JP7726528B2

JP7726528B2 - 操作された酢酸キナーゼバリアント酵素

Info

Publication number: JP7726528B2
Application number: JP2021576600A
Authority: JP
Inventors: ジョナサンブルーム，; ゲーラ，アルベルトオルテガ; ジョヴァナネイザー，; ミケイラジャンホンシャクラウチック，
Original assignee: コデクシス，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2025-08-20
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: IL289508A; KR20220025884A; WO2021003129A3; WO2021003129A2; AU2020299358A1; CN114127102B; JP2022538229A; US12275962B2; MX2021015613A; BR112021024819A2; CN114127102A; US20250215404A1; US20220251523A1; EP3994153A4; SG11202113108UA; EP3994153A2; CA3142162A1

Description

本出願は、全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる、２０１９年７月２日に出願された米国特許仮出願第６２／８６９，６６７号の優先権を主張する。

本発明は、操作された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）酵素、ＡｃＫ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＡｃＫ酵素を産生する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＡｃＫ酵素を含む組成物および操作されたＡｃＫ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。

配列表、表、またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式コピーは、本明細書と共にＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、ファイル名は「ＣＸ２－１９１ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日は２０２０年６月２９日、サイズは１．７４メガバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれるレトロウイルスは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であり、これは罹患した個体の免疫系の進行性の破壊ならびに中枢および末梢神経系の変性を伴う複合疾患である。レトロウイルス複製の一般的特色は、ウイルスコード逆転写酵素によるウイルスＲＮＡゲノムの逆転写であり、ウイルス複製にとって必要なＨＩＶ配列のＤＮＡコピーを生成する。いくつかの化合物、例えばＭＫ－８５９１は、公知の逆転写酵素阻害剤であり、ＡＩＤＳおよび類似の疾患の処置において有用である。ＨＩＶ逆転写酵素を阻害することが公知であるいくつかの化合物が存在するが、この酵素の阻害においてより有効で、それによってＡＩＤＳの影響を改善する追加の化合物が当技術分野でなおも必要である。

ＭＫ－８５９１（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレオシドアナログは、ＤＮＡの合成に使用される天然のヌクレオシドとのその類似性によりＨＩＶの逆転写酵素の有効な阻害剤である。逆転写酵素がこれらのアナログに結合すると、逆転写酵素の進行性の性質を阻害することによりＤＮＡの合成を停止する。酵素の停止は、ＤＮＡ分子の早期の終了をもたらし、ＤＮＡ分子を無効にする。しかし、標準的な化学合成技術によるヌクレオシドアナログの産生は、その化学的な複雑さのために難題であり得る。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号１２、および／もしくは配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、操作された酢酸キナーゼが、ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、配列番号１２、および／または配列番号６００を参照して番号付けられている、操作された酢酸キナーゼを提供する。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、操作された酢酸キナーゼがポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号２を参照して番号付けられている、操作された酢酸キナーゼを提供する。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、操作された酢酸キナーゼは、１２／２５９、１５、１６、１８、２３、２５、２６、３１、３２、３９、４０、４１、４４、４７、４７／４１１、５０、５１、５５、５８／１３５、５９、６４、７０、７６、７６／２３２／２６２、７６／２３２／３６４／３８６、７６／２７３、８５、９２、９６／１１９、１０１、１０２、１０４、１０７、１０８、１１６、１２２、１３５、１３５／３９２、１３６、１３７、１４０、１４１、１４３、１４４、１４５／４００、１５２、１５４、１５９、１６１、１６４、１８３、１９１、１９４、１９７、２１５、２１６、２２２、２２４、２２９、２３２、２３６、２５１、２５６、２５８、２５９／２８４、２６０、２６１、２６３／３９１、２６８、２７３、２７４、２７６、２８３、２８４、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９２、２９７、２９８、２９８／４０５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１７、３２２、３２３、３３７、３４６、３４７、３４８、３４９、３５１、３５２、３５２／４０５、３５４、３５５、３５６、３６２、３６６、３６８、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３８０、３８６、３９０、３９１、３９２、３９８、３９９、および４０７から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、１２Ｋ／２５９Ｖ、１５Ｓ、１６Ｋ、１６Ｒ、１６Ｙ、１８Ｃ、２３Ａ、２３Ｆ、２３Ｇ、２３Ｈ、２３Ｌ、２３Ｎ、２５Ｌ、２５Ｖ、２６Ｇ、３１Ｄ、３２Ｔ、３９Ａ、３９Ｖ、４０Ｌ、４１Ｃ、４４Ｌ、４７Ｄ、４７Ｓ、４７Ｓ／４１１Ｆ、５０Ｋ、５０Ｎ、５０Ｑ、５１Ｆ、５５Ｐ、５８Ｓ／１３５Ｔ、５９Ａ、５９Ｇ、５９Ｖ、６４Ｋ、７０Ｋ、７０Ｔ、７６Ｖ、７６Ｖ／２３２Ｓ／２６２Ｌ、７６Ｖ／２３２Ｓ／３６４Ｉ／３８６Ｋ、７６Ｖ／２７３Ｖ、８５Ｈ、９２Ｄ、９６Ｔ／１１９Ｉ、１０１Ｇ、１０１Ｉ、１０１Ｍ、１０１Ｔ、１０２Ａ、１０４Ａ、１０４Ｌ、１０７Ｋ、１０８Ｌ、１０８Ｒ、１０８Ｗ、１１６Ｄ、１２２Ｃ、１２２Ｅ、１２２Ｇ、１２２Ｔ、１２２Ｖ、１２２Ｗ、１３５Ｌ、１３５Ｎ、１３５Ｔ、１３５Ｔ／３９２Ｗ、１３６Ａ、１３６Ｅ、１３６Ｇ、１３６Ｔ、１３６Ｖ、１３７Ｋ、１３７Ｒ、１４０Ｆ、１４０Ｐ、１４０Ｒ、１４０Ｓ、１４０Ｗ、１４０Ｙ、１４１Ｒ、１４３Ｃ、１４４Ｋ、１４４Ｑ、１４５Ｅ／４００Ｖ、１５２Ｑ、１５４Ｍ、１５４Ｑ、１５４Ｔ、１５４Ｖ、１５９Ｆ、１６１Ｍ、１６１Ｓ、１６１Ｖ、１６４Ｇ、１６４Ｈ、１６４Ｌ、１８３Ａ、１８３Ｇ、１８３Ｓ、１９１Ｉ、１９４Ｋ、１９７Ｐ、１９７Ｑ、１９７Ｒ、２１５Ｅ、２１５Ｆ、２１５Ｌ、２１５Ｍ、２１６Ａ、２１６Ｓ、２２２Ｉ、２２４Ｉ、２２９Ｇ、２２９Ｎ、２３２Ｓ、２３６Ｇ、２５１Ｇ、２５６Ｌ、２５６Ｍ、２５６Ｑ、２５８Ｖ、２５９Ｖ／２８４Ｌ、２６０Ｅ、２６０Ｔ、２６１Ａ、２６３Ｔ／３９１Ｇ、２６８Ｌ、２７３Ｖ、２７４Ｗ、２７６Ｖ、２８３Ｋ、２８４Ｌ、２８６Ｉ、２８７Ａ、２８７Ｄ、２８７Ｇ、２８７Ｌ、２８７Ｔ、２８８Ｇ、２８９Ａ、２８９Ｓ、２９０Ｌ、２９２Ｐ、２９７Ｌ、２９７Ｍ、２９７Ｑ、２９８Ｆ、２９８Ｋ、２９８Ｌ、２９８Ｌ／４０５Ｅ、２９８Ｑ、２９８Ｔ、２９８Ｖ、２９８Ｗ、２９９Ｑ、２９９Ｒ、２９９Ｓ、２９９Ｔ、３００Ｇ、３００Ｓ、３００Ｔ、３０１Ｅ、３０１Ｋ、３０１Ｑ、３０１Ｒ、３０２Ａ、３０２Ｆ、３０２Ｇ、３０２Ｒ、３０２Ｓ、３０３Ｅ、３０４Ａ、３０４Ｃ、３０４Ｄ、３０４Ｅ、３０４Ｑ、３０４Ｒ、３０４Ｖ、３０５Ｎ、３０８Ｒ、３１０Ａ、３１０Ｇ、３１０Ｍ、３１２Ｋ、３１２Ｐ、３１２Ｒ、３１４Ｖ、３１６Ａ、３１６Ｇ、３１６Ｍ、３１６Ｑ、３１６Ｒ、３１６Ｖ、３１７Ａ、３１７Ｇ、３１７Ｉ、３１７Ｌ、３１７Ｓ、３２２Ｇ、３２２Ｎ、３２２Ｓ、３２３Ｐ、３２３Ｓ、３３７Ｌ、３４６Ｌ、３４７Ｑ、３４７Ｒ、３４７Ｔ、３４７Ｖ、３４８Ｅ、３４９Ｖ、３５１Ｌ、３５１Ｒ、３５１Ｓ、３５１Ｖ、３５２Ａ、３５２Ｆ、３５２Ｇ、３５２Ｋ、３５２Ｐ、３５２Ｔ、３５２Ｖ、３５２Ｖ／４０５Ｑ、３５４Ｇ、３５４Ｌ、３５４Ｐ、３５４Ｓ、３５４Ｖ、３５４Ｗ、３５５Ｄ、３５５Ｅ、３５５Ｋ、３５５Ｍ、３５６Ｇ、３６２Ｉ、３６６Ｅ、３６６Ｇ、３６６Ｉ、３６６Ｌ、３６６Ｐ、３６６Ｒ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６８Ｅ、３６８Ｇ、３６８Ｌ、３６８Ｎ、３６８Ｑ、３６８Ｒ、３６８Ｓ、３６８Ｖ、３７１Ｎ、３７１Ｖ、３７２Ｄ、３７２Ｆ、３７２Ｎ、３７２Ｖ、３７３Ｐ、３７３Ｖ、３７４Ｄ、３７４Ｅ、３７４Ｈ、３７４Ｌ、３７４Ｍ、３７４Ｖ、３７５Ｌ、３７６Ｅ、３７６Ｌ、３７６Ｍ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｗ、３７７Ｍ、３７７Ｖ、３７８Ａ、３８０Ｇ、３８６Ｋ、３９０Ｅ、３９０Ｇ、３９０Ｓ、３９０Ｔ、３９０Ｖ、３９１Ｇ、３９１Ｒ、３９２Ｇ、３９２Ｗ、３９８Ｈ、３９８Ｗ、３９８Ｙ、３９９Ａ、３９９Ｐ、３９９Ｓ、および４０７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、Ｒ１２Ｋ／Ｐ２５９Ｖ、Ｖ１５Ｓ、Ｉ１６Ｋ、Ｉ１６Ｒ、Ｉ１６Ｙ、Ｓ１８Ｃ、Ｉ２３Ａ、Ｉ２３Ｆ、Ｉ２３Ｇ、Ｉ２３Ｈ、Ｉ２３Ｌ、Ｉ２３Ｎ、Ｙ２５Ｌ、Ｙ２５Ｖ、Ｑ２６Ｇ、Ｅ３１Ｄ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３９Ａ、Ｇ３９Ｖ、Ｉ４０Ｌ、Ａ４１Ｃ、Ｉ４４Ｌ、Ｅ４７Ｄ、Ｅ４７Ｓ、Ｅ４７Ｓ／Ｉ４１１Ｆ、Ｒ５０Ｋ、Ｒ５０Ｎ、Ｒ５０Ｑ、Ｌ５１Ｆ、Ｖ５５Ｐ、Ｅ５８Ｓ／Ａ１３５Ｔ、Ｋ５９Ａ、Ｋ５９Ｇ、Ｋ５９Ｖ、Ｒ６４Ｋ、Ｅ７０Ｋ、Ｅ７０Ｔ、Ｉ７６Ｖ、Ｉ７６Ｖ／Ｃ２３２Ｓ／Ｉ２６２Ｌ、Ｉ７６Ｖ／Ｃ２３２Ｓ／Ｌ３６４Ｉ／Ｒ３８６Ｋ、Ｉ７６Ｖ／Ｍ２７３Ｖ、Ｌ８５Ｈ、Ｋ９２Ｄ、Ａ９６Ｔ／Ｌ１１９Ｉ、Ｖ１０１Ｇ、Ｖ１０１Ｉ、Ｖ１０１Ｍ、Ｖ１０１Ｔ、Ｖ１０２Ａ、Ｇ１０４Ａ、Ｇ１０４Ｌ、Ｒ１０７Ｋ、Ｆ１０８Ｌ、Ｆ１０８Ｒ、Ｆ１０８Ｗ、Ｅ１１６Ｄ、Ｉ１２２Ｃ、Ｉ１２２Ｅ、Ｉ１２２Ｇ、Ｉ１２２Ｔ、Ｉ１２２Ｖ、Ｉ１２２Ｗ、Ａ１３５Ｌ、Ａ１３５Ｎ、Ａ１３５Ｔ、Ａ１３５Ｔ／Ｖ３９２Ｗ、Ｎ１３６Ａ、Ｎ１３６Ｅ、Ｎ１３６Ｇ、Ｎ１３６Ｔ、Ｎ１３６Ｖ、Ｌ１３７Ｋ、Ｌ１３７Ｒ、Ｉ１４０Ｆ、Ｉ１４０Ｐ、Ｉ１４０Ｒ、Ｉ１４０Ｓ、Ｉ１４０Ｗ、Ｉ１４０Ｙ、Ｋ１４１Ｒ、Ａ１４３Ｃ、Ｍ１４４Ｋ、Ｍ１４４Ｑ、Ｋ１４５Ｅ／Ｉ４００Ｖ、Ｎ１５２Ｑ、Ａ１５４Ｍ、Ａ１５４Ｑ、Ａ１５４Ｔ、Ａ１５４Ｖ、Ａ１５９Ｆ、Ｈ１６１Ｍ、Ｈ１６１Ｓ、Ｈ１６１Ｖ、Ｉ１６４Ｇ、Ｉ１６４Ｈ、Ｉ１６４Ｌ、Ｉ１８３Ａ、Ｉ１８３Ｇ、Ｉ１８３Ｓ、Ｔ１９１Ｉ、Ｒ１９４Ｋ、Ｓ１９７Ｐ、Ｓ１９７Ｑ、Ｓ１９７Ｒ、Ｔ２１５Ｅ、Ｔ２１５Ｆ、Ｔ２１５Ｌ、Ｔ２１５Ｍ、Ｃ２１６Ａ、Ｃ２１６Ｓ、Ａ２２２Ｉ、Ｖ２２４Ｉ、Ｙ２２９Ｇ、Ｙ２２９Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ２３６Ｇ、Ｓ２５１Ｇ、Ｐ２５６Ｌ、Ｐ２５６Ｍ、Ｐ２５６Ｑ、Ｉ２５８Ｖ、Ｐ２５９Ｖ／Ｙ２８４Ｌ、Ｆ２６０Ｅ、Ｆ２６０Ｔ、Ｆ２６１Ａ、Ｍ２６３Ｔ／Ｖ３９１Ｇ、Ｉ２６８Ｌ、Ｍ２７３Ｖ、Ｙ２７４Ｗ、Ｉ２７６Ｖ、Ｖ２８３Ｋ、Ｙ２８４Ｌ、Ｌ２８６Ｉ、Ｓ２８７Ａ、Ｓ２８７Ｄ、Ｓ２８７Ｇ、Ｓ２８７Ｌ、Ｓ２８７Ｔ、Ｋ２８８Ｇ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ２８９Ｓ、Ｆ２９０Ｌ、Ｓ２９２Ｐ、Ｉ２９７Ｌ、Ｉ２９７Ｍ、Ｉ２９７Ｑ、Ｅ２９８Ｆ、Ｅ２９８Ｋ、Ｅ２９８Ｌ、Ｅ２９８Ｌ／Ｋ４０５Ｅ、Ｅ２９８Ｑ、Ｅ２９８Ｔ、Ｅ２９８Ｖ、Ｅ２９８Ｗ、Ｅ２９９Ｑ、Ｅ２９９Ｒ、Ｅ２９９Ｓ、Ｅ２９９Ｔ、Ａ３００Ｇ、Ａ３００Ｓ、Ａ３００Ｔ、Ａ３０１Ｅ、Ａ３０１Ｋ、Ａ３０１Ｑ、Ａ３０１Ｒ、Ｌ３０２Ａ、Ｌ３０２Ｆ、Ｌ３０２Ｇ、Ｌ３０２Ｒ、Ｌ３０２Ｓ、Ｋ３０３Ｅ、Ｇ３０４Ａ、Ｇ３０４Ｃ、Ｇ３０４Ｄ、Ｇ３０４Ｅ、Ｇ３０４Ｑ、Ｇ３０４Ｒ、Ｇ３０４Ｖ、Ｄ３０５Ｎ、Ｃ３０８Ｒ、Ｌ３１０Ａ、Ｌ３１０Ｇ、Ｌ３１０Ｍ、Ｌ３１２Ｋ、Ｌ３１２Ｐ、Ｌ３１２Ｒ、Ｉ３１４Ｖ、Ｄ３１６Ａ、Ｄ３１６Ｇ、Ｄ３１６Ｍ、Ｄ３１６Ｑ、Ｄ３１６Ｒ、Ｄ３１６Ｖ、Ｙ３１７Ａ、Ｙ３１７Ｇ、Ｙ３１７Ｉ、Ｙ３１７Ｌ、Ｙ３１７Ｓ、Ｙ３２２Ｇ、Ｙ３２２Ｎ、Ｙ３２２Ｓ、Ｉ３２３Ｐ、Ｉ３２３Ｓ、Ｖ３３７Ｌ、Ｓ３４６Ｌ、Ｐ３４７Ｑ、Ｐ３４７Ｒ、Ｐ３４７Ｔ、Ｐ３４７Ｖ、Ｉ３４８Ｅ、Ｔ３４９Ｖ、Ｅ３５１Ｌ、Ｅ３５１Ｒ、Ｅ３５１Ｓ、Ｅ３５１Ｖ、Ｄ３５２Ａ、Ｄ３５２Ｆ、Ｄ３５２Ｇ、Ｄ３５２Ｋ、Ｄ３５２Ｐ、Ｄ３５２Ｔ、Ｄ３５２Ｖ、Ｄ３５２Ｖ／Ｋ４０５Ｑ、Ｃ３５４Ｇ、Ｃ３５４Ｌ、Ｃ３５４Ｐ、Ｃ３５４Ｓ、Ｃ３５４Ｖ、Ｃ３５４Ｗ、Ｓ３５５Ｄ、Ｓ３５５Ｅ、Ｓ３５５Ｋ、Ｓ３５５Ｍ、Ｙ３５６Ｇ、Ｖ３６２Ｉ、Ｋ３６６Ｅ、Ｋ３６６Ｇ、Ｋ３６６Ｉ、Ｋ３６６Ｌ、Ｋ３６６Ｐ、Ｋ３６６Ｒ、Ｋ３６６Ｓ、Ｋ３６６Ｗ、Ｋ３６８Ｅ、Ｋ３６８Ｇ、Ｋ３６８Ｌ、Ｋ３６８Ｎ、Ｋ３６８Ｑ、Ｋ３６８Ｒ、Ｋ３６８Ｓ、Ｋ３６８Ｖ、Ｅ３７１Ｎ、Ｅ３７１Ｖ、Ｔ３７２Ｄ、Ｔ３７２Ｆ、Ｔ３７２Ｎ、Ｔ３７２Ｖ、Ｉ３７３Ｐ、Ｉ３７３Ｖ、Ｒ３７４Ｄ、Ｒ３７４Ｅ、Ｒ３７４Ｈ、Ｒ３７４Ｌ、Ｒ３７４Ｍ、Ｒ３７４Ｖ、Ｇ３７５Ｌ、Ｋ３７６Ｅ、Ｋ３７６Ｌ、Ｋ３７６Ｍ、Ｋ３７６Ｒ、Ｋ３７６Ｓ、Ｋ３７６Ｔ、Ｋ３７６Ｗ、Ｅ３７７Ｍ、Ｅ３７７Ｖ、Ｇ３７８Ａ、Ｉ３８０Ｇ、Ｒ３８６Ｋ、Ｌ３９０Ｅ、Ｌ３９０Ｇ、Ｌ３９０Ｓ、Ｌ３９０Ｔ、Ｌ３９０Ｖ、Ｖ３９１Ｇ、Ｖ３９１Ｒ、Ｖ３９２Ｇ、Ｖ３９２Ｗ、Ｌ３９８Ｈ、Ｌ３９８Ｗ、Ｌ３９８Ｙ、Ｍ３９９Ａ、Ｍ３９９Ｐ、Ｍ３９９Ｓ、およびＩ４０７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、表２－１に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。

