JP7716995B2 - 試料中のＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓの存在を決定する際に使用するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月３日に出願された仮出願第６２／８７０，３０８号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

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ファイルＤＩＡ．０１０６．０２＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５に記述された配列表は、サイズが３８キロバイトであり、２０２０年６月２５日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓは、最も一般的で治療可能な性感染症のうちの１つであるトリコモナス症を引き起こす寄生原生動物である。世界中で、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓは、通常、直接の人と人との接触によって、年間約１億８０００万人に感染しており、最も一般的な性感染症（ＳＴＤ）の動作主にしている。米国では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓは年間推定７００万人に感染していると考えられている。その有病率にもかかわらず、積極的な管理または予防プログラムはない。女性の感染症は、膣炎、尿道炎、子宮頸管炎を引き起こすことが知られている。合併症としては、早産、低出生体重児、早期破水、中絶後および子宮摘出後の感染症が挙げられる。骨盤内炎症性疾患、卵管性不妊症、および子宮頸がんとの関連が報告されている。Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓはまた、ＨＩＶおよび他のＳＴＤ動作主における感染の補因子としても関与している。この生物はまた、産道を通過する間に新生児に渡される可能性がある。男性の場合、トリコモナス症の症状としては、尿道異常分泌物、尿道狭窄、精巣上体炎、尿意切迫感、および排尿時灼熱痛が挙げられる。女性では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ感染症の１０～５０％は無症候性であると推定されている。この数は、男性の方が多いと思われる。

その相対的な有病率と他のＳＴＤとの関連を考えると、トリコモナス症を効果的に診断することへの関心が高まっている。細胞培養は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの臨床的検出のための現在の「絶対的基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」とみなされている。しかしながら、その比較的繊細な性質のために、生物の培養は技術的に困難であり、最大の感度を得るには通常最大７日かかる。それでも、細胞培養法の感度は約８５～９５％と推定されている。

オリゴヌクレオチドおよび組成物、ならびにＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相（二相を含む）増幅および／または検出のためにオリゴヌクレオチドおよび組成物を使用する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび組成物、ならびにオリゴヌクレオチドおよび組成物を使用する方法は、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを増幅および／または検出するために記載されている。多相増幅では、標的核酸配列の少なくとも一部分を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で第１相の増幅反応に供する。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これを、その後に第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に供し、それにより、第２の増幅産物を生成する。多相増幅は、単相形式と比較して、分析物濃度の下限で改善された感度および精度をもたらす。多相増幅は、精度および検出時間の短縮の両方の点で優れた性能を発揮する。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列の多相増幅は、
ａ）Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的捕捉混合物と接触させることであって、標的捕捉混合物が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（プロモータープライマー）、および任意選択的に標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を含んで、前増幅ハイブリッドを形成する、接触させることと、
ｂ）前増幅ハイブリッドを単離することと、
ｃ）前増幅ハイブリッドを第１相の増幅混合物と接触させることであって、第１相の増幅混合物が、非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（非プロモータープライマー）、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含み、第１相の増幅混合物が、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している、接触させることと、
ｄ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、線形増幅を支持して、第１の増幅産物を形成する条件下で、前増幅ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅することと、
ｅ）第１の増幅産物を第２相の増幅混合物と接触させることであって、第２相の増幅混合物が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド、または第１相の増幅混合物に欠如している指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を含む、接触させることと、
ｆ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、第１の増幅産物を指数関数的に増幅して、第２の増幅産物を生成することと、
ｇ）第２の増幅産物を検出することと、を含む。
いくつかの実施形態では、第２相の増幅混合物は、検出オリゴヌクレオチドを含有する。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列は、配列番号１７３によって表されるＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ １６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列の一部分を含有するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。

いくつかの実施形態では、標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）は、標的核酸配列の領域に相補的な標的特異的（ＴＳ）配列と、固定化捕捉プローブ結合領域と、を含む。固定化捕捉プローブ結合領域は、核酸配列であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３９、４０、もしくは４１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含む。

いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、３’標的特異的配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む５’プロモーター配列を含む、増幅オリゴヌクレオチドである。３’標的特異的配列は、標的核酸の領域（プロモータープライマー結合部位）に対して相補的な領域を含有し、標的核酸にハイブリダイズする。プロモータープライマーは、標的核酸中のその標的配列（プロモータープライマー結合部位）に結合し、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼによるＲＮＡまたはＤＮＡの鋳型依存性合成を開始することができる。プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２を含む。

いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドは、プロモータープライマーにハイブリダイズした標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドは、ＴＣＯおよびプロモータープライマーのそれぞれにハイブリダイズした標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドを単離することは、固体支持体を使用して前増幅ハイブリッドを捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、固定化捕捉プローブを含む。固体支持体は、磁気的に引き付け可能な粒子であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドを単離することは、標的核酸にハイブリダイズしていないプロモータープライマーを除去することを含む。

いくつかの実施形態では、非プロモータープライマー（ＮＴ７プライマーとも称される）は、プロモータープライマー末端の下流で、プロモータープライマーの伸長のｃＤＮＡ産物中のその標的配列に特異的に結合する増幅オリゴヌクレオチドである。プロモータープライマーは、非プロモータープライマーと組み合わされて、増幅対を形成し、一緒に標的核酸の一部分を増幅するように構成される。非プロモータープライマーは、プロモータープライマーのＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を欠いている。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１相の等温の転写関連増幅反応中、標的核酸を鋳型として使用して、その標的配列の標的核酸に特異的に結合したプロモータープライマーを逆転写酵素（ＲＴ）によって伸長させて、ｃＤＮＡコピーを作製する。次いで、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、非プロモータープライマーを酵素的に伸長させて、二本鎖ＤＮＡを生成する。次に、二本鎖ＤＮＡは、プロモータープライマーによって提供されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターからのＲＮＡ転写の鋳型として機能する。次いで、非プロモータープライマーは、ＲＮＡに結合し、逆転写酵素によって伸長されて、第１の増幅産物をもたらす。追加のプロモータープライマーの不在下では、指数関数的増幅は生じない。次いで、第１の増幅産物を第２相の増幅混合物と接触させて、指数関数的な第２相の増幅を開始する。

いくつかの実施形態では、第１相および第２相の等温の転写関連増幅反応の各々は、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、内因性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を含む。

いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、第２の増幅産物に存在する核酸塩基配列に相補的な標的特異的（ＴＳ）配列を含む。検出オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、１０以上の核酸塩基の長さである。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、１０～３０の核酸塩基の長さである。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、検出可能な分子を含有する。いくつかの実施形態では、検出可能な分子は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含有する。検出オリゴヌクレオチドは、Ｔｏｒｃｈであり得るが、これに限定されない。検出オリゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせであり得る。検出オリゴヌクレオチドはまた、メトキシＲＮＡが含まれるが、これに限定されない、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相増幅の第１相の増幅に使用するのに好適な組成物は、（ａ）任意選択的な標的捕捉オリゴヌクレオチド、（ｂ）Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしたプロモータープライマー、（ｃ）非プロモータープライマー、および（ｄ）線形第１相の増幅反応中の標的核酸の増幅に必要であるが、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している追加の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如しているのは、追加の（遊離）プロモータープライマーである。いくつかの実施形態では、第１相の増幅は、標的核酸にハイブリダイズしていないプロモータープライマーを欠如している。追加の構成要素には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリマー、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、および塩のうちの１つ以上が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相増幅の第２相またはその後の相の増幅で使用するのに好適な組成物は、（ａ）第１の増幅産物、（ｂ）プロモータープライマー、（ｃ）非プロモータープライマー、（ｄ）指数関数的な第２相の増幅反応中の標的核酸の増幅に必要な他の必要な構成要素を含む。追加の構成要素には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリマー、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、および塩のうちの１つ以上が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相増幅および／または検出のための方法が記載される。方法は、
（ａ）標的核酸配列の第１の部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的核酸配列の第１の部分に特異的なプロモータープライマーと接触させ、それにより、第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することと、
（ｂ）固体支持体への標的捕捉およびそれに続く洗浄によって前増幅ハイブリッドを単離して、工程（ａ）で標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしなかったプロモータープライマーのいずれも除去することと、
（ｃ）第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅は支持するが、その指数関数的増幅は支持しない（すなわち、第１相の増幅反応混合物が、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している）条件下で、工程（ｂ）で単離された前増幅ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を、第１相の増幅反応混合物中で、増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことと、
（ｄ）第１の増幅産物を含む反応混合物を、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要であるが、第１の増幅産物を含む反応混合物には欠如している少なくとも１つの構成要素と組み合わせて、第２相の増幅反応混合物を生成することと、
（ｅ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、第２相の増幅混合物中の第１の増幅産物を指数関数的に増幅して、第２の増幅産物を生成することと、
（ｆ）任意選択的に第２の増幅産物を検出することと、を含む。

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素は、プライマープロモーター（例えば、標的核酸とハイブリダイズし、前増幅ハイブリッドの一部として単離したプロモータープライマーに加えて、プロモータープライマー）を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の第１の増幅産物は、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、工程（ｅ）の第２の増幅産物は、ＲＮＡ分子である。第２の増幅産物は、配列特異的検出プローブを使用して検出することができる。配列特異的検出プローブは、第２の増幅産物にハイブリダイズするときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度プローブであり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、工程の配列特異的検出プローブは、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである。検出することは、一定の時間間隔で実施することができる。いくつかの実施形態では、検出することは、リアルタイムで実施される。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物を検出することは、線形検量線を使用して試料中の標的核酸配列を定量化することを含む。

いくつかの実施形態では、記載されたオリゴヌクレオチド、組成物、および方法を使用して、試料中中に存在するＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ １６ＳｒＲＮＡを、１０細胞／ｍｌ以下、１細胞／ｍｌ以下、０．１細胞／ｍｌ以下、または０．０１細胞／ｍｌ以下のコピーで検出することができる。いくつかの実施形態では、記載されたオリゴヌクレオチド、組成物、および方法を使用して、０．００２細胞／ｍｌ以上を有する試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ １６ＳｒＲＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、記載されたオリゴヌクレオチドを使用する検出率は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓが試料中に０．００２細胞／ｍｌ以上で存在する場合、９０％以上または９５％以上である。

いくつかの実施形態では、記載されたオリゴヌクレオチド、組成物、および方法は、多重多相反応におけるＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅および／または検出に使用するのに好適である。多重多相反応を使用して、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓならびに１つ以上の他の標的配列および／または生物を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＣＶ／ＴＶ多重アッセイが記載されている。ＣＶ／ＴＶ多重アッセイは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、およびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの捕捉、増幅、および検出のためのオリゴヌクレオチドを含有する。

多相（二相を含む）順転写媒介増幅（ＴＭＡ）を示すフローチャートである。この実施形態では、Ｔ７プロモーターを含有する増幅プライマー（「Ｔ７プライマー」）は、標的捕捉中に標的核酸配列にハイブリダイズし、続いて過剰のＴ７プライマーを除去する。増幅プロセスは、少なくとも２つの異なる相に分けられる。第１の相では、追加のＴ７プライマー（ＲＴ：逆転写酵素、Ｔ７：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を除いて、必要な増幅試薬および酵素試薬（それぞれ、ＡＲおよびＥＲ）のすべてとともにＮＴ７プライマーが導入される。逆転写酵素の存在下で、標的にハイブリダイズしたＴ７プライマーが伸長され、ｃＤＮＡコピーを作製し、標的ＲＮＡ鋳型を、ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈ活性によって分解される。その後に、ＮＴ７プライマーは、ｃＤＮＡにハイブリダイズして、次いで伸長し、Ｔ７プライマーのプロモーター領域を充填し、活性二本鎖鋳型を作製する。次いで、Ｔ７ポリメラーゼは、鋳型から複数のＲＮＡ転写産物を生成する。その後に、ＮＴ７プライマーは、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズし、伸長し、標的ＲＮＡ鋳型の無プロモーターｃＤＮＡコピーを生成する。ＲＮＡ鎖は、ＲＴのＲＮａｓｅ活性によって分解される。１相増幅混合物中には利用可能な追加のＴ７プライマーがないため、反応はそれ以上進行することができない。次いで、第２相は、Ｔ７プライマーの添加で開始されるため、１相で生成されたｃＤＮＡプールの指数関数的増幅が開始される。

開示を明確にするために、また限定するものではなく、本発明の詳細な説明は、以下のサブセクションに分けられる。

Ａ．定義
本明細書において参照される特許、出願、公開出願、および他の刊行物はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。異なる内容が異なる時間に同じ引用に関連付けられる可能性がある限り、有効出願日の引用に関連付けられた内容を意味する。有効出願日とは、引用が開示される最も早い優先日を意味する。文脈から明らかでない限り、本発明の任意の要素、実施形態、工程、特徴または態様は、他の任意のものと組み合わせて実施することができる。本発明のこの節に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載されている定義に反するか、またはそうでなければ矛盾する場合、この節に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。

