JP7745891B2 - 新規血管障害治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、シロリムスを有効成分として含む血管障害の治療剤に関する。

血管障害は、種々の重篤な症状を引き起こす場合がある。特に末梢血管における血管障害は、レイノー現象や壊死などを呈し、患者ＱＯＬを著しく低下させ、末梢に限らず各組織で重篤な症状を来す場合には死に至る場合もある。そのため、全身を司る血管障害の治療は、非常に重要である。

従来、レイノー現象を始めとする末梢血管障害または血流障害の多くは、細胞外基質の異常蓄積による、毛細血管の脱落、低酸素による機能低下等が原因であると考えられてきた。これに至る原因は様々な仮説があるが、直接的な原因は不明である。環境要因や外的刺激、または体内の免疫異常等、何らかの理由がトリガーとなり血管内皮細胞および血管平滑筋細胞に異常を来すとされ、過剰に産生された細胞外基質の中でもコラーゲンタンパク質の蓄積が血管壁の肥厚の一因であると考えられている（例えば、非特許文献１）。

現在までにおいて、血管障害の治療は、血管拡張作用を有する薬剤の投与を初めとする対症療法が行われており、根本的に疾患の原因を取り除くといった処置（根治療法）は行われていなかった。少なくとも、血管における細胞外基質蓄積に対して直接的に作用する薬剤は見当たらない。

レイノー現象を始めとする末梢血管障害は、強皮症に伴って発生することがあるが、強皮症治療ガイドライン（日本皮膚科学会 全身性強皮症診療ガイドライン）には、強皮症に伴う肺高血圧症の基礎療法として、ジゴキシンを含むジギタリス製剤による療法が記載されている。

Ａｒｍａｎｄｏ Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００９；３６０（１９）：１９８９－２００３

血管障害の治療においては、根本的に疾患の原因を取り除くといった処置を行うことが好ましいといえるが、現在までのところ、そのような処置が可能な薬剤は開示されていない。また、強皮症に伴って発生する末梢血管障害に関する薬剤も開示されていない。本発明は、このような状況に鑑み、細胞外基質異常蓄積、特にＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌が一因となる末梢の血管障害を効果的に治療する薬剤を提供することを目的とした。

本発明者らは検討の結果、血管障害を呈する患者ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞において、主にＩＶ型コラーゲン遺伝子が高発現していることを、初めて見出した。ＩＶ型コラーゲンタンパク質は主に血管内皮細胞に隣接する基底膜に豊富に存在し、血管内皮細胞によって合成および分泌される。そして、血管内皮細胞にシロリムスを作用させることにより、血管内皮細胞におけるＩＶ型コラーゲンタンパク質の合成および分泌を効果的に抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、以下［１］～［５］である。
［１］シロリムスを有効成分として含む、ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害の治療剤。
［２］シロリムスを有効成分として含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌により引き起こされる疾患の治療剤。
［３］シロリムスを有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む、ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害治療用の医薬組成物。
［４］シロリムスを有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌により引き起こされる疾患治療用の医薬組成物。
［５］シロリムスを有効成分として含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌抑制剤。

本発明によると、血管内皮細胞におけるＩＶ型コラーゲンタンパク質の合成および分泌を抑制することが可能となり、コラーゲンを含む細胞外基質の過剰蓄積に伴い生じる末梢血管障害等の血管障害を効果的に治療することができる。

健康成人および強皮症患者由来の血管内皮細胞（１症例、２つの細胞ライン）におけるＩＶ型コラーゲン遺伝子の発現状況の確認結果を示す図である。ＣＯＬ４Ａ１は、ＩＶ型コラーゲンα１遺伝子、ＣＯＬ４Ａ２は、ＩＶ型コラーゲンα２遺伝子、ＣＯＬ４Ａ５は、ＩＶ型コラーゲンα５遺伝子、ＣＯＬ４Ａ６は、ＩＶ型コラーゲンα６遺伝子をそれぞれ示す。 培地中におけるシロリムスの有無によるＩＶ型コラーゲンタンパク質量の違いを示す図である。 培地中におけるジゴキシンの有無によるＩＶ型コラーゲンタンパク質量の違いを示す図である。

本発明は、シロリムスを有効成分として含む、
［１］ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害の治療剤、
［２］ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌により引き起こされる疾患の治療剤、
［３］ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害治療用の医薬組成物、
［４］血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌により引き起こされる疾患治療用の医薬組成物、および
［５］血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌抑制剤
に関する。

