JP7748732B2 - 肺細胞増殖および分化のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９０６，２４１号に基づく優先権を主張しており、その内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府の資金に関する説明文
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）助成金番号ＵＣ６－ＡＩ０５８６０７、ＡＩ１３２１７８およびＡＩ１４９６４４を受けて、政府支援の下で為された。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

配列表に関する記載
配列表のコンピュータ可読形式は、電子提出によって本出願と共に出願されており、その全体が参照により本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名「２０－１３２４－ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＥＱ．ｔｘｔ」を有する２０２０年９月２５日に作成された１０ｋｂのサイズのファイルに含有される。

背景
分野
本開示は、オルガノイド培養物において肺幹細胞および前駆細胞を成長するためのシステムおよび方法、ならびにこれを使用する方法を提供する。

関連技術の説明
組織再生は、周囲の環境によってガイドされる幹細胞および前駆細胞集団の協調した活性によって組織化される。傷害後に、前駆体は、静止状況から、迅速に増殖するかまたは機能的な分化細胞へと分化する活性化状況へと移行する。一部の組織において、前駆体は、中間的な一過性の増幅する細胞を生成し、これは、分化を起こす前に、より多くの細胞を迅速に生成する。微小環境内の複数の因子と共に全身性の因子が、前駆細胞の運命を指示することが公知である。例えば、慢性炎症、加齢、過剰細胞外基質（ＥＣＭ）沈着は、欠損再生に高頻度で関連し、これは一部の場合では、組織変性を生じ、最終的に線維症へと進行する。したがって、損傷した組織を修復するために幹細胞および前駆細胞が経る細胞状況、およびこのような細胞の軌道における微小環境の影響の理解は、臨床的有意性がある。

肺において、肺胞上皮の恒常性における維持および傷害後の再生は、サーファクタント産生立方状２型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ２）によって支えられ、ＡＥＣ２は、自己再生し、薄く平坦でありかつガス交換する１型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ１）へと分化することができる。ＡＥＣ２はまた、新型コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のウイルスおよび病原体に対する防御の最前線の提供において鍵となる役割を果たす。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答してヒトＡＥＣ２において調節不全となる経路の性質、およびこのような経路がどのように他の形態の防御機構と交差するのかは、現在公知ではない。ＡＥＣ２が、抗ウイルス防御機構を活性化しつつ、幹細胞特徴を維持するか否かおよびこれをどのように維持するのかもまた、不明である。

近年の研究は、活性ｗｎｔシグナル伝達について濃縮され、近隣のｗｎｔ不活性ＡＥＣ２と比較してより高い「幹細胞性」を有する、ＡＥＣ２のサブセットを同定した。肺胞前駆細胞サブセットの斯かる差は、明らかに、微小環境シグナルの差が原因である。この場合、ｗｎｔ活性ＡＥＣ２は、ＡＥＣ２におけるｗｎｔシグナル伝達を活性化するためのリガンドを産生するＰＤＧＦＲａ発現肺胞線維芽細胞の近傍にある。立方状のＡＥＣ２から薄く極端に平坦なＡＥＣ１への変換は、細胞の形状、構造および機械的特性に対する劇的な変化を要求する。近年の研究は、ＡＥＣ２増殖および分化に関与するＷｎｔ、ＢＭＰ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦ、ＹＡＰ、ＮＦｋＢ等を含む経路について記載してきたが、そのＡＥＣ１への分化の際にＡＥＣ２が経る移行的な細胞状況は、理解が困難である。加えて、斯かる移行における微小環境変化の影響は、欠損再生の文脈において重要である。実際に、近年の研究は、持続したＮｏｔｃｈシグナル伝達が、ＡＥＣ２からＡＥＣ１への移行を遮断し得ることを明らかにした。

斯かる細胞状況移行およびこのようなプロセスを制御する機構の解明は、扱い易いモデルの欠如によって大部分が妨げられる。肺胞球（ａｌｖｅｏｌｏｓｐｈｅｒｅ）においてＡＥＣ２を増殖させ、ＡＥＣ１へと分化させることができるが、オルガノイドもしくは三次元培養または肺胞球モデルにおけるＡＥＣ２の増殖、維持、または分化のいずれかのための規定された条件の欠如は、これらの研究を限定している。

成体ＡＥＣ２に由来するオルガノイド培養物は、これらの問題に取り組む機会を提供する。現在の条件は、肺胞幹細胞ニッチから単離されたＰＤＧＦＲａ＋線維芽細胞または胎児組織から単離された肺内皮細胞とＡＥＣ２の共培養を要求する。加えて、現在の培養培地は、規定が不十分であり、ウシ（ｂｏｖｉｎｅまたはｃａｌｆ）胎仔血清およびウシ下垂体抽出物に由来する未知の因子を含有する。斯かる複雑な条件は、ＡＥＣ２が選択的に増殖され得るかまたはＡＥＣ１へと分化され得る、モジュレートシステムを提供しない。したがって、規定された培養条件が、細胞型特異的効果の研究に、また、疾患を処置するための薬物を発見するためのハイスループット薬理ゲノミクス研究に必要とされる。

ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイド培養物における肺幹細胞増殖、維持および分化のための化学的に規定された条件が本明細書に記載されている。

開示の簡単な要旨
本開示は、一部には、本発明者らによる、培養において未知の成長構成成分の使用もフィーダー細胞の使用も要求しない、３次元培養物（オルガノイド）における肺幹細胞の成長のための化学的に規定された培養システムの発見に基づく。

本開示の一態様は、無血清培地および細胞外基質構成成分を含む２型肺胞上皮細胞培養培地であって、化学的に規定されており、かつ間質不含である、培養培地を提供する。

本開示の一部の実施形態では、無血清培地および細胞外基質構成成分は、約１：１の比で混合される。

本開示の一部の実施形態では、細胞外基質構成成分は、ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｉ型コラーゲン、Ｃｕｌｔｒｅｘ増殖因子低減基底膜、Ｒ型またはヒト型ラミニンである。

一部の実施形態では、本開示の無血清培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ヘパリン、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ１０、Ｙ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、ＨＥＰＥＳ、Ｎ－アセチルシステイン、抗生物質－抗真菌薬、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の成長栄養素を含む。

本開示の一部の実施形態では、培地は、２型肺胞上皮細胞培養増殖培地である。本開示の一部の実施形態では、増殖培地は、ＩＬ－１β、ＴＮＦαおよびこれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαは、マウスに由来することができる。

本開示の別の態様は、本開示の増殖培地を含む２型肺胞上皮細胞培養維持培地であって、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤をさらに含む維持培地を提供する。

本開示の一部の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ノギン、ＤＭＨ－１、コーディン、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、クロスベインレス（ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＵＳＡＧ－１およびフォリスタチン、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。

本開示の別の態様は、２型肺胞上皮細胞培養分化培地であって、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ヘパリン、ＥＦＧ、ＦＧＦ１０、抗生物質－抗真菌薬（ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）、および／またはこれらの組合せからなる群から選択される成長培地構成成分のうち少なくとも１種を含む分化培地を提供する。

一部の実施形態では、分化培地は、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）を含む。他の実施形態では、分化培地は、無血清培地である。

一部の実施形態では、本開示の分化培地は、ＴＧＦβおよびｐ３８キナーゼの阻害剤を含有しない。

一部の実施形態では、本開示の分化培地は、ＩＬ－６を含む。

本開示のさらに別の態様は、肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムであって、本開示の培地において培養された単離された肺胞上皮細胞を含むシステムを提供する。一部の実施形態では、肺胞上皮細胞は、２型肺胞上皮細胞を含む。

本開示のさらに別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイド培養物において２型肺胞上皮細胞を増殖、維持および／または分化させる方法であって、２型肺胞上皮細胞を得るステップと、本開示のいずれかの培地において細胞を培養するステップとを含む方法を提供する。

本開示の一部の実施形態では、サイトカインは、培養の最初の約４日間にわたり培養培地に添加される。

本開示の一部の実施形態では、２型肺胞上皮細胞は、対象における生着に十分な量で増殖される。本開示の一部の実施形態では、２型肺胞上皮細胞は、収集され、対象に注射される。

本開示の一部の実施形態では、オルガノイド培養物は、遺伝子編集または肺疾患モデル化のための使用に十分な量で増殖される。

本開示のさらに別の態様は、線維芽細胞の非存在下で肺腫瘍細胞を培養する方法であって、対象から腫瘍細胞を単離するステップと、腫瘍細胞を、本開示の増殖培地と接触させるステップとを含む方法を提供する。

本開示のさらに別の態様は、病原体に感染した肺胞球を培養する方法であって、本開示の増殖培地により肺細胞を培養するステップと、肺細胞を感染するのに有効な量で、病原体を肺細胞に接種するステップとを含む方法を提供する。

本開示のさらに別の態様は、オルガノイド培養物において病原体感染を処置または予防することができる薬剤を同定するための方法であって、ｉ）本開示の増殖培地において細胞を培養するステップと、ｉｉ）細胞を感染するのに有効な量で、病原体を細胞に接種するステップと、ｉｉｉ）細胞を薬剤と接触させるステップと、ｉｖ）薬剤が、薬剤で処置されなかった細胞と比べて、細胞における病原体の量の低減を引き起こすか決定するステップとを含む方法を提供する。

上述の方法の一部の実施形態では、ステップｉｉｉは、必要に応じてステップｉｉの前に行われる。

本開示の一部の実施形態では、病原体は、細菌（例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウイルス（例えば、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスまたはエンテロウイルス）または真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ））である。

本開示の一部の実施形態では、細胞は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞、クラブ（ｃｌｕｂ）バリアント細胞、肺胞上皮前駆細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系譜（ｌｉｎｅａｇｅ）陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺導管細胞、人工多能性幹細胞由来肺幹細胞または肺胞２型上皮である。

本開示のさらに別の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺胞球におけるウイルス力価を低減する方法であって、肺胞球がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に、肺胞球を薬剤と接触させるステップを含み、肺胞球が、薬剤と接触されなかった肺胞球と比べて低減されたウイルス力価を示す、方法を提供する。

