JP7735545B2 - Ｃｄｃプラットホーム抗体 - Google Patents

Description

本発明は、抗体の分野に関し、具体的に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）プラットホーム抗体に関する。

補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃ）は、正常なヒトおよび動物の血清と組織液に存在する一組の活性化すると酵素活性があるタンパク質である。１９世紀末に、Ｂｏｒｄｅｔにより、新鮮な血液に熱耐性のない成分が含まれていることが既に実証され、特異的抗体を補助・補充し、免疫溶菌、溶血作用を仲介することができるため、補体と呼ばれる。補体は、３０数種類の可溶性タンパク質、膜結合性タンパク質および補体受容体からなる多分子システムで、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる。正常な場合、補体は血漿タンパク質の構成成分である。補体系の各成分は、活性のない前駆体として血漿に存在する。必要な時、活性化物質、たとえば、抗原－抗体複合体などの作用により、順に活性化され、最終的に作用を発揮する。補体系の各成分の生物学的機能により、補体固有成分、補体調節成分および補体受容体に分かれる。

補体固有成分は、以下の４種類に分かれる：１、古典活性化経路のＣ１、Ｃ２、Ｃ４；２、副経路活性化経路のＢ因子、Ｄ因子およびＰ因子；３、マンノース結合レクチン（ｍａｎｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ、ＭＢＬ）活性化経路のＭＢＬおよびセリンプロテアーゼ；４、共通の末端経路に関与するＣ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９。

補体活性化の過程は、その開始順序により、３つの経路に分かれる：１、抗原－抗体複合体が主要な活性化物質である、Ｃ１ｑ－Ｃ１ｒ２－Ｃ１ｓ２からの古典経路（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）；２、抗体に依存しないＣ３からの副経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ）；３、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）グルコシル基によって認識するレクチン活性化経路（ＭＢＬ ｐａｔｈｗａｙ）。上記の３つの経路は共通の末端経路、すなわち、膜侵襲複合体の形成およびその細胞溶解効果がある。

補体の古典活性化経路（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）とは、主にＣ１ｑが免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）と結合すると、順にＣ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３が活性化され、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ ２ｂ）とＣ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ）が形成するカスケード酵素触媒反応の過程である。それは抗体が仲介する体液免疫応答の主な作用形態である。

免疫複合体は、主に、抗原に結合するＩｇＧ、ＩｇＭ分子である。各Ｃ１ｑ分子は２つ以上のイムノグロブリン分子のＦｃ部分と結合する必要があり、遊離または可溶性の抗体は補体を活性化させない。古典経路の活性化に関与する補体成分は、順に、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２およびＣ３、Ｃ５～Ｃ９である。

古典経路の活性化過程は、３つの主要な段階に分かれる：１、認識段階；２、活性化段階；３、膜侵襲段階。補体系の活性化過程において、多くの生物活性物質が発生し、一連の生物学的効果を引き起こす。補体の生物学的効果は、１、貪食作用の増強、貪食細胞の走化性の増強；２、血管の透過性の増強；３、ウイルスの中和；４、細胞溶解作用；５、免疫反応の調節作用などがある。

研究（参照文献：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩｇＧ Ｈｅｘａｍｅｒｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１４， ３４３（６１７６）：１２６０－３．）では、六量体はＣ１ｑに結合して古典活性化経路を開始させる最も有効な形態であることが示された。Ｇｅｎｍａｂはこの原理に基づいてＨｅｘａＢｏｄｙプラットホームを開発した（参照文献：Ｊｏｎｇ Ｒ ， Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ Ｆ Ｊ ， Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓら， Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｈｅｘａｍｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］． ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１６， １４（１）：ｅ１００２３４４．）。当該プラットホーム技術の特徴は、Ｆｃの特定の部位の突然変異（たとえば、Ｅ３４５Ｒ）を誘導することにより、ＦｃとＦｃの間の相互作用を増強し、抗体が細胞表面の抗原に結合した後、より六量体になりやすいように促進することができることである。形成する六量体は、有効に免疫反応の機能、特に抗体の補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を向上させることができる。しかしながら、既存技術における方法はまだ満足できるものとは言えない。

ＡＤＣＣ、すなわち、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）とは、抗体のＦａｂ領域が腫瘍細胞またはほかの標的細胞の表面の抗原と、Ｆｃ領域が殺傷細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）の表面のＦｃγＲと結合することにより、殺傷細胞の直接の標的細胞の殺傷を仲介することである。中では、ＮＫ細胞は抗体がＡＤＣＣ作用を発揮する主なエフェクター細胞で、抗体のＦｃ領域がＮＫ細胞の表面のＦｃγＲと結合すると、後者が活性化され、活性化されたＮＫ細胞はパーフォリン、グランザイムなどの細胞傷害物質を放出して標的細胞のアポトーシスを誘導することで、標的細胞を殺傷する目的を果たす。よって、ＡＤＣＣ効果は関連抗体が生物学的活性を発揮する主な機序の一つでもある。現在、生物医薬の分野において、ＡＤＣＣ活性について最も開発されている抗体のサブタイプは野生型のＩｇＧ１である。

そのため、本分野では、良いＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を有するプラットホーム抗体の開発がまだ必要である。

本発明の目的は、抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣ活性を増強するプラットホーム、好ましくは抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を増強するプラットホームを提供することにある。

本発明の第一の側面では、抗原結合活性およびＣＤＣ活性を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質であって、所定の抗原を標的とする結合機能ドメイン、および重鎖Ｆｃ領域エレメントを含み、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、
（１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置に、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸残基が含まれており；ならびに／あるいは
（２） Ｃ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている
ものを提供する。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントとテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントはリンカーを介して連結している。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは２本の重鎖Ｆｃ領域を含み、各重鎖Ｆｃ領域は、（１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置に、それぞれ独立に、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸残基がそれぞれ独立含まれており；ならびに／あるいは
（２） Ｃ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている。

もう一つの好適な例において、各重鎖Ｆｃ領域は、３４５番目の位置に、さらに、Ｒが含まれている。

もう一つの好適な例において、前記の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は、さらに、ＡＤＣＣ活性を有する。

もう一つの好適な例において、前記所定の抗原を標的とする結合機能ドメインは、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＣＤ２５、Ｔｒｏｐ－２、ＥｐＣＡＭ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗原分子に結合する。

もう一つの好適な例において、前記所定の抗原を標的とする結合機能ドメインは、ＶＨ、ＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖまたはＶＨＨからなる群から選ばれるドメインを含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのＣＨ３ドメインのＣ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記ＩｇＧは配列番号３１、配列番号３２または配列番号３４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。

もう一つの好適な例において、前記ＩｇＧは哺乳動物、好ましくはネズミ、カニクイザルまたはヒト、より好ましくはヒト由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはヒトＩｇＧ１由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ１由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインを含む。

もう一つの好適な例において、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は単特異性、二重特異性、三重特異性または多重特異性抗体またはその断片もしくは融合タンパク質である。

もう一つの好適な例において、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は二量体、三量体または多量体である。

もう一つの好適な例において、前記多量体は六量体である。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＦｃ領域の３０９番目の位置にＦ、Ｃ、ＷまたはＹからなる群から選ばれるアミノ酸残基が含まれている。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、さらに、ほかの位置のアミノ酸置換を含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、さらに、Ｆｃ領域の３４５番目の位置におけるグルタミン酸残基のアルギニン残基による置換（Ｅ３４５Ｒ）を含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、以下の群から選ばれるＦｃ領域の位置のアミノ酸残基置換を含む：
（１）Ｌ３０９Ｗ＋Ｅ３４５Ｒ；
（２）Ｌ３０９Ｙ＋Ｅ３４５Ｒ；
（３）Ｌ３０９Ｅ＋Ｅ３４５Ｒ；
（４）Ｌ３０９Ｆ＋Ｅ３４５Ｒ；
（５）Ｌ３０９Ｈ＋Ｅ３４５Ｒ；
（６）Ｌ３０９Ｃ＋Ｅ３４５Ｒ；
（７）Ｌ３０９Ｄ＋Ｅ３４５Ｒ；
（８）Ｌ３０９Ｎ＋Ｅ３４５Ｒ；
（９）Ｌ３０９Ｑ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１０）Ｌ３０９Ｒ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１１）Ｌ３０９Ｓ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１２）Ｌ３０９Ｔ＋Ｅ３４５Ｒ；または
（１３）Ｌ３０９Ｋ＋Ｅ３４５Ｒ。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、Ｆｃ領域の位置にＬ３０９Ｗ＋Ｅ３４５Ｒのアミノ酸残基置換がある。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのアミノ酸の番号はＥＵ番号付けシステムに準ずるものである。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントはヒトＩｇＭ由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントに１つまたは複数のアミノ酸の突然変異が含まれている。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントの配列は配列番号７または８で示されるものである。

