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JP7715045B2 - カルボニル還元酵素、これをコードする核酸、及びこれらを利用した光学活性化合物の製造方法 - Google Patents
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JP7715045B2 - カルボニル還元酵素、これをコードする核酸、及びこれらを利用した光学活性化合物の製造方法 - Google Patents

カルボニル還元酵素、これをコードする核酸、及びこれらを利用した光学活性化合物の製造方法

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Description

本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬品、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性化合物に変換する活性を有するカルボニル還元酵素、該カルボニル還元酵素をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体に関し、さらに該カルボニル還元酵素等を用いた光学活性化合物の製造方法に関する。
ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン等のスタチン系化合物又はその塩は、ＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素阻害剤であり、高コレステロール血症、混合型異常脂質血症等の治療に有用である。近年、これらのスタチン系化合物又はその塩を使用した医薬品はジェネリック医薬品が発売されており、これらをより安価に工業的に製造する方法が望まれている。
これらのスタチン系化合物は、以下のような構造
を有する光学活性アルコール類又はその塩であり、
以下のようなカルボニル基が連続して存在する構造
を有するカルボニル基含有化合物を、有機合成的又は生物化学的な方法により、立体選択的に還元して製造する方法が知られている。
例えば、特許文献１には、カルボニル基含有化合物に特定のカルボニル還元酵素（以下「ＯＣＲ１」と称する場合がある。）を作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で光学活性アルコール等の光学活性化合物を製造する方法が記載されている。特許文献２にはＯＣＲ１を使用したロスバスタチンカルシウムの製造方法が、特許文献３にはＯＣＲ１を使用したピタバスタチンカルシウムの製造方法が記載されている。
ここで、ＯＣＲ１は熱安定性が悪く、反応時（加熱時）に酵素の安定性が低下するため大量のＯＣＲ１を使用する必要があることから、ＯＣＲ１の熱安定性の向上を目的とした変異体の研究が行われている（非特許文献１）。
しかしながら、医薬品、農薬等の中間体原料として有用な光学活性化合物、特にスタチン系化合物を、高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に製造するためには、ＯＣＲ１のさらなる性能向上が望まれている。
特許第４２７０９１８号 国際公開第２０１５／１１９２６１号 国際公開第２０１７／０２２８４６号
Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL. 123 No. 6, 673-678, 2017
本発明は、カルボニル還元活性、熱安定性、立体選択性、光学選択性等がＯＣＲ１より高いカルボニル還元酵素を開発することを解決すべき課題とする。さらに、本発明は、該カルボニル還元酵素を用いることにより、高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に光学活性化合物を得ることを解決すべき課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ＯＣＲ１の特定のアミノ酸を特定の別のアミノ酸に置換することにより、カルボニル還元活性、熱安定性、立体選択性、光学選択性等が高いカルボニル還元酵素が得られることを見出し、本発明を完成した。さらに、該カルボニル還元酵素を用いることにより、高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に光学活性化合物を得ることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログにおいて、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するカルボニル還元酵素。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列における５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換される変異
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における１５７番目のメチオニンがバリンに置換される変異
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列における１７０番目のアラニンがセリンに置換される変異
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列における２１１番目のイソロイシンがアラニン又はアスパラギンに置換される変異
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列における２１４番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列における２４９番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
［２］前記（ａ）～（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも２つの変異を有することを特徴とする［１］に記載のカルボニル還元酵素。
［３］配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログにおいて、さらに（ｇ）配列番号１のアミノ酸配列における１６６番目のバリンがアラニンに置換される変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する［１］又は［２］に記載のカルボニル還元酵素。
［４］下記一般式（I）、（II）及び（III）で表される化合物からなる群より選ばれるカルボニル基含有化合物を、
（上記式（Ｉ）、（II）及び（III）において、Ｒは水素原子、アルキル基又はアリール基を示し、
は芳香族環及び／又は複素環を有する置換基を示す。）
［１］～［３］のいずれかに記載のカルボニル還元酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液に接触させてカルボニル基含有化合物を不斉還元させることを特徴とする下記一般式（IV）
（式中、Ｒ及び
は前記と同義である。）
で表される光学活性化合物の製造方法。
［５］前記式（II）及び前記式（III）で表されるカルボニル基含有化合物が、それぞれ下記式（II’）
（式中、Ｒ及び
は前記と同義である。）
及び下記式（III’）
（式中、Ｒ及び
は前記と同義である。）
で表される光学活性体であることを特徴とする［４］に記載の製造方法。
［６］置換基
が、
（式中、
は芳香族環及び／又は複素環を有する置換基を示す。）、
、
又は
である［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］置換基
が、
又は
である［６］に記載の製造方法。
［８］前記微生物又は細胞が、［１］～［３］のいずれかに記載のカルボニル還元酵素をコードする核酸であって、以下の（ｐ）、（ｑ）又は（ｒ）に示す塩基配列を含む核酸で形質転換された微生物又は細胞である、［４］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
（ｐ）配列番号２で表される塩基配列において、１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｑ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｒ）配列番号２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
なお、本明細書において、置換基
は「置換基Ａ」、置換基
は「置換基Ｂ」と称する場合がある。
本発明によれば、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬品、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性化合物に変換する活性を有するカルボニル還元酵素、該カルボニル還元酵素をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体を提供することができる。さらに、本発明によれば、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な光学活性化合物を、高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に得られる製造方法を提供することができる。
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のカルボニル還元酵素
本発明のカルボニル還元酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列のホモログにおいて、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するものであって、カルボニル還元酵素活性を有するものである。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列における５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換される変異