本開示の一部の実施形態では、薬剤は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮαおよびＩＦＮγ）である。

本開示のさらに別の態様は、肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、本開示の培地と、使用のための説明書とを含むキットを提供する。

本開示のさらに別の態様は、オルガノイド培養物において細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、本開示の培地と、使用のための説明書とを含むキットを提供する。

本開示のさらに別の態様は、オルガノイド培養物またはその派生物においてｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、本開示の培地と、使用のための説明書とを含むキットを提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
無血清培地および細胞外基質構成成分を含む２型肺胞上皮細胞培養培地であって、化学的に規定されており、かつ間質不含である、培養培地。
（項目２）
前記無血清培地および前記細胞外基質構成成分が、約１：１の比で混合されている、項目１に記載の培地。
（項目３）
前記細胞外基質構成成分が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｉ型コラーゲン、Ｃｕｌｔｒｅｘ増殖因子低減基底膜、Ｒ型またはヒト型ラミニンである、項目３に記載の培地。
（項目４）
前記無血清培地が、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ヘパリン、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ１０、Ｙ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、ＨＥＰＥＳ、Ｎ－アセチルシステイン、抗生物質－抗真菌薬、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の成長栄養素を含む、先行する項目のいずれかに記載の培地。
（項目５）
前記無血清培地が、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ヘパリン、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ１０、Ｙ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、ＨＥＰＥＳ、Ｎ－アセチルシステインおよび抗生物質－抗真菌薬を含む、項目４に記載の培地。
（項目６）
無血清培地およびＭａｔｒｉｇｅｌの１：１混合物を含む２型肺胞上皮細胞培養培地であって、前記無血清培地が、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２における１０μＭ ＳＢ４３１５４２、３μＭ ＣＨＩＲ ９９０２、１μＭ ＢＩＲＢ７９６、５μｇ／ｍｌヘパリン、５０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌマウスＦＧＦ１０、１０ｎＭ Ｙ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、２％Ｂ２７、１％Ｎ２、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチルシステインおよび１％抗生物質－抗真菌薬を含み、前記培地が、間質不含である、培養培地。
（項目７）
前記Ｍａｔｒｉｇｅｌが、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５４２３０である、項目３に記載の培地。
（項目８）
前記培地が、２型肺胞上皮細胞培養増殖培地である、先行する項目のいずれかに記載の培地。
（項目９）
前記培地が、ＩＬ－１β、ＴＮＦαおよびこれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、項目８に記載の増殖培地。
（項目１０）
前記ＩＬ－１βが、マウスＩＬ－１βを含む、項目８に記載の増殖培地。
（項目１１）
前記ＴＮＦαが、マウスＴＮＦαを含む、項目８に記載の増殖培地。
（項目１２）
前記ＩＬ－１βが、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、項目８に記載の増殖培地。
（項目１３）
前記ＴＮＦαが、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、項目８に記載の増殖培地。
（項目１４）
項目１～１３のいずれかに記載の増殖培地を含む２型肺胞上皮細胞培養維持培地であって、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤をさらに含む、維持培地。
（項目１５）
前記ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、ＤＭＨ－１、コーディン、グレムリン、クロスベインレス、ＬＤＮ１９３１８９、ＵＳＡＧ－１およびフォリスタチン、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、項目１４に記載の維持培地。
（項目１６）
前記ノギンが、マウスノギンを含む、項目１４に記載の維持培地。
（項目１７）
前記ノギンが、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、項目１５または１６のいずれかに記載の維持培地。
（項目１８）
前記ＤＭＨ－１が、約１μＭの濃度である、項目１７に記載の維持培地。
（項目１９）
２型肺胞上皮細胞培養分化培地であって、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ヘパリン、ＥＦＧ、ＦＧＦ１０および抗生物質－抗真菌薬、ならびに／またはこれらの組合せからなる群から選択される成長培地構成成分のうち少なくとも１種を含む、分化培地。
（項目２０）
前記培地が、血清をさらに含む、項目１９に記載の分化培地。
（項目２１）
前記培地が、ウシ胎仔血清またはヒト血清をさらに含む、項目１９に記載の分化培地。
（項目２２）
前記培地が、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ヘパリン、ＥＦＧ、ＦＧＦ１０、ウシ胎仔血清および１％抗生物質－抗真菌薬を含む、項目１８または２１に記載の分化培地。
（項目２３）
前記培地が、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、約５μｇ／ｍｌヘパリン、約５ｎｇ／ｍｌヒトＥＦＧ、約１ｎｇ／ｍｌマウスＦＧＦ１０、約１０％ウシ胎仔血清および約１％抗生物質－抗真菌薬を含む、項目２２に記載の分化培地。
（項目２４）
ＴＧＦβおよびｐ３８キナーゼの阻害剤を含有しない、項目１９～２３のいずれかに記載の分化培地。
（項目２５）
前記培地が、ＩＬ－６を含む、項目１９に記載の分化培地。
（項目２６）
前記培地が、１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、項目２５に記載の分化培地。
（項目２７）
前記培地が、無血清培地である、項目１９に記載の分化培地。
（項目２８）
肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムであって、項目１～２５のいずれかに記載の培地において培養された単離された肺胞上皮細胞を含むシステム。
（項目２９）
前記肺胞上皮細胞が、２型肺胞上皮細胞を含む、項目２８に記載のシステム。
（項目３０）
ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイド培養物において２型肺胞上皮細胞を増殖、維持および／または分化させる方法であって、２型肺胞上皮細胞を得るステップと、項目１～２７のいずれかに記載の培地において前記細胞を培養するステップとを含む方法。
（項目３１）
サイトカインが、培養の最初の約４日間の間に前記培養培地に添加される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記２型肺胞上皮細胞が、対象における生着に十分な量で増殖される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記２型肺胞上皮細胞が、収集され、対象に注射される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記オルガノイド培養物が、遺伝子編集または肺疾患モデル化のための使用に十分な量で増殖される、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
線維芽細胞の非存在下で肺腫瘍細胞を培養する方法であって、対象から腫瘍細胞を単離するステップ、前記腫瘍細胞を、項目１～１３のいずれかに記載の増殖培地と接触させるステップを含む方法。
（項目３６）
病原体に感染した肺胞球を培養する方法であって、項目７～２７のいずれかに記載の増殖培地により肺細胞を培養するステップと、前記肺細胞を感染するのに有効な量で病原体を前記肺細胞に接種するステップとを含む方法。
（項目３７）
オルガノイド培養物において病原体感染を処置または予防することができる薬剤を同定するための方法であって、
ｉ）項目１～２７のいずれかに記載の増殖培地において前記細胞を培養するステップと、
ｉｉ）前記細胞を感染するのに有効な量で病原体を前記細胞に接種するステップと、
ｉｉｉ）前記細胞を薬剤と接触させるステップと、
ｉｖ）前記薬剤が、前記薬剤で処置されなかった細胞と比べて、前記細胞における前記病原体の量の低減を引き起こすか決定するステップと
を含む方法。
（項目３８）
前記ステップｉｉｉが、必要に応じて前記ステップｉｉの前に行われる、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記病原体が、細菌、ウイルスまたは真菌である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ウイルスが、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザ－Ａウイルス、インフルエンザ－Ｂウイルス、またはエンテロウイルスである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記細菌が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞が、気管基底細胞、細気管支分泌細胞、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系譜陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺導管細胞、人工多能性幹細胞由来肺幹細胞または肺胞２型上皮である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞が、肺胞２型上皮細胞である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目４５）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺胞球におけるウイルス力価を低減する方法であって、肺胞球がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に、前記肺胞球を薬剤と接触させるステップを含み、前記肺胞球が、前記薬剤と接触されなかった肺胞球と比べて低減されたウイルス力価を示す、方法。
（項目４６）
前記薬剤が、インターフェロンである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記インターフェロンが、ＩＦＮαおよびＩＦＮγである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、項目１～２７のいずれかに記載の培地と、使用のための説明書とを含むキット。
（項目４９）
オルガノイド培養物において細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、項目１～２７のいずれかに記載の培地と、使用のための説明書とを含むキット。
（項目５０）
オルガノイド培養物またはその派生物においてｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、項目１～２７のいずれかに記載の培地と、使用のための説明書とを含むキット。

図１Ａ～図１Ｃは、肺胞オルガノイド培養システムにおける間質細胞依存性を検査するための実験を示す。図１Ａは、間質細胞依存性を検査するためのオルガノイド培養物の概略図である。ＡＥＣ２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独において培養された（左）、またはＭａｔｒｉｇｅｌの周囲に間質細胞を配するＭａｔｒｉｇｅｌ単独において、両者の間に間隔をあけて培養された（中央）、またはＭａｔｒｉｇｅｌにおいて間質細胞と混合された（右）。図１Ｂは、２０日目の各条件におけるオルガノイド培養物の代表的な画像である。図１Ｃは、各条件におけるコロニー形成効率（ＣＦＥ）の定量化である。エラーバー（Ｅｒｒｏｒ ｂａｓ）、平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）。 図１Ａ～図１Ｃは、肺胞オルガノイド培養システムにおける間質細胞依存性を検査するための実験を示す。図１Ａは、間質細胞依存性を検査するためのオルガノイド培養物の概略図である。ＡＥＣ２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独において培養された（左）、またはＭａｔｒｉｇｅｌの周囲に間質細胞を配するＭａｔｒｉｇｅｌ単独において、両者の間に間隔をあけて培養された（中央）、またはＭａｔｒｉｇｅｌにおいて間質細胞と混合された（右）。図１Ｂは、２０日目の各条件におけるオルガノイド培養物の代表的な画像である。図１Ｃは、各条件におけるコロニー形成効率（ＣＦＥ）の定量化である。エラーバー（Ｅｒｒｏｒ ｂａｓ）、平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）。

