JP7734942B2

JP7734942B2 - Biomarkers and methods for detecting the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and sea anemone

Info

Publication number: JP7734942B2
Application number: JP2021038728A
Authority: JP
Inventors: 明菅野
Original assignee: Tohoku University NUC
Current assignee: Tohoku University NUC
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2025-09-08
Anticipated expiration: 2041-03-10
Also published as: JP2022138701A

Description

本発明は、アスパラガス及びハマタマボウキにおけるＸ染色体及びＹ染色体の有無を検出するためのバイオマーカー及び方法に関する。 The present invention relates to biomarkers and methods for detecting the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and sea anemone.

アスパラガスは個体によって雌雄が分かれている雌雄異株植物である。従来、雌雄は、花の形熊によってのみ区別できていたため、雌雄判別には１～２年かかっていた。その後、この雌雄判別はＤＮＡマーカーによって行うことが可能となった。 Asparagus is a dioecious plant, meaning that individual plants are either male or female. Previously, sex could only be distinguished by the shape of the flowers, and it took one to two years to determine sex. However, it has now become possible to determine sex using DNA markers.

一方、アスパラガスはその収量性から雌株よりも雄株の方が好まれている。そしてアスパラガスの雄株には希に着果する個体（間性株）があり、この間性株後代から得られる超雄株を用いて雌株と交配することにより、後代が全て雄になる全雄品種が育成されている。
超雄株と雄株とは形態的に区別できず、これらの区別するためには雌株と交配して得られる後代を雌雄判別するしかなかったため、ＤＮＡマーカーを用いても超雄株選抜には１～２年の年月が必要であった。かかる点を解消するために、２０１８年にＲＭ１７マーカーが開発された（非特許文献１）。これは超雄株と雄株とを区別できるＤＮＡマーカーである。しかし、かかるＲＭ１７マーカーは、紫アスパラガスでは利用できず、またハマタマボウキ等の近縁野生種でも利用できるか不明なため、超雄株選抜が可能な新たなマーカーの開発が望まれている。 On the other hand, male asparagus plants are preferred over female plants due to their yield potential. Among male asparagus plants, there are some that rarely bear fruit (intersexual plants), and by crossing the progeny of these intersexual plants with female plants, supermale plants are obtained, resulting in the development of all-male varieties, whose progeny are all male.
Supermales and males are morphologically indistinguishable, and the only way to distinguish between them was to cross them with female plants and determine the sex of the resulting progeny. Therefore, even with DNA markers, selecting supermales required one to two years. To address this issue, the RM17 marker was developed in 2018 (Non-Patent Document 1). This is a DNA marker that can distinguish between supermales and males. However, the RM17 marker cannot be used in purple asparagus, and it is unclear whether it can be used in closely related wild species such as Hamatamabouki. Therefore, the development of a new marker that can select supermales is desired.

Acta Hort. 1223:51-58 (2018)Acta Hort. 1223:51–58 (2018) Honda H, Hirai A (1990) A simple and efficient method for identification of hybrids using nonradioactive rDNA as probe. Jpn. J. Breed. 40:339-348Honda H, Hirai A (1990) A simple and efficient method for identification of hybrids using nonradioactive rDNA as probe. Jpn. J. Breed. 40:339-348

本発明は、アスパラガス及びハマタマボウキにおけるＸ染色体及びＹ染色体の有無を検出するための新たなバイオマーカー及び方法を提供することを課題とする。 The objective of the present invention is to provide new biomarkers and methods for detecting the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and sea anemone.

かかる状況の下、本発明者らは、アスパラガス及びハマタマボウキにおける膨大な遺伝情報を様々な試行錯誤を伴い調査した結果、アスパラガス及びハマタマボウキにおける特定の領域において、種々の種、株間で共通して、Ｙ染色体には制限酵素であるＸｓｐＩ切断部位が存在し、Ｘ染色体にはＸｓｐＩ切断部位が存在しないことを見出した。かかる新たな知見に基づき、さらなる検討を加えた結果、本発明者らは、上記領域をX染色体の有無及びY染色体の有無を両方検出するためのバイオマーカーとして用いることを着想し、さらに試験を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 Under these circumstances, the inventors investigated the vast amount of genetic information in asparagus and Hamamelis via a variety of trial and error methods, and discovered that in specific regions of asparagus and Hamamelis, common to various species and strains, there is a restriction enzyme XspI cleavage site on the Y chromosome, but no XspI cleavage site on the X chromosome. Based on this new finding and further investigation, the inventors came up with the idea of using this region as a biomarker for detecting the presence or absence of both an X chromosome and a Y chromosome, and after further testing, they completed the present invention.

従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有さないポリヌクレオチドの有無及びSSM01における２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有するポリヌクレオチドの有無を、アスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体の有無及びY染色体の有無の判定の指標とする方法。 Thus, the present invention provides the following:
Item 1. A method for determining the presence or absence of an X chromosome and the presence or absence of a Y chromosome in asparagus or Hamamelis sativus, using the presence or absence of a polynucleotide that does not have the nucleotide sequence CTAG at a position corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in SSM01 and the presence or absence of a polynucleotide that has the nucleotide sequence CTAG at a position corresponding to positions 271 to 274 in SSM01 as indicators for determining the presence or absence of an X chromosome and the presence or absence of a Y chromosome in asparagus or Hamamelis sativus.

項２．試料中から、SSM01の１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを抽出する工程、ポリヌクレオチドにおけるSSM01の１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドを含む領域を増幅する工程、上記工程で増幅したポリヌクレオチドを、CTAGを認識する制限酵素で処理する工程、該増幅したポリヌクレオチド及び増幅したポリヌクレオチドが制限酵素により切断されてなるポリヌクレオチドを検出する工程を含む、項１に記載の方法。 Item 2. The method of Item 1, comprising the steps of: extracting from a sample a polynucleotide containing an oligonucleotide corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 of SSM01; amplifying a region of the polynucleotide containing the oligonucleotide corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 of SSM01; treating the polynucleotide amplified in the above step with a restriction enzyme that recognizes CTAG; and detecting the amplified polynucleotide and polynucleotides formed by cleavage of the amplified polynucleotide with the restriction enzyme.

項３．前記検出工程において、前記増幅したポリヌクレオチドであって制限酵素により切断されていないポリヌクレオチドが検出された場合にアスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体が存在すると判定する、項２に記載の方法。 Item 3. The method of Item 2, wherein the presence of an X chromosome in asparagus or azalea is determined if the amplified polynucleotide that has not been cleaved by a restriction enzyme is detected in the detection step.

項４．前記検出工程において、前記増幅したポリヌクレオチドであって制限酵素により切断されたポリヌクレオチドが検出された場合にアスパラガス又はハマタマボウキにおけるＹ染色体が存在すると判定する、項２又は３に記載の方法。 Item 4. The method according to Item 2 or 3, wherein the presence of a Y chromosome in asparagus or sea anemone is determined if the amplified polynucleotide cleaved by a restriction enzyme is detected in the detection step.