本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。

本明細書および特許請求の範囲全体を通して、近似の言語を適用して、それが関連する基本的な機能の変化をもたらすことなく許容できる程度に変化する可能性のある任意の定量的または定性的表現を修飾することができる。したがって、「約」または「およそ」などの用語によって修飾された値は、特定の正確な値に限定されるものではなく、特定の値とは異なる値を含み得る。いくつかの実施形態では、約またはおよそは、わずかな変動および／または５％未満の変動を示す。

「試料」は、対象となる分析物、例えば、微生物、ウイルス、遺伝子などの核酸（例えば、標的核酸）、または分析物中の核酸配列もしくは分析物に由来する核酸配列を含むその構成要素を含有するか、または含有することが疑われる検体または物質である。試料は、任意の起源に由来するものであり、例えば、生体検体、臨床検体、および環境源であるが、これらに限定されない。生体検体としては、分析物または分析物中の核酸もしくは分析物に由来する核酸を含有し得る生きているか、または死んだ生物に由来する組織または材料が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料の例としては、呼吸器組織、滲出液（例えば、気管支肺胞洗浄）、生検、喀痰、気管吸引物、唾液、粘液、末梢血、血漿、血清、リンパ節、脳脊髄液、胃腸組織、糞便、尿、泌尿生殖器、体液、組織または材料、および性器病変、肛門性器病変、口腔病変、粘膜皮膚病変、皮膚病変、眼病変またはそれらの組み合わせからの、またはそれらに由来する生検が挙げられるが、これらに限定されない。環境試料の例には、水、氷、土壌、スラリー、破片、バイオフィルム、大気粒子、およびエアロゾルが含まれるが、これらに限定されない。試料は、例えば、培養培地中の細胞および組織の成長から生じる馴化培地を含む、インビトロ細胞培養成分の試料も含んでもよい。試料は、濾過、遠心分離、沈降、またはマトリックスもしくは支持体などの培地への付着を使用することによって試料を処理することから得られるもののような、処理された検体または材料であってもよい。試料の他の処理には、組織、細胞凝集体、または細胞を物理的または機械的に破壊して、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などの他の構成要素を含有し得る溶液中に核酸を含む細胞内構成要素を放出するための処理が含まれ得るが、これらに限定されない。

「接触させること」という用語は、２つ以上の構成要素を一緒にすることを意味する。接触させることは、すべての構成要素を流体または半流体混合物中で混合することによって達成することができる。接触させることは、１つ以上の構成要素が、固体組織切片または基板などの固体表面上の１つ以上の他の構成要素と物理的に接触するときに達成することができる。

「核酸」は、標準的なホスホジエステル結合または他の結合によって共有結合された、窒素含有複素環式塩基もしくは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物を指す。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ－ＲＮＡポリマーまたはそれらの類似体を含む。核酸において、骨格は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）結合（ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、さまざまな結合から構成され得る。核酸の糖部分は、限定されないが、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物（例えば、２’－Ｆ）置換を有する同様の化合物であり得る。窒素塩基は、限定されないが、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、イノシン、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２）であってもよく、これは、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、さまざまな化学的位置のいずれかに改変または置き換え置換基を有するピリミジンまたはプリン、例えば、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、およびＯ４－アルキル－ピリミジン、またはピラゾロ－化合物、例えば、非置換または３－置換ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。核酸は、骨格が１つ以上の位置に窒素塩基を有しない「非塩基性」位置を含んでもよく（米国特許第５，５８５，４８１号）、例えば、１つ以上の非塩基性位置は、別個のオリゴヌクレオチド配列を一緒に結合するリンカー領域を形成し得る。核酸は、従来のＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような従来の糖、塩基、および結合のみを含んでもよいか、または従来の成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格によって結合された従来の塩基、もしくは従来の塩基と１つ以上の類似体との混合物を含有するポリマー）を含んでもよい。本用語には、糖立体配置を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する「ロックド核酸」（ＬＮＡ）が含まれ、これは、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡ中の相補的配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（４２）：１３２３３－４１）。核酸は、修飾された塩基を含み得る。修飾された塩基は、核酸の機能または挙動を変更し得る。特に特許請求の範囲における「配列番号Ｘの配列」への言及は、別に示さない限り、対応する配列表に記載の塩基配列を指し、骨格（例えば、ＲＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）の同一性または塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）を必要としない。

「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含有する核酸である。「標的核酸配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、増幅される、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓなどの標的生物のヌクレオチド配列を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列である。標的配列またはその相補体は、ハイブリダイズして、標的核酸の増幅および／または検出に使用されるオリゴヌクレオチド、増幅オリゴヌクレオチド、および／または検出オリゴヌクレオチドを捕捉する配列を含有する。標的核酸は、増幅されなくてもよい標的配列以外の他の配列を含んでもよい。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、ゲノム核酸、ｒＲＮＡなどの転写された核酸、またはゲノム核酸もしくは転写された核酸に由来する核酸であり得るが、これらに限定されない。

「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、または「オリゴ」は、一緒に結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットから構成されたポリマーである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびにこれらの類似体であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５～１５ｎｔの下限および５０～５００ｎｔの上限を有するサイズ範囲にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～１００ｎｔ、１０～９０ｎｔ、１０～８０ｎｔ、１０～７０ｎｔ、または１０～６０ｎｔのサイズ範囲にある。オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からはならない。オリゴヌクレオチドは、任意の周知のインビトロの化学的または酵素的方法を使用することによって合成的に作製することができ、標準的な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって合成後に精製することができる。オリゴヌクレオチドには、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーとも称される、例えば、Ｔ７プライマー）、非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＴ７プライマー、非プロモータープライマーとも称される）、検出プローブオリゴヌクレオチド（検出オリゴまたは検出プローブとも称される、例えば、Ｔｏｒｃｈ）、および標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣオリゴ）が含まれることが記載されている。Ｎ７およびＮＴ７プライマーはプライミングオリゴヌクレオチドであり、「増幅オリゴヌクレオチド」と称されることがある。

ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、およびそれらの類似体であり得、これには、例えば、メトキシＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない、２’－置換を有するリボヌクレオシドが含まれる。（２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含み、検出プローブ、捕捉プローブ、および／または増幅オリゴヌクレオチドとして有用なオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」、米国特許第６，１３０，０３８号によって開示されている。）ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾された結合などの結合によって、またはオリゴヌクレオチドのその相補的標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって結合され得る。修飾された結合には、標準的なホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合などの異なる結合で置き換えられている結合が挙げられる。核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然のデオキシリボースリン酸骨格を、カルボキシメチルリンカーによって中央の二級アミンに核酸塩基サブユニットを結合する２－アミノエチルグリシン骨格などの疑似ペプチド骨格で置き換えることによって結合することができる。（擬似ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は、一般に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。）オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの他の非限定的例。修飾オリゴヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズすることができるという条件で、任意の核酸類似体が本開示によって企図される。検出プローブの場合、修飾オリゴヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができなければならない。記載されたオリゴヌクレオチドは、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓもしくはＣａｎｄｉｄａ標的核酸またはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓもしくはＣａｎｄｉｄａ標的核酸に由来する核酸配列に特異的にハイブリダイズするように構成される。

配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用し、デフォルトのギャップパラメータを使用して配列を整列させることによって、または検査および最良の整列（すなわち、比較ウィンドウ全体にわたる最高の配列類似性の割合をもたらす）によって、決定することができる。配列同一性の割合は、比較ウィンドウ全体にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、比較ウィンドウ内のギャップ（すなわち、ウィンドウサイズ）を計数せずにマッチした位置の数をマッチした位置およびミスマッチの位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合をもたらすことによって計算される。別段の指示がない限り、２つの配列間の比較ウィンドウは、２つの配列のうちのより短い方の全長によって定義される。

「相補性」という用語は、従来のワトソン・クリックまたは他の非従来型のいずれかによって、ポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する（ハイブリダイズする）能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる第１の核酸配列内の連続鎖中の塩基の割合を示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。相補性パーセントは、同一性パーセントと同様の方法で計算される。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴヌクレオチドが標的核酸（例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓに由来するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズすることを可能にするが、密接に関連する非標的微生物に由来する核酸には優先的にハイブリダイズすることを可能にしない条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、プローブ配列と試験試料中に存在し得る非標的配列の配列との間の類似性の程度、ならびに標的配列を含む因子に応じて変わり得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。

標的核酸の「増幅」は、標的核酸配列の少なくとも一部と同一および／または相補的である標的核酸の複数のコピーをインビトロで作成するプロセスを指す。核酸増幅手順の例には、転写転写媒介増幅が挙げられる（ＴＭＡ、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）。

「単相増幅」は、増幅の開始時に、核酸増幅に必要なすべての構成要素が反応混合物に存在する核増幅反応を指す。単相増幅では、所望の増幅反応とともに開始される望ましくない副反応がしばしば競合し、所望の増幅反応の全体的な性能を低下させる。多重単相増幅反応において、反応混合物中に大量に存在する分析物、または全体的な増幅効率が他の分析物よりも高い分析物の増幅は、混合物中の他の分析物と過度に競合し、増幅を低下させる。

「増幅産物」は、核酸増幅反応において生成され、かつ標的核酸に由来する核酸分子であるか、または標的核酸に由来する核酸自体である。増幅産物は、標的核酸と同じまたは反対方向であり得る標的核酸配列のすべてまたは一部を含有する。

「線形増幅」は、反応中の標的核酸の量に線形比例する標的核酸の増加を生成するように設計される増幅機構を指す。例えば、転写関連反応を使用してＤＮＡ標的から複数のＲＮＡコピーを作製することができ、コピー数の増加は、線形因子（例えば、鋳型の開始コピー×ｎ）によって記載することができる。いくつかの実施形態では、多相増幅手順における第１相の線形増幅は、第２相の増幅反応の開始前に、標的核酸鎖またはそれらの相補体の開始数を少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍増加させる。線形増幅システムの例は、“Ｔ７－ｂａｓｅｄ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ”（ＴＬＡＤ、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：Ａｒｔ．Ｎｏ．１９，Ｍａｙ ９，２００３を参照されたい）である。他の方法を、本明細書に開示する。したがって、「線形増幅」という用語は、標的核酸配列の指数関数的増幅をもたらさない増幅反応を指す。「線形増幅」という用語は、逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲの場合のようにＲＮＡ分子の単一ｃＤＮＡ分子への転写などの、核酸鎖の単一コピーを単純に作製する方法を指すものではない。

「指数関数的増幅」は、反応中の標的核酸の量に幾何学的に比例する標的核酸の増加を生成するように設計される核酸増幅を指す。例えば、ＰＣＲは、あらゆる元の標的鎖および存在するあらゆる合成鎖に対して、１つのＤＮＡ鎖を生成する。同様に、転写関連増幅は、あらゆる元の標的鎖およびその後に合成されるあらゆる鎖に対して、複数のＲＮＡ転写物を生成する。合成された鎖がその後の増幅ラウンドにおいて鋳型として使用されるため、増幅は、指数関数的である。増幅反応は、増幅反応がそのような増加を生成するように設計されている限り、指数関数的増幅とみなされる指数関数的に増加する量の核酸を実際に生成する必要はない。

「実質的に等温の増幅」という用語は、実質的に一定の温度で実行される増幅反応を指す。反応の等温部分は、可変温度での１つ以上の工程、例えば、第１の変性工程および最終熱不活性化工程または冷却工程の前または後にあり得る。この定義は、温度の小さな変動を排除するのではなく、むしろ増幅産物を生成するために基本的に「サイクリング温度」に依存する当該技術分野で既知の他の増幅技術から等温増幅技術を区別するために使用されることが理解される。等温増幅は、例えば、ＰＣＲが加熱ならびにそれに続くプライマーのハイブリダイゼーションおよび低温での重合による変性サイクルに依存する点で、ＰＣＲとは異なる。

値の範囲の参照には、範囲内の整数、および範囲内の整数によって定義されたサブ範囲も含まれる。

Ｂ．多相増幅の方法
開示された方法はまた、核酸鋳型から複数の転写物を生成することによって標的配列を増幅する、一般に「転写関連増幅」法と称される等温増幅システムの態様を使用する。そのような方法は一般に、１つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを使用し、そのうちの１つは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を提供して、標的配列の近くに機能的プロモーター配列を生成し、次いでプロモーターから標的配列を転写する（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号および同第７，３７４，８８５号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９８８／００１３０２号、同第ＷＯ１９８８／０１０３１５号および同第ＷＯ１９９５／００３４３０号）。例には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および自家持続配列複製（３ＳＲ）が含まれる。