シロリムス（別名：ラパマイシン）は、イースター島の土壌から分離された放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの代謝産物であり、１９７０年代にマクロライド系抗生物質として見出された。その後、シロリムスは免疫抑制作用を有することが明らかとなり、世界５５ヵ国で腎移植後の拒絶反応を抑える医薬品として承認されている。

本発明に係る、ＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害の治療剤の治療対象となる血管障害は、典型的には末梢血管障害であるが、それに限定されない。例えば、強皮症を原因として発症する血管障害の様に、コラーゲンを含む細胞外基質の過産生によって引き起こされる血管障害等は、本発明に係る治療剤の治療対象となり得る。具体的には、強皮症の典型症状の一つであるレイノー症候群や、それに伴う肺高血圧症、間質性肺疾患、消化器系の線維化、腎臓の線維化、心臓の線維化、その他の血管病変等が挙げられる。

本発明に係る、シロリムスを有効成分として含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌により引き起こされる疾患の治療剤において、疾患は、下記（１）～（３）から選ばれる。
（１）強皮症に起因して発症した末梢血管障害
（２）レイノー症候群
（３）レイノー症候群に伴う次の疾患：肺高血圧症、間質性肺疾患、消化器系の線維化、腎臓の線維化、心臓の線維化、またはその他の血管病変

本発明に係る医薬組成物は、有効成分であるシロリムスの他、薬学的に許容される担体を含み、経口剤または患部に外部から直接塗布して用いる外用剤の形態で、用いることができる。特に、全身性の疾患を原因として血管障害を発症している治療対象（患者）に対しては、経口剤の形態にて用いることが好ましい。そのような医薬組成物は、従来公知の方法で製造することができる。

本発明に係る経口剤は、例えば錠剤、口腔内崩壊錠剤、カプセル剤、または顆粒剤とすることができる。経口剤には、有効成分であるシロリムスの効果を妨げない範囲で、通常用いられる賦形剤、添加剤、および／または媒体等の薬学的に許容される担体を含む。そのような薬学的に許容される担体としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、安定化剤、酸化防止剤、コーティング剤、甘味料、着色剤、および芳香剤等から選ばれる担体を使用可能である。

使用可能な担体として、具体的には、結合剤としては、無水乳糖、乳糖水和物、結晶セルロース、マンニトール、マクロゴール４００、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、モノオレイン酸グリセリン、硫酸カルシウム等を、結合剤としては、デキストラン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、部分α化デンプン、カルメロースナトリウムおよびヒプロメロース等を、崩壊剤としては、カルボキシメチルスターチナトリウム等を、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素等を、可塑剤としては、クエン酸トリエチル、プロピレングリコール等を、界面活性剤としては、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０等を、安定化剤としては、キサンタンガム、ポリビニルピロリドン、尿素等を、酸化防止剤としては、パラオキシ安息香酸ブチル、トコフェロール、アスコルビン酸等を、コーティング剤としては、オイドラギッド、カルナウバロウ、ヒプロメロース、またはその誘導体等を、甘味料としては、キシリトール等を、着色剤としては、酸化チタン等を、および芳香剤としては、メントール等を、それぞれ例示することができる。

本発明に係る外用剤は、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、またはゲル剤等の一般に用いられる形態とすることができる。そのような外用剤は、有効成分であるシロリムスを適当な溶媒に溶解、または分散させた上で、ゲル化剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤といった、通常用いられる賦形剤や添加剤等の薬学的に許容される担体を配合させたものとすることができる。

用法・用量
本発明に係る治療剤の一態様である経口剤は、水と共に服用する等、通常の経口剤と同様の方法にて使用することができる。用量は、対象疾患の種類、あるいは疾患の重症度や治療対象（患者）の状態により、適宜決定される。通常は、成人に対してシロリムスとして１日あたり１～４ｍｇを、経口投与する。

本発明に係る治療剤の一態様である外用剤は、患部に直接塗布するといった、皮膚疾患等に用いる通常の外用剤と同様の方法にて使用することができる。用量は、対象疾患の種類、あるいは疾患の重症度や治療対象（患者）の状態により、適宜決定される。通常は、成人に対してシロリムスとして１日あたり０．１～２ｍｇに相当する量を、患部周辺の皮膚に直接塗布して用いることができる。

以下に具体的な実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明はその実施形態に限定されるものではなく、それらにおける様々な変更および改変が当業者によって、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく実行され得ることが理解される。

