JP7742129B2

JP7742129B2 - 大動脈瘤の診断、治療剤、および、治療剤のスクリーニングのための新技術

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Publication number: JP7742129B2
Application number: JP2021169876A
Authority: JP
Inventors: 健司糟野; 佐和香田邉; 正之岩野; 孝昭腰地
Original assignee: University of Fukui NUC
Current assignee: University of Fukui NUC
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2025-09-19
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: JP2023059711A

Description

本発明は、大動脈瘤の診断、治療剤、および、治療剤のスクリーニングのための新技術に関する。より具体的には、本発明は、大動脈瘤の診断、大動脈瘤の治療剤のスクリーニング、および、大動脈瘤の治療剤のために、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledを利用する技術である。

大動脈瘤は、大動脈の壁の一部が、全周性または局所性に、拡大または突出した状態、として定義され得る。大動脈瘤は、発生部位などによって分類され得、例えば、胸部に発生するものを胸部大動脈瘤（thoracic aortic aneurysm：ＴＡＡ）、胸部と腹部とに発生するものを胸腹部大動脈瘤（thoracoabdominal aortic aneurysm：ＴＡＡＡ）、腹部に発生するものを腹部大動脈瘤（abdominal aortic aneurysm：ＡＡＡ）と呼ぶ。

大動脈瘤は、無症状のままに病気が進行し、血管の解離および／または破裂によって、初めて見つかるケースが多い。それ故に、大動脈瘤の治療剤の開発は勿論のこと、大動脈瘤の診断方法の開発に、注目が集まっている。

大動脈瘤の治療剤の開発、および、大動脈瘤の診断方法の開発には、大動脈瘤の臨床的なリスク因子、および、大動脈瘤の形成に関与する分子に関する理解を深める必要がある。

大動脈瘤の臨床的なリスク因子としては、喫煙、呼吸障害、加齢、糖尿病、高脂血症、および、高血圧などが知られている。一方、大動脈瘤の形成に関与する分子としては、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ：Osteoprotegerin）、および、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ：Matrix Metalloproteinase）などが知られている。

また、Ｗｎｔシグナル経路を阻害するスクレロスチン（Sclerostin）が、アンギオテンシンＩＩによって誘導される大動脈瘤およびアテローム性動脈硬化症を抑制することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。更に、低酸素状態とアテローム性動脈硬化症とが、関連することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。

現在、これらの知見に基づいて、大動脈瘤の治療剤、および、大動脈瘤の診断方法の開発が進められている。

Smriti et al., Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology, Volume 37, Issue 3, March 2017, Pages 553-566, "Wnt Signaling Pathway Inhibitor Sclerostin Inhibits Angiotensin II-Induced Aortic Aneurysm and Atherosclerosis" Xingyu et al., Circulation Cardiovascular Imaging, Volume 13, Issue 1, e009791, January 8, 2020, "64Cu-ATSM Positron Emission Tomography/Magnetic Resonance Imaging of Hypoxia in Human Atherosclerosis"

しかしながら、従来の大動脈瘤の治療剤、および、大動脈瘤の診断方法は、十分とは言えず、新たな治療剤、および、診断方法の開発が求められている。

そこで、本発明の一態様は、大動脈瘤の診断、治療剤、および、治療剤のスクリーニングのための新たな技術を実現することを目的とする。

本発明者らは、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledが大動脈瘤（例えば、大動脈瘤に存在するアテローム性プラーク）と関連することを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明の一態様は、以下である。

〔１〕被検体から採取した試料において、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を検出する工程を含む、大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法。

〔２〕ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を検出するための部材を備えている、大動脈瘤の診断キット。

〔３〕ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を発現し得る培養細胞と、治療剤の候補物質とを接触させる工程と、上記培養細胞と上記候補物質とを接触させる前後にて、上記培養細胞におけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現を比較する工程と、を有する、大動脈瘤の治療剤のスクリーニング方法。