一部のさらなる実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、操作された酢酸キナーゼがポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号１２を参照して番号付けられている、操作された酢酸キナーゼを提供する。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、操作された酢酸キナーゼは、１５／７０／１５４／２９７／３５２／３５５、１５／１５４／１９１／２９７／２９８／３０１／３４８／３５２／３９１、１５／１５４／１９１／２９７／３５５、１５／１５４／２９７／２９８／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／２９７／２９８／３０１／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／２９８／３５２／３５５、１５／２９７／２９８／３５５、２３／１０１／１０２／１２２／１４０／１４３／３１６／３７２、２３／１０１／１０２／１４０、２３／１０１／３７４、２３／１２２／３１６／３７２／３７４、２３／１２２／３１６／３７４／３９５、２３／１４０／３１６／３７４、２９／１５４／１９１／２９８／３４８／３５５、５１／１０１／１０２／１３５／２４２／３１６／３７４、５１／１０１／３１６、７０／１５４／１６２／１９１／２９７／３０１／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／２９７／３５２、７０／１５４／１９１／２９８／３４８／３５２／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／２９８／３５２、７０／１５４／２９７／２９８／３４８／３５５、７０／１５４／２９７／３５２／３５５、７０／１９１／２９７／２９８／３５２／３９１、１０１／１０２／１２２／１４０／１４２／３１６／３７２／３７４、１０１／１３６／２４２／３７２、１０２／１３５／１４０／３１６、１０２／１３６／１４０／１４２／１４３／３１６、１０２／１４２／３１６、１２２／１４０／１４２／１６４／２４２、１２２／１４２／３１６、１２２／１４３／２４２／３７４、１３５／１３６／１４０／１４２／１４３／２４２／３１６／３７２／３７４、１３５／１４０／１４３／２４２／３７４／３９５、１３５／１４０／３１６、１３６／２４２、１４２／３１６、１４２／３１６／３７２／３７４、１４２／３１６／３７４、１４３／３１６、１５４／１９１／２９７／２９８、１５４／１９１／２９７／２９８／３０１／３５２／３５５、１５４／１９１／２９７／２９８／３５２、１５４／１９１／２９８／３０１／３４８／３５２／３９１、１５４／１９１／２９８／３４８／３５２、および１５４／２９７／２９８から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、１５Ｎ／７０Ｋ／１５４Ｑ／２９７Ｎ／３５２Ｔ／３５５Ｋ、１５Ｎ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｌ／２９８Ｆ／３０１Ｒ／３４８Ｅ／３５２Ｔ／３９１Ｒ、１５Ｎ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｎ／３５５Ｋ、１５Ｎ／１５４Ｑ／２９７Ｎ／２９８Ｆ／３４８Ｅ／３５２Ｇ／３５５Ｋ／３９１Ｒ、１５Ｎ／１９１Ｉ／２９７Ｌ／２９８Ｆ／３０１Ｒ／３４８Ｅ／３５２Ｔ／３５５Ｋ／３９１Ｒ、１５Ｎ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３５２Ｔ／３５５Ｋ、１５Ｎ／２９７Ｌ／２９８Ｆ／３５５Ｋ、２３Ｈ／１０１Ｉ／１０２Ａ／１２２Ｇ／１４０Ｐ／１４３Ｃ／３１６Ｒ／３７２Ｆ、２３Ｈ／１０１Ｉ／１０２Ａ／１４０Ｐ、２３Ｈ／１０１Ｉ／３７４Ｌ、２３Ｈ／１２２Ｇ／３１６Ｒ／３７２Ｆ／３７４Ｌ、２３Ｈ／１２２Ｇ／３１６Ｒ／３７４Ｅ／３９５Ｋ、２３Ｈ／１４０Ｐ／３１６Ｒ／３７４Ｅ、２９Ｄ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３４８Ｅ／３５５Ｋ、５１Ｆ／１０１Ｉ／１０２Ａ／１３５Ｌ／２４２Ｔ／３１６Ｒ／３７４Ｌ、５１Ｆ／１０１Ｉ／３１６Ｒ、７０Ｋ／１５４Ｑ／１６２Ｈ／１９１Ｉ／２９７Ｎ／３０１Ｒ／３５５Ｋ／３９１Ｒ、７０Ｋ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｌ／３５２Ｔ、７０Ｋ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３４８Ｅ／３５２Ｔ／３５５Ｋ／３９１Ｒ、７０Ｋ／１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３５２Ｔ、７０Ｋ／１５４Ｑ／２９７Ｌ／３５２Ｇ／３５５Ｋ、７０Ｋ／１５４Ｑ／２９７Ｎ／２９８Ｆ／３４８Ｅ／３５５Ｋ、７０Ｋ／１９１Ｉ／２９７Ｎ／２９８Ｆ／３５２Ｔ／３９１Ｒ、１０１Ｉ／１０２Ａ／１２２Ｇ／１４０Ｐ／１４２Ｖ／３１６Ｒ／３７２Ｆ／３７４Ｌ、１０１Ｉ／１３６Ｖ／２４２Ｔ／３７２Ｆ、１０２Ａ／１３５Ｌ／１４０Ｐ／３１６Ｒ、１０２Ａ／１３６Ａ／１４０Ｐ／１４２Ｖ／１４３Ｃ／３１６Ｒ、１０２Ａ／１４２Ｖ／３１６Ｒ、１２２Ｇ／１４０Ｐ／１４２Ｖ／１６４Ｈ／２４２Ｔ、１２２Ｇ／１４２Ｖ／３１６Ｒ、１２２Ｇ／１４３Ｃ／２４２Ｔ／３７４Ｅ、１３５Ｌ／１３６Ａ／１４０Ｐ／１４２Ｖ／１４３Ｃ／２４２Ｔ／３１６Ｒ／３７２Ｆ／３７４Ｌ、１３５Ｌ／１４０Ｐ／１４３Ｃ／２４２Ｔ／３７４Ｌ／３９５Ｋ、１３５Ｌ／１４０Ｐ／３１６Ｒ、１３６Ｖ／２４２Ｔ、１４２Ｖ／３１６Ｒ、１４２Ｖ／３１６Ｒ／３７２Ｆ／３７４Ｅ、１４２Ｖ／３１６Ｒ／３７４Ｌ、１４３Ｃ／３１６Ｒ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｌ／２９８Ｆ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｌ／２９８Ｆ／３０１Ｒ／３５２Ｔ／３５５Ｋ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｎ／２９８Ｆ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９７Ｎ／２９８Ｆ／３５２Ｇ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３０１Ｒ／３４８Ｅ／３５２Ｔ／３９１Ｒ、１５４Ｑ／１９１Ｉ／２９８Ｆ／３４８Ｅ／３５２Ｔ、および１５４Ｑ／２９７Ｌ／２９８Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、Ｖ１５Ｎ／Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｉ２９７Ｎ／Ｄ３５２Ｔ／Ｓ３５５Ｋ、Ｖ１５Ｎ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆ／Ａ３０１Ｒ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｔ／Ｖ３９１Ｒ、Ｖ１５Ｎ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｎ／Ｓ３５５Ｋ、Ｖ１５Ｎ／Ａ１５４Ｑ／Ｉ２９７Ｎ／Ｌ２９８Ｆ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｇ／Ｓ３５５Ｋ／Ｖ３９１Ｒ、Ｖ１５Ｎ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆ／Ａ３０１Ｒ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｔ／Ｓ３５５Ｋ／Ｖ３９１Ｒ、Ｖ１５Ｎ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ｄ３５２Ｔ／Ｓ３５５Ｋ、Ｖ１５Ｎ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆ／Ｓ３５５Ｋ、Ｉ２３Ｈ／Ｖ１０１Ｉ／Ｖ１０２Ａ／Ｉ１２２Ｇ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４３Ｃ／Ｄ３１６Ｒ／Ｔ３７２Ｆ、Ｉ２３Ｈ／Ｖ１０１Ｉ／Ｖ１０２Ａ／Ｉ１４０Ｐ、Ｉ２３Ｈ／Ｖ１０１Ｉ／Ｒ３７４Ｌ、Ｉ２３Ｈ／Ｉ１２２Ｇ／Ｄ３１６Ｒ／Ｔ３７２Ｆ／Ｒ３７４Ｌ、Ｉ２３Ｈ／Ｉ１２２Ｇ／Ｄ３１６Ｒ／Ｒ３７４Ｅ／Ｎ３９５Ｋ、Ｉ２３Ｈ／Ｉ１４０Ｐ／Ｄ３１６Ｒ／Ｒ３７４Ｅ、Ｅ２９Ｄ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ｉ３４８Ｅ／Ｓ３５５Ｋ、Ｌ５１Ｆ／Ｖ１０１Ｉ／Ｖ１０２Ａ／Ａ１３５Ｌ／Ｌ２４２Ｔ／Ｄ３１６Ｒ／Ｒ３７４Ｌ、Ｌ５１Ｆ／Ｖ１０１Ｉ／Ｄ３１６Ｒ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｑ１６２Ｈ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｎ／Ａ３０１Ｒ／Ｓ３５５Ｋ／Ｖ３９１Ｒ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｌ／Ｄ３５２Ｔ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｔ／Ｓ３５５Ｋ／Ｖ３９１Ｒ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ｄ３５２Ｔ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｉ２９７Ｌ／Ｄ３５２Ｇ／Ｓ３５５Ｋ、Ｅ７０Ｋ／Ａ１５４Ｑ／Ｉ２９７Ｎ／Ｌ２９８Ｆ／Ｉ３４８Ｅ／Ｓ３５５Ｋ、Ｅ７０Ｋ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｎ／Ｌ２９８Ｆ／Ｄ３５２Ｔ／Ｖ３９１Ｒ、Ｖ１０１Ｉ／Ｖ１０２Ａ／Ｉ１２２Ｇ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ／Ｔ３７２Ｆ／Ｒ３７４Ｌ、Ｖ１０１Ｉ／Ｎ１３６Ｖ／Ｌ２４２Ｔ／Ｔ３７２Ｆ、Ｖ１０２Ａ／Ａ１３５Ｌ／Ｉ１４０Ｐ／Ｄ３１６Ｒ、Ｖ１０２Ａ／Ｎ１３６Ａ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４２Ｖ／Ａ１４３Ｃ／Ｄ３１６Ｒ、Ｖ１０２Ａ／Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ、Ｉ１２２Ｇ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４２Ｖ／Ｉ１６４Ｈ／Ｌ２４２Ｔ、Ｉ１２２Ｇ／Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ、Ｉ１２２Ｇ／Ａ１４３Ｃ／Ｌ２４２Ｔ／Ｒ３７４Ｅ、Ａ１３５Ｌ／Ｎ１３６Ａ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４２Ｖ／Ａ１４３Ｃ／Ｌ２４２Ｔ／Ｄ３１６Ｒ／Ｔ３７２Ｆ／Ｒ３７４Ｌ、Ａ１３５Ｌ／Ｉ１４０Ｐ／Ａ１４３Ｃ／Ｌ２４２Ｔ／Ｒ３７４Ｌ／Ｎ３９５Ｋ、Ａ１３５Ｌ／Ｉ１４０Ｐ／Ｄ３１６Ｒ、Ｎ１３６Ｖ／Ｌ２４２Ｔ、Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ、Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ／Ｔ３７２Ｆ／Ｒ３７４Ｅ、Ａ１４２Ｖ／Ｄ３１６Ｒ／Ｒ３７４Ｌ、Ａ１４３Ｃ／Ｄ３１６Ｒ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆ／Ａ３０１Ｒ／Ｄ３５２Ｔ／Ｓ３５５Ｋ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｎ／Ｌ２９８Ｆ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｉ２９７Ｎ／Ｌ２９８Ｆ／Ｄ３５２Ｇ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ａ３０１Ｒ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｔ／Ｖ３９１Ｒ、Ａ１５４Ｑ／Ｔ１９１Ｉ／Ｌ２９８Ｆ／Ｉ３４８Ｅ／Ｄ３５２Ｔ、およびＡ１５４Ｑ／Ｉ２９７Ｌ／Ｌ２９８Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、表３－１に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号１２に記載の、バリアントの操作されたポリペプチドである。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、操作された酢酸キナーゼがポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号６００を参照して番号付けられている、操作された酢酸キナーゼを提供する。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、操作された酢酸キナーゼは、２３／２４２／３７４、２３／３７４、７０／３７４、２４２／２９８、２４２／３７４、２９８／３７４、および３７４から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は配列番号６００を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、２３Ｈ／２４２Ｔ／３７４Ｌ、２３Ｈ／３７４Ｌ、７０Ｋ／３７４Ｌ、２４２Ｔ／２９８Ｆ、２４２Ｔ／３７４Ｌ、２９８Ｆ／３７４Ｌ、および３７４Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６００を参照して番号付けられている。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、Ｉ２３Ｈ／Ｌ２４２Ｔ／Ｒ３７４Ｌ、Ｉ２３Ｈ／Ｒ３７４Ｌ、Ｅ７０Ｋ／Ｒ３７４Ｌ、Ｌ２４２Ｔ／Ｌ２９８Ｆ、Ｌ２４２Ｔ／Ｒ３７４Ｌ、Ｌ２９８Ｆ／Ｒ３７４Ｌ、およびＲ３７４Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６００を参照して番号付けられている。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、表４－１に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。