項５．SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる、アスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体の有無及びY染色体の有無を両方検出するためのバイオマーカー。 Item 5. A biomarker for detecting the presence or absence of both an X chromosome and a Y chromosome in asparagus or sea anemone, the biomarker comprising a polynucleotide containing an oligonucleotide corresponding to positions 102-105 or 271-274 in SSM01.

項６．前記ポリヌクレオチドの長さが１００ｂｐ～５００ｂｐである、項５に記載のバイオマーカー。 Item 6. The biomarker described in Item 5, wherein the polynucleotide has a length of 100 bp to 500 bp.

項７．項１～４のいずれか一項に記載の方法に用いるための、項５又は６に記載のバイオマーカー。 Item 7. The biomarker described in Item 5 or 6 for use in the method described in any one of Items 1 to 4.

本発明によれば、アスパラガス及びハマタマボウキにおけるＸ染色体及びＹ染色体の有無を検出するための新たなバイオマーカー及び方法を提供することができる。従って、本発明によれば、アスパラガス及びハマタマボウキの性染色体がＸＸ型、ＸＹ型、ＹＹ型のいずれであるかを判別することができるため、超雄株（ＹＹ型）の選抜に使用することができる。 The present invention provides new biomarkers and methods for detecting the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and Hamatamabouki. Therefore, the present invention makes it possible to determine whether the sex chromosomes of asparagus and Hamatamabouki are XX, XY, or YY types, and can be used to select super-male plants (YY type).

実施例における電気泳動の結果（アスパラガス品種）を示す。Electrophoresis results (asparagus varieties) in the examples are shown. 実施例における電気泳動の結果（紫アスパラガス品種）を示す。1 shows the results of electrophoresis (purple asparagus variety) in an example. 実施例における電気泳動の結果（ハマタマボウキ）を示す。The results of electrophoresis in the example (Hamatamabouki) are shown below. 実施例における電気泳動の結果（Asparagus maritimus）を示す。1 shows the results of electrophoresis (Asparagus maritimus) in an example. アスパラガス（品種名ＭａｒｙＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ５００Ｗ）の各染色体におけるSSM01の塩基配列を示す。ＭＷ＿Ｘ：Ｘ染色体；ＭＷ＿Ｙ：Ｙ染色体。The base sequences of SSM01 in each chromosome of asparagus (variety name Mary Washington 500W) are shown below. MW_X: X chromosome; MW_Y: Y chromosome. アスパラガス（品種名Ｇｉｊｎｌｉｍ）の各染色体におけるSSM01の塩基配列を示す。Ｇｍ＿Ｘ：Ｘ染色体；Ｇｍ＿Ｙ：Ｙ染色体。The base sequences of SSM01 in each chromosome of asparagus (variety name: Gijnlim) are shown below. Gm_X: X chromosome; Gm_Y: Y chromosome. 紫アスパラガス（品種名ＰｕｒｐｌｅＰａｓｓｉｏｎ）の各染色体におけるSSM01の塩基配列を示す。Ｐａｓ＿Ｙ：Ｙ染色体；ＰａｓＸ：Ｘ染色体。The base sequences of SSM01 in each chromosome of purple asparagus (cultivar name: Purple Passion) are shown below. Pas_Y: Y chromosome; Pas_X: X chromosome. 紫アスパラガス（品種名ＰａｃｉｆｉｃＰｕｒｐｌｅ）の各染色体におけるSSM01の塩基配列を示す。ＰｆｃＹＰＰ－ｍ^＊：ある個体のＹ染色体ＰｆｃＸＰＰ－ｍ：Ｘ染色体；ＰｆｃＹＰＰ－ｍ：別個体のＹ染色体。The base sequences of SSM01 in each chromosome of purple asparagus (variety name Pacific Purple) are shown below: Pfc Y PP-m ^* : Y chromosome of one individual; Pfc X PP-m: X chromosome; Pfc Y PP-m: Y chromosome of another individual. ハマタマボウキの各染色体におけるSSM01の塩基配列を示す。ＡＫ＿Ｘ：Ｘ染色体；ＡＫ＿Ｙ：Ｙ染色体。The base sequences of SSM01 in each chromosome of Hamatamabouki are shown below. AK_X: X chromosome; AK_Y: Y chromosome.

本発明において、用語「遺伝子」には、特に言及しない限り、タンパク質、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の一次構造を規定している構造遺伝子だけでなく、プロモーター、オペレーター等の特定の制御機能を有する核酸上の領域も包含される。従って、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。 In the present invention, unless otherwise specified, the term "gene" includes not only structural genes that define the primary structure of proteins, tRNA, rRNA, etc., but also regions on nucleic acids that have specific control functions, such as promoters and operators. Therefore, in the present invention, unless otherwise specified, the term "gene" refers to regulatory regions, coding regions, exons, and introns without distinction.

本明細書中において、「核酸」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと同義であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する核酸分子といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する核酸分子（またはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）も包括的に意味するものとする。また、ある配列といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列も包括的に意味するものとする。また、これらの核酸分子は環状でも直鎖状であってもよく、また合成及び生物由来のいずれであってもよい。 As used herein, "nucleic acid" is synonymous with nucleotide, oligonucleotide, and polynucleotide, and may be DNA, RNA, or a DNA-RNA hybrid. These may be double-stranded or single-stranded. When referring to a nucleic acid molecule having a certain sequence, unless otherwise specified, this also encompasses nucleic acid molecules (or nucleotides, oligonucleotides, and polynucleotides) having a complementary sequence. When referring to a sequence, this also encompasses a complementary sequence, unless otherwise specified. These nucleic acid molecules may be circular or linear, and may be synthetic or of biological origin.

