JP7717413B2 - 細胞培養方法および培養上清の製造方法 - Google Patents
細胞培養方法および培養上清の製造方法Info
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Description
本発明は、細胞の培養方法および培養上清の製造方法に関する。より詳しくは、細胞培養により有用な培養上清を製造する方法に関する。
培養細胞により化粧品などに利用可能な生理活性物質を製造することは従来から行われていた（例えば、特許文献１）。
しかしながら、目的の成分の濃度を上げる培養方法については、あまり研究されておらず、より、高濃度の有用成分を含む培養上清を製造する方法の開発が求められていた。
新規な細胞培養方法および培養上清の製造方法を提供する。
［態様１］
グルコース濃度4．5ｇ／L以上含む培地中で動物細胞を培養する工程を有する、培養上清中の有用成分含有量をグルコース濃度1ｇ／L濃度の培地で培養した場合よりも増加させる方法。
［態様２］
前記動物細胞が動物幹細胞である、態様１の方法。
［態様３］
前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする態様１の方法。
［態様４］
さらに、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの含有率を減少させる、態様１の方法。
［態様５］
グルコース濃度4．5ｇ／L以上含む培地中で動物細胞を培養して培養上清中の有用成分を増加させる工程を有する、培養上清の製造方法。
［態様６］
前記動物細胞が動物幹細胞である、態様５の培養上清の製造方法。
［態様７］
前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする態様５の培養上清の製造方法。
［態様８］
さらに、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの含有率を減少させる、態様５の培養上清の製造方法。
［態様９］
前記培養上清が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群から選ばれる有用成分の生体における欠乏を処置するためのものである、態様５の培養上清の製造方法。
［態様１０］
態様５に記載の製造方法により製造された、培養上清。
［態様１１］
態様１０に記載の培養上清を含む、組成物。
［態様１２］
前記組成物が、化粧用組成物、食品用組成物、医科用組成物、および／または歯科用組成物である、態様１１の組成物。
グルコース濃度4．5ｇ／L以上含む培地中で動物細胞を培養する工程を有する、培養上清中の有用成分含有量をグルコース濃度1ｇ／L濃度の培地で培養した場合よりも増加させる方法。
［態様２］
前記動物細胞が動物幹細胞である、態様１の方法。
［態様３］
前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする態様１の方法。
［態様４］
さらに、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの含有率を減少させる、態様１の方法。
［態様５］
グルコース濃度4．5ｇ／L以上含む培地中で動物細胞を培養して培養上清中の有用成分を増加させる工程を有する、培養上清の製造方法。
［態様６］
前記動物細胞が動物幹細胞である、態様５の培養上清の製造方法。
［態様７］
前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする態様５の培養上清の製造方法。
［態様８］
さらに、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの含有率を減少させる、態様５の培養上清の製造方法。
［態様９］
前記培養上清が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群から選ばれる有用成分の生体における欠乏を処置するためのものである、態様５の培養上清の製造方法。
［態様１０］
態様５に記載の製造方法により製造された、培養上清。
［態様１１］
態様１０に記載の培養上清を含む、組成物。
［態様１２］
前記組成物が、化粧用組成物、食品用組成物、医科用組成物、および／または歯科用組成物である、態様１１の組成物。
本発明によれば、新規な動物細胞の培養方法、および新規な組成の培養上清が得られるという効果がある。
本発明は、新規な動物細胞の培養方法と、その培養方法により得られる新規な培養上清を提供する。本発明の１つの実施態様は、培地中のグルコース濃度を上げて動物細胞を培養することにより、培養上清中の有用成分の量を増やし、および／または、非有用成分の含有量を減らすことにある。
すなわち、本発明は、４．５ｇ／L以上の高濃度のグルコース、より好ましくは、９．０ｇ／L以上のグルコースを含む培地で培養することで、グルコースを１ｇ／L含む培地で培養する場合よりも、特定の美容成分などを増加させた培養上清を製造することができる。ここで、グルコースを１ｇ／L含む培地は、グルコースを４．５ｇ／L以上含む培地とグルコース濃度以外は同じ培地であることが好ましい。
本発明の培養方法では、培養上清を製造する際に、通常の動物培養用培地よりも高濃度のグルコースを含む培地で培養することに特徴がある。通常の培地では、１ｇ／L程度のグルコースを含むことが多いが、本発明では、その数倍～１０倍以上のグルコースを含む培地を使用して培養する。本発明において、培地中の好ましいグルコース濃度は、２ｇ／L以上、３ｇ／L以上、４ｇ／L以上、５ｇ／L以上、６ｇ／L以上、７ｇ／L以上、８ｇ／L以上、９ｇ／L以上、１０ｇ／L以上、１１ｇ／L以上、１２ｇ／L以上、１３ｇ／L以上、１４ｇ／L以上，１５ｇ／L以上、１６ｇ／L以上、１７ｇ／L以上、１８ｇ／L以上、１９ｇ／L以上、２０ｇ／L以上が好ましく用いられる。好ましいグルコース濃度の上限としては、１００ｇ／L以下、５０ｇ／K以下、４０g／L以下、３０ｇ／L以下、２５ｇ／L以下である。
好ましくは、継代培養後、PBSなどで細胞を洗浄した後に高濃度のグルコースを含む培地で培養することが好ましい。
グルコース濃度を上げすぎると細胞に悪影響を与える可能性が考えられるが、本発明では、悪影響が出ない範囲でグルコース濃度を上げるのが好ましい。
本発明においては、糖としてグルコースを用いているが、それ以外の糖を用いてもよい。そのような糖としては、例えば、スクロース、ガラクトース、ラクトース、キシロースなどが挙げられるが、これらに限られず、糖濃度を上げることで、生理活性物質の生産量が上がる糖であれば特に制限されない。
本発明の培養方法に適した細胞としては、動物細胞が好ましく用いられる。動物細胞としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヒトなどが挙げられるが、これらに限られず、グルコース濃度を上げることにより有用成分が増加する動物細胞であれば使用できる。より好ましくは、幹細胞、さらに好ましくヒト幹細胞が挙げられる。幹細胞の中でも多能性幹細胞がより好ましく用いられる。多能性幹細胞の種類としては、人工多能性幹細胞（iPS細胞）であっても、胚性幹細胞（ES細胞）であってもよく、それ以外の幹細胞であってもよい。組織幹細胞も本発明の培養方法に用いられる。ヒト臍帯組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、または歯髄幹細胞を用いてもよい。
本発明は、いきなり本発明の培地で培養することもできるが、通常は、一般的な培地で継代培養した細胞を用いて、本発明の培地に交換して培養するのが好ましい。継代培養の継代数の範囲は、複数回が好ましく、２回以上継代培養した細胞を使用することが好ましい。さらに好ましい継代数は、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上である。継代培養の上限数は３０回以内、２５回以内、２０回以内である。
本発明の方法は、グルコース濃度4．5ｇ／L以上含む培地中で該動物細胞を培養する工程に先立ち、動物細胞を継代培養する工程、又は該継代培養した該動物細胞を洗浄する工程を含んでもよい。
グルコース高濃度培地での培養時間は、１０時間以上、より好ましくは１５時間以上、さらに好ましくは２０時間以上、さらに好ましくは２５時間以上、さらに好ましくは３０時間以上、さらに好ましくは３５時間以上、さらに好ましくは４０時間以上、最も好ましくは４５時間以上である。グルコース高濃度培地での培養時間の上限は、５０時間以下、４８時間以下である。
本発明に適用し得る培養容器は、動物細胞の組織培養に一般的に用いられるシャーレ、培養びん、培養フラスコなどであってもよく、タンク培養であってもよい。または、コラーゲンなどの足場に細胞を埋め込んで培養してもよい。さらに、バイオリアクターにより細胞を培養してもよい。いずれの場合も、二酸化炭素分圧４～１０％、温度３５～３８℃で培養する。必要に応じて、酸素、水素などの気体を供給することで、培養速度、培養細胞量を適宜調整することができる。
本明細書において、培養上清とは、培養後の培地をいう。培養上清は培養終了後、ピペットなどで吸い上げてもよく、培養液を遠心分離して細胞と分離してもよい。あるいは、本発明の培養方法により得られた培養上清は、濾過して使用するのが好ましい。濾過フィルターの孔径としては、好ましくは１．０μm、より好ましくは０．４５μm、さらに好ましくは０．２２μmである。エクソソームを精製して用いる場合は、さらに限外濾過を用いるのが好ましい。精製した培養上清は、濃縮して液体として利用してもよく、凍結乾燥して粉末状にして各種製品に混合して用いてもよい。
培養上清をカラムなどを用いて有用成分を精製して用いても良い。カラムとしては、ゲル濾過、イオン交換樹脂、吸着カラム（抗体カラムなど）、極性カラムなどが挙げられるが、これらに限られず、有用成分を濃縮または精製できるものであれば使用できる。カラムはオープンカラムでもよく、高速液体クロマトグラフィーや、ガスクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィーなどであってもよい。
