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JP7727029B2 - アデノ随伴ウイルスの肝臓特異的向性 - Google Patents
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JP7727029B2 - アデノ随伴ウイルスの肝臓特異的向性 - Google Patents

アデノ随伴ウイルスの肝臓特異的向性

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JP7727029B2 JP2024020029A JP2024020029A JP7727029B2 JP 7727029 B2 JP7727029 B2 JP 7727029B2 JP 2024020029 A JP2024020029 A JP 2024020029A JP 2024020029 A JP2024020029 A JP 2024020029A JP 7727029 B2 JP7727029 B2 JP 7727029B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月３０日出願の米国特許仮出願第６２／８４１，１７９号およ
び２０１８年５月１１日出願の米国特許仮出願第６２／６７０，５４３号に対する優先権
を主張する。
本開示は、一般に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の組織向性の変更、および詳細には
、ＡＡＶの肝臓向性の制御に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス（Parvoviridae）の科に属するディ
ペンドパルボウイルス（Dependoparvovirus）属に属する、小型のウイルスである。この
ウイルスは、複製欠損のエンベロープを有しないウイルスであり、感染するが、ヒトおよ
びある特定の霊長類種において疾患を生じることは知られていない。ＡＡＶは、分裂およ
び静止細胞の両方に感染し、天然のウイルスでは、ウイルスが有する遺伝子の宿主ゲノム
への組込みが生じ得る場合があるが、宿主細胞のゲノムに組み込まれずに染色体外の状態
で存続することができる。このような特徴により、ＡＡＶは、ウイルスベクターとしての
遺伝子治療における使用の候補となっている。しかし、ある特定のＡＡＶ血清型は、治療
する疾患に応じて、望ましい場合も望ましくない場合もある肝臓向性を示す。
ＡＡＶ肝臓向性が、どのように決定されるかを理解し、この情報に基づいてＡＡＶの向
性を操作可能とすることは、有益である。
ＡＡＶの組織特異性、すなわち、組織向性は、カプシド血清型により決定され、本明細
書に記載する方法および組成物は、特異性を有する特定のＡＡＶの組織向性を変更して、
変更されたこのようなＡＡＶにより送達される治療を改善することを可能とする。例えば
、ＡＡＶの肝臓向性を変更または変化させることは、例えば、肝臓が所望の標的である場
合、例えば、天然の肝臓向性を向上させることにより、また、肝臓が所望の標的ではない
場合、例えば、天然の肝臓向性を低下させることにより、有益となり得る。例えば、この
ウイルスを肝臓（または非肝臓臓器）の細胞に、より効果的に送達し、より効率的にトラ
ンスフェクトする場合、より低用量の所与のＡＡＶを対象に投与することができる。
一態様において、本開示では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの組織向性を変
更する方法を提供する。このような方法は、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパ
ク質における２６６位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置を位置づけ
るステップと、位置づけられた位置の天然に存在するアミノ酸を、グリシン（Ｇ）アミノ
酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性の向上をもたらすか、またはア
ラニン（Ａ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶの肝臓向性を低下させる、すな
わち、肝臓の脱標的化をもたらすステップとを典型的に含む。
一部の実施形態において、このような方法は、位置づけられた位置の天然に存在するア
ミノ酸をＧアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性の向上、例え
ば、肝臓での濃縮をもたらすステップを含む。一部の実施形態において、このような方法
は、位置づけられた位置の天然に存在するアミノ酸をＡアミノ酸残基と置き換えて、得ら
れるＡＡＶの肝臓向性の低下、例えば、肝臓の脱標的化をもたらすステップを含む。
別の態様において、本開示では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの組織向性を
変更する方法を提供する。このような方法は、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタン
パク質における１６８位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置を位置づ
けるステップと、および位置づけられた位置の天然に存在するアミノ酸を、アルギニン（
Ｒ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性の向上、例えば、肝
臓での濃縮をもたらすか、またはリジン（Ｋ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡ
Ｖの肝臓向性の低下、例えば、肝臓の脱標的化をもたらすステップとを典型的に含む。
一部の実施形態において、このような方法は、位置づけられた位置の天然に存在するア
ミノ酸をＲアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓での濃縮をもたら
すステップを含む。一部の実施形態において、このような方法は、位置づけられた位置の
天然に存在するアミノ酸をＫアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶの肝臓標的化の
低下をもたらすステップを含み得る。
別の態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの組織向性を変更する方法
を提供する。このような方法は、図１４に定義する肝臓トグル領域をＡＡＶカプシドタン
パク質内に位置づけるステップと、天然に存在する肝臓トグル領域を、異種血清型由来の
肝臓トグル領域またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の配列と置き換えて、得られるＡＡＶベクター
の肝臓向性を変更する、例えば、肝臓標的化の向上または低下をもたらすステップとを典
型的に含む。
一部の実施形態において、異種またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の肝臓トグル領域が、Ａｎｃ
８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応するＡＡＶカプシドタ
ンパク質内の位置にＧアミノ酸残基を含む場合、得られるＡＡＶベクターの肝臓での濃縮
がもたらされる。一部の実施形態において、異種またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の肝臓トグル
領域が、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応するＡ
ＡＶカプシドタンパク質内の位置にＡアミノ酸残基を含む場合、得られるＡＡＶベクター
の肝臓標的化の低下がもたらされる。
一部の実施形態において、置き換えるステップは、現存の、もしくはｄｅ ｎｏｖｏ合
成したＤＮＡの部位特異的変異誘発、制限分解およびライゲーション、現存の、もしくは
ｄｅ ｎｏｖｏ合成したＤＮＡの相同性による会合、またはこれらの組合せを使用して実
施する。一部の実施形態において、位置づけるステップは、シーケンシングすることによ
り実施する。
別の態様において、本開示では、肝臓へのトランスフェクションが強化または低下され
たＡＡＶをスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、ＡＡＶカプシドタン
パク質をコードする核酸をシーケンシングするステップと、Ａｎｃ８０（配列番号１）の
カプシドタンパク質における２６６位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸
位置を位置づけるステップと、位置づけられた位置にＧアミノ酸残基または位置づけられ
た位置にＡアミノ酸残基を有するＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップとを典型
的に含む。一般には、位置づけられた位置のＧアミノ酸残基は、肝臓へのトランスフェク
ションが強化されたＡＡＶを示し、一方、位置づけられた位置のＡアミノ酸残基は、肝臓
へのトランスフェクションが低下されたＡＡＶを示す。
別の態様において、本開示では、肝臓へのトランスフェクションが強化または低下され
たＡＡＶをスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、ＡＡＶカプシドタン
パク質をコードする核酸をシーケンシングするステップと、Ａｎｃ８０（配列番号１）の
カプシドタンパク質における１６８位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸
位置を位置づけるステップと、位置づけられた位置にＲアミノ酸残基または位置づけられ
た位置にＫアミノ酸残基を有するＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップとを典型
的に含む。一般には、位置づけられた位置のＲアミノ酸残基は、肝臓へのトランスフェク
ションが強化されたＡＡＶを示し、一方、位置づけられた位置のＫアミノ酸残基は、肝臓
へのトランスフェクションが低下されたＡＡＶを示す。
また別の態様において、本開示では、２６６位のＸ３が、ＧまたはＡから選択される、
配列番号１［Ａｎｃ８０］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、１６８位のＸ１が、ＲまたはＫから選択される、配列
番号１［Ａｎｃ８０］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号２［Ａｎｃ８０Ｌ６５］に示す配列を有する
ＡＡＶを提供する。
さらに別の態様において、本開示では、配列番号３［Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ］
に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号４［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ］に示す配列を有
するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号５［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔ］に
示す配列を有するＡＡＶを提供する。
また別の態様において、本開示では、配列番号６［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲ
Ｉ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号７［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６
