JP7725014B2

JP7725014B2 - ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体又はその機能的断片

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Publication number: JP7725014B2
Application number: JP2021055570A
Authority: JP
Inventors: 美樹安藤; 則夫小松; 純安藤; 翠石井; 啓光中内; 素生渡部
Original assignee: Juntendo University; University of Tokyo NUC
Current assignee: Juntendo University; University of Tokyo NUC
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2025-08-19
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: JP2022152704A

Description

本発明は、ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体又はその機能的断片、及びその利用に関する。

成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ：ａｄｕｌｔＴ-ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ-ｌｙｍｐｈｏｍａ）は、ＨＴＬＶ－１（ｈｕｍａｎＴ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓｔｙｐｅ－Ｉ）というウイルス感染が原因で、ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染し、感染したＴ細胞からがん化した細胞（ＡＴＬ細胞）が無制限に増殖することで発症する（非特許文献１）。ＨＴＬＶ－１は発がん作用を有するＴａｘというウイルスタンパク質の遺伝子を持っているが、このＴａｘ抗原をターゲットにしたＣＴＬ療法は有効な治療法と期待される。

国立感染症研究所ホームページ

本発明の課題は、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体をクローニングし、優れた抗腫瘍効果を有するＴ細胞受容体又はその機能的断片を提供することにある。

そこで本発明者は、患者末梢血からＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導後、シングルセルクローニングを行い、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン樹立に成功した。そして、得られたクローンの自己腫瘍細胞（ＡＴＬ細胞）に対する抗腫瘍効果を確認した。しかしＣＴＬクローンは増殖力に限りがあり、実際の患者の治療に用いるための細胞を確保するのは難しいと考えた。そのため、ＣＴＬクローンを一度ｉＰＳ細胞に変換し、そのｉＰＳ細胞からＴａｘ抗原特異的ＣＴＬを再分化誘導したところ、もとのＣＴＬクローンよりも強力な抗腫瘍効果を持つＣＴＬの作製に成功した。
再分化誘導したＣＴＬをレパトア解析することにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアミノ酸配列を明らかにし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の発明［１］～［８］を提供するものである。
［１］配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［２］配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、［１］記載のＴ細胞受容体又はその機能性断片。
［３］さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、［１］又は［２］記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［４］さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、［１］又は［２］記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含有する、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫治療薬組成物。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫治療薬製造のための使用。
［７］成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫を治療するための、［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球。
［８］［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを特徴とする、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫の治療方法。

本発明のＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫治療薬として有用である。

得られたＴリンパ球のＴａｘ抗原に対する抗原特異性を示す。得られたもとのＴａｘ特異的ＣＴＬクローンとｉＰＳＣ由来Ｔａｘ特異的CTLの抗原特異的細胞傷害活性を示す。ａｕｔｏＡＴＬは、ＡＴＬに対する作用を示し、ＨＬＡｍｉｓｍａｔｃｈｅｄＬＣＬは、コントロールとしてＨＬＡの一致しないＬＣＬ細胞に対する作用を示す。得られたＴＣＲのレパトア解析結果を示す。

本発明は、ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその機能的断片であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有することを特徴とする。

ＨＴＬＶ－１は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡｄｕｌｔＴ-ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＴＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＴＬＶ－１ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：ＨＡＭ）及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＴＬＶ－１ｕｖｅｉｔｉｓ：ＨＵ）などの疾患を引き起こす。ＨＴＬＶ－１は、長さ約９ｋｂのプロウイルス遺伝子を有する。ＨＴＬＶ－１のプロウイルス遺伝子は、Ｔａｘ、Ｒｅｘ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の種々のタンパク質をコードする。このうちＴａｘタンパク質は、完全長として約３５３アミノ酸残基を有し、宿主細胞内でＮＦ－κＢ、ＳＲＦ、ＣＲＥＢなどの宿主の転写因子の活性化、ｐ５３等のタンパク質の機能抑制など、多数の機能を有する。
また、ＨＴＬＶ－１の感染対象細胞のほとんどは、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。