今回のグルコース濃度を高めた培養実験においては、フィブロネクチン（ＦＮ）やＢＭＰがグルコース濃度を上げたことにより増加することがわかった（表５）。さらに、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質（Keratinocyte proline-rich protein）、タイプIケラチン細胞骨格性9（Keratin, type I cytoskeletal 9）、タイプIケラチン細胞骨格性10（Keratin, type I cytoskeletal 10），タイプIケラチン細胞骨格性14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、タイプIIケラチン細胞骨格性1（Keratin, type II cytoskeletal 1）、タイプIIケラチン細胞骨格性3（Keratin, type II cytoskeletal 3）、タイプIIケラチン細胞骨格性5（Keratin, type II cytoskeletal 5）、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性（Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal）、デスモグレイン1（Desmoglein-1）、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖（Collagen alpha-1(II) chain）、骨形成タンパク質４（Bone morphogenetic protein 4）、コラーゲン・アルファ－1（XVIII)鎖（Collagen alpha-1(XVIII) chain）、デスモプラキン（Desmoplakin）、およびデスモコリン２（Desmocollin-2）もグルコース濃度を上げることにより増加することがわかった（表５）。これらは、表１に示すように医療上および／または美容上有用な成分である。したがって、前記培養上清は、好ましくは、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、フィブロネクチン、およびデスモコリン２からなる群から選ばれる有用成分の生体における欠乏を処置するためのものである。ここで、処置としては、例えば、治療のほか、予防などが挙げられる。治療としては、完治のほか、症状の緩和、予後の改善、再発の防止などが挙げられる。生体としては、例えば、骨、軟骨、骨格筋、腱、靱帯などの運動器；目、耳、鼻、舌、皮膚、粘膜、筋紡錘などの感覚器；口、鼻、喉頭、咽頭、気管、気管支、肺などの呼吸器；心臓、脾臓、骨髄、血液などの循環器；口、歯、喉頭、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門、消化腺、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢などの消化器；脳、脊髄、神経などの神経系；乳房、卵巣、子宮、胎盤、膣、陰唇、陰核、陰茎、陰嚢、精巣などの生殖器；視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎、卵巣、胎盤、精巣などの内分泌器；腎臓、尿管、膀胱、尿道などの泌尿器などが挙げられる。生体は、例えば、対象の生体である。ここで、対象としては、例えば、脊椎動物が挙げられる。脊椎動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。哺乳動物は、好ましくはヒトである。対象は、乳幼児、若年、青年、成人、および老人を含めた任意の年齢であり得る。
また、グルコース濃度を上げることにより、減少する成分も見いだされた（表６）。悪影響を与える成分を減少させれば、有用成分の効果をより高めることができる。特に生理活性を持たない成分の場合も、不要な成分が減少することで、有用成分の含有量が増える可能性があり得るので、有用成分以外の成分が減少することは、より有用な培養上清を製造することにつながる可能性がある。
培養上清の利用方法としては、化粧品（美容液、クリームなど）、健康食品、食品、医薬などが挙げられる。美容液の場合は、コラーゲンなどの含有率の高い美容液、化粧品などが提供できる。健康食品の場合は、アンチエイジング、軟骨成分のサプリメントなどが考えられる。培養上清の製品に対する好ましい含有量の下限としては、０．１％以上、０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上である。好ましい含有量の上限としては、９９．９％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下である。
（実施例１）
培養上清抽出時のグルコース濃度の違いによる影響検証
培養上清抽出時の糖濃度の違いによる影響について調査した。
抽出培地に添加する糖濃度を変え、得られた培養上清液を分析した。
・細胞: ヒト臍帯組織由来幹細胞(上清液抽出時の継代数はP8)
・継代時の細胞播種密度: 5000 cells /cm2
培養上清抽出時のグルコース濃度の違いによる影響検証
培養上清抽出時の糖濃度の違いによる影響について調査した。
抽出培地に添加する糖濃度を変え、得られた培養上清液を分析した。
・細胞: ヒト臍帯組織由来幹細胞(上清液抽出時の継代数はP8)
・継代時の細胞播種密度: 5000 cells /cm2
細胞はコージンバイオ社（ADSC-4）培地で増殖培養を行った。コンフルエントに達した段階でTrypLE Selectにより細胞剥離を行い継代操作を行った。総継代数8のタイミングで下記培地組成に切り替えを行い、培養上清液を作製した。
・培地組成: DEME (no-glucose)、gibco社、#A1443001
・糖の種類: グルコース(ナカライテスク, #16806-12)
マンニトール(ナカライテスク, #11662-42)
培地に添加する糖濃度（図１）
１．DMEM+Glucose（1.0 g/L）
２．DMEM+Glucose（4.5 g/L）
３．DMEM+Glucose（9.0 g/L）
４．DMEM+マンニトール（10 mg/mL）
・培地組成: DEME (no-glucose)、gibco社、#A1443001
・糖の種類: グルコース(ナカライテスク, #16806-12)
マンニトール(ナカライテスク, #11662-42)
培地に添加する糖濃度（図１）
１．DMEM+Glucose（1.0 g/L）
２．DMEM+Glucose（4.5 g/L）
３．DMEM+Glucose（9.0 g/L）
４．DMEM+マンニトール（10 mg/mL）
培養細胞の形態を図１に、細胞数を図２に示す。図１に示すように、培地中のグルコース濃度を１ｇ／Ｌから、４．５ｇ／Ｌや、９．０ｇ／Ｌに上げても細胞の形態は特に変化しなかった。しかしながら、細胞数は、培地中のグルコース濃度１ｇ／Ｌと４．５ｇ／Ｌでは大差ないが、９．０ｇ／Ｌでは、約２０％程度細胞数が増加した（図２）。また、マンニトール１％添加区でも、グルコース濃度１ｇ／Ｌと４．５ｇ／Ｌと細胞数はほとんど差がなかった。これに対し、グルコース０ｇ／Ｌ、トレハロース１００ｍｇ／Ｌの区では、顕著に細胞数が少なかった。
上清液の調製方法
P8時点の細胞がコンフルエントに達した段階で、既存培地（ADSC-4）を取り除き、PBSで２回洗浄した。その後、上記組成の培地をそれぞれの細胞群に加えて４８時間培養を行った。培養後、培養上清を回収して、0.22μmフィルター濾過をすることで培養上清液を調整した。
P8時点の細胞がコンフルエントに達した段階で、既存培地（ADSC-4）を取り除き、PBSで２回洗浄した。その後、上記組成の培地をそれぞれの細胞群に加えて４８時間培養を行った。培養後、培養上清を回収して、0.22μmフィルター濾過をすることで培養上清液を調整した。
プロテオーム解析用試料の調製
試料調製
調製した培養上清についてプロテオーム解析の前処理として以下の処理を行った。
サンプル液量に対して等量の400 mM Tris-HCL pH8.5, 4% SDSを加え、サンプル密閉式超音波破砕機で処理した。この資料についてBCAアッセイによりタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度1μg/μLになるように100 mM Tris-HCL pH8.5, 2% SDSで調整した。
試料調製
調製した培養上清についてプロテオーム解析の前処理として以下の処理を行った。
サンプル液量に対して等量の400 mM Tris-HCL pH8.5, 4% SDSを加え、サンプル密閉式超音波破砕機で処理した。この資料についてBCAアッセイによりタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度1μg/μLになるように100 mM Tris-HCL pH8.5, 2% SDSで調整した。
次に、タンパク質のS-S結合を切断するために、タンパク質溶解液（タンパク量20ug）に終濃度20mMになるようにTCEPを添加して50℃で30分間インキュベートした。システイン残基をアルキル化処理するために、終濃度30mMになるようにヨードアセトアミド(IAA)を添加して室温（遮光）で30分間インキュベートした。
次に、Cytiva社のSera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles (Hydrophylic)とSera-Mag Carboxylate-Modified Magnetic Particles (Hydrophobic)を1:1(v/v) で混合して、蒸留水で3回洗浄して、蒸留水で15 μg solids/μLになるように調製した（SP3ビーズ）。上記でアルキル化したサンプルにSP3ビーズ20μLを入れて、さらにサンプル液量の2.5倍量のエタノールを加えた後、20分間室温でミキシングした。該ビーズを80%エタノールで2回洗浄後、50mM Tris-HCL pH8.0を100μL添加してミキシングした。次に、タンパク質をペプチド断片化するためにTrypsin/Lys-C Mix (プロメガ)500ng を添加して、37℃で一晩インキュベートした。
このものに5% TFAを20μL加え、サンプル密閉式超音波破砕機で処理した。得られた処理液をC18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターで乾固した。乾固したものに、3% ACN-0.1% formic acidを加え、サンプル密閉式超音波破砕機でペプチドを溶解した。ペプチドを溶解した溶液についてBCAアッセイによりペプチド濃度を測定し、ペプチド濃度200 ng/μLになるように2% ACN-0.1% TFAで調整した。試料調製されたサンプルは以下のnanoLC-MS/MS分析条件で測定を行った。
nanoLCの分析条件について
インジェクションしたペプチド量:200 ng
使用したnanoLC: UltiMate 3000 RSLCnano LC System (Thermo Fisher Scientific)
カラムサイズ：内径75 μm ×長さ120 mm (日京テクノス)
カラム温度: 40℃
溶媒: A溶媒0.1% ギ酸添加蒸留水、B溶媒0.1% ギ酸添加80% CAN
グラジエント条件は、表２のとおり
インジェクションしたペプチド量:200 ng
使用したnanoLC: UltiMate 3000 RSLCnano LC System (Thermo Fisher Scientific)