もう一つの好適な例において、前記所定の抗原を標的とする結合機能ドメインはＣＤ３８に結合する結合機能ドメインで、以下の群から選ばれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（１） 重鎖可変領域であって、以下に示される３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの：
配列番号１１で示されるＨ－ＣＤＲ１；
配列番号１２で示されるＨ－ＣＤＲ２；
配列番号１３で示されるＨ－ＣＤＲ３；および
軽鎖可変領域であって、以下に示される３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの：
配列番号１４で示されるＬ－ＣＤＲ１；
配列番号１５で示されるＬ－ＣＤＲ２；
配列番号１６で示されるＬ－ＣＤＲ３；あるいは
（２） 重鎖可変領域であって、以下に示される３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの：
配列番号３５で示されるＨ－ＣＤＲ１；
配列番号３６で示されるＨ－ＣＤＲ２；
配列番号３７で示されるＨ－ＣＤＲ３；および
軽鎖可変領域であって、以下に示される３つの相補性決定領域ＣＤＲを含むもの：
配列番号３８で示されるＬ－ＣＤＲ１；
配列番号３９で示されるＬ－ＣＤＲ２；
配列番号４０で示されるＬ－ＣＤＲ３。

もう一つの好適な例において、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は以下の群から選ばれる：
（ａ） 以下の群から選ばれるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質：
配列番号３５で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号３７で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号３８で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１１で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号１３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号１４で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号３５で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号３７で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号３８で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１１で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号１３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号１４で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号３５で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号３７で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号３８で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１１で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号１３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号１４で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を軽鎖；
（ｂ）（ａ）におけるアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなる、抗原結合機能および前記ＣＤＣ活性を有する（ａ）から誘導されるポリペプチド。

もう一つの好適な例において、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は以下の群から選ばれる：
（ａ） 以下の群から選ばれるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質：
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置ＷまたはＹ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置ＷまたはＹ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を軽鎖；
（ｂ）（ａ）におけるアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなる、抗原結合機能および前記ＣＤＣ活性を有する（ａ）から誘導されるポリペプチド。

もう一つの好適な例において、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は以下の群から選ばれる：
（ａ） 以下の群から選ばれるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質：
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３１で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３２で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３２で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３４で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２で示される配列を有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
配列番号２１で示される配列を有するＶＨ領域と、配列番号３４で示される配列を有する重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号２２で示される配列を有するＶＬ領域を軽鎖；
（ｂ）（ａ）におけるアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなる、抗原結合機能および前記ＣＤＣ活性を有する（ａ）から誘導されるポリペプチド。

本発明の第二の側面では、抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣを向上させる方法であって、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質はイムノグロブリンのＦｃ領域および所定の抗原を標的とする結合機能ドメインを含み、前記方法は、以下の工程を含む方法を提供する：
（Ｓ１ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基における突然変異を当該抗体またはその断片もしくは融合タンパク質に導入し、前記突然変異はＩｇＧの重鎖のＦｃ領域の３０９番目を、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸に突然変異させるものを含む；ならびに／あるいは
（Ｓ１ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に、配列番号７または８で示される、テールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントを融合する。

もう一つの好適な例において、前記ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域における３０９番目のＬを、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸に突然変異させる。

もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、以下の工程を含む：
（Ｓ２）突然変異後の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質と突然変異前の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣ性能を比較する。

もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＡＤＣＣの活性を向上させる工程を含む。

もう一つの好適な例において、前記（Ｓ１ａ）および（Ｓ１ｂ）は、同時に、前後にまたは逆転した順で行われる。

もう一つの好適な例において、前記突然変異はＩｇＧの重鎖のＦｃ領域における３０９番目を、Ｗ、Ｙからなる群から選ばれるアミノ酸に突然変異させるものを含む。

もう一つの好適な例において、工程（Ｓ１ａ）では、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質において重鎖Ｆｃ領域における３０９番目がＹでもＷでもない場合、それをＹまたはＷに突然変異させる。

もう一つの好適な例において、工程（Ｓ１ａ）では、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質において重鎖Ｆｃ領域における３０９番目がＹではない場合、それをＹに突然変異させる。

もう一つの好適な例において、工程（Ｓ１ａ）では、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質において重鎖Ｆｃ領域における３０９番目がＷではない場合、それをＷに突然変異させる。

もう一つの好適な例において、工程（Ｓ１ａ）では、前記突然変異は、さらに、ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域における３４５番目をＲに突然変異させるものを含む。

もう一つの好適な例において、工程（Ｓ１ａ）では、前記突然変異は、ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域における３０９番目のＬを、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸に突然変異させるもの；ならびに
ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域における３４５番目のＥをＲに突然変異させるものを含む。

本発明の第三の側面では、重鎖Ｆｃ領域エレメントであって、
（１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置に、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸残基が含まれており；ならびに／あるいは
（２） Ｃ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている
ものを提供する。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントとテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントはリンカーを介して連結している。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのＣＨ３ドメインのＣ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはヒトＩｇＧ１由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＩｇＧ１由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインを含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントはＦｃ領域の３０９番目の位置にＦ、Ｃ、ＷまたはＹからなる群から選ばれるアミノ酸残基が含まれている。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、さらに、ほかの位置のアミノ酸置換を含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、さらに、Ｆｃ領域の３４５番目の位置におけるグルタミン酸残基のアルギニン残基による置換（Ｅ３４５Ｒ）を含む。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、以下の群から選ばれるＦｃ領域の位置のアミノ酸残基置換を含む：
（１）Ｌ３０９Ｗ＋Ｅ３４５Ｒ；
（２）Ｌ３０９Ｙ＋Ｅ３４５Ｒ；
（３）Ｌ３０９Ｅ＋Ｅ３４５Ｒ；
（４）Ｌ３０９Ｆ＋Ｅ３４５Ｒ；
（５）Ｌ３０９Ｈ＋Ｅ３４５Ｒ；
（６）Ｌ３０９Ｃ＋Ｅ３４５Ｒ；
（７）Ｌ３０９Ｄ＋Ｅ３４５Ｒ；
（８）Ｌ３０９Ｎ＋Ｅ３４５Ｒ；
（９）Ｌ３０９Ｑ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１０）Ｌ３０９Ｒ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１１）Ｌ３０９Ｓ＋Ｅ３４５Ｒ；
（１２）Ｌ３０９Ｔ＋Ｅ３４５Ｒ；または
（１３）Ｌ３０９Ｋ＋Ｅ３４５Ｒ。

もう一つの好適な例において、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのアミノ酸の番号はＥＵ番号付けシステムに準ずるものである。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントはヒトＩｇＭ由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントに１つまたは複数のアミノ酸の突然変異が含まれている。

もう一つの好適な例において、前記テールピースエレメントの配列は配列番号７または８で示されるものである。

本発明の第四の側面では、単離された核酸分子であって、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、あるいは本発明の第三の側面に記載の重鎖Ｆｃ領域エレメントをコードする核酸分子を提供する。

本発明の第五の側面では、本発明の第四の側面に記載の核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。

本発明の第六の側面では、本発明の第五の側面に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。

本発明の第七の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは本発明の第三の側面に記載の重鎖Ｆｃ領域エレメントの製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） 発現の条件において、本発明の第六の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、前記の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは前記の重鎖Ｆｃ領域エレメントを発現させる；
（ｂ） （ａ）に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは前記の重鎖Ｆｃ領域エレメントを単離して精製する。

本発明の第八の側面では、以下のものを含むする免疫複合体を提供する：
（ａ） 本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選ばれる複合部分。

本発明の第九の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは本発明の第八の側面に記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含有する薬物組成物を提供する。

本発明の第十の側面では、癌または免疫関連疾患を治療する薬物の製造における、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、あるいは本発明の第八の側面に記載の免疫複合体、あるいは本発明の第九の側面に記載の薬物組成物の使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記癌は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、膠細胞腫、多発性骨髄腫およびほかの新生物性悪性疾患からなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記免疫関連疾患は自己免疫性疾患、好ましくは自己免疫性腎臓疾患（免疫性腎臓炎、自己免疫性腎臓疾患）、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸管疾患、クローン病（Ｃｒｏｈｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性結腸炎、ペイロニー病（Ｐｅｙｒｏｎｉｅ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣疾患、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、手術癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝臓炎、強直性脊椎炎、線維化肺胞炎、バセドウ病（Ｇｒａｖｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ'ｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、ほかの自己免疫性障害、膵臓腺炎、創傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、心臓疾患（虚血性疾患、たとえば、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化を含む）、血管内凝固、骨再吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎および低クロール血症、胎児－母体耐性欠失に関連する不妊症、白斑、重症筋無力症（ＭＧ）、全身性強皮症、炎症性腸疾患、胃炎またはＩｇＧ４関連疾患である。

