical Uses The PD-1/CD19 bispecific antibodies and the like of the present invention are useful for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating autoimmune diseases or graft-versus-host disease (GVHD).

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等が予防、症状進展抑制および／または治療可能な自己免疫疾患としては、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ANCA関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG₄関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（グレーブス病（甲状腺機能亢進症））、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、サルコイドーシス、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、全身性肥満細胞症および封入体筋炎などが挙げられる。 Examples of autoimmune diseases that can be prevented, suppressed in progression of symptoms, and/or treated by the PD-1/CD19 bispecific antibodies and the like of the present invention include Behçet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis (systemic sclerosis, progressive systemic sclerosis), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa (polyarteritis nodosa, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Takayasu's arteritis), malignant rheumatoid arthritis, and rheumatoid arthritis. , juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, rheumatoid vasculitis, large vessel vasculitis, ANCA-associated vasculitis (e.g., granulomatosis with polyangiitis and eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), Cogan's syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, polymyalgia rheumatica, fibromyalgia, antiphospholipid syndrome, eosinophilic fasciitis, IgG ₄ Associated diseases (e.g., primary sclerosing cholangitis, autoimmune pancreatitis, etc.), Guillain-Barré syndrome, myasthenia gravis, chronic atrophic gastritis, autoimmune hepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, primary biliary cirrhosis, Goodpasture's syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, megaloblastic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pernicious anemia, autoimmune neutropenia, idiopathic thrombocytopenic purpura, Graves' disease (Graves' disease (hyperthyroidism)), Hashimoto's disease, autoimmune adrenal insufficiency, primary hypothyroidism, Addison's disease (chronic hypoadrenalism), idiopathic Addison's disease, type 1 diabetes, slowly progressive type 1 diabetes (adult latent autoimmune diabetes) , localized scleroderma, psoriasis, psoriatic arthritis, bullous pemphigoid, pemphigus, pemphigoid, herpes gestationis, linear IgA bullous dermatosis, epidermolysis bullosa acquisita, alopecia areata, vitiligo, vitiligo vulgaris, neuromyelitis optica, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, multifocal motor neuropathy, sarcoidosis, giant cell arteritis, amyotrophic lateral sclerosis, Harada's disease, autoimmune optic neuropathy, idiopathic azoospermia, recurrent abortion, inflammatory bowel disease (e.g., ulcerative colitis, Crohn's disease), celiac disease, ankylosing spondylitis, severe asthma, chronic urticaria, transplant immunity, familial Mediterranean fever, eosinophilic sinusitis, dilated cardiomyopathy, systemic mastocytosis, and inclusion body myositis.

本発明において「治療」とは、例えば、ある疾患もしくはその症状を治癒させることまたは改善させることを意味し、「予防」とは、ある疾患もしくは症状の発現を未然に防止するあるいは一定期間遅延させることを意味し、「症状進展抑制」とは症状の進展または悪化を抑制して病態の進行を止めることを意味する。なお、「予防」の意味には再発抑制も含まれる。「再発抑制」とは、ある疾患もしくは症状の再発を防止または再発の可能性を低減させることを意味する。 In the present invention, "treatment" means, for example, curing or ameliorating a certain disease or its symptoms, "prevention" means preventing the onset of a certain disease or symptom or delaying it for a certain period of time, and "suppression of symptom progression" means suppressing the progression or worsening of symptoms to stop the progression of the pathological condition. The meaning of "prevention" also includes suppression of recurrence. "Suppression of recurrence" means preventing the recurrence of a certain disease or symptom or reducing the possibility of recurrence.

また、別の態様において、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、自己反応性Ｂ細胞介在性疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に有用である。自己反応性Ｂ細胞介在性疾患としては、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症および悪性貧血などが挙げられる。当該医薬用途において、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、自己反応性Ｂ細胞に対する抑制作用を介する。ここで、自己反応性Ｂ細胞に対する抑制作用には、IgGおよびIgMなどのイムノグロブリン産生抑制作用が含まれる。さらに、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、メモリーＴ細胞活性化に対する抑制作用を有する。ここで、メモリーＴ細胞活性化に対する抑制作用には、サイトカイン産生抑制作用が含まれる。 In another aspect, the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention are useful for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating autoreactive B cell-mediated diseases. Examples of autoreactive B cell-mediated diseases include systemic lupus erythematosus, Graves' disease, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, asthma, cryoglobulinemia, primary biliary sclerosis, and pernicious anemia. In this pharmaceutical use, the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention act via an inhibitory effect on autoreactive B cells. Here, the inhibitory effect on autoreactive B cells includes an inhibitory effect on the production of immunoglobulins such as IgG and IgM. Furthermore, the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention have an inhibitory effect on memory T cell activation. Here, the inhibitory effect on memory T cell activation includes an inhibitory effect on cytokine production.

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、通常、全身的または局所的に、非経口の形で投与される。かかる投与方法として、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などが挙げられ、静脈内注射の場合には、点滴による投与が好ましい。その投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、0.1 μg/kgから300 mg/kgの範囲で、特に好ましくは、0.1 mg/kgから10 mg/kgの範囲で、一日一回から数回非経口投与されるか、または一日30分から24時間の範囲で静脈内に持続投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。 The PD-1/CD19 bispecific antibodies and the like of the present invention are typically administered systemically or locally parenterally. Specific examples of such administration methods include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. Injection administration includes, for example, intravenous injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection. Intravenous administration is preferably by infusion. The dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but typically ranges from 0.1 μg/kg to 300 mg/kg per dose per adult, and more preferably ranges from 0.1 mg/kg to 10 mg/kg, once to several times daily parenterally or by continuous intravenous administration for 30 minutes to 24 hours per day. Of course, as mentioned above, the dosage varies depending on various conditions; therefore, a smaller dosage than the above may be sufficient, or a larger dosage may be required.

製剤
本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、注射剤または点滴のための輸液として製剤化されて用いられる場合、当該注射剤または輸液は、水溶液、懸濁液または乳濁液のいずれの形態であってもよく、また、用時に溶剤を加えることにより、溶解、懸濁または乳濁して使用されるように、薬学的に許容できる担体とともに、固形剤として製剤化されていてもよい。注射剤または点滴のための輸液に使用される溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。 When the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention are formulated and used as injections or infusions for intravenous drip infusion, the injections or infusions may be in the form of an aqueous solution, suspension, or emulsion, or may be formulated as a solid together with a pharmaceutically acceptable carrier so that they can be dissolved, suspended, or emulsified by adding a solvent when used. Solvents used in injections or infusions for intravenous drip infusion include, for example, distilled water for injection, physiological saline, glucose solution, and isotonic solutions (e.g., solutions of sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, propylene glycol, etc.).

ここで、薬学的に許容できる担体としては、例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、pH調整剤および抗酸化剤等が挙げられる。安定剤としては、例えば、各種アミノ酸、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート20（登録商標）、ポリソルベート80（登録商標）、HCO-50等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。pH調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。抗酸化剤として、例えば、（１）アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール、ブチル化ハイドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、α-トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤等を用いることができる。 Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, antiseptics, pH adjusters, and antioxidants. Stabilizers include, for example, various amino acids, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, and dibutylhydroxytoluene. Solubilizers include, for example, alcohols (e.g., ethanol), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (e.g., Polysorbate 20®, Polysorbate 80®, HCO-50, and the like). Suspending agents include, for example, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, and sodium lauryl sulfate. Examples of emulsifiers that can be used include gum arabic, sodium alginate, and tragacanth. Examples of soothing agents that can be used include benzyl alcohol, chlorobutanol, and sorbitol. Examples of buffers that can be used include phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, and epsilon aminocaproic acid buffer. Examples of preservatives that can be used include methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, butyl parahydroxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, and borax. Examples of antiseptics that can be used include benzalkonium chloride, parahydroxybenzoic acid, and chlorobutanol. Examples of pH adjusters that can be used include hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, and acetic acid. Examples of antioxidants that can be used include: (1) water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, and sodium sulfite; (2) oil-soluble antioxidants such as ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, lecithin, propyl gallate, and α-tocopherol; and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid, sorbitol, tartaric acid, and phosphoric acid.

注射剤または点滴のための輸液は、その最終工程において滅菌するかあるいは無菌操作法、例えば、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって製造することができる。また、注射剤または点滴のための輸液は、真空乾燥および凍結乾燥による無菌粉末（薬学的に許容できる担体の粉末を含んでいてもよい。）を、適切な溶剤に用時溶解して使用することもできる。 Injections or infusion solutions for intravenous drip can be produced by sterilizing them in the final process or by aseptic procedures, such as sterilizing by filtration, and then filling them into sterile containers. Injections or infusion solutions for intravenous drip can also be produced by vacuum-drying or freeze-drying sterile powders (which may contain a powder of a pharmaceutically acceptable carrier), which can be dissolved in an appropriate solvent immediately before use.