本明細書に開示される実施形態のうちのいくつかの理解を助けるために、以前に詳細に記載されたＴＭＡ方法（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、および同第５，８２４，５１８号）を簡潔に要約する。ＴＭＡでは、増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸に変換する任意の従来の方法を使用することができる。プロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）は、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖をもたらす。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを消化する。第２のプライマー（例えば、ＮＴ７プライマー）は、プロモーター－プライマー末端の下流で、ｃＤＮＡ中のその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴは、ｃＤＮＡを鋳型として使用して第２のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを作製する。機能的プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、最初の標的鎖に相補的な複数（例えば、１００～１０００個）のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を生成する。第２のプライマーは、各アンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、アンプリコンＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作製して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を生成する。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖アンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列は、新しく合成されたＤＮＡのその相補的配列に結合し、ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端およびｃＤＮＡの３’末端を伸長させて、ＲＮＡポリメラーゼが結合する機能的プロモーターを含有し、標的鎖に相補的な追加のアンプリコンを転写するｄｓＤＮＡを作製する。反応中にこれらの工程を繰り返し使用する自己触媒サイクルは、最初の標的配列の増幅を生成する。アンプリコンは、増幅中（リアルタイム検出）または反応の終点（終点検出）で、アンプリコンに含有される配列に特異的に結合するプローブを使用することによって検出することができる。結合プローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。

多相増幅手順を使用してＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓを増幅および／または検出する方法が記載される。本方法は、以下の工程を含む、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を増幅することを含む。最初に、標的核酸配列を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で第１相の増幅反応に供する。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これを、その後に第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に供し、それにより、第２の増幅産物を生成する。

Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの標的核酸配列は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列は、配列番号１７３によって表される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列の一部を含むヌクレオチド配列、またはその相補体である。いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列は、配列番号１７４またはその相補体を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列は、配列番号１７５またはその相補体を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列は、配列番号１７３、１７４、もしくは１７５に存在するヌクレオチド配列またはそれらの相補体からなる。

いくつかの実施形態では、プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分（プロモータープライマー結合部位）は、標的捕捉オリゴヌクレオチドが標的とする部分（使用される場合）とは異なる（例えば、重複しない）可能性がある。プロモータープライマー結合部位は、標的捕捉オリゴヌクレオチド結合部位と完全にまたは部分的に重複しても、同一であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列の増幅された領域は、標的捕捉結合部位と部分的にまたは完全に重複する。いくつかの実施形態では、標的配列の増幅された領域は、標的捕捉結合部位と重複しない。

いくつかの実施形態では、第１の増幅工程の前に、試料を、試料中の標的核酸配列の一部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、１つ以上のプロモータープライマーと接触させる。プロモータープライマーは、３’標的特異的（ＴＳ）配列、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、および任意選択で１つ以上のタグ配列を含む。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼによって認識される。タグ配列は、増幅プライマー結合部位、捕捉に使用される特異的結合部位、または配列決定プライマー結合部位であり得るが、これらに限定されない。１つ以上のプロモータープライマーは、同じ標的核酸配列を標的としても、異なる標的核酸配列を標的としてもよい。異なる標的核酸配列は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。

いくつかの実施形態では、第１相の増幅前に標的核酸配列を単離することが望ましい場合がある。この目的のために、試料は、標的核酸配列の一部分（ＴＣＯ結合部位）への標的捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば、固定化捕捉プローブとの相互作用によって、固体支持体上に直接捕捉される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、３分子複合体（前増幅ハイブリッド）のメンバーとして固体支持体上に捕捉され、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、標的核酸および固定化捕捉プローブを架橋する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁場を使用して操作することができる複数の磁性または磁化可能な粒子またはビーズを含む。標的核酸配列を単離する工程は、標的捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸配列ハイブリッドを洗浄して、その後の増幅を妨害し得る望ましくない構成要素を除去することを含み得る。標的核酸配列を単離する工程は、標的捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸配列ハイブリッドを洗浄して、標的核酸にハイブリダイズしていない過剰なプロモータープライマーを実質的に除去することも含み得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸配列を単離する工程は、標的核酸配列へのプロモータープライマーおよびＴＣＯのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料をプロモータープライマーおよびＴＣＯと接触させることを含む。プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチドが標的とする部分とは異なる（例えば、重複しない）可能性がある。プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分は、標的捕捉オリゴヌクレオチドが標的とする部分と完全にもしくは部分的に重複しても、それと同一であってもよい。プロモータープライマーは、３’標的特異的配列、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、および任意選択で１つ以上のタグ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼによって認識される。タグ配列は、増幅プライマー結合部位、捕捉に使用される特異的結合部位、または配列決定プライマー結合部位であり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび１つ以上のプロモータープライマーが、標的捕捉試薬（ＴＣＲ混合物）中に提供される。１つ以上のプロモータープライマーを、１つ以上の標的核酸配列にハイブリダイズさせて、（ＴＣＯとともに）前増幅ハイブリッドを形成し、標的捕捉工程中に１つ以上の標的核酸配列とともに単離することができる。この方法の１つの利点は、標的捕捉中にプロモータープライマーを標的核酸配列にハイブリダイズさせることによって、捕捉された核酸を洗浄して、ハイブリダイズしていないプロモータープライマーを含む試料構成要素を除去することができることである。多相反応では、ハイブリダイズしていないプロモータープライマーを除去することにより、過剰なプロモータープライマーからの干渉なく第１相の増幅を生じさせることができ、それにより、多重反応に一般的な問題を実質的に低下させるか、または排除する。単相多重増幅反応では、プライマーは、互いに干渉する可能性がある。過剰なプライマーは、ユニプレックスおよび多重反応において、より容易にミスプライミング（非標的核酸にハイブリダイズ）する。さまざまな生物が各々独自のｒＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを有する多重反応では、ミスプライミングは、より大きな懸念事項である。多相増幅は、ストリンジェントな条件下でプロモータープライマーをその目的の標的にハイブリダイズさせ、次いで過剰なプロモータープライマーを洗い流すことによって、これらの問題に対処する。多相増幅の第１相の増幅反応に存在する結果として生じる１：１のプライマー／標的比は、ミスプライミングのレベルまたは増幅時のいかなるミスプライミングの影響も低下させながら、その後の過剰なプライマーの添加を可能にするレベルまで、標的核酸の集団を後押しすることができる。

第１相の増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で実施される。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、線形増幅反応である。第１相の増幅反応は、典型的には、約２倍～約１０，０００倍の増幅を生成する。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、標的核酸配列の約１０倍～約１０，０００倍の増幅を生成する。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、実質的に等温であり、すなわち、それは、ＰＣＲおよび他の一般的な増幅技術に特徴的な熱サイクリングを伴わない。第１相の増幅反応は、４３±２℃、４３±２℃、４２±１℃、４２±０．５℃、４３±０．５℃、４４±０．５℃、４１～４５℃、または４２～４４℃で実施することができる。

いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、標的核酸配列を、標的核酸配列の線形増幅を支持し、その指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１つの構成要素を欠如している第１相の増幅反応混合物（例えば、ＡＭＰ混合物）と接触させることを伴う。いくつかの実施形態では、その指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１つの構成要素は、追加のまたは過剰なプロモータープライマーである。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ反応混合物は、１つ以上の増幅酵素を含む。１つ以上の増幅酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ混合物は、ＲＮａｓｅ Ｈ、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素などのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ混合物は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ混合物は、１つ以上の非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有増幅オリゴヌクレオチド（例えば、非プロモータープライマー（すなわち、ＮＴ７プライマー））を含有する。１つ以上の非プロモータープライマーは、同じ標的核酸配列を標的としても、異なる標的核酸配列を標的としてもよい。異なる標的核酸配列は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ混合物は、１つ以上の非プロモータープライマー、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。ＡＭＰ混合物は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および塩を含むがこれらに限定されない、他の構成要素をさらに含有し得る。

いくつかの実施形態では、指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素が欠如しており、指数関数的増幅を阻害する作用因子が存在し、かつ／または反応混合物の温度が指数関数的増幅の助けとなるものではないため、第１相の増幅反応は、指数関数的増幅反応を支持することができない。非限定的に、指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素の欠如、および／または阻害剤、および／または反応条件は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プロモータープライマー、非プロモータープライマー、またはそれらの組み合わせ）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、Ｃｌｅａｖａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ホスホリラーゼ、グリコシラーゼなど）、酵素補因子、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ^２＋、塩、緩衝液、酵素阻害剤、ブロッキングオリゴヌクレオチド、ｐＨ、温度、塩濃度、およびそれらの任意の組み合わせのいずれかから選択することができる。場合によっては、第１相の反応に存在する指数関数的増幅の阻害剤の効果を逆転させる作用因子などの欠如している構成要素が、間接的に関与し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の構成要素の欠如は、プロモータープライマー（前増幅ハイブリッドの一部として標的核酸にハイブリダイズしたプロモータープライマーを超える追加のプロモータープライマー）である。

第２相（または３つ以上の相が存在する場合、より後の相）の増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を可能にする条件下で実施される。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、指数関数的増幅反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、例えば、転写関連増幅反応または鎖置換増幅反応などの実質的に等温反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、４３±２℃、４３±２℃、４２±１℃、４２±０．５℃、４３±０．５℃、４４±０．５℃、４１～４５℃、または４２～４４℃で実施される。

いくつかの実施形態では、第２（またはより後の）相の増幅は、第２相の増幅反応混合物（例えば、ＰＲＯ混合物）を有する第１の増幅産物を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持する第１相の増幅反応混合物と組み合わせて接触させることを含む。したがって、第２相の増幅反応混合物は、典型的には、最低限、第１相の増幅反応混合物に欠如している指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、増幅オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーなど）、逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補因子、キレート剤、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ^２＋、最適なｐＨ、最適な温度、塩、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の構成要素を含む。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、ＲＮａｓｅ ＨまたはＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素などのＲＮａｓｅを含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、プロモータープライマー、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、検出オリゴをさらに含む。検出オリゴは、Ｔｏｒｃｈまたは分子ビーコンであり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、標的捕捉試薬は、１つ以上の標的捕捉オリゴヌクレオチドと１つ以上のＴ７プロモータープライマーを含有し、ＡＭＰ試薬は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、塩、および１つ以上の非Ｔ７プライマーを含有し、プロモーター（ＰＲＯ）試薬は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、塩、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、１つ以上のＴ７プロモータープライマーおよび１つ以上のトーチ（ｔｏｒｃｈ）オリゴヌクレオチドを含有し、酵素（ＥＮＺ）試薬は、緩衝液、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、キレート剤、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する。

本方法を使用して、生体試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を検出および／または定量化することができる。第２相の増幅反応は、定量的増幅反応であり得る。第２の増幅産物を検出するための方法も記載される。第２の増幅産物の検出および／または定量化は、当該技術分野で既知のさまざまな検出技術を使用して行うことができる。検出および／または定量化は、例えば、検出プローブ、配列決定反応、電気泳動、質量分析、融解曲線分析、またはそれらの組み合わせを使用することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、検出プローブを使用して検出および／または定量化される。検出プローブは、分子トーチ（米国特許第６，５３４，２７４号に記載のＴｏｒｃｈ）、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出および／または定量化は、リアルタイムで実施され得る。検出プローブは、実質的に等しい成功の度合いで、第１および／または第２相の増幅反応に含まれ得る。検出プローブは、第１および／または第２相の増幅反応混合物（例えば、ＡＭＰ混合物および／またはＰＲＯ混合物）中に供給され得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＯ混合物は、検出プローブを含有する。検出プローブは、Ｔｏｒｃｈを含むことができる。

いくつかの実施形態では、記載の方法は、第２の増幅産物を、増幅オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーまたは非プロモータープライマー）、逆転写酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素）、ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補因子、キレート剤、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ^２＋、塩、およびそれらの組み合わせから選択されるがこれらに限定されない、１つ以上の増幅構成要素の別のボーラスと接触させる工程をさらに含む。増幅反応構成要素のうちのいくつかが枯渇する可能性があるため、この追加の工程は、第２相の増幅反応に対する後押しを提供することができる。

記載された方法は、多重反応における試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅および／または検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、多重反応の場合、最初に、複数の標的核酸配列を、標的核酸配列のいずれの指数関数的増幅も支持しない条件下で第１相の増幅反応に供する。第１相の増幅反応は、複数の第１の増幅産物を生成し、これを、その後に第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の（および任意選択的にその後の相の）増幅反応に供し、それにより、第２の増幅産物を生成する。

いくつかの実施形態では、試料中の複数の異なる標的核酸配列を増幅するための方法が提供され、標的核酸配列のすべてではないがいくつかが線形増幅に供され、かつ／またはすべてではないがいくつかの標的核酸配列は指数関数的に増幅される。第１相の増幅の少なくとも４つの変形が企図される：（１）標的配列のうちのいくつかは、線形増幅に供され、残りは増幅されないままにされ、（２）標的配列のうちのいくつかは、指数関数的に増幅され、残りは増幅されないままにされ、（３）標的配列のうちのいくつかは線形増幅に供され、いくつかは指数関数的増幅に供され、残りは増幅されないままにされ、かつ（４）標的配列のうちのいくつかは線形増幅に供され、残りは指数関数的増幅に供される。いくつかの実施形態では、第１相の増幅は、標的核酸配列のすべての増幅をもたらす（オプション４）か、またはそのサブセットのみの増幅をもたらし得る（オプション１～３）。標的核酸配列のサブセットは、比較的少量で存在することが知られている標的および／または他の標的と比較して増幅が困難な標的を表し得る。第１相の増幅反応は、１つ以上の第１の増幅産物を生成する。次いで、試料中の第１の増幅産物および任意の増幅されていない標的核酸配列は、その指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に供され、複数の第２の増幅産物を生成する。いくつかの実施形態では、上記の条件１～４が最終相を除くすべての相に適用され得、最終相について、試料中の増幅されていないか、または線形に増幅された標的核酸配列が、指数関数的増幅を可能にする条件下で、増幅反応に供される、３つ以上の相があり得る。