図２Ａ～図２Ｅは、肺胞球培養のための規定された条件に対する、培地構成成分の肺胞幹細胞ニッチ受容体－リガンドインタラクトームにガイドされた最適化を示す。図２Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験の概略図である。図２Ｂは、マウス肺胞球培養物由来の上皮細胞および線維芽細胞のｔ－分布型確率的近傍埋込み（ｔ－ＳＮＥ）可視化である。マーカー遺伝子発現に基づくクラスター割当てによって、細胞に陰影を付ける。図２Ｃは、各クラスターにおけるマーカー遺伝子の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。各遺伝子の正規化された発現によって、細胞に陰影を付ける。図２Ｄは、肺胞球培養物におけるＡＴ２および線維芽細胞の間の受容体－リガンド相互作用の概略図を示す。図２Ｅは、各クラスターにおける鍵となるシグナル伝達経路における受容体、リガンドおよび調節因子の遺伝子発現を示すドットプロットである。ドットのサイズおよび陰影強度は、それぞれ指し示されている転写物を発現する細胞の数、および発現レベルを指し示す。 図２Ａ～図２Ｅは、肺胞球培養のための規定された条件に対する、培地構成成分の肺胞幹細胞ニッチ受容体－リガンドインタラクトームにガイドされた最適化を示す。図２Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験の概略図である。図２Ｂは、マウス肺胞球培養物由来の上皮細胞および線維芽細胞のｔ－分布型確率的近傍埋込み（ｔ－ＳＮＥ）可視化である。マーカー遺伝子発現に基づくクラスター割当てによって、細胞に陰影を付ける。図２Ｃは、各クラスターにおけるマーカー遺伝子の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。各遺伝子の正規化された発現によって、細胞に陰影を付ける。図２Ｄは、肺胞球培養物におけるＡＴ２および線維芽細胞の間の受容体－リガンド相互作用の概略図を示す。図２Ｅは、各クラスターにおける鍵となるシグナル伝達経路における受容体、リガンドおよび調節因子の遺伝子発現を示すドットプロットである。ドットのサイズおよび陰影強度は、それぞれ指し示されている転写物を発現する細胞の数、および発現レベルを指し示す。 図２Ａ～図２Ｅは、肺胞球培養のための規定された条件に対する、培地構成成分の肺胞幹細胞ニッチ受容体－リガンドインタラクトームにガイドされた最適化を示す。図２Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験の概略図である。図２Ｂは、マウス肺胞球培養物由来の上皮細胞および線維芽細胞のｔ－分布型確率的近傍埋込み（ｔ－ＳＮＥ）可視化である。マーカー遺伝子発現に基づくクラスター割当てによって、細胞に陰影を付ける。図２Ｃは、各クラスターにおけるマーカー遺伝子の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。各遺伝子の正規化された発現によって、細胞に陰影を付ける。図２Ｄは、肺胞球培養物におけるＡＴ２および線維芽細胞の間の受容体－リガンド相互作用の概略図を示す。図２Ｅは、各クラスターにおける鍵となるシグナル伝達経路における受容体、リガンドおよび調節因子の遺伝子発現を示すドットプロットである。ドットのサイズおよび陰影強度は、それぞれ指し示されている転写物を発現する細胞の数、および発現レベルを指し示す。 図２Ａ～図２Ｅは、肺胞球培養のための規定された条件に対する、培地構成成分の肺胞幹細胞ニッチ受容体－リガンドインタラクトームにガイドされた最適化を示す。図２Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験の概略図である。図２Ｂは、マウス肺胞球培養物由来の上皮細胞および線維芽細胞のｔ－分布型確率的近傍埋込み（ｔ－ＳＮＥ）可視化である。マーカー遺伝子発現に基づくクラスター割当てによって、細胞に陰影を付ける。図２Ｃは、各クラスターにおけるマーカー遺伝子の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。各遺伝子の正規化された発現によって、細胞に陰影を付ける。図２Ｄは、肺胞球培養物におけるＡＴ２および線維芽細胞の間の受容体－リガンド相互作用の概略図を示す。図２Ｅは、各クラスターにおける鍵となるシグナル伝達経路における受容体、リガンドおよび調節因子の遺伝子発現を示すドットプロットである。ドットのサイズおよび陰影強度は、それぞれ指し示されている転写物を発現する細胞の数、および発現レベルを指し示す。

図３Ａ～図３Ｃは、オルガノイド成長における培地構成成分の効果を示す。図３Ａは、各培養条件における肺胞球の代表的な画像である。ＳＣＥは、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＥＧＦの、ｐ３８阻害剤（ＢＩＲＢ７９６）抜きを指す。スケールバー、１ｍｍ。図３Ｂは、図２Ａに示す各条件におけるＣＦＥの定量化を示すグラフである。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３、条件当たり少なくとも２個のウェル）を指し示す。図３Ｃは、周囲長が３００μｍを超える肺胞球を示すグラフであり、これは、図３Ａに示す各条件において定量化された。ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ、ｐ＝１．６５×１０^－１０；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７、ｐ＝５．４７×１０^－１４；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ１０、ｐ＝４．９４×１０^－１４；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７＿ＦＧＦ１０、ｐ＝５．１×１０^－６；ｎ．ｓ、有意性なし；スチール・ドワス検定。 図３Ａ～図３Ｃは、オルガノイド成長における培地構成成分の効果を示す。図３Ａは、各培養条件における肺胞球の代表的な画像である。ＳＣＥは、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＥＧＦの、ｐ３８阻害剤（ＢＩＲＢ７９６）抜きを指す。スケールバー、１ｍｍ。図３Ｂは、図２Ａに示す各条件におけるＣＦＥの定量化を示すグラフである。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３、条件当たり少なくとも２個のウェル）を指し示す。図３Ｃは、周囲長が３００μｍを超える肺胞球を示すグラフであり、これは、図３Ａに示す各条件において定量化された。ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ、ｐ＝１．６５×１０^－１０；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７、ｐ＝５．４７×１０^－１４；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ１０、ｐ＝４．９４×１０^－１４；ＳＣＥ ｖｓ ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７＿ＦＧＦ１０、ｐ＝５．１×１０^－６；ｎ．ｓ、有意性なし；スチール・ドワス検定。

図４Ａ～図４Ｃは、化学的に規定された間質不含肺胞オルガノイド培養システムの確立を示す。図４Ａは、１０日目および１５日目のＭＴＥＣおよび無血清培地におけるオルガノイド培養物の概略図および代表的な画像である。図４Ｂは、ＣＦＥの定量化を示すグラフである。図４Ｃは、オルガノイドサイズを示すグラフである。

図５Ａ～図５Ｃは、化学的に規定された間質不含肺胞オルガノイド培養システムの確立を示す。図５Ａは、１０日目および１５日目のＩＬ－１β／ＴＮＦαありおよびなしのオルガノイド培養物の概略図および代表的な画像である。図５Ｂは、ＣＦＥの定量化を示すグラフである。図５Ｃは、オルガノイドサイズを示すグラフである。

図６Ａ～図６Ｂは、化学的に規定された間質不含肺胞オルガノイド培養システムの確立を示す。図６Ａは、ＩＬ－１βのパルス刺激を示す概略図である。図６Ｂは、図６ＡのデータのＣＦＥの定量化を示すグラフである。エラーバー、平均±ｓ．ｅ．ｍ（－ＩＬ－１β ｄ３（ｎ＝２）を除いて、ｎ＝３）。

図７Ａ～図７Ｄは、初代ヒト肺胞球の特性評価を示す。図７Ａは、ＳＦＦＦ培地におけるヒト肺胞球培養の概略図である。７日目に培地からｈＩＬ－１βを除去し、さらに７～１５日間培養した。図７Ｂは、１４日目の３名の個々のドナーの代表的な肺胞球画像である。図７Ｃは、コロニー形成効率（ＣＦＥ）の定量化を示すグラフである。図７Ｄは、１４日目に採取された肺胞球のサイズ（周囲長）を示すグラフである。 図７Ａ～図７Ｄは、初代ヒト肺胞球の特性評価を示す。図７Ａは、ＳＦＦＦ培地におけるヒト肺胞球培養の概略図である。７日目に培地からｈＩＬ－１βを除去し、さらに７～１５日間培養した。図７Ｂは、１４日目の３名の個々のドナーの代表的な肺胞球画像である。図７Ｃは、コロニー形成効率（ＣＦＥ）の定量化を示すグラフである。図７Ｄは、１４日目に採取された肺胞球のサイズ（周囲長）を示すグラフである。

図８Ａ～図８Ｂは、肺胞球培養のための規定された条件を示す。図８Ａは、１０日目および１５日目のＳＦＦＦ培地における標識あり（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）に由来する肺胞球培養物の概略図および代表的な画像である。図８Ｂは、ＳＦＦＦ培地において培養された肺胞球の代表的なＴＥＭ画像である。スケールバー、２μｍ。より強拡大率の画像（右）は、層状体様構造を示す。スケールバー、５００ｎｍ。

図９Ａ～図９Ｂは、肺胞（ａｌｖｅｏ－）増殖培地における肺胞オルガノイドの機能解析を示す。図９Ａは、オルガノイド培養物の継代培養を示す概略図である。図９Ｂは、肺胞増殖培地における継代培養の際の累積的細胞数に基づく成長曲線を示すグラフである。