併用または配合剤
さらに、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等は、自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に使用される他の薬剤とともに組み合わせて使用してもよい。本発明において、他の薬剤とともに組み合わせて使用する場合（併用）の投与形態には、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態であっても、また別々の製剤としての投与形態であってもよい。その併用により、その他の薬剤の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療効果を補完したり、投与量あるいは投与回数を維持ないし低減することができる。本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等と他の薬剤を別々に投与する場合には、一定期間同時投与し、その後、PD-1/CD19二重特異性抗体等のみあるいは他の薬剤のみを投与してもよい。また、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を先に投与し、その投与終了後に他の薬剤を投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、その投与終了後に本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を後に投与してもよく、各々の投与方法は同じでも異なっていてもよい。本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を含む製剤と他の薬剤を含む製剤のキットとして提供することもできる。ここで、他の薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、他の薬剤は任意の２種以上を適宜の割合で組み合わせて投与してもよい。また、前記他の薬剤には、現在までに見出されているものだけでなく今後見出されるものも含まれる。 Combinations or Combinations Furthermore, the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention may be used in combination with other drugs used for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of autoimmune diseases. When used in combination with other drugs (combinations) in the present invention, the administration form may be a combination drug in which both components are combined in a single formulation, or may be administered as separate formulations. This combination can complement the preventive, suppressive of symptom progression, suppression of recurrence, and/or therapeutic effects of the other drug, or maintain or reduce the dosage or frequency of administration. When the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention and the other drug are administered separately, they may be co-administered for a certain period of time, and then the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. alone or the other drug alone may be administered. Alternatively, the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention may be administered first, followed by the other drug after the completion of that administration, or the other drug may be administered first, followed by the PD-1/CD19 bispecific antibodies, etc. of the present invention, after the completion of that administration. The administration methods for each may be the same or different. The formulation containing the PD-1/CD19 bispecific antibody or the like of the present invention can also be provided as a kit containing a formulation containing another drug. The dosage of the other drug can be appropriately selected based on the clinically used dose. Furthermore, any two or more types of other drugs may be administered in combination at an appropriate ratio. Furthermore, the other drugs include not only those discovered to date but also those that will be discovered in the future.

例えば、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等をＩ型糖尿病の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、インスリン製剤（例えば、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミルおよびインスリンアスパルト等）、スルホニルウレア剤（例えば、グリベンクラミド、グリクラジドおよびグリメピリド等）、速攻型インスリン分泌促進薬（例えば、ナテグリニド等）、ビグアナイド製剤（例えば、メトホルミン等）、インスリン抵抗性改善薬（例えば、ピオグリタゾン等）、α－グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボースおよびボグリボース等）、糖尿病性神経症治療薬（例えば、エパルレスタット、メキシレチンおよびイミダプリル等）、GLP-1アナログ製剤（例えば、リラグルチド、エクセナチド、リキシセナチドおよびセマグルチド等）およびDPP-4阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチンおよびアログリプチン等）等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。 For example, when the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention are used for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of type 1 diabetes, they may be used in combination with insulin preparations (e.g., human insulin, insulin glargine, insulin lispro, insulin detemir, insulin aspart, etc.), sulfonylureas (e.g., glibenclamide, gliclazide, glimepiride, etc.), rapid-acting insulin secretagogues (e.g., nateglinide, etc.), biguanides (e.g., metformin, etc.), insulin It may be used in combination with one or more drugs selected from insulin sensitizers (e.g., pioglitazone, etc.), α-glucosidase inhibitors (e.g., acarbose and voglibose, etc.), diabetic neuropathy treatment drugs (e.g., epalrestat, mexiletine, and imidapril, etc.), GLP-1 analogues (e.g., liraglutide, exenatide, lixisenatide, and semaglutide, etc.), and DPP-4 inhibitors (e.g., sitagliptin, vildagliptin, and alogliptin, etc.).

また、例えば、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を多発性硬化症の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾンおよびベタメタゾン等）、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、クラドリビン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コルチコトロピン、ミゾリビン、タクロリムス、フィンゴリモドおよびアレムツズマブ等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。 Furthermore, for example, when the PD-1/CD19 bispecific antibodies and the like of the present invention are used for the prevention, inhibition of symptom progression, inhibition of recurrence, and/or treatment of multiple sclerosis, steroid drugs (e.g., cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, hydrocortisone sodium succinate, fludrocortisone acetate, prednisolone, prednisolone acetate, prednisolone sodium succinate, prednisolone butylacetate, prednisolone sodium phosphate, halopredone acetate, methylprednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone It may also be used in combination with one or more drugs selected from the group consisting of benzodiazepines, triamcinolone acetate, triamcinolone acetonide, dexamethasone, dexamethasone acetate, dexamethasone sodium phosphate, dexamethasone palmitate, paramethasone acetate, and betamethasone), interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetate, mitoxantrone, azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporine, methotrexate, cladribine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticotropin, mizoribine, tacrolimus, fingolimod, and alemtuzumab.

また、例えば、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を全身性エリテマトーデスの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、上記記載のステロイド薬）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスおよびフィンゴリモド等）およびベリムマブから選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。 Furthermore, for example, when the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention are used for the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of systemic lupus erythematosus, they may be used in combination with one or more drugs selected from steroid drugs (e.g., the steroid drugs described above), immunosuppressants (e.g., cyclosporine, tacrolimus, fingolimod, etc.), and belimumab.

例えば、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等を関節リウマチの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、ステロイド薬（例えば、上記記載のステロイド薬）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、スルファサラジン、ブシラミン、レフルノミド、ミゾリビンおよびタクロリムス等）あるいは抗サイトカイン薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブおよびセルトリズマブ等）およびアバタセプト等から選択される何れか一以上の薬剤と組み合わせて使用してもよい。 For example, when the PD-1/CD19 bispecific antibodies and the like of the present invention are used for the prevention, inhibition of symptom progression, inhibition of recurrence, and/or treatment of rheumatoid arthritis, they may be used in combination with one or more drugs selected from steroid drugs (e.g., the steroid drugs described above), antirheumatic drugs (e.g., methotrexate, sulfasalazine, bucillamine, leflunomide, mizoribine, tacrolimus, etc.), anticytokine drugs (e.g., infliximab, adalimumab, tocilizumab, etanercept, golimumab, certolizumab, etc.), abatacept, etc.

その他の自己免疫疾患の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に適用する場合、本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体等と、上記に記載した他の薬剤の何れか一以上と組み合わせて使用してもよい。 When applied to the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence, and/or treatment of other autoimmune diseases, the PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention may be used in combination with one or more of the other drugs listed above.

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples. Based on the description of the present invention, various changes and modifications may be possible by those skilled in the art, and these changes and modifications are also included in the present invention.

実施例１：組換えヒトPD-1-Fc融合タンパクを用いたMeMo（登録商標）マウスへの免疫
本発明のPD-1に特異的に結合する第一アームを取得する方法として、MeMo（登録商標）マウス（WO2009/157771参照）に組換ヒトPD-1タンパク質を免疫する方法を選択した。MeMo（登録商標）マウスは、非組換ヒト重鎖Ｖ遺伝子領域、Ｄ遺伝子領域およびＪ遺伝子領域ならびに組換ヒトκ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型遺伝子を含む遺伝子断片が、マウス定常領域遺伝子に連結されるように遺伝子改変されたマウスであり、抗体の標的タンパクを直接免疫することによって、多様性を有する重鎖と共通軽鎖からなる抗体を産生させることができる。 Example 1: Immunization of MeMo® Mice with Recombinant Human PD-1-Fc Fusion Protein To obtain the first arm of the present invention that specifically binds to PD-1, we selected a method of immunizing MeMo® mice (see WO2009/157771) with recombinant human PD-1 protein. MeMo® mice are genetically engineered mice that have been ligated with a gene fragment containing unmodified human heavy chain V, D, and J gene regions and a recombinant human κ light chain IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 germline gene, linked to a mouse constant region gene. Direct immunization with antibody target proteins allows the production of antibodies consisting of diverse heavy chains and a common light chain.

12～16週齢の12匹のMeMo（登録商標）マウスに、Gerbu adjuvant MM（Gerbu Biotechnik、型番#3001）を用いてエマルジョン化した、組換ヒトPD-1-Fc融合タンパク質（R&D Systems、型番1086-PD）を14日間隔で各々免疫した。免疫０日目、14日目および28日目に同組換ヒトPD-1-Fc融合タンパク質を皮下投与し、以降のタイミングでは、PBSに溶解した同組換ヒトPD-1-Fc融合タンパク質を皮下投与した。免疫21日目、35日目、56日目、77日目および98日目にヒトPD-1強制発現HEK293T細胞株を用いたフローサイトメトリーにより、血清中抗体価を評価した。1000倍希釈した血清においてヒトPD-1強制発現HEK293T細胞株を染色した場合、コントロールとなるヒトPD-1非発現HEK293T細胞株と比較してMFI値が３倍以上増加したマウスのリンパ組織を、ファージディスプレイ・ライブラリーの構築に用いた。ライブラリー構築に進む基準を満たしたマウスは、抗体価の評価日から３日間、組換PD-1-Fc融合タンパク質で追加免疫し、脾臓およびそ径リンパ節を回収した。ヒトPD-1およびカニクイザルPD-1に対する血清中抗体価が1/100以上、かつ追加免疫によって抗体価が上昇しないマウスも脾臓およびそ径リンパ節を回収した。それらのリンパ組織からRNAを抽出したのち、cDNA合成を行った。 Twelve MeMo® mice, aged 12-16 weeks, were immunized at 14-day intervals with recombinant human PD-1-Fc fusion protein (R&D Systems, product number 1086-PD) emulsified with Gerbu adjuvant MM (Gerbu Biotechnik, product number #3001). The recombinant human PD-1-Fc fusion protein was administered subcutaneously on days 0, 14, and 28 after immunization, with subsequent subcutaneous administration of the recombinant human PD-1-Fc fusion protein dissolved in PBS. Serum antibody titers were assessed by flow cytometry using a human PD-1-overexpressing HEK293T cell line on days 21, 35, 56, 77, and 98 after immunization. Lymphoid tissues from mice that showed a 3-fold or greater increase in MFI when staining human PD-1-expressing HEK293T cell lines with 1:1000 diluted serum compared to control human PD-1-non-expressing HEK293T cell lines were used to construct a phage display library. Mice that met the criteria for library construction were boosted with recombinant PD-1-Fc fusion protein three days after the day of antibody titer assessment, and spleens and inguinal lymph nodes were collected. Spleens and inguinal lymph nodes were also collected from mice whose serum antibody titers against human PD-1 and cynomolgus PD-1 were 1/100 or greater and whose antibody titers did not increase after booster immunization. RNA was extracted from these lymphoid tissues, followed by cDNA synthesis.