もう一つの好適な例において、前記免疫関連疾患は自己免疫性腎臓疾患、好ましくは免疫グロブリンＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）または腎障害性モノクローナル・ガンモパチー（ＭＧＲＳ）、ループス腎炎または紫斑病性腎炎である。

本発明の第十一の側面では、疾患を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、本発明の第九の側面に記載の薬物組成物あるいは本発明の第八の側面に記載の免疫複合体を施用する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記疾患は癌または免疫関連疾患を含む。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

図面の説明

図１はＦｃ部分の３０９番目の部位特異的突然変異（Ｌ３０９ Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｗ／Ｙ）を含有する抗体のＲａｊｉ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。 図２はＦｃ部分の３０９番目の部位特異的突然変異（Ｌ３０９ Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｗ／Ｙ）を含有する抗体のＤａｕｄｉ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。 図３はＦｃ部分の３０９番目の部位特異的突然変異（Ｌ３０９ Ｆ／Ｃ／Ｗ／Ｙ）を含有する抗体およびＦｃ部分の末端が改変（ＰｅｐおよびＰｅｐ－ＣＳ）された抗体のＤａｕｄｉ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。 図４はＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１およびその突然変異体のＤａｕｄｉ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。 図５は５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１およびＩｓａｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１抗体のカニクイザルＣＤ３８に対する結合能力を示す。 図６は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）が仲介する補体活性化のＤａｕｄｉ細胞に対する殺傷活性を示す。 図７は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブが仲介する補体活性化のＲｏｍａｓ細胞に対する殺傷活性を示す。 図８は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブが仲介する補体活性化のＲａｊｉ細胞に対する殺傷活性を示す。 図９は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブが仲介するＡＤＣＣ効果のＤａｕｄｉ細胞に対する殺傷活性を示す。 図１０は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブが仲介するＡＤＣＣ効果のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対する殺傷活性を示す。 図１１は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブが仲介するＡＤＣＣ効果のＲｏｍａｓ細胞に対する殺傷活性を示す。 図１２は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブが仲介するＡＤＣＣ効果のＭＯＬＰ８細胞に対する殺傷活性を示す。 図１３は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、対照抗体ダラツムマブが仲介するＡＤＣＣ効果のＲａｊｉ細胞に対する殺傷活性を示す。 図１４は５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、対照抗体ダラツムマブのアポトーシス誘導作用を示す。

具体的な実施形態

本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、意外に、抗体の重鎖定常領域ＦｃのＬ３０９番（好ましくはＬ３０９番およびＥ３４５番）を改変することおよび／または抗体の重鎖定常領域のＦｃ部分にヒトＩｇＭのテールピースを融合することで、顕著に抗体の免疫効果の機能を増強し、特に抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を向上させることができることを見出した。これに基づき、本発明を完成させた。

用語
本発明において、用語「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略称Ａｂ）」と「免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略称ＩｇＧ）」は同様な構造上の特徴のヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同様の軽鎖（Ｌ）と２本の同様の重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）によるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先が定常領域で、重鎖の定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は一つのドメインＣＬを含む。軽鎖の定常領域は重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対応している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などに関与し、異なるエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィドを介して共有結合し、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域の間で形成したポリペプチド間ジスルフィドを介して共有結合する。本発明において、用語「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」とは、パパインで抗体を二つの完全に同様のＦａｂ断片および一つのＦｃ断片に分解することである。Ｆａｂ断片は、抗体の重鎖のＶＨとＣＨ１および軽鎖のＶＬとＣＬドメインからなるものである。Ｆｃ断片、すなわち、フラグメント結晶化可能（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）断片は、抗体のＣＨ２とＣＨ３ドメインからなるものである。Ｆｃ断片は、抗原結合活性がなく、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。本発明において、「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。重鎖可変領域と軽鎖可変領域における相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、卷Ｉ、６４７－６６９頁（１９９１））参照する）を形成している。

本明細書で用いられるように、用語「フレームワーク領域」（ＦＲ）とはＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列で、すなわち、単一の種において異なるグロブリンの間で比較的に保守的なグロブリンの軽鎖と重鎖可変領域のそれらの部分である。グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ４つのＦＲを有し、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる。相応的に、軽鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と、かつ重鎖可変ドメインは（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－ （ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表示される。好適に、本発明のＦＲはヒト抗体ＦＲまたはその誘導体で、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は天然に存在するヒト抗体ＦＲとほぼ同様で、すなわち、配列同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。

ＣＤＲのアミノ酸配列が既知で、当業者は簡単にフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを確定することができる。

本明細書で用いられるように、用語「ヒトフレームワーク領域」は天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域とほぼ同様（約８５％またはそれ以上、具体的に、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）のフレームワーク領域である。

本明細書で用いられるように、「テールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメント」、「ＴＰエレメント」は入れ替えて使用することができ、いずれもＩｇＭ由来のテールピース配列で、好ましくはヒトＩｇＭ由来のものである。本発明のＴＰエレメントは任意の適切なアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＴＰエレメントは天然に存在する抗体において発見されたテールピースでもよく、あるいは、選択的に、長さおよび／または構成において天然テールピースと異なる、修飾されたテールピース配列でもよい。前記の修飾は１つまたは複数のアミノ酸の突然変異でもよいが、たとえば、ＩｇＭのテールピースにおけるシステインをセリンに突然変異させる。

本発明の一つの具体的な実施例において、ＴＰエレメントの配列は配列番号７または８で示されるものである。

なお、ＴＰエレメントと重鎖Ｆｃ領域のＣ末端を直接融合してもよい。あるいは、ＴＰエレメントと重鎖Ｆｃ領域の間に短いリンカー配列を提供してもよい。

本明細書で用いられるように、用語「リンカー」とはＦｃ領域とＴＰエレメントの間の短いリンカー配列で、好ましくは柔軟性リンカーである。適切なリンカーの実例は、単一のグリシン（Ｇｌｙ）、またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含むが、リンカーにおけるアミノ酸残基の標識および配列はリンカーにおける実現しようとする二次構造要素のタイプによって変わる。

抗体またはその断片もしくは融合タンパク質
本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は、抗原結合活性およびＣＤＣ活性を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質であって、所定の抗原を標的とする結合機能ドメイン、および重鎖Ｆｃ領域エレメントを含み、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは２本の重鎖Ｆｃ領域を含み、各重鎖Ｆｃ領域は、（１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置に、Ｗ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｃ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＫからなる群から選ばれるアミノ酸残基が含まれており、ならびに／あるいは（２） Ｃ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントが含まれている。本明細書で用いられるように、「重鎖Ｆｃ領域エレメント」は２本の重鎖Ｆｃ領域を含有する。特別に説明しない限り、本発明において、重鎖Ｆｃ領域エレメントにおける突然変異部位とは、重鎖Ｆｃ領域エレメントにおける各重鎖のＦｃ領域に含まれる突然変異部位である。

なお、本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質の重鎖Ｆｃ領域エレメントにおける３０９番目の特定のＣＤＣ増強型突然変異は、ほかの抗体性能（たとえば、ＣＤＣ、特異性、親和力など）を向上させる技術、たとえば、Ｅ３４５Ｒ突然変異と合わせることができる。好ましくは、本発明における抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は、重鎖Ｆｃ領域エレメントにおける各重鎖のＦｃ領域に突然変異の組み合わせであるＬ３０９Ｗ＋Ｅ３４５Ｒが含まれる場合、明らかにＣＤＣを増強するという意外な作用、より好ましくは明らかにＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を増強する作用を有する。

本明細書で用いられるように、用語「ＣＤＣプラットホーム抗体」、「本発明の抗体」、「本発明の抗体またはその断片」、「本発明の融合タンパク質」、「本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質」は入れ替えて使用することができ、いずれも本発明の第一の側面に記載のＣＤＣ機能が増強した抗体またはその断片もしくは融合タンパク質を指す。なお、前記用語は、さらに、本発明抗体またはその断片もしくは融合タンパク質の活性断片を含み、前記活性断片は抗原結合活性のみならず、３０９番目の特定の突然変異および／またはＴＰ（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントも残っている。

本発明において、別途に指定しない限り、抗体のドメインにおける残基の表示にＥＵ番号付けシステムが使用される。当該システムは、最初にＥｄｅｌｍａｎらによって１９６９年に設計され、以下の文献に詳細が記載されている：Ｋａｂａｔら，１９８７（Ｅｄｅｌｍａｎら，１９６９； “Ｔｈｅ ｃｏｖａ１ｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，” ＰＮＡＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第６３卷ｐｐ７８－８５。Ｋａｂａｔら，１９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ，ＵＳＡ。）。位置の番号および／またはアミノ酸残基を特定の抗体のアイソフォームに付与する場合、任意のほかの抗体のアイソフォームの相応する位置および／またはアミノ酸残基に適用できるということは当業者に既知のことである。たとえば、天然に存在するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４における３０９番目の位置に発見された野生型残基はロイシン残基で、天然に存在するＩｇＧ２に発見された野生型残基はバリン残基である。ＩｇＭまたはＩｇＡ由来の尾部のアミノ酸残基に言及する場合、本分野の通常の実践に基づき、示される位置の番号は天然に存在するＩｇＭまたはＩｇＡにおける残基の位置の番号である。本明細書で用いられるように、「３０９番目の位置におけるアミノ酸残基」とは天然に存在するヒトＩｇＧ１におえる３０９番目の位置における残基で、「３４５番目の位置におけるアミノ酸残基」とは天然に存在するヒトＩｇＧ１におえる３４５番目の位置における残基である。