〔４〕ヌクレオレドキシン発現誘導剤、または、Dishevelled発現抑制剤を有効成分として含有する、大動脈瘤の治療剤。

〔５〕上記ヌクレオレドキシン発現誘導剤は、ｔＢＨＱ、ＳＦＮ、または、ＣＤＤＯである、〔４〕に記載の大動脈瘤の治療剤。

〔６〕上記Dishevelled発現抑制剤は、ｓｉＲＮＡである、〔４〕に記載の大動脈瘤の治療剤。

本発明の一態様によれば、大動脈瘤の診断、治療剤、および、治療剤のスクリーニングのための新たな技術を実現することができる。

本発明の実施例における、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴ／ＭＲＩの試験結果を示す図である。本発明の実施例における、アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現を示す図である。本発明の実施例における、アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現を示す図である。本発明の実施例における、アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現を示す図である。本発明の実施例における、アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現を示す図である。本発明の実施例における、アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現を示す図である。本発明の実施例における、酸化ストレスによる様々な分子の発現量の変化を示す図である。本発明の実施例における、ＮＲＸの発現量の低下が他の分子の発現量に及ぼす影響を示す図である。本発明の実施例における、ＮＲＸの発現量の低下が他の分子の発現量に及ぼす影響を示す図である。本発明の実施例における、ヌクレオレドキシン発現誘導剤のスクリーニングの結果を示す図である。本発明の実施例における、ヌクレオレドキシン発現誘導剤が有する大動脈瘤の治療効果を示す図である。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。

〔１．大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法〕
本発明の一実施形態に係る大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法は、被検体から採取した試料において、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を検出する工程を含む。

上記工程にて、ヌクレオレドキシンの発現の低下が検出されれば、大動脈瘤が将来に形成される、大動脈瘤が形成されつつある、大動脈瘤が既に形成されている、大動脈瘤が将来に形成される可能性がある、大動脈瘤が形成されつつある可能性がある、または、大動脈瘤が既に形成されている可能性がある、と判定（判定１）することができる。

ヌクレオレドキシンの発現の低下の程度は、限定されない。比較対象である試料（例えば、被検体における正常組織）におけるヌクレオレドキシンの発現量をＡとし、被検体から採取した試料（例えば、被検体における異常が疑われる組織）におけるヌクレオレドキシンの発現量をＢとする。例えば、「Ａ＞Ｂ」、「０．９×Ａ≧Ｂ」、「０．８×Ａ≧Ｂ」、「０．７×Ａ≧Ｂ」、「０．６×Ａ≧Ｂ」、「０．５×Ａ≧Ｂ」、「０．４×Ａ≧Ｂ」、「０．３×Ａ≧Ｂ」、「０．２×Ａ≧Ｂ」、「０．１×Ａ≧Ｂ」、または、「０．０１×Ａ≧Ｂ」である場合に、上述した判定１のように判定することができる。

上記工程にて、Dishevelledの発現の上昇が検出されれば、大動脈瘤が将来に形成される、大動脈瘤が形成されつつある、大動脈瘤が既に形成されている、大動脈瘤が将来に形成される可能性がある、大動脈瘤が形成されつつある可能性がある、または、大動脈瘤が既に形成されている可能性がある、と判定（判定２）することができる。

Dishevelledの発現の上昇の程度は、限定されない。比較対象である試料（例えば、被検体における正常組織）におけるDishevelledの発現量をＣとし、被検体から採取した試料（例えば、被検体における異常が疑われる組織）におけるDishevelledの発現量をＤとする。例えば、「Ｄ＞Ｃ」、「Ｄ≧１．１×Ｃ」、「Ｄ≧１．２×Ｃ」、「Ｄ≧１．３×Ｃ」、「Ｄ≧１．４×Ｃ」、「Ｄ≧１．５×Ｃ」、「Ｄ≧１．６×Ｃ」、「Ｄ≧１．７×Ｃ」、「Ｄ≧１．８×Ｃ」、「Ｄ≧１．９×Ｃ」、「Ｄ≧２．０×Ｃ」、「Ｄ≧５．０×Ｃ」、「Ｄ≧１０×Ｃ」、または、「Ｄ≧１００×Ｃ」である場合に、上述した判定２のように判定することができる。

上記工程では、（ｉ）ヌクレオレドキシン、および、DishevelledのｍＲＮＡを検出してもよいし、（ｉｉ）ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledのタンパク質を検出してもよいし、（ｉｉｉ）ヌクレオレドキシン、および、DishevelledのｍＲＮＡおよびタンパク質の両方を検出してもよい。

ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程は、負に制御、および／または、正に制御される場合がある。それ故に、上記工程では、最終産物であって、かつ、機能を発揮する主体であると考えられる、ヌクレオレドキシンおよびDishevelledのタンパク質を検出することが好ましい。当該構成であれば、大動脈瘤を診断するためのより良いデータを取得することができる。

ヌクレオレドキシン、および、DishevelledのｍＲＮＡを検出する方法としては、限定されず、例えば、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法、ノザンブロット法、および、マイクロアレイ法を挙げることができる。なお、これらの方法自体は周知である。したがって、これらの方法を用いてDishevelledのｍＲＮＡを検出する場合には、周知の方法にしたがえばよい。

ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledのタンパク質を検出する方法としては、限定されず、例えば、免疫染色法、免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、および、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。なお、これらの方法自体は周知である。したがって、これらの方法を用いてDishevelledのタンパク質を検出する場合には、周知の方法にしたがえばよい。