Ａ－ＶＲＩ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号８［ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ］に示す配列を
有するＡＡＶを提供する。
さらに別の態様において、本開示では、配列番号９［ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６
７ Ｎ２６８Ｔ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号１０［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ａ］
に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
また別の態様において、本開示では、配列番号１１［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６
Ｇ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号１２［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ａ
Ｓ２６８Ｔ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号１３［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇ
Ｓ２６８Ｔ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
また別の態様において、本開示では、配列番号１４［ＡＡＶ３Ｂ ＡＡＶ９－ＶＲＩ］
に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号１５［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲ
Ｉ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
さらに別の態様において、本開示では、配列番号１６［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５
Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ］に示す配列を有するＡＡＶを提供する。
別の態様において、本開示では、配列番号１７［Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｒ１６８Ｋ］に示
す配列を有するＡＡＶを提供する。
本明細書において使用する場合、「組織向性」は、特定のＡＡＶによる細胞の感染およ
び／またはトランスフェクションに対する天然の組織特異性を指す。例えば、多くのＡＡ
Ｖは肝臓向性を示し、これはこのようなＡＡＶが、他の組織型の細胞ではなく肝細胞に選
択的に感染および／またはトランスフェクトすることを意味する。組織向性は、特定の組
織の細胞の表面および／または特定のＡＡＶの表面に見出される特定の表面タンパク質、
例えば、受容体タンパク質に基づくことが多い。
本明細書において使用する場合、「トグル」は、そのＡＡＶの組織向性と関連するＡＡ
Ｖカプシドタンパク質内の特定の位置または領域を指す。このため、本明細書に記載する
トグル位置または領域に天然に存在するアミノ酸を異なるアミノ酸と置き換える場合、こ
のＡＡＶの組織向性は、変更される。したがって、「肝臓トグル」、例えば、「肝臓トグ
ル１」は、トランスフェクションが、肝細胞へ他よりも優位にもしくは本質的に完全に生
じるか、または肝細胞へ他よりも優位にもしくは本質的に完全に生じないように「切り替
える」ことが可能な残基を指す。
また、本明細書において使用する場合、「肝臓トグル領域」は、図１４に定義するよう
に、「肝臓トグル」が存在する２つのベータ鎖間に位置するアミノ酸残基２０個を指す。
したがって、「肝臓トグル領域」は、トランスフェクションが、肝細胞へ他よりも優位に
もしくは本質的に完全に生じるか、または肝細胞へ他よりも優位にもしくは本質的に完全
に生じないように、異種ＡＡＶまたはｄｅ ｎｏｖｏ由来物からの移入により「切り替え
る」ことが可能な連続した一連の残基を指す。肝臓トグル領域は、可変領域Ｉ（ＶＲＩ）
と重複するため、すべてのトグル領域スワップでは、略称としてこの用語を使用する。
本明細書において使用する場合、「トグル２」は、「トグル１」に非依存的な切替えを
指す。したがって、「肝臓トグル２」は、肝臓トグル１において問題の残基とは異なり、
トランスフェクションが、肝細胞へ他よりも優位にもしくは本質的に完全に生じるか、ま
たは肝細胞へ他よりも優位にもしくは本質的に完全に生じないように「切り替える」こと
が可能な別の残基を指す。
他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、
本発明の方法および組成物が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一
の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の方
法および組成物の実践または試験において使用することができるが、適する方法および材
料は、以下に記載する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限
することを意図しない。本明細書において言及するすべての公表文献、特許出願、特許、
および他の参照は、これらの全体を参照により組み込む。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面
を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じ
て庁より提供されるだろう。
ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングに利用する２１１（２０４８）バリアントＡｎｃ８０ライブラリーを生成するように変更した位置１１個を示すＡｎｃ８０足場配列（配列番号１）である。強調したＸ１位およびＸ３位は、肝臓トグル位置であると決定され、Ａｎｃ８０カプシド配列の残基１６８および２６６に対応する。Ｘ３の残基は、ベクターが遺伝子を肝細胞に効率的に送達するかどうかを定義する優位な位置であり、このため「肝臓トグル」または「トグル」と呼ぶ。位置Ｘ１は、本明細書において「トグル２」と呼ぶ。 図２Ａおよび２ＢはｍそれぞれＡｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２）およびＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号３）のアミノ酸配列である。両配列は、肝臓トグルを除いて同一である。核酸およびタンパク質の両配列におけるグリシン（Ｇ）／アラニン（Ａ）肝臓トグルは、太字として下線を引く。 図３Ａおよび３Ｂは、それぞれＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ（配列番号４）およびＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔ（配列番号５）のアミノ酸配列の提示である。このような配列は、ＡＡＶ９における肝臓トグルの同定および変更、ならびにＡｎｃ８０Ｌ６５における対応する位置を適合させるための、後者におけるさらなる変更を表す。ＡＡＶ９から変更された残基は、太字として下線を引く。 図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ（配列番号６）およびＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ（配列番号７）のアミノ酸配列の提示である。このような配列は、肝臓濃縮および肝臓脱標的化の両方を行う肝臓トグル領域の、Ａｎｃ８０Ｌ６５からＡＡＶ９への移入を表す。移入された配列は、太字として下線を引く。 図５Ａおよび５Ｂは、それぞれＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ（配列番号８）およびＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６７＿Ｎ２６８Ｔ（配列番号９）の配列である。Ａｎｃ８０肝臓トグル領域と比較して短縮され、同定が不確実となるが、ＡＡＶ３ＢのＡ２６６は、この血清型における肝臓トグルを表し得る。ＡＡＶ３Ｂにより、マウス肝臓が不十分に形質導入され、Ａ２６６Ｇの変更により、この機能が向上し得ることを示唆する。Ｔを挿入すると、Ａｎｃ８０とのさらに高い同一性を有する肝臓トグル領域が生成される。ＡＡＶ３Ｂから変更されたか、または挿入された残基は、太字として下線を引く。 図６Ａおよび６Ｂは、それぞれＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５＿Ａ２６６Ａ（配列番号１０）およびＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５＿Ａ２６６Ｇ（配列番号１１）の配列である。ＡＡＶ３Ｂの肝臓トグル領域は、Ａｎｃ８０肝臓トグル領域と比較して短縮される。Ａｎｃ８０における対応する位置からの肝臓濃縮Ｇまたは肝臓脱標的化Ａの挿入により、この機能を移入し得る。ＡＡＶ３Ｂから変更されたか、または挿入された残基には、太字として下線を引く。 図７Ａおよび７Ｂは、それぞれＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５＿Ａ２６６Ａ Ｓ２６８Ｔ（配列番号１２）およびＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５＿Ａ２６６Ｇ Ｓ２６８Ｔ（配列番号１３）の配列である。ＡＡＶ３Ｂの肝臓トグル領域は、Ａｎｃ８０肝臓トグル領域と比較して短縮される。Ａｎｃ８０の対応する位置からの肝臓濃縮Ｇまたは肝臓脱標的化Ａの挿入により、この機能を移入し得る。２６８位のＳをＴへ変更すると、Ａｎｃ８０とのさらに高い同一性を有する領域が生成される。ＡＡＶ３Ｂから変更されたか、または挿入された残基は、太字として下線を引く。 図８Ａ～８Ｃは、それぞれＡＡＶ３Ｂ ＡＡＶ９－ＶＲＩ（配列番号１４）、ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ（配列番号１５）、およびＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ（配列番号１６）の配列である。このような配列は、肝臓濃縮および肝臓脱標的化の両方を行う肝臓トグル領域の、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０Ｌ６５、およびＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６ＡからＡＡＶ３Ｂへの移入を表す。移入された配列は、太字として下線を引く。 肝臓における２０４８ Ａｎｃ８０ライブラリーメンバーの存在量を、Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスにおけるウイルスインプットに対して示すＭＡプロットである。ｙ軸では、ゼロは、インプットの変化がないことを示し、正および負の値は、相対的濃縮または脱標的化をそれぞれ示す。トグル位置１１個のうちＸ３位は、観察された二峰性と相関する。 、非ヒト霊長類のアカゲザルにおけるウイルスインプットに対する、肝臓における２０４８ Ａｎｃ８０ライブラリーメンバーの存在量を示すＭＡプロットである。ｙ軸では、ゼロは、インプットからの変化がないことを示し、正および負の値は、相対的濃縮または脱標的化をそれぞれ示す。マウス肝臓と同様に、トグル位置１１個のうちＸ３位は、観察された二峰性と相関する。 マウス肝臓におけるＡｎｃ８０肝臓トグルのクローン検証を例示する棒グラフである。Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２）とＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号３）の両方を、ｅＧＦＰ発現ゲノムＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＦＦ２Ａ．ｈＡ１ＡＴ．ＲＧＢを用いた三重トランスフェクションにより生成した。このようなベクターをマウス５匹のそれぞれに１．２５ｅ１２ｇｃ／ｋｇの用量で注射し、３日後にマウスを屠殺した。回収した肝臓の体内分布によって、Ａｎｃ８０Ｌ６５トグル「オン」ベクターにおいて、Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａトグル「オフ」ベクターに対して、１細胞あたり１００×のｅＧＦＰコードゲノムの濃縮が明らかとなった。 図１２Ａ～１２Ｋは、一連の顕微鏡画像１１種であり、マウス１０匹に加えて図１１の注射なしの対照マウス１匹の肝臓におけるｅＧＦＰ染色の結果を例示する。Ａｎｃ８０Ｌ６５トグル「オン」ベクターを注射したマウスの肝臓において、Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａトグル「オフ」ベクターに対して、顕著に高いｅＧＦＰ染色が存在する。 図１３Ａは、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ＶＰ３カプシド単量体の結晶構造の模式図である。肝臓トグル（「ＬＴ」）の位置は、矢印により示し、ＬＴを包含する領域の構造は、四角で囲む。図１３Ｂは、ＡＡＶ２、３、６、８および９のＬＴ領域のオーバーレイを示し、トグル位置を定義する局所的二次構造を強調する、結晶構造の模式図である。トグル領域は、β上行（βａ）およびβ下行（βｄ）の二次構造間に位置して、これらの二次構造を含み、αトグル（αｔ）に対して残基２～３個分Ｎ末端にコードされる主要な官能基を有する、残基として定義する。ＬＴ残基は、残基３個のアルファヘリックスに対してＮ末端の、ベータシート結合ループであるＶＲ１内に位置する。 ＡＡＶクレードおよびクローンの原型（例えば、１、４、８～１０および１３行目）、ＡＡＶの臨床的に適合する血清型（天然に存在する血清型と改変した血清型の両方；例えば、２、３、５～７、１１および１２行目）、およびＡｎｃバリアント（例えば、１４～２２行目）の配列アラインメントである。１～２２行目は、配列番号１８～３９に対応する。ｂ上行（ｂａ）、ｂ下行（ｂｄ）、ａトグル（ａｔ）、トグル領域、およびトグル位置自体の位置を示す。ｂ上行（ｂａ）は、保存されたチロシンにおいて開始し、ｂ下行（ｂｄ）は、保存されたセリンにおいて終止する。トグルは、Ａｎｃ８０Ｌ６５において残基２６６、ＡＡＶ９において残基２６７、およびＡＡＶ５において残基２５７を表し、位置番号はトグルを定義する場合に相対的であることが強調される。 Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ９血清型、ならびに肝臓トグルの仮説を試験するために構築したバリアントのＣ末端におけるａトグル（ＮＤＮ）に方向づけられた、肝臓トグル領域配列（配列番号４０～５５、上から下）の表である。最後の２列では、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ９のマウスおよび霊長類の肝臓における既知の「オン」または「オフ」形質導入効率を列挙し、バリアントについてのｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、本明細書において太字で説明する。非試験バリアントについての仮説により予想された効率は、イタリック体で示す。 肝臓トグル領域の異種ＡＡＶ Ｃａｐへの移植性を試験して、単一残基トグルの知見をさらに試験するための方法を示す模式図である。領域に隣接するのは、「スワップ」領域の相同性特異的会合に適する２つの保存されたドメインである。配列番号８６。 「スワップした」肝臓トグル領域（配列番号５６～６３、上から下）を有するバリアントの肝臓形質導入効率の予想を示す表（図１５と類似）である。最後の２列では、本明細書において説明するように、このようなバリアントについて、マウス肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで決定した「オン」または「オフ」形質導入効率を太字で列挙する。非試験バリアントについての仮説により予想された効率は、イタリック体で示す。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９をベースとする肝臓トグルバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入効率を説明する棒グラフである。バリアントは、２９３細胞の三重トランスフェクションにより生成し、ＣＭＶルシフェラーゼをコードするゲノムにパッケージングした。バリアントは、力価測定した後、１００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）でＨｕｈ７細胞に加えた。Ｈｕｈ７細胞は、肝臓癌細胞株であり、正規化ＲＬＵにより説明する形質導入効率は、バリアントが肝臓「オン」であったか、または「オフ」であったか、のおよその指標として解釈され得る。天然ＡＡＶ９ Ｇ２６７をＡに変更すると（配列番号４）、Ｈｕｈ７細胞の形質導入効率が著しく低下し、二重変異体Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔ（配列番号５）も同様に低下した。ＡＡＶ９は、肝臓トグル領域スワップに良好には耐容性を示さないと考えられるが、トグルは、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号６）およびＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号７）のバリアントの相対的効率によって明らかとなり得る。 図１９Ａおよび１９Ｂは、ＡＡＶ３ＢおよびＡＡＶ３Ｂをベースとする肝臓トグルバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入効率を説明する棒グラフである。バリアントは、２９３細胞の三重トランスフェクションにより生成し、ＣＭＶルシフェラーゼをコードするゲノムにパッケージングした。バリアントは、力価測定した後、１００，０００のＭＯＩでＨｕｈ７細胞に加えた。Ｈｕｈ７細胞は、肝臓癌細胞株であり、正規化ＲＬＵにより説明する形質導入効率は、バリアントが肝臓「オン」であったか、または「オフ」であったかのおよその指標として解釈され得る。天然ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６をＧに変更すると（配列番号８）、Ｈｕｈ７細胞の形質導入効率が予想外に著しく低下したが、Ａｎｃ８０Ｌ６５の対応する位置にＴを挿入すると（配列番号９）、このバリアントが救出されて、ＡＡＶ３Ｂを凌いだ。同様に、Ａ（配列番号１０）またはＧ（配列番号１１）をＡ２６６の前に挿入し、Ｓ２６８Ｔを変更または変更しない場合（配列番号１２および配列番号１３）、＋Ｇ「オン」両バリアントを有する肝臓トグル様効率パターンが生じて、ＡＡＶ３Ｂを凌ぐ。ＡＡＶ３Ｂは、肝臓トグル領域スワップに良好な耐容性を示し、トグルは、肝臓「オン」ＡＡＶ９バリアント（配列番号１４）、ならびにＡｎｃ８０Ｌ６５（配列番号１５）およびＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号１６）のバリアントの相対的効率によって明らかとなる。 図２０Ａ～２０Ｃは、ＡＡＶ９ならびにＡＡＶ９をベースとするバリアントＧ２６７ＡおよびＧ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔを注射したマウスによる、ルシフェラーゼのｉｎ ｖｉｖｏでの動態学的発現の結果を示すグラフである。マウスは、５７日間経過観察し、期間中、生存中のイメージングを行った。対象領域は、全体、肝臓、および臀部（大腿および尻の主要筋群）として定義した。肝臓「オフ」ＡＡＶ９両バリアントは、肝臓領域において非常に低い放射輝度が観察されたが、ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔは、ＡＡＶ９に相当する全体的総放射輝度を有する。この二重変異体は、臀部領域からのこの総放射輝度の大半を生成し得る。 図２１Ａ～２１Ｆは、ｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ実験により観察されたデータを裏付ける棒グラフである。ＧＦＰ発現ベクターＡＡＶ９、ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ、またはＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔを注射したマウスを、注射後２８日に屠殺し、ｅＧＦＰ含有ゲノム（ＤＮＡ）とｅＧＦＰ発現（ＲＮＡ）の両方の体内分布を実施した。肝細胞「オフ」両変異体は、肝臓においては、３桁低いＤＮＡおよびＲＮＡレベルを有したが（図２１Ａ～２１Ｂ）、心臓細胞においては、ＡＡＶ９ Ｇ２６７ＡおよびＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔは、ＡＡＶ９と同等であった（図２１Ｃ～２１Ｄ）。有意なことには、四頭筋細胞においては、ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔは、ＡＡＶ９の遺伝子送達および遺伝子発現の両レベルを上回った（図２１Ｅ～２１Ｆ）。 図２１－１の続きである。 図２２Ａおよび２２Ｂは、ＡＡＶ３ＢもしくはＡＡＶ３ＢをベースとするバリアントＧ２６５＿Ａ２６６Ａ、Ｇ２６５＿Ａ２６６Ｇ、Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ、Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ、またはＡＡＶ９を注射したマウスによる、ルシフェラーゼのｉｎ ｖｉｖｏでの動態学的発現の結果を示すグラフである。マウスは、２９日間経過観察し、期間中、生存中のイメージングを行った。対象領域は、全体および肝臓として定義した。ＡＡＶ３Ｂの肝臓「オン」バリアントはともに、肝臓「オフ」対応物よりも高い放射輝度に発光し、トグルの仮説を裏付けた。実際、肝臓「オフ」ＡＡＶ３Ｂ両バリアントは、肝臓領域において非常に低い放射輝度が観察される。興味深いことには、Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ変異体は、野生型ＡＡＶ３Ｂと同等の能力を有したが、有意なことには、グリシンを単純挿入すると、肝臓領域シグナルをＡＡＶ９と等しくしたベクターが生成される。バリアントがＡＡＶ９と、やはり適合する総シグナルは、ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇシグナルの大半が、肝臓から生じることを示唆する。 配列Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｒ２６６Ｋ（配列番号１７）である。配列は、肝臓トグル２を除いてＡｎｃ８０Ｌ６５と同一である。アルギニン（Ｒ）／リジン（Ｋ）肝臓トグルを強調する。 ＡＡＶクレードおよびクローンの原型（例えば、１、４、８～１０および１３行目）、ＡＡＶの臨床的に適合する血清型（天然に存在する血清型と改変した血清型の両方；例えば、２、３、５～７、１１および１２行目）、およびＡｎｃバリアント（例えば、１４～２２行目）の配列アラインメントである。１～２２行目は、配列番号６４～８５に対応する。肝臓トグル２の位置、保存されたプロリンおよびリジンの方向づけ、ならびにＶＰ２の非標準開始コドンを示す。肝臓トグル２は、Ａｎｃ８０Ｌ６５およびＡＡＶ９の残基１６８、ならびにＡＡＶ５の残基１５１を表し、位置番号はトグルを定義する場合に相対的であることが強調される。 図２５Ａおよび２５Ｂは、グラフおよびヒートマップの提示である。図２５Ａでは、左に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス肝細胞における２０４８ Ａｎｃ８０ライブラリーメンバーの存在量を示すＭＡプロットを表し、図２５Ｂでは、左に、２８日目のウイルスインプットに対する異種移植ＦＲＧマウスモデルのＭＡプロットを表す。このような細胞において濃縮されたバリアントを四角で囲み、トグル位置各１１個の同一性を、両図の右に「ヒートマップ」により示す。トグル位置１１個のうち肝臓トグルＸ３位は、濃縮と相関する。Ｘ１位トグル２、状態１もまた、濃縮と相関し、最も濃縮されたバリアントにおいては顕著である。 図２６Ａ～２６Ｃは、左に、動物およびｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける、ウイルスインプットに対する２８日目のＮＨＰ（図２６Ａ）、２８日目の異種移植ＦＲＧマウスモデル（図２６Ｂ）、および３日目のヒト肝細胞（図２６Ｃ）の２０４８ Ａｎｃ８０ライブラリーメンバーの存在量を示す３つのＭＡプロットである。このような細胞において濃縮されたバリアントを四角で囲み、トグル位置各１１個の同一性を、各図の右に「ヒートマップ」により示す。トグル位置１１個のうち肝臓トグルＸ３位は、濃縮と相関する。Ｘ１位置トグル２、状態１もまた、濃縮と相関し、最も濃縮されたバリアントにおいては顕著である。 図２６－１の続きである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本来、肝臓向性である。この向性は、肝臓病因を有