なお、本発明はＣＤＣプラットホーム抗体またはその断片もしくは融合タンパク質を構築する方法、すなわち、本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質を構築する方法も提供するが、前記方法は本発明の第二の側面に記載の通りである。本発明のＣＤＣプラットホーム抗体またはその断片もしくは融合タンパク質を構築する方法では、所定の抗原を標的とする抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣ活性を向上させ、さらに顕著に融合タンパク質のＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を向上させることができる。

本発明において、本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質に含まれる所定の抗原を標的とする結合機能ドメインは異なる抗原のターゲットを標的とすることができ、前記所定の抗原を標的とする結合機能ドメインは、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＣＤ２５、Ｔｒｏｐ－２、ＥｐＣＡＭ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗原分子に結合する。

ＣＤ３８を例とすると、好適に、本発明の抗ＣＤ３８抗体の配列は特許出願ＣＮ２０２０１０８０５４２０．２に記載される通りで、当業者は本分野で熟知される技術で本発明の抗原の結合機能ドメインを修飾または改変し、たとえば、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換を行うことで、さらに抗原の結合機能ドメインの親和力または構造安定性を増加させ、そして通常の測定方法によって修飾または改変後の結果を得ることもできる。

本発明において、本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は、さらに、その保存的変異体を含み、本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドを指す。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。

本発明において、用語「抗」および「結合」とは、二つの分子の間の非ランダムの結合反応のことで、たとえば、抗体とその対する抗原の間の反応が挙げられる。通常、抗体は約１０^－７Ｍ未満、たとえば、約１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ未満またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合する。用語「ＫＤ」とは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数で、抗体と抗原の間の結合親和力を表すためのものである。解離平衡定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が緊密で、抗体と抗原の間の親和力が高い。たとえば、表面プラスモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＳＰＲ）によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で抗体と抗原の結合親和力を、あるいはＥＬＩＳＡ測定によって抗体と抗原の結合の相対的親和力を測定する。

本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は単独に使用してもよく、検出可能ななマーカー（診断目的）、治療剤、または任意の以上のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。

コード核酸および発現ベクター
また、本発明は、上記抗体またはその断片または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。本発明において、用語「発現ベクター」とは特定の標的タンパク質またはほかの物質を発現させるために発現カセットを担持するベクター、たとえば、プラスミド、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）、ファージ、酵母プラスミドまたはほかのベクターを指す。たとえば、適切な調節配列、たとえば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどを含む、本分野の通常の発現ベクターが挙げられ、前記発現ベクターは、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）、プラスミド、ファージ、酵母プラスミドまたはほかのベクターを含むが、これらに限定されない。前記発現ベクターは、好ましくは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．４（＋）、ｐＤＨＦＲまたはｐＴＴ５を含む。

関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。

さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。

本発明において、用語「宿主細胞」は本分野の通常の様々な宿主細胞で、ベクターが安定して自己複製し、かつ担持されるポリヌクレオチド分子が有効に発現されるようにさせることができればよい。中では、前記宿主細胞は原核発現細胞および真核発現細胞を含み、前記宿主細胞は、好ましくは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、２９３Ｆまたは２９３Ｅ細胞を含む。

薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいは融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常４～８程度、好ましくは５～７程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局部注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射注射（たとえば、腹膜内）、頭蓋内注射、または腔内注射を含むが、これらに限定されない。

本発明において、用語「薬物組成物」とは、本発明の二重機能抗体またはその断片もしくは融合タンパク質が薬学的に許容される担体と共に薬物製剤組成物を構成することによってより安定して治療効果を発揮することができ、これらの製剤は本発明で公開される二重機能抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のアミノ酸コア配列の配座の完全性を保つと同時に、タンパク質の多くの官能基の分解（凝集、脱アミノまたは酸化を含むが、これらに限定されない）を防ぐことができる。

本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の二重機能抗体またはその断片もしくは融合タンパク質（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明の二重機能抗体またはその断片もしくは融合タンパク質はほかの治療剤と併用することもできる。

薬物組成物の使用時、安全有効量の二重機能抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、またはその免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ ｍｇ／ｋｇ体重以下で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。

本発明において、用語「有効量」とは、本発明の薬物組成物を被験者に施用すると、治療される個体に予想される効果が生じる量または投与量を指すが、当該予想される効果は個体の病症の改善を含む。用語「被験者」は、哺乳動物、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類動物、ラットおよびマウスなどを含む、これらに限定されない。

応用
また、本発明は、本発明の第一の側面に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、あるいは本発明の第八の側面に記載の免疫複合体、あるいは本発明の第九の側面に記載の薬物組成物の使用、たとえば、診断製剤または薬物の製造における使用を提供する。

好ましくは、前記の薬物は癌、または免疫関連疾患の予防および／または治療のための薬物である。

本発明において、前記癌は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、膠細胞腫、多発性骨髄腫およびほかの新生物性悪性疾患からなる群から選ばれる。

本発明の一つの好適な実施例において、前記の薬物は、ＣＤ３８の発現または機能異常に関連する疾患の予防および／または治療のための薬物である。

本発明において、前記ＣＤ３８の発現または機能異常に関連する疾患は本分野の通常のＣＤ３８の発現または機能異常に関連する疾患である。好ましくは、前記ＣＤ３８の発現または機能異常に関連する疾患は、腫瘍／癌、または免疫関連疾患である。

好ましくは、前記疾患は好適に免疫関連疾患、たとえば、自己免疫性疾患である。より好ましくは、前記の薬物は自己抗体が仲介する自己免疫疾患の治療および／または予防のためのものである。さらに、前記自己免疫性疾患は自己免疫性腎臓疾患（免疫性腎臓炎、自己免疫性腎臓疾患）、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、バセドウ病（Ｇｒａｖｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、重症筋無力症（ＭＧ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性腎臓疾患（免疫性腎臓炎、自己免疫性腎臓疾患）、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸管疾患、クローン病（Ｃｒｏｈｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性結腸炎、ペイロニー病（Ｐｅｙｒｏｎｉｅ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣疾患、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、手術癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝臓炎、強直性脊椎炎、線維化肺胞炎、バセドウ病（Ｇｒａｖｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ'ｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、ほかの自己免疫性障害、膵臓腺炎、創傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、心臓疾患（虚血性疾患、たとえば、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化を含む）、血管内凝固、骨再吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎および低クロール血症、胎児－母体耐性欠失に関連する不妊症、白斑、重症筋無力症（ＭＧ）、全身性強皮症、炎症性腸疾患、胃炎またはＩｇＧ４関連疾患を含むが、形質細胞の過剰な増殖、分泌で生じる抗体と免疫グロブリンから形成される免疫複合体による免疫グロブリンＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）または腎障害性モノクローナル・ガンモパチー（ＭＧＲＳ）、ループス腎炎または紫斑病性腎炎が好ましい。

現在、ＩｇＡＮ、ＭＮ、ＭＧＲＳという３つの自己免疫性腎臓疾患に対する治療は多くの臨床需要が満たされておらず、特に特異的ターゲッティング治療の手段が不足し、ＣＤ２０を標的とするリツキシマブのみがＭＮの治療への使用が許可されているが、ＣＤ２０は自己抗体が少量に生成する活性化Ｂ細胞のみにおいて発現されるため、調査結果では、臨床においてまだ４０％とも達するＭＮ患者は抗ＣＤ２０治療が無効であることが示されている。一方、ＣＤ３８は形質細胞において高度に発現され、本発明における特異的にＣＤ３８を標的とする抗体（たとえば、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒなど）はＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどの効果によって形質細胞の分解およびアポトーシスを誘導することができ、ＩｇＡＮ、ＭＮ、ＭＧＲＳおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に有用である。

本発明の主な利点は以下のものを含む。

（１）本発明は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを増強する新たな技術を提供する。当該技術は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性が欠失したか、限られた抗体薬物をＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ増強型の抗体薬物に変える見込みがある。当該技術を運用すると、既存の異なる標的／標的細胞に作用する抗体を直接改造することができる。当該技術を運用すると、既存の抗体の治療効果を改善し、多くの疾患を治療することができる。

