JP7736388B2 - 黒酵母由来のエキソソームを含む化粧料組成物 - Google Patents

Description

本発明は、黒酵母由来のエキソソームを有効成分として含む皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿及び／又は美白用化粧料組成物に関する。

皮膚の老化が起こると、皮膚の弾力が減少し、皮膚のシワが増加するようになるが、皮膚の弾力減少及び皮膚のシワ形成は、コラーゲンの合成が減少し、コラーゲンを分解する酵素であるＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現が促進されて現れるものとして知られている。

皮膚のシワ改善に効果的であるとして知られている物質としては、アデノシン、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）などがあるが、アデノシンは、臨床での効能がわずかであり、レチノイン酸は、妊娠可能な女性に使用することができず、紅斑などの副作用がある。それによって、植物や天産物の有効成分を活用した皮膚抗老化用機能性化粧品が最近注目を集めている。しかし、植物抽出物を有効成分として含む機能性化粧品は、皮膚に塗布した後に溶液が蒸発する過程で異物感が発生することがあり、効果の持続時間が短いという問題がある。

ヒトの皮膚色を決定するメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）は、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）から生成される。具体的に、メラニンは、生体内に存在するアミノ酸であるチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）を基質とし、メラノサイトに存在するチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）などの酵素による重合化酸化反応により形成される黒褐色の色素である。このように形成されたメラニンは、メラノサイトの樹状突起を通じてケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）という表皮細胞に移動することになる。ケラチノサイトに移動したメラニンは、ケラチノサイトが表皮から離れるときに皮膚から一緒に離れることで除去され得る。しかし、生体内にメラニンを分解する酵素がないので、一度形成されたメラニンは生体内では分解されない。したがって、皮膚を明るくするためには、メラニンの生成を抑制することが重要である。

化粧品としての美白剤の研究は、最近、情緒的に白い皮膚を好む東洋圏の生活レベルの向上と共に皮膚の黒化が紫外線による皮膚老化であると認識されながらその必要性が徐々に増大している。それによって、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ハイドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）などのチロシナーゼ阻害活性を示す物質が化粧料や医薬品に配合されて用いられてきたが、これらのうち大部分は、効果が不十分であるか剤形上不安定な面があって活用度が下がる。特に、ハイドロキノンのような化合物は、強い脱色作用を示し、それ自体が皮膚の感作性を有しているので、皮膚のアレルギーなどを誘発し得、正常的な皮膚の機能を変化させて白斑症を誘発するなどの副作用を示し、皮膚に対する安全性の側面からその使用が制限されている。

皮膚は、人体の１次的な保護障壁であって、体内の水分を保存し、過度な発散を防止し、外部からの多様な刺激（化学物質、大気汚染物質、乾燥した環境、紫外線など）に対して人体を保護する。皮膚は、大きく表皮、真皮、そして皮下脂肪からなっており、表皮は、さらに角質層、顆粒層、有棘層、基底層に区分される。角質形成細胞と角質細胞間の脂質膜で構成された表皮の角質層が正常的に形成されている場合に皮膚の保護機能が維持され得る。角質形成細胞の水分を保持する機能、そして角質細胞間の脂質膜の水分損失を阻む機能によりヒトは皮膚の水分保有量を約３０％に維持し得る。

ヒトの角質形成細胞では、水分とグリセロールを細胞内に輸送する膜貫通タンパク質であるアクアポリン３（ａｑｕａｐｏｒｉｎ ３、ＡＱＰ３）が発現される。ＡＱＰ３は、細胞間の水分及びグリセロールの移動を調節するタンパク質であって、ＡＱＰ３遺伝子の発現が抑制されたマウスモデルで皮膚障壁が損傷され、皮膚の弾力と水分含有能力が低下することが確認された。

また、ヒアルロン酸は、皮膚の天然保湿因子として表皮層で水分を保持する重要な基質である。ヒアルロン酸の合成酵素であるヒアルロナン合成酵素２（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２、ＨＡＳ２）とヒアルロナン合成酵素３（ＨＡＳ３）は、皮膚の表皮で発現し、皮膚の保湿能力を評価する指標として使用されることもある。