する疾患に対する遺伝子治療処置にとっての利点であるが、この臓器に効果的に形質導入
するのに必要とされるゲノム含有ウイルス粒子の数は、患者と提供者の両方に負担をそれ
でもなおもたらし得る。対照的に、非肝臓病因を有する疾患の関連する治療は、ＡＡＶに
より送達される治療物質のほとんどにおいて肝臓がシンクとして作用するため、効果が低
いか、または高用量の投薬を必要とし得る。加えて、有望なＡＡＶ血清型は、マウス肝臓
に効率的には形質導入せず、臨床的適合性および投薬試験のためのマウスモデルの使用を
著しく制限する。
向性と相関するＡＡＶ配列を同定するこれまでの手法は、肝臓向性を定義するモチーフ
を同定するのに、例えば、高度に関連する現存の血清型の、明確な特性との比較、無関係
な血清型間のランダムドメインスワップ、または高次構造の考察に依存している。例えば
、ＡＡＶ向性の決定基のマッピングは、高度に関連する血清型を比較することにより行わ
れている。１つのこのような例は、ＡＡＶ１とＡＡＶ６との間の単一アミノ酸の変異（Ｅ
５３１Ｋ）であり、これによりＡＡＶ１によるマウス肝臓形質導入が向上する（Wu et al
., 2006, J. Virol., 80(22):11393-7）。別の例は、ＡＡＶ２とＡＡＶ８との間のドメイ
ンの相反的スワップであり、これにより向性が変更されるが、いかなる安定な特異的組織
標的モチーフも定義することができなかった（Raupp et al., 2012, J. Virol., 86(17):
9396-408）。さらに、構造の全体的考察は、良好または不良な肝臓形質導入物質間の全体
的な差異のみを強調しており、実践において有用であるというよりも観察的なものである
（Nam et al., 2007, J. Virol., 81(22):12260-71）。
ＡＡＶカプシドタンパク質における肝臓トグルの同定
本開示では、二峰性マウス肝臓向性を生じる、単一部位におけるアミノ酸（例えば、「
肝臓トグル」）の変異を同定するための、合理的にデザインされたＡＡＶカプシドライブ
ラリーのスクリーニングを記載する。また、本開示では、ａ）ヒトにおける肝臓形質導入
を向上させるか、または必要に応じて、肝臓を脱標的化し、これにより有効用量を低下さ
せることが可能となり、ｂ）マウス肝臓形質導入を向上させると同時に、他の好ましい特
性を最小限に変更し、このような血清型をマウス疾患モデルにおいて使用することが可能
となる、ＡＡＶカプシドにおける特異的残基を記載する。
本明細書に記載するように、ＡＡＶカプシドタンパク質の肝臓特異的向性は、Ａｎｃ８
０（配列番号１）の２６６位の１つの残基を変異させることにより変更することができる
。例えば、この位置の非グリシン（Ｇ）アミノ酸残基をグリシン（Ｇ）アミノ酸残基に変
異させると、ＡＡＶの肝臓に対する向性または標的化の向上または上昇が生じるか、ある
いは、この位置の非アラニン（Ａ）アミノ酸残基をアラニン（Ａ）アミノ酸残基に変異さ
せると、ＡＡＶの肝臓に対する向性または標的化の低下（「脱標的化」）が生じる。した
がって、ＡＡＶが肝臓に感染および／またはトランスフェクトする傾向は、Ａｎｃ８０（
配列番号１）のＡＡＶカプシドタンパク質内の２６６位の非Ｇ残基をＧ残基に変異させる
ことにより上昇させることができ、一方、ＡＡＶが肝臓に感染および／またはトランスフ
ェクトする傾向は、Ａｎｃ８０（配列番号１）のＡＡＶカプシドタンパク質内の２６６位
の非Ａ残基をＡ残基に変異させることにより低下させることができる。
一部の実施形態において、例えば、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０または１１に由来する既知の他のカプシドタンパク質のＡｎｃ８０の２６６位に対
応するアミノ酸位置は、所望の肝臓特異的向性に応じて、Ｇアミノ酸残基またはＡアミノ
酸残基のいずれかに変異させることができる。一部の実施形態において、Ｇアミノ酸残基
またはＡアミノ酸残基のいずれかの挿入は、所望により肝臓特異的向性を変更することが
できる。一部の実施形態において、肝臓トグル領域におけるさらなる変更、挿入、または
欠失により、所望により肝臓特異的向性を向上させることができる。一部の実施形態にお
いて、トグル残基を含む天然の肝臓トグル領域全体を、異種カプシドまたはｄｅ ｎｏｖ
ｏ合成した配列の肝臓トグル領域と置き換えて、所望の肝臓向性の向上または低下を達成
することができる。
一部の実施形態において、カプシドタンパク質は、Ａｎｃ８０（配列番号１）の２６６
位に対応する所望のアミノ酸残基を有するように遺伝学的に改変またはデザインして、他
のウイルス成分と混合してＡＡＶウイルス粒子に会合させる場合、ＡＡＶウイルス粒子を
肝臓において濃縮するか、肝臓を脱標的化することができる（例えば、変異させる前のカ
プシド配列、または適切な位置にＧを有しないか、もしくはＡを有しない対応するカプシ
ド配列、または適切な位置にＧの代わりにＡ、もしくはＡの代わりにＧを有する対応する
カプシド配列と比較して）。
また、本明細書において記載する場合、ＡＡＶカプシドタンパク質の肝臓向性は、Ａｎ
ｃ８０（配列番号１）の１６８位の１つの残基を変異させることにより変更することがで
きる。例えば、この位置の非アルギニンアミノ酸残基をアルギニン（Ｒ）アミノ酸残基に
変異させると、ＡＡＶの肝臓向性の向上または上昇が生じるか、あるいは、この位置の非
リジンアミノ酸残基をリジン（Ｋ）アミノ酸残基に変異させると、ＡＡＶの肝臓向性の低
下（「脱標的化」）が生じる。したがって、ＡＡＶが肝臓に感染および／またはトランス
フェクトする傾向は、Ａｎｃ８０（配列番号１）のＡＡＶカプシドタンパク質内の１６８
位の非Ｒ残基をＲ残基に変異させることにより上昇または向上させることができ、一方、
ＡＡＶが肝臓に感染および／またはトランスフェクトする傾向は、Ａｎｃ８０（配列番号
１）のＡＡＶカプシドタンパク質内の１６８位の非Ｋ残基をＫ残基に変異させることによ
り低下させることができる。
一部の実施形態において、例えば、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０または１１に由来する既知の他のカプシドタンパク質のＡｎｃ８０の１６８位に対
応するアミノ酸位置は、所望の肝臓特異的向性に応じて、Ｒアミノ酸残基またはＫアミノ
酸残基のいずれかに変異させることができる。
本明細書に記載の向性を付与するアミノ酸と類似の特性（例えば、極性、酸性度／塩基
性度、疎水性、電荷、および／またはサイズ）を有するアミノ酸を使用可能である（例え
ば、Ａｎｃ８０に対して２６６位のＧもしくはＡの代わりに、またはＡｎｃ８０に対して
１６８位のＲもしくはＫの代わりに）ことが理解される。
本明細書に記載するように、ＡＡＶカプシドタンパク質の肝臓特異的向性は、（図１４
に定義される）肝臓トグル領域内のさらなる残基を変異させることにより変更することが
できる。一部の実施形態において、天然に存在する肝臓トグル領域は、所望の肝臓向性を
有する（例えば、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上するか、または肝臓向性を低
下させる）ように異種血清型由来の肝臓トグル領域と置き換えることができる。一部の実
施形態において、天然に存在する肝臓トグル領域は、所望の肝臓向性を有する（例えば、
得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上するか、または肝臓向性を低下させる）ように
ｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。本明細書に記載するように、異種またはｄｅ
ｎｏｖｏ由来の肝臓トグル領域が、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質にお
ける２６６位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内の位置にＧアミノ酸残基を含む場合
、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性は、向上され、異種またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の肝
臓トグル領域が、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対
応するＡＡＶカプシドタンパク質内の位置にＡアミノ酸残基を含む場合、得られるＡＡＶ
ベクターの肝臓向性は、低下する。
本明細書において説明する発見により、肝細胞において濃縮されたか、または肝細胞か
ら脱標的化されたＡＡＶについて、カプシドタンパク質の配列、ならびに詳細には、Ａｎ
ｃ８０（配列番号１）における２６６および／または１６８位に対応するアミノ酸残基を
コードする核酸の配列に基づいて、ＡＡＶをスクリーニングすることが可能であることが
明らかとなる。核酸をシーケンシングする方法は、当技術分野において周知であり、鎖停
止法（例えば、サンガーシーケンシング法）または化学分解法（例えば、マクサム・ギル
バートシーケンシング法）を含むが、これらに限定されない。多くの変形形態および改良
形態が、開発されており、当技術分野において、自動シーケンシング法およびハイスルー
プットシーケンシング法を含むシーケンシングに使用されている。
本明細書において使用する場合、濃縮された、または濃縮は、カプシドタンパク質が、
Ａｎｃ８０（配列番号１）において、２６６位に対応するアミノ酸位置にＧアミノ酸残基
を、および／または１６８位に対応するＲアミノ酸位置を有しない場合（例えば、オリジ
ナルもしくは野生型配列、または変異させる前の配列）の肝細胞におけるＡＡＶゲノム数
と比較した、肝細胞におけるＡＡＶゲノム数の上昇を指す。本明細書において使用する場
合、脱標的化された、または脱標的化は、カプシドタンパク質が、Ａｎｃ８０（配列番号
１）において、２６６位に対応するアミノ酸位置にＡアミノ酸残基を、および／または１
６８位に対応するＫアミノ酸位置を有しない場合（例えば、オリジナルもしくは野生型配
列、または変異させる前の配列）の肝細胞におけるＡＡＶゲノム数と比較した、肝細胞に
おけるＡＡＶゲノム数の低下を指す。
肝臓におけるＡＡＶゲノム数をスクリーニングする方法は、当技術分野において既知で
あり、不死化および／または初代肝細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入、ならびに野生
型とヒト化の両マウスへのｉｎ ｖｉｖｏでの全身注射を典型的に含む（例えば、Grimm
et al., 2008, J. Virol., 82:5887-911; Lisowski et al., 2014, Nature, 382:doi:10.