一部のさらなる実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号２～６９６の偶数番号の配列に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、配列番号２～６９６の偶数番号の配列に記載のポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作された酢酸キナーゼは、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ酢酸キナーゼと比べて少なくとも１つの改善された特性を含む。なお一部の追加の実施形態では、改善された特性は、野生型酢酸キナーゼと比べて、基質に対する改善された活性を含む。一部の実施形態では、基質は、ヌクレオシド三リン酸および酢酸塩および／またはアセチルリン酸およびヌクレオシド二リン酸を含む。一部のさらなる実施形態では、基質は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびアセチルリン酸および／またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および酢酸塩を含む。一部の追加の実施形態では、改善された特性は、野生型酢酸キナーゼと比べて、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の改善された産生を含む。一部のさらなる実施形態では、操作された酢酸キナーゼは精製されている。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に提供される１つの操作された酢酸キナーゼを含む組成物を提供する。

本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号１１、および／または配列番号５９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む。一部の実施形態では、操作された酢酸キナーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～６９５の奇数番号の配列を含む。本発明はまた、本明細書に提供される酢酸キナーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に提供される酢酸キナーゼをコードする１つのポリヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明はまた、本明細書に提供される酢酸キナーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供する。

本発明はまた、宿主細胞において操作された酢酸キナーゼを産生する方法であって、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼが産生されるように、適した条件下で本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを回収することをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを精製するステップをさらに含む。

本発明は、操作された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）酵素、ＡｃＫ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＡｃＫ酵素を産生する方法もまた提供される。本発明はさらに、ＡｃＫ酵素を含む組成物および操作されたＡｃＫ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。

特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知で一般に採用されるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考資料に記載されている。標準的な技術またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。本明細書で上記および下記の両方で言及した全ての特許、特許出願、論文、および刊行物は、これにより参照により明白に本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の適した方法および材料が、本発明の実践において有用であるが、一部の方法および材料を本明細書に記載する。本発明は、記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬が、当業者によって使用される文脈に応じて異なり得ることから、これらに限定されないと理解されるべきである。したがって、以下に直ちに定義する用語を、全体として本発明を参照してより十分に説明する。

前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的で単なる説明に過ぎず、本発明を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書で使用される節の見出しは、単に構成目的のためであり、記載の主題を限定すると解釈してはならない。数値範囲はその範囲を定義する数字を含む。このように、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲が全て明白に本明細書に記されていたかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を包含すると意図される。同様に、本明細書で開示されるあらゆる最大の（または最小の）数値限定は、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明白に記されているかのように、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。

略語
遺伝子コードされるアミノ酸に関して使用される略語は慣例的であり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸塩（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸塩（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。

三文字略記を使用する場合、具体的に「Ｌ」もしくは「Ｄ」がその前になければ、または略語を使用する文脈から明白でなければ、アミノ酸は、α－炭素（Ｃ_α）に関してＬ－またはＤ－立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α－炭素に関する立体配置を指定しないアラニンを明確に示すが、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」はそれぞれ、Ｄ－アラニンおよびＬ－アラニンを明確に示す。一文字略記を使用する場合、大文字はα－炭素に関してＬ－立体配置のアミノ酸を明確に示し、小文字はα－炭素に関してＤ－立体配置のアミノ酸を明確に示す。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを明確に示し、「ａ」はＤ－アラニンを明確に示す。ポリペプチド配列が、一連の一文字略記または三文字略記（またはその混合物）として提示される場合、配列は、一般的な慣例に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向で表される。

遺伝子コードヌクレオシドに関して使用される略語は慣例的であり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に描写していない限り、略語のヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個々の基準または総計の基準でリボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると指定され得る。核酸配列が一連の一文字略記として表される場合、配列は一般的な慣例に従って５’から３’方向に表され、ホスフェートは指し示されない。

定義
本発明を参照して、本明細書の記載に使用した科学技術用語は、具体的に特に定義されていない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は以下の意味を有すると意図される。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に指し示していない限り、複数形の指示対象を含む。このように、例えば「１つのポリペプチド」という参照は１つより多くのポリペプチドを含む。

同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換性があり、限定的でないと意図される。このため、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族語は、その包括的意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族語と等価である）。

様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者は、一部の具体的な例において、ある実施形態を、「それから本質的になる」または「それからなる」という言語を使用して代替的に説明することができると理解するであろうとさらに理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値に関する許容可能な誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所定の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＥＣ」数は、ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、それらが触媒する化学反応に基づく酵素の数値分類系である。

本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、そのバイオレポジトリコレクションが遺伝子および系統を含む、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指す。

本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびその中に提供される配列データベースを指す。

本明細書で使用される場合、「酢酸キナーゼ」および「ＡｃＫ」は、ヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）および酢酸塩のアセチルリン酸およびヌクレオシド二リン酸（例えば、ＡＤＰ）への可逆的相互変換を媒介する酵素（ＥＣ２．７．２．１）、またはそのようなＡｃＫ酵素に由来するバリアント酵素を指し、そのようなバリアント酵素が供給源の（すなわち、「親の」）酵素と同じ機能性を保持するか否かにかかわらない。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）によらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを意味する。この定義には、Ｄ－およびＬ－アミノ酸、Ｄ－およびＬ－アミノ酸の混合物、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸、およびＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含むポリマーが含まれる。

「アミノ酸」は、本明細書においてその一般に公知の三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される一文字記号のいずれかによって呼ばれる。同様にヌクレオチドは、その一般に許容される一文字表記によって呼ばれ得る。

本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５－１４２［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロ未満の疎水性を呈する側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６未満のｐＫａ値を呈する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は典型的に、水素イオンの喪失により生理的ｐＨで負電荷を持つ側鎖を有する。遺伝子コードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に約６より大きいｐＫａ値を呈する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により生理的ｐＨで正電荷を持つ側鎖を有する。遺伝子コードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共通に共有される電子対が原子の１つによってより緊密に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる極性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１２５－１４２［１９８４］）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を呈する側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香環またはヘテロ芳香環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａにより、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）はその側鎖がヘテロ芳香環を含むことから、塩基性残基または芳香族残基として分類されることもあるが、本明細書ではヒスチジンは、疎水性残基または「拘束された残基」（以下を参照されたい）と分類される。

本明細書で使用される場合、「拘束されたアミノ酸または残基」は、拘束された幾何学を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束された残基としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、それが比較的小さいイミダゾール環を有することから、拘束された幾何学を有する。プロリンは、それが５員環も有することから拘束された幾何学を有する。

本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であり、２つの原子によって共通に共有される電子対が一般的に２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖（すなわち、側鎖は非極性である）を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ－Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、それが他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点においてまれであることに注意されたい。「システイン様残基」は、ジスルフィド架橋の形成にとって利用可能なスルフヒドリル部分を含有するシステインおよび他のアミノ酸を含む。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）（およびＳＨ－含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元型の遊離－ＳＨまたは酸化されたジスルフィド架橋型のいずれかでペプチド中に存在する能力は、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性または親水性特徴を与えるか否かに影響を及ぼす。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．、１９８４、上記）の正規化コンセンサス尺度に従って０．２９の疎水性を呈するが、本開示の目的に関して、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自体の独自の群にカテゴリー化されると理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「小さいアミノ酸または残基」は、全体で３個またはそれより少ない炭素および／またはヘテロ原子（α－炭素および水素を除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小さいアミノ酸または残基は、上記の定義に従って脂肪族、非極性、極性、または酸性の小さいアミノ酸または残基としてさらにカテゴリー化され得る。遺伝子コードされる小さいアミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共に共有結合される２つまたはそれより多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、全てリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）で構成され得るか、全て２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）で構成され得るか、またはリボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物で構成され得る。ヌクレオシドは典型的に、標準的なホスホジエステル連結を介して共に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準の連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含み得る。その上、ポリヌクレオチドは典型的に、天然に存在するコードヌクレオ塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）で構成されるが、これは、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどの１つまたは複数の改変および／または合成ヌクレオ塩基を含み得る。一部の実施形態では、そのような改変または合成ヌクレオ塩基は、アミノ酸配列をコードするヌクレオ塩基である。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、ヌクレオ塩基（すなわち、窒素塩基）および５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非限定的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびイノシンが挙げられる。これに対し、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオ塩基、５炭糖、および１つまたは複数のリン酸基を含むグリコシルアミンを指す。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、キナーゼによってリン酸化されてヌクレオチドを産生することができる。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、ヌクレオ塩基（すなわち、窒素塩基）、５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）、および二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。本明細書における一部の実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は、「ＮＤＰ」と省略される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、およびイノシン二リン酸（ＩＤＰ）が挙げられる。用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、一部の文脈では互換的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。