上記大動脈瘤の種類は、限定されず、例えば、胸部大動脈瘤、胸腹部大動脈瘤、および、腹部大動脈瘤を挙げることができる。

上記被検体は、限定されず、例えば、ヒト、および、非ヒト動物（例えば、家畜、愛玩動物、および、実験動物）を挙げることができる。非ヒト動物としては、例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットを挙げることができる。

上記被検体から採取した試料は、特に限定されず、例えば、上記被検体の、胸部大動脈、胸腹部大動脈、および、腹部大動脈から採取した試料（例えば、これらの大動脈の組織片）を挙げることができる。

上記被検体から試料を採取する方法は、限定されず、公知の方法を用いることができる。

〔２．大動脈瘤の診断キット〕
本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の診断キットは、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を検出するための部材を備えている。

上述した〔１．大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法〕等にて説明した構成については、その説明を省略する。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の診断キットは、ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡを検出するための部材を備えていてもよいし、ヌクレオレドキシン、または、Dishevelledのタンパク質を検出するための部材を備えていてもよい。

ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡを検出するための部材は、例えば、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法、ノザンブロット法、または、マイクロアレイ法にしたがって、ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡを検出するための部材であり得る。

ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡを検出するための部材としては、例えば、ヌクレオレドキシンのｍＲＮＡ、または、DishevelledのｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ（例えば、ｍＲＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド）、ＰＣＲ法にてヌクレオレドキシンのｍＲＮＡ、または、DishevelledのｍＲＮＡを検出するためのプライマーを挙げることができる。

上記プローブ、および、プライマーの長さは、限定されず、ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡを特異的に検出し得る長さであればよい。上記プローブ、および、プライマーの塩基配列は、限定されず、ヌクレオレドキシン、または、DishevelledのｍＲＮＡの任意の箇所に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列であればよい。

ヌクレオレドキシン、または、Dishevelledのタンパク質を検出するための部材は、例えば、免疫染色法、免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、または、ＥＬＩＳＡ法にしたがって、ヌクレオレドキシン、または、Dishevelledのタンパク質を検出するための部材であり得る。

ヌクレオレドキシン、または、Dishevelledのタンパク質を検出するための部材としては、例えば、ヌクレオレドキシン、または、Dishevelledのタンパク質に結合する抗体を挙げることができる。

上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。

上記抗体は、周知の方法に従って作製することができる（例えば［Harlow (Ed.), "Antibodies: a laboratory manual", New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］、［岩崎辰夫他「単クローン抗体:ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」、講談社、１９９１年］を参照）。

モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体の作製方法の例としては、（１）ハイブリドーマ法（例えば［Koehler G & Milstein C (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, Vol.256 (No.5517), pp.447-518］を参照）、（２）トリオーマ法、（３）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば［Kozbor D & Roder JC (1983) "The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes", Immunology Today, Vol.4 (Issue 3), pp.72-79］を参照）、（４）ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（例えば［Cole SPC et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer" In: Reisfeld RA & Sell S (Eds.), "Monoclonal antibodies and cancer therapy", New York: Alan R. Liss, Inc., 1985, pp.77-96 (UCLA symposia on molecular and cellular biology, Vol.27)］を参照）を挙げることができる。

〔３．大動脈瘤の治療剤のスクリーニング方法〕
本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤のスクリーニング方法は、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を発現し得る培養細胞と、治療剤の候補物質とを接触させる工程（第１の工程とも呼ぶ）と、上記培養細胞と上記候補物質とを接触させる前後にて、上記培養細胞におけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現を比較する工程（第２の工程とも呼ぶ）と、を有する。

上述した〔１．大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法〕および〔２．大動脈瘤の診断キット〕等にて説明した構成については、その説明を省略する。

〔３－１．第１の工程〕
上記第１の工程は、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を発現し得る培養細胞と、治療剤の候補物質とを接触させる工程である。

上記ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を発現し得る培養細胞は、限定されず、例えば、大動脈平滑筋細胞を挙げることができる。

上記治療剤の候補物質は、限定されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、核酸、および、糖を挙げることができる。

上記第１の工程では、例えば、治療剤の候補物質を所望の濃度になるように培養液に加え、当該培養液中で、所望の時間（例えば、１時間～１００時間、１時間～７２時間、または、１時間～２４時間）、上記培養細胞を培養することによって、培養細胞と候補物質とを接触させればよい。

〔３－２．第２の工程〕
上記第２の工程は、培養細胞と候補物質とを接触させる前後にて、当該培養細胞におけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現を比較する工程である。

