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JP7740708B2 - ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドを含有する複合体、及びその用途 - Google Patents
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JP7740708B2 - ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドを含有する複合体、及びその用途 - Google Patents

ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドを含有する複合体、及びその用途

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Description

本発明は、ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖CpG含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドを含有する複合体、及びその用途に関する。詳細には、本発明は、増強された免疫賦活活性を有する、ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖CpG含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカンとの複合体、及びその医薬用途等に関する。
CpGオリゴヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活性の非メチル化CG配列（CpGモチーフ）を含有する、短い一本鎖のDNA断片であって、Toll様受容体9（TLR9）の強力なアゴニストである。樹状細胞（DCs）やB細胞を活性化して、I型インターフェロン及び炎症性サイトカインの産生を誘導し、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）反応を含むTh1型の液性及び細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する。CpG ODNは、強い免疫賦活活性を有し、合成により簡便に作成できるため、アジュバントのみならず抗がん剤や抗アレルギー剤としても期待されている。
これまでに、骨格配列及び免疫賦活特性が異なる4種類（Class A、Class B、Class C、Class P）のCpG ODNが報告されている（非特許文献6）。このうち、Class A（Type Dとも呼ばれる）は、I型インターフェロン産生を強力に誘導することができるが、高次構造を形成するために、塩の入った溶液中では凝集塊を形成してしまい、臨床開発が困難である。一方、Class B （Type Kとも呼ばれる）は、非回文構造の、複数のCpGモチーフを含有し、凝集塊を形成せずに、B細胞を強力に活性化してIL-6を産生させることができるが、ほとんどI型インターフェロン産生を誘導しない（非特許文献2、3）。非特許文献4に、いくつかのClass B CpG ODNが報告されている。
シゾフィラン（SPG）は、スエヒロタケ由来の公知の可溶性β-1,3-グルカンであり、β-(1→3)-D-グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当り1個のβ-(1→6)-D-グルコシル側鎖からなる（非特許文献5）。シゾフィラン等のβ-1,3-グルカンは、天然においては三重螺旋構造を形成しているが、アルカリ性溶媒に溶解すると三重螺旋が解離して一本鎖となる。この一本鎖のβ-1,3-グルカンに、ポリデオキシアデニル酸（dA）を混合して中和すると、β-1,3-グルカンとポリ(dA)とが三重螺旋構造の複合体を形成する（非特許文献6）。
近年、代表的なクラスB CpG ODNであるK3の3’末端にポリ（dA）テイルを付加し、シゾフィランやレンチナン等のβ-1,3-グルカンと複合体を形成すると、該複合体は、クラスA CpG ODN配列を有していないにも関わらず、クラスB CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、クラスA CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を併せ持つことが報告されている（特許文献1）。
WO 2015/041318
Vollmer, J. et al., Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009) Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001) Hartmann, G. et al., Journal of immunology 164, 944-953 (2000) Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 168, 1659-1663 (2014) Tabata, K. et al., Carbohydr. Res., 89, 121-135 (1981) Sakurai, K., et al., Biomacromolecules 2, 641-650 (2001)
特許文献1に開示されたK3/β-1,3-グルカン複合体により、凝集せずにI型インターフェロン産生を誘導することができる新たなCpG ODNが提供されたが、この複合体はIL-6産生誘導活性をも併せ持つ「オール・イン・ワン」タイプであるため、I型インターフェロン産生誘導能が増強され、IL-6よりもI型インターフェロン産生誘導型によりシフトしたCpG ODNの開発が望まれている。
本発明は、I型インターフェロン産生能が増強された新たなCpG ODNやこれを含む複合体を提供することを目的とする。
本発明者らは、このK3/SPG複合体のI型インターフェロン産生誘導活性を更に強化すべく検討したところ、CpG ODNとして、K3よりも短い、特定のコンセンサス配列を有する短鎖CpG ODNを用いると、短鎖CpG ODN単独では、K3よりも、免疫賦活活性が低いにも関わらず（非特許文献2及び4）、3’末端にポリ（dA）テイルを付加し、β-1,3-グルカンと複合体化すると、驚くべきことに、K3の場合よりも、むしろIFN-α産生誘導活性が増強されることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下に関する。
［1］式（I）：
5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ （I）
（式中、Xは、T又はCであり、
Lは、1～7塩基からなるヌクレオチド配列であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む、8～16塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
β-1,3-グルカンと複合体を形成可能な長さのポリデオキシアデニル酸
を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に連結されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
［2］XがTである、［1］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［3］ZがTである、［1］又は［2］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［4］Lが、式（II）
5’Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y73’ （II）
（式中、Y1はA、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2、Y3、Y4、Y5、Y6及びY7は、それぞれ独立して、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基である）
で表されるヌクレオチド配列である、［1］～［3］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［5］式（II）においてY3、Y4、Y5、Y6及びY7が存在しない、［4］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［6］Y1が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、［5］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［7］Y2が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、［5］又は［6］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［8］Y1がA又はTであり、Y2がG又はTであり、Y3がC又はTであり、Y4がG又はTであり、Y5がA又はTであり、Y6がG又はTであり、Y7が存在しないか、A又はTである、［4］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［9］Lが、A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である、［1］～［8］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［10］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（I）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基の付加配列を有する、［1］～［9］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［11］1～3塩基の付加配列がC、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である、［10］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［12］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（I）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有する、［1］～［11］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［13］1塩基の付加配列がAである、［12］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［14］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、8～15塩基からなる、［1］～［13］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［15］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、8～12塩基からなる、［1］～［14］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［16］式（I）で表されるヌクレオチド配列が、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列からなる、［1］～［15］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［17］式（I）で表されるヌクレオチド配列が、配列番号68、94、95、96、97、98又は99で表されるヌクレオチド配列からなる、［1］～［15］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［18］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが配列番号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26又は27で表されるヌクレオチド配列からなる、［1］～［15］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［19］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号66、67、68、71、72、73、74、75、76、又は77で表されるヌクレオチド配列からなる、［1］～［15］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［20］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［1］～［19］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［21］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［20］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［22］ポリデオキシアデニル酸の長さが、20～60塩基である、［1］～［21］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［23］配列番号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、又は54で表されるヌクレオチド配列を含む、［1］～［22］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［24］配列番号78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92又は93で表されるヌクレオチド配列を含む、［1］～［22］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［25］［1］～［24］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカンを含有する複合体。
