JP7741067B2

JP7741067B2 - 複数の分析物を用いた糞便抗原検査

Info

Publication number: JP7741067B2
Application number: JP2022523253A
Authority: JP
Inventors: ディー．フーリエ，キース; ジェイ．ドマニコ，マイケル; エム．ウェーバー，ステファニー; エム．クイント，タニア; ピー．リドガード，グラハム
Original assignee: エグザクトサイエンシーズコーポレーション
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2025-09-17
Anticipated expiration: 2040-10-16
Also published as: AU2020365127A1; CN115038968A; US20240019440A1; JP2022552423A; EP4045913A1; KR20220092877A; JP2025172917A; AU2020365127B2; CA3155205A1; WO2021076969A1; EP4045913A4

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］

本出願は、２０１９年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６２／９２３，３００号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供されるのは、複数の異なるタンパク質、核酸、及び他の分子マーカー分析物について、少量のヒト糞便試料（例えば、糞便免疫化学的試験（ＦＩＴ）試料収集装置で収集された試料）を含む、糞便試料を試験するための方法、組成物、ならびにシステム（例えば、物品のセット）である。
［背景技術］

糞便免疫化学的試験（ＦＩＴ試験）は、糞便検体中のヘモグロビンを検出する抗体ベースアッセイであり、結腸直腸癌（ＣＲＣ）のスクリーニングに広く使用されている。いくつかの異なる実験室ベースＦＩＴ試験または臨床現場即時ＦＩＴ試験が利用可能である。利用可能なＦＩＴ試験では、通常、特殊な装置を使用して糞便検体から少量の試料を収集し、装置内に含まれる緩衝液に試料を入れて、試料収集時から試料を分析できるようになるまでヘモグロビンを安定化する。ＦＩＴは、ＣＲＣスクリーニングのための便利で手頃な選択肢の一つである。

結腸直腸腺腫及び癌に関連する可能性のある他のタンパク質バイオマーカーは、電気泳動及び質量分析を使用して比較的大きな検体をスクリーニングすることによって便中で同定されているが（例えば、Ｂｏｓｃｈへの米国特許公開第２０１５／０１４１２７３Ａ１号及び同第２０１７／０１９９１９６Ａ１号、両方をあらゆる目的で参照により本明細書に組み込む）、実験室ベース及び臨床現場即時ＦＩＴ試験は、ヘモグロビン試験に限定されたままである。
［発明の概要］

本技術は、ＦＩＴ試料収集装置を使用して、ヘモグロビン以外の、またはヘモグロビンに加えて、タンパク質バイオマーカーを収集及び安定化するための方法と組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態で、本技術は、ｉ）一定量の安定化液に分散された少量のヒト糞便試料を含む分散試料を提供することと、ｉｉ）様々な量の複数の異なるマーカー分析物の分散試料を分析することと、を含む、ヒト糞便試料を特徴付ける方法を提供する。本明細書で使用する場合、異なるマーカー分析物は、単一分子の位置の異なる部分（例えば、タンパク質もしくは核酸分析物分子の異なるフラグメントまたは領域）を含み得る。特定の実施形態で、異なるマーカー分析物は、完全に異なる分子（例えば、別のタンパク質及び／または別の遺伝子または他の核酸）である。好ましい実施形態で、複数の異なるマーカー分析物は、複数の異なるタンパク質マーカー分析物を含み、好ましくは、少なくとも３つの異なるタンパク質マーカー分析物を含む。

複数の異なるマーカー分析物は、例えば、３つの異なる遺伝子から発現したタンパク質であり得る。特定の実施形態で、複数の異なるマーカー分析物は、３つ以下の異なるマーカー分析物を含む。いくつかの実施形態で、複数の異なるマーカー分析物は、ヒトマーカー分析物（例えば、ヒトタンパク質分析物及び／または核酸分析物）を含む。好ましい実施形態で、複数の異なるマーカー分析物は、ヒトマーカー分析物からなる。

本明細書の技術は、少量の糞便試料（例えば、ＦＩＴ試料収集装置（例えば、少量の糞便試料を安定化するための流体を含む、ＦＩＴ試料収集装置）を使用して収集された糞便試料）の分析に使用される。したがって、いくつかの実施形態で、分散試料中の安定化液の体積は、好ましくは、ＦＩＴ試料収集装置での使用に適した体積（例えば、３ｍＬ未満、好ましくは２ｍＬ未満）である。いくつかの実施形態で、安定化液の体積は、１ｍＬ未満である。いくつかの実施形態で、分散試料は、ＦＩＴ試料収集装置内に提供される。

同様に、分析のための糞便試料の質量は特定の質量に限定されないが、特定の実施形態では、糞便試料の質量は、ＦＩＴ試料収集装置を使用して収集可能な試料の質量である。したがって、特定の実施形態で、少量の糞便試料は、１００ｍｇ未満、好ましくは５０ｍｇ未満、好ましくは２０ｍｇ未満の質量である。

本技術は、例えば分散試料中で検出するための特定のマーカー分析物に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、複数の異なるマーカー分析物は、ヘモグロビン（Ｈｂ）、カルプロテクチン、ハプトグロビン（Ｈｐ）、補体成分３（Ｃ３）、補体成分３ａ（Ｃ３ａ）、ＩｇＧ結合タンパク質のＦｃフラグメント（ＦＣＧＢＰ）、レジスチン様β（ＲＥＴＮＬＢ／ＲＥＬＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）、及びセルピンファミリーＦメンバー２（ＳＥＲＰＩＮＦ２）からなる群から選択される、複数のヒトタンパク質マーカーを含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、Ｈｂ、Ｈｐ、及びＣ３を含み、いくつかの実施形態では、複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、Ｈｂ、Ｈｐ、及びＣ３からなる。