上記第２の工程では、例えば、培養細胞Ｉを準備し、上記候補物質と接触させる前の培養細胞Ｉの一部を採取し、残りの培養細胞Ｉを上記候補物質と接触させる。次いで、予め採取した培養細胞Ｉにおけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現と、上記候補物質と接触させた培養細胞Ｉにおけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現とを比較してもよい。

上記第２の工程では、例えば、上記候補物質と接触させる培養細胞Ｉと、上記候補物質と接触させない培養細胞ＩＩとを別々に準備し、培養細胞Ｉにおけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現と、培養細胞ＩＩにおけるヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上の発現とを比較してもよい。

上記第２の工程において、培養細胞と候補物質とを接触させる前の当該培養細胞におけるヌクレオレドキシンの発現量をＡ’とし、培養細胞と候補物質とを接触させた後の当該培養細胞におけるヌクレオレドキシンの発現量をＢ’とする。例えば、「Ｂ’＞Ａ’」、「Ｂ’≧１．１×Ａ’」、「Ｂ’≧１．２×Ａ’」、「Ｂ’≧１．３×Ａ’」、「Ｂ’≧１．４×Ａ’」、「Ｂ’≧１．５×Ａ’」、「Ｂ’≧１．６×Ａ’」、「Ｂ’≧１．７×Ａ’」、「Ｂ’≧１．８×Ａ’」、「Ｂ’≧１．９×Ａ’」、「Ｂ’≧２．０×Ａ’」、「Ｂ’≧５．０×Ａ’」、「Ｂ’≧１０×Ａ’」、または、「Ｂ’≧１００×Ａ’」である場合に、当該候補物質は大動脈瘤の治療剤になり得ると判定することができる。

上記第２の工程において、培養細胞と候補物質とを接触させる前の当該培養細胞におけるDishevelledの発現量をＣ’とし、培養細胞と候補物質とを接触させた後の当該培養細胞におけるDishevelledの発現量をＤ’とする。例えば、「Ｃ’＞Ｄ’」、「０．９×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．８×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．７×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．６×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．５×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．４×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．３×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．２×Ｃ’≧Ｄ’」、「０．１×Ｃ’≧Ｄ’」、または、「０．０１×Ｃ’≧Ｄ’」である場合に、当該候補物質は大動脈瘤の治療剤になり得ると判定することができる。

〔４．大動脈瘤の治療剤〕
本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤は、ヌクレオレドキシン発現誘導剤、または、Dishevelled発現抑制剤を有効成分として含有する。本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤は、ヌクレオレドキシン発現誘導剤、および、Dishevelled発現抑制剤の両方を有効成分として含有してもよい。

上述した〔１．大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法〕、〔２．大動脈瘤の診断キット〕および〔３．大動脈瘤の治療剤のスクリーニング方法〕等にて説明した構成については、その説明を省略する。

上記ヌクレオレドキシン発現誘導剤は、ヌクレオレドキシンタンパク質の発現量を増加させ得るものであればよく、例えば、（ｉ）ヌクレオレドキシンのＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を誘導するもの、（ｉｉ）ヌクレオレドキシンのｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を誘導するもの、または、（ｉｉｉ）ヌクレオレドキシンのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の分解を抑制するもの、であってもよい。

上記Dishevelled発現抑制剤は、Dishevelledタンパク質の発現量を減少させ得るものであればよく、例えば、（ｉ）DishevelledのＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を抑制するもの、（ｉｉ）DishevelledのｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を抑制するもの、または、（ｉｉｉ）DishevelledのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の分解を誘導するもの、であってもよい。

上記ヌクレオレドキシン発現誘導剤、および、Dishevelled発現抑制剤は、限定されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、核酸、または、糖であってもよい。

上記ヌクレオレドキシン発現誘導剤としては、限定されず、例えば、ｔＢＨＱ（tert-ブチルヒドロキシキノン）、ＳＦＮ（Sulforaphane）、ＣＤＤＯ（2-cyano-3,12-dioxo-oleana-1,9(11)-dien-28-oic acid）を挙げることができる。

上記Dishevelled発現抑制剤としては、限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤に含有される有効成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００質量％とした場合に、０．００００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０００１質量％～１００質量％であってもよく、０．００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～９５質量％であってもよく、０．１質量％～９０質量％であってもよく、０．１質量％～８０質量％であってもよく、０．１質量％～７０質量％であってもよく、０．１質量％～６０質量％であってもよく、０．１質量％～５０質量％であってもよく、０．１質量％～４０質量％であってもよく、０．１質量％～３０質量％であってもよく、０．１質量％～２０質量％であってもよく、０．１質量％～１０質量％であってもよい。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤は、上述した有効成分以外の成分を含有していてもよい。

有効成分以外の成分は、特に限定されず、例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、溶媒、抗菌剤などであり得る。