実施例２：抗PD-1抗体取得のためのファージディスプレイ・ライブラリーの構築（タンパク免疫）
実施例１にて調製したDNAを使用して、イムノグロブリン重鎖可変領域ファミリーに特異的なプライマーを用いてPCR反応を行った。同PCR産物を制限酵素SfiIとXhoIで切断した後、同制限酵素を用いて切断したファージミドベクター［共通軽鎖をコードする遺伝子（ヒトκ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型遺伝子）を含む］に挿入し、同ライブラリーを構築した。 Example 2: Construction of a phage display library for obtaining anti-PD-1 antibodies (protein immunization)
PCR was performed using primers specific to the immunoglobulin heavy chain variable region family and the DNA prepared in Example 1. The PCR product was cleaved with the restriction enzymes SfiI and XhoI and then inserted into a phagemid vector containing a gene encoding a common light chain (human κ light chain IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 germline gene) that had been cleaved with the same restriction enzymes, to construct the library.

実施例３：抗PD-1抗体のスクリーニング
ヒトPD-1-Fc融合タンパク質、ヒトPD-1-Hisタグ融合タンパク質、カニクイザルPD-1-Hisタグ融合タンパク質またはマウスPD-1-Hisタグ融合タンパク質をコートさせたプレートを用いて、PD-1への結合性に基づいたファージセレクションを実施した。ヒトPD-1-Fc融合タンパク質を用いた場合、ファージとインキュベーションする間、ヒトIgG（SIGMA、型番I4506）を添加することによって、Fc反応性クローンを吸収した。ヒトPD-1、カニクイザルPD-1およびマウスPD-1に結合する結合ファージが濃縮された。カニクイザルPD-1強制発現HEK293T細胞株でのセレクションにより、カニクイザルPD-1に結合するファージが濃縮された。セレクションによって得られたファージで形質転換させた大腸菌株TG1のクローンを取得し、マスタープレートを作製した。 Example 3: Screening of anti-PD-1 antibodies. Phage selection based on PD-1 binding was performed using plates coated with human PD-1-Fc fusion protein, human PD-1-His tag fusion protein, cynomolgus monkey PD-1-His tag fusion protein, or mouse PD-1-His tag fusion protein. When human PD-1-Fc fusion protein was used, Fc-reactive clones were absorbed by adding human IgG (SIGMA, product number I4506) during phage incubation. Phage binding to human PD-1, cynomolgus monkey PD-1, and mouse PD-1 was enriched. Phage binding to cynomolgus monkey PD-1 was enriched by selection in HEK293T cell lines overexpressing cynomolgus monkey PD-1. Phages obtained through selection were transformed with the E. coli strain TG1, and clones were isolated to prepare master plates.

さらに、ヒトPD-1-Fc融合タンパク質を吸着させたプレート上のPD-1への結合性に基づいて、上記セレクションから得られたクローンのペリプラズム抽出物から、ファージセレクションを実施した。なお、選択する基準として、陰性対照ウェル（PBS）で得られたシグナル（OD₄₅₀値）に対して、３倍以上のシグナルが得られたものを陽性クローンとした。 Furthermore, phage selection was performed on periplasmic extracts of the clones obtained from the above selection, based on their binding to PD-1 on plates pre-adsorbed with human PD-1-Fc fusion protein. Positive clones were selected based on a signal (OD ₄₅₀ value) that was at least three times higher than that obtained in the negative control well (PBS).

実施例４：抗PD-1抗体の候補クローンのDNAシークエンス
実施例３のスクリーニングによって取得された陽性クローンの重鎖可変領域遺伝子のDNAシークエンスを実施した。解析されたDNA配列はスーパークラスター（重鎖CDR3が同一の長さであって、同CDR3のアミノ酸配列が70％以上相同である一群）とクラスター（重鎖CDR3のアミノ酸配列が同一である一群）に分類した。数百個のクローンが取得され、それらはスーパークラスターおよびクラスターに分類された。 Example 4: DNA sequencing of anti-PD-1 antibody candidate clones. DNA sequencing of the heavy chain variable region genes of the positive clones obtained by the screening in Example 3 was performed. The analyzed DNA sequences were classified into superclusters (groups of clones with heavy chain CDR3s of the same length and with amino acid sequences of the CDR3s that are 70% or more identical) and clusters (groups of clones with identical heavy chain CDR3 amino acid sequences). Several hundred clones were obtained and classified into superclusters and clusters.

実施例５：PD-1発現細胞に対する結合性評価によるスクリーニング
分類された各々スーパークラスターから、以下の条件を満たす抗PD-1モノクローナル抗体クローンを選別し、単離した。
（１）CDR領域に高頻度に体細胞突然変異が導入され、
（２）使用頻度の高いVHの生殖細胞系列型遺伝子を有し、および
（３）ヒトPD-1-Fc融合タンパク質に対する結合性スクリーニングにおいて高いシグナルが得られた。 Example 5: Screening by assessing binding to PD-1-expressing cells Anti-PD-1 monoclonal antibody clones that fulfilled the following criteria were selected and isolated from each of the classified superclusters.
(1) High frequency somatic mutations are introduced into the CDR regions,
(2) It has a germline gene for a frequently used VH, and (3) it gave a high signal in binding screening against human PD-1-Fc fusion protein.

それらのペリプラズム抽出物に含まれるFabフラグメントを用いて、ヒトPD-1強制発現CHO-S細胞株、カニクイザルPD-1強制発現CHO-S細胞株に対する結合性を抗マウスIgGポリクローナル抗体で検出することにより評価した。評価した117個のクローン（105種のクラスター）のうち、抗PD-1モノクローナル抗体クローンPD1-1、PD1-2、PD1-3およびPD1-4を含む22個のクローンでヒトPD-1発現CHO-S細胞株に対する結合性が認められた。 The Fab fragments contained in these periplasmic extracts were used to evaluate their binding to human PD-1-expressing CHO-S cell lines and cynomolgus monkey PD-1-expressing CHO-S cell lines, detected with an anti-mouse IgG polyclonal antibody. Of the 117 clones (105 clusters) evaluated, 22 clones, including the anti-PD-1 monoclonal antibody clones PD1-1, PD1-2, PD1-3, and PD1-4, were found to bind to the human PD-1-expressing CHO-S cell lines.

実施例６：抗PD-1モノクローナル抗体のアミノ酸置換体の作製
クローンPD1-1およびPD1-4は、その重鎖可変領域のフレームワーク領域４に脱アミド化モチーフ（Asn-Gly）を含む。脱アミド化のリスクを低減したPD-1アームの取得を目的として、この脱アミド化モチーフを変換した変異体を作製した。クローンPD1-4のEUナンバリングシステムによる119番目のアスパラギン（Asn）が、公知の部位特異的変異法により、グルタミンとなるよう改変されたクローンPD1-5を作製し、単離した。同クローンもヒトPD-1強制発現CHO-S細胞に対する結合性はクローンPD1-4と同等であった。 Example 6: Construction of Amino Acid-Substituted Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies Clones PD1-1 and PD1-4 contain a deamidation motif (Asn-Gly) in framework region 4 of their heavy chain variable region. To obtain a PD-1 arm with reduced risk of deamidation, we constructed a mutant by altering this deamidation motif. Clone PD1-5 was constructed and isolated by modifying the asparagine (Asn) at position 119 in the EU numbering system of clone PD1-4 to glutamine using a known site-directed mutagenesis method. This clone also exhibited comparable binding to human PD-1-expressing CHO-S cells.

実施例７：CD19発現プラスミドベクターを用いたMeMo（登録商標）マウスへの免疫
本発明のCD19に特異的に結合する第二アームを取得する方法として、MeMo（登録商標）マウス（WO2009/157771参照）にヒトCD19発現プラスミドベクターおよびカニクイザルCD19発現プラスミドベクターを免疫する方法を選択した。 Example 7: Immunization of MeMo (registered trademark) mice with CD19 expression plasmid vectors As a method for obtaining the second arm of the present invention that specifically binds to CD19, a method was selected in which MeMo (registered trademark) mice (see WO2009/157771) were immunized with a human CD19 expression plasmid vector and a cynomolgus monkey CD19 expression plasmid vector.

MeMo（登録商標）マウスは、非組換ヒト重鎖Ｖ遺伝子領域、Ｄ遺伝子領域およびＪ遺伝子領域ならびに組換ヒトκ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型遺伝子を含む遺伝子断片が、マウス定常領域遺伝子に連結されるように遺伝子改変されたマウスであり、抗体の標的タンパクを発現するプラスミドベクターをMeMo（登録商標）マウスに免疫することによって、多様性を有する重鎖と共通軽鎖からなる抗体を産生させることができる。 MeMo (registered trademark) mice are genetically modified mice in which a gene fragment containing non-recombinant human heavy chain V gene regions, D gene regions, and J gene regions, as well as a recombinant human κ light chain IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 germline gene, is linked to a mouse constant region gene. By immunizing MeMo (registered trademark) mice with a plasmid vector expressing the antibody target protein, antibodies consisting of diverse heavy chains and a common light chain can be produced.