X染色体の有無及びY染色体の有無の判定
本発明によれば、SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有するか否かを指標とすることにより、アスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体の有無及びY染色体の有無の判定することができる。SSM01とは本発明者らが命名した領域であり、具体的には、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．NC_033794.1で示される塩基配列の３４２３９８５～３４２４４５３位の領域を示す。例えば、アスパラガス品種‘Mary Washington 500W’のX染色体の塩基配列を以下に示す：
CCATTACCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCGATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCATGTGGACAGGTTGTTAATCTATCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGGCATTGTTCGAGAGTGCTGATGTTGATTAATATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATAAGGATCGATCTCCTCTTAAATTATGGAATGTCTGTTCTCGTGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATATATGCTTGCACTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATTGGATTCTTCCAGAGTCAGCGGTGGATAAGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC（配列番号１）
また、アスパラガス品種‘Mary Washington 500W’のＹ染色体の塩基配列を以下に示す：
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCACGTGGACAGATTGTTAATCTATCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGGCATTGTTCGAGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATTTTGATAAGGATCGATCTCCTCTTAAATTATGGAAGGTCTGTTCTAGTGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATATATGCTTGCACTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACAAGCTGGATAAAGATGTTTCCGATTGGATTCTTCCAGATTCAGTGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC（配列番号２）。 Determining the Presence or Absence of an X Chromosome and a Y Chromosome According to the present invention, the presence or absence of an X chromosome and a Y chromosome in asparagus or Hamatamabouki can be determined by using as an indicator the presence or absence of the nucleotide sequence CTAG at positions corresponding to positions 102-105 or 271-274 in SSM01. SSM01 is a region named by the present inventors, and specifically refers to the region from positions 3423985 to 3424453 in the nucleotide sequence shown in NCBI Accession No. NC_033794.1. For example, the nucleotide sequence of the X chromosome of the asparagus cultivar 'Mary Washington 500W' is shown below:
CCATTACCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCGATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCATGTGGACAGGTTGTTAATCTATCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAA ATGATGCAAATGTAGGCATTGTTCGAGAGTGCTGATGTTGATTAATATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATAAGGATCGATCTCCTCTTAAATTATGGAATGTCTGTT CTCG TGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATATATGCTTGCACTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATTGGATTCTTCCAGAGTCAGCGGTGGATAAGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC (SEQ ID NO: 1)
The base sequence of the Y chromosome of the asparagus variety 'Mary Washington 500W' is shown below:
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCACGTGGACAGATTGTTAATCTATCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAG AAAATGATGCAAATGTAGGCATTGTTCGAGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATTTTGATAAGGATCGATCTCCTCTTAAATTATGGAAGGTCTGTT CTAG TGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATATATGCTTGCACTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACAAGCTGGATAAAGATGTTTCCGATTGGATTCTTCCAGATTCAGTGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC (SEQ ID NO: 2).

本発明者らは、アスパラガス及びハマタマボウキのY染色体が、SSM01の塩基配列中に、より具体的には、SSM01の塩基配列（より典型的には配列番号２で示される塩基配列）における２７１～２７４位に相当する位置に、塩基配列CTAGを有すること、アスパラガス及びハマタマボウキのＸ染色体が、SSM01の塩基配列中に塩基配列CTAGを有さないことを見出した。また、紫アスパラガスにおいても、同様に、Y染色体が、SSM01の塩基配列中に、より具体的には、SSM01の塩基配列（より典型的には配列番号２で示される塩基配列）における２７１～２７４位に相当する位置に、塩基配列CTAGを有し、Ｘ染色体が、SSM01の塩基配列中に塩基配列CTAGを有さないが、紫アスパラガスの中にはごく一部の個体において、Y染色体がSSM01の塩基配列における１０２～１０５位に塩基配列CTAGを有するものもあることを本発明者らは見出した（配列番号３）。 The present inventors have found that the Y chromosomes of asparagus and Hamatamabouki have the nucleotide sequence CTAG in the SSM01 nucleotide sequence, more specifically, at positions corresponding to positions 271-274 in the SSM01 nucleotide sequence (more typically, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2), and that the X chromosomes of asparagus and Hamatamabouki do not have the nucleotide sequence CTAG in the SSM01 nucleotide sequence. Similarly, in purple asparagus, the Y chromosome has the nucleotide sequence CTAG in the SSM01 nucleotide sequence, more specifically, at positions corresponding to positions 271-274 in the SSM01 nucleotide sequence (more typically, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2), and the X chromosome does not have the nucleotide sequence CTAG in the SSM01 nucleotide sequence. However, the present inventors have found that in a very small proportion of purple asparagus individuals, the Y chromosome has the nucleotide sequence CTAG at positions 102-105 in the SSM01 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3).

尚、上記紫アスパラガスのある個体におけるY染色体のSSM01の塩基配列は以下の通りである：
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCATGTGGACAGATTGTTAATCTAGCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGTCATTGTTCGGGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATACGGATCGATCTCCTCTTTAATTATGGAAGGTCTGTTCTCGTGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATGCTTGCATTTGGAGATGAACTGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATGGATTCTTCCAAATTCAGCGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC（配列番号３）
尚、上記紫アスパラガスのある個体におけるＸ染色体のSSM01の塩基配列は以下の通りである：
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCACGTGGACAGATTGTTAATCTATCACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGGCATTGTTTGAGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATAAGGATCGATCTCCTCTTTAATTATGGAATGTCTGTTCTCGTGATTTGAAATCTTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATGCTTGCATTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATTGGATTCTTCCAGAGTCAGCGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC（配列番号４）
Ｘ染色体及びＹ染色体における塩基配列CTAGの有無は、アスパラガス及びハマタマボウキに属する種間、株間で保存されているが、それ以外の配列は異なり得る（図５）。従って、本発明において、「２７１～２７４位に相当する位置」とは、配列番号２における２７１～２７４位より上位で１個又は複数の塩基が付加又は欠失している配列において、上記付加又は欠失で２７１～２７４位から前後した４塩基の位置を意図する。例えば、配列番号１においては、２７７～２８０位（下線部分）が「SSM01における２７１～２７４位に相当する位置」にあたる。同様に「１０２～１０５位に相当する位置」とは、配列番号２における１０２～１０５位より上位で１個又は複数の塩基が付加又は欠失している配列において、上記付加又は欠失で１０２～１０５位から前後した４塩基の位置を意図する。 The base sequence of SSM01 on the Y chromosome of the above purple asparagus individual is as follows:
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCATGTGGACAGATTGTTAAT CTAG CACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGTCATTGTTCGGGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATACGGATCGATCTCTCTTTAATTATGGAAGGTCTGTTCTCGTGATTTGAAATC TTTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATGCTTGCATTTGGAGATGAACTGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATGGATTCTTCCAAATTCAGCGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC (SEQ ID NO: 3)
The base sequence of SSM01 on the X chromosome of the above purple asparagus individual is as follows:
CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTGGTACAAGGAGTGTATCAATCAATAAAGAAGATAGTTTCACAAAAGGATTGAGCAATTTCACGTGGACAGATTGTTAAT CTAT CACACCTACTCATTCAGTCATCAGATCAAGAAAATGATGCAAATGTAGGCATTGTTTGAGAGTGCTGATGTTGATTTAGCATGCGATACACGTGAAAACTAAAGGTCAAGAATCATCTGCATCTTGATAAGGATCGATCTCCTTCTTTAATTATGGAATGTCTGTTCTCGTGATTTGAAATCT TTCTTAATGACTTCTGCGCACAAACCTACTCCTATATGCTTGCATTTGGAGATGAACCGTCCTTAAAGTTTCTGCAGTCCTTCTCTTACTTTACCAGGATAAAGATGTTTCTGATTGGATTCTTCCAGAGTCAGCGGTGGATATGGGAGATCAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC (SEQ ID NO: 4)
The presence or absence of the base sequence CTAG on the X and Y chromosomes is conserved among species and strains belonging to Asparagus and Atractylodes spp., but other sequences may vary (Figure 5). Therefore, in the present invention, "positions corresponding to positions 271 to 274" refers to the four base positions preceding or following positions 271 to 274 in SEQ ID NO: 2, in which one or more bases have been added or deleted above positions 271 to 274. For example, in SEQ ID NO: 1, positions 277 to 280 (underlined) correspond to "positions corresponding to positions 271 to 274 in SSM01." Similarly, "positions corresponding to positions 102 to 105" refers to the four base positions preceding or following positions 102 to 105 in SEQ ID NO: 2, in which one or more bases have been added or deleted above positions 102 to 105.