上記緩衝剤としては、例えば、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε－アミノカプロン酸、トロメタモールが挙げられる。上記リン酸塩としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムが挙げられる。上記ホウ酸塩としては、例えば、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムが挙げられる。上記クエン酸塩としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムが挙げられる。上記酢酸塩としては、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムが挙げられる。上記炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。上記酒石酸塩としては、例えば、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウムが挙げられる。

上記ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。

上記等張化剤としては、例えば、イオン性等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）、非イオン性等張化剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール）が挙げられる。

上記防腐剤としては、例えば、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノールが挙げられる。

上記抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウムが挙げられる。

上記高分子量重合体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲンが挙げられる。

上記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースが挙げられる。

上記溶媒としては、例えば、水、生理的食塩水、アルコールが挙げられる。

上記抗菌剤としては、例えば、β-ラクタム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リンコマイシン系、クロラムフェニコール系、マクロライド系、ケトライド系、ポリペプチド系、グリコペプチド系の抗生物質；ピリドンカルボン酸（キノロン）系、ニューキノロン系、オキサゾリジノン系、サルファ剤系の合成抗菌薬が挙げられる。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤に含有される有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００質量％とした場合に、０質量％～９９．９９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９質量％であってもよく、５質量％～９９．９質量％であってもよく、１０質量％～９９．９質量％であってもよく、２０質量％～９９．９質量％であってもよく、３０質量％～９９．９質量％であってもよく、４０質量％～９９．９質量％であってもよく、５０質量％～９９．９質量％であってもよく、６０質量％～９９．９質量％であってもよく、７０質量％～９９．９質量％であってもよく、８０質量％～９９．９質量％であってもよく、９０質量％～９９．９質量％であってもよい。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤の剤型は、限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、内容液剤、外用剤、坐剤、注射剤、吸入剤を挙げることができる。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤の投与経路は、限定されず、例えば、非経口投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、硬膜外投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、経皮投与、直腸内投与、吸入、局所投与を挙げることができる。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤の投与間隔は、限定されず、例えば、１時間～６箇月間に１回であり、より具体的に、１時間に１回、２時間に１回、３時間に１回、６時間に１回、１２時間に１回、１日間に１回、２日間に１回、３日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１箇月間に１回、２箇月間に１回、３箇月間に１回、４箇月間に１回、５箇月間に１回、６箇月間に１回を挙げることができる。

本発明の一実施形態に係る大動脈瘤の治療剤の投与対象は、限定されず、例えば、ヒト、および、非ヒト動物（例えば、家畜、愛玩動物、および、実験動物）を挙げることができる。非ヒト動物としては、例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットを挙げることができる。

〔５．その他〕
本発明は、以下のように構成することもできる。

＜１＞被検体から採取した試料において、ヌクレオレドキシン、および、Dishevelledからなる群より選択されるいずれか１つ以上を検出する工程を含む、大動脈瘤の診断方法。

＜２＞ヌクレオレドキシン発現誘導剤、または、Dishevelled発現抑制剤を有効成分として含有する大動脈瘤の治療剤を被検体へ投与する工程を有する、大動脈瘤の治療方法。

＜３＞上記ヌクレオレドキシン発現誘導剤は、ｔＢＨＱ、ＳＦＮ、または、ＣＤＤＯである、＜２＞に記載の大動脈瘤の治療方法。

＜４＞上記Dishevelled発現抑制剤は、ｓｉＲＮＡである、＜２＞に記載の大動脈瘤の治療方法。

＜１．^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴ／ＭＲＩ＞
大動脈瘤の手術を予定している２名の患者（患者番号１および２）の基本的なデータを、周知の方法にしたがって取得した。

具体的には、当該患者について、「年齢」、「性別」、「大動脈瘤のタイプ」、「ＢｏｄｙＭａａｓｓＩｎｄｅｘ」、「ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｄｅｘ」、「アルコール」、「高血圧」、「糖尿病」、「異常脂質血症」、および、「^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積」に関するデータを、周知の方法にしたがって取得した。

特に、「^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積」に関するデータは、６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴ／ＭＲＩの手法（例えば、Xingyu et al., Circulation Cardiovascular Imaging, Volume 13, Issue 1, e009791, January 8, 2020, “⁶⁴Cu-ATSM Positron Emission Tomography/Magnetic Resonance Imaging of Hypoxia in Human Atherosclerosis”を参照）を用いて取得した。