図１０Ａ～図１０Ｎは、化学的に規定されたヒト肺の肺胞球培養システムの確立を示す。図１０Ａは、ＳＦＦＦ培地におけるヒト肺胞球培養物および継代培養の概略表示である。図１０Ｂは、異なる継代由来のヒト肺胞球の代表的な画像である。スケールバー１００μｍ。図１０Ｃは、異なる継代におけるヒト肺胞球のコロニー形成効率の定量化を示すグラフである。図１０Ｄは、ＳＦＦＦ培地において１４日間培養されたＰ１およびＰ３ヒト肺胞球における、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＢおよびＡＧＥＲ（左パネル）またはＳＦＴＰＢ、ＨＴＩＩ－２８０およびＤＣ－ＬＡＭＰ（右パネル）に対する免疫染色の画像を示す。図１０Ｅは、Ｐ２（上部）およびＰ８（下部）における、肺胞球から解離された細胞におけるＳＦＴＰＣおよびＨＴＩＩ－２８０に対する免疫染色の画像を示す。図１０Ｆは、Ｐ２およびＰ８由来の肺胞球解離に由来するＨＴＩＩ－２８０^＋ＳＦＴＰＣ^＋細胞／総ＤＡＰＩ^＋細胞の定量化を示すグラフである。図１０Ｇは、Ｐ１０のヒト肺胞球における明視野（左）、ならびにＳＦＴＰＣ、Ｋｉ６７およびＡＧＥＲに対する免疫染色の画像である。図１０Ｈは、Ｐ１およびＰ６のヒト肺胞球におけるＳＦＴＰＣおよびＬＡＭＰ３に対する定量的ＲＴ－ＰＣＲを示すグラフである。図１０Ｉは、ＳＦＦＦ培地において２０日間培養された肺胞球切片におけるＳＦＴＰＣおよびＴＰ６３およびＳＯＸ２に対する免疫染色の画像である。図１０Ｊは、ＳＦＦＦ培地において２０日間培養された肺胞球切片におけるＮＫＸ２－１、ＳＣＧＢ１Ａ１およびＨＴＩＩ－２８０に対する免疫染色の画像である。図１０Ｋは、１０日間にわたる１０％ＦＢＳによる分化の誘導後の肺胞球における、ＡＧＥＲおよびＳＦＴＰＣに対する免疫染色である。図１０Ｌは、１０日間にわたるヒト血清による分化の誘導後の肺胞球におけるＡＧＥＲおよびＳＦＴＰＣに対する免疫染色を示す画像である。強拡大率の画像（右）は、ＡＧＥＲ^＋細胞を示す。スケールバー、５０μｍ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。図１０Ｍは、肺胞球におけるヒトＡＴ２からＡＴ１への分化の概略表示である。ＡＴ２をＳＦＦＦ培地において１０日間培養し、続いてＡＤＭにおいて１４日間培養した。図１０Ｎは、ＡＤＭ条件で１４日間培養されたヒト肺胞球におけるＳＦＴＰＣおよびＡＧＥＲに対する免疫染色の画像である。スケールバー：Ｂ、１００μｍ；Ｄ、５０μｍ；Ｅ、２０μｍ；Ｈ、２０μｍ。ＤＡＰＩは、図１０Ｄ、図１０Ｅおよび図１０Ｈにおいて核を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１１Ａ～図１１Ｉは、肺胞増殖培地における肺胞オルガノイドの機能解析を示す。図１１Ａは、遺伝子編集実験の概略である。ＡＡＶ６に基づく遺伝子送達によって導入されたＧＦＰを発現するオルガノイドの蛍光および明視野画像の重ね合わせ（右）。スケールバー、５０μｍ。図１１Ｂは、腫瘍オルガノイド培養物の概略図を示す。図１１Ｃは、７日目の様々な培地における腫瘍オルガノイドの代表的な画像である。図１１Ｄは、５日目の腫瘍オルガノイドのＣＦＥの定量化を示すグラフである（右）。エラーバー、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図１１Ｅは、７日目の腫瘍オルガノイドにおけるＲＡＧＥ（白色）、ＳＰＣおよびＴＯＭＡＴＯに対する免疫染色の画像である。図１１Ｆは、グラフト実験の概略図である。図１１Ｇは、オルガノイド由来細胞をグラフトされた浄化された肺の代表的な画像である。白色の破線は、肺組織の縁を指し示す。スケールバー、１ｍｍ。図１１Ｈは、肺におけるオルガノイド由来細胞の生着の代表的な画像である。グラフトされた細胞は、内因性ＴＯＭＡＴＯ発現によって検出された。スケールバー、１００μｍ。図１１Ｉは、オルガノイド由来細胞をグラフトされたマウスの肺切片のＲＡＧＥおよびＳＰＣに対する免疫染色を示す画像である。グラフトされた細胞は、内因性ＴＯＭＡＴＯ発現によって検出された。スケールバー、５０μｍ。グラフト実験は、独立して３回行った。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１２Ａ～図１２Ｊは、オルガノイド培養物における細胞同一性のモジュレーションを示す。図１２Ａは、増殖培地における実験の概略図である。図１２Ｂは、１０日目の増殖条件におけるオルガノイドの代表的なホールマウント画像である。図１２Ｃは、指し示されている遺伝子の発現を示すｔＳＮＥプロットである。図１２Ｄは、ＢＭＰ阻害による維持培地における実験の概略図である。図１２Ｅは、１０日目の維持条件におけるオルガノイドの代表的なホールマウント画像である。図１２Ｆは、ＡＭＭにおいて培養されたＰ１およびＰ６マウス肺胞球における、ＳＦＴＰＣ、ＴｄｔおよびＡＧＥＲ（左パネル）またはＳＦＴＰＢ、ＴｄｔおよびＤＣ－ＬＡＭＰ（右パネル）に対する免疫染色の画像である。図１２Ｇは、マウス肺胞球継代培養の概略表示である。図１２Ｈは、継代１、３および６における代表的な肺胞球画像である。図１２Ｉは、異なる継代におけるＣＦＥの定量化を示すグラフである。図１２Ｊは、Ｐ１およびＰ６のマウス肺胞球におけるＳｆｔｐｃ、Ａｂｃａ３およびＬａｍｐ３に対する定量的ＲＴ－ＰＣＲを示すグラフである。アステリスクは、ｐ＜０．０５を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１３は、７日目の肺胞増殖（左）および肺胞維持培地（右）におけるオルガノイドの代表的なホールマウント画像を示す。

図１４Ａ～図１４Ｄは、オルガノイド培養物における細胞同一性のモジュレーションを示す。図１４Ａは、２０日目の分化条件におけるオルガノイドのための概略図である。図１４Ｂは、２０日目の分化条件におけるオルガノイドにおけるＡＧＥＲ、ＳＦＴＰＣ（左）およびＨＯＰＸ、ＰＤＰＮ（右）に対する免疫染色を示す画像である。スケールバー、５０μｍ。図１４Ｃは、Ｐ１（左）およびＰ６（右）のＡＤＭにおいて培養されたマウス肺胞球における、ＳＦＴＰＣおよびＡＧＥＲに対する免疫染色の画像である。スケールバー：Ｄ、１ｍｍ；ＢおよびＧ ５０μｍ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。図１４Ｄは、ＡＥＣ２マーカー（Ｓｆｔｐｃ、Ｌａｍｐ３、Ｌｐｃａｔ１）（左）およびＡＥＣ１マーカー（Ａｇｅｒ、Ｈｏｐｘ、Ｃａｖ１）（右）の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。 図１４Ａ～図１４Ｄは、オルガノイド培養物における細胞同一性のモジュレーションを示す。図１４Ａは、２０日目の分化条件におけるオルガノイドのための概略図である。図１４Ｂは、２０日目の分化条件におけるオルガノイドにおけるＡＧＥＲ、ＳＦＴＰＣ（左）およびＨＯＰＸ、ＰＤＰＮ（右）に対する免疫染色を示す画像である。スケールバー、５０μｍ。図１４Ｃは、Ｐ１（左）およびＰ６（右）のＡＤＭにおいて培養されたマウス肺胞球における、ＳＦＴＰＣおよびＡＧＥＲに対する免疫染色の画像である。スケールバー：Ｄ、１ｍｍ；ＢおよびＧ ５０μｍ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。図１４Ｄは、ＡＥＣ２マーカー（Ｓｆｔｐｃ、Ｌａｍｐ３、Ｌｐｃａｔ１）（左）およびＡＥＣ１マーカー（Ａｇｅｒ、Ｈｏｐｘ、Ｃａｖ１）（右）の発現を示すｔＳＮＥプロットを示す。

図１５Ａ～図１５Ｃは、無血清分化培地による培養物におけるマウスおよびヒトのＡＥＣ２からＡＥＣ１への分化を示す。図１５Ａは、線維芽細胞におけるＩＬ６転写物の濃縮を示すプロットである。図１５Ｂは、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＡＤＭ（血清なし）に培地を置き換える前に、肺胞増殖培地において１０日間培養されたマウスＡＥＣ２を示す概略図、およびＡＥＣ１マーカーＡＧＥＲの発現を示す免疫蛍光画像（下部）である。図１５Ｃは、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＡＤＭ（血清なし）に培地を置き換える前に、ＳＦＦＦ培地において１４日間培養されたヒトＡＥＣ２を示す概略図、およびＡＥＣ１マーカーＡＧＥＲの発現を示す免疫蛍光画像（下部）である。 図１５Ａ～図１５Ｃは、無血清分化培地による培養物におけるマウスおよびヒトのＡＥＣ２からＡＥＣ１への分化を示す。図１５Ａは、線維芽細胞におけるＩＬ６転写物の濃縮を示すプロットである。図１５Ｂは、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＡＤＭ（血清なし）に培地を置き換える前に、肺胞増殖培地において１０日間培養されたマウスＡＥＣ２を示す概略図、およびＡＥＣ１マーカーＡＧＥＲの発現を示す免疫蛍光画像（下部）である。図１５Ｃは、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＡＤＭ（血清なし）に培地を置き換える前に、ＳＦＦＦ培地において１４日間培養されたヒトＡＥＣ２を示す概略図、およびＡＥＣ１マーカーＡＧＥＲの発現を示す免疫蛍光画像（下部）である。