カラムサイズ：内径75 μm ×長さ120 mm (日京テクノス)
カラム温度: 40℃
溶媒: A溶媒0.1% ギ酸添加蒸留水、B溶媒0.1% ギ酸添加80% CAN
グラジエント条件は、表２のとおり
MSの分析条件について
使用したMS: Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)
イオン化法:ESIポジティブモード
測定時間：40分(グラジエント時間4～44分を測定)
MS分析の種類：Overlapping window DIA
スキャンイベント：以下のイベント１～４を繰り返してデータ取得
MSの分析条件について
使用したMS: Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)
イオン化法:ESIポジティブモード
測定時間：40分(グラジエント時間4～44分を測定)
MS分析の種類：Overlapping window DIA
スキャンイベント：以下の表３のイベント１～４を繰り返してデータ取得
使用したMS: Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)
イオン化法:ESIポジティブモード
測定時間：40分(グラジエント時間4～44分を測定)
MS分析の種類：Overlapping window DIA
スキャンイベント：以下のイベント１～４を繰り返してデータ取得
MSの分析条件について
使用したMS: Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)
イオン化法:ESIポジティブモード
測定時間：40分(グラジエント時間4～44分を測定)
MS分析の種類：Overlapping window DIA
スキャンイベント：以下の表３のイベント１～４を繰り返してデータ取得
・イベント1と3のフルスキャン(MS1)測定のパラメーター
Resolution:30,000
AGC target: 3e6
Maximum IT: 55 ms
MS1 scan range: 495 to 785 m/z
・イベント2と4のDIA(MS2)測定パラメーター
Resolution：15,000
AGC target: 3e6
Maximum IT: auto
Loop count: 71(イベント2の場合)、70(イベント4の場合)
MS2 ｓcan range: 200 m/z以上
Normalized Collision Energy: 28
Isolation window: 4.0 m/z
Isolation window center m/zs:以下の表４を参照
Resolution:30,000
AGC target: 3e6
Maximum IT: 55 ms
MS1 scan range: 495 to 785 m/z
・イベント2と4のDIA(MS2)測定パラメーター
Resolution：15,000
AGC target: 3e6
Maximum IT: auto
Loop count: 71(イベント2の場合)、70(イベント4の場合)
MS2 ｓcan range: 200 m/z以上
Normalized Collision Energy: 28
Isolation window: 4.0 m/z
Isolation window center m/zs:以下の表４を参照
データ解析
得られたMSデータはScaffold DIAを用いて以下の条件で解析し、タンパク質・ペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。この解析結果をエクスポートした後、Excelファイルにデータをまとめた。
使用したソフトウェア: Scaffold DIA (Proteome Software)
Protein Sequence Database：HumanUniProtKB/Swiss-Prot database (UP000005640)
Spectral Library：上記の配列データベースからProsit(https://www.proteomicsdb.org/prosit/)によってライブラリを作成
Fragmentation:HCD
Precursor Tolerance: 10 ppm
Fragment Tolerance: 10 ppm
Data Acquisition Type: Staggered DIA
Digestion Enzyme: Trypsin
Peptide Charge: 2-4
Max Missed Cleavages: 1
Fixed Modification: Carbamidomethylation [C]
Peptide FDR: 1%以下
Protein FDR: 1%以下
得られたMSデータはScaffold DIAを用いて以下の条件で解析し、タンパク質・ペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。この解析結果をエクスポートした後、Excelファイルにデータをまとめた。
使用したソフトウェア: Scaffold DIA (Proteome Software)
Protein Sequence Database：HumanUniProtKB/Swiss-Prot database (UP000005640)
Spectral Library：上記の配列データベースからProsit(https://www.proteomicsdb.org/prosit/)によってライブラリを作成
Fragmentation:HCD
Precursor Tolerance: 10 ppm
Fragment Tolerance: 10 ppm
Data Acquisition Type: Staggered DIA
Digestion Enzyme: Trypsin
Peptide Charge: 2-4
Max Missed Cleavages: 1
Fixed Modification: Carbamidomethylation [C]
Peptide FDR: 1%以下
Protein FDR: 1%以下
グルコース濃度を１ｇ／Lから４．５ｇ／Lまたは９．５ｇ／Lに上昇させることで、増加した有用成分および、減少した成分を以下に示す（表５、表６）。
培地のグルコース濃度を１ｇ／Lから４．５ｇ／Lに増加させることで、値が２倍以上になったタンパク質を以下に示す。
タイプIケラチン細胞骨格性9（Keratin, type I cytoskeletal 9）、タイプIケラチン細胞骨格性14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、タイプIケラチン細胞骨格性1（Keratin, type II cytoskeletal 1）レチノール結合タンパク質4（Retinol-binding protein4）、ADP-リボースピロホスファターゼミトコンドリア（ADP-ribose pyrophosphatase, mitochondrial）、テネイシン（Tenascin）、デスモプラキン（Desmoplakin）、タイプIIケラチン細胞骨格性3（Keratin, type II cytoskeletal 3）、ホルネリン（Hornerin）、タイプIケラチン細胞骨格性10（Keratin, type I cytoskeletal 10）、トロンボスポンジンー3（Thrombospondin-3）、タンパク質AHNAK2（Protein AHNAK2）、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮（Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal）、マルチプル上皮成長因子様ドメインタンパク質8（Multiple epidermal growth factor-like domains protein8）、タイプIIケラチン細胞骨格性6A（Keratin, type II cytoskeletal 6A）、カリン－3（Cullin-3）、コイルドコイルドメイン含有タンパク質50（Coiled-coil domain-containing protein 50）、ミメカン（Mimecan）、イムノグロブリンスーパーファミリーDCCサブクラスメンバー4（Immunoglobulin superfamily DCC subclass member 4）、コラーゲンアルファ1（II)鎖（Collagen alpha-1(II) chain）、タンパク質S100-A8（Protein S100-A8）、エプシン－1（Epsin-1）、プロトカドヘリンFat1（Protocadherin Fat 1）、ステロール担体タンパク質2（Sterol carrier protein 2）、マトリックスGlaタンパク質（Matrix Gla protein）、Sec1ファミリードメイン含有タンパク質1（Sec1 family domain-containing protein 1）、タイプIIケラチン細胞骨格性5（Keratin, type II cytoskeletal 5）、ホスホリパーゼAー2ー活性化タンパク質（Phospholipase A-2-activating protein）、ユビキチン抱合酵素E2 Z（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Z）、プレ-mRNAプロセシング因子19（Pre-mRNA-processing factor 19）、エンドヌクレアーゼLACTB2（Endoribonuclease LACTB2）、細胞質性トリプトファンtRNAリガーゼ（Tryptophan--tRNA ligase, cytoplasmic）、Legumainアルファー1，6ーマンノシルー糖タンパク質2ーベーターNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase）、ベーターエノラーゼ（Beta-enolase）、MOBキナーゼ活性化因子１B（MOB kinase activator 1B）、MOB kinase activator 1BMOBキナーゼ活性化因子１A（MOB kinase activator 1A）、免疫関連GTPアーゼファミリーQタンパク質（Immunity-related GTPase family Q protein）、コラーゲンアルファ－3（V)鎖（Collagen alpha-3(V) chain）、カテプシンF（Cathepsin F）、精巣上体特異的アルファーマンノシダーゼ（Epididymis-specific alpha-mannosidase）、ユビキチンドメイン含有タンパク質UBFD1（Ubiquitin domain-containing protein UBFD1）、上皮成長因子受容体基質15様1（Epidermal growth factor receptor substrate 15-like 1）、チメットオリゴペプチダーゼ（Thimet oligopeptidase）、ディスクスラージホモログ１（Disks large homolog 1）、UPF0687タンパク質C20orf27（UPF0687 protein C20orf27）、スペルミン合成酵素（Spermine synthase）、ゴルジレジデントアデノシン3’、5’－ビスホスフェイト３’－ホスファターゼ（Golgi-resident adenosine 3',5'-bisphosphate 3'-phosphatase）、チューブリンベータ８B（Tubulin beta 8B）、ラギュレイター複合体タンパク質LAMTOR3（Ragulator complex protein LAMTOR3）