12～16週齢の12匹のMeMo（登録商標）マウスに、ヒトCD19発現プラスミドベクターおよび／またはカニクイザルCD19発現プラスミドベクターを各々または交互に免疫した。発現プラスミドベクターは、免疫０日目、３日目、６日目、14日目、17日目、28日目、31日目、42日目、49日目、63日目および／または70日目に投与した。ヒトCD19発現細胞株を用いたフローサイトメトリーにより、血清中抗体価を評価した。100倍希釈した血清においてヒトCD19発現細胞株を染色した場合、コントロールとなるヒトCD19非発現細胞株と比較してMFI値が３倍以上増加したマウスのリンパ組織を、ファージディスプレイ・ライブラリーの構築に用いた。ライブラリー構築に進む基準を満たしたマウスは、追加免疫した後、脾臓およびそ径リンパ節を回収した。それらのリンパ組織からRNAを抽出したのち、IgG定常領域特異的プライマーを用いた逆転写反応によりcDNA合成を行った。 Twelve MeMo® mice, aged 12 to 16 weeks, were immunized with a human CD19 expression plasmid vector and/or a cynomolgus monkey CD19 expression plasmid vector, either individually or alternately. The expression plasmid vectors were administered on days 0, 3, 6, 14, 17, 28, 31, 42, 49, 63, and/or 70 after immunization. Serum antibody titers were assessed by flow cytometry using a human CD19-expressing cell line. Lymphoid tissues from mice that showed a 3-fold or greater increase in MFI when stained with 1:100 diluted serum compared to a control human CD19-non-expressing cell line were used to construct a phage display library. After booster immunization, spleens and inguinal lymph nodes were harvested from mice that met the criteria for library construction. RNA was extracted from the lymphoid tissues, and cDNA was synthesized by reverse transcription using IgG constant region-specific primers.

実施例８：抗CD19抗体取得のためのファージディスプレイ・ライブラリーの構築
実施例７にて調製したDNAからイムノグロブリン重鎖可変領域ファミリーに特異的なプライマーを用いてPCR反応を行った。同PCR産物を制限酵素で切断した後、当該制限酵素を用いて切断したファージミドベクター［共通軽鎖をコードする遺伝子（ヒトκ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型遺伝子）を含む］に挿入し、同ライブラリーを構築した。 Example 8: Construction of a phage display library for obtaining anti-CD19 antibodies PCR was performed using primers specific to the immunoglobulin heavy chain variable region family from the DNA prepared in Example 7. The PCR products were cleaved with restriction enzymes and then inserted into a phagemid vector [containing a gene encoding a common light chain (human κ light chain IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 germline gene)] that had also been cleaved with the same restriction enzymes, to construct the library.

実施例９：抗CD19抗体のスクリーニング
ヒトCD19-Fc融合タンパク質（R&D systems、型番9269-CD）、カニクイザルCD19-Fc融合タンパク質（NovoPro Bioscience、型番504385）、ヒトＢ細胞株RajiまたはカニクイザルCD19強制発現HEK293T細胞株を用いて、CD19への結合性に基づいたファージセレクションを実施した。セレクションによって得られたファージで形質転換させた大腸菌株TG1のクローンを取得し、マスタープレートを作製した。なお、選択基準として、陰性対照で得られたシグナル（OD₄₅₀値またはMFI）に対して、３倍以上のシグナルが得られたものを陽性クローンとした。 Example 9: Screening of anti-CD19 antibodies. Phage selection based on CD19 binding was performed using human CD19-Fc fusion protein (R&D Systems, Cat. No. 9269-CD), cynomolgus monkey CD19-Fc fusion protein (NovoPro Bioscience, Cat. No. 504385), the human B cell line Raji, or the HEK293T cell line overexpressing cynomolgus monkey CD19. Clones of the E. coli strain TG1 transformed with the phages obtained through selection were isolated and used to prepare master plates. Positive clones were defined as clones that exhibited a signal (OD ₄₅₀ or MFI) three times higher than that obtained with the negative control.

実施例１０：抗CD19抗体の候補クローンのDNAシークエンス
実施例９のスクリーニングによって取得された陽性クローンの重鎖可変領域遺伝子のDNAシークエンスを実施した。解析されたDNA配列はスーパークラスター（重鎖CDR3が同一の長さであって、重鎖可変領域のアミノ酸配列が相互に70％以上相同である一群）とクラスター（重鎖CDR3および重鎖可変領域のアミノ酸配列が各々相互に同一である一群）に分類した。 Example 10: DNA sequencing of anti-CD19 antibody candidate clones DNA sequencing of the heavy chain variable region genes of the positive clones obtained by the screening in Example 9 was performed. The analyzed DNA sequences were classified into superclusters (groups in which the heavy chain CDR3s are the same length and the amino acid sequences of the heavy chain variable regions are 70% or more identical to each other) and clusters (groups in which the amino acid sequences of the heavy chain CDR3 and heavy chain variable regions are identical to each other).

初回のスクリーニングにおいて、数百個のクローンが取得され、それらはスーパークラスター、クラスターおよび４種の生殖細胞系列に分類された。２回目のスクリーニングにおいて、数百個のクローンが取得され、スーパークラスター、クラスターおよび８種の生殖細胞系列に分類された。その内、１９種のスーパークラスターが初回のスクリーニングとは異なっていた。 In the first screening, several hundred clones were obtained and classified into superclusters, clusters, and four germline types. In the second screening, several hundred clones were obtained and classified into superclusters, clusters, and eight germline types. Of these, 19 superclusters were different from those in the first screening.

実施例１１：CD19に対する結合性評価によるスクリーニング
分類された各スーパークラスターから、以下の条件を満たす抗CD19モノクローナル抗体クローンを選別し、単離した。
（１）CDR領域に高頻度に体細胞突然変異が導入され、
（２）使用頻度の高いVHの生殖細胞系列型遺伝子を有し、および
（３）CD19に対する結合性スクリーニングにおいて高いシグナルが得られた。 Example 11: Screening by evaluation of binding to CD19 Anti-CD19 monoclonal antibody clones that fulfilled the following conditions were selected and isolated from each classified supercluster.
(1) High frequency somatic mutations are introduced into the CDR regions,
(2) It has a germline gene for a frequently used VH, and (3) it gave a high signal in a binding screening against CD19.

それらのペリプラズム抽出物に含まれるFabフラグメントを用いて、CD19に対する結合性を評価した。 The Fab fragments contained in these periplasmic extracts were used to assess their binding to CD19.

評価したクローンのうち、抗CD19モノクローナル抗体クローンCD19-1、CD19-2、CD19-3、CD19-4およびCD19-5を含む複数のクローンにヒトCD19発現細胞株に対する結合性が認められた。 Of the clones evaluated, several clones, including the anti-CD19 monoclonal antibody clones CD19-1, CD19-2, CD19-3, CD19-4, and CD19-5, were found to bind to human CD19-expressing cell lines.

実施例１２：PD-1/CD19二重特異性抗体の調製
PD-1に特異的に結合する第一アームの各々の重鎖を発現する発現ベクターは、実施例５および実施例６にて選択した抗PD-1モノクローナル抗体クローンPD1-1～PD1-5の各々の重鎖可変領域をコードするDNAを、IgG₁重鎖定常領域をコードするDNAに各々連結して作製した。一方、CD19に特異的に結合する第二アームの重鎖を発現する発現ベクターは、実施例１１にて選択した抗CD19モノクローナル抗体クローンCD19-1～CD19-5の重鎖可変領域をコードするDNAを、IgG₁重鎖定常領域をコードするDNAに連結して作製した。ここで、それらの重鎖定常領域を発現する遺伝子には、PD-1に特異的に結合する第一アームの場合には、L351D/L368E変異（DE変異）を有するFc領域を発現するものを使用し、CD19に特異的に結合する第二アームの場合には、L351K/T366K変異（KK変異）を有するFc領域を発現するものを使用した。これら発現ベクターには、IGVK1-39/JK1共通軽鎖もともに発現するように、これをコードする遺伝子を含むように構築された。さらに、これらの重鎖定常領域を発現する遺伝子には、各々、Fcエフェクター活性を消失させるため、重鎖定常領域の235番目ロイシンがグリシンに、236番目グリシンがアルギニンに置換されて発現するように改変されており、さらに、翻訳後のプロセシングを回避するため、重鎖定常領域Ｃ末端447番目のリジンが欠失するよう改変されたものを使用した。これら発現ベクターを、ともに、Free Style 293F細胞に遺伝子導入し、培養上清中に抗体を産生させた。培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにて処理することにより、本発明のPD-1/CD19二重特異性モノクローナル抗体である、クローンCD19-1(Bi)、クローンCD19-2(Bi)、クローンCD19-3(Bi)、クローンCD19-4(Bi)およびクローンCD19-5(Bi)を各々精製した。 Example 12: Preparation of PD-1/CD19 bispecific antibodies
Expression vectors expressing the heavy chains of the first arm that specifically bind to PD-1 were prepared by ligating DNA encoding the heavy chain variable regions of the anti-PD-1 monoclonal antibody clones PD1-1 to PD1-5 selected in Examples 5 and 6 to DNA encoding the _IgG1 heavy chain constant region. Expression vectors expressing the heavy chains of the second arm that specifically bind to CD19 were prepared by ligating DNA encoding the heavy chain variable regions of the anti-CD19 monoclonal antibody clones CD19-1 to CD19-5 selected in Example 11 to DNA encoding the _IgG1 heavy chain constant region. The genes expressing these heavy chain constant regions were those expressing an Fc region with L351D/L368E mutations (DE mutations) for the first arm that specifically binds to PD-1, and those expressing an Fc region with L351K/T366K mutations (KK mutations) for the second arm that specifically binds to CD19. These expression vectors were constructed to contain a gene encoding the IGVK1-39/JK1 common light chain for co-expression. Furthermore, the genes expressing these heavy chain constant regions were modified to replace leucine at position 235 with glycine and glycine at position 236 with arginine to eliminate Fc effector activity. Furthermore, the heavy chain constant region was modified to lack lysine at position 447 at the C-terminus to prevent post-translational processing. These expression vectors were transfected into FreeStyle 293F cells, and antibodies were produced in the culture supernatant. The culture supernatants were collected and purified by protein A affinity chromatography to obtain the PD-1/CD19 bispecific monoclonal antibodies of the present invention: clone CD19-1(Bi), clone CD19-2(Bi), clone CD19-3(Bi), clone CD19-4(Bi), and clone CD19-5(Bi).