（実施例）
（１）患者ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞の培養
細胞は、熊本大学にて樹立済みの健康成人および強皮症患者由来のｉＰＳ細胞を用いた（Ｚｈｏｎｇｚｈｉ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．， ＪＤＳ ２０１６ Ｎｏｖ；８４（２）：１８６－１９６．）。強皮症は、その症状として、末梢血管障害の一つであるレイノー症候群を招来することが知られているため、血管障害モデル細胞として採用した。

健康成人および強皮症患者由来のｉＰＳ細胞につき、表１記載の条件下で培養することにより、血管内皮細胞への分化誘導を行った。

得られた細胞はフローサイトメトリーを用いて、血管内皮細胞マーカーであるＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤ１４４）、ＰＥＣＡＭ－１（ＣＤ３１）陽性細胞のみを分取した。分取した細胞の形態と前記マーカー遺伝子発現から、分取した細胞が血管内皮細胞であることを確認した。

分取した健康成人および強皮症患者ｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞を、表２下段に示す１０％ＦＢＳ含有Ｈｕｍｅｄｉａ ＥＢ－２＋Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ培地（以下、有血清培地）にて培養し、３継代まで拡張した。培養した細胞を、同培地を用いて約１×１０^５個ずつ６ウェルプレート（Ｉ型コラーゲンコート済み）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１日培養した。

細胞がプレート底部に定着したことを確認後、上清の培地を除去し、プレート内の培地をＰＢＳで洗浄した。全体を２つに分け、ＲＮＡ回収用の細胞に対しては、有血清培地を用いて、溶媒対照物質としてＤＭＳＯを０．２５％含有または、被験物質１としてシロリムス１μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯを０．２５％含有条件の培地を調製した。また、細胞上清中タンパク質回収用の細胞に対しては、表２上段のＦＢＳを含まないＨｕｍｅｄｉａ ＥＢ－２＋Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ培地（以下、無血清培地）を用いて、上記と同様の条件になるように培地調製を行った。調製した各培地を細胞が生着したプレートに添加し、３日間３７℃、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーターで培養した。

（２）血管内皮細胞におけるＩＶ型コラーゲン遺伝子発現の確認
上記（１）で得られた培養細胞のうち、有血清培地にて培養した細胞を用いて、以下の手順により、健康成人および強皮症患者ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞における、ＩＶ型コラーゲン遺伝子の発現量を確認した。

３日間の培養後、プレートから上清（培地）を取り除き、ＰＢＳを用いてプレート内を洗浄した。ＲＮＡ抽出試薬（製品名：Ｓｅｐａｓｏｌ（Ｒ）－ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇ 、ナカライテスク製）を加え、細胞を回収した後、細胞懸濁液を容器に移した。そこへクロロホルムを加え攪拌し、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。その後、分離したクロロホルム層のみを別容器に分取し、エタノール沈殿法を用いてＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡから、逆転写酵素（製品名：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ 製）を用いてｃＤＮＡを合成し、蛍光試薬（製品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（Ｒ）ＳＹＢＲ（Ｒ） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ、東洋紡製）を用いて、ｑＰＣＲ法にてＩＶ型コラーゲン遺伝子の発現量を確認した。

結果を、図１に示す。強皮症患者由来の血管内皮細胞では、健康成人由来の血管内皮細胞と比較して、ＩＶ型コラーゲン遺伝子（特に、ＩＶ型コラーゲンα５遺伝子およびα６遺伝子）が、多く発現していることが確認された。前述したように、強皮症患者では、その典型的症状の一つとして、末梢血管障害の一つであるレイノー症候群を発症することが知られている。従ってこの結果は、ＩＶ型コラーゲン遺伝子の高発現が血管壁の肥厚に関わることを強く示唆する結果である。