最近には、環境や生活パターンの変化、社会生活から発生する各種ストレスと環境汚染、化粧習慣によるひんぱんな洗顔などの原因により角質層の水分が減少して皮膚が乾燥し、表面が荒れるようになり、皮膚がつやを失ってくすんで見えるなどの現象が発生して皮膚保湿に関する問題はその重要性が一層大きくなっている。

したがって、皮膚のシワ改善、皮膚の弾力改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚美白及び／又は皮膚保湿などの皮膚状態の改善効果に卓越しているとともに副作用がなく、使用が簡便な新しい美容素材の開発が必要である。

一方、最近細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に、細胞分泌物内には、細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。

細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソームなどと呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別して用いられることもある。

エキソソームは、細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十乃至数百ナノメートルサイズの小胞体であって、内部には、エキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは、細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であって、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節するとして知られている。エキソソームは、由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２） ５６９－５７９）。

すなわち、細胞のアバターと呼ばれるエキソソームは、細胞と類似して成長因子のような生体活性因子を含んでいるが、生体活性因子を細胞と細胞の間に積んで運ぶ伝達体としての役目、すなわち、細胞と細胞の間の交信の役目をする。エキソソームは、幹細胞、免疫細胞、線維芽細胞及び癌細胞などの動物細胞から放出されるだけでなく、植物、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、菌類（ｆｕｎｇｉ）、藻類（ａｌｇａｅ）など多様な生物の細胞からも放出されるものとして知られている。

黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）は、自然界に広く存在する不完全菌類であり、メラニン色素を生成し、培養条件によって菌体外にβ－１，３－１，６－グルカンを大量生産する菌類である。黒酵母は、３０℃で最適成長を有し、１０℃～３５℃で成長する。黒酵母が生産する高分子多糖類であるプルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）は、食品工業でゼリーなどの物性の付与に用いられている。また、液状食品をプルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）のフィルム内に入れる新しい食品が開発されている。黒酵母由来のベータグルカンは、培地中に生合成される菌体外多糖であって、精製する必要がなく、水溶性であるので加工が容易である。

したがって、黒酵母は、食品、化粧品分野などで広く活用されている。しかし、黒酵母に由来するエキソソームの分離・精製及び特性分析に関する研究は、未だに不十分な状態である。したがって、黒酵母に由来するエキソソームに関するより綿密な特性分析及び機能に関する研究が必要である。

微生物の醗酵物や培養液を使用した化粧品が紹介されているが、一部の醗酵物や培養液は、敏感な皮膚を持つ人に皮膚トラブル、皮膚の赤み又は皮膚炎などの副作用を起こすこともある。

一方、前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を深めるためのものに過ぎず、本発明の「先行技術」として利用され得るという承認として引用したものではないことを理解しなければならない。

Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２） ５６９－５７９

上記のような状況で、本発明者らは、黒酵母の醗酵物や培養液に比べて効果が改善された化粧料組成物を開発するために研究し、黒酵母に由来するエキソソームが皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿及び皮膚美白効能に優れていることを確認し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、黒酵母由来のエキソソームを有効成分として含む皮膚状態改善用化粧料組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）由来のエキソソームを有効成分として含む皮膚状態改善用化粧料組成物を提供する。

本明細書で用いられた用語「黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）」は、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属に属する菌類であって、菌糸がなく運動性及び光合成能を有しない単細胞生物である。黒酵母は、自然界に広く存在する不完全菌類であり、メラニン色素を生成し、培養条件によって菌体外にβ－１，３－１，６－グルカンを大量生産する。

本明細書で用いられた用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、黒酵母から細胞外空間に分泌又は放出された膜構造を有するナノサイズの小胞を意味し、エキソソーム類ベシクル又はエキソソーム類パーティクルとも定義される。

本明細書で用いられた用語「黒酵母由来のエキソソーム」と言う用語は、例えば、黒酵母培養液又は黒酵母醗酵物、若しくはこれらと同等の黒酵母の生物学的溶液から分離されるか黒酵母自体から分泌及び／又は放出されたエキソソームを全て含むことを意味する。黒酵母由来のエキソソームを生産するために、当業界で使われているか今後に用いられ得る多様な黒酵母菌株を用いることができ、実施例で用いられた黒酵母菌株は、本発明で用いられ得る黒酵母菌株の一例として理解しなければならず、本発明は、これに制限されるものではない。