本発明の方法の測定対象となる植物としては、アスパラガス及びハマタマボウキが挙げられる。アスパラガスとしては、グリーンアスパラガス、紫アスパラガス等が挙げられる。また、アスパラガスには、上記のアスパラガスに日光を当てずに育てる、いわゆる軟白栽培をすることにより得られるホワイトアスパラガスも含まれる。本発明の方法によれば、グリーンアスパラガス、ホワイトアスパラガスだけでなく、紫アスパラガスのＸ染色体、Ｙ染色体の有無を判別することができるため非常に有用である。本発明においては、用語「アスパラガス」には、学名Asparagus officinalisに分類されるものだけでなく、その近縁野生種のうち、例えば、学名Asparagus maritimusで分類されるものも包含される。より具体的な実施形態において、アスパラガスの品種としては、例えば、Mary Washington 500W’、‘Pacific 2000’、‘JWC1’、‘UC157F1’、Gijnlim’、‘Purple Passion’、‘Pacific Purple’、‘RG紫色舞ルーチェ’、‘RG紫色舞ファースト’、NJ1064、‘Erasmus’等が挙げられる。また、本発明の方法の対象となる植物としては、ハマタマボウキ（Asparagus kiusianus）も挙げられる。また、SSM01、より具体的にはSSM01の１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する箇所に変異を生じさせない限り、アスパラガス及びハマタマボウキは、（交配、遺伝子組み換え等により）遺伝子改変を行ったものであってもよい。また、後述するように、Y染色体においてSSM01の塩基配列中に塩基配列CTAGを有し、Ｘ染色体においてSSM01の塩基配列中に塩基配列CTAGを有さないという特徴は、アスパラガスとハマタマボウキとの間で共通している。従って、本発明の方法は、アスパラガスとハマタマボウキとの交雑種に対しても摘要することができる。従って、本発明において「アスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体の有無及びY染色体の有無の判定」には、これらのアスパラガス又はハマタマボウキに対し遺伝子改変を行ったものであったり、これらの交雑種におけるX染色体の有無及びY染色体の有無の判定を行うことも包含される。 Plants that can be measured using the method of the present invention include asparagus and Hamatamabouki. Examples of asparagus include green asparagus and purple asparagus. Asparagus also includes white asparagus, which is obtained by growing the above-mentioned asparagus without exposing it to sunlight, a process known as blanching. The method of the present invention is highly useful because it can determine the presence or absence of X and Y chromosomes not only in green asparagus and white asparagus, but also in purple asparagus. In the present invention, the term "asparagus" includes not only those classified under the scientific name Asparagus officinalis, but also its closely related wild species, such as those classified under the scientific name Asparagus maritimus. In a more specific embodiment, examples of asparagus varieties include 'Mary Washington 500W', 'Pacific 2000', 'JWC1', 'UC157F1', 'Gijnlim', 'Purple Passion', 'Pacific Purple', 'RG Murasaki Mai Luce', 'RG Murasaki Mai First', NJ1064, and 'Erasmus'. Plants that can be subjected to the methods of the present invention include Asparagus kiusianus. Asparagus and Asparagus kiusianus may be genetically modified (by hybridization, genetic recombination, etc.) as long as mutations are not introduced into SSM01, more specifically, at positions 102 to 105 or 271 to 274 of SSM01. Furthermore, as described below, the characteristic that the Y chromosome contains the CTAG base sequence in the SSM01 base sequence and the X chromosome does not contain the CTAG base sequence is shared between asparagus and Hamatamabouki. Therefore, the method of the present invention can also be applied to hybrids between asparagus and Hamatamabouki. Therefore, in the present invention, "determining the presence or absence of an X chromosome and a Y chromosome in asparagus or Hamatamabouki" also includes genetically modified asparagus or Hamatamabouki, as well as determining the presence or absence of an X chromosome and a Y chromosome in a hybrid of these.

本発明の方法に用いる試料としては、ポリヌクレオチドを抽出できるものであれば特に限定されず、アスパラガス又はハマタマボウキの擬葉、葉、根、茎、花、種子等が挙げられ、効率的なDNA抽出ができる点から擬葉が好ましい。本発明の典型的な実施形態においては、まず、試料からポリヌクレオチドを抽出する。ポリヌクレオチドを抽出する方法は、本発明の属する技術分野において使用されている方法を適宜使用することができ、例えば、非特許文献２に記載の方法等が挙げられる。 The sample used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be used to extract polynucleotides. Examples include pseudo-leaves, leaves, roots, stems, flowers, and seeds of asparagus or Asparagus spp., with pseudo-leaves being preferred due to the efficient DNA extraction that can be achieved. In a typical embodiment of the present invention, polynucleotides are first extracted from the sample. Polynucleotide extraction can be performed using any method used in the technical field to which the present invention pertains, such as the method described in Non-Patent Document 2.

本発明において、抽出したポリヌクレオチドを用い、SSM01中の塩基配列CTAGの有無、より具体的にはSSM01の１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置における塩基配列CTAGの有無を調べる方法は特に限定されず、例えば、上記CTAGに対する制限酵素を用いる方法、上記SSM01の塩基配列を解析する方法等が挙げられる。簡便かつ再現性の高い方法として、CTAGに対する制限酵素を用いる方法が好ましい。 In the present invention, the method for using extracted polynucleotides to examine the presence or absence of the nucleotide sequence CTAG in SSM01, more specifically the presence or absence of the nucleotide sequence CTAG at positions corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 of SSM01, is not particularly limited, and examples include a method using a restriction enzyme specific for CTAG, or a method analyzing the nucleotide sequence of SSM01. A method using a restriction enzyme specific for CTAG is preferred as it is simple and highly reproducible.