多相ユニプレックス（すなわち、単一標的）増幅に関連して上で論じられたさまざまな任意の要素およびパラメータは、本明細書に記載の多相多重増幅モードにも適用可能であることが理解される。

Ｃ．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相増幅のための組成物
いくつかの実施形態では、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を捕捉するためのＴＣＲ混合物は、以下の：（ａ）標的核酸配列にハイブリダイズする領域を有する標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を含むものとして記載される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ混合物は、標的核酸配列にハイブリダイズするプロモータープライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ混合物は、任意選択で増幅酵素を含有する。ＴＣＲ混合物は、試料から標的核酸配列を単離および／または精製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸、ＴＣＯ、およびプロモータープライマーを含む前増幅ハイブリッドとして単離される。

「標的捕捉オリゴヌクレオチド」（ＴＣＯ）は、例えば、相補的核酸配列またはビオチンおよびストレプトアビジンなどの結合対メンバーを使用することにより、標的核酸および固定化捕捉プローブを架橋または結合する核酸オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、標的核酸に非特異的に結合し、それを固体支持体に固定化する。ＴＣＯは、標的核酸配列に対する配列相補性の領域、すなわち、標的特異的（ＴＳ）配列を含む。いくつかの実施形態では、標的捕捉オリゴヌクレオチドのうち、標的核酸中のＴＣＯ結合配列に特異的に結合する（ハイブリダイズする）。ＴＣＯ標的特異的配列は、標的核酸に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の相補性を有する１０～３５ヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列内の領域（ＴＣＯ結合部位）にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ標的特異的配列は、２０～３０のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ標的特異的配列は、２２～２６のヌクレオチドの長さであり、標的核酸に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相補性を有する。ＴＣＯ標的特異的およびＴＣＯ結合部位は、完全に相補的であっても、１つ以上のミスマッチが存在してもよい。両方のアプローチにおいて、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、（例えば、特異的結合対相互作用によって）固定化捕捉プローブに結合する固定化捕捉プローブ結合領域を含む。特異的結合対（または結合パートナー）のメンバーは、互いを特異的に認識し、互いに結合する部分である。メンバーは、第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）および第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と称されることがあり、これらは、一緒に特異的に結合するさまざまな部分を表す。特異的結合対は、例えば、受容体およびそのリガンド、酵素およびその基質、補因子または補酵素、抗体またはＦａｂ断片およびその抗原またはリガンド、糖およびレクチン、ビオチンおよびストレプタビジンまたはアビジン、リガンドおよびキレート剤、タンパク質またはアミノ酸およびその特異的結合金属（ヒスチジンおよびニッケルなど）、完全にまたは部分的に相補的な配列を含む実質的に相補的なポリヌクレオチド配列、ならびに相補的なホモポリマー配列によって例証される。特異的結合対は、天然に存在するもの（例えば、酵素および基質）、合成のもの（例えば、合成受容体および合成リガンド）、または天然に存在するＢＰＭと合成ＢＰＭとの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、標的特異的配列および固定化捕捉プローブ結合領域は両方とも、核酸配列である。標的特異的配列および捕捉プローブ結合領域は、互いに共有結合していても、１つ以上のリンカーによって結合された異なるオリゴヌクレオチド上にあってもよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブ結合領域は、ポリＡ配列、ポリＴ配列、またはポリＴ－ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＴ－ポリＡ配列は、ｄＴ３ｄＡ３０を含む。１つ以上の標的捕捉オリゴヌクレオチドを、標的捕捉および／または増幅反応に使用してもよい。１つ以上の標的捕捉オリゴヌクレオチドは、同じ標的配列に結合しても、異なる標的配列に結合してもよい。標的配列は、同じ遺伝子に由来しても、異なる遺伝子に由来してもよく、かつ／または同じ生物に由来しても異なる生物に由来してもよい。

「固定化捕捉プローブ」は、標的捕捉オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、固定化捕捉プローブは、固体支持体に結合した塩基配列認識分子を含有し、これは、非結合材料からの結合した標的ポリヌクレオチドの分離を促進する。溶液中に遊離するマトリックスおよび粒子などの、任意の既知の固体支持体を使用してもよい。例えば、固体支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁気的に引き付け可能な粒子であり得る。いくつかの実施形態では、支持体は、単分散である（すなわち、サイズが均一±約５％である）磁性球を含む。固定化捕捉プローブは、直接的に（例えば、共有結合もしくはイオン相互作用を介して）、または間接的に固体支持体に結合し得る。有用な固体支持体の一般的な例には、磁性粒子またはビーズが含まれる。

「標的捕捉」という用語は、細胞断片、細胞小器官、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の核酸などの試料混合物の他の構成要素から標的核酸を選択的に分離または単離することを指す。標的捕捉システムは、（例えば、ＴＣＯ標的特異的配列などの目的の標的核酸に特異的な配列を使用することによって）他の試料構成要素から所定の標的核酸を特異的かつ選択的に分離することができるか、またはそれは、標的の他の特徴（例えば、その物理的特徴を示さない他の試料構成要素からそれを区別する標的核酸の物理的特性）を使用することによって、他の試料構成要素から標的核酸を非特異的かつ選択的に分離することができる。標的捕捉方法および組成物は、以前に詳細に記載されている（米国特許第６，１１０，６７８号および同第６，５３４，２７３号、ならびに米国公開第２００８／０２８６７７５Ａ１号）。いくつかの実施形態では、標的捕捉は、溶液相の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび支持体に結合した固定化捕捉プローブを利用して、標的核酸と複合体を形成し、他の構成要素から捕捉された標的を分離する。

「分離すること」、「単離すること」、または「精製すること」という用語は一般に、混合物中の１つ以上の他の構成要素から、試料などの混合物の１つ以上の構成要素を除去することを指す。試料構成要素は、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸を含み得る、一般に水性溶液相の核酸を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、混合物中の他の構成要素から分離または除去される。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３９、４０、もしくは４１のヌクレオチド配列、または配列番号３９、４０、もしくは４１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯの標的特異的配列は、配列番号３９、４０、もしくは４１、または配列番号３９、４０、もしくは４１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３９、４０、もしくは４１、または配列番号３９、４０、もしくは４１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは配列番号３９を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列、または配列番号１、２、もしくは３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号１、２、もしくは３、または配列番号１、２、もしくは３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯのヌクレオチド配列は、配列番号１、２、もしくは３のヌクレオチド配列、または配列番号１、２、もしくは３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号１、２、もしくは３、または配列番号１、２、もしくは３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。

「増幅オリゴヌクレオチド」（またはより簡単に「プライマー」）は、標的核酸、またはその相補体にハイブリダイズして、核酸増幅反応に関与する、オリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドは、核酸鋳型（標的核酸配列）に相補的であり、鋳型との複合体化して（水素結合またはハイブリダイゼーションによる）、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ポリメラーゼによる合成の開始に好適なプライマー：鋳型複合体を供与する少なくとも３’末端を含有する。増幅オリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合したヌクレオチド塩基を付加することによって伸長され、その塩基は鋳型に相補的である。その結果がプライマー伸長産物である。増幅オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上のヌクレオチドの長さである。増幅オリゴヌクレオチドは、その３’末端に、標的核酸の領域（増幅プライマー結合部位）に少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的であり、ハイブリダイズする標的特異的（ＴＳ）配列を含む。増幅オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、標的核酸の領域に完全に相補的であり得るか、または増幅オリゴヌクレオチドがＲＮＡ依存性もしくはＤＮＡ依存性ポリメラーゼによる合成の鋳型依存性を開始することができるならば、それは１つ以上のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、少なくとも１０の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、少なくとも１５の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチド標的特異的配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続するヌクレオチドの長さである。連続した塩基は、増幅オリゴヌクレオチドが結合する標的配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、または完全に（１００％）相補的であり得る。既知の事実上すべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型に複合化する（「プライミング」）必要があるが、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー）は一般にプライマーを必要としない。

いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドは、標的特異的配列の５’に位置するＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列であり得るが、これらに限定されない。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有する増幅オリゴヌクレオチドは、本明細書ではプロモータープライマーと称される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列（Ｔ７プライマー）である。Ｔ７プロモーター配列は、約２５～３０のヌクレオチドの長さであり得る。例示的なＴ７プロモーター配列としては、配列番号６５（５’－ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ－３’）および配列番号６６（５’－ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ－３’）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、Ｔ７プライマーである。いくつかの実施形態では、Ｔ７プライマーは、配列番号１７６の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、配列番号１７６の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する１５～３０の連続する塩基を含有する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモータープライマーは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８のヌクレオチド配列、または配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プライマーの標的特異的配列は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８、または配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモータープライマーは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモータープライマーは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｔ７プライマーは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。

プロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）は、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖をもたらす。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを消化する。

いくつかの実施形態では、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列の線形増幅のための第１相の増幅混合物（ＡＭＰ混合物）は、非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（非プロモータープライマーＮＴ７プライマーとも呼ばれる）、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含み、第１相の増幅混合物が、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＡＭＰ混合物は、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素が存在しないという条件で、線形第１相の増幅反応中に標的核酸を増幅するために必要な構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如しているのは、追加のプロモータープライマーである。

いくつかの実施形態では、ＮＴ７プライマーは、配列番号１７７の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴ７プライマーは、配列番号１７７の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する１５～３０の連続する塩基を含有する。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、もしくは５５のヌクレオチド配列、または配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、もしくは５５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９のヌクレオチド配列、または配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９、または配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーのヌクレオチド配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９のヌクレオチド配列、または配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９、または配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。

「検出オリゴヌクレオチド」、「検出プローブ」、または「プローブ」は、標的核酸またはその増幅産物の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅産物などの標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズする検出オリゴヌクレオチド）または間接的（すなわち、検出オリゴヌクレオチドを標的に結合する中間構造体にハイブリダイズする検出オリゴヌクレオチド）のいずれかであり得る。検出オリゴヌクレオチドの標的配列は一般に、検出オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする、より大きい配列内の特異的配列を指す。検出オリゴヌクレオチドは、標的特異的な配列および標的に相補的でない配列を含んでもよい。そのような非標的相補的配列には、検出および／または増幅の促進に使用することができる、ヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与する配列が含まれ得る。（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号および同第２００６／０１９４２４０Ａ１号）。相補的配列および非相補的配列は、連続していても、リンカーによって結合されてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、またはＣ_１６リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ_９リンカーである。検出オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡであっても、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有しても、それらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’メトキシヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、すべての２’メトキシリボヌクレオチドを含有する。

いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、１つ以上の検出可能なマーカーまたは標識を含有する。検出可能なマーカーは、蛍光分子であり得るが、これに限定されない。蛍光分子は、検出オリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端、またはオリゴマーに沿った任意の場所に結合することができる。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、分子ビーコンまたはトーチであり得る。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、加水分解検出オリゴヌクレオチドであり得る。検出オリゴヌクレオチドは、５’末端に結合した蛍光分子、および３’末端に結合したクエンチャーを含有することができる。あるいは、蛍光分子を検出オリゴヌクレオチドの３’末端に結合させ、クエンチャーを検出オリゴヌクレオチドの５’末端に結合させることができる。