本明細書で用いられた用語「皮膚の状態改善」は、皮膚状態の悪化と係わる症状の程度を減少させることを言い、皮膚状態は、皮膚弾力、皮膚シワ、皮膚のキメ、皮膚トーン、皮膚明るさ、皮膚再生、皮膚美白及び皮膚保湿と係わるパラメータであってもよい。

具体的に、「皮膚の弾力改善」は、コラーゲン合成を促進するなど皮膚の脂肪組織の体積を増加させて垂れた皮膚組織を収縮させる効果と共に皮膚の弾力を維持あるいは増加させることを意味する。

また、「皮膚シワ」は、皮膚が老衰して生じた細かい線を意味するが、遺伝子による原因、皮膚真皮に存在するコラーゲンとエラスチンの減少、外部環境などにより誘発され得る。したがって、本明細書で用いられる用語である「皮膚のシワ改善」は、皮膚にシワが生成されることを抑制又は阻害したり、既に生成されたシワを緩和したりすることを意味する。

一方、本明細書で用いられる用語である「皮膚トーン」は、皮膚の色が濃いか薄いかの程度の状態を意味し、「皮膚のトーン改善」は、一定しない皮膚のトーンを一定にすることを意味する。「皮膚美白」と「皮膚の明るさ改善」は、メラニンなどの色素の過多により明度が減少した皮膚の明度を増加させるか、又は皮膚の明度を一定レベルに維持することを含む。

また、「皮膚再生」は、皮膚の外部及び内部原因により損傷された皮膚組織が回復することを言う。前記外部原因としては、紫外線、外部汚染物質、創傷、外傷などが挙げられ、前記内部原因としては、疾病、ストレスなどが挙げられる。「皮膚保湿」は、皮膚の水分が減少することを阻害又は抑制するか皮膚の水分含有量を増加させて皮膚表面を滑らかにし、ツヤを付与することを言う。

下記実施例から確認できるように、前記黒酵母由来のエキソソームは、皮膚線維芽細胞に伝達され（図２）、コラーゲン合成を増加させる（図３）。また、メラノーマ細胞では、メラニンの生成を抑制し（図５）、ヒアルロン酸合成酵素又はアクアポリン合成を促進する。

したがって、黒酵母由来のエキソソームを含む化粧料組成物は、皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚美白及び皮膚保湿効果からなる群より選択される一つ以上の効果を示すことができる。

一方、本発明の皮膚状態改善用化粧料組成物は、ローション剤、液剤、クリーム剤、沈積マスク剤、ゲル剤、エアロゾール剤及び粉末剤で構成された群から選択される少なくとも１種の剤形で作られ得る。

前記ローション剤は、化粧料組成物の有効成分と乳化剤などを混合して油性成分と水性成分を均質化させた後に粘液状に作った剤形を言い、クリーム剤は、化粧料組成物の有効成分と乳化剤などを混合して油性成分と水性成分を均質化させた後に半固形状に作った剤形を言う。また、液剤は、化粧料組成物の有効成分と他の成分を溶剤などに溶かして液状に作った剤形であり、ゲル剤は、液体を浸透させた分子量が大きい有機分子からなった半固形状を言う。

沈積マスク剤は、ローション剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤などを不織布などの支持体に沈積して作った剤形であって、パッチ、マスクパック、マスクシートなどで作られ得る。エアロゾール剤は、原液を同じ容器又は他の容器に充填した噴射剤（液化気体、圧縮気体など）の圧力を利用して霧状、泡沫状などで噴出するものを言う。また、粉末剤とは、均質に粉末状又は微粒状に作ったものを言い、賦形剤などを用いることができる。

例えば、本発明の皮膚状態改善用化粧料組成物は、ローション剤又はクリーム剤に作られるか、若しくはパッチ、マスクパック又はマスクシートの少なくとも一面に塗布されるか沈積され得る。

一方、本発明の皮膚状態改善用化粧料組成物は、皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿及び／又は皮膚美白などを目的として用いられ、当業界で通常的に製造されるいかなる形態にも製造され得る。例えば、パッチ、マスクパック、マスクシート、柔軟化粧水、栄養化粧水、収れん化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに製造され得るが、これに限定されるものではない。