以下の表に、２名の患者の基本的なデータを記載する。なお、下記の表の項目「アルコール」では、患者に飲酒の習慣がある場合を「＋」と記載し、患者に飲酒の習慣がない場合を「－」と記載する。下記の表の項目「高血圧」では、患者が高血圧である場合を「＋」と記載し、患者が高血圧でない場合を「－」と記載する。下記の表の項目「糖尿病」では、患者が糖尿病である場合を「＋」と記載し、患者が糖尿病でない場合を「－」と記載する。下記の表の項目「異常脂質血症」では、患者が異常脂質血症である場合を「＋」と記載し、患者が異常脂質血症でない場合を「－」と記載する。下記の表の項目「^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積」では、患者の体内に^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察される場合を「＋」と記載し、患者の体内に^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察されない場合を「－」と記載する。

^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴは、生体内の組織の中でも、特に酸化ストレスがかかっている組織に蓄積することが知られている。一方の患者（患者番号１）では、他方の患者（患者番号２）と比較して、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が多く観察された。

^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴが蓄積されている組織を更に詳細に観察したところ、胸部大動脈瘤の動脈壁（特に、胸部大動脈瘤の動脈壁のアテローム性プラーク、および、アテローム性プラークの近傍）において、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が顕著であった（図１の１０１を参照）。

また、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察された胸部大動脈瘤の動脈壁では、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察されない胸部大動脈瘤の動脈壁と比較して、有意に多数の粥腫（アテローム性プラーク）が認められた（図１の１０２を参照）。

なお、図１の１０２において、「Ｃａｓｅ１」は患者番号１の患者を示し、「Ｃａｓｅ２」は患者番号２の患者を示している。また、図１の１０２において、「ｎ」は、観察した胸部大動脈瘤の動脈壁のサンプル数を示している。また、図１の１０２において、「Ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓｐｌａｑｕｅａｒｅａ（％）」は、観察した胸部大動脈瘤の動脈壁の面積に対する、アテローム性プラークの面積の割合を示している。

＜２．アテローム性プラークの近傍における様々な分子の発現＞
^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察されない胸部大動脈瘤の動脈壁と、^６４Ｃｕ－ＡＴＳＭＰＥＴの蓄積が観察される胸部大動脈瘤の動脈壁とを、様々な分子を指標にして免疫染色および蛍光染色し、アテローム性プラーク、および、その近傍におけるこれらの分子の発現の変化を観察した。

上記分子としては、４－ＨＮＥ（4-hydroxyxynonenal）、ＮＲＸ（nucleoredoxin）、β－カテニン、Ｄｖｌ（Dishevelled）、ＯＰＧ（osteoprotegerin）、ＭＭＰ－２（matrix metalloproteinase-2）、ＭＭＰ－７（matrix metalloproteinase-7）、ＭＭＰ－９（matrix metalloproteinase-9）を用いた。なお、４－ＨＮＥは、生体内の酸化ストレスによって不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）から生成されるアルデヒドである。つまり、４－ＨＮＥは、酸化ストレスの指標である。

上記免疫染色および蛍光染色には、市販の染色キットを用いた。具体的な染色方法は、当該染色キットに備えられているプロトコールにしたがった。なお、上記分子のうち、４－ＨＮＥ以外の分子については、免疫染色および蛍光染色によって、タンパク質の発現レベルを検出した。

図２～図６に、免疫染色および蛍光染色の染色像を示す。

図２に示すように、（ｉ）アテローム性プラーク内およびその近傍では４－ＨＮＥの生成が多いこと（換言すれば、アテローム性プラーク内およびその近傍では、酸化ストレスが強いこと）、（ｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではＮＲＸの発現量が少ないこと、（ｉｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではβ－カテニンの発現量が多いこと、が明らかになった。

図３に示すように、（ｉ）アテローム性プラークの近傍ではＮＲＸの発現量が少ないこと、（ｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではＤｖｌの発現量が多いこと、（ｉｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではβ－カテニンの発現量が多いこと、が明らかになった。

図４に示すように、アテローム性プラークの近傍において、ＮＲＸの発現量が少ない領域と、β－カテニンの発現量が多い領域とは、同じ領域であることが明らかになった。

図５に示すように、（ｉ）アテローム性プラークの近傍ではＯＰＧの発現量が多いこと、（ｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではＭＭＰ－２の発現量が多いこと、（ｉｉｉ）アテローム性プラークの近傍ではＭＭＰ－７の発現量が多いこと、（ｉｖ）アテローム性プラークの近傍ではＭＭＰ－９の発現量が多いこと、が明らかになった。

図６に示すように、アテローム性プラークの近傍において、ＭＭＰ－２の発現量が多い領域と、β－カテニンの発現量が多い領域とは、同じ領域であることが明らかになった。

＜３．酸化ストレスによる様々な分子の発現量の変化＞
ヒト大動脈平滑筋細胞を培養する培養液に対して、所定の濃度（０μＭ、１０μＭ、または、５０μＭ）になるようにＨ_２Ｏ_２を加え、その後、当該ヒト大動脈平滑筋細胞を、所定の時間（３時間、または、８時間）培養した。なお、Ｈ_２Ｏ_２は、細胞に対して酸化ストレスを与える作用を有する。