［26］β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、［25］記載の複合体。
［27］β-1,3-グルカンが、カードランである、［25］記載の複合体。
［28］(i) ［1］～［24］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii) β-1,3-グルカン
を含有する医薬組成物。
［29］(i)のオリゴデオキシヌクレオチドが(ii)のβ-1,3-グルカンと複合体を形成している、［28］記載の医薬組成物。
［30］β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、［28］又は［29］記載の医薬組成物。
［31］β-1,3-グルカンが、カードランである、［28］又は［29］記載の医薬組成物。
［32］免疫賦活用である、［28］～［31］のいずれかの医薬組成物。
［33］I型インターフェロン産生誘導用である、［28］～［31］のいずれか記載の医薬組成物。
［34］免疫賦活用又はI型インターフェロン産生誘導用医薬組成物を製造するための、［25］～［27］のいずれか記載の複合体の使用。
［35］I型インターフェロン産生誘導用医薬組成物を製造するための、［25］～［27］のいずれか記載の複合体の使用。
［36］［25］～［27］のいずれか記載の複合体の薬理的有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における免疫反応を増強する方法。
［37］［25］～［27］のいずれか記載の複合体の薬理的有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物においてI型インターフェロン産生を誘導する方法。
［38］免疫反応の増強において使用するための、［25］～［27］のいずれか記載の複合体。
［39］I型インターフェロン産生の誘導において使用するための、［25］～［27］のいずれか記載の複合体。
［1b］式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、T又はCであり、
Y1は、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む、8～16塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
β-1,3-グルカンと複合体を形成可能な長さのポリデオキシアデニル酸
を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に連結されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
［2b］XがTである、［1b］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［3b］Y1が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、［1b］又は［2b］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［4b］Y2が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、［1b］～［3b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［5b］ZがTである、［1b］～［4b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［6b］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基の付加配列を有する、［1b］～［5b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［7b］1～3塩基の付加配列がC、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である、［6b］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［8b］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、［1b］～［7b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［9b］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、8～12塩基からなる、［1b］～［8b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［10b］式（Ib）で表されるヌクレオチド配列が、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列からなる、［1b］～［9b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［11b］CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26又は27で表されるヌクレオチド配列からなる、［1b］～［10b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［12b］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［1b］～［11b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［13b］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［12b］記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［14b］ポリデオキシアデニル酸の長さが、20～60塩基である、［1b］～［13b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［15b］配列番号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、又は54で表されるヌクレオチド配列を含む、［1b］～［14b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［16b］［1b］～［15b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカンを含有する複合体。
［17b］β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、［16b］記載の複合体。
［18b］(i) ［1b］～［15b］のいずれか記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii) β-1,3-グルカン
を含有する医薬組成物。
［19b］(i)のオリゴデオキシヌクレオチドが(ii)のβ-1,3-グルカンと複合体を形成している、［18b］記載の医薬組成物。
［20b］β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、［18b］又は［19b］記載の医薬組成物。
［21b］免疫賦活用である、［18b］～［20b］のいずれか記載の医薬組成物。
［22b］I型インターフェロン産生誘導用である、［18b］～［20b］のいずれか記載の医薬組成物。
［23b］免疫賦活用又はI型インターフェロン産生誘導用医薬組成物を製造するための、［16b］又は［17b］記載の複合体の使用。
［24b］I型インターフェロン産生誘導用医薬組成物を製造するための、［16b］又は［17b］記載の複合体の使用。
［25b］［16b］又は［17b］記載の複合体の薬理的有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における免疫反応を増強する方法。
［26b］［16b］又は［17b］記載の複合体の薬理的有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物においてI型インターフェロン産生を誘導する方法。
［27b］免疫反応の増強において使用するための、［16b］又は［17b］記載の複合体。
［28b］I型インターフェロン産生の誘導において使用するための、［16b］又は［17b］記載の複合体。
本発明により、強力なI型インターフェロン産生誘導活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。本発明の複合体は、強力なI型インターフェロン産生誘導活性を有するので、自然免疫や獲得免疫（特に細胞性免疫）を活性化させる免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして有用である。
CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のマウス脾臓細胞IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のインビボにおけるIFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のインビボにおけるIFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のインビボにおけるIFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とカードランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。 CpG ODN-dA40とシゾフィランの複合体のヒトPBMC IFN-α産生誘導活性を示す。横軸の数値は、化合物名を示す。
1．オリゴデオキシヌクレオチド
本発明は、式（I）：
5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ （I）
（式中、Xは、T又はCであり、
Lは、1～7塩基からなるヌクレオチド配列であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む、8～16塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
β-1,3-グルカンと複合体を形成可能な長さのポリデオキシアデニル酸
を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に連結されている、オリゴデオキシヌクレオチドを提供するものである。
本明細書において「オリゴデオキシヌクレオチド」と「ODN」は同義である。また、「CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」と、「CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、交換可能に用いられる。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活性の非メチル化CpGモチーフを含有する一本鎖DNAであり、TLR9のアゴニストである。CpG ODNには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、クラスA（タイプDとも呼ばれる）、クラスB（タイプKとも呼ばれる）、クラスC及びクラスPの4つの型がある（Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)）。
クラスB CpG ODNは、古典的には非回文構造の、複数の非メチル化CpGモチーフを含有し、B細胞を活性化してIL-6を産生させるが、形質細胞様樹状細胞（pDCs）のIFN-α産生をほとんど誘導しないという構造的及び機能的特性を有するCpG ODNである。非メチル化CpGモチーフとは少なくとも1つのシトシン（C）－グアニン（G）配列を含む短いヌクレオチド配列であって、該シトシン－グアニン配列におけるシトシンの5位がメチル化されていないものをさす。本明細書において、CpGとは、特にことわらなり限り非メチル化CpGを意味する。