図１６Ａ～図１６Ｅは、肺胞球由来ＡＴ２が、ウイルス受容体を発現し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して許容的であることを示す。図１６Ａは、ヒト肺胞球におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰ感染のための概略表示である。ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされたプレート上で、ＳＦＦＦ培地においてＡＴ２を１０～１２日間培養し、続いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させ、異なる時点の後にＲＮＡ単離または組織学的解析を行った。図１６Ｂは、対照およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰ感染ヒト肺の肺胞球の代表的な広視野顕微鏡画像である。図１６Ｃは、感染２４、４８および７２時間後に肺の肺胞球培養物から採取された培地を使用したプラークアッセイによってウイルス力価を測定したことを示すグラフである。図１６Ｄは、対照およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒトＡＥＣ肺胞球におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写物に対する定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析を示すグラフである。図１６Ｅは、感染７２時間後の偽およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト肺胞球における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マイナス鎖特異的逆転写と、それに続く、２種の異なるゲノム遺伝子座（１２０２～１３６３および８４８～９８１）を標的とするＲＴ－ｑＰＣＲの定量化を示すグラフである。アステリスクは、ｐ＜０．０５を示す。スケールバー：Ａ、ＢおよびＣ、３０μｍ、Ｄ．２０μｍ。Ｆ．２０μｍ。マージされた画像における白色のボックスは、単一チャネル画像の領域を指し示す。全ての定量化データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。 同上。 同上。

図１７Ａ～図１７Ｄは、トランスクリプトームプロファイリングが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肺細胞におけるインターフェロン、炎症性および細胞死経路の濃縮を明らかにしたことを示す。図１７Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した、ＳＦＦＦにおいて培養された肺胞球における上方調節（右）および下方調節（左）された遺伝子を示すボルケーノ（ｖｏｌｃａｎｏ）プロットである。ＤＥＳｅｑ２を使用して、統計解析を行った。図１７Ｂは、バルクＲＮＡ－ｓｅｑによって検出された、偽およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト肺胞球におけるＩＦＮリガンドの発現レベルを示すグラフである。図１７Ｃは、バルクＲＮＡ－ｓｅｑによって検出された、偽およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト肺胞球における受容体の発現レベルを示すグラフである。図１７Ｄは、バルクＲＮＡ－ｓｅｑによって検出された、偽およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト肺胞球における下流標的の発現レベルを示すグラフである。データは、ＦＰＫＭ平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示される。 同上。 同上。

図１８Ａ～図１８Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、サーファクタントの喪失およびＡＴ２細胞死を誘導することを示す。図１８Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肺胞球のパーセントの定量化を示すグラフである。図１８Ｂは、低感染（１～１０個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＋細胞）および高感染（１０個またはそれよりも多いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＋細胞）肺胞球の定量化を示すグラフである。図１８Ｃは、非感染対照における、ならびにウイルス感染肺胞球中のＳＡＲＳ－およびＳＡＲＳ＋細胞における、ＳＦＴＰＣ＋細胞の定量化を示すグラフである。図１８Ｄは、非感染対照における（灰色）、感染肺胞球中のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－細胞（青色）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＋細胞における、活性ＣＡＳＰ３＋細胞の定量化を示すグラフである。図１８Ｅは、非感染対照における（灰色）、感染肺胞球中のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２－細胞（青色）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＋細胞における、Ｋｉ６７＋細胞の定量化を示すグラフである。 同上。 同上。

図１９は、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者から得られる上皮細胞における細胞型特異的マーカー遺伝子発現を示すドットプロットである。

図２０Ａ～図２０Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肺胞球およびＣＯＶＩＤ－１９肺由来のＡＴ２におけるトランスクリプトーム全体にわたる類似性を示す。図２０Ａは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の気管支肺胞上皮洗浄液中のＡＴ２細胞（右）および健康な肺（対照）から単離されたＡＴ２（左）において濃縮された特異的遺伝子を示すボルケーノプロットである。ウィルコクソン順位和検定を統計解析に使用した。図２０Ｂは、対照および重症ＣＯＶＩＤ－１９患者肺に由来するＡＴ２細胞における、サイトカインおよびケモカイン（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１４およびＩＬ３２）、インターフェロン標的（ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５およびＩＦＩ６）、アポトーシス（ＴＮＦＳＦ１０、ＡＮＸＡ５およびＣＡＳＰ４）、サーファクタント関連（ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＤおよびＮＡＰＳＡ）ならびにＡＴ２細胞関連（ＬＡＭＰ３、ＮＫＸ２－１およびＡＢＣＡ３）の遺伝子発現を示すバイオリン（ｖｉｏｌｉｎ）プロットである。 同上。[０００１] 図２１Ａ～図２１Ｈは、ＩＦＮ処置が、肺胞球由来ＡＴ２において細胞死およびサーファクタントの喪失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の特色を再現することを示す。図２１Ａは、対照およびＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－ｇ処置ヒト肺の肺胞球の代表的な画像である。図２１Ｂは、対照およびインターフェロン処置ヒト肺胞球における、総ＤＡＰＩ＋（肺胞球当たり）細胞における活性カスパーゼ３＋細胞の定量化を示すグラフである。図２１Ｃは、対照およびインターフェロン処置ヒト肺胞球における、総ＤＡＰＩ＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の定量化を示すグラフである。＊、＊＊および＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示す。図２１Ｄは、インターフェロンで処置された肺胞球（ａｌｖｅｏｌｏｐｈｅｒｅ）におけるＳＦＴＰＢに対するＲＴ－ＰＣＲ解析の定量化を示すグラフである。図２１Ｅは、インターフェロンで処置された肺胞球（ａｌｖｅｏｌｏｐｈｅｒｅ）におけるＳＦＴＰＣに対するＲＴ－ＰＣＲ解析の定量化を示すグラフである。図２１Ｆは、インターフェロンで処置された肺胞球（ａｌｖｅｏｌｏｐｈｅｒｅ）におけるＡＣＥ２に対するＲＴ－ＰＣＲ解析の定量化を示すグラフである。図２１Ｇは、インターフェロンで処置された肺胞球（ａｌｖｅｏｌｏｐｈｅｒｅ）におけるＴＭＰＲＳＳ２に対するＲＴ－ＰＣＲ解析の定量化を示すグラフである。図２１Ｈは、ＳＦＦＦにおいて培養された（ｃｕｌｕｔｒｅｄ）対照およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（感染４８時間（ｊｏｕｒｓ）後（ｐｓｔ））肺胞球における、ＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２に対する定量的（ｑａｎｔｉａｔｉｖｅ）ＲＴ－ＰＣＲ解析を示すグラフである。＊、＊＊＊、＊＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。 同上。 同上。 同上。

図２２Ａは、ＩＦＮまたはＩＦＮ阻害剤処置と、それに続くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の概略図である。図２２Ｂは、感染２４および４８時間後に肺胞球培養物から採取された培地を使用したプラークアッセイによって測定された、対照、ルキソリチニブ処置、ＩＦＮａ処置およびＩＦＮｇ処置培養物におけるウイルス力価を示すグラフである。

本開示の原理の理解を促す目的のため、次に、好まれる実施形態を記載するために、好まれる実施形態の参照が為され、具体的な言葉遣いが使用されるであろう。それにもかかわらず、これによる本開示の範囲の限定は意図されず、本明細書に説明されている本開示のそのような変更およびさらなる修正は、本開示が関係する技術分野の当業者によって通常想起される通りに企図されることが理解されるであろう。

定義

冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、この冠詞の文法上の目的語の１つをまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すように本明細書で使用される。例として、「１つのエレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つのエレメントを意味し、２つ以上のエレメントを含むことができる。

「約」は、所与の値が、所望の結果に影響を与えることなく、終点を「僅かに上回る」または「僅かに下回る」ことができることを仮定して、数値的範囲の終点に柔軟性を提供するように使用される。

用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「を有する」およびこれらの変形形態の本明細書における使用は、この用語の前に収載されているエレメントおよびその均等ならびに追加的なエレメントを包含することを意図する。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する収載されている項目のうち１種または複数のありとあらゆる可能な組合せと共に、選択肢（「または」）の意味で解釈される場合は組合せの欠如を指し、これを包含する。

本明細書で使用される場合、移行句「から本質的になる」（および文法上の異形）は、列挙されている材料またはステップ、ならびに請求されている発明の「基本的および新規特徴（複数可）に大幅な影響を与えないもの」を包含するものとして解釈されたい。よって、用語「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の均等として解釈されるべきではない。

さらに、本開示はまた、一部の実施形態では、本明細書に示されるいずれかの特色または特色の組合せが、除外または省略され得ることを企図する。例を示すと、本明細書が、複合体が構成成分Ａ、ＢおよびＣを含むことを記述する場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれかまたはこれらの組合せが、単独でまたはいずれかの組合せで省略および否定され得ることが特に意図される。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に他に指示がなければ、範囲内に納まる別々の値のそれぞれを個々に参照する簡便な方法として機能することが単に意図され、別々の値のそれぞれが、あたかも本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が、１％～５０％として記述される場合、２％～４０％、１０％～３０％または１％～３％等の値等が、本明細書に明確に列挙されることが意図される。上述は、特に意図されるものの単なる例であり、列挙されている最低値および最高値の間の数値および最低値および最高値を含む数値のあらゆる可能な組合せは、本開示において明確に記述されていると考慮されるべきである。

用語「疾患」は、本明細書で使用される場合、生物の一部に影響を与える、構造または機能のいずれかの異常状態および／または障害を含むがこれらに限定されない。これは、感染性疾患もしくは化学的毒素等の外部因子、またはがん、がん転移およびその他の内部機能障害によって引き起こされ得る。

用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。

本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、患者によって顕在化されたまたは患者が易罹患性となり得る疾患、障害または病原体感染に応答して為される臨床介入を指す。処置の目標は、疾患、障害、疾患原因媒介体（例えば、細菌またはウイルス）もしくは状態の症状の軽減もしくは予防、その進行もしくは悪化を遅くすることもしくは停止、および／または疾患、障害もしくは状態の寛解を含む。

他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。

化学的に規定された、間質不含オルガノイド培養システム

本開示は、一部には、本発明者らによる、肺胞幹細胞増殖、維持および分化を包含する、機能的なかつ別個の細胞状況の生成を可能にする、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムの発見に基づく。３次元培養物（オルガノイド）における肺幹細胞の成長のための化学的に規定された培養システムは、培養における未知の成長構成成分またはフィーダーの使用を要求しない。