本技術はマーカー分析物を分析する特定の方法に限定されないが、特定の実施形態では、分析は免疫化学的アッセイを含む。

いくつかの実施形態で、安定化液は、緩衝液（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液）を含む。他の成分もまた、例えば、細胞の安定化、タンパク質の安定化、微生物増殖の遅延などのために安定化液で使用され得る。したがって、本技術は、緩衝液、担体タンパク質、界面活性剤、塩、キレート剤、及び抗菌剤または抗生物質から選択される１つ以上の成分を含む、安定化液を企図する。特定の実施形態では、安定化液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液、ウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ－２０）、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及びゲンタマイシンのうちの１つ以上を含む。特定の好ましい実施形態では、安定化液は、２０ｍＭのトリス、１０％のウシ血清アルブミン、０．１０％のＴＷＥＥＮ２０、０．０９５％のアジ化ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む。

他の安定化成分もまた、例えば、上記のような安定化液で、または異なる組成物を有する溶液で使用され得る。特定の実施形態では、ヘモグロビンを安定化するのに適した成分が含まれ得る。例えば、いくつかの実施形態では、安定化液は、プロトポルフィリン；多価カチオン；糖または多糖類；浸透圧調節物質、及び任意選択で多価カチオン；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）安定化成分、及び任意選択で多価カチオン；から選択される１つ以上の安定化試薬を含む。特定の実施形態では、安定化液は、多価カチオン、好ましくは、Ｃｒ^３＋及びＣｏ^３＋から選択される多価カチオンと錯体を形成したプロトポルフィリンＩＸを含む。いくつかの実施形態では、安定化液は、置換または非置換のポリガラクツロン酸、及び任意選択で多価カチオンを含む。

少量の糞便試料を取り出した後に残っている一定量の糞便試料もまた、１つ以上のマーカー分析物について分析され得ることが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本技術は、本明細書に記載の実施形態のいずれかを提供し、ここで、少量のヒト糞便試料は、ａ）ヒト対象からの糞便全体試料を採取することと、ｂ）糞便全体試料の一部を取り出して、糞便試料の取り出された部分及び残りの部分を生成することであって、ここで、取り出された部分は少量の糞便試料である、前記生成することと、ｃ）少量の糞便試料を一定量の安定化液と混ぜ合わせて分散試料を生成することと、ｄ）糞便試料の残りの部分を安定化することと、を含む方法によって提供される。

糞便試料の残りの部分は、いくつかの異なる方法で安定化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、糞便試料の残りの部分を安定化することは、ｉ）糞便試料の残りの部分に安定化緩衝液を加えること、好ましくは、安定化緩衝液中に糞便試料の残りの部分を均質化して、糞便ホモジネートを形成すること、ｉｉ）糞便試料の残りの部分を凍結すること、のうちの一方または両方を含む。特定の好ましい実施形態では、安定化緩衝液は、約１００～約３００ｍＭのキレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含むキレート剤を含み、約４００～約６００ｍＭのトリス塩酸塩を含む。

いくつかの実施形態では、糞便試料の残りの部分を分析することは、糞便ホモジネートを処理して清澄化した流体画分から固形物を分離することと、清澄化した流体画分を分析することと、を含む。清澄化した流体画分を生成する手段は、例えば濾過して、例えば清澄化した濾液を生成すること、及び／または遠心分離して、例えば清澄化した上清を生成することを含み得る。糞便試料を処理し、アッセイ阻害物質を除去し、標的核酸分子を単離する方法には、例えば、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，０４７，３９０号に開示される方法が含まれる。

糞便試料の残りの部分の分析に関して、糞便試料の残りの部分で分析される１つ以上のマーカー分析物は、分散試料でも分析されるマーカー分析物または複数の分析物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態で、分散試料及び糞便試料の残りの部分は、マーカー分析物の同じセットについて分析される。他の実施形態では、糞便試料の残りの部分で分析される１つ以上のマーカー分析物は、分散試料で分析されないマーカー分析物からなる。

いくつかの実施形態で、糞便試料の残りの部分で分析されるマーカー分析物は、１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物、好ましくは、突然変異及びシトシンのメチル化状態のうちの少なくとも１つについて分析される１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物を含む。本明細書に記載の方法、組成物、及び物品のセットを使用して分析可能なヒトＤＮＡマーカー分析物の例には、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許第ＷＯ２０１５／１５３２８９号（ＰＣＴ出願／米国特許第２０１５／０２２７４９号）に記載のマーカーが含まれる。分散した試料は、１つ以上のＤＮＡマーカー分析物、または他の核酸分析物について同様に分析され得ることが企図される。

本技術はまた、上述の方法のうちのいずれか１つを使用してヒトの糞便試料を特徴付けるための物品（例えば、容器、収集装置、試薬など）を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本技術は、一定量の安定化液に分散した少量のヒト糞便試料を含む分散試料を収容するＦＩＴ試料収集装置を含む、物品のセットと、様々な量の複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物について分散試料を分析するための試薬のセットと、を提供する。好ましい実施形態では、ＦＩＴ試料収集装置中の安定化液の量は、３ｍＬ未満、好ましくは２ｍＬ未満である。