近年、代表的なクラスB CpG ODNであるK3（atcgactctcgagcgttctc：配列番号65）の3’末端にポリ（dA）テイルを付加し、シゾフィランやレンチナン等のβ-1,3-グルカンと複合体を形成すると、該複合体は、クラスA CpG ODN配列を有していないにも関わらず、クラスB CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、クラスA CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を併せ持つことが報告されている（WO 2015/041318）。本発明者らは、この複合体の免疫賦活活性を更に強化すべく検討したところ、CpG ODNとして、K3よりも短い、特定のコンセンサス配列を有する短鎖CpG ODNを用いると、短鎖CpG ODN単独では、K3よりも、免疫賦活活性が低いにも関わらず（D. Verthelyi et al J. Immunol., vol. 168, no. 4, pp. 1659-1663, 2014；D. Verthelyi et al., J. Immunol., vol. 166, no. 4, pp. 2372-2377, 2001）、3’末端にポリ（dA）テイルを付加し、β-1,3-グルカンと複合体化すると、驚くべきことに、K3の場合よりも、むしろIFN-α産生誘導活性が増強されることを見出し、本発明を完成した。
本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）：
5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ （I）
（式中、Xは、T又はCであり、
Lは、1～7塩基からなるヌクレオチド配列であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む。
Lのヌクレオチド配列の長さは、1、2、3、4、5、6又は7塩基であり、好ましくは1又は2塩基である。
一態様において、Lは式(II)
5’Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y73’ （II）
（式中、Y1はA、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2、Y3、Y4、Y5、Y6及びY7は、独立して、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基である）
で表されるヌクレオチド配列である。
該態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ia）：
5’X-CpG-Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7-CpG-TZ3’ （Ia）
（式中、Xは、T又はCであり、
Y1は、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2、Y3、Y4、Y5、Y6及びY7は、それぞれ独立して、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む、8～16塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
β-1,3-グルカンと複合体を形成可能な長さのポリデオキシアデニル酸
を含み、ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に連結されている。
一態様において、式（II）及び式（Ia）におけるY3、Y4、Y5、Y6及びY7が存在しない。即ち該態様においては、本発明に用いられるCpG ODNは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、T又はCであり、
Y1は、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、T又はCである）
で表されるヌクレオチド配列を含む。
式（Ib）において、Y1は、好ましくは、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である。
式（Ib）において、Y2は、好ましくは、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である。
式（Ib）において、Y1Y2は、好ましくはAG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C又はGであり、より好ましくはAG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T又はGである。
更なる局面において、式（Ib）におけるY1Y2は、好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C又はGであり、より好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T又はGである。
式（II）及び式（Ia）の別の態様において、Y1がA又はTであり、Y2がG又はTであり、Y3がC又はTであり、Y4がG又はTであり、Y5がA又はTであり、Y6がG又はTであり、Y7が存在しないか、A又はTである。好ましくは、Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7が、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である。
式（I）において、Lは、好ましくは、A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である。
式(I)、(Ia)及び(Ib)において、Xは、好ましくは、Tである。
式(I)、(Ia)及び(Ib)において、Zは、好ましくは、Tである。
式(Ib)の一態様において、XはTであり、
Y1は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
ZはTである。
式(Ib)の一態様において、XはTであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T又はG）であり、
ZはTである。
式(Ib)の一態様において、XはTであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T又はG）であり、
ZはTである。
式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列からなる。
更なる局面において、式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号68又は94で表されるヌクレオチド配列からなる。
式（Ia）の一態様において、
XはTであり、
Y1がA又はTであり、
Y2がG又はTであり、
Y3がC又はTであり、
Y4がG又はTであり、
Y5がA又はTであり、
Y6がG又はTであり、
Y7が存在しないか、A又はTであり、
ZはTである。
式（Ia）の一態様において、
XはTであり、
Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7が、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列であり、
ZはTである。
一態様において、式(Ia)で表されるヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号95、96、97、98又は99で表されるヌクレオチド配列からなる。
式(I)で表されるヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68、94、95、96、97、98又は99で表されるヌクレオチド配列からなる。
本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していてもよいし、付加配列を有していなくてもよい。付加配列を有する場合、その長さは、好ましくは、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）である。好ましくは、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有する。付加配列の長さが1塩基の場合（付加配列：N1）、N1はA、T、C及びGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチドであり、好ましくはC又はTであり、より好ましくはCである。付加配列の長さが2塩基の場合（付加配列：N1N2）、N1及びN2は、独立して、A、T、C及びGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチドである。N1は好ましくはCである。N2は好ましくはTである。付加配列：N1N2は好ましくはCTである。付加配列の長さが3塩基の場合（付加配列：N1N2N3）、N1、N2及びN3は、独立して、A、T、C及びGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチドである。N1は好ましくはCである。N2は好ましくはTである。N3は好ましくはCである。付加配列：N1N2N3は好ましくはCTCである。より好ましい態様において、本発明に用いられるCpG ODNは、式(I)、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、T、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有する。更に好ましい態様において、本発明に用いられるCpG ODNは、式(I)、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有する。
本発明に用いられるCpG ODNは、式(I)、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していてもよいし、付加配列を有していなくてもよい。付加配列を有する場合、その長さは、好ましくは、1～4塩基（即ち、1、2、3又は4塩基）であり、より好ましくは1塩基である。付加配列の長さが1塩基の場合、該付加配列はA、T、C及びGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチドであり、好ましくはAである。好ましくは、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列（例、A）を有し、より好ましくは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない。
好ましい態様において、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列5’側に付加配列を有していない。より好ましい態様において、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない。
更なる局面において、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有する。より好ましくは、本発明に用いられるCpG ODNは、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、式（I）、(Ia)又は(Ib)で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、Aの1塩基付加配列を有する。
本発明に用いられるCpG ODNは、8～16塩基（例、8、9、10、11、12、13、14、15又は16塩基）からなり、好ましくは8～15塩基（例、8、9、10、11、12、13、14又は15塩基）からなり、より好ましくは8～12塩基（例、8、9、10、11又は12塩基）からなる。
本発明に用いられるCpG ODNは、好ましくは、配列番号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26又は27で表されるヌクレオチド配列からなる。
更なる局面において、本発明に用いられるCpG ODNは、好ましくは、配列番号66、67、68、71、72、73、74、75、76又は77で表されるヌクレオチド配列からなる。
ポリデオキシアデニル酸（dA）の長さは、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖とともに複合体を形成するのに十分な長さであれば特に限定されない。該複合体は、1本のポリデオキシアデニル酸（dA）鎖と2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖からなる三重螺旋構造であり得る。安定な三重螺旋構造を形成する観点からは、ポリデオキシアデニル酸（dA）の長さは、通常20ヌクレオチド長以上、好ましくは40ヌクレオチド長以上である。ポリ（dA）は、長ければ長いほどβ-1,3-グルカンと安定な三重螺旋構造を形成するので、理論的には上限はないが、長すぎると、オリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さにバラつきが生じる原因となるので、通常、80ヌクレオチド長以下、好ましくは60ヌクレオチド長以下である。一方、前記安定な三重螺旋構造の形成に加え、単位量のβ-1,3-グルカンあたりに結合する本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量を増大させ、且つオリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さのばらつきの回避、複合化効率の観点からは、ポリ（dA）の長さは、好ましくは、20～60ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長）、より好ましくは、30～50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30～45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長）である。更なる局面において、ポリ（dA）の長さは、好ましくは20～50ヌクレオチド長（20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、より好ましくは20～40ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40ヌクレオチド長）、更に好ましくは、25～40ヌクレオチド長（25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40ヌクレオチド長）である。特に、30ヌクレオチド長以上の場合、良好な複合化効率を示す。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリ（dA）を含むことにより、2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）鎖とともに三重螺旋構造を形成する活性を有する。なお、ポリデオキシアデニル酸を「ポリ（dA）」又は「poly(dA)」と表記することもある。