本明細書で使用される場合、「標識」または「検出可能な標識」は、検出される検出オリゴヌクレオチドまたは検出可能なシグナルを生じさせる検出オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接的結合は、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性もしくはイオン相互作用、およびキレートもしくは配位錯体形成）を使用し得るが、間接的結合は、架橋部分またはリンカー（例えば、抗体または追加のオリゴヌクレオチドを介する）を使用し得、これらは検出可能なシグナルを増幅する。任意の検出可能な部分は、例えば、放射性核種、ビオチンもしくはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する色素もしくは粒子などの発色団（例えば、ラテックスもしくは金属ビーズ）、蛍光化合物（例えば、生物発光化合物、燐光化合物、または化学発光化合物）、および蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）を使用し得る。フルオロフォアとしては、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（商標）（オレンジまたはレッド）、ＱＵＡＳＡＲ（商標）、フルオレセイン、ヘキソクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＤＡＢＣＹＬ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＣＹ色素（ＣＹ５など）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素化合物として知られているものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端と標識との間に塩基スペーサーを含む。スペーサー（またはリンカー）は、アルキル基であり得る。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収してバックグラウンド蛍光を低減するクエンチャー分子と組み合わせて使用してもよい。そのようなクエンチャーとしては、ＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹＹ（登録商標）クエンチャー（ＢＢＱ－６５０（登録商標））、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（またはＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－２（ＢＨＱ２）を含むが、これらに限定されないＢＨＱ（商標））、またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物が挙げられるが、これらに限定されない。本開示に関連して使用され得る相互作用ドナー／アクセプター標識対の例には、ＦＲＥＴ対と非ＦＲＥＴ対とを区別しようとせずに、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ＣａｌＲｅｄ－６１０／ＢＨＱ－２、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、Ｑｕａｓａｒ７５０／ＢＨＱ－２、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチル－ローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨＱ１、ＣＹ５／ＢＨＱ２、ＣＹ３／ＢＨＱ１、ＣＹ３／ＢＨＱ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしていない標識検出オリゴヌクレオチドからハイブリダイズを物理的に除去することなく標識を検出することを可能にする、混合物中の結合標識検出オリゴヌクレオチドが非結合標識検出オリゴヌクレオチドと比較して検出可能な変化を示す均一系で検出可能な標識を含む（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。当技術分野で既知の検出可能な標識または検出オリゴヌクレオチドには、化学発光標識（アクリジニウムエステル化合物、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号を含む）、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されない。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中に検出オリゴヌクレオチドを酵素的に分解すると蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放および閉鎖配置で存在し、閉鎖配置は、フルオロフォアをクエンチし、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉鎖した検出オリゴヌクレオチドを開放する。

いくつかの実施形態では、検出プローブは、Ｔｏｒｃｈである。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号１７８の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、配列番号１７７の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０の連続する塩基を含有する。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、もしくは６２のヌクレオチド配列、または配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、もしくは６２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８のヌクレオチド配列、または配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８、または配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈのヌクレオチド配列は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８のヌクレオチド配列、または配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８、または配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、トーチは、５’末端に結合した蛍光分子、および３’末端に結合したクエンチャーを含有する。あるいは、蛍光分子をトーチの３’末端に結合させ、クエンチャーを検出オリゴヌクレオチドの５’末端に結合させてもよい。いくつかの実施形態では、トーチは、５’末端の５～６のヌクレオチド配列に相補的であり、それとハイブリダイズすることができる５～６のヌクレオチド配列を３’末端に含有する。いくつかの実施形態では、５’末端の５～６ヌクレオチドに相補的であり、それとハイブリダイズすることができる３’末端の５～６ヌクレオチド配列は、リンカーを介してトーチに連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ_１－１６リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ_９リンカーである。

増幅産物の「検出」は、任意の既知の方法を使用して達成することができる。例えば、増幅された核酸は、検出可能な物理的変化（例えば、電気的変化）をもたらす表面と関連し得る。増幅された核酸は、溶液相で、またはそれらをマトリックス内またはマトリックス上に濃縮し、それらに関連する標識（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出することにより、検出され得る。他の検出方法は、増幅産物の配列に相補的なプローブを使用して、プローブ：産物複合体の存在を検出するか、または増幅産物から検出されたシグナルを増幅するためにプローブの複合体を使用する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号および同第５，８４９，４８１号）。他の検出方法は、シグナルにおける変化が分子ビーコン、分子トーチ、ハイブリダイゼーションスイッチプローブなどの増幅産物に結合したときのみに生じるため、シグナル生成が標的配列の存在に結合しているプローブを使用する（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，３６１，９４５号、同第６，５３４，２７４号、同第６，８３５，５４２号、同第６，８４９，４１２号および同第８，０３４，５５４号；および米国公開第２００６／０１９４２４０Ａ１号）。検出は、標的増幅中に存在し、アンプリコンにリアルタイムでハイブリダイズする検出オリゴヌクレオチドを使用して達成することができる。検出オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含有してもよい。トーチは、各末端に相補的領域を含む。これらの相補的領域は、互いに結合し、「閉鎖」トーチを形成する。閉鎖構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、フルオロフォアシグナルはクエンチされる。すなわち、それは、光によって励起されたときに検出可能なシグナルを放出しない。しかしながら、トーチが相補的標的に結合すると、トーチ内の相補的領域は、強制的に離されて、「開放」トーチを形成する。開放形態では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しておらず、フルオロフォアシグナルは励起時に検出可能である（すなわち、もはやクエンチされていない）。アンプリコン－トーチ結合は、フルオロフォアからのクエンチャーの分離をもたらし、これにより、光刺激および特定の波長でのシグナル放出に応答したフルオロフォアの励起が可能になる。トーチは、増幅中に存在し、相補的アンプリコンがリアルタイムで生成されるにつれて、それに結合する可能性がある。より多くのアンプリコンが作製されるにつれて、より多くのトーチが結合し、より多くのシグナルが作り出される。シグナルは最終的に、それがバックグラウンドを超える検出され得るレベルに達し、最終的にすべての利用可能なトーチがアンプリコンに結合し、シグナルが最大に達する点に到達する。増幅の開始時、および増幅配列のコピー数が少ない場合、検出オリゴヌクレオチドのほとんどが閉鎖する（３’および５’末端が塩基対合し、蛍光シグナルがクエンチされる）。増幅中、より多くの検出オリゴヌクレオチドが、標的配列に結合するため、検出オリゴヌクレオチドの３’および５’末端が分離し、蛍光の増加（蛍光の消光の低下）を生じさせる。さらなる増幅後、蛍光シグナルは、最大に近づく。

いくつかの実施形態では、検出は、時間間隔で実施される。検出は、一定の時間間隔で蛍光を測定することによって行うことができる。時間間隔は、１～６０秒、１～１２０秒、１～１８０秒、１～２４０秒、または１～３００秒であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、時間間隔は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０秒である。一定の時間間隔で実施される検出では、各間隔は、サイクルと称される。検出は、２０～２４０サイクル、３０～２１０サイクル、４０～１８０サイクル、５０～１５０サイクル、または６０～１２０サイクルにわたって実施することができる。例えば、６０分間にわたる３０秒ごとの検出は、１２０サイクルをなす。検出は、サイクルの開始時に生じても、終了時に生じてもよい。検出は、継続的に実施されてもよい。

いくつかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーまたは非プロモータープライマー）、検出オリゴヌクレオチド、または標的捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５０％超、または１００％が修飾される。修飾ヌクレオチドには、修飾ヌクレオベースを有するヌクレオチドが含まれる。修飾核酸塩基には、合成および天然の核酸塩基、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリンが含まれるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオチドには、（２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、および２’－フルオロヌクレオチドなどの２’－ハロゲンヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）２’修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾塩基を有するヌクレオチドも含まれる。修飾ヌクレオチドには、ホスホロチオエート結合などであるがこれに限定されない、修飾結合を有するヌクレオチドも含まれる。

本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれも、１つ以上のタグを含有することができる。「タグ」は、標的配列への結合を超えたいくつかの追加の機能を付与する目的で、オリゴヌクレオチドに共有結合されたヌクレオチド配列であり得る。オリゴヌクレオチドタグの非限定的な例には、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター、プライマー結合部位、配列決定タグ、質量タグ、バーコードタグ、捕捉タグなどが挙げられる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、同第５，８８２，８５６号、同第６，８２８，０９８号、およびＰＣＴ公開第０５／０１９４７９号）。タグはまた、いくつかの追加の機能を付与する目的で、オリゴヌクレオチドに共有結合された非ヌクレオチド分子であり得る。

多重増幅が意図される場合、本組成物は、複数の異なる標的捕捉オリゴヌクレオチドプロモータープライマー、および複数の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする非プロモータープライマーを含み得る。異なる標的核酸配列は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。

上記のように、本明細書に開示される方法および組成物は、インビトロで標的核酸配列を増幅して、試料中の標的核酸の存在を示すために検出され得る増幅された配列を生成するのに有用である。方法および組成物は、増幅された核酸を合成して、病状の診断および／または予後を決定するため、環境および／または食品試料の純度または品質を検出するため、または法医学的証拠を調査するための有用な情報を提供するために有用である。方法および組成物は、実行するのが比較的迅速かつ安価である広いダイナミックレンジにわたって高感度のアッセイを提供するのに有利であり、それらを高スループットおよび／または自動化システムでの使用に適したものにする。この方法および組成物は、単一の標的配列、すなわちユニプレックス増幅システムを分析するアッセイに使用することができ、複数の異なる標的配列、すなわち多重増幅システムを同時に分析するアッセイに特に有用である。いくつかの実施形態では、組成物および反応混合物は、ユーザがアッセイにおいて成分を一緒に使用して所望の標的を増幅する方法を効率的に実行することを可能にするので有用である定義されたアッセイ構成要素を含むキットで提供される。

Ｄ．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの多相増幅および検出のためのオリゴヌクレオチド組成物。
いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４７のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号４９のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５０のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号４９のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号５１のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号４９のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーは、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

追加のオリゴヌクレオチドを、表１に提供する。

Ｅ．組成物およびキット
本開示は、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅、検出、および／または定量化に有用なオリゴマー、組成物、およびキットを提供する。オリゴマー、組成物、およびキットは、ユニプレックスまたは多重多相増幅法で使用することができる。

試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸の存在もしくは不在を決定するため、またはその量を定量化するための反応混合物も記載される。さまざまな反応混合物には、標的捕捉（ＴＣＲ）混合物、増幅（ＡＭＰ）混合物、プロモータープライマー（ＰＲＯ）混合物、および酵素（ＥＮＺ）混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本開示によれば、混合物は独立して、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸の増幅および／または検出のための本明細書に記載のプロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）、非プロモータープライマー（ＮＴ７オリゴヌクレオチド）、ＴＣＯ、検出オリゴヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、塩、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、キット中に提供することができる。組成物、キットおよび／または反応混合物は、いくつかの任意の成分をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の試験試料成分を含み、その中に、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸が存在する場合も存在しない場合もある。いくつかの実施形態では、キットは、対照ＴＣＯ、対照プロモータープライマー、対照非プロモータープライマー、対照検出オリゴヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上の対照オリゴヌクレオチドを含む。キットは、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドを含んでも、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ種が含まれるが、これに限定されない１つ以上の他の生物の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、１つ以上の検出オリゴヌクレオチドを含む検出オリゴヌクレオチドを含む。検出オリゴヌクレオチドは、独立して蛍光標識およびクエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、１つ以上のＴｏｒｃｈ検出オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、２つ以上のＴｏｒｃｈ検出オリゴヌクレオチドを含む。２つ以上のＴｏｒｃｈオリゴヌクレオチドは、異なる生物からの増幅産物を検出でき、異なるチャネルで検出可能であり得る。

いくつかの実施形態では、キット、組成物、または反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、陽性対照核酸、陰性対照核酸、対照核酸、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）、ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）、Ｃｌ、ＭｇＣｌ_２、酢酸カリウム、緩衝液、ＢＳＡ、スクロース、トレハロース、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、アンモニウムイオン、ＥＤＴＡ、ならびに等温増幅および／または検出に好適な他の試薬または緩衝液のうちの１つ以上をさらに含有する。ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素であり得るが、これに限定されない。緩衝液は、トリス－ＨＣｌおよびトリス－酢酸であり得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００であり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、記載されたＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのためのプライマーおよび検出オリゴヌクレオチドは、製造日から少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１５ヶ月、少なくとも１８ヶ月、または少なくとも２４ヶ月の貯蔵寿命を有する。

本明細書に開示されるあらゆる方法が、本方法の目的に向けられた方法において関与する材料の対応する使用の開示としても理解されるべきである。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ配列を含むオリゴヌクレオチドのいずれか、ならびにそのようなオリゴヌクレオチドを含む任意の組み合わせ（例えば、キットおよび組成物）は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの検出および／もしくは定量化またはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ核酸配列を増幅する際に使用するため、ならびにＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの検出および／もしくは定量化またはＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ核酸配列の増幅のための組成物の調製に使用するために開示されるものとしても理解されるべきである。

ある特定の実施形態では、キットは、本開示による方法を実施するための一組の説明書をさらに含み、説明書は、添付文書、および／またはキットもしくはその構成要素の包装に関連し得る。

本明細書に記載の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例によってさらに理解することができる。実施例で使用される方法工程は、本明細書で記載されており、以下の情報は、方法で使用される典型的な試薬および条件をより具体的に記載している。上記の説明に提供されるガイダンスに従う限り、プロセスまたは結果に実質的に影響を及ぼさない他の試薬および条件を使用してもよい。さらに、開示される方法および組成物は、手動で、または自動化されたデバイスにおいて１つ以上の工程（例えば、ピペッティング、混合、インキュベーションなど）を実施するシステムで実施されても、任意の型の既知のデバイス（例えば、試験管、多管ユニットデバイス、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの多ウェルデバイスなど）で使用されてもよい。

実施例に記載の方法で使用される例示的な試薬には、以下が含まれる。

「試料輸送培地」または「ＳＴＭ」は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含んだリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）である。