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における１５７番目のメチオニンがバリンに置換される変異
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列における１７０番目のアラニンがセリンに置換される変異
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列における２１１番目のイソロイシンがアラニン又はアスパラギンに置換される変異
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列における２１４番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
（ｆ）配列番号１のアミノ酸配列における２４９番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
本発明において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性な化合物に変換する活性を意味する。カルボニル還元酵素活性を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性な化合物に変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、一般式（I）、（II）又は（III）で表されるカルボニル基含有化合物に、測定の対象とするカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を作用させ、これらのカルボニル基含有化合物から変換された一般式（IV）で表される化合物の量を直接的に測定することにより、カルボニル還元酵素活性を確認することができる。また、ＮＡＤＰＨを補酵素として含有する測定系の場合は、ＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することによりカルボニル還元酵素活性を確認することができる。
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、特許第４２７０９１８号に記載のオガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var. nonfermentans）NBRC（旧IFO）1473由来のアミノ酸配列（ＯＣＲ１）である。
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のホモログとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、1～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドである。
「１～複数個のアミノ酸」とは、通常１個～１００個、好ましくは１個～５０個、より好ましくは１個～２０個、さらに好ましくは１個～１０個、特に好ましくは１個～５個のアミノ酸である。
また、本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のホモログとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列全長と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列全長と９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列有し、かつ、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドである。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性（同一性又は類似性ともいう）は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら,J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
上記配列番号１で表されるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列のホモログは、特許第４２７０９１８号に記載の方法により取得することができる。
本発明のカルボニル還元酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列のホモログにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の変異を有することにより優れた特性を有する。以下、（ｄ）、（ｃ）、（ｆ）、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）の順に各変異について説明する。
（ｄ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における２１１番目のイソロイシンがアラニン又はアスパラギンに置換される変異である。この変異により、立体選択性及び光学選択性が向上する。
具体的には、下記一般式（I）又は（II）で表されるカルボニル基含有化合物の３位のカルボニル基を選択的に還元する性能が向上する。したがって、一般式（I）又は（II）で表されるカルボニル基含有化合物から、高収率、高化学純度で一般式（IV）で表される光学活性化合物を得ることができる。また、（ｄ）の変異は光学選択性も向上するため、一般式（I）、（II）又は（III）表されるカルボニル基含有化合物から、高収率、高光学純度で一般式（IV）で表される光学活性化合物を得ることができる。
特に、置換基Ａが
又は
である場合、３位のカルボニル基を選択的に還元する性能が高い。
したがって、例えば、下記のような反応により、下記に示す光学活性化合物を高収率、高化学純度及び高光学純度で得ることができる。
（ｃ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における１７０番目のアラニンがセリンに置換される変異である。この変異により、熱安定性が向上する。
また、（ｆ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における２４９番目のメチオニンがロイシンに置換される変異である。この変異により、熱安定性が向上する。
これらの変異により、加熱条件下での還元反応においてもカルボニル還元酵素の活性が低下せず、高い酵素活性を維持するため、一般式（I）、（II）又は（III）表されるカルボニル基含有化合物から、高収率、高化学純度で一般式（IV）で表される光学活性化合物を得ることができる。また、（ｃ）の変異と（ｆ）の変異の両方の変異がある場合は、より熱安定性が向上するため好ましい。
（ａ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換される変異である。この変異により、立体選択性が向上する。
具体的には、上記一般式（I）又は（II）で表されるカルボニル基含有化合物の３位のカルボニル基を選択的に還元する性能が向上するため、上記一般式（IV）で表される光学活性化合物を高収率及び高化学純度で得ることができる。
特に、置換基Ａが
である場合、カルボニル基含有化合物に対する反応速度、反応効率が向上する。
したがって、例えば、下記のような反応により、下記に示す光学活性化合物の生成速度、生成効率が向上し、高収率、高化学純度及び高光学純度で該光学活性化合物を得ることができる。
（ｂ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における１５７番目のメチオニンがバリンに置換される変異である。この変異により、立体選択性及び光学選択性が向上する。
また、（ｅ）の変異は、配列番号１のアミノ酸配列における２１４番目のメチオニンがロイシンに置換される変異である。この変異により、立体選択性及び光学選択性が向上する。
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するカルボニル還元酵素を、下記一般式（Ｉ）
で表されるカルボニル基含有化合物に作用させた場合、３位のカルボニル基の方が、５位のカルボニル基よりも優先的に還元されるため、下記一般式（III）
で表される化合物が、下記一般式（II）
で表される化合物よりも多く生成する。また、上記一般式（III）で表される化合物から
下記一般式（IV）
で表される化合物への反応速度は、上記一般式（II）で表される化合物から上記一般式（IV）で表される光学活性化合物への反応速度より遅いため、上記一般式（III）で表される化合物が残存するおそれがある。
（ｂ）の変異と（ｅ）の変異を有するカルボニル還元酵素を、上記一般式（I）で表されるカルボニル基含有化合物に作用させた場合、３位のカルボニル基の還元が抑制され、３位と５位のカルボニル基がバランス良く還元される。そして、上記一般式（II）及び（III）で表される化合物から上記一般式（IV）で表される光学活性化合物に変換する反応速度、反応効率が向上するため、効率的に、高収率、高化学純度で上記一般式（IV）で表される光学活性化合物を得ることができる。
特に、置換基Ａが
である場合、カルボニル基含有化合物から光学活性化合物に変換する反応速度、反応効率がより向上する。
したがって、例えば、下記のような反応により、下記に示す光学活性化合物の生成速度、生成効率が向上し、高収率、高化学純度及び高光学純度で該光学活性化合物を得ることができる。
さらに、（ｂ）の変異と（ｅ）の変異の両方の変異がある場合は、カルボニル基含有化合物に対する反応効率も向上するため、より好ましい。
本発明のカルボニル還元酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列において、上記（ａ）～（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するカルボニル還元酵素である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の変異は、目的とする上記式（IV）で表される光学活性化合物の種類によって１以上の変異を適宜選択することができるが、（ａ）～（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも２つの変異を有することが好ましく、さらに少なくとも３つの変異を有することが好ましい。