1分子の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、複数個のCpG ODN及び／又はポリ（dA）が含まれていてもよいが、好ましくは、CpG ODN及びポリ（dA）が1つずつ含まれ、最も好ましくは、1つのCpG ODN及び1つのポリ（dA）からなる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリ（dA）がCpG ODNの3’側に連結されていることを特徴とする。CpG ODNとポリ（dA）とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、2つの近接した構成要素の間に挿入される1以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を意味する。スペーサー配列の長さは、特に限定されないが、通常1～10ヌクレオチド長、好ましくは1～5ヌクレオチド長、より好ましくは1～3ヌクレオチド長である。最も好ましくは、CpG ODNとポリ（dA）とが、スペーサー配列を介さずに（即ち、直接共有結合により）連結されて、1本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドを構成する。
このCpG ODNとポリ（dA）との間の共有結合は、インビボにおける分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合である。該修飾は、ホスホロチオエート修飾又はホスホロジチオエート修飾である。CpG ODNとポリ（dA）との間の共有結合は、好ましくは、ホスホロチオエート修飾されたリン酸ジエステル結合（即ち、ホスホロチオエート結合）である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、CpG ODN、ポリ（dA）及び任意的なスペーサー配列に加え、その5’末端及び／又は3’末端に付加的なヌクレオチド配列を有していてもよい。該付加的なヌクレオチド配列の長さは、本発明の複合体が免疫賦活活性（好ましくはB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常1～10ヌクレオチド長、好ましくは1～5ヌクレオチド長、より好ましくは1～3ヌクレオチド長である。
好ましい一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、5’末端の付加的なヌクレオチド配列を含まない。該態様においては本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの最も5’末端にCpG ODNが位置する。該態様においては、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、CpG ODN、ポリ（dA）、任意的なスペーサー配列及び任意的な3’末端の付加的なヌクレオチド配列からなり、好ましくは、CpG ODN、ポリ（dA）及び任意的な3’末端の付加的なヌクレオチド配列からなり、より好ましくは、CpG ODN及びポリ（dA）からなる。
好ましい一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、このような5’末端及び3’末端の付加的なヌクレオチド配列を含まない。該態様においては、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの最も5’末端にCpG ODNが位置し、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの最も3’末端にポリ（dA）が位置する。該態様においては、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、CpG ODN、ポリ（dA）及び任意的なスペーサー配列からなり、更に好ましくは、CpG ODN及びポリ（dA）からなる。
最も好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、上述のCpG ODN及びポリ（dA）からなり、CpG ODNが該オリゴデオキシヌクレオチドの5’末端に、ポリ（dA）が3’末端に、それぞれ位置する。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの全長は、通常28～200ヌクレオチド長、好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長（具体的には、35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 又は80ヌクレオチド長）、より好ましくは、40～65ヌクレオチド長（具体的には、40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65ヌクレオチド長）、最も好ましくは、43～57ヌクレオチド長（具体的には、43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57ヌクレオチド長）である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの具体的な例としては、配列番号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、又は54で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドを挙げることができる。
更なる局面において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの具体的な例として、配列番号78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92又は93で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドを挙げることができる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、インビボにおける分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよい。好ましくは、該改変はホスホロチオエート修飾又はホスホロジチオエート修飾を含む。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合により置換されている。
好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の修飾を含み、より好ましくは、リン酸ジエステル結合の修飾は、ホスホロチオエート結合（即ち、WO 95/26204に記載されているように、非架橋酸素原子のうちの1つが、硫黄原子に置換される）である。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合により置換されている。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、CpG ODNにおいて、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合による修飾を含み、より好ましくは、該CpG ODNのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換され、さらに好ましくは該CpG ODNのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、ポリ（dA）において、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合を含み、より好ましくは、該ポリ（dA）のリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換され、さらに好ましくは該ポリ（dA）のリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。
好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換され、より好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。
ホスホロチオエート結合により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、分解に対する抵抗性のみならず、免疫賦活活性の増強、及びβ-1,3-グルカン複合体の高収率が期待できる。本明細書におけるホスホロチオエート結合はホスホロチオエート骨格と、リン酸ジエステル結合はリン酸骨格とそれぞれ同義である。
一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、
8～16塩基（好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは、30～50ヌクレオチド長、より好ましくは30～45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されており、
全長が、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）である。
一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T又はG）であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、
8～16塩基（好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは、30～50ヌクレオチド長、より好ましくは30～45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されており、
全長が、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）である。
式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（I）：
5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ （I）
（式中、Xは、Tであり、
Lは、1～7塩基からなるヌクレオチド配列であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（I）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（I）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、通常28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。Lは、A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T又はG）であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、T、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、Aの１塩基付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68又は94で表されるヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ia）：
5’X-CpG-Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7-CpG-TZ3’ （Ia）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7が、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、T、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列（好ましくは、C又はT）を有し、
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、Aの１塩基付加配列を有し、