いくつかの実施形態では、試薬のセットによって分析可能な複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、少なくとも３つの異なるタンパク質マーカー分析物を含み、特定の好ましい実施形態では、複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、３つ以下の異なるマーカー分析物を含む。好ましくは、複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、Ｈｂ、カルプロテクチン、Ｈｐ、Ｃ３、Ｃ３ａ、ＦＣＧＢＰ、ＲＥＴＮＬＢ／ＲＥＬＭ、Ｓ１００Ａ１２、及びＳＥＲＰＩＮＦ２からなる群から選択され、好ましくはＨｂ、Ｈｐ、及びＣ３を含む。特定の実施形態では、試薬のセットによって分析可能な複数の異なるヒトタンパク質マーカー分析物は、Ｈｂ、Ｈｐ、及びＣ３からなる。本技術は特定の分析方法に限定されないが、特定の実施形態では、分散試料を分析するための試薬のセットは、免疫化学的アッセイのための試薬のセットを含む。

ヒト糞便試料の質量は特定の量に限定されないが、いくつかの実施形態では、少量のヒト糞便試料は、１００ｍｇ未満、好ましくは５０ｍｇ未満、好ましくは２０ｍｇ未満の質量である。任意の適切な安定化液（例えば、上述した安定化液及びその変形例のうちのいずれか）を、物品のセットで使用することができる。

少量のヒト糞便試料が糞便全体試料から取り出された部分を含む、物品のセットのいくつかの実施形態では、物品のセットは、糞便試料の安定化した残りの部分を更に含む。好ましくは、糞便試料の安定化した残りの部分は、安定化緩衝液を含む。任意の適切な安定化緩衝液（例えば、上述した安定化緩衝液及びその変形例のうちのいずれか）を、物品のセットで使用することができる。いくつかの実施形態では、糞便試料の安定化した残りの部分は、安定化緩衝液中に均質化される。

物品のセットは、様々な量の１つ以上のマーカー分析物について糞便試料の安定化した残りの部分を分析するための試薬のセットを更に含み得る。いくつかの実施形態では、糞便試料の安定化した残りの部分を分析するための試薬のセットによって分析可能な１つ以上のマーカー分析物は、分散試料を分析するための試薬のセットによって分析可能な少なくとも１つのヒトタンパク質マーカー分析物を含み、いくつかの実施形態では、糞便試料の安定化した残りの部分を分析するための試薬のセットによって分析可能な１つ以上のマーカー分析物は、１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物を含む。好ましい実施形態では、１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物について糞便試料の安定化した残りの部分を分析するための試薬のセットは、突然変異及びシトシンのメチル化状態のうちの少なくとも１つを分析するための試薬を含む。

定義
本発明の科学技術の理解を促進するために、いくつかの用語及び語句を下記に定義する。更なる定義は、発明を実施するための形態の全体を通して記載されている。

本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つ以上を意味することができる。例えば、「ａ」部品は、１つの部品または複数の部品を意味することができる。

「糞便」及び「便」という用語は、本明細書では、糞便（例えば、ヒトの糞便）の試料に関して同義で使用される。

本明細書で使用する場合、「計量された」という用語は、合理的に再現可能な測定量を有することを意味する。

本明細書で使用する場合、「ＦＩＴ試料収集装置」という用語は、分析のために、糞便試料を収集するための、好ましくは計量された糞便試料を収集するための装置を指す。例えば、米国特許第９，２１１，１１２号、同第７，７８０，９１５号、及び同第６，７８０，１６０号を参照のこと。いくつかの実施形態で、ＦＩＴ試料収集装置は、ＦＩＴ試料収集装置によって収集された一定量の糞便試料中の成分を安定化するのに適切な量の、一定量の安定化剤（例えば、安定化緩衝液）を含む。

本明細書で使用する場合、「ＦＩＴ装置試料」という用語は、ＦＩＴ試料収集装置によって収集された少量の糞便試料を指す。ＦＩＴ装置試料は、好ましくは、本明細書で以下に定義されるような少量の糞便試料であり、より好ましくは、計量された試料である。いくつかの実施形態では、ＦＩＴ装置試料は、試料の１つ以上の成分（例えば、糞便試料のタンパク質、核酸、炭水化物、または他の成分）を安定化するのに適した量の、一定量の流体（例えば、安定化緩衝液）と混ぜ合わせた少量の糞便試料を含む。

本明細書で使用する場合、「少量の糞便試料」は、マイクログラムの任意の整数値及びその間のマイクログラムの任意の小数部を含む、約１００ｍｇ未満、好ましくは９０ｍｇ未満、好ましくは８０ｍｇ未満、好ましくは７０ｍｇ未満、好ましくは６０ｍｇ未満、好ましくは５０ｍｇ未満、好ましくは４０ｍｇ未満、好ましくは３０ｍｇ未満、好ましくは２０ｍｇ未満、好ましくは１０ｍｇ未満、好ましくは９ｍｇ未満、好ましくは８ｍｇ未満、好ましくは７ｍｇ未満、好ましくは６ｍｇ未満、好ましくは５ｍｇ未満、好ましくは４ｍｇ未満、好ましくは２ｍｇ未満、好ましくは１ｍｇ未満の糞便試料を指す。好ましい実施形態では、少量の糞便試料を、１つ以上の成分、好ましくは高分子成分（例えば、糞便試料のタンパク質、核酸、炭水化物、及び他の成分）を安定化するのに適した一定量の安定化流体（例えば、安定化緩衝液）と混ぜ合わせる。