「標的捕捉試薬」または「ＴＣＲ」は、（ｄＴ）１４オリゴヌクレオチドがそれに共有結合した２５０μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ－ＭＡＧ（商標）ＭＧ－ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とともに塩化リチウムおよびＥＤＴＡを含んだＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）である。

「標的捕捉洗浄溶液」または「ＴＣ洗浄溶液」は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）の無水エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウムを含んだＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）である。

「増幅試薬」または「ＡＲ」は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、４つのリボヌクレオチド三リン酸（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびｒＵＴＰ）を含んだＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．７）である。プライマーおよび／またはプローブは、増幅試薬中の反応混合物に添加されても、試薬（無プライマー増幅試薬）とは別々に添加されてもよい。

増幅または前増幅反応混合物中で使用される場合、「酵素試薬」または「ＥＮＺ」は、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、塩、および補因子を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）である。

実施例Ａ．多相増幅／検出
Ｔ７プライマーを、標的捕捉中に標的配列にハイブリダイズし、それに続いて過剰なＴ７プライマーを除去する。

第１の相中、ＮＴ７プライマーを、追加のＴ７プライマーを除いて、必要な増幅のすべて、検出、および酵素試薬とともに導入される。逆転写酵素の存在下で、捕捉された標的にハイブリダイズしたＴ７プライマーが伸長され、ｃＤＮＡコピーを作製し、標的ＲＮＡ鋳型が、逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によって分解される。その後に、ＮＴ７プライマーは、ｃＤＮＡにハイブリダイズして、伸長し、Ｔ７プライマーのプロモーター領域を充填し、活性二本鎖ＤＮＡ鋳型を作製する。次いで、Ｔ７ポリメラーゼは、鋳型から複数のＲＮＡ転写産物を生成する。その後に、ＮＴ７プライマーは、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズし、伸長し、標的ＲＮＡ鋳型の無プロモーターｃＤＮＡコピーを生成する。ＲＮＡ鎖は、逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性によって分解される。１相増幅混合物中には利用可能な遊離Ｔ７プライマーがないため、反応はそれ以上進行しない。次いで、第２相は、Ｔ７プライマーおよび任意選択的に検出オリゴヌクレオチドの添加で開始されるため、１相で生成されたｃＤＮＡプールの指数関数的増幅が開始される。

多重増幅および検出には、ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、Ｔｏｒｃｈオリゴヌクレオチドの各々の１つ以上が使用される。オリゴヌクレオチドは、同じ標的核酸中の異なる配列を増幅しても、異なる標的核酸中の配列を増幅しても、それらの組み合わせであってもよい。異なる標的核酸は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。

プレート設定：
いくつかの実施形態では、２つの自動化されたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒデバイスで使用するための４つの異なるプレートを設定する。
１．プレート１（ＴＣＲプレート）は、溶解された試料を含有する。このプレートに、標的捕捉試薬（１００μＬ）を添加する。ＴＣＯおよびＴ７プライマーが、標的核酸（４００μＬの試料）にハイブリダイズする。磁石を使用し、磁性ビーズ（固体支持体上の捕捉プローブ）を使用して、ＴＣＯ：標的核酸：Ｔ７プライマー（前増幅ハイブリッド）を捕捉する。
２．プレート２は、深ウェルプレートであり、５００μＬ／ウェルのＡＰＴＩＭＡ洗浄緩衝液を保持する。Ａｐｔｉｍａ洗浄緩衝液は、細胞溶解で残った過剰なタンパク質および脂質を洗浄するために使用される界面活性剤およびアルコールを含有する。
３．プレート３は、２００μＬ／ウェルのＡＰＴＩＭＡ洗浄緩衝液を含有し、前増幅ハイブリッドの第２の洗浄の提供に使用される。
４．プレート４は、５０μＬ／ウェルのＡＭＰ試薬を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ試薬は、緩衝液、塩、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および１つ以上の非Ｔ７プライマーを含有する。

標的捕捉および単離：ＴＣＯおよびＴ７プライマーを、標的核酸を含有する（または含有することが疑われる）試料に添加する。Ｔ７プライマーを、１つの標的核酸に対して約１つのＴ７プライマーの比で添加する。ＴＣＯおよびＴ７プライマーを標的核酸とともに一定時間インキュベートして、ＴＣＯおよびＴ７プライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする。次いで、前増幅ハイブリッドを精製し、過剰なまたはハイブリダイズしていないＴ７プライマーを除去する。次いで、ＴＣＯの場合はポリ（ｄＴ）結合パートナーを有する磁性粒子を使用して、前増幅ハイブリッドを単離する。
１．プレート１（ＴＣＲプレート）をヒートブロックに入れ、６２℃まで３０分間加熱し、それに続いて室温で２０分～２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、ＴＣＲプレートを６５°Ｃの蓋でカバーして、ウェルの上部に結露が形成されるのを防ぐ。次いで、捕捉された前増幅ハイブリッドを、プレート２に移動させる。
２．第１の洗浄（約１０分）後、深ウェルコーム／マグネットカバーをプレート２に追加して、前増幅ハイブリッドを捕捉する。捕捉された前増幅ハイブリッドを、プレート３に移動させる。
３．第２の洗浄後、小さなコーム（マグネットカバー）をプレート３に追加して、前増幅ハイブリッドを捕捉する。洗浄した前増幅ハイブリッドを捕捉し、プレート４に移動させる。第４のプレートを、熱サイクラーに移動させて、リアルタイムで等温増幅および検出する。

多相転写媒介増幅およびリアルタイム検出。
第１相の増幅：ＮＴ７プライマー、酵素、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰ（ＡＭＰ混合物）は、前増幅ハイブリッドを含有する精製された標的核酸とともに存在する。混合物をある期間にわたってインキュベートして、第１の増幅産物の形成を可能にする。
１．ＮＴ７プライマーおよび精製された標的核酸を含有するＡＭＰプレートを、ハイブリダイズしたＴ７プライマーとともに、４４℃で５分間インキュベートする。
２．逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含有する２５μＬのＥＮＺミックスをプレートの各ウェルに添加し、密封して１分間１４００ｒｐｍで混合し、サーマルサイクラーで４４℃で５分間インキュベートする。
第２相の増幅：Ｔ７プライマーを第１の増幅産物に添加し、ある期間にわたってインキュベートして、第２の増幅産物の形成を可能にする。
３．２５μＬのＰＲＯ混合物を各ウェルに添加し、密封し、１４００ｒｐｍで１分間混合する。いくつかの実施形態では、ＰＲＯ混合物は、緩衝液、塩、界面活性剤、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、１つ以上のＴ７プライマー、Ｔｏｒｃｈプローブを含有する。
４．反応プログラム：４３℃で３０秒の１２０回のサイクル、各サイクルの終了時に標識検出（収集）を実行する。

検出：検出オリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルを一定の間隔で記録することによって、標的核酸配列の増幅をリアルタイムで検出する。

実施例１．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ二相性リアルタイムＴＭＡオリゴスクリーニング。
以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。

結果：どの組み合わせも、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅および／または検出を可能にするのに十分に強い曲線をもたらさなかった。

実施例２．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ二相性リアルタイムＴＭＡオリゴスクリーニング。
代替標的捕捉をスクリーニングし、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ Ｔ７プライマーを滴定して、アッセイの性能が改善するかどうかを確認する。以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。

結果：どの組み合わせも、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅および／または検出を可能にするのに十分に強い曲線をもたらさなかった。

実施例３．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ二相性リアルタイムＴＭＡオリゴスクリーニング。
以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。

結果：ＡＭＰ１／ＰＲＯ１、ＡＭＰ１／ＰＲＯ３、ＡＭＰ２／ＰＲＯ３、およびＡＭＰ３／ＰＲＯ５は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの良好な増幅および／または検出をもたらした。

実施例４．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ二相性リアルタイムＴＭＡオリゴスクリーニング。
以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。

システムのいくつかは増幅を示したが、どのシステムも強い曲線を生成しなかった。示されたオリゴは実行可能なシステムの候補であり得るが、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅／検出ではどの組み合わせもうまく機能しなかった。

実施例５．Ｔ．ｔｅｎａｘのＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ増幅システムとの交差反応性。
以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。

結果：１×１０^５個のＴ．Ｔｅｎａｘ細胞／反応の存在は、示されたオリゴヌクレオチドを使用したＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの検出を妨害しなかった。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓは同じ出現点で検出され、Ｔ．Ｔｅｎａｘが存在するかどうかに関係なく同じＲＦＵに達した。示されたオリゴヌクレオチドは、実質的に遅い出現時間（より遅い約８分対約１４分）およびより低いＲＦＵ（１５ｐｍｏｌのＴｏｒｃｈで、約２２，０００対約７３００）であるにもかかわらず、Ｔ．Ｔｅｎａｘを検出した。Ｔｏｒｃｈ配列番号６４は、Ｔ．Ｔｅｎａｘで非常に低いバックグラウンドを示した。

実施例６．Ｔ．ＴｅｎａｘおよびＰｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｍｉｎｉｓのＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ増幅システムとの交差反応性。
以下の条件を使用して、上記のように多相増幅を実施した。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ対Ｔ．ｔｅｎａｘおよびＰ．ｈｏｍｉｎｉｓの増幅の特異性について、Ｎ７オリゴヌクレオチド配列番号９をＮ７オリゴヌクレオチド配列番号１１と比較し、Ｔｏｒｃｈ配列番号２３をＴｏｒｃｈ配列番号６４と比較した。二相増幅反応は、ＴＣＯ配列番号３およびＮＴ７プライマー配列番号１５を利用して記載されているように実施した。Ｔｏｒｃｈ配列番号２３は、より強い増幅曲線を提供した（表５～７）。Ｎ７オリゴヌクレオチド配列番号１１は、ＴＴｉｍｅが遅く、ＲＦＵ範囲が低いため、バックグラウンドが少なくなった（表５～８）。

密接に関連する非標的種であるＰ．ｈｏｍｉｎｉｓとＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓとの間に交差反応性は観察されなかった。

Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのＴ７プライマーの配列番号９および配列番号１１と配列番号２４の性能を、Ｃａｎｄｉｄａ種群およびＣ．ｇｌａｂｒａｔａを含むすべてのアッセイオリゴヌクレオチドを用いた多重形式で確認した。Ｔ７プライマー配列番号１１は、ＣＶ／ＴＶ多重アッセイにおいて、配列番号９と比較して低いＴ．ｔｅｎａｘのバックグラウンドを有していた。

Ｔ７プライマー配列番号１１は、ＣＶ／ＴＶ多重増幅アッセイ（表５～９）で同じトーチを使用した配列番号９と比較して、ＲＦＵ範囲（５，９９２対４，９２１）および後に出現するＴ時間（１４．８８対６．３０）によって低いＴ．ｔｅｎａｘのバックグラウンドを有していた。

Ｔ７プライマー配列番号１１は、ＣＶ／ＴＶ多重増幅アッセイ（表５～９）で同じトーチを使用した配列番号９と比較して、ＲＦＵ範囲（５，９９２対４，９２１）および後に出現するＴ時間（１４．８８対６．３０）によって低いＴ．ｔｅｎａｘのバックグラウンドを有していた。

実施例７．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ種の多重増幅。
二相増幅を、以下の条件を使用して上記のように実施した。

結果：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの両方のＴｏｒｃｈが、ＦＡＭチャネルで読み取られた。

１×１０^４細胞／反応のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓは、反応中に存在した場合には、Ｓ１のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのオリゴは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ増幅を部分的に阻害し、１×１０^６細胞／反応のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓが反応中に存在した場合は、阻害しなかった。５つのＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴの組み合わせのいずれも、１×１０^６細胞／反応のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓが反応中に存在した場合、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増幅に影響を及ぼさなかった。さらに、５つのＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴの組み合わせのいずれもＣ．ｇｌａｂｒａｔａの増幅に悪影響を及ぼさなかった。

０．１でＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ細胞／反応システムＳ４は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを増幅して検出した。１でＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ細胞／反応システムＳ１、Ｓ２、およびＳ３は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを増幅して検出した。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの増幅は、Ｃａｎｄｉｄａオリゴの存在によって著しく阻害されなかった。

実施例８．多重アッセイの最適化。
以下の条件を使用して、上記のように多重多相増幅を実施した。多重アッセイを、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの検出のために、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）を含有するＴｏｒｃｈ配列番号２２および配列番号２３を使用して実施した。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのＴＣＯは配列番号３であり、ＮＴ７プライマーは配列番号１５であり、Ｔ７プライマーは配列番号１１であった。多重アッセイは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび他のＣａｎｄｉｄａ種の検出（それぞれＦＡＭチャネルで検出される）ならびにＣ．ｇｌａｂｒａｔａ（ＨＥＸチャネルで検出される）の検出のためのオリゴヌクレオチドをさらに含有した。対照Ｔｏｒｃｈは、Ｃｙ５．５チャネルで検出された。Ｃａｎｄｉｄａオリゴヌクレオチドを、表９－５に列挙している。