13、14又は15塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、通常28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列は、配列番号95、96、97、98又は99で表されるヌクレオチド配列であり得る。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとしては、後述する化合物4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、36、37、38、41、42、43、44、45、46又は47を挙げることができる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、上記オリゴデオキシヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類が包含される。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、t－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N，N’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩のようなアリ－ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ－ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、1本鎖、2本鎖、3本鎖のいずれの形態でもよいが、好ましくは1本鎖である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたオリゴデオキシヌクレオチド」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とするオリゴデオキシヌクレオチド重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、2本のβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）とともに三重螺旋構造の複合体を形成し、優れた免疫賦活活性を呈するので、下記の本発明の複合体や本発明の医薬組成物の調製に有用である。
2．複合体
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカンを含有する複合体（以下、本発明の複合体と称する。）を提供するものである。
上述の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるCpG ODNは、それ単独ではClass A CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）に乏しい。しかしながら、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン）と複合体を形成することによりClass A CpG ODNの配列を要することなく、強力なClass A CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を獲得する。
本発明で用いられるβ-1,3-グルカンとしては、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β-1,3-グルカンは、好ましくは、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのように、1,6-グルコピラノシド分枝を多く含有する（側鎖率33～40％）β-1,3-グルカンであり、より好ましくはシゾフィランである。カードランのように、1,6-グルコピラノシド分枝を含まない直鎖構造のβ-1,3-グルカンも、また好ましい。
シゾフィラン（SPG）は、公知の可溶性β－グルカンであり、スエヒロタケから単離することができる。SPGは、β-(1→3)-D-グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当り1個のβ-(1→6)-D-グルコシル側鎖からなる（Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A., Carbohydr. Res., 1981, 89, 1, p.121-135）。レンチナン（LNT）は、公知のβ-1,3-1,6-グルカンであり、シイタケの子実体から単離することができる。レンチナンの分子式は(C6H10O5)nであり、代表的な分子量は約30～70万である。
本明細書において「複合体」とは、複数の分子が、静電結合、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合又は共有結合を介して会合することにより得られる産物を意味する。
本発明の複合体は、好ましくは、三重螺旋構造状を呈する。好ましい態様において、当該三重螺旋構造を形成する3本の鎖のうち、2本はβ-1,3-グルカン鎖であり、1本は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖である。当該複合体は一部に、三重螺旋構造を形成していない部分を含んでいてもよい。
本発明の複合体における、オリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカンの組成比は、オリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖長、及びβ-1,3-グルカンの長さ等に応じて、変化しうる。例えば、β-1,3-グルカン鎖と、ポリデオキシアデニル酸の鎖の長さが同等の場合には、2本のβ-1,3-グルカン鎖と、1本の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが会合し、三重螺旋構造を形成し得る。一般的には、β-1,3-グルカン鎖に対して、ポリデオキシアデニル酸の鎖長は短いので、2本のβ-1,3-グルカン鎖に対して、複数の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸を介して会合し、三重螺旋構造を形成し得る。
本発明の複合体は、上述の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）からなる。
一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、
8～16塩基（好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは、30～50ヌクレオチド長、より好ましくは30～45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されており、
全長が、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）である。
一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T又はG）であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、
8～16塩基（好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは、30～50ヌクレオチド長、より好ましくは30～45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されており、
全長が、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）である。
式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（I）：
5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ （I）
（式中、Xは、Tであり、
Lは、1～7塩基からなるヌクレオチド配列であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（I）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（I）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。Lは、A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1は、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Y2は、存在しないか、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基（即ち、1、2又は3塩基）の付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、1塩基の付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ib）：
5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2は、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C又はG（好ましくは、AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T又はG）であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、T、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列を有し、
式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、Aの1塩基付加配列を有し、
8～16塩基（好ましくは8～15塩基、より好ましくは8～12塩基）からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
式(Ib)で表されるヌクレオチド配列は、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68又は94で表されるヌクレオチド配列であり得る。
更なる局面において、一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、式（Ia）：
5’X-CpG-Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7-CpG-TZ3’ （Ia）
（式中、Xは、Tであり、
Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7が、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及びAGCGAGからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列であり、
Zは、Tである）
で表されるヌクレオチド配列を含み、
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、C、T、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかの付加配列（好ましくは、C又はT）を有し、
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していないか、Aの1塩基付加配列を有し、
13、14又は15塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
20～60ヌクレオチド長（好ましくは20～50ヌクレオチド長、より好ましくは20～40ヌクレオチド長、更に好ましくは25～40ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸
を含み；
ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサー配列を介さずに連結されており、
CpGオリゴデオキシヌクレオチドが最も5’末端に位置し、
ポリデオキシアデニル酸が最も3’末端に位置するか、ポリデオキシアデニル酸の3’末端側に付加配列が連結し、
リン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている。該オリゴデオキシヌクレオチドの全長は、28～200ヌクレオチド長（好ましくは30～100ヌクレオチド長、より好ましくは35～80ヌクレオチド長、更に好ましくは、40～65ヌクレオチド長、より更に好ましくは、43～57ヌクレオチド長）であり得る。
式（Ia）で表されるヌクレオチド配列は、配列番号95、96、97、98又は99で表されるヌクレオチド配列であり得る。
一態様において、本発明の複合体は、オリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含有し、該オリゴデオキシヌクレオチドは、後述する化合物4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、36、37、38、41、42、43、44、45、46及び47からなる群から選択されるいずれかである。