本明細書で使用される場合、用語「生体触媒」、「生体触媒の」、「生体内変換」、および「生合成」は、有機化合物について化学反応を実施するための酵素の使用を指す。

本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。

本明細書で使用される場合、「組換え」、「操作された」、「バリアント」、および「天然に存在しない」とは、細胞、核酸、またはポリペプチドを参照して使用される場合、そうでなければ天然に存在しない様式で改変されている材料、または材料の天然もしくはネイティブ型に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸、またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸、またはポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用する操作によって産生されるかまたは由来する。非限定的な例としては、中でもネイティブ（非組み換え）型の細胞内で見出されない遺伝子を発現する組換え細胞、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。

用語「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける比較を指し、２つの最適に整列させた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に発生する位置の数を決定してマッチした位置の数を生じること、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算すること、および結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算され得る。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に発生するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと共に整列する位置の数を決定してマッチした位置の数を生じること、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算すること、および結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算され得る。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野において公知であるように、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２［１９８１］）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３［１９７０］）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４［１９８８］）によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（例えば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、が挙げられるがこれらに限定されない任意の適した方法によって実行することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられるがこれらに限定されず、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３－４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３３８９－３４０２［１９７７］を参照されたい）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通して公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、何らかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたは満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照されたい）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各々の配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（マッチする残基の対のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。各々の方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ未満となる場合；あるいはいずれかの配列の末端に達した場合に中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５［１９８９］を参照されたい）を使用する。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを、提供されるデフォルトパラメーターを使用して採用することができる。

本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性比較の基礎として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは各々、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得る、および（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含み得ることから、２つ（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づき得るが、参照配列は、一次配列において１つまたは複数の変化を有し得る配列である。

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントであって、配列が、少なくとも２０個連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得る、および比較ウィンドウにおける配列の部分が、２つの配列の最適なアライメントに関して参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０連続残基より長くなり得、必要に応じて３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウを含む。

本明細書で使用される場合、「対応する」、「を参照して」、および「と比較して」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比べる場合に指定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなくて、参照配列に関して明確に示される。例えば、所定のアミノ酸配列、例えば、操作された酢酸キナーゼのアミノ酸配列を、２つの配列間の残基のマッチを最適にするようにギャップを導入することによって参照配列と整列させることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それに対して整列されている参照配列に関して行う。

本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば少なくとも３０～５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比べて少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９～９５パーセントの間の配列同一性、またはより通常、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０パーセントまたはそれ未満となる欠失または付加を含む配列と、参照配列を比べることによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の具体的な実施形態では、用語「実質的な同一性」は、例えばデフォルトのギャップ加重を使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比べられる配列において同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸の差」および「残基の差」は、参照配列における対応する位置でのアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差を指す。一部の例では、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグを有しない同等の参照配列と比較して維持される。アミノ酸の差の位置は、一般的に本明細書において「Ｘｎ」と呼ばれ、式中ｎはそれに対して残基の差が基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比べてＸ９３位での残基の差」とは、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の差を指す。このように、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位でセリンを有する場合、「配列番号４と比べてＸ９３位での残基の差」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換である。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での具体的なアミノ酸残基の差は「ＸｎＹ」として指し示され、式中「Ｘｎ」は、上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の一文字識別子である。一部の例（例えば、実施例に表される表）では、本発明はまた、従来の表記「ＡｎＢ」によって示される具体的なアミノ酸の差も提供し、式中Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、およびＢは操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の差を含み得、これは参照配列と比較して残基の差が存在する指定された位置のリストによって指し示される。一部の実施形態では、１つより多くのアミノ酸をポリペプチドの具体的な残基位置で使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって隔てられる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュはまた、所定のバリアント内の複数の置換を指し示すためにも使用され得る（すなわち、コンビナトリアルバリアントなどでは、所定の配列に１つより多くの置換が存在する）。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸の差を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、このため典型的にポリペプチド中のアミノ酸の、同じまたは類似の定義されたクラスのアミノ酸内のアミノ酸による置換を伴う。限定ではない例によって、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）により置換し、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）により置換し、芳香族側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）により置換し、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）により置換し、酸性側鎖を有するアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）により置換し、および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸をそれぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸に交換する。

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなくて群の間でアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす。限定ではない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸により置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸により置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸により置換された親水性アミノ酸であり得る。

本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、１個もしくはそれより多くのアミノ酸、２個もしくはそれより多くのアミノ酸、５個もしくはそれより多くのアミノ酸、１０個もしくはそれより多くのアミノ酸、１５個もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれより多くのアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得るが、酵素活性を保持し、および／または操作された酢酸キナーゼ酵素の改善された特性を保持する。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とし得る。様々な実施形態では、欠失は連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は、典型的にアミノ酸配列において「－」によって指し示される。

本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドから１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分における挿入であり得るか、またはカルボキシもしくはアミノ末端に対する挿入であり得る。本明細書で使用される挿入は、当技術分野で公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであるか、または天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸の１個または複数によって隔てられ得る。

用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」は、参照配列と比べてポリペプチド配列におけるアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例に提供される表に記載されるバリアント酢酸キナーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。

「機能的断片」および「生物活性断片」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、それが比べられる配列（例えば、本発明の全長の操作された酢酸キナーゼ）中の対応する位置と同一であり、全長のポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それが天然で付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内またはｉｎｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去または精製されているポリペプチドを包含する。組換え酢酸キナーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態で、例えば溶解物もしくは単離された調製物として調製され得る。そのため、一部の実施形態では、組換え酢酸キナーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、そのポリペプチド種が、存在する主な種である（すなわち、モル濃度または重量基準で、組成物中の他の任意の個々の高分子種より豊富に存在する）組成物を指し、一般的に目的の種が、存在する高分子種のモルまたは％重量で少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、酢酸キナーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）である酢酸キナーゼを含む。一般的に、実質的に純粋な酢酸キナーゼ組成物は、組成物に存在するモルまたは％重量によって、全ての高分子種の約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多く、および約９８％またはそれより多くを構成する。一部の実施形態では、目的の種は、本質的に均一となるまで精製され（すなわち、夾雑物種は、従来の検出法では組成物中で検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換え酢酸キナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照酢酸キナーゼポリペプチド、および／または野生型酢酸キナーゼポリペプチド、および／または別の操作された酢酸キナーゼポリペプチドと比べて任意の酵素特性の改善を呈する操作された酢酸キナーゼポリペプチドを提供する。このように、「改善」レベルを決定し、野生型ならびに操作された酢酸キナーゼを含む様々な酢酸キナーゼポリペプチドの間で比べることができる。改善された特性としては、増加したタンパク質発現、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、増加した基質または最終産物阻害に対する耐性、増加した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、増加した酸性ｐＨに対する耐性、増加したタンパク質分解活性に対する耐性（すなわち、低減されたタンパク質分解に対する感受性）、低減された凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイルなどの特性が挙げられるがこれらに限定されない。追加の実施形態では、用語は、酢酸キナーゼ酵素の少なくとも１つの改善された特性を参照して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照酢酸キナーゼポリペプチドおよび／または野生型酢酸キナーゼポリペプチド、および／または別の操作された酢酸キナーゼポリペプチドと比べて任意の酵素特性の改善を呈する操作された酢酸キナーゼポリペプチドを提供する。このため、「改善」レベルを決定し、野生型ならびに操作された酢酸キナーゼを含む様々な酢酸キナーゼポリペプチドの間で比べることができる。

本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照酵素と比べた比活性の増加（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）、または基質の産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量の酵素を使用して指定された期間での基質の開始量の産物へのパーセント変換）によって表され得る。一部の実施形態では、用語は、本明細書に提供される操作された酢酸キナーゼポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照酢酸キナーゼ酵素と比べて比活性の増加（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）、または基質の産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量の酢酸キナーゼを使用して指定された期間での基質の開始量の産物へのパーセント変換）によって表され得る。一部の実施形態では、用語は、本明細書に提供される改善された酢酸キナーゼ酵素を参照して使用される。本発明の操作された酢酸キナーゼの酵素活性を決定する例示的な方法を実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、その変化が増加した酵素活性を導き得る酵素活性に関する任意の特性が影響を受け得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在する酢酸キナーゼまたは酢酸キナーゼポリペプチドが由来する別の操作された酢酸キナーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍もの酵素活性、またはそれより高い酵素活性であり得る。

本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、指定された条件下で一定期間内に産物に変換された基質のパーセントを指す。このように、酢酸キナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、指定された期間内での基質の産物への「パーセント変換」として表現され得る。

「ゼネラリスト（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比べて広範囲の基質に関して改善された活性を呈する酵素を指す。ゼネラリスト酵素は必ずしもあらゆる可能性がある基質に関して改善された活性を実証する必要はない。一部の実施形態では、本発明は、それらが広範囲の立体的および電子的に多様な基質に関して親遺伝子と比較して類似または改善された活性を実証するという点において、ゼネラリスト特性を有する酢酸キナーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供されるゼネラリスト酵素は、代謝物／産物の産生を増加させるために広範囲の多様な分子にわたって改善されるように操作された。

用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用される場合、核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度の予測に関する公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１６８：７６１－７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８８９３－８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３－９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５：７８４０－７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１８：６４０９－６４１２［１９９０］（ｅｒｒａｔｕｍ、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａ）；Ｓｕｇｇｓｅｔａｌ．、１９８１、ｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＵｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅｄＧｅｎｅｓ、Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．［ｅｄｓ．］、ｐｐ．６８３－６９３、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７－２５９［１９９１］を参照されたい）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示のポリペプチドをコードし、定義された条件、例えば中等度にストリンジェントなまたは高ストリンジェント条件下で本発明の操作された酢酸キナーゼ酵素をコードする配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズする。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件を指す。一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシー条件下で実施した後、様々な、しかしより高いストリンジェンシーでの洗浄を実施する。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％より高い同一性を有する相補的核酸に標的ＤＮＡが結合するのを可能にする条件を指す。例示的な中等度のストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーションの後に、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般的に、定義されたポリヌクレオチド配列に関する溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍより約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８ＭＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８ＭＮａＣｌ中、６５℃で安定でない場合、本明細書で企図されるように高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃と同等の条件下でのハイブリダイゼーションの後に、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（重量／体積）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーションと同等の条件でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄である。他の高ストリンジェンシー条件、ならびに中等度のストリンジェント条件は上で引用した参考文献に記載されている。

本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に使用されるコドンに変化させることを指す。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義的」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において縮重しているが、特定の生物によるコドン使用が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用バイアスは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低いコピー数のタンパク質との比較での高度に発現されたタンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関して、より高くなり得る。一部の実施形態では、酢酸キナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物における最適な産生に関してコドン最適化され得る。

本明細書で使用される場合、「好ましい」、「最適な」、および「高いコドン使用バイアス」のコドンは、単独でまたは組み合わせて使用する場合、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子におけるコドン使用、共通の機能または起源の遺伝子セット、高度に発現された遺伝子、生物全体の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、近縁の生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組合せに関連して決定され得る。その頻度が遺伝子発現レベルと共に増加するコドンは典型的に、発現に関して最適なコドンである。例えばクラスター解析または対応解析を使用する多変量解析を含む、コドン頻度（例えば、コドン使用、相対的同義コドン使用）、および具体的な生物におけるコドン選好性、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための多様な方法が公知である（例えば、ＧＣＧＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ、Ｐｅｄｅｎ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、１４：３７２－７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２２２４３７－４６［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ、Ｇｅｎｅ８７：２３－２９［１９９０］を参照されたい）。コドン使用表は、多くの異なる生物に利用可能である（例えば、Ｗａｄａｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２０：２１１１－２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２８：２９２［２０００］；Ｄｕｒｅｔ、ｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａ；ＨｅｎａｕｔａｎｄＤａｎｃｈｉｎ、ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）、ＡＳＭＰｒｅｓｓ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．、ｐ．２０４７－２０６６［１９９６］を参照されたい）。コドン使用を得るためのデータ供給源は、タンパク質をコードすることが可能な任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現されたタンパク質（例えば、完全なタンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現された配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域（例えば、Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ８、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２５９－２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉｅｔａｌ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１３：２６３－２７０［１９９７］を参照されたい）をコードすることが実際に公知の核酸配列を含む。

本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現にとって必要または有利である全ての構成要素を含む。各々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブまたは外来であり得る。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のためにリンカーと共に提供され得る。

「作動可能に連結された」は、本明細書において制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するように、目的のポリヌクレオチドと比較した位置に制御配列が適切に置かれる（すなわち、機能的な関係で）構成として定義される。

「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型、およびハイブリッドプロモーターを含む、選ばれる宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る任意の核酸配列であり得る。

語句「適した反応条件」は、本発明の酢酸キナーゼポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することが可能である酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷の範囲、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒など）を指す。一部の例示的な「適した反応条件」を本明細書に提供する。

本明細書で使用される場合、「負荷」、例えば「化合物の負荷」または「酵素負荷」は、反応の開始時の反応混合物中の構成要素の濃度または量を指す。

本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細書に提供される操作された酵素（例えば、操作された酢酸キナーゼポリペプチド）によって作用する化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、反応からの産物（例えば、デオキシリボースリン酸アナログ）の収量の「増加」は、反応の間に存在する特定の構成要素（例えば、酢酸キナーゼ酵素）が同じ基質および他の置換基による同じ条件下で行われた反応と比べてより多くの産物を産生させる場合に発生するが、目的の構成要素の非存在下では発生しない。