なお、これらPD-1/CD19二重特異性抗体クローンは、その作製において使用された抗CD19モノクローナル抗体クローンCD19-1、CD19-2、CD19-3、CD19-4およびCD19-5に由来する、CD19に特異的に結合する第二アームを有する点において、それら抗CD19モノクローナル抗体クローンに各々対応している。また、これらPD-1/CD19二重特異性抗体クローンは、何れもPD1-5に由来する、PD-1に特異的に結合する第一アームを有する。 These PD-1/CD19 bispecific antibody clones correspond to the anti-CD19 monoclonal antibody clones CD19-1, CD19-2, CD19-3, CD19-4, and CD19-5 used in their production, in that they each have a second arm that specifically binds to CD19, which is derived from the anti-CD19 monoclonal antibody clones CD19-1, CD19-2, CD19-3, CD19-4, and CD19-5. Furthermore, all of these PD-1/CD19 bispecific antibody clones have a first arm that specifically binds to PD-1, which is derived from PD1-5.

実施例１３：抗CD19モノクローナル抗体の変異体およびそれらに対応するPD-1/CD19二重特異性抗体の作製
実施例１２において作製したPD-1/CD19二重特異性抗体クローンは、医薬品化のためにスケールアップされた生産工程においては、第一アーム重鎖／軽鎖複合体、第二アーム重鎖／軽鎖複合体および／またはそれらの各ホモダイマーである副産物との分離精製が十分に達成できないおそれがある。そのため、陽イオン交換クロマトグラフィー精製時において、当該副産物からの当該二重特異性抗体の分離向上を目的とし、等電点を高めた抗CD19モノクローナル抗体のアミノ酸変異体を作製した。 Example 13: Preparation of anti-CD19 monoclonal antibody mutants and their corresponding PD-1/CD19 bispecific antibodies. The PD-1/CD19 bispecific antibody clones prepared in Example 12 may not be sufficiently separated and purified from the by-products, i.e., the first arm heavy chain/light chain complex, the second arm heavy chain/light chain complex, and/or their respective homodimers, during a scaled-up production process for pharmaceutical production. Therefore, to improve the separation of the bispecific antibody from the by-products during cation exchange chromatography purification, amino acid mutants of the anti-CD19 monoclonal antibody with increased isoelectric points were prepared.

クローンCD19-5のVHのアミノ酸配列を表す配列番号３０における114番目のグルタミンを、公知の部位特異的変異法によりアルギニンに置換した変異体を作製した。なお、本発明において、その変異体を「CD19-6」と命名した。また、各抗体の等電点は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェアGenetyx（株式会社ゼネティクス）を用いて計算した。 A mutant was created in which glutamine at position 114 in SEQ ID NO: 30, which represents the amino acid sequence of the VH of clone CD19-5, was replaced with arginine using known site-directed mutagenesis. In the present invention, this mutant was named "CD19-6." The isoelectric point of each antibody was calculated using gene and amino acid sequence analysis software Genetyx (Genetyx Corporation).

さらに、CD19-6のVHを有する重鎖のＣ末端（但し、Ｃ末端アミノ酸であるリシンを有する。）に、グリシンおよび配列番号６７～７０で表されるペプチドが各々付加された形態の各変異体（以下、これらをまとめて「CD19-6/C末端ペプチド付加体」と記載する。）を、公知の遺伝子改変手法により作製した。なお、本発明において、CD19-6の当該Ｃ末端に、配列番号６７で表されるペプチドが付加された形態の変異体を、「CD19-7」と命名した。 Furthermore, mutants in which glycine and the peptides represented by SEQ ID NOs: 67 to 70 were added to the C-terminus of the heavy chain having the VH of CD19-6 (but still containing the C-terminal amino acid lysine) were prepared by known gene modification techniques (hereinafter collectively referred to as "CD19-6/C-terminal peptide adducts"). In the present invention, the mutant in which the peptide represented by SEQ ID NO: 67 was added to the C-terminus of CD19-6 was designated "CD19-7."

実施例１２と同様の手法に従い、これら抗CD19モノクローナル抗体の変異体をコードする各DNAとクローンPD1-5をコードするDNAが各々挿入された同実施例記載の各発現ベクターを、Free Style 293F細胞に遺伝子導入して培養上清中に抗体を産生させた。培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにて処理することにより、本実施例において作製された各変異体に由来する本発明の二重特異性抗体を各々精製した。これらのうち、CD19-6に由来する同二重特異性抗体を「CD19-6(Bi)」とし、CD19-7に由来する同二重特異性抗体クローンを「CD19-7(Bi)」と命名した。 Following a similar procedure to Example 12, the expression vectors described in that Example, into which DNA encoding these anti-CD19 monoclonal antibody mutants and DNA encoding clone PD1-5 had been inserted, were transfected into FreeStyle 293F cells, and antibodies were produced in the culture supernatant. The culture supernatant was collected and subjected to protein A affinity chromatography to purify the bispecific antibodies of the present invention derived from each of the mutants produced in this Example. Of these, the bispecific antibody derived from CD19-6 was designated "CD19-6(Bi)," and the bispecific antibody clone derived from CD19-7 was designated "CD19-7(Bi)."

実施例１４：PD-1/CD19二重特異性抗体と副産物との精製分離の検討
実施例１２および１３において各々作製されたPD-1/CD19二重特異性抗体について、それらの製造において生成されてくると懸念される副産物との精製分離の成否について検討した。 Example 14: Investigation of purification and separation of PD-1/CD19 bispecific antibodies and by-products The PD-1/CD19 bispecific antibodies produced in Examples 12 and 13 were investigated to determine whether they could be purified and separated from by-products that may be generated during their production.

実施例１２および１３において各々回収した同二重特異性抗体が含まれる培養上清を別途、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにて処理することにより、同二重特異性抗体と副産物に相当する抗PD-1抗体および抗CD19抗体を各々精製した。 The culture supernatants containing the bispecific antibodies recovered in Examples 12 and 13 were separately subjected to protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography to purify the bispecific antibodies and the by-product anti-PD-1 and anti-CD19 antibodies, respectively.

これら各精製抗体が含まれる溶媒を、pH6.0となるように限外濾過法によりバッファー置換した。バッファーＡ（pH7.0）を用いて平衡化した陽イオン交換カラムTSKgel SP-STAT Column（東ソー、型番0021964）にバッファー置換後の各精製抗体をアプライした。1 mol/L塩化ナトリウムを含むバッファーＢ（pH7.0）を用いた塩グラジエントによって、カラムに結合した各精製抗体を溶出した。なお、移動相の流速は0.5 mL/分、溶出はバッファーＡからバッファーＢへのリニアグラジエントとし、各精製抗体をアプライ開始後０～10分はバッファーＢを０％、10～40分にかけてバッファーＢを０～100％に直線的に増やし、40～50分はバッファーＢを100％とした。 The solvent containing each purified antibody was buffer-exchanged using ultrafiltration to a pH of 6.0. After buffer exchange, each purified antibody was applied to a cation exchange column, TSKgel SP-STAT Column (Tosoh, model number 0021964), equilibrated with buffer A (pH 7.0). Each purified antibody bound to the column was eluted using a salt gradient with buffer B (pH 7.0) containing 1 mol/L sodium chloride. The mobile phase flow rate was 0.5 mL/min, and elution was performed with a linear gradient from buffer A to buffer B. Buffer B was 0% from 0 to 10 minutes after application of each purified antibody, then linearly increased from 0 to 100% from 10 to 40 minutes, and then maintained at 100% buffer B from 40 to 50 minutes.