（２）３０９番目のアミノ酸の部位特異的突然変異により、顕著に本発明の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ性能を向上させることができる。また、本発明の３０９番目の特定のＣＤＣおよび／またはＣＤＣ増強型の突然変異は、ほかの抗体性能（たとえば、ＣＤＣ、特異性、親和力など）を向上させる技術、たとえば、Ｅ３４５Ｒ突然変異と合わせることができる。

以下、具体的な実施例を合わせ、さらに本発明を陳述する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で詳細な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。

関連試薬資材：
ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１３４３）；Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ， Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ（Ｃｙｔｉｖａ，カタログ番号２８９２０２３４）；ＨＢＳ－ＥＰ＋ ｐＨ７．４緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号ＢＲ－１００６－６９）；Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｒｏｍａｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、ＭＯＬＰ８細胞は南京科佰生物有限公司から購入された；ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞（蘇州瑞安生物科技有限公司，カタログ番号ＲＡ－ＣＫ０１）；Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ７５７０）；Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ （Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カタログ番号Ａ１１）；Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ７９４０）； Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ アポトーシス検出キット（Ｙｅａｓｅｎ， カタログ番号４０３０２ＥＳ６０）。

実施例で使用されたタンパク質発現および精製の方法の説明は以下の通りである。

標的遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４に構築し、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）で構築された発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標） ２９３－Ｆ Ｃｅｌｌｓ細胞（以下、ＨＥＫ２９３Ｆと略され、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された）に導入して抗体または組み換えタンパク質を発現させ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された）において５日培養した後、細胞上清を収集し、さらにＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィーによって抗体を精製し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによって組み換えタンパク質を精製した。

以下の実施例で使用されたＥＬＩＳＡ検出方法の説明は以下の通りである。

相応する組み換えタンパク質でマイクロプレートをコーティングし、１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴは０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸塩緩衝液）でマイクロプレートをブロッキングした。被験抗体を勾配希釈した後、上記組み換えタンパク質がコーティングされたマイクロプレートに移し、室温で半時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、適切に希釈されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識されたヒツジ抗ヒト抗体（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｓｉｇｍａから購入された）を入れ、室温で半時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ（３，３'，５，５'－テトラメチルベンチジジン）を基質とする呈色液を入れ、室温で１～５ ｍｉｎインキュベートした。５０μＬの停止液（２ Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を入れて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０）によってＯＤ４５０を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でブロッティングおよびデータ分析を行い、そしてＥＣ_５０／ＩＣ_５０を計算した。

以下の実施例で使用されたな物理・化学的性質の検出方法の説明は以下の通りである。

ＨＰＬＣ－ＳＥＣ
抗体は高分子量のタンパク質で、高度に複雑な二次および三次構造を有する。翻訳後修飾、集合および分解などの変化のため、抗体は生物化学および生物物理の特性の面において異質のものである。分離技術によって三重特異性抗体を分析すると、通常、バリアント、集合体および分解断片が観察され、これらの存在によって安全性および有効性が害される可能性がある。抗体を生産および保存する過程において、集合体、分解断片および不完全に組み立てられた分子が現れやすい。本発明において、高速液体クロマトグラフィー－分子排斥クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）によってサンプルにおける上記不純物の含有量を検出した。集合体の分子量は単量体よりも大きいため、相応するピークの保持時間が短い。分解断片または不完全に組み立てられた分子の分子量は単量体よりも小さいため、相応するピークの保持時間が長い。ＨＰＬＣ－ＳＥＣで使用されるクロマトグラフィー装置はＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００で、移動相の調製方法は以下の通りである：適量の２０ ｍＭリン酸二水素ナトリウム母液を取り、２０ ｍＭリン酸水素二ナトリウムでｐＨを６．８±０．１に調整した。仕込み量：２０ μｇ。クロマトグラフィーカラムはＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬで、仕様は７．８×３００ ｍｍ ５μｍである。流速０．５ ｍＬ／ｍｉｎ、溶離時間３０ ｍｉｎ；カラム温度２５℃、サンプル室温度１０℃；検出波長２１４ ｎｍ。

本発明の抗体配列：

実施例１ 抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体（５０Ｇ１２）の製造
５０Ｇ１２－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ（以下、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１と呼ぶ）は抗ＣＤ３８ヒト化モノクローナル抗体で、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列がＣＮ２０２０１０８０５４２０．２における配列番号１１および配列番号１２（すなわち、本発明における配列番号５および６）からのものである。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１および２の通りである。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３５、３６および３７、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の軽鎖のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３８、３９および４０の通りである。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１（アミノ酸配列は配列番号３の通りである）、軽鎖定常領域はヒトκ（アミノ酸配列は配列番号４の通りである）である。ここで、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＨＣおよび５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＬＣと名付ける。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＨＣと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、２つのベクターを組み合わせて発現させて抗体を精製したが、得られた抗体を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１と名付けた。

実施例２ 抗体の重鎖定常領域のＦｃ部分の改変
文献（Ｒｏｗｌｅｙ Ｔ Ｆ， Ｐｅｔｅｒｓ Ｓ Ｊ， Ａｙｌｏｔｔ Ｍら， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｘａｖａｌｅｎｔ Ｆｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｃ－ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｖｉｄｉｔｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｅ－ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１８， １（１）： １－１２．）からわかるように、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体はＬ３０９（Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）がシステイン（Ｃと略す）に突然変異してかつＦｃ末端にヒトＩｇＭのテールピースが融合した後、六量体化した抗体複合体になりやすい。これにより、ヒトＩｇＧ１のＬ３０９Ｃ突然変異およびヒトＩｇＭのテールピースはヒトＩｇＧ１の六量体への形成を促進する潜在力があることが示された。

１．Ｆｃ部分の３０９番目の部位特異的突然変異
ここで、本実施例は５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖の遺伝子のＬ３０９部位に対して部位特異的突然変異を行い、Ｌ３０９をそれぞれ（Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｗ／Ｙ）に突然変異させ、一連の突然変異体が得られ、さらに上記方法に従って発現させて抗体を精製し、得られた抗体をそれぞれ５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｘ（ＸはＥ／Ｆ／Ｈ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｗ／Ｙを表す）と名付けた。

ＣＤＣを測定する方法は、下記の通りである：ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入され、そしてＡＴＣＣのお薦めの方法によって通常の培養および継代が行われた。ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１１８３５－０３０）にヒト血清（Ａｌｌｃｅｌｌｓ；カタログ番号：ＰＢ０２２－Ｃ）をいれ、ヒト血清の最終濃度が５％にようにした；この培地で対数期のＲａｊｉ／Ｄａｕｄｉ細胞を再懸濁させた後、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号：ＣＬＳ３５９９）に接種し、各ウェルに５０ μＬの細胞懸濁液（１０万個細胞含有）を接種した；被験抗体を勾配希釈した後、上記細胞が接種された９６ウェルプレートに５０ μＬ／ウェルで入れた；均一に混合した後、二酸化炭素細胞インキュベーターにおいて２．５時間インキュベートした；９６ウェルプレートにＣＣＫ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，カタログ番号：ＣＫ０４）を２０ μＬ／ウェルで入れ、続いて２時間インキュベートした；ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって９６ウェルプレートのＯＤ４５０を読み取った；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータ分析およびブロッティングを行い、ＩＣ_５０を計算した。

ＣＤＣ活性が強いほど、細胞の活力が低く、ＯＤ４５０も低くなる。図１および図２の結果のいずれからも、親の抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１と比べ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｆ／Ｃ／Ｗ／Ｙは顕著に増強したＣＤＣを有することが示された。中では、アイソタイプ対照は標的と関連しないヒトＩｇＧ１モノクローン抗体である。

２．Ｆｃ部分の末端の改変
ここで、遺伝子工学によってＩｇＭのテールピース（アミノ酸配列：ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号７）、当該短鎖ペプチドをＰｅｐと略す）のコード配列を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖の遺伝子の末端に連結し、そして当該重鎖の遺伝子を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＨＣと名付けた（アミノ酸配列が配列番号９の通りである）。発現の過程において抗体分子の間にジスルフィド結合が形成しないように、２本のテールピースにおけるシステインをセリンに突然変異させ（突然変異後のテールピースのアミノ酸配列：ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＳＹ（配列番号８）、当該短鎖ペプチドをＰｅｐ－ＣＳと略す）、そして当該重鎖の遺伝子を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳ－ＨＣと名付けた（アミノ酸配列が配列番号１０の通りである）。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＨＣと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳ－ＨＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、２つのベクターをそれぞれ５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＬＣの遺伝子と組み合わせて発現させて抗体を精製したが、得られた抗体をそれぞれ５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳと名付けた。