Ｔ細胞受容体（以下、ＴＣＲという）は、Ｔ細胞の抗原認識機能を担うものであり、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖などのタンパク質から構成される。このうち、ＴＣＲα鎖タンパク質（ＴＣＲα）とＴＣＲβ鎖タンパク質（ＴＣＲβ）とのヘテロ二量体、又はγとδ鎖とのヘテロ二量体が、補助分子としてのＣＤ３複合体（γ、δ、ε、ζを含む）、ＣＤ４又はＣＤ８などと一緒になってＴＣＲを形成している。
ＴＣＲα及びＴＣＲβは、可変領域（Ｖ領域＋Ｊ領域）及び定常領域（Ｃ領域）を有している。なお、可変領域中のＶ領域には相補性決定領域（ＣＤＲ）が存在する。従って、ＴＣＲは、ＴＣＲα及びＴＣＲβ中のＶ領域（ＣＤＲ領域を含む）、又はＶ領域及びＪ領
域のアミノ酸配列によって特徴づけることができる。

本発明のＴＣＲは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有することを特徴とする。
ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、さらに当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのが好ましい。
本発明のＴＣＲとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有するＴＣＲが好ましい。
また、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域中には、配列番号３で示されるＣＤＲ３領域が含まれる。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域には、配列番号６で示されるＣＤＲ３領域が含まれる。

本発明のＴＣＲは、さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有することが好ましい。
ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、さらに当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのが好ましい。
本発明のＴＣＲとしては、さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有するＴＣＲが好ましい。
さらに本発明のＴＣＲは、配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖を有するＴＣＲが好ましい。

本発明のＴＣＲの機能的断片としては、前記α鎖Ｖ領域及びβ鎖Ｖ領域を有するポリペプチド、前記α鎖Ｖ領域、α鎖Ｊ領域、β鎖Ｖ領域及びβ鎖Ｊ領域を有するポリペプチド、これらのポリペプチドの結合体などが挙げられる。

本発明のＴＣＲは、例えば、患者末梢血からＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導後、シングルセルクローニングを行い、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球クローンを樹立することにより得られる。
末梢血からＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するには、健常人であっても、ウイルス感染症を患っているヒトであってもよい。
本発明においてＴ－ｉＰＳ細胞に誘導されるＴ細胞は、Ｔａｘ抗原特異性を有するＴ細胞が好ましい。例えば、ＣＤ３及びＣＤ８が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ８陽性細胞であるＣＴＬが挙げられる。また、例えばＣＤ３及びＣＤ４が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ４陽性細胞であるＴ細胞が挙げられる。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。なお、製造効率の観点からは、特にこれに限定されないが、抗原特異的ＣＤ８陽性細胞を得るためには、Ｔ－ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いることが好ましい。また、免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一または実質的に同一であることが好ましい。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を誘導するＴ細胞として、抗原特異性のないＴ細胞も含まれる。具体的にはＣＡＲＴ細胞もしくはＴＣＲ－Ｔ細胞など遺伝子改変Ｔ細胞が挙げられる。

このようなＴ細胞は、例えばヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血が好ましい。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分離する際には腫瘍組織もしくは末梢血から分離することができる。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、細胞分離用磁気ビーズなどを用いる磁気セレクション、ＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリー、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いる活性化Ｔ細胞誘導法などが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現、又はＰＤ－１などのシグナル分子を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離することが出来る。さらに、抗原特異性を有するＴ細胞を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣクラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するＴ細胞を精製することができる。

本発明において、Ｔ細胞をｉＰＳ細胞にするために導入される遺伝子は、（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（ｂ）ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、（ｃ）Ｓｏｘ２遺伝子、（ｄ）Ｋｌｆ４遺伝子、（ｅ）ＮＡＮＯＧ遺伝子、及び(ｆ)ＬＩＮ２８遺伝子などのうち少なくとも４種類の遺伝子の組み合わせが好ましい。

本発明において、Ｔ細胞に前記遺伝子群を導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記遺伝子群をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記遺伝子群をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。