反応は、反応の触媒に関与する他の酵素と比べてその酵素の量が、約２％未満、約１％未満、または約０．１％（重量／重量）未満である場合、特定の酵素を「実質的に含まない」と言われる。

本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画する」とは、分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、および濾過）、またはそのようなプロセスの組合せを適用して、所望のタンパク質が最初の液体産物中より溶液中で高いパーセンテージの総タンパク質を含む溶液を提供することを意味する。

本明細書で使用される場合、「開始組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、開始組成物は、任意の適した基質を含む。

本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質に及ぼす酵素ポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、「平衡化」は、本明細書で使用される場合、化学または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定した場合に、立体異性体の相互変換を含む、化学または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態濃度をもたらすプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖または分岐鎖のいずれかの１～１８個（両端の値を含む）の炭素原子、より好ましくは１～８個（両端の値を含む）の炭素原子、および最も好ましくは１～６個（両端の値を含む）の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。指定された数の炭素原子を有するアルキルを括弧内に示す（例えば、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルは、炭素原子１～４個のアルキルを指す）。

本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの二重結合を含有する直鎖または分岐鎖のいずれかの２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の基を指す。

本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの三重結合を含有し、加えて必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する直鎖または分岐鎖のいずれかの２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の基を指す。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、およびヘテロアルキニル」は、１つまたは複数の炭素原子が各々独立して同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基に交換されている、本明細書で定義されるアルキル、アルケニル、およびアルキニルを指す。炭素原子を交換することができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、その組合せを含む－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲα－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）ＮＲα－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲα－などが挙げられるがこれらに限定されず、各々のＲαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される。

本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、Ｒβが上記で定義されたアルキル基であり、これには、やはり本明細書で定義される必要に応じて置換されたアルキル基が含まれる、－ＯＲβ基を指す。

本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアンスリル）を有する６～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「アミノ」は、－ＮＨ２基を指す。置換されたアミノは、－ＮＨＲδ、ＮＲδＲδ、およびＮＲδＲδＲδ基を指し、各々のＲδは、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、シクロへテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノなどが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。

本明細書で使用される場合、「オキシ」は、二価の基－Ｏ－を指し、これは様々な置換基を有し、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成し得る。

本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。

本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、多様な置換基を有し、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成し得る－Ｃ（Ｏ）－を指す。

本明細書で使用される場合、「アルキルオキシカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲεを指し、Ｒεは、必要に応じて置換され得る本明細書で定義されるアルキル基である。

本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換されたアミノカルボニルは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδを指し、アミノ基ＮＲδＲδは本明細書で定義される通りである。

本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。

本明細書で使用される場合、「シアノ」は、－ＣＮを指す。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１～１０個（両端の値を含む）の炭素原子、ならびに環内に酸素、窒素、および硫黄から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくはアルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール－アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、好ましくはアルケニル部分に２～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルケニル（すなわち、ヘテロアリール－アルケニル基）を指す。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、好ましくはアルキニル部分に２～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールによって置換されたアルキニル（すなわち、ヘテロアリール－アルキニル基）を指す。

本明細書で使用される場合、「複素環」、「複素環式」、および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、２～１０個（両端の値を含む）の炭素環原子および環内に窒素、硫黄、または酸素から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ環原子の単環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有し得る。複素環の例としては、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「員環」とは、任意の環状構造を包含することを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。このように、例えばシクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。

特に指定されない限り、前述の基において水素が占有している位置を、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換されたアルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換されたスルホンアミド、シアノ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシ、および（複素環）アルキルによって例示されるがこれらに限定されない置換基によってさらに置換することができ；好ましいヘテロ原子は酸素、窒素、および硫黄である。これらの置換基にオープン価数（ｏｐｅｎｖａｌｅｎｃｅ）が存在する場合、それらをアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、および／または複素環式基によってさらに置換することができ、これらのオープン価数が炭素に存在する場合、それらをハロゲンおよび酸素、窒素、または硫黄結合置換基によってさらに置換することができ、ならびに複数のそのようなオープン価数が存在する場合、結合の直接形成によって、または新規ヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、もしくは硫黄に対する結合を形成することによってのいずれかで、これらの基を結び付けて環を形成することができると理解される。上記の置換は、水素を置換基に交換することによって、本発明の分子に対して許容されない不安定性が導入されず、それ以外は化学的に妥当であることを条件として行うことができるとさらに理解される。

本明細書で使用される場合、用語「培養する」は、任意の適した条件下で（例えば、液体、ゲル、または固体培地を使用して）微生物細胞の集団を成長させることを指す。

組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子をベクター、例えばプラスミドにクローニングし、所望の宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉなどにおいて発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者に周知の広く多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットもまた、多くの市販の分子生物学供給元から入手可能である。方法は、規定のアミノ酸での特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的またはランダム変異（領域特異的）、または遺伝子全体のランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うために利用可能である。酵素バリアントを生成するために多数の適した方法が当業者に公知であり、これらにはＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学飽和変異誘発、または当技術分野で公知の他の任意の適した方法が挙げられるがこれらに限定されない。変異誘発および定向進化方法を酵素コードポリヌクレオチドに容易に適用してバリアントライブラリを生成することができ、これらを発現、スクリーニング、およびアッセイすることができる。任意の適した変異誘発および定向進化方法が、本発明において有用であり、当技術分野で周知である（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、および全ての関連する米国、ならびにＰＣＴおよび非米国対応物；Ｌｉｎｇｅｔａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７－７８［１９９７］；Ｄａｌｅｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５７：３６９－７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３－４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３－１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３７：１－７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９－８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５－３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌｅｔａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、３：２８４－２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｔａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９－２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８－２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６－４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４－４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５－３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９－３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたい）。

一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、酵素調製物を規定の温度（または他のアッセイ条件）に供すること、および熱処理または他の適したアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによってスクリーニングする。次にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、遺伝子から単離し、シーケンシングしてヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現させるために使用する。発現ライブラリから酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学技術、例えばＨＰＬＣ分析）を使用して実施することができる。

バリアントが産生された後、それらを任意の所望の特性（例えば高いまたは増加した活性、または低いもしくは低減された活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）に関してスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換え酢酸キナーゼポリペプチド」（本明細書において「操作された酢酸キナーゼポリペプチド」、「バリアント酢酸キナーゼ酵素」、「酢酸キナーゼバリアント」、および「酢酸キナーゼコンビナトリアルバリアント」とも呼ばれる）は有用である。一部の実施形態では、「組換え酢酸キナーゼポリペプチド」（「操作された酢酸キナーゼポリペプチド」、「バリアント酢酸キナーゼ酵素」、「酢酸キナーゼバリアント」、および「酢酸キナーゼコンビナトリアルバリアント」とも呼ばれる）は有用である。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドの適した宿主での発現をもたらすことが可能な、適した制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、トランスジーン）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後改変、翻訳、および翻訳後改変が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの産生に伴う任意のステップを含む。一部の実施形態では、用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。用語は、転写、転写後改変、翻訳、および翻訳後改変が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの産生に伴う任意のステップを包含する。一部の実施形態では、用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が天然で会合していない場合、作動可能に連結された別の配列に対して「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリペプチドであり、宿主細胞から除去され、実験室における操作に供された後、宿主細胞に再導入されたポリヌクレオチドを含む。

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、酢酸キナーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適した宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターによって形質転換されているまたはトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞である。

用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと７０％より高い配列同一性であるが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％より高い、７８％より高い、８０％より高い、８３％より高い、８５％より高い、８８％より高い、９０％より高い、９１％より高い、９２％より高い、９３％より高い、９４％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、９９％より高い配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログはまた、１つまたは複数のＤ－アミノ酸残基および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。

用語「有効量」は、所望の結果を生み出すための十分な量を意味する。当業者は、ルーチンの実験を使用することによって有効量がどれかを決定し得る。

用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合する少なくとも１つの他の構成要素から除去された分子（例えば単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の構成要素を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とするのではなく、むしろ相対的な定義として意図される。

本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、化学反応または酵素反応において１つの立体異性体が別の立体異性体より優先的に形成されることを指す。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他方より好ましい場合は部分的であり得るか、または１つのみの立体異性体が形成される場合には完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、これは両者の合計における１つのエナンチオマーの割合（典型的にはパーセンテージとして報告される）である。これは一般に当技術分野において代替的に、式［主エナンチオマー－副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従って計算されるエナンチオマー過剰率（「ｅ．ｅ．」）として（典型的にパーセンテージとして）報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの割合（典型的にパーセンテージとして報告される）であり、一般にはジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として代替的に報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、ステレオマー過剰率のタイプである。

本明細書で使用される場合、「位置選択性」、および「位置選択的反応」は、結合を行うまたは切断する１つの方向が他の可能性がある全ての方向に対して優先的に発生する反応を指す。反応は、識別が完全である場合は完全に（１００％）位置選択的であり、１つの部位での反応産物が他の部位での反応産物より多い場合には、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）、または部分的に位置選択的（ｘ％、ここでパーセンテージは目的の反応に応じて設定される）であり得る。

本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、化学反応または酵素反応において１つの産物が別の産物より優先的に形成されることを指す。

本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」は、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５～６または８～１２）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、処理されていない酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持する酢酸キナーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「熱安定な」は、上昇した温度（例えば、４０～８０℃）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、同じ上昇した温度に曝露された野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持する酢酸キナーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」は、様々な濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５～２４時間）曝露された後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％より多くから８０％）を維持する酢酸キナーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」とは、熱安定かつ溶媒安定である酢酸キナーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「必要に応じた」、および「必要に応じて」とは、その後に記載される事象または状況が発生してもよく発生しなくてもよいこと、および記載が、事象または状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載された任意の分子に関して、立体的に現実的でおよび／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するであろう。

本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」とは、化学基の用語またはシリーズにおける全てのその後の修飾子を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されても置換されなくてもよく、シリーズの「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」に関して、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他と独立して置換されても置換されなくてもよい。

発明の詳細な説明
本発明は、操作された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）酵素、ＡｃＫ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＡｃＫ酵素を産生する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＡｃＫ酵素を含む組成物および操作されたＡｃＫ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、薬学的化合物の産生において特に有用である。

一部の実施形態では、本発明は、グリセロールのＣ２炭素にかさ高い置換基を有するリン酸化グリセロール誘導体およびグリセルアルデヒド誘導体、とりわけ化合物（１）の示される非天然のヌクレオシドアナログをｉｎｖｉｔｒｏで酵素的に合成するための中間体であるリン酸化エチニル－グリセロールおよびエチニル－グリセルアルデヒドを産生するためにＡＴＰをＡＤＰからリサイクルするのに適した酵素を提供する。

化合物（５）などのリン酸化グリセルアルデヒド誘導体の産生は難しいことがある。しかし、対応する非リン酸化グリセルアルデヒド誘導体（６）は、グリセロール誘導体（７）をアルコールオキシダーゼによって酸化することによって作出することができる。グリセロールアルデヒドが形成されると、これをスキームＩに示すようにパントテン酸キナーゼ（ＰａｎＫ）によって所望の中間体（５）へとリン酸化することができる。

リン酸化された中間体（５）の産生は、リン酸ドナーとしてＡＴＰを利用する。次に、得られたＡＤＰを、スキームＩＩに表すように、アセチルリン酸を使用してＡｃＫによってＡＴＰにリサイクルする。本発明の改善されたＡｃＫ酵素はアセチルリン酸を使用してＡＴＰをＡＤＰからリサイクルする改善された活性を有する。

一部の実施形態では、本開示の操作されたＡｃＫポリペプチドは、化合物（１）のヌクレオシドアナログなどの化合物を産生するための多酵素系の一部である。一部の実施形態では、操作されたＡｃＫポリペプチドは、以下の酵素：パントテン酸キナーゼ、ホスホペントムターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルドラーゼ、および／またはスクロースホスホリラーゼのうちの１つまたは複数を含む多酵素系の一部である。

操作されたＡｃＫポリペプチド
本発明は、操作されたＡｃＫポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、これはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載すると理解されるべきである。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＡｃＫ酵素と比べて改善された特性を有する操作された天然に存在しないＡｃＫ酵素を提供する。任意の適した反応条件が本発明において有用である。一部の実施形態では、リン酸化反応を実施するために操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために方法を使用する。一部の実施形態では、反応条件は、以下および実施例に詳しく記載するように、操作されたＡｃＫの濃度または量、基質、緩衝液、溶媒、補因子、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または操作されたＡｃＫポリペプチドを固相支持体に固定する条件に関して改変されている。

一部の実施形態では、反応条件を補足するために追加の反応構成要素または追加の技術を利用する。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するまたは不活化を防止する、産物阻害を低減する、反応の平衡を所望の産物形成へとシフトさせるための手段を講じることを含む。

一部のさらなる実施形態では、基質化合物を産物化合物に変換するための上記のプロセスのいずれかは、産物化合物の抽出、単離、精製、結晶化、濾過、および／または凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含み得る。本明細書に提供されるプロセスによって産生された生物触媒反応混合物から産物を抽出、単離、精製、および／もしくは結晶化する方法、技術、およびプロトコールは当業者に公知であり、ならびに／またはルーチンの実験を通して手に入れることができる。加えて、実例となる方法を以下の実施例に提供する。

操作されたポリペプチドをコードする操作されたＡｃＫポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御してポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを作製する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する酵素ポリペプチドを発現させる。

当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、本発明のポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドに関する説明が提供される。同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝子コードの縮重により、その全てが操作された酵素（例えば、ＡｃＫ）ポリペプチドをコードする極めて多数の核酸を作出することができる。このように、本発明は、可能性があるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって、作出することができ、本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードする酵素ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能性がある変形形態を産生するための方法および組成物を提供し、そのような全ての変形形態は、実施例（例えば、様々な表）に提示するアミノ酸配列を含む本明細書に記載の任意のポリペプチドに関して具体的に開示されていると考えるべきである。