本発明の好ましい実施形態においては、次に、前記のように抽出したポリヌクレオチドをテンプレートとして、SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する領域を含むポリヌクレオチドを増殖する工程を含む。増幅するポリヌクレオチドとしては、その長さが１００ｂｐ～５００ｂｐのものが好ましく、３００ｂｐ～５００ｂｐであるものがより好ましい。また、増幅するポリヌクレオチドとしてはSSM01の塩基配列（より典型的には配列番号２で示される塩基配列）における１～２３位の塩基及び４４６～４６９位の塩基を含むことが好ましい。また本発明において増殖するポリヌクレオチドとしては、下記核酸分子（１）及び（２）にアニーリング（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチド等が挙げられる：
（１）5’-CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTG-3’（配列番号５）で示される塩基配列からなる核酸分子、または配列番号３で示される塩基配列において１個又は数個（例えば、２個、３個等）の塩基が置換、欠失、又は付加された塩基配列からなる核酸分子。
（２）5’-GCTCCATACCTTAGAATTGCCTTG-3’（配列番号６）で示される塩基配列からなる核酸分子、または配列番号４で示される塩基配列において１個又は数個（例えば、２個、３個等）の塩基が置換、欠失、又は付加された塩基配列からなる核酸分子。 In a preferred embodiment of the present invention, the method next includes a step of amplifying a polynucleotide containing a region corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in SSM01 using the polynucleotide extracted as described above as a template. The polynucleotide to be amplified is preferably 100 to 500 bp in length, more preferably 300 to 500 bp. Furthermore, the polynucleotide to be amplified preferably contains bases 1 to 23 and 446 to 469 in the base sequence of SSM01 (more typically the base sequence shown in SEQ ID NO: 2). Furthermore, examples of polynucleotides to be amplified in the present invention include polynucleotides that anneal (hybridize) to the following nucleic acid molecules (1) and (2):
(1) A nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, or a nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in which one or several (e.g., two, three, etc.) bases have been substituted, deleted, or added.
(2) A nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a nucleic acid molecule consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in which one or several (e.g., two, three, etc.) bases have been substituted, deleted, or added.

本発明の典型的な実施形態において、「アニーリングする」とは、以下の条件でアニーリングすることを意図する。アニーリングの条件（ハイブリダイゼーション条件）としては、SSM01の塩基配列における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置を含むポリヌクレオチドを増幅しうるような条件であればよいが、典型的には、ストリンジェントな条件が挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、Molecular Cloning : A Laboratory Manual ( Sambrook, ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年)に記載の条件などが挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃で加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃で洗浄した場合に、陽性のアニーリングのシグナルが観察される条件が挙げられる。 In a typical embodiment of the present invention, "annealing" refers to annealing under the following conditions: The annealing conditions (hybridization conditions) may be any conditions that allow amplification of a polynucleotide containing a position corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in the nucleotide sequence of SSM01, but typically include stringent conditions.
Here, "stringent conditions" include, for example, the conditions described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Specific examples of stringent conditions include conditions under which a positive annealing signal is observed when the sample is heated at 42°C in a solution of 6xSSC, 0.5% SDS, and 50% formamide, and then washed at 68°C in a solution of 0.1xSSC, 0.5% SDS.

ポリヌクレオチドを増幅する方法としては、自体公知の方法、例えば、ＰＣＲ等を用いることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、前述の核酸分子（１）及び（２）等が挙げられる。ＰＣＲの条件は特に限定されず、本願発明が属する技術分野において使用されている条件を適宜使用することができ、また後述の実施例に記載の条件に準じて行うこともできる。 Polynucleotide amplification can be achieved by any method known per se, such as PCR. Primers used in PCR include, for example, the aforementioned nucleic acid molecules (1) and (2). PCR conditions are not particularly limited; conditions used in the technical field to which the present invention pertains can be used as appropriate, and PCR can also be performed according to the conditions described in the Examples below.

本発明の好ましい実施形態においては、次に、上記工程で増幅したポリヌクレオチドを制限酵素処理する。制限酵素としては、CTAGを認識し切断するものであれば特に限定されず、例えば、BfaI、FspBI、MaeI、XspI等が挙げられ、XspIが好ましい。当該工程は、例えば、上記工程で増幅したポリヌクレオチド及び市販の制限酵素を、当該市販の制限酵素の説明書に記載の方法に従い用いることにより行うことができる。例えば、工程で増幅したポリヌクレオチドに、制限酵素を加え、さらに任意選択で緩衝液、水等を加えて攪拌した後、一定の時間、一定の温度で放置することにより行うことができる。当該工程の温度は、特に制限酵素が活性を有する範囲で適宜設定できるが、例えば、３５～３８℃、典型的には３７℃の範囲で設定できる。当該工程の時間も特に限定されないが、例えば、３０～１８０分、好ましくは６０～１２０分の範囲で設定できる。緩衝液としては、Ｋバッファー等を用いることができる。Ｋバッファーとしては、例えば、タカラバイオ社製のものを使用することができる。反応系のｐＨも特に限定されないが、例えば、７～１０、好ましくは８～９の範囲で設定できる。ｐＨはＴｒｉｓ－ＨＣｌ等により調整することができる。当該工程により反応系中に含まれるポリヌクレオチド中に塩基配列CTAGを有するものが存在する場合には、制限酵素により切断される。そのため、次の工程で制限酵素の切断産物の有無を確認することにより、Ｙ染色体の有無を確認することができるようになる。また、次の工程で制限酵素に切断されていないポリヌクレオチドの有無を確認することによりＸ染色体の有無を確認することができるようになる。 In a preferred embodiment of the present invention, the polynucleotide amplified in the above step is then subjected to restriction enzyme digestion. The restriction enzyme is not particularly limited as long as it recognizes and cleaves CTAG, and examples include BfaI, FspBI, MaeI, and XspI, with XspI being preferred. This step can be performed, for example, by using the polynucleotide amplified in the above step and a commercially available restriction enzyme according to the instructions for the commercially available restriction enzyme. For example, the restriction enzyme can be added to the polynucleotide amplified in step 1, and optionally a buffer solution, water, etc., followed by stirring and then leaving the mixture at a constant temperature for a certain period of time. The temperature for this step can be set appropriately within the range in which the restriction enzyme is active, for example, 35 to 38°C, typically 37°C. The duration of this step is also not particularly limited, but can be set, for example, in the range of 30 to 180 minutes, preferably 60 to 120 minutes. K buffer or the like can be used as the buffer. For example, a K buffer manufactured by Takara Bio Inc. can be used. The pH of the reaction system is not particularly limited, but can be set, for example, in the range of 7 to 10, preferably 8 to 9. The pH can be adjusted with Tris-HCl or the like. If any polynucleotides containing the base sequence CTAG are present in the reaction system during this step, they will be cleaved by the restriction enzyme. Therefore, by checking for the presence or absence of restriction enzyme cleavage products in the next step, it becomes possible to confirm the presence or absence of a Y chromosome. Furthermore, by checking for the presence or absence of polynucleotides not cleaved by the restriction enzyme in the next step, it becomes possible to confirm the presence or absence of an X chromosome.