タイプIケラチン細胞骨格性9（Keratin, type I cytoskeletal 9）、タイプIケラチン細胞骨格性14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、タイプIケラチン細胞骨格性1（Keratin, type II cytoskeletal 1）レチノール結合タンパク質4（Retinol-binding protein4）、ADP-リボースピロホスファターゼミトコンドリア（ADP-ribose pyrophosphatase, mitochondrial）、テネイシン（Tenascin）、デスモプラキン（Desmoplakin）、タイプIIケラチン細胞骨格性3（Keratin, type II cytoskeletal 3）、ホルネリン（Hornerin）、タイプIケラチン細胞骨格性10（Keratin, type I cytoskeletal 10）、トロンボスポンジンー3（Thrombospondin-3）、タンパク質AHNAK2（Protein AHNAK2）、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮（Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal）、マルチプル上皮成長因子様ドメインタンパク質8（Multiple epidermal growth factor-like domains protein8）、タイプIIケラチン細胞骨格性6A（Keratin, type II cytoskeletal 6A）、カリン－3（Cullin-3）、コイルドコイルドメイン含有タンパク質50（Coiled-coil domain-containing protein 50）、ミメカン（Mimecan）、イムノグロブリンスーパーファミリーDCCサブクラスメンバー4（Immunoglobulin superfamily DCC subclass member 4）、コラーゲンアルファ1（II)鎖（Collagen alpha-1(II) chain）、タンパク質S100-A8（Protein S100-A8）、エプシン－1（Epsin-1）、プロトカドヘリンFat1（Protocadherin Fat 1）、ステロール担体タンパク質2（Sterol carrier protein 2）、マトリックスGlaタンパク質（Matrix Gla protein）、Sec1ファミリードメイン含有タンパク質1（Sec1 family domain-containing protein 1）、タイプIIケラチン細胞骨格性5（Keratin, type II cytoskeletal 5）、ホスホリパーゼAー2ー活性化タンパク質（Phospholipase A-2-activating protein）、ユビキチン抱合酵素E2 Z（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Z）、プレ-mRNAプロセシング因子19（Pre-mRNA-processing factor 19）、エンドヌクレアーゼLACTB2（Endoribonuclease LACTB2）、細胞質性トリプトファンtRNAリガーゼ（Tryptophan--tRNA ligase, cytoplasmic）、Legumainアルファー1，6ーマンノシルー糖タンパク質2ーベーターNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase）、ベーターエノラーゼ（Beta-enolase）、MOBキナーゼ活性化因子１B（MOB kinase activator 1B）、MOB kinase activator 1BMOBキナーゼ活性化因子１A（MOB kinase activator 1A）、免疫関連GTPアーゼファミリーQタンパク質（Immunity-related GTPase family Q protein）、コラーゲンアルファ－3（V)鎖（Collagen alpha-3(V) chain）、カテプシンF（Cathepsin F）、精巣上体特異的アルファーマンノシダーゼ（Epididymis-specific alpha-mannosidase）、ユビキチンドメイン含有タンパク質UBFD1（Ubiquitin domain-containing protein UBFD1）、上皮成長因子受容体基質15様1（Epidermal growth factor receptor substrate 15-like 1）、チメットオリゴペプチダーゼ（Thimet oligopeptidase）、ディスクスラージホモログ１（Disks large homolog 1）、UPF0687タンパク質C20orf27（UPF0687 protein C20orf27）、スペルミン合成酵素（Spermine synthase）、ゴルジレジデントアデノシン3’、5’－ビスホスフェイト３’－ホスファターゼ（Golgi-resident adenosine 3',5'-bisphosphate 3'-phosphatase）、チューブリンベータ８B（Tubulin beta 8B）、ラギュレイター複合体タンパク質LAMTOR3（Ragulator complex protein LAMTOR3）
培地中のグルコース濃度を１ｇ／Lから９ｇ／Lに増加させて培養した際に、値が２倍以上に増加したタンパク質を以下に示す。
タイプIケラチン細胞骨格性9（Keratin, type I cytoskeletal 9）、TSCC22ドメインファミリータンパク質2（TSC22 domain family protein 2）、コールドショックドメイン含有タンパク質E1（Cold shock domain-containing protein E1）、テ ネイシン（Tenascin）、ホルネリン（Hornerin）、レチノール結合タンパク質4（Retinol-binding protein 4）、タイプIケラチン細胞骨格性14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、真核細胞翻訳開始因子3サブユニットL（Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit L）、マルチプル上皮成長因子様ドメインタンパク質8（Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8）、タイプIIケラチン細胞骨格性1（Keratin, type II cytoskeletal 1）、トロンボスポンジンー3（Thrombospondin-3）、タイプIIケラチン細胞骨格性3（Keratin, type II cytoskeletal 3）、デスモプラキン（Desmoplakin）、アネキシンA7（Annexin A7）、組織アルファーL-フコシダーゼ（Tissue alpha-L-fucosidase）、ミオシンー10（Myosin-10）、L-キシルロース還元酵素（L-xylulose reductase）、ホスホリボシルホルミルグリシナミジン合成酵素（Phosphoribosyl formyl glycinamidine synthase）、胸腺受容体相互作用タンパク質6（Thyroid receptor-interacting protein 6）、コラーゲンアルファ1（II)鎖（Collagen alpha-1(II) chain）、ソーティングネキシン-2（Sorting nexin-2）、ホスホリパーゼAー2ー活性化タンパク質（Phospholipase A-2-activating protein）、多重凝固因子欠乏タンパク質2（Multiple coagulation factor deficiency protein 2）、マトリックスGlaタンパク質（Matrix Gla protein）、シグナル認識粒子54ｋDaタンパク質（Signal recognition particle 54 kDa protein）、プレ-mRNAプロセシングースプライシング因子8（Pre-mRNA-processing-splicing factor 8）、プロトカドヘリンFat1（Protocadherin Fat 1）、シグナル認識粒子受容体サブユニットアルファ（Signal recognition particle receptor subunit alpha）、核有糸分裂装置タンパク質1（Nuclear mitotic apparatus protein 1）、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ制御サブユニット10（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 10）、イムノグロブリンスーパーファミリーDCCサブクラスメンバー4（Immunoglobulin superfamily DCC subclass member 4）、カリンー3（Cullin-3）、タイプIIケラチン細胞骨格性1b（Keratin, typeII cytoskeletal 1b）、ミメカン（Mimecan）、精巣上体特異的アルファーマンノシダーゼ（Epididymis-specific alpha-mannosidase）、シュドウリジン－5’－ホスファターゼ（Pseudouridine-5'-phosphatase）、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ／ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼタイプ－1サブユニットアルファ（Protein farnesyltransferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha）、ビネキシン （Vinexin）、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮性（Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal）、シスタチオニンガンマ-リアーゼ（Cystathionine gamma-lyase）、タイプIケラチン細胞骨格性10（Keratin, type I cytoskeletal 10）、高親和性アフィニティカチオン性アミノ酸トランスポーター1（High affinity cationic amino acid transporter 1）、ラギュレイター複合体タンパク質LAMTOER3（Ragulator complex protein LAMTOR3）、自然な細胞毒性引き金受容体3リガンド1（Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1）、デスモコリン－2（Desmocollin-2）、エプシン－1（Epsin-1）、SEC23－相互作用タンパク質（SEC23-interacting protein）、イムノグロブリン結合タンパク質1（Immunoglobulin-binding protein 1）、反発ガイダンス分子B（Repulsive guidance moleculeB）、カテプシンF（Cathepsin F）、小型グルタミンリッチテトラ虜ペプチド反復配列含有タンパク質ベータ（Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein beta）、複製タンパク質A32ｋDaサブユニット（Replication protein A 32 kDa subunit）、血清アミロイドA-2タンパク質（Serum amyloid A-2 protein）、ビス（5’ーヌクレオシル）ーテトラホスファターゼ（非対称）（Bis(5'-nucleosyl)-tetraphosphatase[asymmetrical]）、アルファー1，6ーマンノシルー糖タンパク質2ーベーターNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyl transferase）、コイルドコイルおよびC2ドメイン含有タンパク質1A（Coiled-coil and C2 domain-containing protein 1A）、タンパク質SOGA1（Protein SOGA1）、免疫関連GTPアーゼファミリーQタンパク質（Immunity-related GTPase family Q protein）、膜貫通型タンパク質132A（Transmembrane protein 132A）、ユビキチン抱合酵素E2R2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2）、タイプIIケラチン細胞骨格性5（Keratin,type II cytoskeletal 5）、エンドヌクレアーゼLACTB2（Endoribonuclease LACTB2）、ペプチジループロリルシスートランスイソメラーゼFKBP14（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP14）、CCR4-NOT転写複合体サブユニット1（CCR4-NOT transcription complex subunit 1）、ホスホパントテン酸ーシステインリガーゼ（Phosphopantothenate--cysteine ligase）、ゴルジレジデントアデノシン3’、5’－ビスホスフェイト３’－ホスファターゼ（Golgi-resident adenosine 3',5'-bisphosphate 3'-phosphatase）、細胞質性トリプトファンtRNAリガーゼ（Tryptophan--tRNA ligase, cytoplasmic）、ラミニンサブユニットアルファ－4（Laminin subunit alpha-4）、L-アミノアジピン酸セミアルデヒド脱水素酵素ーホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase-phosphopantetheinyl transferase）、ATP依存性DNAヘリカーゼQ1（ATP-dependent DNA helicase Q1）、タンパク質unc-45ホモログA（Protein unc-45 homolog A）、グルタミン酸ーシステインリガーゼ制御サブユニット（Glutamate--cysteine ligase regulatory subunit）、ユビキリン－2（Ubiquilin-2）、補体成分3（Complement C3）、インポーティン－9（Importin-9）、液胞タンパク質ソーティング付随タンパク質25（Vacuolar protein-sorting-associated protein 25）、ユビキチンドメイン含有タンパク質UBFD1（Ubiquitin domain-containing protein UBFD1）、アデニル酸シクラーゼ付随タンパク質2（Adenylyl cyclase-associated protein 2）、アタキシン10（Ataxin-10）、TRIOおよびF-アクチン結合タンパク質（TRIO and F-actin-binding protein）、チオレドキシン様タンパク質4A（Thioredoxin-like protein 4A）、タイプIIケラチン細胞骨格性73（Keratin, type II cytoskeletal 73）、ミトコンドリア由来ディアブロホモログ（Diablo homolog, mitochondrial）、ベーターエノラーゼ（Beta-enolase）、SPRYドメイン含有タンパク質4（SPRY domain-containing protein 4）RNAー結合タンパク質ラリー（RNA-binding protein Raly）、ビトロネクチン（Vitronectin）、コラーゲンアルファ－3（V)鎖（Collagen alpha-3(V) chain）、フェニルアラニンーｔRNAリガーゼベータサブユニット（Phenylalanine--tRNA ligase beta subunit）、WDリピート含有タンパク質82（WD repeat-containing protein 82）、アナモルシン（Anamorsin）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（Retinoid-inducible serine carboxypeptidase）、ジペプチドペプチダーゼ4（Dipeptidyl peptidase 4）、エチルマロニルーCoAデカルボキシラーゼ（Ethylmalonyl-CoA decarboxylase）、ジペプチドペプチダーゼ9（Dipeptidyl peptidase 9）、チミジンホスホリラーゼ（Thymidine phosphorylase）、U8 U8 snoRNA-デキャッピング酵素（snoRNA-decapping enzyme）、Ran結合タンパク質3（Ran-binding protein 3）、GTPアーゼNas（GTPase NRas）、ロイシンーシスチンアミノペプチダーゼ（Leucyl-cystinyl aminopeptidase）、タンパク質S100-A8（Protein S100-A8）、レグマイン（Legumain）、26Sプロテオソーム非ATPアーゼ制御サブユニット8（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 8）、2機能性3’ーホスフォアデノシン5’ーホスホ硫酸合成酵素1（Bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 1）、内在性膜タンパク質2B（Integral membrane protein 2B）、液胞タンパク質ソーティング付随タンパク質VTA1ホモログ（Vacuolar protein sorting-associated protein VTA1 homolog）、エクスポーティン－T（Exportin-T）、ユビキチン抱合酵素E2 Z（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Z）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（Bisphosphoglycerate mutase）、細胞遊走・細胞浸潤エンハンサー1（Migration and invasion enhancer 1）、トランスフォーミング増殖因子ベータ1プロプロテイン（Transforming growth factor beta-1 proprotein）、IRRE様タンパク質1のKin（Kin of IRRE-like protein 1）、イノシトールポリフォスフェイト1ホスファターゼ（Inositol polyphosphate 1-phosphatase）、CADタンパク質（CAD protein）、ミトコンドリア性エノールCoAヒトラターゼ（Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial）、スペルミン合成酵素（Spermine synthase）、グルタチオンSトランスフェラーゼLANCL1（Glutathione S-transferase LANCL1）、細胞性レチノイン酸結合タンパク質2（Cellular retinoic acid-binding protein 2）、酸性セラミダーゼ（Acid ceramidase）、カリン－2（Cullin-2）、棘皮動物微小管付随タンパク質様2（Echinoderm microtubule-associated protein-like 2）、リソソーム酸リパーゼ／コレステリルエステルハイドロラーゼ（Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase）、アダプチンイヤー結合コート付随タンパク質2（Adaptin ear-binding coat-associated protein 2）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイネースドメイン含有タンパク質17（Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17）、イノシン－5’－1リン酸脱水素酵素1（Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 1）、リン脂質輸送タンパク質（Phospholipid transfer protein）、ピカチュリン（Pikachurin）、タンパク質透明ホモログ1（Protein