一方、本発明の一具体例の皮膚状態改善用化粧料組成物は、本発明の効果を損傷しない範囲内で化粧料組成物に通常的に利用される成分、例えば、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤などを必要に応じて追加で含むことができる。

また、本発明の一具体例の皮膚状態改善用化粧料組成物は、黒酵母由来のエキソソーム以外に、その作用（皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚再生、皮膚保湿、皮膚のトーンや皮膚の明るさ改善、皮膚美白、皮膚美容など）を損傷させない限度で、従来から使用されてきた皮膚改善剤、抗酸化剤及び／又は保湿剤と混合して使用することができる。例えば、本発明の黒酵母由来のエキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウムなど）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の化粧料組成物において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、好ましくは、ゲル化高分子を多価アルコールに分散させて得たハイドロゲルであってもよい。前記ゲル化高分子は、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム及びローカストビーンガムからなる群より選択された少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール及びグリセリンからなる群より選択された少なくとも１種であってもよい。

また、本発明の皮膚状態改善用化粧料組成物は、一般皮膚化粧料に配合される化粧学的に許容可能な担体を１種以上追加で含むことができ、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などと適切に配合され得るが、これに制限されるものではない。

本発明の剤形が粉末剤又はエアロゾール剤である場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダー又はこれらの混合物が利用され得、特に、エアロゾール剤である場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。

本発明の剤形がクリーム剤又はゲル剤である場合には、担体成分として動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などが利用され得る。

本発明の剤形が液剤のうち溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶媒化剤又は乳濁化剤が利用され得、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエード、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが利用され得る。

本発明の剤形が液剤のうち懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガロース又はトラガカントなどが利用され得る。

本発明の他の様相は、前記皮膚状態改善用化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に適用させる段階を含む治療用を除いた哺乳動物の皮膚を改善させる美容方法を提供する。

前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウマ、ウシ、サル又はブタであってもよいが、これに制限されない。

本発明の美容方法において、皮膚の状態改善とは、皮膚組織の外観及び感じの視覚的及び／又は触覚的に知覚し得る肯定的な変化を意味する。例えば、皮膚の状態改善とは、皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿及び／又は皮膚美白であってもよい。

本発明で、前記皮膚状態改善用化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に適用させる段階は、（ａ）前記皮膚状態改善用化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布する段階、又は（ｂ）前記皮膚状態改善用化粧料組成物が塗布されるか沈積されたパッチ、マスクパック又はマスクシートを哺乳動物の皮膚に接触又は付着する段階、又は前記（ａ）及び（ｂ）を順次に進行する段階であってもよい。前記（ａ）段階では、ローション剤又はクリーム剤の剤形の皮膚状態改善用化粧料組成物が用いられ得る。

また、本発明の美容方法は、（ｃ）前記（ｂ）段階以後に前記パッチ、マスクパック又はマスクシートを哺乳動物の皮膚から除去し、前記皮膚状態改善用化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に塗布する段階をさらに含むことができる。前記（ｃ）段階では、ローション剤又はクリーム剤の剤形の皮膚状態改善用化粧料組成物が用いられ得る。

一方、本発明に記載した全ての成分は、好ましくは、化粧品安全基準などに関する規定及び中国の「化粧品安全技術規範」で規定した最大使用値を超過しない範囲内で本発明の組成物に含まれ得る。

本発明の化粧料組成物は、皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーンや皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿及び／又は皮膚美白効果に優れているので、皮膚状態改善の用途として有用に用いられ得る。

図１は、本発明の黒酵母由来のエキソソームに対してＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行って得た粒子サイズ分布と粒子数を示したグラフである。 図２は、蛍光染色された黒酵母由来のエキソソームがヒト皮膚線維芽細胞に伝達されたことを示した細胞蛍光顕微鏡イメージである（緑色：細胞内に伝達されたエキソソーム、青色：細胞核）。 図３は、ヒト皮膚線維芽細胞に黒酵母由来のエキソソームを低濃度及び高濃度で処理した後の相対的なコラーゲン量を示したグラフである。 図４は、蛍光染色された黒酵母由来のエキソソームがメラノーマ細胞に伝達されたことを示した細胞蛍光顕微鏡イメージである（緑色：細胞内に伝達されたエキソソーム、青色：細胞核）。 図５は、メラノーマ細胞に酵母由来のエキソソームを低濃度及び高濃度で処理した後にメラニン生成量が減少したことを示したグラフである。