本発明の好ましい実施形態においては、次に、上記工程で制限酵素に供した試料中の、制限酵素で切断されたポリヌクレオチドの有無の確認、及び／又は制限酵素で切断されていないポリヌクレオチドの有無を検出（確認）する。制限酵素で切断されたポリヌクレオチドの有無、及び制限酵素で切断されていないポリヌクレオチドの有無を確認は、例えば、電気泳動等により行うことができる。制限酵素で切断されたポリヌクレオチドと制限酵素で切断されていないポリヌクレオチドとは分子量が大きく異なることになること、及び制限酵素で切断されているポリヌクレオチドは２つに分かれていることから、電気泳動で試料中のポリヌクレオチドを分離、検出することにより、試料中に制限酵素で切断されているポリヌクレオチドが存在しているか否か及び制限酵素で切断されていないポリヌクレオチドの有無を検出することができる。電気泳動を行う場合、ゲルとしては、アガロースゲル、アクリルアミドゲル等を用いることができる。泳動バッファーとしては、ＴＡＥバッファー、ＴＢＥバッファー、ＴＰＥバッファー等を用いることができる。また、電圧は特に限定されないが、例えば、２０～１５０Ｖ、好ましくは５０～１００Ｖの範囲で設定できる。 In a preferred embodiment of the present invention, the sample subjected to the restriction enzyme treatment in the above step is then subjected to the next step of confirming the presence or absence of polynucleotides cleaved by the restriction enzyme and/or detecting (confirming) the presence or absence of polynucleotides uncleaved by the restriction enzyme. The presence or absence of polynucleotides cleaved by the restriction enzyme and the presence or absence of polynucleotides uncleaved by the restriction enzyme can be confirmed, for example, by electrophoresis. Because polynucleotides cleaved by the restriction enzyme and polynucleotides uncleaved by the restriction enzyme have significantly different molecular weights, and polynucleotides cleaved by the restriction enzyme are separated into two, separating and detecting polynucleotides in the sample by electrophoresis can detect the presence or absence of polynucleotides cleaved by the restriction enzyme and the presence or absence of polynucleotides uncleaved by the restriction enzyme in the sample. When performing electrophoresis, agarose gel, acrylamide gel, or the like can be used as the gel. Examples of the electrophoresis buffer that can be used include TAE buffer, TBE buffer, and TPE buffer. The voltage is not particularly limited, but can be set, for example, in the range of 20 to 150 V, preferably 50 to 100 V.

本発明の方法は、試料中に、SSM01またはその（１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置を含む）部分配列を含むにおけるポリヌクレオチドであって、１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有さないポリヌクレオチドが存在する場合、当該アスパラガス又はハマタマボウキがX染色体を有すると判定し、SSM01またはその（１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置を含む）部分配列を含むにおけるポリヌクレオチドであって、１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有さないポリヌクレオチドが存在しない場合、当該アスパラガス又はハマタマボウキがX染色体を有さないと判定する工程を含んでもよい。また、本発明の方法は、試料中に、SSM01またはその（１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置を含む）部分配列を含むにおけるポリヌクレオチドであって、１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有するポリヌクレオチドが存在する場合、当該アスパラガス又はハマタマボウキがＹ染色体を有すると判定し、SSM01またはその（１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置を含む）部分配列を含むにおけるポリヌクレオチドであって、１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当する位置に塩基配列CTAGを有するポリヌクレオチドが存在しない場合、当該アスパラガス又はハマタマボウキがＹ染色体を有さないと判定する工程を含んでもよい。 The method of the present invention may include the steps of determining that the asparagus or the sea buckthorn has an X chromosome if the sample contains a polynucleotide comprising SSM01 or a partial sequence thereof (including positions corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274) that does not have the base sequence CTAG at positions 102 to 105 or 271 to 274, and determining that the asparagus or the sea buckthorn does not have an X chromosome if the sample does not contain a polynucleotide comprising SSM01 or a partial sequence thereof (including positions corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274) that does not have the base sequence CTAG at positions 102 to 105 or 271 to 274. The method of the present invention may also include a step of determining that the asparagus or the sea buckthorn has a Y chromosome if the sample contains a polynucleotide containing SSM01 or a partial sequence thereof (including positions corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274) and having the nucleotide sequence CTAG at positions 102 to 105 or 271 to 274, and determining that the asparagus or the sea buckthorn does not have a Y chromosome if the sample does not contain a polynucleotide containing SSM01 or a partial sequence thereof (including positions corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274) and having the nucleotide sequence CTAG at positions 102 to 105 or 271 to 274.

バイオマーカー
別の実施形態において、本発明は、SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる、アスパラガス又はハマタマボウキにおけるX染色体の有無及びY染色体の有無を両方検出するためのバイオマーカーを提供する。 In another embodiment, the present invention provides a biomarker for detecting both the presence or absence of an X chromosome and the presence or absence of a Y chromosome in asparagus or sea anemone, the biomarker comprising a polynucleotide containing an oligonucleotide corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in SSM01.

本発明のバイオマーカーを構成するポリヌクレオチドの長さは、３００ｂｐ～５００ｂｐであることが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーを構成するポリヌクレオチドは、SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドに加え、CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTG（配列番号３）で示される塩基配列からなる核酸分子又は当該核酸分子にアニーリングする核酸分子をさらに含んでいてもよい。また、好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーを構成するポリヌクレオチドは、SSM01における１０２～１０５位又は２７１～２７４位に相当するオリゴヌクレオチドに加え、CAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC（配列番号４）で示される塩基配列からなる核酸分子又は当該核酸分子にアニーリングする核酸分子をさらに含んでいてもよい。本発明においては、バイオマーカーを構成するポリヌクレオチドは、配列番号３で示される塩基配列からなる核酸分子又は当該核酸分子にアニーリングする核酸分子；及び配列番号４で示される塩基配列からなる核酸分子又は当該核酸分子にアニーリングする核酸分子の両方を含むことが好ましい。本発明のバイオマーカーは、アスパラガス及びハマタマボウキにおけるＸ染色体及びＹ染色体の有無を検出するために用いることができる。 The length of the polynucleotide constituting the biomarker of the present invention is preferably 300 bp to 500 bp. In a preferred embodiment, the polynucleotide constituting the biomarker of the present invention may further comprise, in addition to the oligonucleotide corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in SSM01, a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTG (SEQ ID NO: 3) or a nucleic acid molecule that anneals to said nucleic acid molecule. Also, in a preferred embodiment, the polynucleotide constituting the biomarker of the present invention may further comprise, in addition to the oligonucleotide corresponding to positions 102 to 105 or 271 to 274 in SSM01, a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in CAAGGCAATTCTAAGGTATGGAGC (SEQ ID NO: 4) or a nucleic acid molecule that anneals to said nucleic acid molecule. In the present invention, the polynucleotide constituting the biomarker preferably comprises both a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid molecule that anneals to said nucleic acid molecule; and a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid molecule that anneals to said nucleic acid molecule. The biomarkers of the present invention can be used to detect the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and sea anemone.