本明細書で使用する場合、「糞便全体試料」という用語は、例えば、対象による排便によって便収集装置（例えば、容器、コンテナ、または面）上にまたはその中に直接収集可能な、対象による排便の未分割生成物を指す。

本明細書で使用する場合、「分散試料」という用語は、分散マトリックス（例えば、流体、ゲルなど）と混ぜ合わせた試料（例えば、糞便試料）を指し、試料物質がマトリックス内に分散している。分散試料は、マトリックス内で均一になるように混合する必要はない。例えば、試料物質は、例えば、均質化によって混合されて、存在するすべての試料がマトリックス全体に本質的に均一に分散され得るか、または混合により、元の試料物質の一部が、試料の分散画分を含むマトリックスの存在下で、識別可能な形態（例えば、糞便試料の残存する半固形部分）で残存してもよい。

「安定化液」及び「安定化緩衝液」という用語は、糞便試料の１つ以上の成分、好ましくは高分子成分（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、及び他の成分）を安定化するのに適した流体マトリックスに関して本明細書で同義に使用される。安定化緩衝液には、タンパク質（例えば、ヘモグロビン）または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を安定化するために、または試料（例えば、血液または糞便試料）の両方を安定化するために選択される緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、安定化緩衝液は、例えば、米国特許公開第２０１９／０３０２１２９Ａ１号、ＰＣＴ特許出願／米国特許第２０１９／０２２５９８号、及び米国特許第９，２１１，１１２号に記載されているタンパク質安定化緩衝液、または、例えば、米国特許第６，５５１，７７７号、同第８，７２２，３３０号、同第１０，０６４，４０４号、同第９，３７６，７０９号、同第９，６５７，２２７号、及び同第９，９２６，５９０号、同第１０，１４４，９５５号に記載されている核酸安定化緩衝液を含み、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

１つ以上のヘモグロビン安定化試薬を含む、ＦＩＴ試料収集装置用の糞便安定化緩衝液が企図される。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘモグロビン安定化試薬は、例えば、浸透圧調節物質；多価カチオン；糖または多糖類、及び任意選択で多価カチオン；プロトポルフィリン；ならびにホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）安定化成分、及び任意選択で多価カチオン；から選択され得る。溶液中のそのような試薬の例及び濃度は、米国特許第２０１９／０３０２１２９Ａ１号に記載されている。

いくつかの実施形態で、溶液は、浸透圧調節物質（例えば、ベタイン）を含み得る。これらの１５つの実施形態にて、浸透圧調節物質（例えば、ベタイン）は、２Ｍ～５Ｍの範囲の濃度であり得る。

いくつかの実施形態では、溶液は、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を含み得る。これらの実施形態では、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）は、０．１Ｍ～０．５Ｍの範囲の濃度であり得る。いずれの場合でも、溶液は任意選択で多価カチオン、Ｍｇ^２＋またはＣａ^２＋を含み得る。これらの実施形態では、多価カチオン（例えば、カルシウムまたはマグネシウムイオン）は、５ｍＭ～２５ｍＭの範囲の濃度であり得る。

いくつかの実施形態では、溶液は、多糖類（例えば、α－（１－４）結合Ｄ－ガラクツロン酸などの置換または非置換ポリガラクツロン酸）を含み得る。これらの実施形態で、多糖類（例えば、置換または非置換のポリガラクツロン酸）は、０．００５％～０．５％（例えば、０．０１％～０．１２５％）の範囲の濃度であり得る。これらの実施形態では、溶液は、任意選択で多価カチオンを含み得る。溶液が多価カチオンを含む実施形態では、多価カチオンは、５ｍＭ～２５ｍＭの範囲の濃度であり得る。いくつかの実施形態で、溶液は、５ｍＭ～２５ｍＭの範囲の濃度で、置換または非置換のポリガラクツロン酸及び多価カチオン（例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）を含み得る。

いくつかの実施形態では、溶液は、金属イオンと錯体を形成したプロトポルフィリン、例えば、プロトポルフィリンＩＸ、またはオクタエチルポルフィリン（Ｈ２ＯＥＰ）もしくはテトラフェニルポルフィリン（Ｈ２ＴＰＰ）などのその類似体を含み得る。これらの実施形態では、プロトポルフィリンは、ヘミン（配位塩化物配位子を有する第二鉄（Ｆｅ３＋）イオンを含有するプロトポルフィリンＩＸ）またはヘマチンであり得る。他の実施形態では、プロトポルフィリンは、二価または三価のカチオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｃｒ３＋、またはＣｏ３＋）と錯体を形成したプロトポルフィリンＩＸであり得る。これらの実施形態で、プロトポルヒリンは、０．１μＭ～１００μＭの範囲（例えば、１μＭ～１０μＭ）の濃度で溶液中にあり得る。いくつかの実施形態では、溶液は、ＨＲＰコンジュゲート安定化剤（ＰＮ８５Ｒ－１０２；ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＨＲＰコンジュゲート安定化剤（ＰＮＳＺ０２；Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）、及びＨＲＰコンジュゲート安定化剤（ＰＮａｂ１７１５３７；Ａｂｃａｍ）から選択されるＨＲＰ安定化成分を含み得る。他のＨＲＰ安定化成分（例えば、ＡｂＧｕａｒｄ（ＢｉｏＲａｄＰＮ：ＢＵＦ０５２；ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．２０００ＡｌｆｒｅｄＮｏｂｅｌＤｒ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７）を使用できる可能性がある。溶液がＨＲＰ安定化成分を含む場合、その成分は、１％～２０％（例えば、５％～１５％または５％～２０％）の範囲の濃度であり得る。