また、本発明のカルボニル還元酵素は、（ｇ）の変異を有していてもよい。（ｇ）の変異は、非特許文献１に記載されている変異であり、配列番号１のアミノ酸配列における１６６番目のバリンがアラニンに置換される変異である。この変異により、カルボニル還元酵素の熱安定性が向上する。
本発明のカルボニル還元酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列から、当業者に公知の方法、例えば、部位特異的変異導入法、ＰＣＲ法等の周知の技術により製造することができる。
また、本発明のカルボニル還元酵素は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該カルボニル還元酵素を分離精製することによって製造することもできる。本発明のカルボニル還元酵素をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA：RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のカルボニル還元酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、Ogataea minuta var. nonfermentans NBRC1473株由来の細胞又は組織より調製した全RNA又はmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長カルボニル還元酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（TAKARA BIO INC.）、MutanTM-K（TAKARA BIO INC.）等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸としては、本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り限定されないが、特に以下の（ｐ）、（ｑ）又は（ｒ）に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
（ｐ）配列番号２で表される塩基配列において、１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｑ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｒ）配列番号２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸
前記（ｐ）に示す核酸のホモログとしては、配列番号２で表される塩基配列において、１～複数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含み、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。置換、挿入又は付加の場合は、１～複数個の塩基が置換、挿入又は付加されたものが好ましい。ここで、「１～複数個の塩基」とは、例えば、１個～６０個、好ましくは１個～３０個、より好ましくは１個～１５個、さらに好ましくは１個～１０個、特に好ましくは１個～５個の塩基である。
前記（ｑ）に示す核酸のホモログとしては、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。好ましくは、配列番号２で表される塩基配列と９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性（同一性ともいう）を有する塩基配列を有し、かつ本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸である。
本明細書における塩基配列の相同性（同一性ともいう）は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝1；ミスマッチスコア＝－3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
前記（ｒ）に示す核酸のホモログとしては、本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り、配列番号２の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、既報の条件（例：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.16.3.6, 1999）を参考に適宜設定することができ、具体的には、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1 x SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1 x SSC、0.1％ SDS、さらに好ましくは、65℃、0.1 x SSC、0.1％ SDSや68℃、0.1 x SSC、0.1％ SDS等（高ストリンジェントな条件）に相当する塩濃度及び温度で、１回、より好ましくは１～３回洗浄する条件等が挙げられる。
当業者であれば、配列番号２で表される核酸に部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入及び／又は付加を行い、所望の変異を導入することにより、上記のような核酸のホモログを得ることが可能である。
本発明の核酸は、本発明のカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし得る。本発明の核酸が、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列と高い同一性を有する塩基配列を有する場合、該核酸によりコードされるポリペプチドを含むカルボニル還元酵素のカルボニル還元酵素活性の程度は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むもの、又は該アミノ酸配列のホモログを有するポリペプチドを含むものと定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば、約0.1～約5倍、好ましくは約0.3～約3倍）で異なってもよい。
また、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸配列又はその一部や、配列番号２で表される塩基配列又はその一部をもとに、例えばDNA Databank of JAPAN（DDBJ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列情報又はそれをコードするDNAの塩基配列情報を手に入れることも可能である。
後述する本発明の製造方法においては、基質であるカルボニル基含有化合物に、上記カルボニル還元酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞としては、もともと当該カルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を用いてもよいし、育種により前記生産能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。微生物若しくは細胞としては、その生死は問わず、例えば、休止菌体等を好適に用いることができる。本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の種類としては、「宿主微生物」又は「宿主細胞」として後述するものが挙げられる。
育種により前記生産能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理等、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とするDNAを導入する方法、染色体上でプロモーター等の発現調節配列を改変して目的とするDNAの発現を強化する方法等が挙げられる。
これらのうち、前記の本発明のポリペプチドをコードするDNAで形質転換された微生物若しくは細胞を用いることが好ましい。
本発明のポリペプチド（カルボニル還元酵素）をコードする核酸（DNA）は、前記の通り、Ogataea minuta var. nonfermentans NBRC1473株由来の染色体DNAを鋳型として用い、適切なプライマーを用いてPCRを行うことでクローニングできる。
また、本発明のポリペプチド（カルボニル還元酵素）をコードする核酸（DNA）は、前記の通り、Ogataea minuta var. nonfermentans NBRC1473株由来の全RNA若しくはmRNAを鋳型として用い、RT-PCR法によって直接増幅した全長カルボニル還元酵素 cDNAを調製した後、適切なプライマーを用いてPCRを行うことによりクローニングできる。
例えば、上記のようにして得た本発明のポリペプチドをコードするDNAを公知の発現ベクターに発現可能な配置で挿入することにより、本発明のポリペプチド遺伝子発現ベクターが提供される。そして、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドをコードするDNAが導入された形質転換体を得ることができる。形質転換体は、宿主の染色体DNAに本発明のポリペプチドをコードするDNAを相同組み換え等の手法によって発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクター等を用いて目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