本発明の複合体は、特開2008-100919号公報；WO2015/04131； Sakurai et al., Biomacromolecules 2, 641-650 (2001)； Shimada et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007)； Koyama et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)； Minari et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)等に記載された方法に準じ、調製することができる。すなわち、天然では三重螺旋構造として存在するβ-1,3-グルカンを非プロトン性有機極性溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等）またはアルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等）に溶解して一本鎖に解く。このようにして得られた一本鎖のβ-1,3-グルカンの溶液と本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの溶液（水溶液、中性付近のpHの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のpHの緩衝水溶液）とを混合し、必要に応じて再度pHを中性付近に調整後、適当時間保持する、例えば、5℃で一夜保持する。その結果、2本のβ-1,3-グルカン鎖と1本の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリ（dA）鎖が三重螺旋構造を形成することにより、本発明の複合体が形成される。生成した複合体に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製、限外濾過、透析等を行うことにより、複合体未形成のオリゴデオキシヌクレオチドを除くことができる。また、生成した複合体に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、複合体未形成のβ-1,3-グルカンを除くことができる。上記の方法により、複合体を適宜精製することができる。
本発明の複合体の形成は、例えばCD（円偏光二色性）スペクトルによるコンフォメーション変化、サイズ排除クロマトグラフィーによるUV吸収シフト、ゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動、キャピラリー電気泳動を測定することにより確認することができるが、これに限らない。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカンとの混合比は、ポリ（dA）鎖の長さ等を考慮して適宜設定することができるが、通常モル比（β-1,3-グルカン/ODN）が0.005～10.0である。
本発明の複合体は、好ましくは単離されている。「単離された複合体」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とする複合体重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
本発明の複合体は、優れた免疫賦活活性を有し、IFN-α産生を誘導する活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してIFN-αを産生させる活性）が高いので、免疫賦活剤等として有用である。
3．医薬組成物
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）を含む、医薬組成物を提供するものである。好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが、β-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）と複合体（即ち、本発明の複合体）を形成している。即ち、本発明の医薬組成物は、好ましくは、上述の本発明の複合体を含む。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）、或いは上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）、或いは上記本発明の複合体に加えて、薬理学的に許容され得る担体を含み得る。本医薬組成物は抗原（下に詳述する）を更に含んでいてもよい。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは上記本発明の複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のpHは5～10が挙げられ、好ましくは6～8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは本発明の複合体を含む溶液又は懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは本発明の複合体を含む粉末製剤を調製することもできる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは本発明の複合体を粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で溶解又は分散することにより、使用に供することができる。
本発明の医薬組成物が、オリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせを含む場合、オリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）のモル比（β-1,3-グルカン/ODN）は、特に限定されないが、例えば0.005～10.0である。
医薬組成物中の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは本発明の複合体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1～100重量%、好ましくは約1～99重量%、さらに好ましくは約10～90重量%程度である。
本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ-1,3-グルカン（例、シゾフィラン、カードラン）の組み合わせ、或いは本発明の複合体を単独で含有していてもよく、他の有効成分と組み合わせて含有していてもよい。
4．医薬用途
本発明の複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明の複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明の複合体又は医薬組成物を、哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン（Pan-IFN-α、IFN-α2等）産生を強力に誘導するので、I型インターフェロン産生誘導剤として有用である。I型インターフェロンの産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型インターフェロンが有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが有効な疾患としては、ウイルス感染症（例えば、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等）、癌等を挙げることが出来る。
また、本発明の複合体は、強力なワクチンアジュバント活性を有し、本発明の複合体を、抗原と共に、哺乳動物へ投与すると、該抗原に対する免疫反応を強力に誘導することが出来る。したがって、本発明は、(a) 本発明の複合体、及び(b) 抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物をも提供するものである。本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）や細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）を強力に増強する。従って、本発明の複合体及び医薬組成物、特に本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、ワクチンアジュバントとして有用である。本明細書において、アジュバントとは免疫応答を促す補助剤のことであり、抗原とともに生体に投与されたとき、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質を意味する。
抗原としては、投与対象の哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）にとって抗原性を有しており、抗体又は細胞傷害性Tリンパ球（CTL、CD8+T細胞）が抗原として認識し得る限り、特に限定されるものではなく、抗原となるあらゆる物質（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質、ならびに前記物質の修飾体（例えば、一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加等（以下、変異等）を導入した修飾体など）を用いることができる。抗原としては、例えば、原虫、真菌、細菌、ウイルスなどの病原体由来の抗原、癌等の特定の疾患に関係する抗原等が用いられ得るが、これらに限定されない。
本明細書において、「抗原Aが、病原体Xに由来する」とは、抗原Aが、当該病原体Xに構成因子として含まれることを意味する。例えば、抗原Aがポリペプチドである場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、病原体Xのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸配列中に存在することを意味する。
病原体由来の抗原としては、病原体そのもの又はその一部、不活化又は弱毒化した病原体そのもの又はその一部、あるいはそれらの変異等を導入した修飾体等が挙げられる。
抗原として病原体由来の抗原を用いると、当該抗原に対する免疫反応が惹起され、該抗原を含む病原体を免疫学的に生体外へ排除する仕組みが構築される。従って、(a) 本発明の複合体、及び(b) 病原体由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、当該病原体感染症の予防又は治療のために有用である。
本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）や、細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）を強力に誘導し得る。特に、本発明の複合体は、I型インターフェロンを強力に誘導する。I型インターフェロンは、ウイルス感染後の自然免疫応答や獲得免疫の活性化に重要な役割を果たす。I型インターフェロンはCD40、CD80、CD86といった共刺激分子やMHC 分子の発現を誘導し、樹状細胞（DC）を成熟させ、ウイルス抗原のクロスプレゼンテーションを促進する。また、ケモカインを誘導してリンパ球や単球を炎症部位に遊走させる。また、細胞傷害性T細胞（CD8+T細胞）においてその活性化、増殖、メモリーCD8+T細胞の維持に関与する。従って、細胞傷害性T細胞により認識されることが知られている細胞内感染性の病原体（ウイルス、原虫、真菌、細菌等）由来の抗原や、癌化した細胞に関連した抗原（例えば、腫瘍抗原）等が抗原として好適に用いられる。
細胞内感染性ウイルスとしては、特に限定されないが、RSウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス（HCV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンパーウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-1）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス等が挙げられる。細胞内感染性バクテリアとしては、マイコプラズマ等が挙げられる。細胞内感染性原虫としては、マラリア原虫、住血吸虫等が挙げられる。細胞内感染性病原体は好ましくはウイルス（具体的には、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス等）である。
癌化した細胞に関連した抗原としては、癌化した細胞において特異的に発現する蛋白質、糖鎖、ペプチド、ならびに前記物質の変異体（欠失、置換、及び／又は付加）又はその修飾体などが挙げられる。
例えば、(a) 本発明の複合体、及び(b) 病原体や癌由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物を、当該病原体感染症や癌の患者、当該病原体感染症や癌に罹患する可能性のある哺乳動物（例、ヒト）に投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性T細胞（CTL）活性を促進させ、該抗原特異的な抗体産生を誘導又は促進し、即ち、哺乳動物（例、ヒト）の防御免疫反応を誘導又は促進することにより、該感染症や癌を予防又は治療することが出来る。即ち、該組成物は、上記感染症、癌等の疾患の予防又は治療として有用である。
(a) 本発明の複合体、及び(b)抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、上記本発明の医薬組成物に準じて調製することができる。
刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
［実施例１］
以下の表6に記載したCpG ODNsは、味の素バイオファーマサービス、株式会社ジーンデザイン及び神戸天然物化学株式会社で合成された。これらのオリゴデオキシヌクレオチドは、常法である固相ホスホロアミダイト法を用いて合成された。（M. H. Caruthers. A brief review of DNA and RNA chemical synthesis. Biochem. Soc. Trans., 2011, 39, 575-580.）