本明細書で使用される場合、用語「オルガノイド」は、培養において成長された幹細胞に由来する、自己形成された三次元（３Ｄ）構造または実体を指す。オルガノイド培養物は、ある特定の型の細胞のみを産生すること等により、臓器の複雑さを再現することができる、または臓器の選択された側面を表現することができる。あるいは、分化前のある特定のステージにおいて、これは、幹細胞のみで構成されていてよい。

幹細胞は、自身を複製する（自己再生する）能力および他の細胞型を生じる能力の両方を有する細胞である。幹細胞が分裂すると、娘細胞は、幹細胞のままでいることができる、またはより特化した型の細胞になることができる、または１種または複数の特化した細胞型へと分化する他の娘細胞を生じることができる。２種の型の哺乳動物幹細胞は、胚盤胞または着床前胚に存在する未分化細胞に由来する多能性胚性幹細胞と、成体組織または臓器に見出される成体幹細胞である。成体幹細胞は、組織または臓器の正常なターンオーバーまたは再生を維持することができ、損傷後に組織または臓器において細胞を修復および補充することができる。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、増殖および自己再生することができ、１種または複数の他の細胞型を生成する能力を有する前駆細胞を生じることができる未分化細胞を、または分化細胞を生じ得る先駆体を指す。ある特定の場合では、娘細胞または前駆もしくは先駆細胞は、分化細胞を生じることができる。ある特定の場合では、娘細胞または前駆もしくは先駆細胞は、それ自身が増殖および自己再生することができると共に、その後に１種または複数の成熟細胞型へと分化する後代を産生することができる。

前駆細胞は、自己再生することができるか、または分化細胞型へと分化することができるという点において幹細胞と同様の細胞を指すが、前駆細胞は既に、幹細胞よりも特化または規定されている。

本開示の幹細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない、いずれかの動物に由来することができる。

本開示のオルガノイド培養システムによって育生され得る幹細胞は、正常（例えば、対象の健康な組織由来の細胞）または異常細胞（例えば、形質転換された細胞、確立された細胞または罹病組織試料に由来する細胞）であり得る。

一部の実施形態では、本開示のオルガノイド培養物は、肺幹細胞に由来することができる。肺幹細胞の分裂は、肺の構造の再生を促進することができる。肺幹細胞の例は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆（ＡＥＰ）細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系譜陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺導管細胞、人工多能性幹細胞由来肺幹細胞および肺胞２型上皮（ＡＥＣ２またはＡＴ２と本明細書において称される）細胞を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、オルガノイド培養物は、肺胞２型細胞を含有する。ＡＥＣ２細胞は、自己再生することができると共に、肺胞１型上皮細胞（ＡＥＣ１）の前駆体として作用することができる。ＡＥＣ２細胞は、定常状態下および傷害条件下の両方で、ＡＥＣ１細胞集団を補充することができる。三次元（３Ｄ）（オルガノイド）培養物において、ＡＥＣ２細胞は、ＡＥＣ２細胞マーカー（例えば、Ｓｆｔｐｃ、Ｓｆｔｐｂ、Ｌａｍｐ３、Ｌｐｃａｔ７、ＨＴＩＩ－２８０）を発現する細胞およびＡＥＣ１細胞マーカー（例えば、Ａｇｅｒ（ＲＡＧＥ）、ＨｏｐｘおよびＣａｖ１）を発現する細胞および／または移行状況マーカーを発現する細胞を含有する肺胞球を形成することができる。

一部の実施形態では、本開示のオルガノイド培養物は、皮膚、乳腺、食道、膀胱、前立腺、卵巣および唾液腺を含む臓器由来の基底幹細胞に由来することができる。

したがって、本開示の一態様は、無血清培地および細胞外基質構成成分を含む、これからなるまたはこれから本質的になる細胞培養培地であって、化学的に規定されており、かつ間質不含である細胞培養培地を提供する。

本開示の細胞培養培地を使用して、多数の異なる細胞を培養することができる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、幹細胞培養培地である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、肺幹細胞培養培地である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、肺胞２型細胞培養培地である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、腫瘍細胞培養培地（例えば、肺腫瘍細胞）である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、病原体に感染した細胞のための細胞培養培地である。

用語「細胞培養培地」は、本明細書で使用される場合、細胞または組織を育生（例えば、増殖、維持または分化）することができる、栄養素を含有する液体、半液体またはゼラチン状物質を指す。

用語「化学的に規定された培地」は、本明細書で使用される場合、培地において使用されている化学物質の全てが既知であり、酵母、動物または植物組織が培地に存在しない、培地を指す。化学的に規定された培地は、既知含量の全成分を有することができる。

「間質不含」細胞培養培地は、本明細書で使用される場合、間質細胞または間質結合組織を含有しない細胞培養培地を指す。間質細胞（生きていても、固定されていてもよい）の例は、免疫細胞、骨髄由来細胞、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞を含むがこれらに限定されない。

用語「細胞外基質構成成分」または「ＥＣＭ」は、周囲の細胞に構造および生化学的支持を提供する細胞培養培地成分を指す。細胞外基質構成成分は、線維性タンパク質およびグリコサミノグリカンの連動する網目を含有することができる。本開示の細胞外基質構成成分は、プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸）、ヒアルロン酸、タンパク質、コラーゲン（例えば、原線維（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ型）、ＦＡＣＩＴコラーゲン（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＩＸ、ＸＸＩ型コラーゲンおよびコラーゲンＸＸＩＩ型アルファ１）、短鎖（コラーゲンＶＩＩＩおよびＸ型）、基底膜（コラーゲンＩＶ型）およびＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩ型コラーゲン）、エラスチン、フィブロネクチン、エンタクチンまたはラミニンを含むことができる。本明細書に記載されている培養培地において使用される細胞外基質構成成分は、エンゲルブレスホルムスワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されたゼラチン状タンパク質混合物であり得る。細胞外基質構成成分の例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｉ型コラーゲン、Ｃｕｌｔｒｅｘ増殖因子低減基底膜、Ｒ型またはヒト型ラミニンを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞外基質構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌである。他の実施形態では、細胞外基質構成成分は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）＃３５４２３０のＭａｔｒｉｇｅｌである。

用語「無血清培地」またはＳＦＭは、血清（例えば、凝固した血液から分離されたタンパク質に富んだ液）の非存在下で特異的な細胞型の成長を支持することができる１種または複数の成長栄養素を含有する培地を指す。無血清培地を使用することの利点は、細胞培養バッチ間の一貫性の改善、細胞培養培地の各バッチが、使用前に品質保証について検査される必要がないこと、病原体混入リスクの減少、細胞培養研究の再現性の改善、ならびに細胞培養産物の単離および精製の改善を含む。

無血清培地の用語「成長栄養素」は、小分子化合物（例えば、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ＤＭＨ－１またはＹ－２７６３２）、組換えタンパク質（例えば、ヒトＥＧＦ、マウスＦＧＦ１０、マウスＩＬ－１βまたはマウスノギン）、サプリメント（例えば、ヘパリン、Ｎ－２、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸまたはＮ－アセチル－Ｌ－システイン、増殖因子、酵素阻害剤（例えば、トリプシン阻害剤）、必須ビタミン、ニューロペプチド、ニューロトランスミッターおよび微量元素（例えば、銅、マンガン、亜鉛およびセレニウム）等の種々の成分を含むことができる。

一部の実施形態では、無血清培地は、ＴＧＦ－β阻害剤を含むことができる。ＴＧＦ－β阻害剤の例は、ＬＴＢＰ（潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質）、Ａ ７７－０１、Ａ ８３－０１、ＡＺ １２７９９７３４、Ｄ ４４７６、ガルニセルチブ（Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ）、ＧＷ ７８８３８８、ＩＮ １１３０、ＬＹ ３６４９４７、Ｒ ２６８７１２、ＳＢ ５０５１２４、ＳＢ ５２５３３４、ＳＤ ２０８、ＳＭ １６、ＩＴＤ
１、ＳＩＳ３、Ｎ－アセチルピューロマイシン、ＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘおよびＬＹ２１０９７６１を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、ＧＳＫ３阻害剤を含むことができる。ＧＳＫ－３阻害剤の例は、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＬｉＣｌ２、ＡＴ７５１９、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＴＷＳ１１９、チデグルシブ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、２－Ｄ０８、ＢＩＯ－アセトキシム（ａｃｅｔｏｘｉｍｅ）、ＩＭ－１２、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）または６－ブロモインディルビン－３’－オキシムを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含むことができる。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤の例は、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＰＤ １６９３１６およびＳＢ２０３５８０を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、抗凝固薬（抗血栓薬）を含むことができる。抗凝固薬の例は、ヘパリンまたはワルファリンを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、１種または複数の増殖因子を含むことができる。増殖因子の例は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、顆粒細胞－マクロファージコロニー刺激因子、トランスフェリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－アルファ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびトランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）を含むがこれらに限定されない。無血清培地における使用のための増殖因子またはホルモンは、植物もしくは動物から精製されても、または組換えＤＮＡ技術を使用して細菌もしくは酵母において産生されてもよい。

一部の実施形態では、無血清培地は、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏキナーゼ）阻害剤を含むことができる。ＲＯＣＫ阻害剤の例は、Ｙ２７６３２、リパスジル（Ｋ－１１５）、ネタルスジル（ＡＲ－１３５０３）、ＲＫＩ－１８およびＲＫＩ－１１を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、基本培地サプリメントまたは基礎培地を含むことができる。基本培地サプリメントの例は、インスリン－トランスフェリン－セレニウムおよび改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ変法イーグル培地／ＨａｍのＦ－１２）を含むがこれらに限定されない。本開示の培養培地がスケーラブルであり、培地の体積を培養サイズに従って調整することができることが理解されるであろう。