1038/ nature12875を参照）。
効率的（もしくは向上した）肝臓向性または非効率的（もしくは低下した）肝臓向性を
付与する代表的カプシドタンパク質を本明細書において提供する。効率的肝臓向性を付与
する（例えば、肝細胞におけるＡＡＶゲノムの濃縮を生じる）代表的カプシドタンパク質
の配列は、配列番号２［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０＋２６６Ｇ］、配列番号６［ＡＡＶ９ Ａ
ｎｃ８０＋２６６Ｇ ＶＲＩ］、配列番号９［ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６７ Ｎ２
６８Ｔ］、配列番号１１［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇ］、配列番号１３［ＡＡＶ
３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６８Ｔ］、配列番号１４［ＡＡＶ３Ｂ ＡＡＶ９＋２
６７Ｇ－ＶＲＩ］、配列番号１５［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０＋２６６Ｇ－ＶＲＩ］に示し
、一方、肝臓向性の低下を付与する（例えば、ＡＡＶ粒子による肝臓の脱標的化を生じる
）代表的カプシドタンパク質の配列は、配列番号３［Ａｎｃ８０＋２６６Ａ］、配列番号
４［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ］、配列番号５［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔ］、配列
番号７［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０＋２６６Ａ－ＶＲＩ］、配列番号１０［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２
６５ Ａ２６６Ａ］、配列番号１２［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ａ Ｓ２６８Ｔ］
、配列番号１６［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０＋２６６Ａ－ＶＲＩ］、配列番号１７［Ａｎｃ
８０Ｌ６５ Ｒ１６８Ｋ］に示す。
以下に詳細に説明するように、二峰性パターンの肝臓形質導入を示す２つのＡＡＶカプ
シドタンパク質の配列の、配列番号２および配列番号３は、配列番号１に示す配列を有す
るＡｎｃ８０足場配列に起源を有し、この場合、図１においてＸ３で示す２６６位は、Ｇ
またはＡのいずれかである。同様に、二峰性パターンの肝臓形質導入を示す２つのＡＡＶ
カプシドタンパク質の配列の、配列番号１６および配列番号１７は、配列番号１に示す配
列を有するＡｎｃ８０足場配列に起源を有し、この場合、Ｘ１で示す１６８位は、Ｒまた
はＫのいずれかである。
肝臓トグルを含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸
本明細書に記載するように、ＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸残基を２６６
位トグルのＧアミノ酸残基とＡアミノ酸残基との間で変異させるか、または挿入すると、
得られるＡＡＶの肝臓向性が濃縮と脱標的化とで切り替わる。同様に、ＡＡＶカプシドタ
ンパク質におけるアミノ酸残基を１６８位トグルのＲアミノ酸残基とＫアミノ酸残基との
間で変異させると、得られるＡＡＶの肝臓向性が、濃縮と脱標的化とで切り替わる。配列
の変異は、核酸レベルで行われ、変異は、コードされたアミノ酸配列（例えば、コードさ
れたタンパク質）に典型的に翻訳される。本明細書において使用する場合、核酸は、１つ
または複数の核酸類似体または骨格修飾を含むものを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み得
る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり、通常、目的の使用に依存し得る。
変異は、種々の方法を使用して核酸に導入することができ、この多くは、当技術分野に
おいて周知である。例えば、変異は、変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲに
よる変異誘発）を使用して、または所望の変異（複数可）を含む核酸分子を化学的に合成
することにより核酸に導入することができる。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis（
Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Ed. 2）およびDieffenbach & Dveksle
r（PCR primer: a laboratory manual, 2003, Ed. 2）を参照されたい。
核酸は、当技術分野において通例の技術を使用して得る（例えば、単離する）ことがで
きる。例えば、核酸は、それらに限定されないが、組換え核酸技術、および／またはポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的
ＰＣＲ技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, E
ds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組換え核酸技術は
、例えば、核酸の単離に使用可能な、制限酵素分解およびライゲーションを含む。また、
単離した核酸は、単一核酸分子または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして化学的
に合成することができる。
「単離された」核酸分子は、単離した核酸分子が由来する生物のゲノムの核酸の一端ま
たは両端に天然に隣接する配列を含まない核酸分子である（例えば、ＰＣＲまたは制限酵
素分解により生成したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）。このような単離された核酸分
子は、一般に、操作の利便性のため、または以下に詳細に検討する融合核酸分子を生成す
るために、ベクター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）に導入する
。加えて、単離した核酸分子は、組換えまたは合成核酸分子のような改変核酸分子を含み
得る。
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過、およびハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーのような既知の方法により、天然源（例えば、生体試料）から得る（例え
ば、精製する）ことができる。また、ポリペプチドは、例えば、発現ベクターにより核酸
を発現させることにより精製することができる。加えて、精製したポリペプチドは、化学
合成により得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば
、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を
使用して測定することができる。
本明細書において使用する場合、「精製された」ポリペプチドは、これが天然に付随す
る細胞成分から分離または精製したポリペプチドである。典型的には、ポリペプチドは、
乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９
５％または９９％）これが天然に付随するタンパク質および天然に存在する分子を含まな
い場合に「精製された」と考えられる。化学的に合成したポリペプチドは、本来、これが
天然に付随する成分から分離しているため、合成ポリペプチドは、「精製されて」いる。
核酸は、ベクターにおいて増殖させることができる。ベクターは、ウイルスベクターま
たは非ウイルスベクターを含むことができ、また、発現ベクターを含むことができる。多
くのベクターは、市販されており、ベクターは、当技術分野において通例の組換えＤＮＡ
技術を使用して容易に生成することができる。核酸を含むベクターは、一部の例では、こ
のような核酸に動作可能に結合させることができる発現エレメントを有し得る。ベクター
は、選択的マーカーをコードする配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）のような配列をさ
らに含み得る。核酸を含むベクターは、キメラまたは融合ポリペプチド（すなわち、ポリ
ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに存在し得る異種ポリペプチドに動作可能に結
合するポリペプチド）をコードすることができる。代表的異種ポリペプチドは、コードさ
れたポリペプチドの精製において使用可能なものである（例えば、６ｘＨｉｓタグ、グル
タチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ））。
発現エレメントは、当技術分野において既知であり、コード配列の発現を配向し、制御
する核酸配列を含む。発現エレメントの１つの例は、プロモーター配列である。また、発
現エレメントは、核酸の発現を調節する、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメン
ト、または誘導性エレメントを含み得る。発現エレメントは、ウイルス起源であるか、も
しくは非ウイルス分子生物学的技術によるもの（例えば、プラスミドベクターの単純増殖
）であり得るか、発現エレメントは、それらに限定されないが、細菌、酵母、昆虫、もし
くは哺乳動物起源であり得るか、または発現エレメントは、種々の起源のエレメントの組
合せであり得る。本明細書において使用する場合、動作可能に結合する、は、プロモータ
ーまたは他の発現エレメント（複数可）が、核酸の発現を配向するか、または制御するよ
うに核酸に対してベクター内に位置することを意味する。一部の例では、動作可能に結合
する、は、２つの配列がインフレームであることを意味する。
ウイルスベクターを宿主細胞に導入する方法は、当技術分野において既知であり、ウイ
ルスの天然の感染能力を典型的に利用する。非ウイルスベクターを宿主細胞に導入する方
法は、当技術分野において既知である。本明細書において使用する場合、「宿主細胞」は
、ウイルスまたは非ウイルスベクターが導入される特定の細胞を指し、このような細胞の
子孫または潜在的子孫をも含む。宿主細胞は、必要に応じて、原核または真核細胞であり
得る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）のような細菌細胞において、または昆虫細胞
、酵母もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）また
はＣＯＳ細胞）において発現させることができる。他の適する宿主細胞は、当業者に既知
である。非ウイルス核酸は、それらに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、ヒートショック、リポフ
ェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスによる核酸導入のような既知の
方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれによっても宿主細胞に
導入することができる。
肝臓トグルを含むＡＡＶカプシドタンパク質を使用する方法
ＡＡＶウイルスは、導入遺伝子を（他のウイルス配列とともにｃｉｓまたはｔｒａｎｓ
で）含んで細胞に送達し得る。導入遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子（例えば、ベー
タ－ラクタマーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、
チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、またはルシフェラーゼ、またはヘマグルチニンもしくはＭ
ｙｃのような抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）または治療遺伝子（例えば、ホ
ルモンもしくはこの受容体、増殖因子もしくはこの受容体、分化因子もしくはこの受容体