培養の後、ヒト大動脈平滑筋細胞を回収し、周知のウエスタンブロット法によって、当該ヒト大動脈平滑筋細胞が発現する、ＮＲＸ、β－カテニン、および、β－アクチンのタンパク質の量を定量した。

図７に試験結果を示す。

図７の７０１に、ウエスタンブロット法によって、ＮＲＸ、β－カテニン、および、β－アクチンのタンパク質を検出した結果を示す。ＮＲＸは、培養液中のＨ_２Ｏ_２の濃度が高くなるにしたがって発現量が減少し、かつ、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養時間が長くなるにしたがって、発現量が減少した。一方、β－カテニンは、培養液中のＨ_２Ｏ_２の濃度が高くなるにしたがって発現量が増加し、かつ、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養時間が長くなるにしたがって、発現量が増加した。β－アクチンは、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養条件が変化しても、発現量に変化はなかった。

図７の７０２に、β－アクチンの発現量に対する、ＮＲＸの発現量の比を示す。図７の７０２からも、ＮＲＸは、培養液中のＨ_２Ｏ_２の濃度が高くなるにしたがって発現量が減少し、かつ、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養時間が長くなるにしたがって、発現量が減少することが理解できる。

図７の７０３に、β－アクチンの発現量に対する、β－カテニンの発現量の比を示す。図７の７０３からも、β－アクチンは、培養液中のＨ_２Ｏ_２の濃度が高くなるにしたがって発現量が増加し、かつ、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養時間が長くなるにしたがって、発現量が増加することが理解できる。

＜４．ＮＲＸの発現量の低下が他の分子の発現量に及ぼす影響＞
ＮＲＸの発現量を低下させるために、ヒト大動脈平滑筋細胞を培養する培養液に対して、所定の濃度になるようにＮＲＸのｓｉＲＮＡを加え、その後、当該ヒト大動脈平滑筋細胞を、所定の時間培養した。

培養の後、ヒト大動脈平滑筋細胞を回収し、周知のウエスタンブロット法によって、当該ヒト大動脈平滑筋細胞が発現する、ＮＲＸ、β－カテニン、ＯＰＧ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、β－アクチンのタンパク質の量を定量した。

図８および９に試験結果を示す。

図８の８０１に、ウエスタンブロット法によって、ＮＲＸ、β－カテニン、ＯＰＧ、および、β－アクチンのタンパク質を検出した結果を示す。ＮＲＸは、培養液中のＮＲＡのｓｉＲＮＡの濃度が高くなるにしたがって発現量が減少した。一方、β－カテニン、および、ＯＰＧは、培養液中のＮＲＡのｓｉＲＮＡの濃度が高くなるにしたがって発現量が増加した。β－アクチンは、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養条件が変化しても、発現量に変化はなかった。

図８の８０２に、β－アクチンの発現量に対する、ＮＲＸの発現量の比を示す。図８の８０２から、ＮＲＸは、培養液中のＮＲＸのｓｉＲＮＡの濃度が高くなるにしたがって発現量が減少することが理解できる。

図８の８０３に、β－アクチンの発現量に対する、β－カテニンの発現量の比を示す。図８の８０３から、β－カテニンは、ＮＲＸの発現量が減少するにしたがって発現量が増加することが理解できる。

図８の８０４に、β－アクチンの発現量に対する、ＯＰＧの発現量の比を示す。図８の８０４から、ＯＰＧは、ＮＲＸの発現量が減少するにしたがって発現量が増加することが理解できる。

図９の９０１に、ウエスタンブロット法によって、ＮＲＸ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、および、β－アクチンのタンパク質を検出した結果を示す。ＮＲＸは、培養液中のＮＲＡのｓｉＲＮＡの濃度が高くなるにしたがって発現量が減少した。一方、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、および、ＭＭＰ－９は、培養液中のＮＲＡのｓｉＲＮＡの濃度が高くなるにしたがって発現量が増加した。β－アクチンは、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養条件が変化しても、発現量に変化はなかった。

図９の９０２に、β－アクチンの発現量に対する、ＭＭＰ－２の発現量の比を示す。図９の９０２から、ＭＭＰ－２は、ＮＲＸの発現量が減少するにしたがって発現量が増加することが理解できる。

図９の９０３に、β－アクチンの発現量に対する、ＭＭＰ－７の発現量の比を示す。図９の９０３から、ＭＭＰ－７は、ＮＲＸの発現量が減少するにしたがって発現量が増加することが理解できる。