クローンCD19-2（等電点：8.32）、CD19-5（等電点：8.40）、CD19-6（等電点：8.49）およびCD19-7（等電点：8.75）の陽イオン交換カラムにおける保持時間（分）は、各々15.167、15.185、15.749および17.521であり、クローンCD19-6およびCD19-7については保持時間が延長した。一方、クローンPD1-3（等電点：7.67）およびPD1-5（等電点：7.52）は陽イオン交換カラムに結合せず溶出した。 The retention times (min) on a cation exchange column for clones CD19-2 (isoelectric point: 8.32), CD19-5 (isoelectric point: 8.40), CD19-6 (isoelectric point: 8.49), and CD19-7 (isoelectric point: 8.75) were 15.167, 15.185, 15.749, and 17.521, respectively. Clones CD19-6 and CD19-7 had longer retention times. On the other hand, clones PD1-3 (isoelectric point: 7.67) and PD1-5 (isoelectric point: 7.52) did not bind to the cation exchange column and eluted.

一方、PD-1/CD19二重特異性抗体クローンCD19-2(Bi)およびCD19-5(Bi)は陽イオン交換カラムに結合せず溶出したが、クローンCD19-6(Bi)およびCD19-7(Bi)は、その保持時間（分）13.715および14.955であった。 On the other hand, the PD-1/CD19 bispecific antibody clones CD19-2(Bi) and CD19-5(Bi) did not bind to the cation exchange column and eluted, while the retention times (min) of clones CD19-6(Bi) and CD19-7(Bi) were 13.715 and 14.955.

以上のように、第二アームにおけるアミノ酸置換あるいはその重鎖Ｃ末端への特定のペプチドの付加により等電点を高めることで、陽イオン交換クロマトグラフィー精製時において、目的物である本発明の二重特異性抗体と副産物である抗PD-1抗体および抗CD19抗体との分離向上が図られ、当該副産物の混入が極めて低減された本発明の二重特異性抗体の提供が可能となった。 As described above, by increasing the isoelectric point through amino acid substitution in the second arm or addition of a specific peptide to the C-terminus of the heavy chain, improved separation of the target bispecific antibody of the present invention from the by-products, anti-PD-1 antibody and anti-CD19 antibody, during purification by cation exchange chromatography has been achieved, making it possible to provide bispecific antibodies of the present invention with extremely reduced contamination by these by-products.

実施例１５：PD-1/CD19二重特異性抗体の結合性評価
ヒトIgG1-Fc融合ヒトPD-1細胞外領域組換タンパク質（R&D systems、型番1086-PD）を用いたBiacore測定にて、実施例１２および１３において取得したPD-1/CD19二重特異性モノクローナル抗体の第一アームのPD-1組換タンパク質への結合親和性を評価した。なお、当該組換タンパク質の固定化には、Series S Sensor Chip CM5センサーチップ（GEヘルスケア、型番29-1049-88）を使用した。 Example 15: Evaluation of binding affinity of PD-1/CD19 bispecific antibodies The binding affinity of the first arm of the PD-1/CD19 bispecific monoclonal antibodies obtained in Examples 12 and 13 to the PD-1 recombinant protein was evaluated by Biacore analysis using a human IgG1-Fc fused human PD-1 extracellular domain recombinant protein (R&D systems, model no. 1086-PD). The recombinant protein was immobilized on a Series S Sensor Chip CM5 sensor chip (GE Healthcare, model no. 29-1049-88).

同様に、ヒトIgG1-Fc融合ヒトCD19細胞外領域組換タンパク質（R&D systems、型番9269-CD）を用いたBiacore測定にて、同抗体の第二アームのCD19結合親和性を評価した。各クローンの第一アームのPD-1への結合親和性（Kd値）ならびに第二アームのCD19への結合親和性を図１１に示す。CD19-6(Bi)のPD-1およびCD19への各結合親和性は、実施例１３のアミノ酸置換を受けていない構造のCD19-5(Bi)の活性に比べ向上していることが確認された。 Similarly, the CD19 binding affinity of the second arm of the antibody was evaluated by Biacore analysis using a human IgG1-Fc fused human CD19 extracellular domain recombinant protein (R&D systems, product number 9269-CD). The binding affinity (Kd value) of the first arm of each clone to PD-1 and the binding affinity of the second arm to CD19 are shown in Figure 11. The binding affinity of CD19-6(Bi) to PD-1 and CD19 was confirmed to be improved compared to the activity of CD19-5(Bi), which has a structure without amino acid substitutions as described in Example 13.

実施例１６：PD-1/CD19二重特異性抗体の結合性確認
実施例１２および１３において取得したPD-1/CD19二重特異性抗体がヒトPD-1、カニクイザルPD-1、ヒトCD19およびカニクイザルCD19に各々特異的に結合することを確認した。ヒトPD-1強制発現CHO-S細胞株、カニクイザルPD-1強制発現CHO-S細胞株、CHO-S細胞株、ヒトCD19強制発現CHO-K1細胞株、カニクイザルCD19強制発現CHO-K1細胞株およびCHO-K1細胞株に対して、クローンCD19-1(Bi)～CD19-6(Bi)を各々添加し、氷上にて20分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、PE標識ヤギ抗ヒトIgG-Fc F(ab′)₂フラグメント抗体（ThermoFisher、型番H10104）100μLを添加して氷上にて20分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーにて同抗体の第一アームのPD-1結合性および第二アームのCD19結合性を評価した。当該アッセイの結果を図１２～図１６に示す。 Example 16: Confirmation of Binding Properties of PD-1/CD19 Bispecific Antibodies The PD-1/CD19 bispecific antibodies obtained in Examples 12 and 13 were confirmed to specifically bind to human PD-1, cynomolgus monkey PD-1, human CD19, and cynomolgus monkey CD19, respectively. Clones CD19-1(Bi) to CD19-6(Bi) were added to human PD-1-expressing CHO-S cell lines, cynomolgus monkey PD-1-expressing CHO-S cell lines, CHO-S cell lines, human CD19-expressing CHO-K1 cell lines, cynomolgus monkey CD19-expressing CHO-K1 cell lines, and CHO-K1 cell lines, respectively, and incubated on ice for 20 minutes. After washing, the cells were added with 100 μL of PE-labeled goat anti-human IgG-Fc F(ab') ₂ fragment antibody (ThermoFisher, product number H10104) and incubated on ice for 20 minutes. After washing the cells, the PD-1 binding of the first arm and the CD19 binding of the second arm of the antibody were assessed by flow cytometry. The results of the assay are shown in Figures 12 to 16.

いずれのクローンもヒトPD-1、カニクイザルPD-1、ヒトCD19およびカニクイザルCD19に結合した。なお、この実験系での非特異的結合は検出されなかった。 All clones bound to human PD-1, cynomolgus monkey PD-1, human CD19, and cynomolgus monkey CD19. No nonspecific binding was detected in this experimental system.

実施例１２において取得したPD-1/CD19二重特異性モノクローナル抗体がPD-1およびCD19に同時に各々特異的に結合することを確認した。まず、ヒトCD19強制発現CHO-K1細胞株およびCHO-K1細胞株に対して、クローンCD19-1(Bi)～CD19-5(Bi)を各々添加し、氷上にて20分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、6×Hisタグ融合ヒトPD-1細胞外領域組換タンパク質（R&D systems、型番8986-PD）100μLを添加して氷上にて20分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、AlexaFluor488標識マウス抗Hisタグ抗体（MBL、型番D291-A48）100μLを添加して氷上にて２０分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーにてヒトPD-1細胞外領域組換タンパク質の結合量を評価した。当該アッセイの結果を図１７に示す。 The PD-1/CD19 bispecific monoclonal antibody obtained in Example 12 was confirmed to simultaneously and specifically bind to PD-1 and CD19. First, clones CD19-1(Bi) to CD19-5(Bi) were added to a human CD19-overexpressing CHO-K1 cell line and a CHO-K1 cell line, respectively, and incubated on ice for 20 minutes. After washing, 100 μL of 6xHis-tagged human PD-1 extracellular domain recombinant protein (R&D systems, product number 8986-PD) was added and incubated on ice for 20 minutes. After washing, 100 μL of AlexaFluor488-labeled mouse anti-His tag antibody (MBL, product number D291-A48) was added and incubated on ice for 20 minutes. After washing, the amount of binding of the human PD-1 extracellular domain recombinant protein was assessed by flow cytometry. The assay results are shown in Figure 17.

いずれのクローンもPD-1およびCD19に同時に結合した。なお、この実験系での非特異的結合は検出されなかった。 All clones simultaneously bound to PD-1 and CD19. Furthermore, no nonspecific binding was detected in this experimental system.

実施例１７：PD-1/CD19二重特異性抗体の第一アームの結合特性評価
実施例１２において取得したPD-1/CD19二重特異性抗体の第一アームのPD-1/PD-L1結合への影響を評価するため、同二重特異性抗体クローンと可溶性PD-L1組換タンパク質のPD-1への結合に関する競合結合アッセイを行った。まず、ヒトPD-1強制発現CHO-S細胞株に対してクローンCD19-1(Bi)～CD19-5(Bi)、ニボルマブおよび抗ヒトPD-1抗体J105（Immunology Letters, 2002, Vol.83, Issue 3, p.215-220）を氷上にて各々添加した。さらに、ビオチン標識用キット（同仁化学研究所、型番LK03）を用いてビオチン化した可溶性PD-L1組換タンパク質（R&D systems、型番156-B7）を氷上にて添加した。細胞を洗浄した後、APC標識ストレプトアビジン（BioLegend、型番405207）を氷上にて添加した。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーにて可溶性PD-L1組換タンパク質の結合量を評価した。その結果を図１８に示す。 Example 17: Evaluation of the binding characteristics of the first arm of the PD-1/CD19 bispecific antibody To evaluate the effect of the first arm of the PD-1/CD19 bispecific antibody obtained in Example 12 on PD-1/PD-L1 binding, a competitive binding assay was performed to examine the binding of the bispecific antibody clone and soluble PD-L1 recombinant protein to PD-1. First, clones CD19-1(Bi) to CD19-5(Bi), nivolumab, and the anti-human PD-1 antibody J105 (Immunology Letters, 2002, Vol. 83, Issue 3, pp. 215-220) were added to a human PD-1-expressing CHO-S cell line on ice. Next, soluble PD-L1 recombinant protein (R&D systems, product number 156-B7) biotinylated using a biotin labeling kit (Dojindo Laboratories, product number LK03) was added on ice. After washing the cells, APC-conjugated streptavidin (BioLegend, product number 405207) was added on ice. After washing the cells, the amount of soluble PD-L1 recombinant protein binding was assessed by flow cytometry. The results are shown in Figure 18.