以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。

明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。

＜実施例１：黒酵母由来のエキソソームの製造＞

黒酵母菌株であるＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ Ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＯＦＹ１１－１菌株（ＫＣＴＣから入手；寄託番号１４１５８ＢＰ）を振とう培養した後、培養培地を遠心分離してペレット化して黒酵母細胞を除去した。

黒酵母細胞が除去された培養液から、タンジェント流濾過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を利用して黒酵母由来のエキソソームを分離した。

分離した黒酵母由来のエキソソームのサイズと濃度は、ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌから購入）を利用したナノ粒子トラッキング分析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮＴＡ）で確認した（図１）。

＜実施例２：黒酵母由来のエキソソームの皮膚線維芽細胞への伝達能の確認＞

黒酵母由来のエキソソームがヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＤＦ、ＡＴＣＣから購入）内に伝達するか否かを次のように確認した。

実施例１で準備した黒酵母由来のエキソソームの膜を蛍光染色するためにＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）蛍光染料と反応させた。反応後、反応液をＭＷ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のカラムで分画してエキソソーム膜に染色されていない遊離ＰＨＫ６７（ｆｒｅｅ ＰＫＨ６７）蛍光染料を除去した。陰性対照群としては、ＰＫＨ６７蛍光染料を緩衝溶液と反応させた後、ＭＷ３０００で分画したものを用いた。ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームをあらかじめ培養して準備したヒト皮膚線維芽細胞とともに培養した後、時間によるエキソソームの細胞内伝達有無を蛍光顕微鏡で観察した。細胞核の染色には、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）蛍光染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用い、細胞膜の染色には、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ蛍光染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。

蛍光顕微鏡で黒酵母由来のエキソソームの細胞内への伝達有無を確認した結果、緑色蛍光が細胞内部に時間の経過に応じて蓄積されることを確認して、黒酵母由来のエキソソームが細胞内に伝達されることが分かった（図２）。

＜実施例３：黒酵母由来のエキソソームのコラーゲンの生成促進効果の確認＞

ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭ培地に分散されたヒト皮膚線維芽細胞を２４－ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０^４濃度で分株して２４時間の間培養した。

その後、実施例１で準備した黒酵母培養液又は黒酵母由来のエキソソームを無血清培地に希薄してヒト皮膚線維芽細胞に処理し、ヒト皮膚線維芽細胞を２４時間培養した。ヒト皮膚線維芽細胞を利用したコラーゲン生成効能の確認のために実験群を次のように分類した：

（１）陰性対照群（図３で「対照群」で表示）：無血清培地のみ処理した実験群；

（２）黒酵母培養液処理群（図３で「ＣＭ」で表示）：実施例１で準備した黒酵母培養液を無血清培地に希釈して処理した実験群（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^９粒子／ｍＬ）；

（３）黒酵母由来のエキソソームの低濃度処理群（図３で「低濃度エキソソーム」で表示）：実施例１で準備した黒酵母由来のエキソソームを低濃度で無血清培地に希釈して処理した実験群（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^９粒子／ｍＬ）；

（４）黒酵母由来のエキソソームの高濃度処理群（図３で「高濃度エキソソーム」で表示）：実施例１で準備した黒酵母由来のエキソソームを高濃度で無血清培地に希釈して処理した実験群（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^１０粒子／ｍＬ）。

ヒト皮膚線維芽細胞を２４時間培養後に培養液を回収して遠心分離した後、遠心分離された培養液を準備した。ヒト皮膚線維芽細胞から合成されて培養液に蓄積されたコラーゲン量をプロコラーゲンタイプＩＣ－ペプチド（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＣ－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＩＰ）に対するＥＩＡキット（Ｔａｋａｒａから購入）で測定した。測定されたコラーゲン量をＭＴＴアッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入）で測定した総細胞数で分けて正規化させることによって相対的なコラーゲンの量を決定した。