diaphanous homolog 1）、ラミニンサブユニットベータ－2（Laminin subunitbeta-2）、プレフォルジンサブユニット5（Prefoldin subunit 5）、グルコース1，6ービスフォスフェート合成酵素（Glucose 1,6-bisphosphate synthase）、ロイシンリッチリピート含有タンパク質47（Leucine-rich repeat-containing protein 47）、拡張シナプトタグミン－2（Extended synaptotagmin-2）、GDH/6PGLエンドプラズミック2機能性タンパク質（GDH/6PGL endoplasmic bifunctional protein）、コートマーサブユニットゼータ－2（Coatomer subunit zeta-2）、タンパク質AHNAK2（Protein AHNAK2）、プロスタグランジンーH2 D-イソメラーゼ（Prostaglandin-H2 D-isomerase）、ｃAMPー依存性タンパク質キナーゼタイプIIーアルファ制御サブユニット（cAMP-dependent protein kinase type II-alpha regulatory subunit）、Sec1ファミリードメイン含有タンパク質1（Sec1 family domain-containing protein 1）、イソアミル酢酸加水分解エステラーゼ”1ホモログ（Isoamyl acetate-hydrolyzing esterase 1 homolog）、プログラム細胞死タンパク質10（Programmed cell death protein 10）、タンパク質アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ5（Protein arginine N-methyltransferase 5）、アルファーアミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase）、コイルドコイルドメイン含有タンパク質126（Coiled-coil domain-containing protein126）、タンパク質ホスファターゼ（1F（Protein phosphatase 1F）、スムーセリンSUMOー活性化硬度サブユニット1（Smoothelin SUMO-activating enzyme subunit 1）、上皮成長因子受容体基質15様1（Epidermal growth factor receptor substrate 15-like 1）、ユビキチン様抱合酵素ATG3（Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3）、タンパク質YIPF3（Protein YIPF3）、L-乳酸脱水素酵素A
ー様6B（L-lactate dehydrogenase A-like 6B）、ベーター セントラクチン（Beta-centractin）、ガラクトセレブロシダーゼ（Galactocerebrosidase）、コピンー3（Copine-3）、推定ペプチジルーｔRNAヒドロラーゼPTHRHD1（Putative peptidyl-tRNA hydrolase PTRHD1）、アルファーN-アセチルグルコサミニダーゼ（Alpha-N-acetylglucosaminidase）、キネクチン（Kinectin）、アストロサイトリン酸化タンパク質PEA-15（Astrocytic phosphoprotein PEA-15）、インヒビンベータA鎖（Inhibin beta A chain）、上皮成長因子受容体リン酸化酵素基質8様タンパク質2（Epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 2）、STE20様セリン／スレオニンタンパク質リン酸化酵素（STE20-like serine/threonine-protein kinaseLIM）、ドメインオンリータンパク質7（LIM domain only protein 7）、セラミド輸送タンパク質（Ceramide transfer protein）、荷電多胞体タンパク質4ｂ（Charged multivesicular body protein 4b）、ミクロフィブリル付随糖タンパク質4（Microfibril-associated glycoprotein 4）、アスパルチルアミノペプチダーゼ（Aspartyl aminopeptidase）、NEDO4様E3ユビキチンータンパク質リガーゼ（E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like）エクソシスト複合体コンポーネント7（Exocyst complex component 7）、ハプトグロビン関連タンパク質（Haptoglobin-related protein）、ユビキチン抱合酵素E2 Q1（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Q1）、トランスリン付随タンパク質X（Translin-associated protein X）、39様カルシウム結合タンパク質（Calcium-binding protein 39-like）、ペプチジルプロリルシスートランスーイソメラーゼNIMA―相互作用１（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1）、BAGファミリー分子チャペロン制御因子2（BAG family molecular chaperone regulator 2）、アポトーシス調節因子BAX（Apoptosis regulator BAX）、タンパク質ホスファターゼ1制御サブユニット7（Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7）、トランスサイレチン（Transthyretin）、液胞タンパク質ソーティング関連タンパク質35（Vacuolar protein sorting-associated protein 35）、トロンボスポンジンモチーフ4を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4）、ベータ－1，3ーNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼルナティックフリンジ（Beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase lunaticfringe）、2’－デオキシヌクレオシド5’ホスフェイトN嘉瑞分解酵素1（Nー2'-deoxynucleoside 5'-phosphate N-hydrolase 1）、タンパク質dpy-30ホモログ（Protein dpy-30 homolog）、繊維芽細胞成長因子受容体1（Fibroblast growth factor receptor 1）、ホスホマンノムターゼ2（Phosphomannomutase 2）
タイプIケラチン細胞骨格性9（Keratin, type I cytoskeletal 9）、TSCC22ドメインファミリータンパク質2（TSC22 domain family protein 2）、コールドショックドメイン含有タンパク質E1（Cold shock domain-containing protein E1）、テ ネイシン（Tenascin）、ホルネリン（Hornerin）、レチノール結合タンパク質4（Retinol-binding protein 4）、タイプIケラチン細胞骨格性14（Keratin, type I cytoskeletal 14）、真核細胞翻訳開始因子3サブユニットL（Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit L）、マルチプル上皮成長因子様ドメインタンパク質8（Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8）、タイプIIケラチン細胞骨格性1（Keratin, type II cytoskeletal 1）、トロンボスポンジンー3（Thrombospondin-3）、タイプIIケラチン細胞骨格性3（Keratin, type II cytoskeletal 3）、デスモプラキン（Desmoplakin）、アネキシンA7（Annexin A7）、組織アルファーL-フコシダーゼ（Tissue alpha-L-fucosidase）、ミオシンー10（Myosin-10）、L-キシルロース還元酵素（L-xylulose reductase）、ホスホリボシルホルミルグリシナミジン合成酵素（Phosphoribosyl formyl glycinamidine synthase）、胸腺受容体相互作用タンパク質6（Thyroid receptor-interacting protein 6）、コラーゲンアルファ1（II)鎖（Collagen alpha-1(II) chain）、ソーティングネキシン-2（Sorting nexin-2）、ホスホリパーゼAー2ー活性化タンパク質（Phospholipase A-2-activating protein）、多重凝固因子欠乏タンパク質2（Multiple coagulation factor deficiency protein 2）、マトリックスGlaタンパク質（Matrix Gla protein）、シグナル認識粒子54ｋDaタンパク質（Signal recognition particle 54 kDa protein）、プレ-mRNAプロセシングースプライシング因子8（Pre-mRNA-processing-splicing factor 8）、プロトカドヘリンFat1（Protocadherin Fat 1）、シグナル認識粒子受容体サブユニットアルファ（Signal recognition particle receptor subunit alpha）、核有糸分裂装置タンパク質1（Nuclear mitotic apparatus protein 1）、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ制御サブユニット10（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 10）、イムノグロブリンスーパーファミリーDCCサブクラスメンバー4（Immunoglobulin superfamily DCC subclass member 4）、カリンー3（Cullin-3）、タイプIIケラチン細胞骨格性1b（Keratin, typeII cytoskeletal 1b）、ミメカン（Mimecan）、精巣上体特異的アルファーマンノシダーゼ（Epididymis-specific