形質転換体の作製方法としては、具体的には、宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、本発明のポリペプチドをコードするDNAを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する方法や直接宿主ゲノム中に該DNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。この場合、宿主において適当なプロモーターをDNAの5'－側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを3'－側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」に詳述されているベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が基質であるカルボニル基含有化合物や目的物である光学活性化合物に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacteriuｍ）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属等に属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等に属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ピキア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属等に属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4thed.) Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)に記載の方法）。
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーター等の例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミド等が挙げられ、lac（β－ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc（lac、trpの融合）、λファージPL、PR等に由来するプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等が挙げられる。
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等を挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α－アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーター等が利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240（Gene,26,273-82(1983)）等を挙げることができる。
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、ベクターとしては、pAJ43（Gene 39,281(1985)）等のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、ベクターとしては、pCS11（特開昭５７－１８３７９９号公報）、pCB101（Mol.Gen.Genet.196,175(1984)）等のプラスミドベクターが挙げられる。
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、ベクターとしては、Mol.Cell.Biol.6,80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクター等を挙げることができる。特に、pAUR224は、タカラバイオ株式会社から市販されており容易に利用できる。
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリジー（Aspergillus oryzae）等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989)）。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（例えば、蚕）等の動物中（Nature 315,592-594(1985)）や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の処理物としては、例えば、該微生物若しくは細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の細胞調製物、微生物若しくは細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を挙げることができる。
本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液としては、例えば、該細胞と液体培地の懸濁液や、該細胞が分泌発現型細胞である場合は該細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物を挙げることができる。
２．本発明の組成物
本発明の組成物（酵素剤）は、本発明のカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を含み、一般式（I）、（II）又は（III）
で表されるカルボニル基含有化合物を基質とし、一般式（IV）
で表される光学活性化合物を生成する反応を触媒するものである。本発明の組成物は、触媒として使用することで、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な該光学活性化合物を高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に製造することができるため、有用である。
本発明の組成物は、有効成分（酵素等）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
３．本発明の光学活性化合物の製造方法
本発明によれば、本発明のカルボニル還元酵素を、
下記一般式（I）、（II）及び（III）で表される化合物からなる群より選ばれるカルボニル基含有化合物
に作用させて、下記一般式（IV）で表される光学活性化合物を製造することを含む、下記一般式（IV）で表される光学活性化合物の製造方法が提供される。
また、前記式（II）及び前記式（III）で表されるカルボニル基含有化合物は、それぞれ下記式（II’）及び下記式（III’）
で表される光学活性体であることが好ましい。
なお、本明細書において、Ｒは水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。アルキル基としては、好ましくは炭素数１～８の直鎖又は分岐アルキル基であり、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖アルキル基であり、特に好ましくはエチル基又はｎ－プロピル基である。
また、置換基Ａは芳香族環及び／又は複素環を有する置換基を示す。具体的には、置換基Ａとしては、置換基としてフッ素原子を有する芳香族環を有する置換基、窒素原子を有する複素環を有する置換基及び／又はナフタレン環を有する置換基が好ましく、これらのなかでも、
、
、
又は
が好ましく、特に
が好ましい。
ここで、置換基Ｂは芳香族環及び／又は複素環を有する置換基を示す。具体的には、置換基Ｂとしては、窒素原子を有する複素環を有する置換基が好ましく、特に、
又は
が好ましい。
本発明においては、置換基Ａは、

又は
であることが特に好ましい。
本発明のカルボニル還元酵素を、上記一般式（I）、（II）又は（III）で表されるカルボニル基含有化合物に接触させる際には、精製又は粗精製した本発明のカルボニル還元酵素、本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、上記一般式（I）、（II）又は（III）で表されるカルボニル基含有化合物に接触させることによって、上記一般式（IV）で表される光学活性化合物を製造することができる。
本発明のカルボニル還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、本発明のポリペプチドをコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、基質となるカルボニル基含有化合物に応じて適宜選択することができる。例えば、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ/ｖ％～５０ｗ/ｖ％程度、好ましくは１ｗ/ｖ％～２０ｗ/ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。ここで、ｗ/ｖ％は、重量（weight）／体積（volume）％を表す。
また、反応液に添加するカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液は、取り扱い性に優れ、また、反応液への添加が容易であることから、凍結した状態で用いることもできる。凍結した状態で用いるときは、その形状は、特に制限はないが、例えば、角柱状、円柱状、塊状、球状等にすることができる。
反応の方法は特に限定されず、本発明のカルボニル還元酵素を含む液体に、反応基質となるカルボニル基含有化合物を加え、適当な温度や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、上記一般式（IV）で表される光学活性化合物を製造することができる。
反応基質となるカルボニル基含有化合物の量は、該化合物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、反応基質となるカルボニル基含有化合物は、基質濃度が０．０１ｗ/ｖ％～９０ｗ/ｖ％、好ましくは０．１ｗ/ｖ％～３０ｗ/ｖ％の範囲で用いることができる。
反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応媒体は、反応基質となるカルボニル基含有化合物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、水性媒体、又は水性媒体と有機溶媒との混合物を用いることができる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、tert－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質であるカルボニル基含有化合物の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