上記方法によって５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｆ／Ｃ／Ｗ／Ｙ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐおよび５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳのＣＤＣを検出した。異なる点は、ここでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^R Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｇ７５７２，ＣＴＧと略す）で細胞の活力を検出したことにある。一部のウェルの細胞にＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．１％）入れることによって細胞を十分に分解させ、これらの細胞をＣＴＧに入れた後に生じる信号はベース値である。抗体で処理されていない細胞をＣＴＧに入れた後に生じる信号は最大値である。ＣＤＣは以下の公式で計算される：細胞傷害（％）＝（最大値－実験値）／（最大値－ベース値）×１００。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータ分析およびブロッティングを行い、図３に示す。ＥＣ_５０を計算し、表２に示す。

ＣＤＣが強いほど、ＥＣ_５０が小さく、Ｔｏｐ（曲線のプラトーの高さ）が高くなる。図３および表２の結果から、親の抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１と比べ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｆ／Ｃ／Ｗ／Ｙは顕著に増強したＣＤＣを有し、中では、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｆ／Ｙ的ＣＤＣが５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｃ／Ｗよりも弱いことが示された。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐと５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳは近いＣＤＣを有し、そしてこれらのＣＤＣは５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｃ／Ｗに基本的に相当する。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｃ／Ｗ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐおよび５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳはいずれもＴｏｐが９９超で、これによってこれらの抗体は高濃度の場合、標的細胞を十分に分解させることができることが示された。

実施例３ 抗体突然変異体の集合体の分析
ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって上記好適な抗体突然変異体の純度を測定した。結果は以下の通りであった。

ＨＰＬＣ－ＳＥＣの測定結果から、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｆ／Ｗ／Ｙおよび５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳの主要ピークの比率がいずれも９８％超であることがわかり、これによってこれらはサイズ異質性が小さく、高い純度を有することが示された。また、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｃおよび５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐの主要ピークの比率がそれぞれ７９．７％と７４．０％で、両者の純度が８０％未満で、スペクトルでは、この２つの抗体に多くの集合体が存在することが示された。

実施例４ 抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体ＯＫＴ１０の改変
１．ＯＫＴ１０ヒト化モノクローナル抗体の製造
ＯＫＴ１０は抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体で、マウスハイブリドーマからできたものである。その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１９および２０）はＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＢＡ４２８８８．１およびＡＢＡ４２８８７．１）からのものである。

上記可変領域をコードするＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成されたものである。ＯＫＴ１０の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を分析し、Ｋａｂａｔ番号付けでそれぞれＯＫＴ１０の重鎖と軽鎖の抗原相補性決定領域およびフレームワーク領域を決定した。ＯＫＴ１０の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＨ－ＣＤＲ１：ＲＳＷＭＮ（配列番号１１）、Ｈ－ＣＤＲ２：ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＴＳＬＫＤ（配列番号１２）およびＨ－ＣＤＲ３：ＹＧＮＷＦＰＹ（配列番号１３）で、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＬ－ＣＤＲ１：ＫＡＳＱＮＶＤＴＮＶＡ（配列番号１４）、Ｌ－ＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１５）およびＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列番号１６）である。

ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／において、ネズミ由来のＯＫＴ１０の重鎖可変領域をヒトＩｇＧ胚系配列と相同性比較し、ＩＧＨＶ３－４８＊０１を重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとして選択し、ネズミ由来のＯＫＴ１０の重鎖ＣＤＲをＩＧＨＶ３－４８＊０１の骨格領域に移植し、そしてＨ－ＣＤＲ３の後にＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７）を第四のフレームワーク領域として付加し、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の配列を得た。同様に、ネズミ由来のＯＫＴ１０の軽鎖可変領域とヒトＩｇＧ胚胎系配列に対して相同性の比較を行い、ＩＧＫＶ１－１６＊０１を軽鎖ＣＤＲ移植鋳型として選択し、ネズミ由来のＯＫＴ１０の軽鎖ＣＤＲをＩＧＫＶ１－１６＊０１の骨格領域に移植し、そしてＬ－ＣＤＲ３の後にＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）を第四のフレームワーク領域として入れ、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の配列を得た。ＣＤＲ移植可変領域に基づき、一部のフレームワーク領域のアミノ酸部位を復帰突然変異させた（復帰突然変異は、ヒト由来フレームワーク領域の一部のアミノの酸をネズミ由来フレームワーク領域の同一の位置のアミノ酸に突然変異させることで、復帰突然変異の部位は一般的に構造および／または親和力の維持に非常に重要である）。復帰突然変異の場合、アミノ酸配列に対してＫａｂａｔ番号付けを行い、部位の位置はＫａｂａｔ番号で示す。

好適に、ＣＤＲ移植重鎖可変領域について、２８番目のＴをＤに復帰突然変異させる。ＣＤＲ移植軽鎖可変領域について、３６番目のＦをＹに、４６番目のＳをＡに復帰突然変異させた。

上記復帰突然変異部位を持つ重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれＯＫＴ１０ヒト化重鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号２１の通りである）と軽鎖可変領域（アミノ酸配列は配列番号２２の通りである）と定義した。上記ヒト化した重鎖と軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成されたものである。合成されたヒト化重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域（アミノ酸配列は配列番号３の通りである）と連結し、全長のヒト化重鎖の遺伝子を得たが、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＨＣと名付けた（アミノ酸配列は配列番号２３の通りである）。ヒト化軽鎖可変領域をとヒトκ鎖定常領域（アミノ酸配列は配列番号４の通りである）と連結し、全長のヒト化軽鎖の遺伝子を得たが、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＬＣと名付けた（アミノ酸配列は配列番号２４の通りである）。

ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＨＣとＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、２つのベクターを組み合わせて発現させて抗体を精製したが、得られた抗体をＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１と名付けた。

２．ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１突然変異体の製造
ここで、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１重鎖の遺伝子のＬ３０９の位置に対して部位特異的突然変異を行い、それぞれＷまたはＹに突然変異させ、突然変異遺伝子をさらにそれぞれＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＬＣと組み合わせ、発現させて抗体を精製したが、得られた抗体をそれぞれＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９ＷとＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｙと名付けた。ここで、遺伝子工学によってＰｅｐ－ＣＳのコード配列をＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１の重鎖の遺伝子の末端に連結し、そして当該重鎖の遺伝子をＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳ－ＨＣと名付け（アミノ酸配列が配列番号２５の通りである）、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＬＣと組み合わせた後、上記方法によって発現させて抗体を精製したが、得られた抗体をＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳと名付けた。

３．ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１突然変異体のＣＤＣの測定
上記実施例に記載の方法によってＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１およびその突然変異体のＣＤＣを測定した。結果を図４に示す。

図４の結果から、親の抗体ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１と比べ、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｗ、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９ＹおよびＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳは顕著に増強したＣＤＣ活性を有し、これらのＥＣ_５０がそれぞれ０．５９４２ ｎＭ、５．９０２ ｎＭおよび１．７１５ ｎＭで、これらのプラトーがそれぞれ９９．８５、６９．８４および９９．４３であることが示された。ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９ＷおよびＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｐｅｐ－ＣＳはいずれもＴｏｐが９９超で、これによってこれらの抗体は高濃度の場合、標的細胞を十分に分解させることができることが示された。上記結果から、三者の中で、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９ＷはＣＤＣが最も強いことが示された。

４．ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１のカニクイザルＣＤ３８に対する結合力
ダラツムマブは市販が許可された抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体で、その重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２６と２７）は『ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２４， Ｎｏ． １， ２０１０』から入手されたものである。

イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）は別の市販が許可された抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体で、その重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２８と２９）は『ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ． ３， ２０１５』から入手されたものである。

上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成されたものである。合成されたダラツムマブの重鎖可変領域の遺伝子をヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域の遺伝子と連結し、全長の重鎖の遺伝子を得た。ダラツムマブの軽鎖可変領域の遺伝子をヒトκ鎖定常領域の遺伝子と連結し、全長の軽鎖の遺伝子を得た。上記実施例に記載の方法によって発現させて抗体を精製したが、得られた抗体をＤａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１と名付けた（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂとも呼ぶ）。また、同じような実験方法によって抗体Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１を得た。

カニクイザルＣＤ３８のアミノ酸配列（配列番号３０）はｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ５ＶＡＮ０から入手されたもので、カニクイザルＣＤ３８の細胞外部分をコードするＤＮＡは上海生工生物工程有限公司によって合成され、遺伝子の末端にポリヒスチジンをコードするコード配列を付加し、さらに組み換え遺伝子を発現ベクターに構築した。上記実施例に記載の方法によって当該組み換えタンパク質を発現させ、さらにＮｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーカラムで培養上清における組み換えタンパク質を精製したが、得られた組み換えタンパク質をＣＤ３８－ＥＣＤ－Ｃｙｎｏと名付けた。

ＣＤ３８－ＥＣＤ－Ｃｙｎｏでマイクロプレートをコーティングし（１０ ｎｇ／ウェル）、さらにＥＬＩＳＡで５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１およびＩｓａｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１のＣＤ３８－ＥＣＤ－Ｃｙｎｏに対する結合能力を測定した。