任意の実施形態で、溶液は、多価カチオン（例えば、カルシウムイオンまたはマグネシウムイオン）を含み得る。これらの実施形態にて、多価カチオンは、５ｍＭ～２５ｍＭの範囲の濃度であり得る。任意の実施形態にて、溶液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液（例えば、１０ｍＭ～５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）、ウシ血清アルブミン（例えば、５％～２０％のＢＳＡ）、ポリソルベート２０（例えば、０．０５％～０．２％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０））、アジ化ナトリウム（例えば、０．０５％～０．２％のアジ化ナトリウム）などの防腐剤、塩化ナトリウム（例えば、５０ｍＭ～２５０ｍＭの塩化ナトリウム）などの塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、例えば、５ｍＭ～２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸）などのキレート剤、及びゲンタマイシンなどの抗生物質（例えば、５ｕｇ／ｍＬ～５０ｕｇ／ｍＬ）を更に含む。

本明細書で使用する場合、「マーカー分析物」という用語は、その最も広い意味で使用され、試料を特徴付けるために分析またはアッセイすることができる、試料の任意の成分または特徴（例えば、疾患もしくは状態の兆候、または疾患もしくは状態の不在）を指す。
［図面の簡単な説明］

［図１］組織病理学的に大腸癌（ＣＡ）、進行性腺腫（ＡＡ）であるとして、または癌及び進行性腺腫が陰性であるとして分類された対象の糞便全体上清試料における一連のタンパク質マーカーの存在を検査した結果を示す表（表２）である。
［図２］組織病理学的に大腸癌（ＣＡ）、進行性腺腫（ＡＡ）であるとして、または癌及び進行性腺腫が陰性であるとして分類された対象のＦＩＴ装置試料における一連のタンパク質マーカーの存在に関する表（表３）である。
［発明を実施するための形態］

本明細書で提供されるのは、ヘモグロビンの分析の有無にかかわらず、糞便試料中の複数のマーカー（例えば、複数の異なるタンパク質マーカー）を分析するための技術である。いくつかの実施形態では、複数の異なるマーカーは、糞便全体検体からの上清試料で試験され、一方、いくつかの実施形態では、複数の異なるタンパク質マーカーは、例えば、ＦＩＴ試料収集装置を使用して収集されるような、少量の試料で試験される。ＦＩＴ試料収集装置は、通常、０．１ｇ未満の試料、より一般的には１０～２０ｍｇの試料を収集する。更に他の実施形態では、糞便全体試料中の複数のタンパク質を試験した結果は、ＦＩＴ試料収集装置を使用して収集された同じ糞便検体からの試料を試験した結果と組み合わされる。更に他の実施形態では、糞便検体は、非タンパク質マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）について更に試験される。以下の説明では、次の略語を参照する：ヘモグロビン（Ｈｂ）カルプロテクチン、ハプトグロビン（Ｈｐ）、補体成分３（Ｃ３）、補体成分３ａ（Ｃ３ａ）、ＩｇＧ結合タンパク質のＦｃフラグメント（ＦＣＧＢＰ）、レジスチン様β（ＲＥＴＮＬＢ／ＲＥＬＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）、及びセルピンファミリーＦメンバー２（ＳＥＲＰＩＮＦ２）。

既知のすべての糞便免疫化学的検査（ＦＩＴ）は、糞便試料中のヘモグロビンのみを測定する。例えば、以下が含まれる。
１．ＣＡＲＥｐｒｉｍｅＨｂ（ＡｌｆｒｅｓａＰｈａｒｍａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）
２．ＨｂＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
３．ＯＣセンサー（ＥｉｋｅｎＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）（米国ではＰｏｌｙｍｅｄｃｏとして販売）
４．ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮＨｂ（Ｒ－Ｂｉｏｐｈａｒｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
５．ＳＥＮＴｉＦＩＴ－ＦＯＢゴールド（ＳｅｎｔｉｎｅｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）
６．ＥｕｒｏｌｙｓｅｒＦＯＢ試験（ＥｕｒｏｌｙｓｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）
７．ＩｍｍｏＣＡＲＥ－Ｃ（ＣＡＲＥＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｖｏｅｒｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
８．ＱｕａｎｔＯｎＨｅｍ（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
９．ＱｕｉｋＲｅａｄｇｏｉＦＯＢＴ（ＯｒｉｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）