一部の実施形態では、コドンは、好ましくはタンパク質産生のために選んだ宿主細胞によって利用されるように最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは典型的に、細菌における発現のために使用される。そのため、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長のコード領域におけるコドン位置のうち約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の、または９０％超で好ましいコドンを含有する。

一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性を有する酵素活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、本明細書に提供される配列番号から選択される参照配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、もしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、および参照ポリヌクレオチドまたは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比べて１つもしくは複数の残基の差（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのアミノ酸残基位置）を含む。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は配列番号２を含むが、一部の他の実施形態では、参照ポリペプチド配列は配列番号１２を含み、なおも一部の他の実施形態では、参照ポリペプチド配列は配列番号６００を含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される任意のポリヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、または本明細書に提供されるバリアント酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、参照配列と比べて１つまたは複数の残基の差を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、本明細書の操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を容易にするために多様なやり方で操作される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つまたは複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。そのベクターに挿入する前に単離されたポリヌクレオチドを操作することは、利用される発現ベクターに応じて望ましいまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変する技術は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、制御配列は、中でもプロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、適したプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を方向付けるための適したプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：３７２７－３７３１［１９７８］を参照されたい）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１－２５［１９８３］を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞の例示的なプロモーターとしては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ酸安定アルファ－アミラーゼ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照されたい）の遺伝子から得られたプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、切断型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞の他の役立つプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ８：４２３－４８８［１９９２］を参照されたい）。

一部の実施形態では、制御配列はまた、適した転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終止させるために宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したターミネーターが、本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的な転写ターミネーターは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の他の役立つターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、上記を参照されたい）。

一部の実施形態では、制御配列はまた、適したリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したリーダー配列が本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的なリーダーとしては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。

一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。選ばれる宿主細胞において機能的である任意の適したポリアデニル化配列が本発明において有用である。糸状菌宿主細胞の例示的なポリアデニル化配列としては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞に関して役立つポリアデニル化配列は公知である（例えば、ＧｕｏａｎｄＳｈｅｒｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５：５９８３－５９９０［１９９５］を参照されたい）。

一部の実施形態では、制御配列はまた、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路へと方向付けるコード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端はもともと、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントとの翻訳読み取り枠で天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選ばれる宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の適したシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現にとって有用である。細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、ＢａｃｉｌｌｕｓＮＣｌＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｒｓＡの遺伝子から得られた領域が挙げられるがこれらに限定されない領域を含む、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドが当技術分野で公知である（例えば、ＳｉｍｏｎｅｎａｎｄＰａｌｖａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５７：１０９－１３７［１９９３］を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域としては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞の役立つシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子からのシグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素前駆体」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照されたい）の遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない任意の適した供給源から得られ得る。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。

一部の実施形態では、調節配列もまた利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長と比較してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系である。原核宿主細胞では、適した調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞では、適した調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌では、適した調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。

別の態様では、本発明は、それらが導入される宿主のタイプに応じて、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および１つまたは複数の発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点などを含む組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載される様々な核酸および制御配列を共に結び付け、そのような部位での酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために１つまたは複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生する。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を発現のために適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作製を伴う一部の実施形態では、コード配列は、コード配列が発現のために適切な制御配列と作動可能に連結されるようにベクターに配置される。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され、酵素ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる任意の適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは、線形または閉じた環状プラスミドであり得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、その複製が染色体複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されるとそれがゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製するベクターである。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを共に含有する２つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。

一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例としては、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞の適したマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が挙げられるがこれらに限定されない。

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが宿主細胞における操作された酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現に使用するために適した宿主細胞は当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞はまた、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。細菌選択可能マーカーの例としては、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、およびもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みまたはゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメントを含有する。宿主細胞ゲノムへの組み込みを伴う一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同組換えもしくは非相同組換えによってベクターをゲノムに組み込むためのベクターの他の任意のエレメントに依存する。

一部の代替の実施形態では、発現ベクターは、相同組み替えによる宿主細胞のゲノムへの組み込みを方向付ける追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、染色体における正確な位置に宿主細胞ゲノムにベクターを組み込むことを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を増加させるために、組み込みエレメントは好ましくは十分数のヌクレオチド、例えば１００～１０，０００塩基対、好ましくは４００～１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００～１０，０００塩基対を含有し、これは相同組み替えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおいて標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コードまたはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。

自律複製の場合、ベクターは、ベクターが当該宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例としては、Ｐ１５Ａｏｒｉ、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（プラスミドがＰ１５Ａｏｒｉを有する）、もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、もしくはｐＴＡ１０６０である。酵母宿主細胞に使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞においてその機能を温度感受性にする変異を有する複製起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１４３３［１９７８］を参照されたい）。

一部の実施形態では、遺伝子産物の産生を増加させるために、本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入する。核酸配列のコピー数の増加は、宿主細胞ゲノムに配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むこと、または核酸配列と共に増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含めることによって得ることができ、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれによって核酸配列の追加のコピーを含有する細胞を、適切な選択可能な作用剤の存在下で細胞を培養することによって選択することができる。

本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。適した市販の発現ベクターとしては、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。他の適した発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ｐＵＣ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはｐＰｏｌｙ（例えば、Ｌａｔｈｅｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ５７：１９３－２０１［１９８７］を参照されたい）に由来するプラスミドが挙げられるがこれらに限定されない。

このように、一部の実施形態では、少なくとも１つのバリアント酢酸キナーゼをコードする配列を含むベクターを、ベクターの増殖およびバリアント酢酸キナーゼの発現を可能にするために宿主細胞に形質転換する。一部の実施形態では、バリアント酢酸キナーゼを翻訳後改変してシグナルペプチドを除去し、一部の例では、分泌後切断してもよい。一部の実施形態では、上記の形質転換された宿主細胞を、バリアント酢酸キナーゼの発現を可能にする条件下で適した栄養培地中で培養する。適切な補給剤を含有する最小培地または複合培地を含むがこれらに限定されない、宿主細胞を培養するために役立つ任意の適した培地が本発明において有用である。一部の実施形態では、宿主細胞を、ＨＴＰ培地中で成長させる。適した培地は様々な販売元から入手可能であるか、または公開されたレシピに従って調製してもよい（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。

別の態様では、本発明は、本明細書に提供される改善された酢酸キナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において酢酸キナーゼ酵素を発現させるために１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされる酢酸キナーゼポリペプチドの発現に使用するための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記の宿主細胞に関する適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。

酢酸キナーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術としては、中でも電気穿孔、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法が当業者に公知である。

一部の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。適した真核宿主細胞としては、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。適した真菌宿主細胞としては、子嚢菌門、担子菌門、不完全菌門、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、不完全菌類が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の全ての糸状菌形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖類で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は酵母とは形態学的に異なる。

本発明の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、および／またはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、および／またはその有性世代もしくは無性世代、ならびにその同義語、バシオニム（ｂａｓｉｏｎｙｍ）、またはその分類学上の等価物が挙げられるがこれらに限定されない、任意の適した属および種の細胞である。

本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。

本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は藻類細胞、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。

一部の他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。適した原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム不定細菌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。任意の適した細菌生物が本発明において有用であり、これにはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は工業用株である。多数の工業用細菌株が公知であり、本発明において適している。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、およびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれらに限定されない工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉＥ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、およびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、およびＰ．ｓｐ．Ｄ－０ｌ１０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。

本発明において有用である多くの原核生物および真核生物株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、ＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕＶｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの複数の培養コレクションから公共に容易に入手可能である。

一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性、ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌にとって望ましい他の特性を改善する特徴を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子操作技術および／または古典的な微生物学技術（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、一部の実施形態では、組換え改変および古典的選択技術の組合せを使用して宿主細胞を産生する。組換え技術を使用して、宿主細胞内および／または培養培地中での酢酸キナーゼバリアントの収量の増加をもたらすように、核酸分子を導入、欠失、阻害、または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼ欠損である細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトはピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子操作アプローチでは、相同組換えを使用して、遺伝子をｉｎｖｉｖｏで特異的に標的化することによって標的化遺伝子改変を誘導し、コードされるタンパク質の発現を抑制する。代替のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術は、遺伝子発現を阻害するために有用である。細胞におけるタンパク質発現を低減させるために多様な方法が当技術分野で公知であり、これらには、タンパク質をコードする遺伝子の全てまたは一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊するための部位特異的変異誘発が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２８：２２ｅ９７［２０００］；Ｃｈｏｅｔａｌ．、Ｍｏｌｅｃ．ＰｌａｎｔＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．、１９：７－１５［２００６］；ＭａｒｕｙａｍａａｎｄＫｉｔａｍｏｔｏ、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔ．、３０：１８１１－１８１７［２００８］；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｏｍ．、２７２：３４４－３５２［２００４］；およびＹｏｕｅｔａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９１：６１５－６２２［２００９］を参照されたい）。ランダム変異誘発後の所望の変異に関するスクリーニングもまた有用である（例えば、その両方が参照により組み込まれる、Ｃｏｍｂｉｅｒｅｔａｌ．、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２２０：１４１－８［２００３］；およびＦｉｒｏｎｅｔａｌ．、Ｅｕｋａｒｙ．Ｃｅｌｌ２：２４７－５５［２００３］を参照されたい）。

ベクターまたはＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入することは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して達成することができ、これらの方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ－媒介形質転換、電気穿孔、または当技術分野で公知の他の一般的な技術が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（これにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）が有用である。

一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、または酢酸キナーゼポリヌクレオチドを増幅するために適切となるように改変された従来の栄養培地中で培養される。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞に関して以前に使用された条件であり、当業者に周知である。記載したように、細菌、植物、動物（特に哺乳動物）および古細菌（ａｒｃｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌ）起源の細胞を含む多くの細胞の培養および産生に関して、多くの標準的な参考文献およびテキストが利用可能である。

一部の実施形態では、本発明のバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを発現する細胞は、回分発酵または連続発酵条件下で成長する。古典的な「回分発酵」は、閉鎖系であり、培地の組成を発酵の始めに設定し、発酵の間、人為的な変更に供されない。回分系の変形形態は、本発明において有用である「流加培養発酵」である。この変形形態では、基質は発酵が進行するにつれて徐々に添加される。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中の基質の量を限定することが望ましい場合に役に立つ。回分発酵および流加発酵は、一般的であり当技術分野で周知である。「連続発酵」は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が処理のために同時に除去される開放系である。連続発酵は一般的に、細胞が主に対数成長期にある場合に一定の高密度での培養を維持する。連続発酵系は、定常状態成長条件を維持するように努める。連続発酵プロセスのために栄養および増殖因子をモジュレートする方法ならびに産物の形成速度を最大限にするための技術は、工業微生物学の分野において周知である。

本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系は、バリアント酢酸キナーゼを産生するために有用である。いくつかの系が市販されており、その方法は当業者に周知である。

本発明は、バリアント酢酸キナーゼポリペプチドまたはその生物活性断片を作出する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、配列番号１２、および／または配列番号６００と少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含み、本明細書に提供される少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞を提供すること：形質転換された宿主細胞を、宿主細胞がコードされたバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを発現する条件下で培養培地中で培養すること；および必要に応じて発現されたバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または発現されたバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。一部の実施形態では、方法はさらに、必要に応じてコードされた酢酸キナーゼポリペプチドを発現させた後に形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに必要に応じて発現されたバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離することを提供する。本発明はさらに、バリアント酢酸キナーゼポリペプチドの産生にとって適した条件下でバリアント酢酸キナーゼポリペプチドによって形質転換された宿主細胞を培養すること、およびバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアント酢酸キナーゼポリペプチドを作出する方法を提供する。典型的に、酢酸キナーゼポリペプチドの回収または単離は、本明細書に記載の技術を含む当技術分野で周知のタンパク質回収技術を使用して、宿主細胞培養培地から、宿主細胞から、または両方から行う。一部の実施形態では、宿主細胞を、遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、および得られた粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において採用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知である多くの他の適した方法を含むがこれらに限定されない、任意の簡便な方法によって破壊することができる。

宿主細胞において発現された操作された酢酸キナーゼ酵素は、中でもリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製に関して当技術分野で公知の技術の任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収することができる。細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉからのタンパク質を溶解して高い効率で抽出するための適した溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）として市販されている。このように、一部の実施形態では、得られたポリペプチドは、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって回収／単離され、必要に応じて精製される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって栄養培地から単離される。一部の実施形態では、望ましければ成熟タンパク質の立体配置を完成させるためにタンパク質の再フォールディングステップを使用する。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップにおいて採用する。例えば一部の実施形態では、当技術分野で公知の方法が本発明において有用である（例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｒｙｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３５３：１１７［２００１］；およびＨｏｎｇｅｔａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７３：１３３１［２００７］を参照されたい）。実際に、当技術分野で公知の任意の適した精製方法が、本発明において有用である。

酢酸キナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、逆相クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に依存し、これらは当業者に公知である。

一部の実施形態では、親和性技術は、改善された酢酸キナーゼ酵素を単離するために有用である。親和性クロマトグラフィー精製に関して、酢酸キナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体を産生するために、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるがこれらに限定されない様々な宿主動物を、酢酸キナーゼの注射によって免疫してもよい。酢酸キナーゼポリペプチドを、側鎖官能基によって、または側鎖官能基に付着するリンカーによって適した担体、例えばＢＳＡに付着させてもよい。フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に役立つヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍが挙げられるがこれらに限定されない様々なアジュバントを使用して、宿主種に応じて免疫応答を増加させてもよい。

一部の実施形態では、酢酸キナーゼバリアントは、粗製抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として酵素を発現する細胞の形態で調製および使用される。一部の実施形態では、酢酸キナーゼバリアントは、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）、粉末形態（例えば、アセトン粉末）として調製され、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、酢酸キナーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。