競合する対照と組み合わせた４つの標的を、多重形式で試験した。Ｃａｎｄｉｄａ種およびＣ．ｇｌａｂｒａｔａチャネルのオリゴヌクレオチド濃度の滴定を実施して、すべての増幅システム間のバランスを見つけた。ＴＣＲおよびＮＴ７におけるＴ７のＣａｎｄｉｄａ種オリゴヌクレオチドの量を増やした製剤を試験および検証した。次に、Ｃａｎｄｉｄａ種のオリゴ濃度を、ＴＣＲおよびＮＴ７でＣ．ｇｌａｂｒａｔａのＴ７を増加させて試験した。両方の試験セットで、他のチャネルの阻害は示されなかった。

Ｃａｎｄｉｄａ種のオリゴ濃度の最適化により、システム１の元の濃度（６ｐｍｏｌ／ｒｘｎ配列番号３５、５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ配列番号３６）とシステム２の増加したオリゴ濃度を比較して、ＦＡＭチャネルの改善が示された。

Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ増幅システムの２番目の最適化では、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓオリゴ濃度の増加とともにオリゴヌクレオチド濃度が増加した。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａのＨＥＸチャネルでのより速いＴＴｉｍｅは、ＦＡＭでのＣａｎｄｉｄａ種の増幅効率を変えることなく観察された。新しいＣ．ｇｌａｂｒａｔａオリゴ濃度の増加により、競合的対照も改善された。

標的の組み合わせを試験したところ、高力価のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの存在下でのＣ．ｇｌａｂｒａｔａの増幅の間に顕著な負の相互作用が発見された。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの両方について、ＴＣＲのＴ７およびＡＭＰのＮＴ７の高、中、および低濃度の４因子特性評価設計戦略を選択し、各分析物について、どの因子がＴ時間に最大の影響を与えたかを判定した。高濃度を現在の濃度として設定した。実験は２０回の実行で構成された。ＴＣＲ中のＴＶ Ｔ７の濃度が低いと、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの増幅が速くなることが見出された。

Ｔｏｒｃｈ配列番号２３を使用して、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを、多重で０．００１細胞／ｍＬで検出した。

実施例９．分析感度。
各Ｃａｎｄｉｄａ種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、およびＣ．ｇｌａｂｒａｔａ）ならびにＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓのＡｐｔｉｍａ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉａ（ＳＴＭ）での培養溶解物の段階希釈を、ＣＶ／ＴＶ多重アッセイで試験した。各種について、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの場合は１０００ＣＦＵ／ｍＬ～３０ＣＦＵ／ｍＬ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの場合は３００ＣＦＵ／ｍＬ～３ＣＦＵ／ｍＬ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの場合は１００ＣＦＵ／ｍＬ～１０ＣＦＵ／ｍＬ、およびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの場合は０．０１細胞／ｍＬ～０．０００１細胞／ｍＬの１／２ｌｏｇ滴定を１５回繰り返し、実行した。以下の条件を使用して、記載されているように多相増幅を実施した。

Ｃａｎｄｉｄａ種の陽性パーセント、平均ＴＴｉｍｅ、平均ＲＦＵ範囲、および平均Ｔ勾配を、表９－７に示す。Ｃａｎｄｉｄａ種はＦＡＭチャネルで、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａはＨＥＸチャネルで、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓはＲＯＸチャネルで、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの競合的対照ＴｏｒｃｈはＣｙ５．５チャネルで検出された。

Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓについての陽性パーセント、平均ＴＴｉｍｅ、平均ＲＦＵ範囲、および平均Ｔ勾配を表９－８に示す。Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの１００％陽性シグナルに到達するための検出限界は、０．００１細胞／ｍｌであった。

通常のプロビットモデルを使用すると、０．０００４（０．０００３～０．０００５）細胞／ｍＬで存在するＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する確率は５０％（９５％信頼水準）であり、０．００１（０．００７～０．０００３）細胞／ｍＬで存在するＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する確率は９５％（９５％信頼水準）である。Ｇｏｍｐｅｒｔｚプロビットモデルを使用すると、０．００００４（０．０００３～０．０００６）細胞／ｍＬで存在するＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する確率は５０％（９５％信頼水準）であり、０．０００８（０．０００６～０．００１６）細胞／ｍＬで存在するＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する確率は９５％（９５％信頼水準）である。プロビット値の種を表９－９および９－１０に示す。

実施例１０．インシリコ特異性分析。
Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、および対照オリゴヌクレオチド（表９．５）と対照オリゴヌクレオチド（表９．５）のインシリコ分析を実行して、システムが望ましくない標的と交差反応するか、望ましくない分子間または分子内相互作用を形成する可能性を評価した。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ７およびＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒアプリケーションを使用した相互作用分析にも供された。内部Ｔｏｒｃｈ配列の有無にかかわらず、対象の開始位置が３００ｂｐ以下の順および逆プライマー対との潜在的な相互作用を調べた。マッチを、対象の配列と同じ方向の順プライマー、対象の配列と逆方向のリバースプライマー、および対象の配列と同じ方向のＴｏｒｃｈ配列についてフィルタリングした。ヒトおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するクエリとしてＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓおよび対照オリゴヌクレオチドを使用したＢＬＡＳＴの結果を、ＡＣＶ／ＴＶシステムで増幅および検出される可能性があると思われる対象について調べた。ＢＬＡＳＴによってクエリされたすべてのデータセット（細菌、真菌、ウイルス、ヒト）の中で、関心のある可能性のあるプライマーのみの相互作用が１つ特定された：ＨＩＶ－１（受入番号ＡＦ２５４７０８）とオリゴ配列番号３６および１１。ＨＩＶ－１を、交差反応性試験（下記参照）のパネル１１で試験し、交差反応性または干渉の兆候を示さなかった。したがって、これら２つのオリゴによるＨＩＶの増幅はごくわずかである。

実施例１１．交差反応性試験。
ＲＯＸチャネルの標的としてＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを追加し、さまざまな生物に対する交差反応性を４重アッセイパネルで評価した。記載したＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴを使用して、上記のように多相増幅を実施した。パネルおよび結果を、表１０－１に示す。各パネルの５つの複製物を試験して、交差反応性が発生したかどうかを判定した。（注：パネル１０および１２は、標的種が含有されていたため、列挙されていない。）

パネル７の１つの複製物は、ＦＡＭチャネルで陽性であった。他のすべての複製物は、すべてのチャネルで陰性であった。パネル７の生物に対する交差反応性を再評価した。これらの生物を再試験したところ、交差反応は観察されず、すべての複製物は陰性であった。パネル７で見つかった偽陽性の複製物は、ランダムな汚染イベントによるものであると結論付けられた。

実施例１２．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ検出のためのＲＯＸチャネルにおける干渉。
交差反応性パネルの５つの複製物を、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓの存在下で３倍の検出限界（０．００３細胞／ｍＬ）で試験した。記載されているように多相増幅を実施した。ＲＯＸチャネルにパネルが存在する場合、干渉は観察されず、すべての複製物は予想どおり陽性であった。対照Ｔｏｒｃｈ（Ｃｙ５．５、ＲＴＦ２）は、すべての複製物に対して有効であった。結果は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴが、上記の実施例のパネル１～９、１１、および１３のさまざまな生物の存在下でＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出することができることを示した。

交差反応性パネルの５つの複製物を、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの存在下で３倍の検出限界（０．００３細胞／ｍＬ）で試験した。記載されているように多相増幅を実施した。ＲＯＸチャネルにパネルが存在する場合、干渉は観察されず、すべての複製物は予想どおり陽性であった。対照Ｔｏｒｃｈ（Ｃｙ５．５、ＲＴＦ２）は、すべての複製物に対して有効であった。結果は、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴが、上記の実施例のパネル１～９、１１、および１３のさまざまな生物の存在下でＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出することができることを示した。

実施例１３．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ臨床試料試験
Ａｐｔｉｍａ Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓアッセイで最初に陽性と判定された１７の膣スワブ臨床検体を、Ａｐｔｉｍａ ＣＶ／ＴＶ多重アッセイできれいに試験した。多相増幅を、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓオリゴＴＣＯ配列番号３、ＮＴ７プライマー配列番号１５、Ｔ７プライマー配列番号１１、およびＴｏｒｃｈ配列番号２４を使用して記載されているように実施した。各未希釈試料の１つの複製物を、試験用に採取した。試料の１５／１７（８８％）は、ＣＶ／ＴＶ多重アッセイで有効な結果をもたらし、すべてＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓに対して陽性であった。有効な試料のうちの３／１５（２０％）は、Ｃａｎｄｉｄａ種およびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの両方で陽性であった。無効な試料は、すべてのチャネルにシグナルがないために無効であると判定され、記録された機器エラーがあり、これは、試料量が不十分であることが原因である可能性がある。

次に、最初の試験に続いてＳＴＭによる段階希釈を作成し、Ａｐｔｉｍａ ＣＶ／ＴＶ多重およびＡｐｔｉｍａ Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ Ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＩＶＤアッセイに対して比較試験をした。１：５～１：１０，０００の範囲のＳＴＭでの希釈を、未希釈試料試験のＴ時間に応じて臨床試料に対して行った。未希釈試料試験から無効であると判定された試料１１２０７および１３０２３に対して、１：１０の希釈を行った。各希釈物を、ＣＶ／ＴＶ多重アッセイを用いて実行し、Ａｐｔｉｍａ Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ Ｖａｇｉｎａｌｉｓアッセイで再試験した。以前の無効な試料は、１：１０希釈で再試験した際に有効であった。以前の無効な試料を含むすべての試料は、Ａｐｔｉｍａ Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ Ｖａｇｉｎａｌｉｓアッセイの解釈と一致した。