ＡｎｔｏｎＧｉｅｓらは、結腸直腸癌の９つの糞便免疫化学的試験を評価した。試験は同じ試料セットで評価され、比較された。比較の結果は、９３％以上の特異性がすべての試験に設定されている場合、ＣＲＣ検出に対してほぼ等しい感度が観察されることを示している。ただし、各試験の試験特性は、このデータセットにおいて、９３％の特異性で、ＣＲＣ検出に対して８２％を超える感度を達成した試験はなく、９７％の特異性で、でのＣＲＣ検出に対して７５％を超える感度を達成した試験がないことを示している。（ＡｎｔｏｎＧｉｅｓｅｔａｌ．ＤｉｒｅｃｔＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆ９ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＦｅｃａｌＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｓｔｓｆｏｒＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｎｃｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２０１８；１５４：９３－１０４）。逆に、これらの試験の感度は、カットオフ値を変えることで上方に調整できるが、感度を上げると特異性が犠牲になる。

異なるタンパク質分析物を試験する際の難しさの１つは、糞便試料中のタンパク質の安定性が低い可能性があることである。分析物濃度が低く、分析感度が低いと、特にＦＩＴ試料収集装置によって通常収集される少量の糞便で、糞便中のタンパク質の有意義な検出と分析が更に制限される可能性がある。例えば、上記のＦＩＴ試験用の試料収集装置は、試験用に少量の計量された量（通常は２０ｍｇ以下）を提供するように構成されている。通常、これらの装置は、例えば、サンプリングスプーンまたはロッドでこすり取ることによって過剰な試料を排除するように構成され、その結果、計量された量の糞便試料が、以下の表に示すように、設定量の緩衝液が入ったリザーバまたは容器に送達され得るようになっている。

上述したＦＩＴ収集装置のそれぞれは、ヘモグロビンを検出するのに十分な量の試料を提供することが示されているが、これらの同じ少量の試料で他のタンパク質マーカーを検出することは、より困難であることが証明されている。評価した２４つのタンパク質マーカーのうち、ＨｂアッセイについてのＦＩＴの感度と特異性を改善する可能性を示したのは２つのマーカーだけだった。

実験例
ＦＩＴ及び糞便全体試料は、ＣＯＬＯＧＵＡＲＤ収集キット（ＥｘａｃｔＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に従って装置を使用して収集された。ＦＩＴ試料は、米国特許第９，２１１，１１２号に記載されているように、装置を使用して収集され、緩衝液で安定化して、得られた懸濁試料を直接試験した。

糞便全体試料を収集し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液を含む、Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ糞便緩衝液２００２０４で安定化した。糞便試料を秤量し、次に緩衝液と混ぜ合わせた。好ましくは、緩衝液と糞便は、４：１（重量：重量または体積：重量）の緩衝液対糞便比で混ぜ合わせる。試料を緩衝液でホモジナイズし、遠心分離して固形物を除去し、バイオマーカー試験のために上清を収集する。

糞便全体上清及びＦＩＴ試料を、２４つの追加のタンパク質マーカーの存在／検出について評価した。評価のために、市販の分析キットをいくつかの異なる販売者から購入した。評価で使用したタンパク質マーカーアッセイのリストは、表１にある。

試料を製造元の指示に従って試験し、試験した液体の量は様々なアッセイ要件に応じた。すべてのキットで、試料の量は２５～１００μＬの範囲で変化した。一部の手順では、例えば、試料安定化緩衝液による阻害を低減するために、及び／または定量アッセイの測定範囲内の標的分析物を含む試料を生成するために、糞便全体上清からの試料を試験前に希釈する必要があった。希釈は、未希釈～１５０倍希釈の範囲だった。ＦＩＴ収集装置試料は、通常、試験前に１０倍に希釈された。

評価のために選択された試料は、既知の病理を有する集団から構成された。すべての試料が各タンパク質アッセイで評価されたわけではない。糞便全体上清試料で評価されたタンパク質マーカーのリストとその結果を表２に示す（図１）。ＦＩＴ装置試料で評価されたタンパク質マーカーとその結果を表３に示す（図２）。

評価された２４つのタンパク質バイオマーカーのうち、ハプトグロビン（Ｈｐ）と補体成分３（Ｃ３）は、Ｈｂの結果と組み合わせると、ＨｂのみのＦＩＴよりも感度と特異性が向上した。これらの２つのバイオマーカーは、ヘモグロビンの結果と組み合わせた場合にＦＩＴ試料試験の感度と特異性を改善する可能性が最も高いことを示し、既知の病態を持つ試料の大きな一団で試験した。試料団は、１１５つの癌試料（ＣＡ）、１１２つの進行腺腫試料（ＡＡ）、及び４８８つの癌陰性で構成された。糞便全体試料を収集し、それぞれの少量をＦＩＴ収集装置で取り出して、糞便全体上清試験の結果を、ＦＩＴ収集装置を使用して処理した対応する少量の試料と比較できるようにした。

癌を検出するための各バイオマーカーの性能を評価するために、ＲＯＣ曲線分析を実行し、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。

表４は、糞便全体上清試料で図１に示したマーカーの分析から得られたＡＵＣの結果を示す。０．６を超えるＡＵＣの結果が、更なる分析のために選択された。不十分なバイオマーカーの検出がいくつかの事例で観察され、これらのマーカーはＡＵＣの計算に含まれなかった。

表５は、ＦＩＴ装置試料で図２に示したマーカーの分析から得られたＡＵＣの結果を示している。０．６を超えるＡＵＣの結果が、更なる分析のために選択された。不十分なバイオマーカーの検出がいくつかの事例で観察され、これらのマーカーはＡＵＣの計算に含まれなかった。