（３）血管内皮細胞におけるＩＶ型コラーゲンタンパク質の合成および分泌に対するシロリムスの影響の確認
上記（１）において、無血清培地にて培養した細胞上清を用いて、下記の方法にて培地中に放出されたＩＶ型コラーゲンタンパク量を定量した。
まず、培地中に放出されたタンパク質の濃縮を行った。この操作は、血清中に含まれるタンパク質の影響を考え、無血清下で培養を行う必要がある。３日間、無血清培地下で培養した細胞の細胞上清のみを回収した後、そこへ回収した培地の４倍量の冷却アセトンを加え、－２０℃にて一晩静止した。翌日、４℃、１０００Ｇで１０分遠心分離を行った後、上清を除去し、沈殿物に７５％エタノールを加え攪拌し、再び同様の条件による遠心分離を行った。エタノールを除去後、沈殿物を乾燥させ、ＲＩＰＡバッファーにて溶解し、各サンプルをタンパク質定量試薬（ブラッドフォード プロテインアッセイ、バイオ・ラッド製）を用いて、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度になるよう調整を行った。調整後、９５℃のヒートブロックにてタンパク質変性をさせ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。各サンプルをゲル（スーパーセップ^ＴＭエース ５－１２％、富士フイルム和光純薬製）にアプライし、泳動後、メンブレン（イモビロン－Ｐ メンブレン、メルク製）に転写した。一次抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｔｙｐｅ ＩＶ Ｃｏｌｌａｇｅｎ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二次抗体にはＨＲＰ標識抗体（バイオ・ラッド製）を用いた。抗体反応後、ＨＲＰ化学発光試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｒ） ウェスタンブロッティング検出試薬、メルク製）を用いてルミノ・イメージアナライザー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ｍｉｎｉ、ＧＥヘルスケア・ジャパン製）にてＩＶ型コラーゲンタンパク質を検出した。

結果を、図２に示す。この図に示すように、被験物質１（シロリムス）を含有させた培地では溶媒対照培地に比べて、ＩＶ型コラーゲンタンパク質の量が、優位に少なかった。これは、シロリムスを含有させることにより、血管内皮細胞内におけるＩＶ型コラーゲンタンパク質の合成および分泌を抑制したことを示す結果である。上述したように、強皮症は、何らかの原因により血管壁の肥厚を来すことから、上記（２）に示した我々の実験結果と合わせると、この障害は、血管内皮細胞でのＩＶ型コラーゲン遺伝子の高発現が一因を担っていることが示唆され、且つ、シロリムスは、ＩＶ型コラーゲンタンパク質量を減少させる効果があることから、本薬剤は、レイノー症候群等のコラーゲンを含む細胞外基質の過産生が起因となり生じる末梢血管障害の治療剤として、有効に働くことが示された。

（比較例）
上記（１）において被験物質１を含有させた培地の代わりに被験物質２（ジゴキシン）１０ｎｍｏｌ／Ｌを含有させた培地を用いて実施例と同様の操作を行い、ジゴキシンの存在がＩＶ型コラーゲンの発現に与える影響を確認した。

結果を、図３に示す。この図に示すように、ジゴキシンを含有させた培地では培地中のＩＶ型コラーゲンタンパク質量はほとんど減少しておらず、ジゴキシンは末梢血管障害の治療効果は低いことが示唆された。ジゴキシンを含むジギタリス製剤は強皮症に伴う肺高血圧症の基礎療法として強皮症治療ガイドライン（日本皮膚科学会 全身性強皮症診療ガイドライン）に記載がある。また、ジゴキシンを含む強心配糖体の類似物質の線維化疾患に対する効果は複数の発刊物等で報告がなされている。我々の得た結果は、このような従来からの知見に反し、少なくとも末梢血管障害に対しては、ジゴキシンの効果は期待できず、一方で、ガイドラインにおいて治療効果の記載も示唆もされていないシロリムスが、ＩＶ型コラーゲンを含む細胞外基質の過産生が起因となる末梢血管障害の治療に対しては効果を奏することを示すものである。

Claims (7)

1. シロリムスを有効成分として含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンα５およびα ６遺伝子の高発現によるＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害の治療剤。
2. 血管障害が、強皮症に起因して発症したものである、請求項１に記載の治療剤。
3. 血管障害が、末梢血管障害である、請求項１または２に記載の治療剤。
4. 末梢血管障害が、レイノー症候群、またはレイノー症候群に伴う肺高血圧症、間質性肺疾患、消化器系の線維化、腎臓の線維化、心臓の線維化、およびその他の血管病変から選ばれる請求項３に記載の治療剤。
5. シロリムスを有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む、血管内皮細 胞からのＩＶ型コラーゲンα５およびα６遺伝子の高発現によるＩＶ型コラーゲンタンパ ク質の過剰な合成および分泌に伴う血管障害治療用の医薬組成物。
6. 経口剤、または外用剤である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. シロリムスを有効成分として含む、血管内皮細胞からのＩＶ型コラーゲンα５およびα ６遺伝子の高発現によるＩＶ型コラーゲンタンパク質の過剰な合成および分泌抑制剤。