本発明によれば、アスパラガス及びハマタマボウキにおけるＸ染色体及びＹ染色体の有無を検出するための新たなバイオマーカー及び方法を提供することができる。従って、本発明によれば、アスパラガス及びハマタマボウキの性染色体がＸＸ型、ＸＹ型、ＹＹ型のいずれであるかを判別することができるため、対象のアスパラガス及びハマタマボウキが、雄株（ＸＹ型）であるか、雌株（ＸＸ型）であるか、超雄株（ＹＹ型）であるかを判別できる。従って、本発明によれば、超雄株（ＹＹ型）の選抜に使用することができる。本発明において、性染色体のＸＸ型、ＸＹ型、ＹＹ型は、それぞれ、ｍｍ型、ｍＭ型、ＭＭ型と表示することもできる。 The present invention provides new biomarkers and methods for detecting the presence or absence of X and Y chromosomes in asparagus and sea buckthorn. Therefore, the present invention makes it possible to determine whether the sex chromosomes of asparagus and sea buckthorn are XX, XY, or YY types, and therefore whether the target asparagus or sea buckthorn is a male (XY type), a female (XX type), or a super-male (YY type). Therefore, the present invention can be used to select super-males (YY type). In the present invention, the XX, XY, and YY types of sex chromosomes can also be expressed as mm, mM, and MM, respectively.

以下に実施例を用いて本発明の好ましい実施形態を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。 The following examples will specifically explain preferred embodiments of the present invention, but the present invention is not limited to these examples.

実験材料
アスパラガス品種：‘Mary Washington 500W’ 、‘Pacific 2000’ 、‘JWC1’ 、 ‘UC157F1’ 、‘Gijnlim’ （全雄）
紫アスパラガス品種：‘Purple Passion’、‘Pacific Purple’、‘RG紫色舞ルーチェ’、‘RG紫色舞ファースト’、NJ1064（全雄）、‘Erasmus’（全雄）
アスパラガス近縁野生種：Asparagus maritimus
ハマタマボウキ：Asparagus kiusianus
全DNA抽出法
各個体から疑葉5-10本を採取し、Honda and Hirai (1990)* の方法に従い全DNAの抽出を行った。DNA抽出buffer ((1M Tris・HCl (pH 8.0) 10ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml、NaCl 2.9g、H₂O) /100ml) 600μlとメルカプトエタノール 1μlを転倒混和し、そのうち300μlをサンプルチューブに加え、ジルコニアビーズを入れシェイカーで破砕した。破砕後、残りのDNA抽出bufferとメルカプトエタノールの混合溶液 300μlと、20% SDS 40μlをサンプルチューブに加え転倒混和し、65℃で10分間インキュベートした。5M 酢酸カリウム溶液((5M Potassium acetate 60ml、glacial acetic acid 11.5ml、H₂O) /100ml) 200μlを加え転倒混和し、氷上で20分間静置後、14500rpm(4℃)で20分間遠心した。上清をミラクロスで濾過し、新たなチューブに移した。イソプロパノール 400μlを加え転倒混和し、-20℃で20分間静置後、13000rpm(4℃)で15分間遠心した。上清を捨て、ペーパータオル上にフタを開けた状態でチューブを逆さに置き10分間静置した。5-1 TE buffer((1M Tris・HCl(pH 8.0) 5ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 2ml、H₂O) /100ml)140μlを加えボルテックスで良く混合し、ペレットを完全に溶解させた後、14000rpm(4℃)で10分間遠心した。上清を新たなチューブに移し、3M 酢酸ナトリウム溶液15μlとイソプロパノール 100μlを加え転倒混和し、-20℃で20分間静置後、14000rpm(4℃)で10分間遠心した。上清を捨て70% エタノール 300μlを加えボルテックスで良く混合した後、14000rpm(4℃)で5分間遠心した。上清を捨て、ペーパータオル上にフタを開けた状態でチューブを逆さに置き風乾し、真空ポンプで10分間乾燥させた後、TE buffer 100μlに溶解した。 Experimental Materials Asparagus varieties: 'Mary Washington 500W', 'Pacific 2000', 'JWC1', 'UC157F1', 'Gijnlim' (all males)
Purple asparagus varieties: 'Purple Passion', 'Pacific Purple', 'RG Purple Mai Luce', 'RG Purple Mai First', NJ1064 (all male), 'Erasmus' (all male)
Wild relative of asparagus: Asparagus maritimus
Asparagus kiusianus
Total DNA extraction method
Five to ten pseudo-leaves were collected from each individual plant, and total DNA was extracted according to the method of Honda and Hirai (1990). Six hundred microliters of DNA extraction buffer (10 ml of 1 M Tris·HCl (pH 8.0), 10 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2.9 g of NaCl, and _H2O )/100 ml) and 1 μl of mercaptoethanol were mixed by inversion, and 300 μl of this mixture was added to a sample tube. Zirconia beads were added and the leaves were crushed on a shaker. After crushing, the remaining 300 μl of the DNA extraction buffer and mercaptoethanol mixture and 40 μl of 20% SDS were added to the sample tube, mixed by inversion, and incubated at 65°C for 10 minutes. 200 μl of 5M potassium acetate solution (60 ml of 5M potassium acetate, 11.5 ml of glacial acetic acid, H ₂ O)/100 ml was added, mixed by inversion, left to stand on ice for 20 minutes, and then centrifuged at 14,500 rpm (4°C) for 20 minutes. The supernatant was filtered through Miracloth and transferred to a new tube. 400 μl of isopropanol was added, mixed by inversion, left to stand at -20°C for 20 minutes, and then centrifuged at 13,000 rpm (4°C) for 15 minutes. The supernatant was discarded, and the tube was placed upside down on a paper towel with the lid open and left to stand for 10 minutes. 5-1 140 μl of TE buffer (5 ml of 1 M Tris·HCl (pH 8.0), 2 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0), H ₂ O)/100 ml) was added and mixed well by vortexing. The pellet was completely dissolved and then centrifuged at 14,000 rpm (4°C) for 10 minutes. The supernatant was transferred to a new tube, and 15 μl of 3 M sodium acetate solution and 100 μl of isopropanol were added. The mixture was mixed by inversion and left to stand at -20°C for 20 minutes, after which it was centrifuged at 14,000 rpm (4°C) for 10 minutes. The supernatant was discarded, and 300 μl of 70% ethanol was added, mixed well by vortexing, and then centrifuged at 14,000 rpm (4°C) for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the tube was placed upside down on a paper towel with the lid open to air dry. It was then dried using a vacuum pump for 10 minutes, and then dissolved in 100 μl of TE buffer.