このような発現ベクターのうち、前記遺伝子群を含むステルス型ＲＮＡ発現ベクターを用いるのが、がん化の危険性の低減、導入効率の点から、より好ましい。
ステルス型ＲＮＡ発現ベクターとは、ベクターが染色体に入ることを回避し、核内ではなく細胞質内で、持続的で安定して遺伝子が発現するように設計されたベクターである。１万３０００塩基対以上の大きな遺伝子の導入や、１０個の遺伝子の同時導入もでき、細胞に傷害を与えず、導入遺伝子が不要な時には除去が可能で、細胞がベクターを異物として認識できないステルス性を持っている。
このようなステルス型ＲＮＡ発現ベクターとしては、下記（１）～（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素からなり、自然免疫構造を活性化させない複合体が挙げられる。
（１）前記遺伝子群に対するＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするＲＮＡ配列、
（７）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列。

また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立する際には、前記Ｔ細胞は、前記遺伝子群の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）もしくはインターロイキン－７（ＩＬ－７）及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。

かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。また、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。さらに、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましい。

また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記４遺伝子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２～７日間であるが、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは３～５日間である。１５ｍＬチューブ内でＴ細胞とベクターを混合することにより感染させる、もしくは遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。

前記Ｔ細胞を培養し、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＡＩＭＶ^TM ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ２を用いることができる。培地には、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＩＬ－２のかわりに培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することも好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

また、前記Ｔ細胞に前記４遺伝子を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記４遺伝子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダーフリー条件下で培養するのが好ましい。例えば、ラミニン５１１Ｅ８断片であるｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液もしくはビトロネクチンでコーティングされたウェルなどが挙げられる。フィーダー細胞条件下での培養でも樹立可能であり、フィーダー細胞としては例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。

さらに、前記Ｔ細胞からＴ－ｉＰＳ細胞に誘導する過程において、翌日からｉＰＳ細胞の培地を添加しておくことが好ましい。その後は１日おきに半量ずつ培地交換を行い、徐々にＴ細胞培地からｉＰＳ培地に置換するのが好ましい。

また、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎもしくはビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が望ましい。

このようにしてＴ－ｉＰＳ細胞の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法が挙げられる。一方でシングルセルであるＣＴＬクローンから樹立したＴ－ｉＰＳの場合、性質が似ていることが多いため、Ｔ－ｉＰＳ細胞の各コロニーを選択せず、樹立できたコロニーを全てそのまま継代する方法もある。

このようにして選択された細胞がＴ－ｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現を免疫染色やＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。

これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら、回収するのが好ましい。概ね、前記４遺伝子を含む遺伝子群を前記Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。

次に、樹立したＴ－ｉＰＳ細胞からＴａｘ抗原特異的ＣＴＬ細胞を分化誘導する。
この再分化誘導方法としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法が好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に分化させ、次いで当該ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞をＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法がより好ましい。
更には、前記特許文献１記載のように、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させ、Ｔ細胞受容体を刺激する物質を添加してＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に刺激を与え、次いでＴ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５のサイトカインの存在下でＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に分化させることにより得るのが好ましい。

Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるには、Ｔ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはマウスストローマ細胞）上で、サイトカイン、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。
用いるストローマ細胞としては、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。培地に添加されるサイトカインは、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１種のサイトカインであることが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯ、又は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌであることがより好ましい。
また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、Ｔ－ｉＰＳサック（造血前駆細胞を含有する袋状の構造物）を形成させやすくする点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。また、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５～２０％）下にて１週間程度培養することがより好ましい。

Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるために、さらに、前記のＴ－ｉＰＳサックに含まれている細胞を、サイトカインや血清（例えば、ＦＢＳ)等を含有する培地中にて、フィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上で培養することが好ましいが、フィーダーフリーの条件下でサイトカインコートのｗｅｌｌを使用する。Ｔ－ｉＰＳサックの内部に存在する細胞は、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ１細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５が挙げられる。培地としては、例えば、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地が挙げられるが、α－ＭＥＭ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌ以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。

このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから１４～２８日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。

なお、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現しているか否かは、抗ＴＣＲαβ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる。

抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞の製造方法においては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、ＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成を抑制することができ、ひいては、再分化して得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることができる。

Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える方法としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチド、前記Ｔ細胞受容体に対し拘束性を示すＨＬＡとの複合体を発現する細胞、及び該抗原ペプチドを結合させたＭＨＣ多量体からなる群から選択される少なくとも１の物質とＴ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とを接触させる方法が好ましく、生理的な刺激を与える観点からは、特異ペプチド／ＨＬＡ複合体発現細胞を接触させる方法がより好ましい。また、刺激の均一性を重視する観点からは、抗体や試薬を接触させる方法がより好ましい。

接触させる方法は、例えば、培地中に、ＰＨＡ等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。

ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては、１～１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。

このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するのに必要な期間を含むことが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから７～２９日間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。

本発明において、Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるために、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞は、サイトカインや血清（例えば、ヒト血清）等を含有する培地中にて培養することが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させることができるものであればよく、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５が挙げられる。これらの中では、ＣＤ８シングルポジティブ細胞への分化において、ＣＤ８系譜を選択させ、かつメモリー型ＣＤ８+Ｔ細胞生成が生じ易くさせるという観点では、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を組み合わせて添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては、１～２０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、ＤＭＥＭ培地、α－ＭＥＭ培地が挙げられるが、ＲＰＭＩ－１６４０培地又はＸ－ＶＩＶＯ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外のサイトカインが添加してあってもよい。

かかる培養においては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）であることが好ましい。かかるＰＢＭＣとして、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とはアロ（同種異系）の関係にあることが好ましい。また、ＴＣＲを刺激し続け、ＴＣＲの更なる再構成を抑制し続けるという観点から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチドを提示する末梢血単核球細胞を用いることがより好ましい。

このＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるための培養期間としては、２～４週間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。

このように分化誘導されたＣＤ８シングルポジティブ細胞が、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来であり、また該Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。

また、このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＣＤ８の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。例えば、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の場合は、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の元となったＴ細胞が認識する抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体（例えば、ＭＨＣテトラマー）を用いて精製する方法を採用することもできる。

また、本発明により得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、ＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従って、本発明によれば、元のＴ細胞と同一のＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＣＤ８シングルポジティブＴ細胞であって、ＰＤ－１を発現せず、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＣＲ７を発現する細胞を製造することができる。そして、ヒトから採取したＴ細胞は、ＰＤ－１を発現し、幼若なメモリーフェノタイプの割合は少ない点で、得られたＴ細胞とは異なる。

このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞を維持するために、１～２週間毎に、当該細胞に刺激を与えてもよい。かかる刺激としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、該ＣＤ８ＳＰ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とオートの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。

得られたｉＰＳＣ由来Ｔリンパ球が、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害活性を有するか否かの確認は、ＭＨＣペンタマー、ＭＨＣテトラマーなどを用いてもとの末梢血由来ＣＴＬと同一の抗原特異性を保持していることを確認する。更にＴＣＲ配列解析を行いＴＣＲαβを同定した。

また、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組み換えによって製造することもできる。すなわち、例えば、本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を宿主Ｔ細胞に導入し、Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性を有する細胞を選択すればよい。
宿主Ｔ細胞にＴＣＲをコードする遺伝子を導入するには、種々のウイルスベクターに当該遺伝子を組み込むのが好ましい。
Ｔａｘ抗原特異的細胞傷害性を有する細胞の選択は、前記のＴａｘ抗原特異的細胞傷害活性の確認でもよいし、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの産生能の検出でもよい。

得られたＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、優れたＴａｘ抗原特異的細胞傷害活性を有するので、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＴＬＶ－１ｕｖｅｉｔｉｓ：ＨＵ）などの疾患の治療薬、特に成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫治療薬組成物として有用である。