その結果、黒酵母由来のエキソソームは、陰性対照群に比べてヒト皮膚線維芽細胞でコラーゲン合成を著しく増加させ、特に、処理濃度が増加するにつれてコラーゲン合成を一層増加させることが確認できた（図３）。すなわち、本発明の黒酵母由来のエキソソームは、濃度依存的にヒト皮膚線維芽細胞でコラーゲン合成を増加させることが確認できた。

また、同一濃度（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^９粒子／ｍＬ）で、黒酵母培養液処理群より黒酵母由来のエキソソームの低濃度処理群でヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン生成量が多いことが分かった（図３）。

したがって、本発明の黒酵母由来のエキソソームを有効成分として含有する化粧料組成物は、コラーゲン合成を増加させる活性を有し、黒酵母由来のエキソソームは、皮膚のシワ改善、皮膚の弾力改善及び／又は皮膚再生用機能性化粧料組成物の有効成分として有用に活用され得る。

＜実施例４：黒酵母由来のエキソソームのマウスメラノーマ細胞への伝達能の確認＞

黒酵母由来のエキソソームがマウスメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０；ＡＴＣＣから購入）内に伝達されるか否かを次のように確認した。

実施例１で準備した黒酵母由来のエキソソームの膜を蛍光染色するためにＰＫＨ６７蛍光染料と反応させた。反応後、反応液をＭＷ３０００カラムで分画してエキソソーム膜に染色されていない遊離ＰＫＨ６７蛍光染料を除去した。陰性対照群としては、ＰＫＨ６７蛍光染料を緩衝溶液と反応させた後、ＭＷ３０００で分画したものを用いた。ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームをあらかじめ培養して準備したＢ１６Ｆ１０細胞とともに培養した後、時間によるエキソソームの細胞内への伝達有無を蛍光顕微鏡で観察した。細胞核の染色は、ヘキスト蛍光染料を用い、細胞膜染色には、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ蛍光染料を用いた。

蛍光顕微鏡で黒酵母由来のエキソソームの細胞内への伝達有無を確認した結果、緑色蛍光が細胞内部に時間の経過に応じて蓄積されることを確認して、黒酵母由来のエキソソームがメラノーマ細胞内に伝達されることが分かった（図４）。

＜実施例５：メラニン生成の抑制効果＞

黒酵母由来のエキソソームの美白効果をメラノーマ細胞に対するメラニン生成の抑制程度を通じて確認した。前記メラノーマ細胞は、マウス黒色腫に由来する細胞であり、メラニンという黒色の色素を分泌する。メラノーマ細胞を４８－ウェルプレートに各ウェル当たり８ｘ１０^３濃度で分株した後、１０％ウシ胎児血清を含むフェノールレッド未含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。

その後、実施例１で準備した黒酵母由来のエキソソームをメラニン合成刺激剤であるα－ＭＳＨ（α－ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が混合された培養培地に希釈した後、メラノーマ細胞に処理し、メラノーマ細胞を４８時間培養した。実験群は次のように分類した：

（１）陰性対照群（図５で「陰性対照群」で表示）：メラニン合成刺激剤であるａ－ＭＳＨが混合された培養培地を処理した実験群；

（２）陽性対照群（図５で「陽性対照群」で表示）：メラニン合成刺激剤であるａ－ＭＳＨとアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）（最終濃度：１ｍＭ）を混合した培養培地を処理した実験群；

（３）黒酵母由来のエキソソームの低濃度処理群（図５で「低濃度エキソソーム」で表示）：メラニン合成刺激剤であるａ－ＭＳＨと低濃度の黒酵母由来のエキソソームを混合した培養培地を処理した実験群（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^９粒子／ｍＬ）；

（４）黒酵母由来のエキソソームの高濃度処理群（図５で「高濃度エキソソーム」で表示）：メラニン合成刺激剤であるａ－ＭＳＨと高濃度の黒酵母由来のエキソソームを混合した培養培地を処理した実験群（粒子数基準処理濃度：３．０Ｘ１０^１０粒子／ｍＬ）。

メラノーマ細胞を４８時間培養した後、培養液を回収して洗浄溶液（ＰＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）でメラノーマ細胞を洗浄した。