一部の実施形態では、酢酸キナーゼポリペプチドは、任意の適した固体基材に付着する。固体基材としては、固相、表面、および／または膜が挙げられるがこれらに限定されない。固相支持体としては、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそのコポリマーおよびグラフトが挙げられるがこれらに限定されない。固相支持体はまた、無機、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金属、例えば金または白金でもあり得る。基材の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固相支持体は多孔性または非多孔性であり得、膨張または非膨張特徴を有し得る。固相支持体は、ウェル、へこみ、または他の容器、器、特色、または位置の形態で構成され得る。複数の支持体を、試薬のロボット送達のために指定可能な、または検出方法および／もしくは機器によって、様々な位置にアレイ上に構成することができる。

一部の実施形態では、免疫学的方法を使用して、酢酸キナーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用してバリアント酢酸キナーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、配列番号１２、および／もしくは配列番号６００を含むポリペプチド、ならびに／またはその免疫原性断片に対して）惹起された抗体をビーズに固定し、バリアント酢酸キナーゼが結合する条件下で細胞培養培地と混合し、そして沈殿させる。関連するアプローチでは、免疫クロマトグラフィーは有用である。

一部の実施形態では、バリアント酢酸キナーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、バリアント酢酸キナーゼ配列を、精製促進ドメインに融合する。本明細書で使用される場合、用語「精製促進ドメイン」は、それが融合されるポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適した精製ドメインとしては、金属キレートペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン－トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ３７：７６７［１９８４］を参照されたい）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（例えば、ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐから入手可能なシステム）において利用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載の組成物および方法において使用することが企図される１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたポリヒスチジン領域に融合される本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー；例えば、Ｐｏｒａｔｈｅｔａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．、３：２６３－２８１［１９９２］を参照されたい）上での精製を容易にするが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのバリアント酢酸キナーゼポリペプチドを分離する手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）はまた、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド－アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ－融合体の場合ではグルタチオン－アガロース）への吸着後に、遊離リガンドの存在下での溶出によって溶解した細胞から容易に精製することができる。

したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現にとって適した条件下で操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能な宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書に記載の酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップを含む。

宿主細胞にとって適切な培養培地および成長条件は当技術分野で周知である。酵素ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適した方法が本発明において有用であると企図される。適した技術としては、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の様々な特色および実施形態を、以下の代表的な実施例において例証するが、これらは例証するためであって限定しないと意図される。

実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例証目的に限って提供され、本発明を限定すると解釈してはならない。実際に、以下に記載される試薬および装置の多くに関して様々な適した供給源が存在する。本発明は、任意の試薬または装置項目に関して任意の特定の供給源に限定されないと意図される。

以下の実験の開示において、以下の省略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（回転数／分）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（セ氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＲＨ（相対湿度）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－ｌ－チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス）；ＳＦＰ（振とうフラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（一般に使用される実験用Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＣｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ－ＵＶ（ＨＰＬＣ－紫外可視検出器）；１ＨＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（ＶａｒｉａｎＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（ＩｎｆｏｒｓＵＳＡＩｎｃ．、ＡｎｎａｐｏｌｉｓＪｕｎｃｔｉｏｎ、ＭＤ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。

（実施例１）
ｐＣＫ１１０９００における操作されたポリペプチドの産生
酢酸キナーゼ活性を有するＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａからの天然に存在する野生型ポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、その全体がこれにより参照により組み込まれる、米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）にクローニングし、その後ｌａｃプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ｆｈｕＡにおいて発現させた。

９６ウェルフォーマットにおいて、単一コロニーを採集し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬＣＡＭを含有するＬＢ１８０μＬ中、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で成長させた。一晩成長させた後、成長した培養物２０μＬを、３０μｇ／ｍＬＣＡＭと共にＴＢ３８０μＬを含有するディープウェルプレートに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％で成長させた。培養物の吸光度（ＯＤ_６００）が０．６～０．８に達すると、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加することによって、酢酸キナーゼ遺伝子の発現を誘導した。誘導後、成長を１８～２０時間継続させた。細胞を、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離によって採取し、培地を捨てた。細胞ペレットを使用の準備ができるまで－８０℃で保存した。アッセイを実施する前に、細胞ペレットを、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを有するｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウムを含有する溶解緩衝液４００μＬ中に再懸濁させた。プレートを、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で中等度の振とう速度で２時間攪拌した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、清澄化した上清を、以下に記載するＨＴＰアッセイ反応に使用した。

振とうフラスコ手順を使用して、操作された酢酸キナーゼポリペプチドの振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成することができ、これは本明細書に記載の生物触媒プロセスにおける二次スクリーニングアッセイおよび／または使用にとって役に立つ。酵素の振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）調製物は、ＨＴＰアッセイにおいて使用される細胞溶解物と比べてより精製された操作された酵素の調製物（例えば、総タンパク質の最大３０％）を提供し、またより濃縮された酵素溶液の使用を可能にする。培養を開始するために、目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬＣＡＭおよび１％グルコースを有するＬＢ５ｍＬに接種した。培養物を３０℃のインキュベーター内で２５０ｒｐｍで振とうさせながら一晩（少なくとも１６時間）成長させた。成長させた培養物を、１Ｌの振とうフラスコ中で３０μｇ／ｍＬＣＡＭを有するＴＢ２５０ｍＬ中で、最終ＯＤ_６００が０．０５となるように希釈した。培養物２５０ｍＬを３０℃、２５０ｒｐｍでＯＤ_６００が０．６～０．８に達するまで成長させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように添加することによって、酢酸キナーゼ遺伝子の発現を誘導し、成長をさらに１８～２０時間継続した。培養物を、予め重量を測定した遠心分離ボトルに移した後、７０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することによって細胞を採取した。上清を捨て、残った細胞ペレットの重量を測定した。一部の実施形態では、細胞を使用の準備ができるまで－８０℃で保存した。溶解するため、細胞ペレットを、細胞ペレット１ｇあたりｐＨ７．５の５０ｍＭ冷リン酸カリウム６ｍＬ中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、１１０ＬのＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して溶解した。細胞デブリを、４℃、１０，０００ｒｐｍで６０分間の遠心分離によって除去した。清澄化した溶解物を収集し、－８０℃で凍結した後、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して凍結乾燥した。凍結した清澄化した溶解物の凍結乾燥は、粗製の操作されたポリペプチドを含む乾燥振とうフラスコ粉末を提供する。

（実施例２）
改善された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）活性に関する配列番号２に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号２の酢酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を使用して、表２－１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、開始ポリペプチドと比べて所望の条件下で改善された酢酸キナーゼ活性（例えば、ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセルアルデヒドからエチニルグリセルアルデヒドリン酸産物への％変換によって測定される、ＡＤＰおよびアセチルリン酸を介したＡＴＰのリサイクリングを促進する能力）を示した。偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、ＨＴＰアッセイおよび表２－２に記載の分析方法と共に、以下に記載される配列番号２の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

定向進化を、配列番号１に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリを、様々な周知の技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の差の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイ、およびポリペプチドがＡＤＰおよびアセチルリン酸を介してＡＴＰのリサイクリングを促進する能力を測定する分析方法（ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセルアルデヒド基質からエチニルグリセルアルデヒドリン酸産物への変換を介して測定）を使用してスクリーニングした。

酵素アッセイは、９６ウェルフォーマットにおいて、ＨＴＰ酵素溶解物、最終濃度２０ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、２当量のアセチルリン酸、０．３ｇ／ＬのＡＴＰ、０．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号６９８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５を含む総体積５０μＬ／ウェルで実施した。以下を各ウェルに添加することによって、反応を実施した：（ｉ）４０ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、３００ｍＭのアセチルリン酸、０．６ｇ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号６９８）、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００ｍＭのリン酸カリウム（混合物のｐＨを７．８に調整した）を含有する溶液２５μＬ、（ｉｉ）０．３％（体積／体積）の希釈したＡｃＫＨＴＰ溶解物２５μＬ。反応プレートをヒートシールし、３０℃、６００ｒｐｍで一晩振とうした。

一晩（約１６時間）のインキュベート後、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム１００μＬを試料と混合した。別個のプレートにおいて、試料２０μＬを移し、１０ｇ／ＬのＯ－ベンジルヒドロキシルアミンのメタノール溶液１８０μＬと混合した。プレートをシールし、２５℃、４００ｒｐｍで２０～３０分間振とうさせた。試料をメタノール中でさらに４倍希釈した後、以下の表２－２に記載の方法を使用してＵＰＬＣ分析を行った。表２－１に示すデータは、指定された反応条件下で配列番号２によって形成された化合物５のピーク面積と比べた、バリアント酵素によって形成された化合物５のピーク面積として計算された配列番号２と比較した活性を反映する。

選択したヒットバリアントを、２５０ｍＬ振とうフラスコ中で成長させ、酵素粉末を生成した。酵素粉末の活性を、０．０００２～０．２ｇ／ＬのＳＦ粉末、３ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、２当量のアセチルリン酸、０．３ｇ／ＬのＡＴＰ、０．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号６９８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．８中、上記のアッセイと類似のアッセイを使用して３０℃、６００ｒｐｍで３時間において評価した。

（実施例３）
改善された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）活性に関する配列番号１２に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号１２の酢酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号１１）を使用して、表３－１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、開始ポリペプチドと比べて、所望の条件下で改善された酢酸キナーゼ活性（例えば、ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセルアルデヒドからエチニルグリセルアルデヒドリン酸産物への％変換によって測定されるＡＤＰおよびアセチルリン酸を介したＡＴＰのリサイクリングを促進する能力）を示した。偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、ＨＴＰアッセイおよび表２－２に記載の分析方法と共に、以下に記載される配列番号１２の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

定向進化を、配列番号１１に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリを、様々な周知の技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の差の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイ、およびポリペプチドがＡＤＰおよびアセチルリン酸を介してＡＴＰのリサイクリングを促進する能力を測定する分析方法（ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセルアルデヒド基質からエチニルグリセルアルデヒドリン酸産物への変換を介して測定）を使用してスクリーニングした。

酵素アッセイは、９６ウェルフォーマットにおいて、ＨＴＰ酵素溶解物、最終濃度２０ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、２当量のアセチルリン酸、０．３ｇ／ＬのＡＴＰ、０．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７００）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５を含む総体積５０μＬ／ウェルで実施した。反応を、以下を各ウェルに添加することによって実施した：（ｉ）４０ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、３００ｍＭのアセチルリン酸、０．６ｇ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７００）、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００ｍＭのリン酸カリウム（混合物のｐＨを７．８に調整した）を含有する溶液２５μＬ、（ｉｉ）０．３％（体積／体積）の希釈したＡｃＫＨＴＰ溶解物２５μＬ。反応プレートをヒートシールし、３０℃、６００ｒｐｍで一晩振とうした。

一晩（約１６時間）のインキュベートの後、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム１００μＬを試料と混合した。別個のプレートにおいて、試料２０μＬを移し、１０ｇ／ＬのＯ－ベンジルヒドロキシルアミンのメタノール溶液１８０μＬと混合した。プレートをシールし、２５℃、４００ｒｐｍで２０～３０分間振とうさせた。試料をメタノール中でさらに４倍希釈した後、表２－２に記載の方法を使用してＵＰＬＣ分析を行った。表３－１に示すデータは、指定された反応条件下で配列番号１２によって形成された化合物５のピーク面積と比べた、バリアント酵素によって形成された化合物５のピーク面積として計算された配列番号１２と比較した活性を反映する。

ヒットバリアントを、２５０ｍＬ振とうフラスコ中で成長させ、酵素粉末を生成した。酵素粉末の活性を、０．０００２～０．２ｇ／ＬのＳＦ粉末、３ｇ／Ｌのエチニルグリセルアルデヒド、２当量のアセチルリン酸、０．３ｇ／ＬのＡＴＰ、０．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７００）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．８中、上記のアッセイと類似のアッセイを使用して３０℃、６００ｒｐｍで３時間において評価した。

（実施例４）
改善された酢酸キナーゼ（ＡｃＫ）活性に関する配列番号６００に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号６００の酢酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５９９）を使用して、表４－１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、開始ポリペプチドと比較して、所望の条件下で改善された酢酸キナーゼ活性（例えば、ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセロールからエチニルグリセロールリン酸産物への％変換によって測定されるＡＤＰおよびアセチルリン酸を介したＡＴＰのリサイクリングを促進する能力）を示した。偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、アッセイおよび表４－２に記載の分析方法と共に、以下に記載される配列番号６００の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

定向進化を、配列番号５９９に記載のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリを、様々な周知の技術（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の差の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイ、およびポリペプチドがＡＤＰおよびアセチルリン酸を介してＡＴＰのリサイクリングを促進する能力を測定する分析方法（ＡＴＰ制限条件下でのエチニルグリセロール基質からエチニルグリセロールリン酸産物への変換を介して測定）を使用してスクリーニングした。

酵素アッセイは、９６ウェルフォーマットにおいて、ＨＴＰ酵素溶解物、最終濃度５０ｇ／Ｌのエチニルグリセロール、１．２５当量のアセチルリン酸、０．１モル％のＡＴＰ、０．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７０２）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのビストリス緩衝液ｐＨ７．０を含む総体積５０μＬ／ウェルで実施した。反応を、以下を各ウェルに添加することによって実施した：（ｉ）６２．５ｇ／Ｌのエチニルグリセロール、１．５６２５当量ｍＭのアセチルリン酸、０．１２５モル％ＬのＡＴＰ、０．６２５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７０２）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭビストリス緩衝液ｐＨ７．０を含有する溶液４０μＬ。最終マスターミックスのｐＨはｐＨ＝６．８であった（ｉｉ）５０倍希釈したＡｃＫＨＴＰ溶解物１０μＬ。反応プレートをヒートシールし、３０℃、６００ｒｐｍで一晩振とうした。