上記配列中のsはヌクレオシド間がホスホロチオエート結合であることを示す。
上記のリストの中から、化合物6、8、9、10及び18について詳細を記載する。表7に前述した配列のCpG ODN-dA40の分子量および逆相HPLCを用いて分析した保持時間を示す。（分析条件 カラム：Waters, X-Bridge C18 2.5 μm, 4.6 x 100 nm、A溶液：8 mM トリエチルアミン、100 mM ヘキサフルオロイソプロパノール、B溶液：メタノール、B溶液グラジエント：5%→30%（20 min）、温度：60℃、流速：1 mL/min、波長：260 nm）
［試験例1］CpG ODN-dA(s)40とSPG（シゾフィラン）との複合体形成
SPG溶液の濃度が15 mg/mLとなるように0.25 mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を添加し、固体が完全に溶解するまで攪拌した。110 μM核酸水溶液に対して、SPG溶液と等量の0.3 Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を加えて攪拌した。得られた核酸溶液にSPG溶液を加え、終夜攪拌した。溶液の混合比率は核酸1モルに対してSPGは0.27モルとした。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、CpG ODNシグナルの高分子量側へのシフトを波長260 nmにおける吸収をモニタリングすることにより確認した（System: ACQUITY UPLC H-Class system (Waters)、Pre-column: Asahipak GF-1G 7B (Shodex)、Column: Asahipak GF7M-HQ (Shodex)二本のカラムを連結、Flow rate: 0.6 mL/min、Buffer: 10 mM EDTA PBS、温度40℃）。用いる複合体は、90%以上の複合体化率を示すもののみを用いた。以下の試験例におけるCpG ODN-dA(s)40の活性評価においては、いずれもこのCpG ODN-dA(s)40とSPGとの複合体を用いた。
［試験例2］K3と化合物6および化合物7の活性比較評価
ヒトPBMCs (Frozen NPB-MNC: AllCells, PB003F lot.3018992)にCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体を添加し(1.0×105 cells/100 μL/well x 96 well plate, duplicate)、該細胞を24時間培養した。上清中のIFN alpha濃度をELISA（Human IFN alpha (pan specific) ELISA development kit 3425-1H-6 (Mabtech AB)）で測定した。
Class B CpGは、12塩基以上のホスホロチオエート骨格CpG ODNであり、塩基長は長い方が高い免疫活性を示すことが知られている（Verthelyi, D., Ishii, K. J., Gursel, M. & Klinman, D. M. Human Peripheral Blood Cells Differentially Recognize and Respond to Two Distinct CpG Motifs. J. Immunol. 2001, 166, 2372-2377.）。Class B CpGであるK3をSPG複合体とすることで、Class B CpGの免疫賦活化活性（B細胞を刺激しIL-6を産生する）とClass A CpGの免疫賦活化活性（pDCに作用してIFN alphaを産生する）を併せ持つことが報告されている(WO2015/041318)。本発明者らは、CpG ODNの塩基長を短くしたときの効果を調べるべく、CpG部分が12塩基長である化合物6/SPG複合体、化合物7/SPG複合体およびK3-dA(s)40/SPG複合体についてIFN alpha産生誘導能を評価した。
図1に示すように、化合物6/SPG複合体および化合物7/SPG複合体ともにK3-dA(s)40/SPG複合体を上回るIFN alpha産生誘導能を示した。K3は20塩基長であるのに対し、化合物6および化合物7のCpG ODN部分は12塩基長である。この結果から、CpG ODN部分の塩基長が短い複合体の方がIFN alpha産生誘導能が高いことが示唆された。
［試験例3］ヒトPBMCを用いた短鎖CpG ODN-dA(s)40/SPG複合体の活性評価
TLR9にはODNが2か所結合する部位があり、(1) 5’-X1CX2-3’と(2) CpGモチーフがそれぞれの部位に結合する(Umehara Ohto. Immunity 2018, 48, 1-10)。本発明ではこれら2種類の結合配列をもち、かつその最小限の塩基数とすることによりIFN alpha産生能が高まると考え、それらの配列の評価を行った。
ヒトPBMC（CTL,Cat.CTL-UP1,Sample ID#HHU20190711）にCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体を添加し(5.0×105 cells/100 μL/well x 96 well plate, duplicate)、該細胞を24時間培養した。上清中のIFN alpha濃度をBio-Plex(BIO-RAD: Bio-Plex pro Reagent kitIII #171304090M,ヒトサイトカインスクリーニングパネルスタンダード #12007919, IFN alpha2セット #171B6010M)で測定した。
結果を図2及び3に示す。K3を代表とするCpG ODNにおいて必要と考えられている塩基長（12塩基以上）（非特許文献2）よりも短いCpG ODNを、SPGと複合化することにより、高い免疫賦活化作用（IFN alpha産生誘導作用）を示すことが明らかとなった。
なお、化合物1/SPG、化合物2/SPG、化合物3/SPG、化合物5/SPG、化合物9/SPG、化合物10/SPG、化合物11/SPG、化合物23/SPG及び化合物24/SPGの複合体は、IFN alpha産生誘導活性が非常に低いか、ほとんどなかった。
［試験例4］マウス脾臓細胞を用いた活性評価
マウス（C57BL/6J、雌、8 weeks）の脾臓細胞にCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体を添加し（1.0×106 cells/100 μL/well, 96 well plate, duplicate)、24時間培養した。上清のIFN alphaをELISA（IFN alpha Mouse ELISA Kit Thermo Fisher Scientific #BMS6027）で測定した。
結果を図4に示す。ヒトPBMCと同様に、本発明の複合体は、既存のK3-dA(s)40/SPG複合体よりも強力にマウス脾臓細胞のIFN alpha産生を誘導した。
［試験例5］マウスにおけるin vivoでの活性評価
マウス（C57BL/6J、雌、8weeks, n= 3）にCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体を尾静脈投与(1.5 nmol/200 μL/head)した。6時間後に採血をし、血漿中のIFN alpha濃度をELISA(IFN alpha Mouse ELISA Kit Thermo Fisher Scientific #BMS6027)で測定した。
結果を図5に示す。K3-dA(s)40/SPG複合体は、IFN alpha産生誘導がほとんど認められなかった。一方、本発明のCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体は、マウス生体内においても高いIFN alpha産生誘導能を示した。これまでに、CpGをマウスに尾静脈投与し、血漿中のIFN alphaの増加を認めた報告例はなく、本発明の複合体が優れた免疫賦活化効果を有することが示唆された。
［実施例２］
以下の表8に記載したCpG ODNsは、味の素バイオファーマサービス、株式会社ジーンデザイン及び神戸天然物化学株式会社で合成された。これらのオリゴデオキシヌクレオチドは、常法である固相ホスホロアミダイト法を用いて合成された。（M. H. Caruthers. A brief review of DNA and RNA chemical synthesis. Biochem. Soc. Trans., 2011, 39, 575-580.）
上記配列中のsはヌクレオシド間がホスホロチオエート結合であることを示す。
化合物28、29、30及び31は、化合物21と同一のCpG ODN（TsCsGsGsCsGsTsTsC）（配列番号20）を有するが、ポリdA(s)の長さが化合物21とは異なる。化合物21はポリdA(s)の長さが40であるが、化合物28、29、30及び31のそれは、それぞれ35、30、25及び20である。化合物32、33、34及び35は、化合物21と同一のCpG ODN塩基配列（配列番号20）及び同一の長さのポリdA(s)（dA(s)40）を有するが、CpG ODN内に含まれるホスホロチオエート結合の数及び位置が化合物21とは異なる。
上記のリストの中から、化合物28、29及び30について詳細を記載する。化合物28、化合物29及び化合物30の分子量および逆相HPLCを用いて分析した保持時間を示す。
（分析条件 カラム：Waters, X-Bridge C18 2.5 μm, 4.6 x 75 nm、A溶液：8 mM トリエチルアミン、100 mM ヘキサフルオロイソプロパノール、B溶液：メタノール、B溶液グラジエント：5%→30%（20 min）、温度：60℃、流速：1 mL/min、波長：260 nm）
［試験例6］マウスにおけるin vivoでの活性評価
マウス（C57BL/6J、雌、8 weeks）にCpG ODN-dA(s)n/SPG複合体を尾静脈投与（0.5 nmol/200 μL/head）した。6時間後に採血をし、血漿中のIFN alpha濃度をELISA（IFN alpha Mouse ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific #BMS6027）で測定した。
結果を図6に示す。本発明のCpG ODN-dA(s)n/SPG複合体は、マウス生体内において高いIFN alpha産生誘導能を示した。化合物28、29及び30の結果から、ポリdA(s)の長さが40未満であっても、複合体のIFN alpha産生誘導能は維持されることが示唆された。
［試験例7］マウスにおけるin vivoでの活性評価
マウス（C57BL/6J、雌、8 weeks）にCpG ODN-dA(s)n/SPG複合体を尾静脈投与（0.5 nmol/200 μL/head）した。6時間後に採血をし、血漿中のIFN alpha濃度をELISA（IFN alpha Mouse ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific #BMS6027）で測定した。
結果を図7に示す。本発明のCpG ODN-dA(s)n/SPG複合体は、マウス生体内において高いIFN alpha産生誘導能を示した。
［試験例8］CpG ODN-dA(s)n/Curdlan複合体の活性評価
SPGに換えてカードラン（Curdlan）を用いたこと以外は試験例１に準じて、化合物20とカードランとの複合体を形成した。
ヒトPBMC（CTL、Cat. CTL-UP1、Sample HHU20190709）に化合物20/Curdlan複合体を添加し（5.0×105 cells/100 μL/well ×96 well plate、duplicate）、該細胞を24時間培養した。上清中のIFN alpha濃度をELISA（IFN alpha Human Matched Antibody Pair、Thermo Fisher Scientific、#BMS216MST）で測定した。
結果を図8に示す。図中 “Naked”はカードランと複合体を形成していない化合物20を示す。また、“drCurdlan”は化合物20/Curdlan複合体の調製と同様に、変性及び再生処理に付したカードランである。drCurdlanの濃度は、1000nM CpG ODN-dA(s)40/Curdlan複合体におけるCurdlan濃度と同等である。化合物20/Curdlan複合体は、化合物20/SPG複合体と同様に、ヒトPBMCのIFN alpha産生を誘導した。この結果からβ-グルカンとしてカードランを使用した場合でも、本発明の複合体の免疫賦活活性が維持されることが示唆された。
［試験例9］ヒトPBMCを用いた短鎖CpG ODN-dA(s)40/SPG複合体の活性評価
ヒトPBMC（CTL、Cat. CTL-UP1、Sample HHU20200611）にCpG ODN-dA(s)n/SPG複合体を添加し（5.0×105 cells/100 μL/well ×96 well plate、duplicate）、該細胞を24時間培養した。上清中のIFN alpha濃度をELISA（IFN alpha Human Matched Antibody Pair、Thermo Fisher Scientific、#BMS216MST）で測定した。