、免疫系制御因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキン）もしくはこの受容体
、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害ＲＮＡまたは触媒ＲＮＡ）または標的抗原（例えば、発癌
性抗原、自己免疫抗原）をコードする遺伝子）であり得る。
特定の治療遺伝子は、少なくとも部分的に、治療する特定の疾患または欠損症に依存す
る。単なる例として、遺伝子導入または遺伝子治療は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性
線維症、レーバー先天黒内障、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常（例えば、フェニル
ケトン尿症を含む先天性アミノ酸代謝異常、プロピオン酸血症を含む先天性有機酸代謝異
常、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）を含む先天性脂肪酸代謝異常
）、がん、色覚異常、錐体杆体ジストロフィー、黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性症
）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満、炎症性腸
障害、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠動脈心疾患、家族性腎
アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト・ヤコブ
病、鎌状赤血球症、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、ラクトース
不耐症、脂質蓄積障害（例えば、ニーマン・ピック病Ｃ型）、バッテン病、コロイデレミ
ア、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイ・バー症候群）、先天
性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、および／または筋萎縮性側索硬
化症（ＡＬＳ）の治療に適用することができる。また、例として、遺伝子導入または遺伝
子治療は、網膜ジストロフィーの治療に適用することができる（例えば、両アレル性ＲＰ
Ｅ６５変異関連網膜ジストロフィーが確認された患者の治療を示す１回限りの遺伝子治療
製品である（ＬＵＸＴＵＲＮＡ（商標））（ボレチジーンネパルボベック－ｒｚｙｌ（vo
retigene neparvovec-rzyl））（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，フ
ィラデルフィア、ＰＡ州））。
また、治療遺伝子は、例えば、対象（例えば、ヒト、動物（例えば、ペット、家畜、絶
滅危惧動物））の免疫化に有用な免疫原であり得る。例えば、免疫原は、生物（例えば、
病原体）またはその免疫原性の部分もしくは成分（例えば、毒素ポリペプチドまたはこの
副産物）から得ることができる。例として、免疫原性ポリペプチドを得ることが可能な病
原体は、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、オルソミクソウイル
ス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば、肺炎球菌（Pneumococci）、
ブドウ球菌（Staphylococci）、リステリア（Listeria）、シュードモナス（Pseudomonas
））、および真核生物（例えば、アメーバ、マラリア、リーシュマニア、線虫）を含む。
本明細書に記載の方法およびこのような方法により生成される組成物が、特定のいかなる
導入遺伝子によっても制限されないことが理解される。
通常、生理学的に適合する担体に懸濁したＡＡＶウイルスは、標準技術を使用して、対
象（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適する担体は、多様
な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウ
ム、ゼラチン、デキストラン、アガー、ペクチン、および水を用いて処方され得る生理食
塩水を含む。ＡＡＶウイルスは、適切な細胞に形質導入または感染し、十分なレベルの遺
伝子導入および発現を提供し、過度の有害作用もなく治療的利点をもたらす十分な量で投
与する。通常の薬学的に許容される投与経路は、経口、鼻腔内、気管内、吸入、静脈内、
筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与経路による、例えば、肝臓または肺
のような臓器への直接送達を含むが、これらに限定されない。投与経路は、必要に応じて
、組み合わせることができる。
対象に投与されるＡＡＶウイルスの用量は、主に、治療する条件、ならびに年齢、体重
、および対象の健康状態のような因子に依存する。例えば、ヒト対象に投与される治療有
効量のＡＡＶウイルスは、一般に、約１×１０１～１×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）の
濃度のウイルス（例えば、約１×１０３～１×１０９ＧＣ）を含む溶液約０．１ｍｌ～約
１０ｍｌの範囲である。導入遺伝子の形質導入および／または発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
またはタンパク質アッセイによる投与後に種々の時点で監視することができる。一部の例
では、導入遺伝子の発現レベルを監視して、投薬の頻度および／または量を決定すること
ができる。また、治療目的のために記載するものに類似する投薬レジメンは、免疫化に利
用し得る。
本発明に従って、通常の分子生物学、微生物学、生化学、および組換えＤＮＡ技術を当
技術分野の技術において利用し得る。このような技術は、文献において十分に説明されて
いる。本発明は、特許請求の範囲に記載する本発明の方法および組成物の範囲を制限しな
い以下の実施例においてさらに記載される。
[実施例１]
ＡＡＶ肝臓トグルを同定するための材料および方法
ＡＡＶ配列の２１１（２０４８）バリアントＡｎｃ８０ライブラリー（例えば、米国特
許第９，６９５，２２０号を参照）を、Ａｎｃ８０足場配列（配列番号１；図１）内の１
１個の位置（図１におけるＸ１～Ｘ１１）を変更することにより生成した。各バリアント
は、哺乳動物発現プラスミドにクローニングし、ｐＲｅｐおよびｐＡｄヘルパーアクセサ
リープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、ウイルスベクターの
形態でライブラリーを生成した。次いで、このライブラリーは、肝臓局在性のｉｎ ｖｉ
ｖｏでのスクリーニングに使用した（例えば、濃縮対脱標的化）。簡潔には、１つの実験
において、３匹のマウスに、Ａｎｃ８０ベクターライブラリーを総ｇｃ２．７３１１（約
１ｅ１３ｇｃ／ｋｇ）で注射した。注射後３日目に、マウスを屠殺し、肝臓を回収して凍
結した。別の実験では、２匹のアカゲザルに、Ａｎｃ８０ベクターライブラリー１．６ｅ
１２ｇｃ／ｋｇを注射して、注射後２８日目に試験を終了し肝臓を回収した。総ゲノムＤ
ＮＡは、肝臓から抽出し、組織に存在するウイルスバリアントの集団は、次世代シーケン
シングにより定量化した。以下に記載するように、図１に示すＡｎｃ８０足場配列におい
て強調したＸ３位は、肝臓トグル位置であると決定した。Ｘ３位は、Ａｎｃ８０足場配列
の残基２６６に対応する。
ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニング実験の結果は、図９および図１０に示す。肝臓にお
ける、ウイルスインプット（ｘ軸）に対する２０４８バリアントＡｎｃ８０ライブラリー
メンバーの存在量（ｙ軸）を示すプロットを示す。ｙ軸では、ゼロは、インプットの変化
がないことを示し、正および負の値は、相対的濃縮または脱標的化をそれぞれ示す。Ａｎ
ｃ８０足場配列内のトグル位置１１個のうちＸ３位は、観察された肝臓二峰性と相関した
。
劣位であるが、それにもかかわらず肝臓濃縮または脱標的化に関連するのは、Ｘ１位の
アミノ酸残基の同一性であり、Ａｎｃ８０足場配列の残基１６８に対応する。トグル「ヒ
ートマップ」と呼ばれる方法により、すべてのトグル位置の同一性の考察が、ビジュアル
形式で可能となった。また、所望の特性によりバリアントの群を選択することによって、
ヒートマップでは、存在する場合、影響を受ける複数のトグル位置を明らかとすることが
できる。図９および図１０から同一のデータを使用すると、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス
（図２５）とアカゲザル（図２６）の両方は、最も肝臓濃縮されたＡｎｃ８０バリアント
に存在する、Ｘ３＝１（Ｇ）およびＸ１＝１（Ｒ）を有する。Ｘ１位の適合性を裏付けて
、ＦＲＧヒト肝臓異種移植マウスモデルから回収したマウスとヒトの両方の肝細胞につい
て、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓構造を模倣する条件下で培養した初代ヒト肝細胞（
マイクロパターン化共培養物、ＭＰＣＣ）において、類似のパターンが観察された。
[実施例２]
ＡＡＶ肝臓トグルの生成および試験
肝臓トグルを含む、２０４８バリアントＡｎｃ８０ライブラリー由来の特定の配列（例
えば、その全体を参照により本明細書において組み込む米国特許第９，７１９，０７０号
を参照）を生成した（図２）。Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２）は、２６６位にＧを含ん
で肝臓濃縮を示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号３）は、２６６位にＡを含
んで肝臓脱標的化を示す。Ｇ／Ａ肝臓トグルは、強調し、図２に示す色分けと一致するよ
うに、図３において色分けする。
個々のバリアントのそれぞれは、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ生成断片と遺伝子合
成断片とを混合する等温（ギブソン）クローニングのいずれかに由来する。このようなバ
リアントは、標準的ｒｅｐ／ｃａｐ「ｔｒａｎｓ」プラスミドにクローニングしてベクタ
ーを生成する。次いで、ＧＦＰおよびアルファ１－アンチトリプシンを発現するベクター
バリアントは、グラウスベック遺伝子治療センター（Grousbeck Gene Therapy Center）
の遺伝子導入ベクターコア（Gene Transfer Vector Core）により生成する。
１バリアントあたり８週齢の雄マウス３匹および親対照に、総ゲノムコピー１ｅ１１（
約５ｅ１２ｇｃ／ｋｇ）を注射し、３日目に肝臓組織を回収する。肝臓におけるゲノムコ
ピー数は、ｑＰＣＲにより判定し、絶対値および親対照に対する比率として表す。図１１
は、２６６位にＧを含むＡｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２）が、肝臓濃縮を示し、２６６位
にＡを含むＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号３）が、肝臓脱標的化を示すことを
示す。さらに、図１２は、肝臓組織のｅＧＦＰ染色により観察されるゲノムからの発現が
、２６６位にＧを含むＡｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２）を利用する場合、２６６位にＡを
含むＡｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ（配列番号３）に対して、より明白であることを示す
。
[実施例３]
相当する肝臓トグル残基を他の血清型において同定する
図１３Ａは、ＡＡＶ２ ＶＰ３カプシド単量体の結晶構造を示す。肝臓トグル（「ＬＴ
」）の位置は、矢印により示し、ＬＴを包含する領域の構造は、四角で囲む。肝臓トグル
残基は、Ａｎｃ８０の２６６位に相当する位置のαトグルに対して２～３残基分ｎ末端に
位置し得る。図１３Ｂは、ＡＡＶ２、３、６、８および９ＶＰ３のＬＴ領域のオーバーレ
イを示し、トグル位置を定義する局所的二次構造を強調する、ＡＡＶ２ ＶＰ３の結晶構
造である。トグル領域は、β上行（βａ）およびβ下行（βｄ）の二次構造間に位置して
、これらの二次構造を含み、αトグル（αｔ）に対して残基２～３個分Ｎ末端にコードさ