一晩（約１８時間）インキュベートした後、発色団含有種を産生させ、単純な反応のモニタリングを可能にするために、反応試料を、以下の条件で５，５’，５’’－［２，２’，２’’－ニトリロトリス（メチレン－トリス（１Ｈ－ベンズイミダゾール－２，１－ジイル））］トリペンタン酸３カリウム水和物、（（ＢｉｍＣ４Ａ）３）を使用して誘導体化した：５当量のベンジルアジド、５モル％の硫酸銅、７．５モル％の（ＢｉｍＣ４Ａ）３、２０モル％のアスコルビン酸ナトリウム、クリックケミストリーを達成するための９：１の水：ＤＭＳＯ。反応後、反応物５μＬを、新しい９６ウェルプレートにおいて（ＢｉｍＣ４Ａ）３誘導体化溶液２２０μＬと組み合わせた。クリックケミストリー反応を４５℃で１時間インキュベートした。次に試料を、ＵＰＬＣ－ＵＶ（表４－２）による分析のための調製において、０．２２ミクロンの９６ウェルフィルタープレートを使用して遠心分離によって濾過した。

ヒットバリアントを、２５０ｍＬ振とうフラスコ中で成長させ、酵素粉末を生成した。酵素粉末の活性を、０．０１２５～０．０５ｇ／ＬのＳＦ粉末、５０ｇ／Ｌのエチニルグリセロール、１．２５当量のアセチルリン酸、０．１モル％のＡＴＰ、０．２５～１．５ｇ／Ｌの操作されたパントテン酸キナーゼ（配列番号７０２）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭビストリス緩衝液ｐＨ７．０（最終マスターミックスのＰＨ＝６．８）、上記のアッセイと類似のアッセイを使用して３０℃、６００ｒｐｍで１８時間において評価した。振とうフラスコ粉末試験のデータを表４－１に示す。

特定の実施形態では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
配列番号２、配列番号１２、および／もしくは配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、前記操作された酢酸キナーゼが前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、配列番号１２、および／または配列番号６００を参照して番号付けられている、操作された酢酸キナーゼ。
（項目２）
配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、ここで前記操作された酢酸キナーゼが、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられている、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目３）
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、２９８、１２／２５９、１５、１６、１８、２３、２５、２６、３１、３２、３９、４０、４１、４４、４７、４７／４１１、５０、５１、５５、５８／１３５、５９、６４、７０、７６、７６／２３２／２６２、７６／２３２／３６４／３８６、７６／２７３、８５、９２、９６／１１９、１０１、１０２、１０４、１０７、１０８、１１６、１２２、１３５、１３５／３９２、１３６、１３７、１４０、１４１、１４３、１４４、１４５／４００、１５２、１５４、１５９、１６１、１６４、１８３、１９１、１９４、１９７、２１５、２１６、２２２、２２４、２２９、２３２、２３６、２５１、２５６、２５８、２５９／２８４、２６０、２６１、２６３／３９１、２６８、２７３、２７４、２７６、２８３、２８４、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９２、２９７、２９８／４０５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１７、３２２、３２３、３３７、３４６、３４７、３４８、３４９、３５１、３５２、３５２／４０５、３５４、３５５、３５６、３６２、３６６、３６８、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３８０、３８６、３９０、３９１、３９２、３９８、３９９、および４０７から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられている、項目２に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目４）
配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、ここで前記操作された酢酸キナーゼが前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けられている、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目５）
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、１５／７０／１５４／２９７／３５２／３５５、１５／１５４／１９１／２９７／２９８／３０１／３４８／３５２／３９１、１５／１５４／１９１／２９７／３５５、１５／１５４／２９７／２９８／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／２９７／２９８／３０１／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／２９８／３５２／３５５、１５／２９７／２９８／３５５、２３／１０１／１０２／１２２／１４０／１４３／３１６／３７２、２３／１０１／１０２／１４０、２３／１０１／３７４、２３／１２２／３１６／３７２／３７４、２３／１２２／３１６／３７４／３９５、２３／１４０／３１６／３７４、２９／１５４／１９１／２９８／３４８／３５５、５１／１０１／１０２／１３５／２４２／３１６／３７４、５１／１０１／３１６、７０／１５４／１６２／１９１／２９７／３０１／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／２９７／３５２、７０／１５４／１９１／２９８／３４８／３５２／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／２９８／３５２、７０／１５４／２９７／２９８／３４８／３５５、７０／１５４／２９７／３５２／３５５、７０／１９１／２９７／２９８／３５２／３９１、１０１／１０２／１２２／１４０／１４２／３１６／３７２／３７４、１０１／１３６／２４２／３７２、１０２／１３５／１４０／３１６、１０２／１３６／１４０／１４２／１４３／３１６、１０２／１４２／３１６、１２２／１４０／１４２／１６４／２４２、１２２／１４２／３１６、１２２／１４３／２４２／３７４、１３５／１３６／１４０／１４２／１４３／２４２／３１６／３７２／３７４、１３５／１４０／１４３／２４２／３７４／３９５、１３５／１４０／３１６、１３６／２４２、１４２／３１６、１４２／３１６／３７２／３７４、１４２／３１６／３７４、１４３／３１６、１５４／１９１／２９７／２９８、１５４／１９１／２９７／２９８／３０１／３５２／３５５、１５４／１９１／２９７／２９８／３５２、１５４／１９１／２９８／３０１／３４８／３５２／３９１、１５４／１９１／２９８／３４８／３５２、および１５４／２９７／２９８から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けられている、項目２に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目６）
配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、ここで前記操作された酢酸キナーゼが、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号６００を参照して番号付けられている、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目７）
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、２３／２４２／３７４、２３／３７４、７０／３７４、２４２／２９８、２４２／３７４、２９８／３７４、および３７４から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６００を参照して番号付けられている、項目２に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目８）
表２－１、表３－１、および／または表４－１に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目９）
配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１０）
配列番号１２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１１）
配列番号１２に記載の、バリアントの操作されたポリペプチドを含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１２）
配列番号６００と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１３）
配列番号６００に記載の、バリアントの操作されたポリペプチドを含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１４）
配列番号２～６９６の偶数番号の配列に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１５）
配列番号２～６９６の偶数番号の配列に記載のポリペプチド配列を含む、項目１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１６）
野生型Ｍ．ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ酢酸キナーゼと比べて少なくとも１つの改善された特性を含む、項目１～１５のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１７）
前記改善された特性が、野生型酢酸キナーゼと比べて、基質に対する改善された活性を含む、項目１６に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１８）
前記基質が、アデノシン二リン酸およびアセチルリン酸を含む、項目１７に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目１９）
前記改善された特性が、野生型酢酸キナーゼと比べて、アデノシン三リン酸の改善された産生を含む、項目１６に記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目２０）
精製されている、項目１～１９のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目２１）
ヌクレオシドアナログを産生するための多酵素系の一部である、項目１～２０のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
（項目２２）
項目１～２１のいずれかに記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを含む組成物。
（項目２３）
項目１～２１のいずれかに記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
（項目２４）
少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号１１、および／または配列番号５９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含み、前記操作された酢酸キナーゼの前記ポリヌクレオチド配列が１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
（項目２５）
配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードする、項目２３に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目２６）
配列番号１１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードする、項目２３に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目２７）
配列番号５９９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードする、項目２３に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目２８）
制御配列に作動可能に連結されている、項目２３～２７のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
（項目２９）
コドン最適化されている、項目２３～２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
（項目３０）
配列番号１～６９５の奇数番号の配列を含む、項目２３～２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
（項目３１）
項目２３～３０のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
（項目３２）
項目３１に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３３）
項目２３～３０のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
（項目３４）
宿主細胞において操作された酢酸キナーゼを産生させる方法であって、項目３２および／または３３に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼが産生されるように、適した条件下で培養することを含む、方法。
（項目３５）
少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを培養物および／または宿主細胞から回収することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを精製するステップをさらに含む、項目３４および／または３５に記載の方法。
本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的に関して個別に参照により本明細書に組み込まれることが指し示されているのと同程度に、全ての目的に関してその全体がこれにより参照により組み込まれる。

様々な具体的な実施形態を例証および説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変化を行うことができると認識される。

Claims

配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作された酢酸キナーゼであって、前記操作された酢酸キナーゼが、前記ポリペプチド配列において、２９８Ｆ、２９８Ｌ、２９８Ｋ、２９８Ｑ、２９８Ｔ、２９８Ｖおよび２９８Ｗからなる群より選択される、２９８位の少なくとも１つの置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられており、前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号２の野生型酢酸キナーゼと比べて、アデノシン三リン酸の改善された産生を含む、操作された酢酸キナーゼ。
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、１２／２５９、１５、１６、１８、２３、２５、２６、３１、３２、３９、４０、４１、４４、４７、４７／４１１、５０、５１、５５、５８／１３５、５９、６４、７０、７６、７６／２３２／２６２、７６／２３２／３６４／３８６、７６／２７３、８５、９２、９６／１１９、１０１、１０２、１０４、１０７、１０８、１１６、１２２、１３５、１３５／３９２、１３６、１３７、１４０、１４１、１４３、１４４、１４５／４００、１５２、１５４、１５９、１６１、１６４、１８３、１９１、１９４、１９７、２１５、２１６、２２２、２２４、２２９、２３２、２３６、２５１、２５６、２５８、２５９／２８４、２６０、２６１、２６３／３９１、２６８、２７３、２７４、２７６、２８３、２８４、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９２、２９７、４０５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１７、３２２、３２３、３３７、３４６、３４７、３４８、３４９、３５１、３５２、３５２／４０５、３５４、３５５、３５６、３６２、３６６、３６８、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３８０、３８６、３９０、３９１、３９２、３９８、３９９、および４０７から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットをさらに含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、ここで前記操作された酢酸キナーゼが前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、１５／７０／１５４／２９７／３５２／３５５、１５／１５４／１９１／２９７／３０１／３４８／３５２／３９１、１５／１５４／１９１／２９７／３５５、１５／１５４／２９７／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／２９７／３０１／３４８／３５２／３５５／３９１、１５／１９１／３５２／３５５、１５／２９７／３５５、２３／１０１／１０２／１２２／１４０／１４３／３１６／３７２、２３／１０１／１０２／１４０、２３／１０１／３７４、２３／１２２／３１６／３７２／３７４、２３／１２２／３１６／３７４／３９５、２３／１４０／３１６／３７４、２９／１５４／１９１／３４８／３５５、５１／１０１／１０２／１３５／２４２／３１６／３７４、５１／１０１／３１６、７０／１５４／１６２／１９１／２９７／３０１／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／２９７／３５２、７０／１５４／１９１／３４８／３５２／３５５／３９１、７０／１５４／１９１／３５２、７０／１５４／２９７／３４８／３５５、７０／１５４／２９７／３５２／３５５、７０／１９１／２９７／３５２／３９１、１０１／１０２／１２２／１４０／１４２／３１６／３７２／３７４、１０１／１３６／２４２／３７２、１０２／１３５／１４０／３１６、１０２／１３６／１４０／１４２／１４３／３１６、１０２／１４２／３１６、１２２／１４０／１４２／１６４／２４２、１２２／１４２／３１６、１２２／１４３／２４２／３７４、１３５／１３６／１４０／１４２／１４３／２４２／３１６／３７２／３７４、１３５／１４０／１４３／２４２／３７４／３９５、１３５／１４０／３１６、１３６／２４２、１４２／３１６、１４２／３１６／３７２／３７４、１４２／３１６／３７４、１４３／３１６、１５４／１９１／２９７、１５４／１９１／２９７／３０１／３５２／３５５、１５４／１９１／２９７／３５２、１５４／１９１／３０１／３４８／３５２／３９１、１５４／１９１／３４８／３５２、および１５４／２９７から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットをさらに含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号６００と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、ここで前記操作された酢酸キナーゼが、前記ポリペプチド配列において少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が配列番号６００を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号６００と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、２３／２４２／３７４、２３／３７４、７０／３７４、２４２、２４２／３７４、および３７４から選択される１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換または置換セットをさらに含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６００を参照して番号付けられている、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号１２に記載の、バリアントの操作されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号６００と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号６００に記載の、バリアントの操作されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号４～１４、２２、６４および５９２～６９６の偶数番号の配列に記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼバリアントの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
配列番号４～１４、２２、６４および５９２～６９６の偶数番号の配列に記載のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作された酢酸キナーゼ。
野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ酢酸キナーゼと比べて少なくとも１つの改善された特性をさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
前記改善された特性が、野生型酢酸キナーゼと比べて、基質に対する改善された活性を含む、請求項１４に記載の操作された酢酸キナーゼ。
前記基質が、アデノシン二リン酸およびアセチルリン酸を含む、請求項１５に記載の操作された酢酸キナーゼ。
精製されている、請求項１～１６のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
ヌクレオシドアナログを産生するための多酵素系の一部である、請求項１～１７のいずれかに記載の操作された酢酸キナーゼ。
請求項１～１８のいずれかに記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを含む組成物。
請求項１～１８のいずれかに記載の少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド。
少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性のポリヌクレオチド配列を含み、前記操作された酢酸キナーゼの前記ポリヌクレオチド配列が１つまたは複数の位置で少なくとも１つの置換を含み、前記操作された酢酸キナーゼが、２９８Ｆ、２９８Ｌ、２９８Ｋ、２９８Ｑ、２９８Ｔ、２９８Ｖおよび２９８Ｗからなる群より選択される、ポリペプチド配列の２９８位における少なくとも１つの置換を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けられており、前記操作された酢酸キナーゼが、配列番号２の野生型酢酸キナーゼと比べて、アデノシン三リン酸の改善された産生を含む、ポリヌクレオチド。
配列番号１１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
配列番号５９９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼまたはその機能的断片をコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
制御配列に作動可能に連結されている、請求項２０～２３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
コドン最適化されている、請求項２０～２４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
配列番号３～１３、２１、６３および５９１～６９５の奇数番号の配列を含む、請求項２０～２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
請求項２０～２６のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項２７に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
請求項２０～２６のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
宿主細胞において操作された酢酸キナーゼを産生させる方法であって、請求項２８および／または２９に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼが産生されるように、適した条件下で培養することを含む、方法。
少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを培養物および／または宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
前記少なくとも１つの操作された酢酸キナーゼを精製するステップをさらに含む、請求項３０および／または３１に記載の方法。