結果を図9に示す。本発明のCpG ODN-dA(s)nは、SPGと複合化することにより、高い免疫賦活化作用（IFN alpha産生誘導作用）を示した。化合物36/SPG複合体及び化合物42/SPG複合体が有意な免疫賦活作用を有することから、式(I)のヌクレオチド配列の5’側に少なくとも1塩基の付加配列が連結されていても、複合体の免疫賦活活性は維持されることが示唆された。一方、化合物39/SPG及び化合物40/SPGの複合体は、IFN alpha産生誘導活性が非常に低いか、ほとんどなかった。
［試験例10］ヒトPBMCを用いた短鎖CpG ODN-dA(s)40/SPG複合体の活性評価
ヒトPBMC（CTL、Cat. CTL-UP1、Sample # HHU20190709）にCpG ODN-dA(s)40/SPG複合体を添加し（5.0×105 cells/100 μL/well ×96 well plate、duplicate）、該細胞を24時間培養した。上清中のIFN alpha濃度をELISA（IFN alpha Human Matched Antibody Pair、Thermo Fisher Scientific、#BMS216MST）で測定した。CpG ODN-dA(s)40としては、化合物43、44、45、46及び47を用いた。これらの化合物は、2つのCpG間のヌクレオチド長が6又は7塩基であり、CpG ODN部分の塩基長が14又は15であることを特徴とする。
結果を図10に示す。評価したCpG ODN-dA(s)40は、SPGと複合化することにより、高い免疫賦活化作用（IFN alpha産生誘導作用）を示した。CpG ODN内に含まれる2つのCpG間のヌクレオチド長を6又は7塩基まで伸ばしても、本発明の複合体の免疫賦活活性が維持されることが示唆された。また、CpG ODN部分の塩基長を14又は15まで伸ばしても、本発明の複合体の免疫賦活活性が維持されることが示唆された。
本発明により、強力なI型インターフェロン産生誘導活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。本発明の複合体は、強力なI型インターフェロン産生誘導活性を有するので、自然免疫や獲得免疫（特に細胞性免疫）を活性化させる免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして有用である。
本出願は日本で出願された特願2019-235078（出願日：2019年12月25日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (26)

  1. 式（Ib）：
    5’X-CpG-Y1Y2-CpG-TZ3’ （Ib）
    （式中、Xは、T又はCであり、
    Y1は、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
    Y2は、存在しないか、A、G、T及びCからなる群から選択されるいずれかの塩基であり、
    Zは、T又はCである）
    で表されるヌクレオチド配列を含む、8～12塩基からなるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び
    20ヌクレオチド長以上、80ヌクレオチド長以下の長さのポリデオキシアデニル酸
    を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に連結されており、CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の5’側に付加配列を有していない、オリゴデオキシヌクレオチド。
  2. XがTである、請求項1記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  3. ZがTである、請求項1又は2記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  4. Y1が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、請求項1～3のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  5. Y2が、A、G及びTからなる群から選択されるいずれかの塩基である、請求項1～4のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  6. Y1Y2が、A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA及びTTからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である、請求項1～5のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  7. CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、式（Ib）で表されるヌクレオチド配列の3’側に付加配列を有していないか、1～3塩基の付加配列を有する、請求項1～6のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  8. 1～3塩基の付加配列が、C、CT及びCTCからなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列である、請求項7記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  9. 式（Ib）で表されるヌクレオチド配列が、配列番号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63又は64で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1～8のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  10. 式（Ib）で表されるヌクレオチド配列が、配列番号68又は94で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1～8のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  11. CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号4、6、7、8、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26又は27で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1～8のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  12. CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号67又は68で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1～8のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  13. オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項1～12のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  14. オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項13記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  15. ポリデオキシアデニル酸の長さが、20～60塩基である、請求項1～14のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  16. 配列番号31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、又は54で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～15のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  17. 配列番号78、79、80、81、83又は84で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項1～15のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  18. 請求項1～17のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカンを含有する複合体。
  19. β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、請求項18記載の複合体。
  20. β-1,3-グルカンが、カードランである、請求項18記載の複合体。
  21. (i) 請求項1～17のいずれか1項記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び
    (ii) β-1,3-グルカン
    を含有する医薬組成物。
  22. (i)のオリゴデオキシヌクレオチドが(ii)のβ-1,3-グルカンと複合体を形成している、請求項21記載の医薬組成物。
  23. β-1,3-グルカンが、シゾフィランである、請求項21又は22記載の医薬組成物。
  24. β-1,3-グルカンが、カードランである、請求項21又は22記載の医薬組成物。
  25. 免疫賦活用である、請求項21～24のいずれか1項記載の医薬組成物。
  26. I型インターフェロン産生誘導用である、請求項21～24のいずれか1項記載の医薬組成物。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010189400A (ja) 2001-06-21 2010-09-02 Dynavax Technologies Corp キメラ免疫調節化合物とその使用方法
WO2015041318A1 (ja) 2013-09-20 2015-03-26 独立行政法人医薬基盤研究所 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
WO2016103531A1 (ja) 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
WO2016152767A1 (ja) 2015-03-20 2016-09-29 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
AU2001227889A1 (en) * 2000-01-14 2001-07-24 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
LT2825672T (lt) * 2012-03-13 2019-06-10 Swift Biosciences, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti valdomam pagal dydį substrato polinukleotidų homopolimeriniam uodegų formavimui su nukleorūgščių polimeraze
US9800908B2 (en) 2013-07-09 2017-10-24 Koninklijke Kpn N.V. Synchronized data processing of broadcast streams between receivers, including synchronized data processing between a receiver that is in the process of processing a stream and a receiver that wants to join the stream
JP6715775B2 (ja) * 2014-12-25 2020-07-01 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチド
JP2018100616A (ja) 2016-12-20 2018-06-28 いすゞ自動車株式会社 ランキンサイクルシステム
US20210139985A1 (en) * 2018-04-10 2021-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Dna-barcoded antigen multimers and methods of use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010189400A (ja) 2001-06-21 2010-09-02 Dynavax Technologies Corp キメラ免疫調節化合物とその使用方法
WO2015041318A1 (ja) 2013-09-20 2015-03-26 独立行政法人医薬基盤研究所 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
WO2016103531A1 (ja) 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
WO2016152767A1 (ja) 2015-03-20 2016-09-29 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途

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