糞便全体試料及び対応するＦＩＴ収集装置の少量の試料を、Ｃ３及びＨｐアッセイで試験した。Ｃ３とＨｐの結果がモデル化され、個々のアッセイ、及びＦＩＴ収集装置で収集された試料からのヘモグロビン結果と組み合わせたアッセイの特異性と感度がモデル化された。

糞便全体上清試料
糞便全体上清試料の結果を以下の表６に示す。これらのデータは、糞便全体試料で、Ｃ３マーカーのみがヘモグロビンマーカーと比較して改善された癌感受性を示し、Ｃ３、Ｈｐ、及びＨｂマーカーを組み合わせたときに最大の感度が達成されたことを示している。

ＦＩＴ装置試料
ＦＩＴ収集装置で収集された試料（つまり、約２０ｍｇの試料）では、表７に示すように、Ｃ３、Ｈｐ、及びＨｂの結果を組み合わせたときに最大の感度を達成した。これらのデータは、ＦＩＴＨｂ分析のみで得られた結果と比較して、Ｈｂの結果をＣ３またはＨｐの結果と組み合わせると、ＦＩＴ試料の分析の全体的な感度が改善されたことを示している。

糞便全体上清試料データ＋ＦＩＴ装置試料データ
糞便全体上清から収集されたデータ及び対応するＦＩＴ収集装置試料データ（すなわち、糞便全体試料から採取され、並行して処理されたＦＩＴ試料）も組み合わされた。表８は、そのマーカーのＦＩＴと糞便全体上清データを組み合わせた場合のＣ３、Ｈｐ、及びＨｂマーカーの分析のＡＵＣ結果を示している。

ＦＩＴ試料と糞便全体上清試料の両方を組み合わせて試験した場合、以下の表９に示すように、その結果は、糞便全体またはＦＩＴ装置のサンプリングのみでの個々のマーカー試験と比較して、一般的に改善された感度を示した。これらのデータは、ＦＩＴ試料と対応する糞便全体試料の両方を試験してその結果を組み合わせた場合に、Ｈｂの全体的な感度が向上したことを示している。Ｈｂに加えてＨｐ及び／またはＣ３を試験すると、Ｈｂ分析のみの場合よりも感度がわずかに向上した。

上述のアッセイは、１つ以上の他の分子を検出するための追加のアッセイによって更に向上され得る。ＦＩＴ装置試料や糞便全体上清試料を含む、糞便試料中のタンパク質マーカーの検出は、他のマーカー（例えば、糞便試料中のメチル化マーカー遺伝子（複数可）や他の核酸、及び／または血液や血液産物の試料中のマーカー（ＲＮＡ（複数可）、メチル化マーカー遺伝子（複数可）及び／または自己抗体（複数可）を含むがこれらに限定されない））と個別にまたは任意の組み合わせで、全体の感度を更に高めることができることは、当業者であれば理解することができるであろう。

特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本出願において引用されるすべての文献及び同様の資料は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために明示的に援用される。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本明細書に記載される様々な実施形態が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。参照により援用される際に用語の定義が本発明の教示に提供される定義と異なるような場合は、本発明の教示に提供される定義が優先されるものとする。

記載される本科学技術の組成物、方法、及び用途の種々の修正形態ならびに変形形態は、記載されるような本科学技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明白である。本科学技術を特定の例示的な実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲に記載されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、薬理学、生化学、医学、または関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するために記載された方式の様々な修正形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

組織病理学的に大腸癌（ＣＡ）、進行性腺腫（ＡＡ）であるとして、または癌及び進行性腺腫が陰性であるとして分類された対象の糞便全体上清試料における一連のタンパク質マーカーの存在を検査した結果を示す表（表２）である。図１－１の続き。図１－２の続き。図１－３の続き。図１－４の続き。図１－５の続き。図１－６の続き。図１－７の続き。図１－８の続き。図１－９の続き。図１－１０の続き。図１－１１の続き。図１－１２の続き。図１－１３の続き。図１－１４の続き。図１－１５の続き。図１－１６の続き。図１－１７の続き。図１－１８の続き。図１－１９の続き。図１－２０の続き。図１－２１の続き。図１－２２の続き。図１－２３の続き。図１－２４の続き。図１－２５の続き。図１－２６の続き。図１－２７の続き。図１－２８の続き。図１－２９の続き。図１－３０の続き。図１－３１の続き。組織病理学的に大腸癌（ＣＡ）、進行性腺腫（ＡＡ）であるとして、または癌及び進行性腺腫が陰性であるとして分類された対象のＦＩＴ装置試料における一連のタンパク質マーカーの存在に関する表（表３）である。図２－１の続き。図２－２の続き。図２－３の続き。図２－４の続き。図２－５の続き。図２－６の続き。図２－７の続き。図２－８の続き。図２－９の続き。図２－１０の続き。図２－１１の続き。図２－１２の続き。図２－１３の続き。図２－１４の続き。図２－１５の続き。図２－１６の続き。図２－１７の続き。図２－１８の続き。図２－１９の続き。