反応温度、反応時のｐＨ，反応時間は、反応基質となるカルボニル基含有化合物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、反応温度は４℃～８０℃、好ましくは１０℃～７０℃で、反応時のｐＨはｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ４～８、反応時間は、０．５時間～７２時間程度である。
本発明の製造方法により生成する上記一般式（IV）で表される光学活性化合物は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物を、反応基質である下記一般式（I）、（II）又は（III）で表されるカルボニル基含有化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、光学活性化合物を製造する方法に関する。形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物はいずれかを単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
特に、本発明の製造方法は、特に、置換基Ａが
又は
である場合、すなわち、ピタバスタチン又はロスバスタチンの製造に好適に用いることができる。
（１）ピタバスタチンの場合
ピタバスタチンの製造方法としては、例えば、特許第４２７０９１８号公報、国際公開第２０１７／０２２８４６号等に記載の方法が挙げられる。
反応基質となる下記一般式（I'）、（II''）又は（III''）
で表されるカルボニル基含有化合物は、特開平１－２７９８６６号公報、特開平８－１２７５８５号公報、特開平５－１７８８４１号公報、国際公開第２０１７／０２２８４６号等に記載された方法と公知の方法を組み合わせることによって、任意に製造することができる。これらの化合物は１種あるいは２種以上を組み合わせて原料として使用することができる。
反応基質として、一般式（I'）で表される化合物を用いる場合には、その製造中間体として、一般式（II''）で表される化合物を経由する場合と、一般式（III''）で表される化合物を経由する場合がある。ついては、式（I'）で表される化合物から、あらかじめ式（II''）で表される化合物及び式（III''）で表される化合物を製造し、それを単離し、さらに一般式（IV'）で表される光学活性化合物
へ誘導してもよいし、式（II''）で表される化合物及び式（III''）で表される化合物を単離することなく、そのまま一般式（IV'）で表される化合物を製造してもよい。
反応基質となる一般式（I'）、（II''）又は（III''）で表されるカルボニル基含有化合物は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～１０ｗ／ｖの％範囲で用いられる。反応基質は、予め反応系に存在させていてもよいし、反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点から、反応開始時から連続的又は間欠的に添加することもできる。
また、反応は補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
上記補酵素を添加する場合には、生産効率向上のため、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが好ましい。再生方法としては、
１）本発明の微生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、
３）本発明の微生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは宿主細胞に導入する方法等が挙げられる。
上記１）の方法においては、反応効率の点から、反応系にグルコース、エタノール、２－プロパノール又はギ酸などを添加することが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、グルタルアルデヒド処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍～１００倍、好ましくは０．５倍～２０倍程度となるように添加するのがよい。
また、上記再生酵素の基質となる化合物の添加、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノール又はイソプロパノール等の添加も必要となるが、その添加量としては、反応基質であるカルボニル基含有化合物１ｍｏｌに対して、通常０．１ｍｏｌ～２０ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ～１０ｍｏｌである。
また、上記３）の方法においては、工程（ｉ）に用いられる酵素をコードするＤＮＡと共に上記再生酵素のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入し宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法等を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する必要がある。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させる方法も可能である。
反応は、水性媒体中又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体、又は水性媒体と有機溶媒との混合物は、反応基質であるカルボニル基含有化合物、並びに上記酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を含有する。また、必要に応じて各種補酵素を含有していてもよい。補酵素を含有する場合は、その再生システム、すなわち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。
なお、反応基質であるカルボニル基含有化合物は、後述する方法により製造することも可能である。
水性媒体としては、水、又はリン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液等のｐＨ緩衝液が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール等、反応基質であるカルボニル基含有化合物の溶解度が高いものを使用することができる。これらの中でも、有機溶媒としては、反応基質であるカルボニル基含有化合物の溶解度が高いことから、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノールが好ましい。さらに転化率が高いことからジメチルスルホキシドがより好ましい。
反応は、通常４℃～７０℃、好ましくは３０℃～６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ４～８で行われる。反応時間は、通常０．５時間～４８時間、好ましくは０．５時間～２４時間である。
得られる一般式（IV'）で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーションなどにより菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化などを適宜組み合わせることにより精製することができる。
例えば、下記式の反応には、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列において、（ｄ）、（ｃ）又は（ｆ）の変異を１つ以上、好ましくは２つ以上有しているカルボニル還元酵素を好適に用いることができる。また、さらに（ｇ）の変異を有していてもよい。特に、下記式の反応には、少なくとも（ｄ）の変異を有しているものが好ましい。
また、例えば、下記式の反応には、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）又は（ｆ）の変異を１つ以上、好ましくは２つ以上、特に好ましくは３つ以上有しているカルボニル還元酵素を好適に用いることができる。また、さらに（ｇ）の変異を有していてもよい。特に、下記式の反応には、（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）の変異を有しているものが好ましい。
（２）ロスバスタチンの場合
ロスバスタチンの製造方法としては、例えば、国際公開第２０１５／１１９２６１号等に記載の方法が挙げられる。
反応基質としては、例えば、下記一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物を用いることができる。
反応基質となる一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～１０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
反応においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加する。
上記補酵素を添加する場合には、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、
１）本発明の微生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、
３）本発明の微生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは宿主細胞に導入する方法等が挙げられる。
上記１）の方法においては、反応系にグルコース、エタノール、２－プロパノール又はギ酸などを添加することが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍～１００倍、好ましくは０．５倍～２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応基質である一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物に対して、通常０．１当量～２０当量、好ましくは１当量～１０当量添加する。