クローンCD19-1(Bi)～CD19-5(Bi)は、PD-1に対する可溶性PD-L1組換タンパク質の結合を許容した。一方、ニボルマブおよびJ105は、同条件でPD-1に対する可溶性PD-L1組換タンパク質の結合を完全に阻害した。 Clones CD19-1(Bi) to CD19-5(Bi) allowed soluble PD-L1 recombinant protein to bind to PD-1. On the other hand, nivolumab and J105 completely inhibited the binding of soluble PD-L1 recombinant protein to PD-1 under the same conditions.

また、実施例５において取得された抗PD-1モノクローナル抗体クローンPD1-1～PD1-4を各々第一アームとした二重特異性抗体も、同様の評価により、PD-1に対する可溶性PD-L1組換タンパク質の結合を許容することが確認された。 In addition, similar evaluation of bispecific antibodies using the anti-PD-1 monoclonal antibody clones PD1-1 to PD1-4 obtained in Example 5 as the first arm confirmed that they allowed soluble PD-L1 recombinant protein to bind to PD-1.

実施例１８：PD-1/CD19二重特異性抗体の活性化Ｂ細胞に対するインビトロ抑制作用
健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）から、B Cell Isolation Kit II, human（Miltenyi Biotec、型番130-091-151）によって分離したＢ細胞を用いて、ヒトIgM産生に対する抑制作用を評価した。細胞培養プレートにヒトＢ細胞を播種し、抗ヒトCD79B抗体（LifeSpan Biosciences、型番LS-C134648）、ヒトCD40L組換タンパク質（Enzo Life Sciences、型番ALX-522-110）、ヒトIL-21組換タンパク質（R&D systems、型番8879-IL）を添加して、活性化処置を行った。クローンCD19-1(Bi)～CD19-5(Bi)またはコントロール抗体を処置し、活性化処置後の培養上清中に含まれるIgMをELISA法（ThermoFisher、型番BMS2098）にて定量した。その結果を図１９に示す。クローンCD19-1(Bi)～CD19-5(Bi)は、何れもIgM産生を抑制した。なお、図中のIgM産生量（ng/mL）は、平均値±標準誤差（N=4）で示した。 Example 18: In vitro inhibitory effect of PD-1/CD19 bispecific antibodies on activated B cells. The inhibitory effect on human IgM production was evaluated using B cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (LONZA, product number CC-2702) derived from healthy individuals using the B Cell Isolation Kit II, human (Miltenyi Biotec, product number 130-091-151). Human B cells were seeded on cell culture plates and activated with anti-human CD79B antibody (LifeSpan Biosciences, product number LS-C134648), human CD40L recombinant protein (Enzo Life Sciences, product number ALX-522-110), and human IL-21 recombinant protein (R&D systems, product number 8879-IL). After treatment with clones CD19-1(Bi) to CD19-5(Bi) or a control antibody, the IgM content in the culture supernatant after activation was quantified by ELISA (ThermoFisher, model number BMS2098). The results are shown in Figure 19. All clones CD19-1(Bi) to CD19-5(Bi) suppressed IgM production. The IgM production levels (ng/mL) in the figure are shown as mean ± standard error (N = 4).

実施例１９：PD-1/CD19二重特異性抗体の活性化Ｂ細胞に対するインビボ抑制作用
健常人由来末梢血単核細胞（LONZA、型番CC-2702）を移植したNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJマウス（以下、NSGマウスと略記する。）を用いて、ヒトIgG₂産生に対する抑制作用を評価した。NSGマウス１匹当たり1×10⁷個の健常人由来末梢血単核細胞を移植した。移植３日目、７日目、10日目、14日目および17日目に、クローンCD19-1(Bi)～CD19-4(Bi)またはコントロール抗体を3 mg/kgの投与量で１日１回各々腹腔内投与した。移植21日目に尾静脈より採血を行い、血清を調製した。一方、クローンCD19-5(Bi)およびCD19-6(Bi)については、移植３日目、７日目および10日目に、同様の用法用量にて各々腹腔内投与した。この際も並行してコントロール抗体を腹腔内投与した。移植14日目に尾静脈より採血を行い、血清を調製した。血清中に含まれるヒトIgG₂をELISA法（ThermoFisher、型番BMS2093）にて定量した。図２０および２１にその結果を示す。クローンCD19-1(Bi)～CD19-6(Bi)は、何れもIgG₂産生を抑制した。なお、図中のIgG₂産生量（μｇ／ｍＬ）は、平均値±標準誤差（N=4～8）で示した。 Example 19: In vivo inhibitory effect of PD-1/CD19 bispecific antibodies on activated B cells. The inhibitory effect on human IgG2 production was evaluated using NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ mice (hereinafter referred to as NSG mice) transplanted with peripheral blood mononuclear cells (LONZA, model number CC- ₂₇₀₂ ) derived from healthy individuals. Peripheral blood mononuclear cells derived from healthy individuals were transplanted at a rate of 1 x 10 per NSG mouse. On days 3, 7, ¹⁰ , 14, and 17 after transplantation, clones CD19-1(Bi) to CD19-4(Bi) or control antibodies were intraperitoneally administered once daily at a dose of 3 mg/kg. Blood was collected from the tail vein on day 21 after transplantation, and serum was prepared. On the other hand, clones CD19-5(Bi) and CD19-6(Bi) were administered intraperitoneally at the same doses on days 3, 7, and 10 after transplantation. A control antibody was also administered intraperitoneally. Blood was collected from the tail vein on day 14 after transplantation, and serum was prepared. Human _IgG2 in the serum was quantified by ELISA (ThermoFisher, model number BMS2093). The results are shown in Figures 20 and 21. Clones CD19-1(Bi) to CD19-6(Bi) all suppressed _IgG2 production. The _IgG2 production levels (μg/mL) in the figures are shown as mean ± standard error (N = 4–8).

実施例２０：PD-1/CD19二重特異性抗体のPD-1への結合に対する交差競合性の評価
PD-1/CD19二重特異性抗体の作製に使用される抗PD-1モノクローナル抗体の各クローンPD1-1～PD1-5を第一アームとした二重特異性抗体のPD-1への結合に対する交差競合性を評価するため、競合結合アッセイを行った。 Example 20: Evaluation of cross-competition of PD-1/CD19 bispecific antibodies for binding to PD-1
A competitive binding assay was performed to evaluate the cross-competitive ability of bispecific antibodies with anti-PD-1 monoclonal antibody clones PD1-1 to PD1-5 used in the generation of PD-1/CD19 bispecific antibodies as the first arm for binding to PD-1.

まず、ヒトPD-1発現CHO-S細胞株に対して、クローンPD1-5を第一アームとした二重特異性抗体を氷上にて添加した。さらに、ビオチン標識したクローンPD1-1～PD1-5を各々第一アームとした二重特異性抗体を各々添加し、氷上にてインキュベートした。細胞を洗浄した後、PE標識ストレプトアビジン（BD Pharmingen，型番554061）を添加して氷上にてインキュベートした。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーにてビオチン標識した同抗体の結合量を評価した。 First, a bispecific antibody with clone PD1-5 as the first arm was added to a human PD-1-expressing CHO-S cell line on ice. Next, biotin-labeled bispecific antibodies with clones PD1-1 to PD1-5 as the first arm were added, respectively, and incubated on ice. After washing the cells, PE-labeled streptavidin (BD Pharmingen, product number 554061) was added and incubated on ice. After washing the cells, the amount of binding of the biotin-labeled antibody was assessed by flow cytometry.

クローンPD1-5を第一アームとした二重特異性抗体は、クローンPD1-1～PD1-4を各々第一アームとした同抗体のPD-1への結合を阻害し、それらのPD-1への結合に対して交差競合することが確認された。 A bispecific antibody with clone PD1-5 as the first arm was confirmed to inhibit the binding of the same antibodies with clones PD1-1 to PD1-4 as the first arm to PD-1, and to cross-compete for their binding to PD-1.

実施例２１：ヒト末梢血単核細からのサイトカイン放出に対する、PD-1/CD19二重特異性抗体のインビトロ作用の評価
PD-1/CD19二重特異性抗体のサイトカイン放出活性を解析することを目的として、本発明の二重特異性抗体クローンおよびマウス抗ヒトCD3抗体OKT3（BioLegend、型番317304）のヒト末梢血単核細胞（以下、ヒトPBMC）への添加実験を各々実施した。 Example 21: Evaluation of the in vitro effect of PD-1/CD19 bispecific antibodies on cytokine release from human peripheral blood mononuclear cells
To analyze the cytokine-releasing activity of PD-1/CD19 bispecific antibodies, we performed experiments in which the bispecific antibody clones of the present invention and the mouse anti-human CD3 antibody OKT3 (BioLegend, product number 317304) were added to human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).