一部の実施形態では、無血清培地は、Ｌ－グルタミンの代用品を含むことができる。Ｌ－グルタミンの代用品の例は、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（ＡｌａＧｌｎ）およびＧｌｕｔａｍｉｎｅＰｌｕｓを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、ニューロン細胞培養構成成分を含むことができる。ニューロン細胞培養構成成分の例は、Ｂ－２７を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、緩衝剤を含むことができる。緩衝剤は、生理的ｐＨ（例えば、約７．２～約７．６）を維持することができる細胞培養培地の構成成分である。本開示の細胞培養培地における使用に適した緩衝剤の例は、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウムおよびフェノールレッドを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、抗酸化剤を含むことができる。本開示の細胞培養培地における使用に適した抗酸化剤の例は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスコルビン酸およびビタミンＣを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、抗生物質を含むことができる。本開示の細胞培養培地における使用に適した抗生物質の例は、抗生物質－抗真菌薬、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよびゲンタマイシンを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、無血清培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ変法イーグル培地／ＨａｍのＦ－１２）におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ヘパリン、ＥＧＦ（例えば、ヒトＥＧＦ、マウスＥＧＦ）、ＦＧＦ１０、Ｙ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、ＨＥＰＥＳ、Ｎ－アセチルシステイン、抗生物質－抗真菌薬、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の成長栄養素を含むことができる。

一部の実施形態では、細胞培養培地の無血清培地および細胞外基質構成成分は、約１：１の比で混合される。

一部の実施形態では、肺幹細胞（例えば、２型肺胞上皮細胞）培養培地は、無血清培地およびＭａｔｒｉｇｅｌの１：１混合物を含む、これからなるまたはこれから本質的になり、無血清培地は、５μＭ～２０μＭのＳＢ４３１５４２、１μＭ～１０μＭのＣＨＩＲ
９９０２、０．５μＭ～５μＭのＢＩＲＢ７９６、２．５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌのヘパリン、５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、５ｎＭ～２０ｎＭのＹ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム（１．７μＭのインスリン、０．０６８μＭのトランスフェリンおよび０．０３８μＭのセレニウム）、０．５％～２％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％～３％のＢ２７、０．５％～２％のＮ－２、１０ｍＭ～２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ｍＭ～２ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび０．５％～２％の抗生物質－抗真菌薬の濃度を含み、これらの構成成分は全て、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地に含有され、培地は、間質不含である。

一部の実施形態では、肺幹細胞（例えば、２型肺胞上皮細胞）培養培地は、無血清培地およびＭａｔｒｉｇｅｌの１：１混合物を含む、これからなるまたはこれから本質的になり、無血清培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２における約１０μＭのＳＢ４３１５４２、３μＭのＣＨＩＲ ９９０２、１μＭのＢＩＲＢ７９６、５μｇ／ｍｌのヘパリン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、１０ｎＭのＹ２７６３２、インスリン－トランスフェリン－セレニウム（１．７μＭのインスリン、０．０６８μＭのトランスフェリンおよび０．０３８μＭのセレニウム）、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、２％のＢ２７、１％のＮ－２、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．２５ｍＭのＮ－アセチルシステインおよび１％の抗生物質－抗真菌薬の濃度を含み、培地は、間質不含である。

本開示の別の態様は、肺幹細胞（例えば、２型肺胞上皮細胞）培養増殖培地を提供する。用語「増殖培地」または「無血清、フィーダー不含」または「ＳＦＦＦ」は、本明細書で互換的に使用され、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞の増殖および増殖を支持することができる細胞培養培地を指す。

本開示の増殖培地は、無血清培地および細胞外基質構成成分を含むことができ、培養培地は、化学的に規定されており、かつ間質不含であり、増殖培地は、１種または複数のサイトカインをさらに含む。

サイトカインは、細胞シグナル伝達において役割を果たすことができる小型のタンパク質（例えば、約５～２０ｋＤａ）である。サイトカインの例は、インターロイキン－１α（ＩＬ－１α）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１６（ＩＬ－１６）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７）（ＩＬ－１８）、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γおよび腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、増殖培地は、ＩＬ－１β、ＴＮＦαおよび／またはこれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、増殖培地は、マウスＩＬ－１βを含む。他の実施形態では、増殖培地は、マウスＴＮＦαを含む。

一部の実施形態では、増殖培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬの濃度でＩＬ－１βを含む。一部の実施形態では、増殖培地は、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－１βを含む。

一部の実施形態では、増殖培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＮＦαを含む。一部の実施形態では、増殖培地は、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＴＮＦαを含む。

一部の実施形態では、ＳＦＦＦ培地は、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、Ｙ－２７６３２、ヒトＥＧＦ、マウスＦＧＦ１０、マウスＩＬ－１β、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、および改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地を含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

一部の実施形態では、ＳＦＦＦ培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約１０μＭのＳＢ４３１５４２、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭのＢＩＲＢ７９６、約１０μＭのＹ－２７６３２、約５０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、約１０ｎｇ／ｍｌのマウスＦＧＦ１０、約１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１Ｂ、約５μｇ／ｍｌのヘパリン、約１×のＢ－２７サプリメント、約１×の抗生物質－抗真菌薬、約１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１×のＧｌｕｔａＭＡＸおよび約１．２５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

他の実施形態では、ＳＦＦＦ培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、Ｙ－２７６３２、ヒトＥＧＦ、ヒトＦＧＦ１０、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸおよびＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

他の実施形態では、ＳＦＦＦ培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約１０μＭのＳＢ４３１５４２、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭのＢＩＲＢ７９６、約１０μＭのＹ－２７６３２、約５０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、約１０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ１０、約５μｇ／ｍｌのヘパリン、約１×のＢ－２７サプリメント、約１×の抗生物質－抗真菌薬、約１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１×のＧｌｕｔａＭＡＸおよび約１．２５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

一部の実施形態では、増殖培地は、ヒト肺幹細胞（例えば、ヒトＡＥＣ２細胞）自己再生のために調合される。

処置期間において異なる時点で、異なる持続時間にわたり、一部の成長栄養素を本開示の培養培地に添加することができることが理解されるであろう。処置期間は、幹細胞が培養培地と接触している期間を指す。

一部の実施形態では、１種または複数の成長栄養素は、処置期間の持続時間にわたり常時、増殖培地中に存在する。増殖培地中に常時存在し得る成長栄養素の例は、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸおよび／またはＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む。

一部の実施形態では、１種または複数の成長栄養素は、処置期間の限定された持続時間にわたり（例えば、培養の０日目～４日目にまたは最初の４日間だけ）、増殖培地中に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）は、処置期間の０日目～４日目に、増殖培地中に存在する。一部の実施形態では、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１β）は、処置期間の最初の４日間のみに存在する。

用語「増殖」、「増殖する」または「増加する」は、肺幹細胞増殖の文脈で使用される場合、肺幹細胞（例えば、ＡＥＣ２細胞）の数の統計的に有意な量での増加を意味する。用語「増殖」、「増殖する」または「増加する」は、対照または参照レベルと比較した、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％のもしくは最大１００％かつ１００％を含む増加、または対照または参照レベルと比較した、少なくとも約２倍もしくは少なくとも約３倍もしくは少なくとも約４倍もしくは少なくとも約５倍、少なくとも約６倍もしくは少なくとも約７倍もしくは少なくとも約８倍、少なくとも約９倍もしくは少なくとも約１０倍の増加または１０倍もしくはそれよりも多いいずれかの増加を意味する。対照／参照試料は、例えば、本明細書に記載されている増殖培地または方法を使用して増殖されていない、例えば、増殖培地培養の開始時におけるまたは増殖培地培養物に添加された細胞の初期数における、同じ生物学的供給源から得られる細胞の集団を指す。

本開示の別の態様は、肺幹細胞（例えば、２型肺胞上皮細胞）培養維持培地を提供する。用語「維持培地」または「ＡＭＭ」は、本明細書で互換的に使用され、細胞培養において細胞の特定の細胞状況を維持することができる細胞培養培地を指す。例えば、本開示の維持培地を使用して、このようなオルガノイドにおけるＡＥＣ１細胞の誘導を抑圧しつつ、ＡＥＣ２細胞同一性を維持することができる。

一部の実施形態では、本開示の維持培地は、本開示の増殖培地および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤を含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

ＢＭＰ阻害剤の例は、ノギン、ＤＭＨ－１、コーディン、グレムリン、クロスベインレス、ＵＳＡＧ－１、ＬＤＮ１９３１８９、フォリスタチン、フォリスタチン様、ＤＭＨ－２、ＬＤＮ ２１２８５４、ＬＤＮ ２１４１１７、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）二塩酸塩およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、維持培地は、ＢＭＰ阻害剤を含み、ＢＭＰ阻害剤は、ノギンまたはＤＭＨ－１である。一部の実施形態では、ノギンは、マウスノギンである。

一部の実施形態では、本開示の維持培地は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でノギンを含む。一部の実施形態では、本開示の維持培地は、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でノギンを含む。

一部の実施形態では、本開示の維持培地は、約０．１μＭ～約５μＭの濃度でＤＭＨ－１を含む。一部の実施形態では、維持培地は、約１μＭの濃度でＤＭＨ－１を含む。

一部の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、処置期間の持続時間全体にわたり、維持培地中に存在する。

一部の実施形態では、ＡＭＭ培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地におけるＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＲＢ７９６、ＤＭＨ－１、Ｙ－２７６３２、ヒトＥＧＦ、マウスＦＧＦ１０、マウスＩＬ－１β、マウスノギン、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸおよびＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む。

一部の実施形態では、ＡＭＭ培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約１０μＭのＳＢ４３１５４２、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、約１μＭのＢＩＲＢ７９６、約１μＭのＤＭＨ－１、約１０μＭのＹ－２７６３２、約５０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、約１０ｎｇ／ｍｌのマウスＦＧＦ１０、約１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－１β、約（ａｏｕｔ）１０ｎｇ／ｍｌのマウスノギン、約５μｇ／ｍｌのヘパリン、約１×のＢ－２７サプリメント、約１×の抗生物質－抗真菌薬、約１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約１×のＧｌｕｔａＭＡＸおよび約１．２５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