また、上記３）の方法においては、本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡと共に上記再生酵素のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に、宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する必要がある。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
反応は、一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物及び上記酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びに、必要に応じて各種補酵素（その再生システム、即ち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。）を含有する、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。なお、一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物は、国際公開第２０１５／１１９２６１号等に記載の方法等により製造することができる。
水性媒体としては、水又はリン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール等、一般式（I''）で表されるカルボニル基含有化合物の溶解度が高いものを使用することができる。これらの中でも、有機溶媒としては、一般式（I''）で表される化合物の溶解度が高いことから、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノールが好ましい。さらに転化率が高いことからジメチルスルホキシドがより好ましい。
また、反応は、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトール、イノシトール、ソルビトール、キシリトール等の多価アルコール類の存在下で行なうことができる。上記多価アルコール類は、重合体や誘導体であってもよく、また、一種で用いることも二種以上を混合して用いることもできる。反応を多価アルコール類の存在下で行なうと、転化率が向上する傾向にある。中でも、グリセリンは、酵素の高次構造を保持することで酵素活性を維持することができると考えられ、さらに、入手が容易であるため好ましい。
反応は、通常４℃～７０℃、好ましくは２０℃～６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ４～８で行われる。反応時間は、通常０．５時間～４８時間、好ましくは０．５時間～２４時間である。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
得られる一般式（VI''）
で表される光学活性化合物は、遠心分離やフィルトレーションなどにより菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化などを適宜組み合わせることにより精製することができる。
一般式（VI''）で表される光学活性化合物を結晶化により精製する場合、用いることのできる有機溶媒としては、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン、トルエンなどの炭化水素溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）などのエーテル溶媒、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等のアルコール溶媒、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等、一般式（VI''）で表される光学活性化合物の溶解度が高い溶媒を使用することができる。これらの有機溶媒は単独で用いることができるが、これらの有機溶媒と水との混合溶媒も用いることができる。
一般式（VI''）で表される光学活性化合物を結晶化により精製する場合、（VI''）で表される光学活性化合物を有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後、１５℃／時間以下の冷却速度で冷却することにより、前記一般式（VI''）で表される光学活性化合物の結晶を析出させることが好ましい（この冷却して結晶を析出させる工程のことを、以下、「冷却工程」という）。
冷却工程において、冷却を開始する温度は、好ましくは１５℃～６０℃、より好ましくは２０℃～５５℃である。
冷却工程における冷却速度は、１５℃／時間以下が好ましく、９℃／時間以下がより好ましく、６℃／時間以下がさらに好ましく、５℃／時間以下が特に好ましい。これは、得られる一般式（VI''）で表される光学活性化合物の純度を上げるためである。
なお、冷却工程においては、冷却速度を途中で変更することもできる。特に、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下の温度範囲においては、ゆっくり冷却することが好ましい。具体的には、冷却速度を９℃／時間とすることがより好ましく、６℃／時間以下とすることがさらに好ましく、５℃／時間以下とすることが特に好ましい。
例えば、下記式の反応には、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）又は（ｆ）の変異を１つ以上、好ましくは２つ以上、特に好ましくは３つ以上有しているカルボニル還元酵素を好適に用いることができる。また、さらに（ｇ）の変異を有していてもよい。特に、下記式の反応には、（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）の変異を有しているものが好ましい。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
本実施例における定量分析は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用い、以下の条件で測定を行った。
＜測定条件１＞
カラム：Ｎａｃａｌａｉ社製Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ３Ｃ１８ＭＳ－ＩＩ （４．６×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝３００／１５０／４５０／１
流速：０．５ｍＬ／分 カラム温度：５０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
注入量：５μＬ
＜測定条件２＞
カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧIII（４．６×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：１００ｍＭ ＨＣＯＯＮＨ４ Ｂ：エタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４５％（０分）→４５％（２０分）→８０％（３０分）→８０％（３５分）
流速：０．５５ｍＬ／分 カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
注入量：５μＬ
＜測定条件３＞
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液 Ｂ：０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４０％（０分）→９５％（１２分）→６４％（１４分）→４０％（１７分）
流速：０．３ｍＬ／分 カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
注入量：５μＬ
＜測定条件４＞
カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧＳ－III（４．６×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（体積／体積／重量）
流速：１ｍＬ／分 カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
注入量：５μＬ
参考例１（菌体の調製）
（１）遺伝子のクローニング
特許文献１（特許第４２７０９１８号公報）を参考にして遺伝子のクローニングを行った。オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var. nonfermentans）NBRC 1473由来のＯＣＲ１（配列番号１）をコードする遺伝子配列ｏｃｒ１（配列番号２）を基に、常法に従ってＰＣＲを行い、ｏｃｒ１遺伝子の上流に制限酵素サイトＥｃｏＲＩと下流に制限酵素サイトＸｂａＩを含む全長約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
次に、特許文献２（国際公開第２０１５／１１９２６１号）を参考に、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子（GeneBank Accession No. AL009126.3）がコードするグルコース－１－デヒドロゲナーゼにおいて９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したＧＤＨ（配列番号３）をコードする遺伝子配列（以下、ｇｄｈ（配列番号４）を基に、常法に従ってＰＣＲを行い、ｇｄｈ遺伝子の上流に制限酵素サイトＥｃｏＲＩと下流に制限酵素サイトＸｂａＩを含む全長約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたｏｃｒ１のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａIにより消化した特開２００５－３４０２５号公報に記載のプラスミドｐＫＶ３２にLigation-Convenience Kit（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１を得た。