前記回収された培養培地とＣＣＫ－８アッセイ試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏから購入）を混合して５％のＣＯ_２、３７℃の条件で２時間インキュベーションした後、上層液を９６－ウェルプレートに移して４５０ｎｍで吸光度を測定した。また、洗浄されたメラノーマ細胞に１０％ ＤＭＳＯを混合した１Ｎ ＮａＯＨ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を処理した後、プレートを密封して８５℃で２０分間加熱してメラノーマ細胞内のメラニンを抽出した。抽出したメラニンは、４０５ｎｍで吸光度を測定してメラニン量を計算した。

その結果、黒酵母由来のエキソソームは、濃度依存的にメラノーマ細胞のメラニン合成を減少させることが確認できた（図５）。

したがって、本発明の黒酵母由来のエキソソームを有効成分として含有する化粧料組成物は、美白効果を有し、黒酵母由来のエキソソームは、皮膚のトーンや皮膚の明るさ改善、及び／又は皮膚美白のための機能性化粧料組成物の有効成分として有用に活用され得る。

＜実施例６：ヒアルロン酸合成酵素又はアクアポリン合成の促進効果の確認＞

ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ)を６－ウェル細胞培養プレートに各ウェル当たり２ｘ１０^５濃度で分株し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、培地を１０％ ＦＢＳ及びカルシウム（Ｃａ^２＋）が含まれていないＤＭＥＭ培地に交替した後、黒酵母由来のエキソソームを培地に希釈して２４時間処理した。２４時間が経過した後に細胞を回収して冷却されたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で全体ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを主型としてｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＰｈｉｌｅＫｏｒｅａ、Ｋｏｒｅａ）で逆転写反応を行ってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは、定量した後、水で希釈して全ての反応に同一量を用いた。ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）、ＨＡＳ２プライマー（ＩＤ：Ｈｓ００１９３４３５＿ｍ１）及びＡＱＰ３プライマー（ＩＤ ：ＨＳ０１１０５４６９＿Ｇ１）を用いた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）でリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行った。

実験結果は、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＧＡＰＤＨ）を基準としてΔΔＣｔ方法で計算して示した。黒酵母由来のエキソソームを処理しない陰性対照群のｍＲＮＡ発現量を約１．０とし、これを基準として実験群のＨＡＳ２（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）及びＡＱＰ３（ａｑｕａｐｏｒｉｎ ３）遺伝子の発現程度を数値化した（表１～２）。

黒酵母由来のエキソソーム処理によるヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ２遺伝子の発現程度を測定した結果、表１から確認できるように、黒酵母由来のエキソソームを処理しない無処理群に比べ、黒酵母由来のエキソソームを処理した場合、濃度依存的にＨＡＳ２遺伝子の発現が増加することを確認し、最大約３倍にＨＡＳ２遺伝子の発現が増加することを確認した。

また、黒酵母由来のエキソソームの処理による膜貫通タンパク質であるアクアポリン３，ＡＱＰ３遺伝子の発現程度を測定した結果、表２から確認できるように、黒酵母由来のエキソソームを処理しない無処理群に比べ、黒酵母由来のエキソソームを処理した場合、濃度依存的にＡＱＰ３遺伝子の発現が増加することを確認し、最大約４．５倍にＡＱＰ３遺伝子の発現が増加することを確認した。

したがって、本発明の黒酵母由来のエキソソームを有効成分として含む化粧料組成物は、ヒアルロン酸あるいはアクアポリン合成の増加を通じた皮膚の保湿剤効果を有し、皮膚保湿用化粧料組成物の有効成分として有用に活用され得る。

以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。

Claims (5)

1. 分離した黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚状態改善用化粧料組成物。
2. 前記皮膚状態改善は、皮膚の弾力改善、皮膚のシワ改善、皮膚のキメ改善、皮膚のトーン改善、皮膚の明るさ改善、皮膚再生、皮膚保湿又は皮膚美白である、請求項１に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
3. 前記黒酵母由来のエキソソームは、黒酵母培養液又は黒酵母醗酵物、若しくは黒酵母の生物学的溶液から分離されたものである、請求項１又は請求項２に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
4. ローション剤、液剤、クリーム剤、沈積マスク剤、ゲル剤、エアロゾール剤及び粉末剤で構成された群から選択される少なくとも１種の剤形である、請求項１又は請求項２に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
5. パッチ、マスクパック又はマスクシートの少なくとも一面に塗布されるか沈積されるものである、請求項１又は請求項２記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。