図９の９０４に、β－アクチンの発現量に対する、ＭＭＰ－９の発現量の比を示す。図９の９０４から、ＭＭＰ－９は、ＮＲＸの発現量が減少するにしたがって発現量が増加することが理解できる。

＜５．大動脈瘤の治療剤のスクリーニング＞
ヒト大動脈平滑筋細胞を培養する培養液に対して、所定の濃度になるようにｔＢＨＱ、ＳＦＮ、または、ＣＤＤＯを加え、その後、当該ヒト大動脈平滑筋細胞を、所定の時間培養した。なお、ｔＢＨＱを用いる場合には、培養液中のｔＢＨＱの濃度を、０μＭ、５μＭ、２０μＭ、または、１００μＭとした。ＳＦＮを用いる場合には、培養液中のＳＦＮの濃度を、０μＭ、１μＭ、１０μＭ、または、５０μＭとした。ＣＤＤＯを用いる場合には、培養液中のＣＤＤＯの濃度を、０ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、または、１．５ｎＭとした。

培養の後、ヒト大動脈平滑筋細胞を回収し、周知のウエスタンブロット法によって、当該ヒト大動脈平滑筋細胞が発現する、ＮＲＸ、および、β－アクチンのタンパク質の量を定量した。

図１０に試験結果を示す。図１０に、ウエスタンブロット法によって、ＮＲＸ、および、β－アクチンのタンパク質を検出した結果を示す。培養液中のｔＢＨＱの濃度を１００μＭとした場合、ＮＲＸの発現量が増加した。培養液中のＳＦＮの濃度を１μＭ、および、１０μＭとした場合、ＮＲＸの発現量が増加した。培養液中のＣＤＤＯの濃度を０．５ｎＭ、１ｎＭ、および、１．５ｎＭとした場合、ＮＲＸの発現量が増加した。

次いで、ＮＲＸの発現量を増加させる上記の化合物（ヌクレオレドキシン発現誘導剤）に関して、大動脈瘤の治療効果を確認した。

ＭＭＰ－２は、大動脈瘤の形成に関与することが知られている。このことは、ＭＭＰ－２の発現量を減少させることができる化合物は、大動脈瘤の治療効果を有することを示唆している。そこで、以下の試験では、ＮＲＸの発現誘導剤を代表してｔＢＨＱを用い、ｔＢＨＱがＭＭＰ－２の発現量を減少させる効果を有するか否か、換言すれば、ＢＨＱが大動脈瘤の治療効果を有するか否かを確認した。

ヒト大動脈平滑筋細胞を培養する培養液に対して、所定の濃度（５μＭ、２０μＭ、または、１００μＭ）になるようにｔＢＨＱを加え、その後、当該ヒト大動脈平滑筋細胞を、所定の時間培養した。

培養の後、ヒト大動脈平滑筋細胞を回収し、周知のウエスタンブロット法によって、当該ヒト大動脈平滑筋細胞が発現する、ＮＲＸ、ＭＭＰ－２、および、β－アクチンのタンパク質の量を定量した。

図１１に試験結果を示す。

図１１の１１０１に、ウエスタンブロット法によって、ＮＲＸ、ＭＭＰ－２、および、β－アクチンのタンパク質を検出した結果を示す。ＮＲＸは、培養液中のｔＢＨＱの濃度が高くなるにしたがって発現量が増加した。一方、ＭＭＰ－２は、培養液中のｔＢＨＱの濃度が高くなるにしたがって発現量が減少した。β－アクチンは、ヒト大動脈平滑筋細胞の培養条件が変化しても、発現量に変化はなかった。

図１０の１１０２に、β－アクチンの発現量に対する、ＮＲＸの発現量の比を示す。図１０の１１０２から、ＮＲＸは、培養液中のｔＢＨＱの濃度が高くなるにしたがって発現量が増加することが理解できる。

図１０の１１０３に、β－アクチンの発現量に対する、ＭＭＰ－２の発現量の比を示す。図１０の１１０３から、ＭＭＰ－２は、培養液中のｔＢＨＱの濃度が高くなるにしたがって発現量が減少することが理解できる。

本発明は、大動脈瘤の診断、大動脈瘤の治療剤のスクリーニング、大動脈瘤の治療に利用することができる。

Claims

被検体から採取した試料において、ヌクレオレドキシンを検出する工程を含み、
上記被検体から採取した試料は、上記被検体の、胸部大動脈、胸腹部大動脈、または、腹部大動脈から採取した試料である、大動脈瘤を診断するためのデータの取得方法。
ヌクレオレドキシンを検出するための部材を備えている、胸部大動脈、胸腹部大動脈、または、腹部大動脈から採取した試料から大動脈瘤を診断するための、大動脈瘤の診断キット。