次に、上記（１）で得られたｇｄｈのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２にLigation-Convenience Kit（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＧＤＨを得た。
さらに、ｐＫＶ３２ＧＤＨを鋳型として、常法に従ってＰＣＲを行い、上流および下流に制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを付加した全長約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１の下流に挿入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨを得た。得られたプラスミドにおけるｇｄｈ遺伝子の向きはＰＣＲにより確認した。
（３）ＯＣＲ１変異体発現用プラスミドの調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨを鋳型として、例えばQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレントテクノロジー社製）のような部位特異的突然変異誘発手法を用いて、常法に従い、下記表１に示す変異体を発現し得る変異体プラスミドを作製した。
なお、以下に示す表において、Ａはアラニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｖはバリンを示す。また、例えば、Ｉ２１１Ａは、配列番号１のアミノ酸配列において２１１番目のイソロイシンがアラニンに置換されている変異を示す。
ここで、Ｄ５４Ｖは（ａ）の変異、Ｍ１５７Ｖは（ｂ）の変異、Ａ１７０Ｓは（ｃ）の変異、Ｉ２１１Ａ及びＩ２１１Ｎは（ｄ）の変異、Ｍ２１４Ｌは（ｅ）の変異、Ｍ２４９Ｌは（ｆ）の変異、Ｖ１６６Ａは（ｇ）の変異である。
実施例１（発現株の調製）
上記参考例１の（２）及び（３）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨ及びその変異体プラスミドを用いて、大腸菌（Escherichia coli）JM１０９（タカラバイオ社製）を常法に従って形質転換し、それぞれの形質転換体を得た。
実施例２
５Ｓ－ＭＯＬＥに、実施例１で得られた形質転換体を作用させて還元し、ＤＯＬＥを製造した。得られたＤＯＬＥのｓｙｎ体とａｎｔｉ体の比率を測定し、光学選択性を評価した。
ここで、５Ｓ－ＭＯＬＥ、ｓｙｎ－ＤＯＬＥ、ａｎｔｉ－ＤＯＬＥはそれぞれ以下の構造を有する化合物である。
ＯＣＲ１及び表２に示す変異を有する形質転換体それぞれについて、以下の反応及び評価を実施した。
形質転換体を濃度２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（以下「ＩＰＴＧ」と称する。）を含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を回収し、濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）２００μＬ、濃度２ｇ／ＬのＮＡＤＰ＋３０μＬ、トルエン１μＬを添加して５分間激しく振とうさせた後、濃度５０重量％のグルコース１０μＬ及び濃度５ｇ／Ｌの５Ｓ－ＭＯＬＥ１０μＬを添加し、４５℃で１時間振とうして反応させた。
得られた反応液にアセトニトリル７５０μＬを添加し、遠心分離した後、得られた遠心上清を、測定条件２及び測定条件１でＨＰＬＣ分析した。各形質転換体のａｎｔｉ体比を表２に示す。
ａｎｔｉ体比は、ＨＰＬＣ分析により得られたｓｙｎ－ＤＯＬＥとａｎｔｉ－ＤＯＬＥの比率から下記計算式により算出した。
ａｎｔｉ体比（％）＝ａｎｔｉ－ＤＯＬＥ生成量／ｓｙｎ－ＤＯＬＥ生成量×１００
表２から明らかなように、Ｉ２１１Ａ又はＩ２１１Ｎの変異を有するものは、ＯＣＲ１と比較してａｎｔｉ体比が低減していた。すなわち、（ｄ）の変異（Ｉ２１１Ａ又はＩ２１１Ｎ）により、光学選択性が向上することが判明した。
実施例３
ＤＯＸＥに、実施例１で得られた形質転換体を作用させて還元し、得られた３Ｒ－ＭＯＬＥ、５Ｓ－ＭＯＬＥ及びＤＯＬＥ生成量から、反応活性及び立体選択性を評価した。
ここで、ＤＯＸＥ、３Ｒ－ＭＯＬＥ、５Ｓ－ＭＯＬＥ及びＤＯＬＥはそれぞれ以下の構造を有する化合物である。
ＯＣＲ１及び表３に示す変異を有する形質転換体それぞれについて、以下の反応及び評価を実施した。
形質転換体を濃度２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を回収し、濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファーに懸濁し、懸濁液を入れた容器を氷水中に浸して超音波破砕処理を行った。得られた菌体溶解液を遠心分離し、菌体破砕物上清を得た。
得られた菌体破砕物上清１００μＬに、濃度０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）１００μＬ、濃度２０ｇ／Ｌのグルコース１００μＬ、濃度０．２ｇ／ＬのＮＡＤＰ＋１０μＬ、濃度１ｇ／ＬのＤＯＸＥのＤＭＳＯ溶液１００μＬ及び水９０μＬを添加し、ThermoMixer R Mixer（エッペンドルフ社製）を用いて、５０℃、１０００ｒｐｍで１５分間反応させた。反応後、アセトニトリル１ｍＬを添加して混合した後、遠心分離した。得られた上清を測定条件３でＨＰＬＣ分析した。各形質転換体の反応活性及び３Ｒ－ＭＯＬＥ比を表３に示す。
反応活性及び３Ｒ－ＭＯＬＥ比は、ＨＰＬＣ分析により得られた各ピーク面積値から下記計算式により算出した。
反応活性＝５Ｓ－ＭＯＬＥピーク面積＋３Ｒ－ＭＯＬＥピーク面積
３Ｒ－ＭＯＬＥ比＝３Ｒ－ＭＯＬＥピーク面積／５Ｓ－ＭＯＬＥピーク面積
なお、反応活性は、ＯＣＲ１を基準として０．９倍以下を“－”、１．０倍を“＋”、１．１倍を“＋＋”、１．２倍以上を“＋＋＋”として評価した。
また、３Ｒ－ＭＯＬＥ比は、ＯＣＲ１を基準として０．９～１．０倍を“＋”、０．７～０．８倍を“＋＋”、０．６倍以下を“＋＋＋” として評価した。
表３から明らかなように、Ｍ１５７Ｖ又はＭ２１４Ｌの変異を有するものは、ＯＣＲ１と比較して３Ｒ－ＭＯＬＥ比が低減していた。特に、Ｍ１５７ＶとＭ２１４Ｌの両方の変異を有するものは、３Ｒ－ＭＯＬＥ比が低減するだけでなく、反応活性も向上していた。すなわち、Ｍ１５７Ｖ（（ｂ）の変異）、Ｍ２１４Ｌ（（ｅ）の変異）により、立体選択性、反応活性が向上することが判明した。
実施例４
ＯＣＲ１及び表４に示す変異を有する形質転換体それぞれについて、以下の反応及び評価を実施した。
形質転換体を濃度２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を回収し、濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファーに懸濁し、懸濁液を入れた容器を氷水中に浸して超音波破砕処理を行った。得られた菌体溶解液を遠心分離し、菌体破砕物上清を得た。
得られた菌体破砕物上清について、Quick Start Bradfordプロテインアッセイキット（ＢＩＯ－ＲＡＤラボラトリーズ社製）を用い、常法に従ってタンパク質濃度を測定した。
また、得られた菌体破砕物上清を２つに分け、１つは４℃～１０℃で冷蔵保存し、もう１つはThermoMixer R Mixer（エッペンドルフ社製）を用いて、５０℃、２００ｒｐｍで１時間加熱処理を行った。
冷蔵保存又は加熱処理を行ったそれぞれの菌体破砕物上清について、菌体破砕物上清１０μＬ、濃度１ｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）２５μＬ、濃度８ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ１０μＬ、水２００μＬ、及び濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの２，２，２，－トリフルオロアセトフェノン（TFAP）のＤＭＳＯ溶液５μＬを混合した。混合したものを９６ウェルプレート（コーニング社製）に入れ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーバイオ社製）を用いて、３４０ｎｍの吸光度変化を２分間測定した。単位時間当たりの吸光度変化の平均値（ｍＯＤ／分）を算出し、吸光度変化の傾きから下記式により単位時間・単位タンパク質当たりの活性値を算出した。
また、冷蔵保存又は加熱処理を行ったそれぞれの菌体破砕物上清について、Quick Start Bradfordプロテインアッセイキット（ＢＩＯ－ＲＡＤラボラトリーズ社製）を用い、常法に従ってタンパク質濃度を測定した。
なお、ＮＡＤＰＨのモル吸光係数は６．３ｍＬ／μｍｏｌ・ｃｍとして計算した。
活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ－タンパク質）＝（－１）×吸光度変化の傾き×２５０μＬ／１０μＬ／６３００／０．５５／タンパク質濃度
上記のようにして得られた活性値を、下記式に当てはめることにより、熱処理前後の活性比を算出し、熱安定性を評価した。各形質変換体の熱安定性を表４に示す。
熱安定性（％）＝加熱処理時の活性値／冷蔵保存時の活性値×１００
熱安定性の値が２０％より少ない場合を“－”、２０％～７０％の範囲を“＋”、７０％より多い場合を“＋＋”として評価した。
表４から明らかなように、Ａ１７０Ｓ又はＭ２４９Ｌの変異を有するものは熱安定性が向上していた。特に、Ａ１７０ＳとＭ２４９Ｌの両方の変異を有するものは、さらに熱安定性が向上していた。すなわち、Ａ１７０Ｓ（（ｃ）の変異）、Ｍ２４９Ｌ（（ｆ）の変異）により、熱安定性が向上することが判明した。
また、Ａ１７０Ｓ、Ｍ２４９Ｌ及びＶ１６６Ａの変異のうち、２以上を有するものは熱安定性が向上することが判明した。
実施例５
実施例３と同様にして得られたＯＣＲ１及び表６に示す変異を有する菌体破砕物上清について酵素活性を測定した。
酵素活性は、表５に示す組成の反応液において、反応温度３０℃で、ＴＦＡＰ添加時のＮＡＤＰＨの減少量を３４０ｎｍの波長で測定することにより確認した。酵素活性の単位Ｕは、１分あたりの変換量（μｍｏｌ）を示す。
以下の反応において、カルボニル還元酵素の量は、上記酵素活性（ユニット：Ｕ）を元に秤量した。
また、ＤＯＸＥ及びＤＯＬＥはそれぞれ以下の構造を有する化合物である。