Claims

結腸直腸腺腫又は結腸直腸癌の兆候のためのヒト糞便検体を特徴付ける方法であって、
ａ）以下の２つの試料を含むヒト糞便検体を提供することと、
ｉ)一定量の安定化液中のヒト糞便検体の第１部分を含む第１試料；及び、
ｉｉ)前記安定化液とは異なる安定化緩衝液中のヒト糞便検体の第２部分を含む第２試料
ｂ）様々な量の１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物について前記第１試料を分析することと、
ｃ）様々な量の同じ１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物について前記第２試料を分析することと、
ｄ）工程ｂ）及び工程ｃ）の結果の組み合わせに基づき、結腸直腸腺腫及び／又は結腸直腸癌の存在又は不在を示すようにヒト糞便検体を特徴付けることと、を含む、方法。
前記第１試料における前記安定化液の体積が３ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。
前記第１試料における前記安定化液の体積が２ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。
前記糞便検体の前記第１部分が、１００ｍｇ未満である、請求項２に記載の方法。
前記糞便検体の前記第１部分が、５０ｍｇ未満である、請求項２に記載の方法。
前記糞便検体の前記第１部分が、２０ｍｇ未満である、請求項２に記載の方法。
前記第２試料は、前記緩衝液と前記第２部分の総量とが少なくとも４：１の比（重量：重量または体積：重量）である、請求項１に記載の方法。
前記第２試料は、前記緩衝液と前記第２部分の総量とが４：１の比（重量：重量または体積：重量）である、請求項７に記載の方法。
前記第２部分は、前記糞便検体から前記第１部分を取り出した後の前記糞便検体の残りの部分を含む、請求項１に記載の方法。
前記ヒト糞便検体の前記第２部分は、安定化緩衝液中で均質化される、請求項１に記載の方法。
前記第２試料の分析することが、前記第２試料を処理して清澄化した流体画分から固形物を分離することと、前記清澄化した流体画分を分析することと、を含む、請求項１又は１０に記載の方法。
前記１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物が、少なくとも３つの異なるヒトタンパク質マーカー分析物を含む、請求項１に記載の方法。
前記１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物が、補体成分３（Ｃ３）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ハプトグロビン（Ｈｐ）、カルプロテクチン、補体成分３ａ（Ｃ３ａ）、ＩｇＧ結合タンパク質のＦｃフラグメント（ＦＣＧＢＰ）、レジスチン様β（ＲＥＴＮＬＢ／ＲＥＬＭ）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）、及びセルピンファミリーＦメンバー２（ＳＥＲＰＩＮＦ２）からなる群から選択される、１つ以上のヒトタンパク質マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
前記１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物が、Ｃ３、Ｈｂ及びＨｐを含む、請求項１３に記載の方法。
前記１つ以上の異なるヒトタンパク質マーカー分析物が、Ｃ３、Ｈｂ及びＨｐからなる、請求項１３に記載の方法。
前記分析することが、免疫化学的アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
ｉ)前記安定化液が、２０ｍＭのトリス、１０％のウシ血清アルブミン、０．１０％のＴＷＥＥＮ２０、０．０９５％のアジ化ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むこと、
ｉｉ)前記安定化液が、
プロトポルフィリン；
多価カチオン；
糖または多糖類；
浸透圧調節物質；
多価カチオン；及び
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）安定化成分；から選択される１つ以上の安定化試薬を含むこと、
ｉｉｉ)前記安定化液が、多価カチオンと錯体を形成したプロトポルフィリンＩＸを含むこと、及び
ｉｖ)前記安定化液が、置換または非置換のポリガラクツロン酸を含むこと、の少なくとも１つによってさらに定義される、請求項１に記載の方法。
前記安定化液が、Ｃｒ^３＋及びＣｏ^３＋から選択される多価カチオンと錯体を形成したプロトポルフィリンＩＸを含む、請求項１６に記載の方法。
２つの試料を含む前記ヒト糞便検体が、
ａ）ヒト対象から全体の糞便検体を収集することと、
ｂ）前記全体の糞便検体の一部を取り出して、前記糞便検体の取り出した部分及び残りの部分を生成することであって、ここで、前記取り出した部分が糞便検体の第１部分である、前記生成することと、
ｃ）前記糞便検体の第１部分を一定量の安定化液と混ぜ合わせて、前記第１試料を生成することと、
ｄ）第２試料を生成するために、前記糞便検体の残りの部分に対して安定化緩衝液を加えることと、を含む方法によって提供される、請求項１に記載の方法。
ｉ）前記第２試料を均質化して、糞便ホモジネートを形成すること、及び
ｉｉ）前記第２試料を凍結すること、の１つ以上を更に含む、請求項１９に記載の方法。
前記安定化緩衝液が、キレート剤及び緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
前記安定化緩衝液が、１００～３００ｍＭのキレート剤及び４００～６００ｍＭのトリス塩酸塩を含む、請求項２０に記載の方法。
前記キレート剤が、ＥＤＴＡを含む、請求項２２に記載の方法。
前記安定化液が、２０ｍＭのトリス塩酸塩、１０％のウシ血清アルブミン、０．１０％のＴＷＥＥＮ２０、０．０９５％のアジ化ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含み、
前記安定化緩衝液が、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡ、及び４００～６００ｍＭのトリス塩酸塩を含む、請求項１３に記載の方法。
１つ以上のヒト核酸マーカー分析物のために前記第１試料及び／又は第２試料を分析することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記１つ以上のヒト核酸マーカー分析物が、１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物を含む、請求項２５に記載の方法。
前記１つ以上のヒトＤＮＡマーカー分析物が、
突然変異と、
シトシンのメチル化状態と、のうちの少なくとも１つについて分析される、請求項２６に記載の方法。