図５では、ＯＫＴ１０－Ｈｕ－ＩｇＧ１は有効にカニクイザルのＣＤ３８に結合することができ、ＥＣ_５０が０．１３２４ ｎＭであることが示された。５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ＩｇＧ１およびＩｓａｔｕｘｉｍａｂ－ＩｇＧ１はいずれもカニクイザルＣＤ３８を認識することができない。

実施例５ モノクローナル抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒの製造
遺伝子工学および分子クローニング技術によって５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１重鎖定常領域のＬ３０９の位置をＷに部位特異的突然変異させ、同時にＥ３４５の位置をＲに部位特異的突然変異させ、そしてｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、得られた重鎖を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒと名付け、上記重鎖を５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－ＬＣとともにＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に形質移入して５日発現させ、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーカラムによって精製して得られた抗体を５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒと名付けた。同様の方法によって単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ（５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１－Ｌ３０９Ｗとも呼ぶ）および５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒを得た。

実施例６ ５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５ＲのヒトＣＤ３８に対する親和力の測定
ここで、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された）によって５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、ダラツムマブのヒトＣＤ３８タンパク質に対する結合、解離定数を測定した。具体的な実施方法は以下の通りである。

１） ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号２１３４３）に従ってヒトＣＤ３８タンパク質をビオチン化し、そしてＣＤ３８－ｂｉｏｔｉｎと名付けた。

２） ＣＡＰチップのカップリング：５０μｇ／ｍＬ Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ ＲｅａｇｅｎｔをＨＢＳ－ＥＰ＋ ｐＨ７．４ Ｂｕｆｆｅｒと１：１で混合し、操作パラメーターは接触時間６０ｓ、流速 ２ μＬ／ｍｉｎであった。

３）Ｂｉｏｔｉｎ－ＣＤ３８を捕獲し、操作パラメーターは以下の通りである： ｂｉｏｔｉｎ－ＣＤ３８濃度２μｇ／ｍＬ、接触時間１５ ｓ、流速１０ μＬ／ｍｉｎ、再生接触時間３０ ｓ。

４） ＨＢＳ－ＥＰ＋ ｐＨ７．４緩衝液で各被験抗体を希釈し、最高濃度が２００ｎＭで、２倍で１．５６２５ ｎＭおよび０濃度点に希釈し、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ説明書に従って再生液を調製し、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋにおいて以下のパラメーターで仕込んだ：結合時間１８０ｓ、解離時間６００ｓ、流速３０μＬ／ｍｉｎ、再生接触時間３０ｓ、流速３０μＬ／ｍｉｎ。

５） Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅでデータを分析し、「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ」モードにおいて「１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ」の公式を選んでフィッティングし、各抗体とＣＤ３８の親和力のデータを得た。

表４で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１はＣＤ３８タンパク質に対する親和力がダラツムマブよりも強く、具体的に、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒ、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１の解離定数ｋｄがダラツムマブよりも良く、３つの抗体の平衡解離定数ＫＤがそれぞれ２．９９×１０^－９ Ｍ，３．５８×１０^－９ Ｍおよび２．６０×１０^－８ Ｍであったと表された。

実施例７ ５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５ＲのＣＤＣ活性の測定
対数期あるヒトバーキットリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＲｏｍａｓをＤＰＢＳで一回洗浄し、無血清でフェノールレッド無しの１６４０培地で細胞密度が２Ｅ５／ｍＬになるように調整し、５０μＬ／ウェルで白色の９６ウェル細胞培養プレートに敷いた。無血清でフェノールレッド無しの１６４０培地で抗体を所要の濃度に希釈した後、３倍勾配で連続して１２の濃度に希釈した。上記細胞培養プレートに希釈が完成された薬品を５０μＬ／ウェルで入れ、抗体の最終濃度が５０ｎＭで、平行で２つの重複ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ_２細胞インキュベーターにおいて３０ｍｉｎインキュベートした。Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔを２０μＬ／ウェルで上記培養プレートに入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２細胞インキュベーターにおいて２ｈインキュベートした。上記細胞培養プレートを室温において１５ｍｉｎ平衡化し、８０μＬ／ウェルで室温で平衡化されたＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ呈色剤を入れ、室温で８ｍｉｎインキュベートした後、マイクロプレートリーダーｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入、型番ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ｉ３）によって検出してデータを収集し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９によってデータ分析およびブロッティングを行い、そしてＩＣ_５０を計算した。

図６で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体の活性化は、Ｒｏｍａｓ細胞に対する殺傷活性が明らかに未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブよりも優れ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりもやや良かった。表５で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体作用は、Ｒｏｍａｓ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約８倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｂｏｔｔｏｍ）がダラツムマブよりも約９８倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約１．７倍優れ、５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約１．２倍優れた。

図７で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体の活性化は、Ｄａｕｄｉ細胞に対する殺傷活性が明らかに単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１および対照抗体ダラツムマブよりも優れ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりもやや良かった。表６で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体作用は、Ｄａｕｄｉ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約１９倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｂｏｔｔｏｍ）がダラツムマブよりも約２５倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約３．２倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約１．４倍優れた。

図８で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体の活性化は、Ｒａｊｉ細胞に対する殺傷活性が明らかに単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒ、未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、対照抗体ダラツムマブよりも優れたが、５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１およびダラツムマブはＲａｊｉ細胞においてほとんどＣＤＣ活性がなく、これはＲａｊｉ細胞の表面のＣＤ３８発現レベルが比較的に低かったことに関連する可能性がある。表７で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介する補体作用は、Ｒａｊｉ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約２倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｂｏｔｔｏｍ）が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約２．４倍優れた。

上記データから、各抗体は異なる細胞において引き起こすＣＤＣ効果が異なることが示され、これはＣＤ３８の異なる細胞における発現レベルのみならず、各細胞における補体調節タンパク質ＣＤ５５およびＣＤ５９の発現量に関連する（参照文献：ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ［Ｊ］． Ｂｌｏｏｄ， ２０１６， １２８（７）：９５９－９７０．）。しかし、確定できる点は、抗体の重鎖の定常領域に同時にＬ３０９ＷとＥ３４５Ｒの二部位の突然変異を導入すると、有効に抗体が仲介するＣＤＣ活性を増強することができ、そして、前記二部位の突然変異の導入は抗体に意外な優れた活性を付与し、Ｌ３０９ＷまたはＥ３４５Ｒの単一部位の突然変異を導入した抗体あるいは突然変異部位が導入されていない抗体のいずれよりも優れ、そしてこのようなＣＤＣの増強効果はＣＤ３８発現レベルが比較的に低い腫瘍細胞においてより顕著に表れることである。

実施例８ ５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５ＲのＡＤＣＣ活性の測定
対数期にあるヒトバーキットリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、ヒト骨髄腫細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９、ヒト多発性骨髄腫細胞ＭＯＬＰ８は、ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、無血清１６４０培地で細胞密度を４．８Ｅ５／ｍＬに調整し、２５μＬ／ウェルで白色の９６ウェル細胞培養プレートに敷いた。無血清１６４０培地で各抗体を所要の濃度に希釈した後、３倍勾配で連続して１０の濃度に希釈し、希釈が完成された各抗体を、２５μＬ／ウェルで上記細胞培養プレートに入れ、そして細胞インキュベーターにおいて４５ｍｉｎインキュベートした。ＤＰＢＳで対数期のＡＤＣＣ効果細胞を１回洗浄した後、無血清１６４０培地で細胞密度を３Ｅ６／ｍＬに調整し、２５μＬ／ウェルで上記培養プレートに入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２細胞インキュベーターにおいて６ｈインキュベートした。

事前に細胞培養プレートを室温で１５ｍｉｎ程度平衡化し、各ウェルに６０μＬのＢｉｏ－ｇｌｏ呈色剤を入れ、室温で４ｍｉｎインキュベートした後、マイクロプレートリーダーｉ３で検出してデータを収集し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９でデータ分析およびブロッティングを行い、そしてＩＣ_５０を計算した。

図９で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果のＤａｕｄｉ細胞に対する殺傷活性は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブよりも明らかに良かった。表８で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果は、Ｄａｕｄｉ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約１．５倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｔｏｐ）がダラツムマブよりも約１．３倍優れ、かつＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約２倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約１．７倍優れた。

図１０で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対する殺傷活性は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブよりも明らかに良かった。表９で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果は、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約１．５倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｔｏｐ）がダラツムマブよりも約１．９倍優れ、かつＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約１．９倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約１．３倍優れた。

図１１で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果のＲｏｍａｓ細胞に対する殺傷活性は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブよりも明らかに良かった。表１０で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果は、Ｒｏｍａｓ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約２．７倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｔｏｐ）がダラツムマブよりも約１．２倍優れ、かつＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約２．４倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約２倍優れた。