本発明の医薬組成物は、本発明のＴリンパ球に加えて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。そのような担体の例として、生理食塩水、リンゲル液などが挙げられる。さらに本発明の医薬組成物は、必要に応じて、保存剤、着色剤などの公知の薬学的に許容される添加物を含むことができる。
本発明の医薬組成物の形態は、注射剤が好ましく、Ｔ細胞輸注療法用の注射剤が好ましい。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
Ｔａｘ特異的ＣＴＬクローンよりセンダイウイルスベクターを用いてＴ－ｉＰＳ細胞の樹立。
１）健常人末梢血より末梢血単核球を分離後、抗原提示目的に樹状細胞を誘導した。７日後、誘導した樹状細胞にＴａｘ抗原ペプチド（Ｔａｘ１１－１９，Ａ０２０１）を添加し末梢血単核球と共培養開始した。約８～１０日後にＴａｘ特異的ＣＴＬ検出のため、ＣＴＬをＭＨＣテトラマーで染色後、フローサイトメトリーにてテトラマー陽性率を確認した。Ｔａｘ特異的ＣＴＬを確認後、シングルセルソート又はテトラマー／ＰＥビーズセレクション後限界希釈法を行った。

２）約３～６週間後立ち上がったコロニーのテトラマー染色を行い、フローサイトメトリーでＣＴＬクローン樹立の確認をした。樹立確認後ＣＴＬクローンをＣＤ３／２８刺激後、以下のＡ）の２種類のベクターを用い遺伝子導入した。ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＣＴＬを移動し、ＣＴＬメディウムを培地としてＣＯ₂インキュベーターで培養開始した。

Ａ）ＳｅＶ４因子ベクター＋ＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原

３）ＳｅＶ遺伝子導入翌日、ｉＰＳメディウム（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ）を等量加え、その後は１日おきに半量ずつＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎに置換した。
４）７日後にＴ－ｉＰＳ細胞のコロニーが観察でき、その後コロニーピックアップして拡大培養を行なった。その後ｉＰＳＣ由来ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄＴａｘ－ＣＴＬ（Ｔａｘ－ｒｅｊＴ）を分化誘導した。
５）細胞傷害性試験を行うと元の末梢血ＣＴＬより強力に腫瘍細胞に抗原特異的細胞傷害活性を示すことができた。

図１に末梢血から誘導したＴａｘ－ＣＴＬと樹立したＴａｘ特異的ＣＴＬクローン、更にｉＰＳＣ由来Ｔａｘ－ＣＴＬ（Ｔａｘ－ｒｅｊＴ）のテトラマー染色結果を示す。

実施例２
（細胞傷害性試験）
１）ＡＴＬ腫瘍細胞に対するＴａｘ－ｒｅｊＴの細胞傷害活性と末梢血由来Ｔａｘ－ＣＴＬの細胞傷害性細胞傷害性を比較するために５１クロム放出試験を行った。エフェクターとしてＴａｘ－ｒｅｊＴ又は末梢血由来Ｔａｘ－ＣＴＬ、クロムでラベルしたターゲットである患者由来（自家）ＡＴＬ細胞、コントロールターゲットであるＨＬＡ不一致ＥＢウイルス感染腫瘍細胞株（ＬＣＬ）をエフェクター：ターゲット比を２０：１、１０：１、５：１と２．５：１で６時間共培養した。
２）共培養後培養上清を別のカウンター用のプレートに移し、乾燥後プレートリーダーで測定した。
３）Ｔａｘ－ｒｅｊＴはＡＴＬ細胞に対して強い抗原特異的細胞傷害性を示したが（６０－７０％）、コントロールのＨＬＡ不一致腫瘍細胞株に対しては１０％以下と細胞傷害性を示さなかった。末梢血由来Ｔａｘ－ＣＴＬはＡＴＬ細胞に対して１５－２０％程度の細胞傷害性を示した。コントロールのＨＬＡ不一致腫瘍細胞株に対しては１０％以下と細胞傷害性を示さなかった。Ｔａｘ－ｒｅｊＴのＴａｘ抗原特異的細胞傷害活性はＴａｘ－ＣＴＬより強力であった（図２）。

実施例３
ＴＣＲ配列の解析結果を、図３に示す。

Claims

配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のＴ細胞受容体又はその抗原結合断片。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、請求項１記載のＴ細胞受容体又はその抗原結合断片。
請求項１又は２記載のＴ細胞受容体又はその抗原結合断片を有するＴａｘ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含有する、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫治療薬組成物。