れる主要な官能基を有する、残基として定義する。ＬＴ残基は、残基３個のアルファヘリ
ックスに対してＮ末端の、ベータシート結合ループであるＶＲ１内に位置する。
図１４は、肝臓トグルを包含する、原型であり臨床的に適合する血清型由来の一次ＶＲ
Ｉアミノ酸配列のアラインメントであり、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、１５行目に位置する。β
上行（βａ）、β下行（βｄ）、αトグル（αｔ）、トグル領域、およびトグル自体の位
置を強調する。β上行（βａ）は、保存されたチロシンにおいて開始し、β下行（βｄ）
は、保存されたセリンにおいて終止する。多くの血清型では、Ａｎｃ８０ ２６６に相当
する位置は、近い同一性により容易に推測することができる。他に、注目すべきは、クレ
ードＢウイルスＡＡＶ２およびＡＡＶ３、ならびに関連するウイルスＡＡＶ４およびＲｈ
３２．３３において、相当する位置は、より曖昧であるか、それほど明白でない。それに
もかかわらず、一次配列は、他の血清型において、肝臓トグルを同定するガイドとして作
用し得る。図５に示すように、トグルは、Ａｎｃ８０Ｌ６５において残基２６６、ＡＡＶ
９において残基２６７、およびＡＡＶ５において残基２５７を表し、トグルを定義すると
、位置番号が関連していることが強調される。
[実施例４]
他の血清型におけるＡＡＶ肝臓トグルの生成および試験
同様に、図１５は、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ９血清型、ならびに
肝臓トグルの仮説を試験するために構築したバリアントのＣ末端におけるαトグル（ＮＤ
Ｎ）に方向づけられた、肝臓トグル領域の配列アラインメントである。Ａｎｃ８０Ｌ６５
、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ９、ならびに他のバリアントを、マウス（Ｍ）または霊長類
（Ｐ）の肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。このような血清型についてのマウス肝
臓形質導入効率は、最後の２列において「オン」または「オフ」により示す。完了した実
験についての表現型は、太字で示し、なお進行中の実験についての表現型は、イタリック
体で示す。
本明細書において同定する単一残基の肝臓トグルの他に、肝臓トグル領域全体は、トグ
ル機能を異種血清型に移入すると同時に、肝臓トグル源血清型の所望の他の特徴を保持し
得る。図１６では、このような残基に隣接する保存されたドメインを利用することによる
肝臓トグル領域の移植性を迅速かつ容易に試験する方法を記載する。この約１００～１１
０ｂｐの領域の増幅またはｄｅ ｎｏｖｏ合成により、異種血清型への相同性特異的会合
が可能となる。
図１７では、この試験の一部、および図１６に例示するように会合させた肝臓トグル領
域スワップを列挙する。最後の２列では、この試験により決定したマウスおよび霊長類に
おけるｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓トグル機能を太字で、または予想された肝臓トグル機能を
イタリック体で記載する。
Ｈｕｈ７肝臓癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入は、すべての肝臓トグルバリアン
トの生存率を試験すること、このようなバリアントのｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓トグル「オ
ン」または「オフ」表現型を示唆することの両方でｉｎ ｖｉｔｒｏで役立つ。図１８お
よび図１９に説明するように、ベクター送達ルシフェラーゼ発現により判定すると、力価
について正規化した場合、改変バリアントのほとんどは、驚くべきことに、安定とはなら
ないまでも、いくらかの生存率を提示した。さらに、観察されたルシフェラーゼ活性の量
は、Ａｎｃ８０に相当する位置の肝臓オン「Ｇ」を有するこのようなバリアントが、肝臓
オフ「Ａ」のこれらの同胞よりも高いＲＬＵ値を有したという点において、予想された肝
臓トグル表現型と適合した。
重要なことには、トグルは、Ａｎｃ８０の２６６位に相当する位置においてｉｎ ｖｉ
ｖｏで実証され、これは、ＡＡＶ９において２６７位である。ＡＡＶ９において、Ｇ２６
７をＡに変更すると、図２０および図２１に説明するように、生存中のルシフェラーゼシ
グナル、１細胞あたりのゲノムコピーおよび送達されたマーカー発現が、肝臓において桁
違いに低下する。さらに、他のトグル領域残基の変更の必要性は、トグル単独変異体ＡＡ
Ｖ９ Ｇ２６７Ａに対する二重変異体ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔの優れた能力に
より実証される。二重変異体は、肝臓「オフ」表現型を示すだけでなく、この結果は、心
臓および骨格筋への遺伝子送達の利点を示唆する。
ＮＨＰ、ＦＲＧマウスによるヒト肝臓異種移植モデル、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒ
ト肝臓モデルによるさらなる研究により、ＡＡＶによる肝臓遺伝子送達に影響する第２の
位置が同定され、本明細書において「肝臓トグル２」と呼んだ。このトグルは、Ａｎｃ８
０足場の残基Ｘ１によりコードされ、Ａｎｃ８０Ｌ６５の１６８位に対応する。
図２２は、推定の肝臓トグル「オフ」ウイルスＡＡＶ３Ｂを、Ａ２６６をＧに変更して
Ｔを２残基Ｃ末端に挿入するか（配列番号９）、または２６８位の残基をＳからＴに変更
するか、もしくは変更せずにＧをＡ２６６の前に挿入するか（配列番号１１）のいずれか
により、肝臓「オン」とすることができることを生存中のルシフェラーゼ発現により実証
する。肝臓「オフ」の予想は、このような後者２つのバリアントのＡ「オフ」挿入の適合
により観察される（配列番号１０）。さらに、天然ＡＡＶ３Ｂ肝臓トグル「オフ」領域を
、ＡＡＶ９（配列番号１４）およびＡｎｃ８０Ｌ６５（配列番号１５）由来の肝臓トグル
「オン」領域とスワップすると、マウス肝臓形質導入も向上する。肝臓トグル「オフ」Ａ
ｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａにおいてスワップすると、ｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラー
ゼ発現が、この「オン」対応物Ａｎｃ８０Ｌ６５と比較して低下する（配列番号１６）。
図２４では、臨床的に適合する血清型およびＡｎｃＡＡＶにおけるＸ１の位置および局
所的状況を同定する。これは、ＡＡＶ５を除くすべてのＡＡＶの配列アラインメントによ
り容易に同定可能な、ＶＰ２のＮ末端に近い正荷電モチーフに位置し、このＶＰ２ Ｎ末
端は、残基１７～２０個分短い。それにもかかわらず、すべての血清型は、この保存され
た隣接残基：残基２個分Ｎ末端のプロリンおよび残基１個分Ｃ末端のリジンに対する関連
性により肝臓トグル２を定義することができる。
図２５および図２６では、肝臓トグル２の肝臓濃縮に対する適合性を例示する。図２５
では、実験により、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびヒト肝臓異種移植マウスモデル
ＦＲＧのマウス肝細胞成分の両方におけるＡｎｃ８０バリアントの濃縮を検索した。図２
６では、実験により、アカゲザル肝臓、ＦＲＧ実験による相互的ヒト肝細胞、およびマイ
クロパターン共培養（ＭＰＣＣ）と呼ばれる技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した
ヒト肝細胞におけるＡｎｃ８０バリアントの濃縮を検索した。いずれの場合も、肝臓濃縮
されたバリアントが、付随するＭＡプロットから選択されると、肝臓トグルＸ３の適合性
が明らかとなった。加えて、Ｘ１位の適合性は明らかであり、ランク順に下位から上位ま
で濃縮が上昇するにつれて、バリアントによりトグル０＝Ｋからトグル１＝Ｒに切り替わ
った。このパターンは、Ｘ１位の肝臓トグル２は、Ｘ３位の肝臓トグルに依存しないが、
Ｘ３のトグルは、優位な位置であることを示唆する。
ＡＡＶ３Ｂは、肝細胞への効率的移入のためにはヒト肝細胞増殖因子受容体（ＨｕＨＧ
ＦＲ）に依存するという発見以来（Ling et al., 2010, Hum. Gen. Ther, 21(12): 1741-
1747）、臨床的に適合する血清型として好評を得ている。この発見以前は、この血清型は
、マウスにおけるこの不十分な肝臓送達能力のため、遺伝子治療では却下されていた。そ
れにもかかわらず、ほとんどの前臨床疾患モデルは、マウスにおいてであり、このような
マウスモデルは、例えば、効率、安全性の判定、および遺伝子治療薬の用量の決定におい
て重要な役割を果たす。ＡＡＶ３Ｂが、所望の治療特性を保持すると同時に、マウスにお
ける肝臓送達能力が霊長類と同レベルまで向上するようにＡＡＶ３Ｂを改変することは、
産業にとって非常に有用である。ＡＡＶ３Ｂは、Ａｎｃ８０と比較して、短縮されたＶＲ
Ｉおよび肝臓トグル領域を有し、これにより、Ａｎｃ８０の２６６位に相当する位置とし
て残基を割り当てることが困難となっている（図１４および図１５を参照）。
２６６位のＡのＧへの変更では、Ｈｕｈ７細胞への遺伝子送達は向上せず、実際、この
変更により、機能喪失表現型がＡＡＶ３Ｂに生成され得る。所望の特性の改変において、
肝臓トグル領域全体を考察する必要性を強化して、ＡＡＶ３Ｂにおける相当する位置のＴ
のＡｎｃ８０への挿入と同時にＡ２６６のＧへの変更、またはＡｎｃ８０における相当す
るであろう位置におけるＡもしくはＧのいずれかの挿入により、Ｈｕｈ７細胞およびｉｎ
ｖｉｖｏにおいて、肝臓「オン」および「オフ」の両表現型を示すバリアントが生成さ
れる（図１９および図２２）。さらに、ＡＡＶ３Ｂは、肝臓トグル領域スワップに良好な
耐容性を示すと考えられ、ＡＡＶ９およびＡｎｃ８０Ｌ６５から肝臓「オン」肝臓トグル
領域を移入すると、このようなバリアントのＨｕｈ７およびｉｎ ｖｉｖｏでのマウス肝
細胞遺伝子送達が、ＡＡＶ３Ｂ単独に対して向上する。肝臓「オフ」Ａｎｃ８０Ｌ６５
Ｇ２６６Ａ肝臓トグル領域を移入すると、この能力がバックグラウンドレベル付近まで低
下する（図１９および図２２）。重要なことには、ＧをＧ２６５とＡ２６６の間へ単一挿
入すると、肝臓におけるルシフェラーゼシグナルにより判定する場合、マウスにおいてＡ
ＡＶ９と同等の能力を有する、３Ｂをベースとする血清型が生成される（図２２）。
他の実施形態
本発明の方法および組成物は、いくつかの異なる態様とともに本明細書において記載さ
れているが、種々の態様についての前述の記載は、例示であり、本発明の方法および組成
物の範囲を制限しないことを意図することが理解されるべきである。他の態様、利点、お
よび修飾形態は、以下の特許請求の範囲内に存在する。
使用可能であり、ともに使用可能であり、準備において使用可能である方法および組成物、または開示する方法および組成物による生成物を開示する。これらおよび他の材料を本明細書において開示し、これらの方法および組成物の組合せ、サブセット、相互作用、群等を開示することが理解される。すなわち、種々の各個体ならびにこれらの組成物および方法の集合的組合せおよび順列への特定の参照は、明示的には開示しない場合があるが、それぞれを詳細に熟慮して、本明細書において記載する。例えば、特定の組成物または特定の方法を開示して考察し、いくつかの組成物または方法を考察する場合、組成物および方法のありとあらゆる組合せおよび順列は、これらと矛盾するように詳細に指示しない限り、詳細に熟慮する。また同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せは、詳細に熟慮して開示する。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの組織向性を変更する方法であって、
Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応するか、またはＡｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における１６８位に対応する、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置を位置づけるステップと、
Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置の天然に存在するアミノ酸を、グリシン（Ｇ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上させるか、もしくはアラニン（Ａ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶの肝臓向性を低下させるステップ、または
Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置の天然に存在するアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上させるか、もしくはリジン（Ｋ）アミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶの肝臓向性を低下させるステップと
を含む、方法。
２．Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置の天然に存在する前記アミノ酸をＧアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上させるステップを含む、上記１に記載の方法。
３．Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置の天然に存在する前記アミノ酸をＡアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を低下させるステップを含む、上記１に記載の方法。
４．Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置の天然に存在する前記アミノ酸をＲアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上させるステップを含む、上記１に記載の方法。
５．Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置の天然に存在する前記アミノ酸をＫアミノ酸残基と置き換えて、得られるＡＡＶの肝臓向性を低下させるステップを含む、上記１に記載の方法。
６．前記置き換えるステップが、部位特異的変異誘発を使用して実施される、上記１から５のいずれかに記載の方法。
７．前記置き換えるステップが、現存の、またはｄｅ ｎｏｖｏ合成したＤＮＡの制限分解およびライゲーションにより実施される、上記１から６のいずれかに記載の方法。
８．前記置き換えるステップが、現存の、またはｄｅ ｎｏｖｏ合成したＤＮＡの相同性による会合により実施される、上記１から７のいずれかに記載の方法。
９．前記位置づけるステップが、シーケンシングすることにより実施される、上記１から８のいずれかに記載の方法。
１０．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の肝臓向性のレベルをスクリーニングする方法であって、
ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸をシーケンシングするステップと、
Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応する前記ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置、またはＡｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における１６８位に対応する前記ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置を位置づけるステップと、
Ａｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置にＧアミノ酸残基もしくはＡアミノ酸残基を有するか、またはＡｎｃ８０（配列番号１）の前記カプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置にＲアミノ酸残基もしくはＫアミノ酸残基を有する、ＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップと
を含み、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置のＧアミノ酸残基、またはＡｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置のＲアミノ酸残基が、肝臓向性を示すＡＡＶを示し、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応する位置づけられた位置のＡアミノ酸残基、またはＡｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における１６８位に対応する位置づけられた位置のＫアミノ酸残基が、肝臓向性をほとんど提示しないか、もしくはまったく提示しないＡＡＶを示す、方法。
１１．２６６位のＸ ３ が、ＧまたはＡから選択され、１６８位のＸ １ が、ＲまたはＫから選択される、配列番号１［Ａｎｃ８０］に示す配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
１２．配列番号２［Ａｎｃ８０Ｌ６５］、配列番号３［Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ］、配列番号４［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ］、配列番号５［ＡＡＶ９ Ｇ２６７Ａ Ｓ２６９Ｔ］、配列番号６［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ］、配列番号７［ＡＡＶ９ Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ］、配列番号８［ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ］、配列番号９［ＡＡＶ３Ｂ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６７ Ｎ２６８Ｔ］、配列番号１０［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ａ］、配列番号１１［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇ］、配列番号１２［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ａ Ｓ２６８Ｔ］、配列番号１３［ＡＡＶ３Ｂ Ｇ２６５ Ａ２６６Ｇ Ｓ２６８Ｔ］、配列番号１４［ＡＡＶ３Ｂ ＡＡＶ９－ＶＲＩ］、配列番号１５［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＶＲＩ］、配列番号１６［ＡＡＶ３Ｂ Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｇ２６６Ａ－ＶＲＩ］、および配列番号１７［Ａｎｃ８０Ｌ６５ Ｒ１６８Ｋ］からなる群から選択される配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
１３．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの組織向性を変更する方法であって、
ＡＡＶカプシドタンパク質内の図１４に定義する肝臓トグル領域を位置づけるステップと、
天然に存在する肝臓トグル領域を、異種血清型由来の肝臓トグル領域またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の配列と置き換えて、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性を向上させるか、または肝臓向性を低下させるステップと
を含む、方法。
１４．異種またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の前記肝臓トグル領域が、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内の位置にＧアミノ酸残基を含む場合、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性が、向上する、上記１３に記載の方法。
１５．異種またはｄｅ ｎｏｖｏ由来の前記肝臓トグル領域が、Ａｎｃ８０（配列番号１）のカプシドタンパク質における２６６位に対応するＡＡＶカプシドタンパク質内の位置にＡアミノ酸残基を含む場合、得られるＡＡＶベクターの肝臓向性が、低下する、上記１３に記載の方法。

Claims (7)

  1. 以下からなる群から選択されるカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：
    ａ）その肝臓トグル領域においてＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号５８）を含む改変を含むＡＡＶ９カプシドタンパク質；
    ｂ）その肝臓トグル領域においてＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号６３）を含む改変を含むＡｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質；
    ｃ）その肝臓トグル領域においてＡＡＶ９－ＶＲ１（ＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮ、配列番号６２）を含む改変を含むＡｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質；及び
    ｄ）Ｓ２６８Ｔ改変を含むＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質。
  2. 前記カプシドタンパク質が、その肝臓トグル領域においてＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号５８）を含む改変を含むＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  3. 前記カプシドタンパク質が、その肝臓トグル領域においてＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号６３）を含む改変を含むＡｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  4. 前記カプシドタンパク質が、その肝臓トグル領域においてＡＡＶ９－ＶＲ１（ＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮ、配列番号６２）を含む改変を含むＡｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  5. 前記カプシドタンパク質が、Ｓ２６８Ｔ改変を含むＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  6. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の組織向性を変更する方法であって、
    ａ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質の肝臓トグル領域がＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号５８）を含むように改変すること；
    ｂ）Ａｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質の肝臓トグル領域がＡＡＶ３Ｂ－ＶＲ１（ＳＱＳＧＡＳＮＤＮ、配列番号６３）を含むように改変すること；
    ｃ）Ａｎｃ８０Ｌ６５カプシドタンパク質の肝臓トグル領域がＡＡＶ９－ＶＲ１（ＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮ、配列番号６２）を含むように改変すること；又は
    ｄ）ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質の肝臓トグル領域がＳ２６８Ｔ改変を含むように改変すること；
    を含む、方法。
  7. 請求項６に記載の方法によって作製された、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
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