*Honda H, Hirai A (1990) A simple and efficient method for identification of hybrids using nonradioactive rDNA as probe. Jpn. J. Breed. 40:339-348
プライマー配列情報（5’-3’）
SSM01_Fw: CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTG
SSM01_Rev: GCTCCATACCTTAGAATTGCCTTG
PCR反応
全DNAを鋳型とし、SSM01マーカーを用いてPCR反応を行った。反応液は以下のように調製した。 *Honda H, Hirai A (1990) A simple and efficient method for identification of hybrids using nonradioactive rDNA as probe. Jpn. J. Breed. 40:339-348
Primer sequence information (5'-3')
SSM01_Fw: CCATTCCCTGCAAAGTTTAGGTG
SSM01_Rev: GCTCCATACCTTAGAATTGCCTTG
PCR reaction
PCR was performed using the total DNA as a template and the SSM01 marker. The reaction mixture was prepared as follows.

反応液をよく撹拌し、サーマルサイクラーにセットし、以下の条件でPCR反応を行った。 The reaction mixture was mixed well, placed in a thermal cycler, and PCR was carried out under the following conditions.

制限酵素処理
SSM01プライマーを用いて増幅したPCR産物を制限酵素XspＩを用いて制限酵素処理を行った。反応液は以下のように調製した。 Restriction enzyme digestion
The PCR product amplified using the SSM01 primer was subjected to restriction enzyme treatment with the restriction enzyme XspI. The reaction solution was prepared as follows.

反応液をよく撹拌し、インキュベーターに入れて37℃で90分間反応を行った。 The reaction mixture was mixed well and placed in an incubator at 37°C for 90 minutes.

アガロースゲル電気泳動
制限酵素処理後、反応液全量を、エチジウムブロマイドを添加した1.0%アガロースゲルで電気泳動し、UVトランスイルミネーター上でDNAを確認し、デジタルカメラによりゲルの写真を撮影した。 Agarose Gel Electrophoresis After restriction enzyme treatment, the entire reaction mixture was electrophoresed on a 1.0% agarose gel containing ethidium bromide, the DNA was confirmed on a UV transilluminator, and the gel was photographed with a digital camera.

実験結果
実験結果を図１～４に示す。アスパラガス品種（図１）、紫アスパラガス品種（図２）、ハマタマボウキ（図３）、Asparagus maritimus（図４）のいずれにおいても、雄個体においては、XspＩで切断されたSSM01に由来する２つのバンドとXspＩで切断されていないSSM01に由来する１つのバンドが共に検出された。具体的には、アスパラガス品種 ‘Mary Washington 500W’ 、‘Pacific 2000’ 、‘JWC1’ 、 ‘UC157F1’ 、‘Gijnlim’の全てにおいて、雄個体ではＹ染色体のSSM01は２７１～２７４位に相当する位置で切断されていた。紫アスパラガス品種のうち‘Purple Passion’、‘RG紫色舞ルーチェ’、‘RG紫色舞ファースト’、‘NJ1064’（全雄）、‘Erasmus’（全雄）においてはいずれも、雄個体で、Ｙ染色体のSSM01は２７１～２７４位に相当する位置で切断されていた（図１）。紫アスパラガス品種のうち‘Pacific Purple’においても雄個体ではＹ染色体のSSM01がXspＩで切断されたが、切断位置は、２７１～２７４位に相当する位置で切断されたもの（PP-m 雄個体）だけでなく、１０２～１０５位に相当する位置で切断されたもの（PP-m* 雄個体）もあった（図２）。アスパラガスの近縁野生種であるハマタマボウキ（Asparagus kiusianus）も雄個体においてＹ染色体のSSM01は２７１～２７４位に相当する位置で切断されていた（図３）。アスパラガスの近縁野生種であるAsparagus maritimusでは、雄個体においてＹ染色体のSSM01は１０２～１０５位に相当する位置で切断されていた（図４）。また、上記いずれの品種においても、雌個体においては、XspＩで切断されていないSSM01に由来する１つのバンドのみが検出され、XspＩで切断されたSSM01に由来する２つのバンドは検出されなかった。 The experimental results are shown in Figures 1 to 4. In all of the asparagus cultivars (Figure 1), purple asparagus cultivars (Figure 2), Hamatamabouki (Figure 3), and Asparagus maritimus (Figure 4), two bands derived from XspI-cleaved SSM01 and one band derived from uncleaved SSM01 were detected in male individuals. Specifically, in all of the asparagus cultivars 'Mary Washington 500W', 'Pacific 2000', 'JWC1', 'UC157F1', and 'Gijnlim', SSM01 on the Y chromosome was cleaved at positions corresponding to positions 271 to 274 in male individuals. In the purple asparagus cultivars 'Purple Passion,''RG Murasaki Mai Luce,''RG Murasaki Mai First,''NJ1064' (all males), and 'Erasmus' (all males), SSM01 on the Y chromosome was disrupted at positions 271-274 in all males (Fig. 1). In the purple asparagus cultivar 'Pacific Purple,' SSM01 on the Y chromosome was also disrupted by XspI in males, but the disruption occurred not only at positions 271-274 (PP-m males) but also at positions 102-105 (PP-m* males) (Fig. 2). In males of Asparagus kiusianus, a wild relative of asparagus, SSM01 on the Y chromosome was also disrupted at positions 271-274 (Fig. 3). In Asparagus maritimus, a wild species closely related to asparagus, SSM01 on the Y chromosome was truncated in male individuals at positions corresponding to positions 102 to 105 (Fig. 4). In addition, in female individuals of all the above cultivars, only one band derived from SSM01 that was not cleaved with XspI was detected, and the two bands derived from SSM01 that was cleaved with XspI were not detected.

Claims

A method for determining the presence or absence of an X chromosome and a Y chromosome in asparagus or azalea, using as indicators the presence or absence of a polynucleotide that does not have the nucleotide sequence CTAG at positions corresponding to positions 102-105 or 271-274 in the region from positions 3423985 to 3424453 in the nucleotide sequence shown in NCBI Accession No. NC_033794.1, and the presence or absence of a polynucleotide that has the nucleotide sequence CTAG at positions corresponding to positions 271-274 in the region from positions 3423985 to 3424453 in the nucleotide sequence shown in NCBI Accession No. NC_033794.1.

The method of claim 1, comprising the steps of: extracting from a sample a polynucleotide containing an oligonucleotide corresponding to positions 102-105 or 271-274 of the region of positions 3423985-3424453 of the nucleotide sequence set forth in NCBI Accession No. NC_033794.1; amplifying a region of the polynucleotide containing the oligonucleotide corresponding to positions 102-105 or 271-274 of the region of positions 3423985-3424453 of the nucleotide sequence set forth in NCBI Accession No. NC_033794.1; treating the polynucleotide amplified in the above step with a restriction enzyme that recognizes CTAG; and detecting the amplified polynucleotide and polynucleotides formed by cleavage of the amplified polynucleotide with the restriction enzyme.

The method of claim 2, wherein the presence of an X chromosome in asparagus or sea anemone is determined when the amplified polynucleotide that has not been cleaved by a restriction enzyme is detected in the detection step.

The method of claim 2 or 3, wherein the presence of a Y chromosome in asparagus or sea anemone is determined if the amplified polynucleotide cleaved by a restriction enzyme is detected in the detection step.