ヒトPBMC（LONZA、型番CC-2702）に、クローンCD19-6(Bi)またはOKT3を添加し、培養を行った。サイトメトリックビーズアレイ（BD Biosciences、型番551809）を用いたフローサイトメトリーにて培養上清中に含まれるIL-2を定量した。その結果を図２２に示す。なお、図中のIL-2産生量（pg/mL）は、平均値±標準誤差（N=3）で示した。 Human PBMCs (LONZA, model number CC-2702) were cultured with clone CD19-6(Bi) or OKT3. IL-2 in the culture supernatant was quantified by flow cytometry using a cytometric bead array (BD Biosciences, model number 551809). The results are shown in Figure 22. IL-2 production levels (pg/mL) in the figure are shown as mean ± standard error (N=3).

OKT3はIL-2産生を顕著に誘導したのに比べ、CD19-6(Bi)によるIL-2産生は認められなかった。 OKT3 significantly induced IL-2 production, whereas CD19-6(Bi) did not induce IL-2 production.

実施例２２：PD-1/CD19二重特異性抗体の物理化学的安定性評価
本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体は、示差走査カロリメトリー（DSC）による構造安定性評価、拡散係数変化率（DLS）測定によるコロイド安定性評価およびストレス条件下（例えば、pH3～4/5℃下またはpH7/5℃下／凍結融解５回）における化学的安定性評価（例えば、タンパク質濃度変化、分子構造変化、会合／凝集の有無、チャージバリアント生成の有無、構造変化およびCD19への結合性）の何れの物理化学的安定性評価においても良好な性能を示すことが確認された。 Example 22: Evaluation of physicochemical stability of PD-1/CD19 bispecific antibodies The PD-1/CD19 bispecific antibodies of the present invention were confirmed to exhibit favorable performance in all physicochemical stability assessments, including structural stability assessment by differential scanning calorimetry (DSC), colloidal stability assessment by diffusion coefficient change (DLS) measurement, and chemical stability assessment under stress conditions (e.g., pH 3-4/5°C or pH 7/5°C/five freeze-thaw cycles) (e.g., changes in protein concentration, changes in molecular structure, presence or absence of association/aggregation, presence or absence of charge variant generation, structural changes, and binding to CD19).

本発明のPD-1/CD19二重特異性抗体またはその抗体断片は、自己免疫疾患または移植片対宿主病（GVHD）の予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に有用である。 The PD-1/CD19 bispecific antibody or antibody fragment thereof of the present invention is useful for preventing, inhibiting the progression of symptoms, inhibiting recurrence, and/or treating autoimmune diseases or graft-versus-host disease (GVHD).

Claims

A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a bispecific antibody or an F(ab') 2 fragment thereof, which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD- ₁ and CD19, respectively;
(A) the first arm that specifically binds to PD-1 has a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25, and (B) the second arm that specifically binds to CD19 has a VH consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 , and SEQ ID NO:62, and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.

2. The pharmaceutical composition of claim 1, wherein ( A) the first arm that specifically binds to PD-1 has a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25, and (B) the second arm that specifically binds to CD19 has a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:62 and a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:25 .

The pharmaceutical composition of claim 1 or 2 , wherein the first arm that specifically binds to PD-1 allows for the interaction between PD-1 and PD-L1.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3 , wherein the bispecific antibody is an IgG antibody.

The pharmaceutical composition according to claim 4 , wherein the IgG antibody is an _IgG1 antibody or an _IgG4 antibody.

The pharmaceutical composition according to claim 4 , wherein the IgG antibody is an _IgG1 antibody.

The pharmaceutical composition according to claim 6 , wherein the binding to Fc receptors is eliminated or attenuated.

The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the leucine at position 235 in the EU numbering system in the two heavy chain constant regions of the bispecific antibody has been substituted with glycine, and/or the glycine at position 236 in the EU numbering system has been substituted with arginine.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 8, wherein the leucine at position 351 and the threonine at position 366, according to the EU numbering system, in the constant region of the heavy chain having a VH of the first arm that specifically binds to PD-1, are substituted with lysine and lysine, respectively, and the leucine at position 351 and the leucine at position 368, according to the EU numbering system, in the constant region of the heavy chain having a VH of the second arm that specifically binds to CD19 , are substituted with aspartic acid and glutamic acid, respectively.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 8, wherein the leucine at position 351 according to the EU numbering system is substituted with aspartic acid and the leucine at position 368 is substituted with glutamic acid in the constant region of the heavy chain having a VH of the first arm that specifically binds to PD-1, and the leucine at position 351 is substituted with lysine and the threonine at position 366 is substituted with lysine in the constant region of the heavy chain having a VH of the second arm that specifically binds to CD19 .

The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 10 , wherein the lysine at position 447 according to the EU numbering system in each of the two heavy chain constant regions of the bispecific antibody is absent.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7 and 10 , wherein the heavy chain having the VH of the first arm that specifically binds to PD-1 comprises a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8 , 10 and 12 , wherein the heavy chain having the VH of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 13, wherein the light chain having a VL in a first arm that specifically binds to PD-1 and/or the light chain having a VL in a second arm that specifically binds to CD19 comprises a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 .

A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a bispecific antibody or a F(ab') 2 fragment thereof, which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, and which specifically binds to PD- ₁ and CD19, respectively, wherein the bispecific antibody is
(A) a heavy chain having a VH of the first arm that specifically binds to PD-1;
(B) a light chain having a VL in the first arm that specifically binds to PD-1;
(C) a heavy chain having a VH of a second arm that specifically binds to CD19, and (D) a light chain having a VL of a second arm that specifically binds to CD19;
(a) a heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1 comprises a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(b) a light chain having a VL of the first arm that specifically binds to PD-1 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29;
(c) the heavy chain having a VH of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VH consisting of any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 62, and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and (d) the light chain having a VL of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

A pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a bispecific antibody which specifically binds to PD-1 and CD19, and which has a first arm that specifically binds to PD-1 and a second arm that specifically binds to CD19, wherein the bispecific antibody is
(A) a heavy chain having a VH of the first arm that specifically binds to PD-1;
(B) a light chain having a VL in the first arm that specifically binds to PD-1;
(C) a heavy chain having a VH of a second arm that specifically binds to CD19, and (D) a light chain having a VL of a second arm that specifically binds to CD19;
(a) a heavy chain having a VH of a first arm that specifically binds to PD-1 comprises a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(b) a light chain having a VL of the first arm that specifically binds to PD-1 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29;
(c) the heavy chain having a VH of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VH consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 and a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and (d) the light chain having a VL of the second arm that specifically binds to CD19 comprises a VL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 16 , further comprising at least one pharmaceutically acceptable carrier.

A preventive agent, a suppressive agent for the progression of symptoms, the suppression of recurrence, and/or a therapeutic agent for an autoimmune disease , comprising the pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 17 .

Autoimmune diseases include Behçet's disease, systemic lupus erythematosus, chronic discoid lupus erythematosus, multiple sclerosis, scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa, aortitis syndrome, malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjögren's syndrome, adult Still's disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis, rheumatoid vasculitis, large vessel vasculitis, ANCA-associated vasculitis, Cogan's syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, polymyalgia rheumatica, fibromyalgia, antiphospholipid antibody syndrome, eosinophilic fasciitis, and IgG ₄ Associated diseases: Guillain-Barré syndrome, myasthenia gravis, chronic atrophic gastritis, autoimmune hepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, primary biliary cirrhosis, Goodpasture's syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, megaloblastic anemia, autoimmune hemolytic anemia, pernicious anemia, autoimmune neutropenia, idiopathic thrombocytopenic purpura, Graves' disease, Hashimoto's disease, autoimmune adrenal insufficiency, primary hypothyroidism, Addison's disease, idiopathic Addison's disease, type 1 diabetes, slowly progressive type 1 diabetes, localized scleroderma, psoriasis, psoriatic arthritis, bullous pemphigoid, pemphigus , pemphigoid, herpes gestationis, linear IgA bullous dermatopathy, epidermolysis bullosa acquisita, alopecia areata, vitiligo, vitiligo vulgaris, neuromyelitis optica, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, multifocal motor neuropathy, sarcoidosis, giant cell arteritis, amyotrophic lateral sclerosis, Harada's disease, autoimmune optic neuropathy, idiopathic azoospermia, habitual abortion, inflammatory bowel disease, celiac disease, ankylosing spondylitis, severe asthma, chronic urticaria, transplant immunity, familial Mediterranean fever, eosinophilic sinusitis, dilated cardiomyopathy, systemic mastocytosis, or inclusion body myositis .

The agent according to claim 18 or 19, which is administered in combination with any one or more drugs selected from insulin preparations, sulfonylureas, rapid-acting insulin secretagogues, biguanide preparations, insulin sensitizers, α-glucosidase inhibitors, drugs for treating diabetic neuropathy, GLP-1 analogue preparations, DPP-4 inhibitors, steroid drugs, interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetate, mitoxantrone, azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporine, methotrexate, cladribine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticotropin, mizoribine, tacrolimus, fingolimod, alemtuzumab, immunosuppressants, belimumab , antirheumatic drugs, anticytokine drugs , and abatacept .

A preventive agent for preventing, suppressing the progression of symptoms, suppressing recurrence and/or treating graft-versus-host disease (GVHD) , comprising the pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 17 .