濃度１０ｇ／ＬのＤＯＸＥ、濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、濃度１２０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、濃度２ｍｏｌ％のＮＡＤＰ＋、濃度２０重量％のＤＭＳＯ、１０Ｕのカルボニル還元酵素及び５Ｕ～１０Ｕのグルコースデヒドロゲナーゼを含む２ｍＬの反応液を調製した。反応液を振とうさせながら５０℃で４時間反応させた。得られたＤＯＬＥを測定条件３でＨＬＰＣ分析した。結果を表６に示す。
表６から明らかなように、上記変異を有するものはＤＯＬＥ変換率が大幅に向上していた。すなわち、これらの変異を有するものは、カルボニル還元活性、反応効率が大きく向上することが判明した。
参考例２
本参考例は、国際公開第２０１５／１１９２６１号の実施例４－４に記載の方法である。
１Ｌのジャーファーメンター（エイブル社製、型式ＢＭＪ－０１）に、イオン交換水３８５．９ｍＬ、グルコース４８．３ｇ（２６８．１ｍｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）１３８ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、リン酸水素二カリウム８．２９ｇ（４７．６ｍｍｏｌ）、及びリン酸二水素カリウム３．９７ｇ（２９．２ｍｍｏｌ）を仕込み溶解させた。そこに、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１－ＧＤＨの凍結菌体５０．６０ｇ、及びＤＭＳＯ１２４．２０ｇ（１５８９．７ｍｍｏｌ）にＤＯＸＰ１４．４ｇ（２７．７ｍｍｏｌ）を溶かして調製した基質溶液全量を添加し、内温５０℃で５時間撹拌した。反応中は２５重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを６に保持した。ＤＯＬＰが得られていることは、ＨＰＬＣの保持時間（retention time）で確認し、このときの転化率は９０．２５％であった。
ここで、ＤＯＸＰ及びＤＯＬＰはそれぞれ以下の構造を有する化合物である。
実施例６
実施例１で得られた形質転換体ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１（Ａ１７０Ｓ／Ｉ２１１Ａ／Ｍ２４９Ｌの変異を有するもの（配列番号１６））－ＧＤＨを、濃度２５ｍｇ／Ｌカナマイシン及び濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を回収し、参考例２と同様の方法で反応を行ってＤＯＬＰを得た。
得られたＤＯＬＰを測定条件４でＨＰＬＣ分析したところ、転化率は９５．９８％であり、参考例２と比較して転化率が向上していた。
Ａ１７０Ｓ（（ｃ）の変異）、Ｉ２１１Ａ（（ｄ）の変異）及びＭ２４９Ｌ（（ｆ）の変異）の変異を有することにより、反応効率が向上することが判明した。
本発明によれば、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬品、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性化合物に変換する活性を有するカルボニル還元酵素、該カルボニル還元酵素をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体を提供することができる。さらに、本発明によれば、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な光学活性化合物を、高純度で高光学純度で、かつ安価に工業的に得られる製造方法を提供し、該医薬品、農薬等の生産効率を向上させ、増産することができる。
本出願は日本で出願された特願２０１９－２１１７９７（出願日：２０１９年１１月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表されるアミノ酸配列全長と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である該アミノ酸配列のホモログにおいて、以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するカルボニル還元酵素。
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列における５４番目のアスパラギン酸がバリンに置換される変異
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列における１７０番目のアラニンがセリンに置換される変異
    （ｄ）配列番号１のアミノ酸配列における２１１番目のイソロイシンがアラニン又はアスパラギンに置換される変異
    （ｆ）配列番号１のアミノ酸配列における２４９番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
  2. 前記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）からなる群から選ばれる少なくとも２つの変異を有することを特徴とする請求項１に記載のカルボニル還元酵素。
  3. さらに以下の（ｂ）及び／又は（ｅ）の変異を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のカルボニル還元酵素。
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における１５７番目のメチオニンがバリンに置換される変異
    （ｅ）配列番号１のアミノ酸配列における２１４番目のメチオニンがロイシンに置換される変異
  4. 配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のホモログにおいて、さらに（ｇ）配列番号１のアミノ酸配列における１６６番目のバリンがアラニンに置換される変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する請求項１～３のいずれか１項に記載のカルボニル還元酵素。
  5. 下記一般式（I）、（II）及び（III）で表される化合物からなる群より選ばれるカルボニル基含有化合物を、
    （上記式（I）、（II）及び（III）において、Ｒは水素原子、アルキル基又はアリール基を示し、
    は
    から選択される置換基を示す。）
    請求項１～４のいずれか一項に記載のカルボニル還元酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞を有機溶媒又は界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの、微生物若しくは細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したものから選択され、且つ本発明のカルボニル還元酵素を含有する又は本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有するもの、及び／又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液に接触させてカルボニル基含有化合物を不斉還元させることを特徴とする下記一般式（IV）
    （式中、Ｒ及び
    は前記と同義である。）
    で表される光学活性化合物の製造方法。
  6. 前記式（II）及び前記式（III）で表されるカルボニル基含有化合物が、それぞれ下記式（II’）
    （式中、Ｒ及び
    は前記と同義である。）
    及び下記式（III’）
    （式中、Ｒ及び
    は前記と同義である。）
    で表される光学活性体であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
  7. 置換基
    が
    である、請求項５又は６記載の製造方法。
  8. 前記微生物又は細胞が、請求項１～４のいずれか一項に記載のカルボニル還元酵素をコードする核酸であって、以下の（ｐ）、（ｑ）又は（ｒ）に示す塩基配列を含む核酸で形質転換された微生物又は細胞である、請求項５～７のいずれか一項に記載の製造方法。
    （ｐ）配列番号２で表される塩基配列において、１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加された塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
    （ｑ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
    （ｒ）配列番号２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつカルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
  9. 請求項１～４のいずれか一項に記載のカルボニル還元酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞を有機溶媒又は界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの、微生物若しくは細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したものから選択され、且つ本発明のカルボニル還元酵素を含有する又は本発明のカルボニル還元酵素を生産する能力を有するもの、及び／又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を含み、下記一般式（I）、（II）
    及び（III）
    （上記式（I）、（II）及び（III）において、Ｒは水素原子、アルキル基又はアリール基を示し、
    は
    から選択される置換基を示す。）
    で表される化合物からなる群より選ばれるカルボニル基含有化合物から、下記一般式（IV）
    （式中、Ｒ及び
    は前記と同義である。）
    で表される光学活性化合物を生成する反応を触媒する組成物。
  10. 置換基
    が
    である、請求項９記載の組成物。
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