図１２で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果のＭＯＬＰ８細胞に対する殺傷活性は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブよりも明らかに良かった。表１１で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果は、ＭＯＬＰ８細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約３．５倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｔｏｐ）がダラツムマブよりも約１．５倍優れ、かつＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約３．３倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約２．５倍優れた。

図１３で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果のＲａｊｉ細胞に対する殺傷活性は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ、単一部位突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒおよび対照抗体ダラツムマブよりも明らかに良かった。表１２で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒが仲介するＡＤＣＣ効果は、Ｒａｊｉ細胞に対する殺傷のＩＣ_５０がダラツムマブよりも約９．２倍優れ、最大殺傷活性の絶対値（Ｔｏｐ）がダラツムマブよりも約１．３倍優れ、かつＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｅ３４５Ｒよりも約２．７倍優れ、ＩＣ_５０が５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗよりも約３倍優れた。

上記データから、抗体の重鎖の定常領域に同時にＬ３０９ＷとＥ３４５Ｒの二部位の突然変異を導入すると、有効に抗体が仲介するＡＤＣＣ活性を増強することができ、その活性がＬ３０９ＷまたはＥ３４５Ｒの単一部位の突然変異のみを導入した抗体あるいは突然変異部位が導入されていない抗体のいずれよりも優れ、そしてＣＤＣ効果に敏感でないＮＣＩ－Ｈ９２９にも（参照文献：ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ［Ｊ］． Ｂｌｏｏｄ， ２０１６， １２８（７）：９５９－９７０．）、Ｌ３０９ＷとＥ３４５Ｒの二部位の突然変異が優れたＡＤＣＣ増強効果を表すことが示された。

実施例９ ５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒのアポトーシス誘導作用
対数期にあるヒトバーキットリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉを２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で１回洗浄し、１Ｅ５／１５０μＬ／ウェルで細胞密度を調整し、９６ウェル細胞培養プレートに敷いた。２％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で抗体を１２ｎＭに希釈した後、３倍勾配で連続して８の濃度に希釈し、５０μＬ／ウェルで希釈された抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに入れ、抗体の最終濃度が３ｎＭで、細胞インキュベーターにおいて２４ｈインキュベートした。冷却しておいたＰＢＳで、２００μＬ／ウェルで、４００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心して細胞を２回洗浄した。ＦＩＴＣで標識されたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス検出キットでアポトーシス細胞を染色し、１００μＬの１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁させ、１．５μＬ／ウェルでＦＩＴＣ－Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを入れ、軽く均一に混合し、光を避けて室温で１５ｍｉｎ反応させた。１００μＬの１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れ、均一に混合し、１ｈ内でフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎから購入、型番ｃｙｔｏｆｌｅｘ）でＦＩＴＣチャンネルの平均蛍光強度を測定してデータを分析し、染色細胞数を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９でデータ分析およびブロッティングを行い、ＩＣ_５０を計算した。

図１４で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒによって誘導されたＤａｕｄｉ細胞のアポトーシス効果は未突然変異抗体５０Ｇ１２－Ｈｕ－ＩｇＧ１に相当し、いずれも明らかに対照抗体ダラツムマブよりも良く、表１３で示されるように、５０Ｇ１２－Ｌ３０９Ｗ－Ｅ３４５Ｒによって誘導されたＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスの最大活性（Ｔｏｐ）はダラツムマブよりも約２．１倍優れた。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (19)

1. 抗原結合活性およびＣＤＣ活性を有する抗体またはその断片もしくは融合タンパク質であって、所定の抗原を標的とする結合機能ドメイン、および重鎖Ｆｃ領域エレメントを含み、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、ＩｇＧ由来のものであり、
   （１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置が、Ｗのアミノ酸残基であり；ならびに
   （２） Ｆｃ領域の３４５番目の位置が、Ｒのアミノ酸残基であり、
   ここで、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのアミノ酸の番号は、ＥＵ番号付けシステムに準ずるものである
   ことを特徴とする抗体またはその断片もしくは融合タンパク質。
2. 前記の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質は、さらに、ＡＤＣＣ活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその断片または融合タンパク質。
3. 前記重鎖Ｆｃ領域エレメントは、Ｃ末端にテールピース（ｔａｉｌ－ｐｉｅｃｅ）エレメントを含み、前記テールピースエレメントの配列が、配列番号７または８に示される配列である、請求項１～２のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質。
4. 前記所定の抗原を標的とする結合機能ドメインは、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＣＤ２５、Ｔｒｏｐ－２、ＥｐＣＡＭ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗原分子に結合することを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質。
5. 前記重鎖Ｆｃ領域エレメントが、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質。
6. 前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質が、ＣＤ３８を標的とする結合機能ドメインを含み、以下の群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質： 配列番号３５で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号３６で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号３７で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号３８で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号３９で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号４０で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖；あるいは
   配列番号１１で示されるＨ－ＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＨ－ＣＤＲ２および配列番号１３で示されるＨ－ＣＤＲ３を含有するＶＨ領域と、ＥＵ番号付けではヒトＩｇＧ１の３０９番目の位置にＷまたはＹ突然変異、そして３４５番目の位置にＲ突然変異のある重鎖定常領域とを含む重鎖、ならびに、配列番号１４で示されるＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＬ－ＣＤＲ２および配列番号１６で示されるＬ－ＣＤＲ３を含有するＶＬ領域を含む軽鎖。
7. 抗体またはその断片もしくは融合タンパク質のＣＤＣを向上させる方法であって、前記抗体またはその断片もしくは融合タンパク質はイムノグロブリンのＦｃ領域および所定の抗原を標的とする結合機能ドメインを含み、前記方法は、以下の工程を含む方法：
   （Ｓ１ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基における突然変異を当該抗体またはその断片もしくは融合タンパク質に導入し、前記突然変異は、ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域の３０９番目のアミノ酸をＷに突然変異させ、及び３４５番目のアミノ酸をＲに突然変異させること、
   ここで、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのアミノ酸の番号は、ＥＵ番号付けシステムに準ずるものである。
8. （Ｓ１ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に、配列番号７または８で示される、テールピースエレメントを融合すること、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 重鎖Ｆｃ領域エレメントであって、
   （１） Ｆｃ領域の３０９番目の位置に、Ｗのアミノ酸残基を含み、ならびに
   （２） Ｆｃ領域の３４５番目の位置に、Ｒのアミノ酸残基を含み、
   ここで、前記重鎖Ｆｃ領域エレメントのアミノ酸の番号は、ＥＵ番号付けシステムに準ずるものである
   ことを特徴とする重鎖Ｆｃ領域エレメント。
10. 請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質、あるいは請求項９に記載の重鎖Ｆｃ領域エレメントをコードすることを特徴とする、単離された核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸分子を含有することを特徴とする、発現ベクター。
12. 請求項１１に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、宿主細胞。
13. 請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質あるいは請求項９に記載の重鎖Ｆｃ領域エレメントの製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
    （ａ） 発現の条件において、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することにより、前記の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは前記の重鎖Ｆｃ領域エレメントを発現させる；
    （ｂ） （ａ）に記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは前記の重鎖Ｆｃ領域エレメントを単離して精製する。
14. 以下のものを含むことを特徴とする免疫複合体：
    （ａ） 請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質、ならびに
    （ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選ばれる複合部分。
15. 請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその断片もしくは融合タンパク質あるいは請求項１４に記載の免疫複合体と薬学的に許容される担体とを含む含有することを特徴とする薬物組成物。
16. 癌または免疫関連疾患を治療する薬物の製造における、請求項１～６のいずれかに記載の抗体またはその断片または融合タンパク質、あるいは請求項１４に記載の免疫複合体、あるいは請求項１５に記載の薬物組成物の使用。
17. 前記癌は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、膠細胞腫、多発性骨髄腫およびほかの新生物性悪性疾患からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
18. 前記免疫関連疾患が、自己免疫性疾患である、請求項１６に記載の使用。
19. 前記自己免疫性疾患が、自己免疫性腎臓疾患、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸管疾患、クローン病（Ｃｒｏｈｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性結腸炎、ペイロニー病（Ｐｅｙｒｏｎｉｅ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣疾患、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、手術癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝臓炎、強直性脊椎炎、線維化肺胞炎、バセドウ病（Ｇｒａｖｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ'ｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、ほかの自己免疫性障害、膵臓腺炎、創傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、心臓疾患、血管内凝固、骨再吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎および低クロール血症、胎児－母体耐性欠失に関連する不妊症、白斑、重症筋無力症（ＭＧ）、全身性強皮症、炎症性腸疾患、胃炎またはＩｇＧ４関連疾患、免疫グロブリンＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）または腎障害性モノクローナル・ガンモパチー（ＭＧＲＳ）、ループス腎炎または紫斑病性腎炎であることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。