実施形態
実施形態１．配列番号１７６の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する１５～３０個の隣接する塩基を含有するプロモータープライマーを含む試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を増幅する際に使用するための、増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態２．プロモータープライマーが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む、実施形態１に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態３．Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が、配列番号６５または６６を含む、実施形態２に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態４．プロモータープライマーが、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態２に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態５．プロモータープライマーが、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態６．実施形態１～５のいずれか１つに記載の増幅オリゴヌクレオチドと、１つ以上の追加の標的核酸の増幅に使用するのに好適な１つ以上の追加の増幅オリゴヌクレオチドと、を含む、増幅オリゴヌクレオチドのセット。
実施形態７．配列番号１７７の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する１５～３０個の隣接する塩基を含有する非プロモータープライマーを含む試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を増幅する際の、増幅オリゴヌクレオチドまたは使用。
実施形態８．非プロモータープライマーが、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態６に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態９．非プロモータープライマーが、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態７に記載の増幅オリゴヌクレオチド。
実施形態１０．実施形態７～９のいずれか１つに記載の非プロモータープライマーと、１つ以上の追加の標的核酸の増幅に使用するのに好適な１つ以上の追加の非プロモータープライマーと、を含む、増幅オリゴヌクレオチドのセット。
実施形態１１．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸増幅産物を検出するための検出オリゴヌクレオチドであって、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、検出オリゴヌクレオチド。
実施形態１２．検出オリゴヌクレオチドが、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸の増幅産物にハイブリダイズしたときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度ハイブリダイゼーションプローブである、実施形態１１に記載の検出オリゴヌクレオチド。
実施形態１３．検出オリゴヌクレオチドが、フルオロフォアおよび任意選択でクエンチャーを含有する、実施形態１２に記載の検出オリゴヌクレオチド。
実施形態１４．検出オリゴヌクレオチドが、分子トーチである、実施形態１３に記載の検出オリゴヌクレオチド。
実施形態１５．検出オリゴヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含有する、実施形態１１に記載の検出オリゴヌクレオチド。
実施形態１６．実施形態１１～１５のいずれか１つに記載の検出オリゴヌクレオチドと、１つ以上の追加の標的核酸の増幅産物を検出する際に使用するのに好適な１つ以上の追加の検出オリゴヌクレオチドと、を含む、検出オリゴヌクレオチドのセット。
実施形態１７．試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸を捕捉する際に使用するための標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）であって、ＴＣＯが、配列番号３９、４０、または４１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列と、固定化捕捉プローブに結合する固定化捕捉プローブ結合領域と、を含む、標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）。
実施形態１８．固定化捕捉プローブ結合領域が、アッセイ条件下で、捕捉プローブに結合されるオリゴヌクレオチドに安定してハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、実施形態１７に記載のＴＣＯ。
実施形態１９．ＴＣＯが、配列番号１、２、または３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１８に記載のＴＣＯ。
実施形態２０．実施形態１７～１９のいずれか１つに記載のＴＣＯと、１つ以上の追加の標的核酸の捕捉で使用するための１つ以上の追加のＴＣＯと、を含む、ＴＣＯのセット。
実施形態２１．試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出するための組成物であって、
（ａ）実施形態１～５のいずれか１つに記載の増幅オリゴヌクレオチドを含むプロモータープライマーと、
（ｂ）実施形態７～９のいずれか１つに記載の増幅オリゴヌクレオチドを含む非プロモータープライマーと、
（ｃ）実施形態１１～１５のいずれか１つに記載の検出オリゴヌクレオチドを含む検出オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）任意選択で、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を含むＴＣＯと、を含む、組成物。
実施形態２２．プロモータープライマーが、標的捕捉混合物中に存在し、非プロモータープライマーが、第１相の増幅混合物中に存在し、プロモータープライマーおよび検出オリゴヌクレオチドが、第２相の増幅混合物中に存在する、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態２３．標的捕捉混合物が、ＴＣＯをさらに含む、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２４．第１相の増幅混合物が、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびリボヌクレオチド三リン酸のうちの１つ以上を含有する、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２５．固定化捕捉プローブをさらに含み、固定化捕捉プローブが、ＴＣＯ上に存在する第２の結合対メンバーに結合する第１の結合対メンバーを含有する、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６．固定化捕捉プローブが、磁気的に引き付け可能な粒子である、実施形態２５に記載の組成物。
実施形態２７．第１相の増幅反応混合物が、プロモータープライマーを欠く、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２８．標的捕捉混合物が、１つ以上の追加のプロモータープライマーを含有し、第１相の増幅混合物が、１つ以上の追加の非プロモータープライマーを含有し、第２の増幅混合物が、１つ以上の追加のさらなるプロモータープライマーおよび１つ以上の検出オリゴヌクレオチドを含有し、１つ以上の追加のプロモータープライマー、非プロモータープライマー、および検出オリゴヌクレオチドが、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ以外の種の増幅および検出に好適である、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態２９．Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ以外の種の少なくとも１つが、Ｃａｎｄｉｄａ種である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態３０．ＴＣＯが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３１．ＴＣＯが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３２．ＴＣＯが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３３．ＴＣＯが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３４．ＴＣＯが、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３５．ＴＣＯが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３６．ＴＣＯが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３７．ＴＣＯが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３８．ＴＣＯが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態３９．ＴＣＯが、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｔ７プライマーが、配列番号４のヌクレオチド配列を含み、ＮＴ７プライマーが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み、Ｔｏｒｃｈが、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態４０．試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する方法であって、
（ａ）Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列の第１の部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料をプロモータープライマーと接触させ、それにより、プロモータープライマーおよび標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することであって、
プロモータープライマーが、配列番号１７６の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する核酸配列を含む、生成することと、
（ｂ）固体支持体への標的捕捉およびそれに続く洗浄によって前増幅ハイブリッドを単離して、工程（ａ）で標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしなかったプロモータープライマーのいずれも除去することと、
（ｃ）第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、工程（ｂ）で単離された前増幅ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を、第１相の増幅反応混合物中で増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことであって、
第１相の増幅反応混合物が、非プロモータープライマーを含み、非プロモーターが、プロモータープライマーの伸長産物の一部に相補的であり、配列番号１７７の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性を有する核酸配列を含み、
第１の増幅産物が、第１相の、実質的に等温の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、もたらすことと、
（ｄ）第１の増幅産物を含む反応混合物を追加のプロモータープライマーと組み合わせて、第２相の増幅反応混合物を生成することであって、
第２相の増幅反応混合物が、検出オリゴをさらに含む、生成することと、
（ｅ）第２相において、第２相の増幅反応混合物において実質的に等温の転写関連増幅反応を実施し、第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、それにより第２の増幅産物を合成することと、
（ｆ）一定の時間間隔で検出オリゴヌクレオチドを用いて、第２相の増幅反応混合物中の第２の増幅産物の合成を検出することと、
（ｇ）工程（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化することと、を含む、方法。
実施形態４１．プロモータープライマーが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が、配列番号６５または６６を含む、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．プロモータープライマーが、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４４．プロモータープライマーが、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５．非プロモータープライマーが、第１相の等温の転写関連増幅反応において酵素的に伸長される、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４６．非プロモータープライマーが、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．非プロモータープライマーが、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．前増幅ハイブリッドを単離することが、試料を標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）と接触させることを含み、前増幅ハイブリッドが、ＴＣＯおよびプロモータープライマーのそれぞれにハイブリダイズした標的核酸配列を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４９．ＴＣＯが、配列番号３９、４０、または４１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０．ＴＣＯが、配列番号１、２、または３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５１．固体支持体が、固定化捕捉プローブを含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態５２．固定化捕捉プローブが、磁気的に引き付け可能な粒子である、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．第１相および第２相の等温の転写関連増幅反応の各々が、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、逆転写酵素が、内因性ＲＮａｓｅ Ｈ活性を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態５４．第１相の増幅反応混合物が、遊離プロモータープライマーを欠く、実施形態４０に記載の方法。
実施形態５５．工程（ｃ）の第１の増幅産物が、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、工程（ｅ）の第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、実施形態４０に記載の方法。
実施形態５６．工程（ｄ）の検出オリゴヌクレオチドが、第２の増幅産物にハイブリダイズするときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度ハイブリダイゼーションプローブである、実施形態４０に記載の方法。
実施形態５７．工程（ｄ）の検出オリゴヌクレオチドが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８．検出オリゴヌクレオチドが、配列番号１７８の領域またはその相補体と少なくとも９０％の相補性の領域を含有する、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．検出オリゴヌクレオチドが、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．検出オリゴヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１．工程（ｇ）が、検量線および工程（ｆ）からの結果を使用して試料中の標的核酸配列を定量化することを含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態６２．方法が、２つ以上の異なるプロモータープライマーおよび２つ以上の異なる非プロモータープライマーを含み、２つ以上の異なるプロモータープライマーおよび２つ以上の異なる非プロモータープライマーが、異なる標的核酸を増幅して、２つ以上の異なる増幅産物を生成する、実施形態４０に記載の方法。
実施形態６３．２つ以上の異なる増幅産物が、２つ以上の異なる検出オリゴヌクレオチドを使用して検出されることをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６３．２つ以上の異なる標的核酸が、異なる種に由来する、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．異なる種が、Ｃａｎｄｉｄａ種である、実施形態６３に記載の方法。

Claims (24)

1. 試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列を増幅する際に使用するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
   （ａ）２５～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号４２を含む標的特異的配列を有し、その５’末端に結合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する核酸配列を含むプロモータープライマー、および非プロモータープライマーであって、２５～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号１３を含む標的特異的配列を有する核酸を含む、非プロモータープライマー、
   （ｂ）２５～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号４２を含む標的特異的配列を有し、その５’末端に結合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する核酸配列を含むプロモータープライマー、および非プロモータープライマーであって、２０～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号１４を含む標的特異的配列を有する核酸を含む、非プロモータープライマー、
   （ｃ）２３～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号４５を含む標的特異的配列を有し、その５’末端に結合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する核酸配列を含むプロモータープライマー、および非プロモータープライマーであって、２２～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号１５を含む標的特異的配列を有する核酸を含む、非プロモータープライマー、または
   （ｄ）２２～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号４７を含む標的特異的配列を有し、その５’末端に結合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する核酸配列を含むプロモータープライマー、および非プロモータープライマーであって、２２～３０連続ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号１５を含む標的特異的配列を有する核酸を含む、非プロモータープライマー、
   を含む、オリゴヌクレオチドのセット。
2. 前記プロモータープライマーが、配列番号４２、４５、または４７のヌクレオチド配列からなる標的特異的配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
3. 前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーター配列が、配列番号６５または６６を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
4. 前記プロモータープライマーが、配列番号４、９、または１１の核酸配列を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
5. 前記プロモータープライマーが、配列番号４、９、または１１のヌクレオチド配列からなる核酸配列を含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
6. 前記非プロモータープライマーが、配列番号１３、１４、または１５のヌクレオチド配列からなる核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
7. さらに、１つ以上の追加の標的核酸の増幅に使用するのに好適な１つ以上の追加のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
8. さらに、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸増幅産物を検出するための検出オリゴヌクレオチドを含み、前記検出オリゴヌクレオチドが、１３～３０の核酸塩基長であり、かつ配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、またはその相補体を含む標的特異的配列を有する核酸配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドが、フルオロフォア、またはフルオロフォアおよびクエンチャーを含有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
9. 前記検出オリゴヌクレオチドが、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２のヌクレオチド配列からなる標的特異的配列を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
10. 前記検出オリゴヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、または２８の核酸配列を含む、請求項８または９に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
11. 前記検出オリゴヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、または２８のヌクレオチド配列からなる核酸配列を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
12. さらに、１つ以上の追加の標的核酸の増幅産物を検出する際に使用するのに好適な１つ以上の追加の検出オリゴヌクレオチドを含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
13. さらに、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸を捕捉する際に使用するための標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を含み、
    （ｉ）前記ＴＣＯが、配列番号３９、４０、もしくは４１を含む標的特異的配列を有する核酸配列と、固定化捕捉プローブに結合する固定化捕捉プローブ結合領域と、を含むか、または
    （ｉｉ）前記ＴＣＯが、配列番号１、２、もしくは３を含む核酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
14. （ｉ）前記ＴＣＯが、配列番号３９、４０、または４１のヌクレオチド配列からなる標的特異的配列を含むか、または（ｉｉ）前記ＴＣＯが、配列番号１、２、または３のヌクレオチド配列からなる核酸配列を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットを含む、試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出するためのキットまたは組み合わせ物。
16. さらに、請求項１３または１４に記載の標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）を含む、請求項１５に記載のキットまたは組み合わせ物。
17. 前記プロモータープライマーが、標的捕捉混合物中に存在し、前記非プロモータープライマーが、第１相の増幅混合物中に存在し、前記プロモータープライマーおよび検出オリゴヌクレオチドが、第２相の増幅混合物中に存在する、請求項１５または１６に記載のキットまたは組み合わせ物。
18. 前記標的捕捉混合物が、１つ以上の追加のプロモータープライマーを含有し、前記第１相の増幅混合物が、１つ以上の追加の非プロモータープライマーを含有し、前記第２相の増幅混合物が、１つ以上の追加のプロモータープライマーおよび１つ以上の検出オリゴヌクレオチドを含有し、前記１つ以上の追加のプロモータープライマー、非プロモータープライマー、および検出オリゴヌクレオチドが、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ以外の種の増幅および検出に好適である、請求項１７に記載のキットまたは組み合わせ物。
19. 前記Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ以外の種のうちの少なくとも１つが、Ｃａｎｄｉｄａ種である、請求項１８に記載のキットまたは組み合わせ物。
20. 請求項１３または１４に記載のオリゴヌクレオチドのセットを用いて試料中のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを検出する方法であって、前記方法が、
    （ａ）Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ標的核酸配列の第１の部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記試料を、前記プロモータープライマーと接触させ、それにより、前記プロモータープライマーおよび前記標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することと、
    （ｂ）標的捕捉によって、前記前増幅ハイブリッドを固体支持体上に単離することであって、標的捕捉が、前記試料を前記標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）と接触させることを含み、前記前増幅ハイブリッドが、前記ＴＣＯおよびプロモータープライマーのそれぞれにハイブリダイズした前記標的核酸配列を含む、単離することと、それに続いて洗浄して、工程（ａ）で前記標的核酸配列の前記第１の部分にハイブリダイズしなかった前記プロモータープライマーのいずれも除去することと、
    （ｃ）第１相の等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅を支持するが、その指数関数的増幅を支持しない条件下で、工程（ｂ）で単離された前記前増幅ハイブリッドの前記標的核酸配列の少なくとも一部分を、第１相の増幅反応混合物中で増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことであって、
    前記第１相の増幅反応混合物が、前記非プロモータープライマーを含み、
    前記第１の増幅産物が、前記第１相の、等温の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、もたらすことと、
    （ｄ）前記第１の増幅産物を含む前記反応混合物を追加のプロモータープライマーと組み合わせて、第２相の増幅反応混合物を生成することであって、
    前記第２相の増幅反応混合物が、前記検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、生成することと、
    （ｅ）第２相において、前記第２相の増幅反応混合物において等温の転写関連増幅反応を実施し、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を行い、それにより第２の増幅産物を合成することと、
    （ｆ）一定の時間間隔で前記検出オリゴヌクレオチドを用いて、前記第２相の増幅反応混合物中の前記第２の増幅産物の合成を検出することと、
    （ｇ）工程（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化することと、を含む、方法。
21. 前記非プロモータープライマーが、前記第１相の等温の転写関連増幅反応において酵素的に伸長される、請求項２０に記載の方法。
22. 工程（ｄ）における前記検出オリゴヌクレオチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、または２８の核酸配列を含む蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記方法が、２つ以上の異なるプロモータープライマーおよび２つ以上の異なる非プロモータープライマーを含み、前記２つ以上の異なるプロモータープライマーおよび前記２つ以上の異なる非プロモータープライマーが、異なる標的核酸を増幅して、２つ以上の異なる増幅産物を生成する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記２つ以上の異なるプロモータープライマーおよび前記２つ以上の異なる非プロモータープライマーが、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ種を増幅する、請求項２３に記載の方法。