alpha-mannosidase）、シュドウリジン－5’－ホスファターゼ（Pseudouridine-5'-phosphatase）、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ／ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼタイプ－1サブユニットアルファ（Protein farnesyltransferase/geranylgeranyl transferase type-1 subunit alpha）、ビネキシン （Vinexin）、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮性（Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal）、シスタチオニンガンマ-リアーゼ（Cystathionine gamma-lyase）、タイプIケラチン細胞骨格性10（Keratin, type I cytoskeletal 10）、高親和性アフィニティカチオン性アミノ酸トランスポーター1（High affinity cationic amino acid transporter 1）、ラギュレイター複合体タンパク質LAMTOER3（Ragulator complex protein LAMTOR3）、自然な細胞毒性引き金受容体3リガンド1（Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1）、デスモコリン－2（Desmocollin-2）、エプシン－1（Epsin-1）、SEC23－相互作用タンパク質（SEC23-interacting protein）、イムノグロブリン結合タンパク質1（Immunoglobulin-binding protein 1）、反発ガイダンス分子B（Repulsive guidance moleculeB）、カテプシンF（Cathepsin F）、小型グルタミンリッチテトラ虜ペプチド反復配列含有タンパク質ベータ（Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein beta）、複製タンパク質A32ｋDaサブユニット（Replication protein A 32 kDa subunit）、血清アミロイドA-2タンパク質（Serum amyloid A-2 protein）、ビス（5’ーヌクレオシル）ーテトラホスファターゼ（非対称）（Bis(5'-nucleosyl)-tetraphosphatase[asymmetrical]）、アルファー1，6ーマンノシルー糖タンパク質2ーベーターNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyl transferase）、コイルドコイルおよびC2ドメイン含有タンパク質1A（Coiled-coil and C2 domain-containing protein 1A）、タンパク質SOGA1（Protein SOGA1）、免疫関連GTPアーゼファミリーQタンパク質（Immunity-related GTPase family Q protein）、膜貫通型タンパク質132A（Transmembrane protein 132A）、ユビキチン抱合酵素E2R2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2）、タイプIIケラチン細胞骨格性5（Keratin,type II cytoskeletal 5）、エンドヌクレアーゼLACTB2（Endoribonuclease LACTB2）、ペプチジループロリルシスートランスイソメラーゼFKBP14（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP14）、CCR4-NOT転写複合体サブユニット1（CCR4-NOT transcription complex subunit 1）、ホスホパントテン酸ーシステインリガーゼ（Phosphopantothenate--cysteine ligase）、ゴルジレジデントアデノシン3’、5’－ビスホスフェイト３’－ホスファターゼ（Golgi-resident adenosine 3',5'-bisphosphate 3'-phosphatase）、細胞質性トリプトファンtRNAリガーゼ（Tryptophan--tRNA ligase, cytoplasmic）、ラミニンサブユニットアルファ－4（Laminin subunit alpha-4）、L-アミノアジピン酸セミアルデヒド脱水素酵素ーホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase-phosphopantetheinyl transferase）、ATP依存性DNAヘリカーゼQ1（ATP-dependent DNA helicase Q1）、タンパク質unc-45ホモログA（Protein unc-45 homolog A）、グルタミン酸ーシステインリガーゼ制御サブユニット（Glutamate--cysteine ligase regulatory subunit）、ユビキリン－2（Ubiquilin-2）、補体成分3（Complement C3）、インポーティン－9（Importin-9）、液胞タンパク質ソーティング付随タンパク質25（Vacuolar protein-sorting-associated protein 25）、ユビキチンドメイン含有タンパク質UBFD1（Ubiquitin domain-containing protein UBFD1）、アデニル酸シクラーゼ付随タンパク質2（Adenylyl cyclase-associated protein 2）、アタキシン10（Ataxin-10）、TRIOおよびF-アクチン結合タンパク質（TRIO and F-actin-binding protein）、チオレドキシン様タンパク質4A（Thioredoxin-like protein 4A）、タイプIIケラチン細胞骨格性73（Keratin, type II cytoskeletal 73）、ミトコンドリア由来ディアブロホモログ（Diablo homolog, mitochondrial）、ベーターエノラーゼ（Beta-enolase）、SPRYドメイン含有タンパク質4（SPRY domain-containing protein 4）RNAー結合タンパク質ラリー（RNA-binding protein Raly）、ビトロネクチン（Vitronectin）、コラーゲンアルファ－3（V)鎖（Collagen alpha-3(V) chain）、フェニルアラニンーｔRNAリガーゼベータサブユニット（Phenylalanine--tRNA ligase beta subunit）、WDリピート含有タンパク質82（WD repeat-containing protein 82）、アナモルシン（Anamorsin）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（Retinoid-inducible serine carboxypeptidase）、ジペプチドペプチダーゼ4（Dipeptidyl peptidase 4）、エチルマロニルーCoAデカルボキシラーゼ（Ethylmalonyl-CoA decarboxylase）、ジペプチドペプチダーゼ9（Dipeptidyl peptidase 9）、チミジンホスホリラーゼ（Thymidine phosphorylase）、U8 U8 snoRNA-デキャッピング酵素（snoRNA-decapping enzyme）、Ran結合タンパク質3（Ran-binding protein 3）、GTPアーゼNas（GTPase NRas）、ロイシンーシスチンアミノペプチダーゼ（Leucyl-cystinyl aminopeptidase）、タンパク質S100-A8（Protein S100-A8）、レグマイン（Legumain）、26Sプロテオソーム非ATPアーゼ制御サブユニット8（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 8）、2機能性3’ーホスフォアデノシン5’ーホスホ硫酸合成酵素1（Bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 1）、内在性膜タンパク質2B（Integral membrane protein 2B）、液胞タンパク質ソーティング付随タンパク質VTA1ホモログ（Vacuolar protein sorting-associated protein VTA1 homolog）、エクスポーティン－T（Exportin-T）、ユビキチン抱合酵素E2 Z（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Z）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（Bisphosphoglycerate mutase）、細胞遊走・細胞浸潤エンハンサー1（Migration and invasion enhancer 1）、トランスフォーミング増殖因子ベータ1プロプロテイン（Transforming growth factor beta-1 proprotein）、IRRE様タンパク質1のKin（Kin of IRRE-like protein 1）、イノシトールポリフォスフェイト1ホスファターゼ（Inositol polyphosphate 1-phosphatase）、CADタンパク質（CAD protein）、ミトコンドリア性エノールCoAヒトラターゼ（Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial）、スペルミン合成酵素（Spermine synthase）、グルタチオンSトランスフェラーゼLANCL1（Glutathione S-transferase LANCL1）、細胞性レチノイン酸結合タンパク質2（Cellular retinoic acid-binding protein 2）、酸性セラミダーゼ（Acid ceramidase）、カリン－2（Cullin-2）、棘皮動物微小管付随タンパク質様2（Echinoderm microtubule-associated protein-like 2）、リソソーム酸リパーゼ／コレステリルエステルハイドロラーゼ（Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase）、アダプチンイヤー結合コート付随タンパク質2（Adaptin ear-binding coat-associated protein 2）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイネースドメイン含有タンパク質17（Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17）、イノシン－5’－1リン酸脱水素酵素1（Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 1）、リン脂質輸送タンパク質（Phospholipid transfer protein）、ピカチュリン（Pikachurin）、タンパク質透明ホモログ1（Protein diaphanous homolog 1）、ラミニンサブユニットベータ－2（Laminin subunitbeta-2）、プレフォルジンサブユニット5（Prefoldin subunit 5）、グルコース1，6ービスフォスフェート合成酵素（Glucose 1,6-bisphosphate synthase）、ロイシンリッチリピート含有タンパク質47（Leucine-rich repeat-containing protein 47）、拡張シナプトタグミン－2（Extended synaptotagmin-2）、GDH/6PGLエンドプラズミック2機能性タンパク質（GDH/6PGL endoplasmic bifunctional protein）、コートマーサブユニットゼータ－2（Coatomer subunit zeta-2）、タンパク質AHNAK2（Protein AHNAK2）、プロスタグランジンーH2 D-イソメラーゼ（Prostaglandin-H2 D-isomerase）、ｃAMPー依存性タンパク質キナーゼタイプIIーアルファ制御サブユニット（cAMP-dependent protein kinase type II-alpha regulatory subunit）、Sec1ファミリードメイン含有タンパク質1（Sec1 family domain-containing protein 1）、イソアミル酢酸加水分解エステラーゼ”1ホモログ（Isoamyl acetate-hydrolyzing esterase 1 homolog）、プログラム細胞死タンパク質10（Programmed cell death protein 10）、タンパク質アルギニンN-メチルトランスフェラーゼ5（Protein arginine N-methyltransferase 5）、アルファーアミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase）、コイルドコイルドメイン含有タンパク質126（Coiled-coil domain-containing protein126）、タンパク質ホスファターゼ（1F（Protein phosphatase 1F）、スムーセリンSUMOー活性化硬度サブユニット1（Smoothelin SUMO-activating enzyme subunit 1）、上皮成長因子受容体基質15様1（Epidermal growth factor receptor substrate 15-like 1）、ユビキチン様抱合酵素ATG3（Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3）、タンパク質YIPF3（Protein YIPF3）、L-乳酸脱水素酵素A
ー様6B（L-lactate dehydrogenase A-like 6B）、ベーター セントラクチン（Beta-centractin）、ガラクトセレブロシダーゼ（Galactocerebrosidase）、コピンー3（Copine-3）、推定ペプチジルーｔRNAヒドロラーゼPTHRHD1（Putative peptidyl-tRNA hydrolase PTRHD1）、アルファーN-アセチルグルコサミニダーゼ（Alpha-N-acetylglucosaminidase）、キネクチン（Kinectin）、アストロサイトリン酸化タンパク質PEA-15（Astrocytic phosphoprotein PEA-15）、インヒビンベータA鎖（Inhibin beta A chain）、上皮成長因子受容体リン酸化酵素基質8様タンパク質2（Epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 2）、STE20様セリン／スレオニンタンパク質リン酸化酵素（STE20-like serine/threonine-protein kinaseLIM）、ドメインオンリータンパク質7（LIM domain only protein 7）、セラミド輸送タンパク質（Ceramide transfer protein）、荷電多胞体タンパク質4ｂ（Charged multivesicular body protein 4b）、ミクロフィブリル付随糖タンパク質4（Microfibril-associated glycoprotein 4）、アスパルチルアミノペプチダーゼ（Aspartyl aminopeptidase）、NEDO4様E3ユビキチンータンパク質リガーゼ（E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like）エクソシスト複合体コンポーネント7（Exocyst complex component 7）、ハプトグロビン関連タンパク質（Haptoglobin-related protein）、ユビキチン抱合酵素E2 Q1（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 Q1）、トランスリン付随タンパク質X（Translin-associated protein X）、39様カルシウム結合タンパク質（Calcium-binding protein 39-like）、ペプチジルプロリルシスートランスーイソメラーゼNIMA―相互作用１（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1）、BAGファミリー分子チャペロン制御因子2（BAG family molecular chaperone regulator 2）、アポトーシス調節因子BAX（Apoptosis regulator BAX）、タンパク質ホスファターゼ1制御サブユニット7（Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7）、トランスサイレチン（Transthyretin）、液胞タンパク質ソーティング関連タンパク質35（Vacuolar protein sorting-associated protein 35）、トロンボスポンジンモチーフ4を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4）、ベータ－1，3ーNーアセチルグルコサミントランスフェラーゼルナティックフリンジ（Beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase lunaticfringe）、2’－デオキシヌクレオシド5’ホスフェイトN嘉瑞分解酵素1（Nー2'-deoxynucleoside 5'-phosphate N-hydrolase 1）、タンパク質dpy-30ホモログ（Protein dpy-30 homolog）、繊維芽細胞成長因子受容体1（Fibroblast growth factor receptor 1）、ホスホマンノムターゼ2（Phosphomannomutase 2）
上記に示すように、グルコース濃度を上げることで、多くのタンパク質の培地中の含有量が増加することがわかった。これらのデータより、有用成分を増加させるためのグルコース濃度が推定できる。
本発明は、美容産業、医療業などに利用できる。
Claims (8)
- グルコース濃度4．5ｇ／L以上25ｇ／L以下含む培地中で、10時間以上50時間以下、ヒト臍帯組織由来幹細胞を培養する工程を有する、培養上清中の有用成分含有量をグルコース濃度1ｇ／L濃度の培地で培養した場合よりも増加させる方法であって、前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする、方法。
- グルコース濃度4．5ｇ／L以上25ｇ／L以下含む培地中で、10時間以上50時間以下、ヒト臍帯組織由来幹細胞を培養する工程を有する、培養上清中の成分の含有率をグルコース濃度1ｇ／L濃度の培地で培養した場合よりも減少させる方法であって、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の含有率を減少させる、方法。
- グルコース濃度4．5ｇ／L以上25ｇ／L以下含む培地中で、10時間以上50時間以下、ヒト臍帯組織由来幹細胞を培養して培養上清中の有用成分を増加させる工程を有する、培養上清の製造方法であって、前記有用成分が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、およびデスモコリン２からなる群に含まれる1以上の成分であることを特徴とする、培養上清の製造方法。
- グルコース濃度4．5ｇ／L以上25ｇ／L以下含む培地中で、10時間以上50時間以下、ヒト臍帯組織由来幹細胞を培養して培養上清中の成分の含有率を減少させる工程を有する、培養上清の製造方法であって、培養上清中のグロビンサブファミリーＢメンバー１、ｍＲＮＡターンオーバー４タンパク質ホモログ、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットアルファ－３、ユビキリン－１、荷電多包体タンパク質４ａ、メルリン、およびエクスポーティン－７からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の含有率を減少させる、培養上清の製造方法。
- 前記培養上清が、ケラチノサイトプロリンリッチタンパク質、タイプIケラチン細胞骨格性9、タイプIケラチン細胞骨格性10、タイプIケラチン細胞骨格性14、タイプIIケラチン細胞骨格性1、タイプIIケラチン細胞骨格性3、タイプIIケラチン細胞骨格性5、タイプIIケラチン細胞骨格性2上皮細胞性、デスモグレイン1、コラーゲン・アルファ－1(II)鎖、骨形成タンパク質４、コラーゲン・アルファ－1(XVIII)鎖、デスモプラキン、およびデスモコリン２からなる群から選ばれる有用成分の生体における欠乏を処置するためのものである、請求項３の培養上清の製造方法。
- 請求項３または４に記載の製造方法により製造された、培養上清。
- 請求項６に記載の培養上清を含む、組成物。
- 前記組成物が、化粧用組成物、食品用組成物、医科用組成物、および／または歯科用組成物である、請求項７の組成物。
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