一部の実施形態では、維持培地は、ヒト肺幹細胞（例えば、ヒトＡＥＣ２細胞）維持のために調合される。

本開示の別の態様は、肺幹細胞（例えば、２型肺胞上皮細胞）培養分化培地を提供する。用語「分化培地」または「ＡＤＭ」は、本明細書で互換的に使用され、細胞培養において細胞の異なる細胞状況へと分化するための細胞の特定の細胞状況を促進することができる細胞培養培地を指す。例えば、本開示の分化培地を使用して、ＡＥＣ２細胞をＡＥＣ１細胞へと変換することができる。

本開示の分化培地は、１種または複数の増殖因子およびサプリメントを含むことができる。さらに、本開示の分化培地は、血清（例えば、ウシ胎仔血清、ヒト血清）を含有することができる。

本開示の分化培地は、分化培地および細胞外構成成分（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の１：１混合物を含むことができる。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地におけるＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ヘパリン、ＥＦＧ、ＦＧＦ１０、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）および抗生物質－抗真菌薬のうち少なくとも１種、ならびに／またはこれらの組合せを含む、これからなるまたはこれから本質的になる。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約のＩＴＳ、インスリン１．７μＭ、トランスフェリン０．０６８μＭおよび亜セレン酸塩：０．０３８μＭ、約１％のＧｌｕｔａｍａｘ、約５μｇ／ｍｌヘパリン、約５ｎｇ／ｍｌヒトＥＦＧ、約１ｎｇ／ｍｌマウスＦＧＦ１０、約１０％ウシ胎仔血清および約１％ａｎｔｉ－ａｎｔｉ（抗細菌薬および抗真菌薬）の濃度を含む。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地におけるヒトＥＧＦ、マウスＦＧＦ１０、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインおよびウシ胎仔血清を含む。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約５ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、約１ｎｇ／ｍｌのマウスＦＧＦ１０、約５μｇ／ｍｌのヘパリン、約１×のＢ－２７サプリメント、約１×の抗生物質－抗真菌薬、約１×のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１．２５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、約１０％のＦＢＳを含む。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地におけるヒトＥＧＦ、ヒトＦＧＦ１０、ヘパリン、Ｂ－２７サプリメント、抗生物質－抗真菌薬、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインおよびヒト血清を含む。

一部の実施形態では、分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地における約５ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、約１ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ１０、約５μｇ／ｍｌのヘパリン、約１×のＢ－２７サプリメント、約１×の抗生物質－抗真菌薬、約１×のＧｌｕｔａＭＡＸ、約１．２５ｍＭおよび約１０％のヒト血清を含む。

一部の実施形態では、分化培地の成長栄養素は、処置期間の持続時間全体にわたり、分化培地中に存在する。

一部の実施形態では、分化培地は、ＴＧＦβおよびｐ３８キナーゼの阻害剤を含有しない。

一部の実施形態では、分化培地は、ヒト肺幹細胞（例えば、ヒトＡＥＣ２細胞）分化のために調合される。

一部の実施形態では、本開示の分化培地は、血清（ウシ胎仔血清またはヒト血清）を含有せず、よって、無血清培地と考慮される。

本開示の無血清分化培地は、血清の代わりにサイトカインを含むことができる。一部の実施形態では、本開示の無血清分化培地は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－６を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の無血清分化培地は、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－６を含む。

一部の実施形態では、肺幹細胞が維持培地において培養された後に、または肺幹細胞が本開示のＳＦＦＦ培地において培養された後に、本開示の無血清分化培地を使用して、肺幹細胞（例えば、ＡＥＣ２細胞）を培養することができる。

本開示の別の態様は、肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムであって、本開示の培地のいずれかにおいて培養された単離された肺胞上皮細胞を含むシステムを提供する。

本システムの一部の実施形態では、肺胞上皮細胞は、２型肺胞上皮細胞を含む。本システムの他の実施形態では、肺胞上皮細胞は、ＡＥＣ２およびＡＥＣ１細胞の混合物を含む。本システムの他の実施形態では、肺胞上皮細胞は、いずれか所与の時点で、培養培地においてＡＥＣ２細胞を優勢に（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％超）含む。本システムの他の実施形態では、肺胞上皮細胞は、分化培地によるＡＥＣ２細胞の処置後に、ＡＥＣ１細胞を優勢に（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％超）含む。

方法

本発明のさらに別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイド培養物において肺幹細胞を増殖、維持および／または分化する方法であって、肺幹細胞を得るステップと、細胞を本開示の培養培地と接触させるステップとを含む、これからなるまたはこれから本質的になる方法を提供する。

用語「肺幹細胞を得るステップ」は、細胞または細胞の集団を、それが本来存在する対象または肺試料から除去するプロセスを指す。肺幹細胞は、生きているまたは死亡した対象における健康なまたは罹病した肺組織から得ることができる。肺幹細胞は、疾患（肺疾患またはその他（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ））を有する対象、または肺疾患を発症するリスクがある対象から得ることができる。肺幹細胞が、本開示の培養培地と接触して置かれる前に、細胞または細胞の集団は、試料由来の他の型の細胞または組織から分離および精製することができる。

上述の方法の一部の実施形態では、肺幹細胞は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆体（ＡＥＰ）細胞、クララ細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系譜陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺導管細胞、人工多能性幹細胞由来肺幹細胞および肺胞２型上皮（ＡＥＣ２）細胞を含む。一部の実施形態では、肺幹細胞は、肺胞２型上皮（ＡＥＣ２）細胞を含む。

上述の方法の一部の実施形態では、培養培地は、本開示の増殖培地、維持培地または分化培地である。

上述の方法の一部の実施形態では、サイトカインは、培養の最初の約４日間にわたり培養培地に添加される。

一部の実施形態では、増殖培地、維持培地または分化培地は、ヒト幹細胞による使用のために調合される。

上述の方法の一部の実施形態では、肺幹細胞は、対象に投与される。上述の方法の一部の実施形態では、肺幹細胞は、治療有効量で対象に投与される。

用語「投与」または「投与すること」は、ヒト、霊長類、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、獣医学対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、臓器または体液に適用される場合、限定することなく、対象、細胞、組織、臓器または体液およびその他への、外因的リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬剤、治療剤、診断剤または組成物の接触を指す。投与は、例えば、治療的、薬物動態的、診断的、研究的、プラセボ的および実験方法を指すことができる。「投与」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断、結合組成物または別の細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ処置を包含する。

本開示のシステムおよび方法によって培養された肺幹細胞（例えば、ＡＥＣ２細胞）は、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、頭蓋内、眼内、脳内、心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、気管内および静脈内を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知のいずれかの経路によって、対象（例えば、ヒト、マウス、サル、または肺を有するいずれかの哺乳動物）に投与することができる。

上述の方法の一部の実施形態では、所望の肺幹細胞は、本開示の増殖培地を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖して、治療法、研究または貯蔵（例えば、凍結保存による）に要求される十分な数の細胞を得ることができる。一部の実施形態では、所望の肺幹細胞は、対象（例えば、ヒト、マウス、または肺を有するいずれかの哺乳動物）における収集、注射および／または生着に十分な量で増殖することができる。

上述の方法の一部の実施形態では、オルガノイド培養物は、遺伝子編集または肺疾患モデル化のための使用に十分な量で増殖することができる。

本開示の別の態様は、線維芽細胞の非存在下で肺腫瘍細胞を培養する方法であって、対象から腫瘍細胞を単離するステップ、腫瘍細胞を、請求項７～１２のいずれかに記載の増殖培地と接触させるステップを含む方法を提供する。本開示の細胞培養培地を使用して、腫瘍細胞を増殖して、研究目的のための（例えば、がん病理学を理解するためのまたは治療剤の有効性を検査するための）腫瘍に基づくオルガノイドモデルの作成に使用することができる。

肺腫瘍細胞は、肺がんを患う対象から単離することができる。単離される腫瘍細胞は、原発性肺腫瘍または続発性肺腫瘍（例えば、別の組織において開始し、肺に転移するがん）であり得る。肺腫瘍細胞の例は、小細胞癌、組み合わせた小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、パンコースト腫瘍細胞、神経内分泌腫瘍、または肺カルチノイド腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない、小細胞肺がん細胞または非小細胞肺がん細胞を含むがこれらに限定されない。確立された肺がん細胞系を、本開示の培養培地と共に使用することもできる。本開示の細胞培地と共に使用することができる肺がん細胞系は、ＡＴＣＣウェブサイト上に見出すことができる。肺がん細胞系の例は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合－Ａ５４９同質遺伝子的細胞系、ＮＣＩ－Ｈ８３８［Ｈ８３８］、ＨＣＣ８２７、ＳＫ－ＬＵ－１、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、ＮＣＩ－Ｈ１８１９［Ｈ１８１９］、ＮＣＩ－Ｈ６７６Ｂ［Ｈ６７６Ｂ］、Ｈｓ ６１８．Ｔ、ＨＢＥ４－Ｅ６／Ｅ７［ＮＢＥ４－Ｅ６／Ｅ７］、ＮＣＩ－Ｈ１６６６［Ｈ１６６６、Ｈ１６６６］、ＮＣＩ－Ｈ２３［Ｈ２３］、ＮＣＩ－Ｈ１４３５［Ｈ１４３５］、ＮＣＩ－Ｈ１５６３［Ｈ１５６３］、７０３Ｄ４およびＮＣＩ－Ｈ１６８８［Ｈ１６８８］、ＮＣＩ－Ｈ１８７［Ｈ１８７］、ＮＣＩ－Ｈ６６１［Ｈ６６１］、ＮＣＩ－Ｈ４６０［Ｈ４６０］、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ１１５５［Ｈ１１５５］、ＤＭＳ １１４、ＮＣＩ－Ｈ６９［Ｈ６９］、ＤＭＳ ７９、ＤＭＳ
５３、ＳＷ １２７１［ＳＷ１２７１、ＳＷ１２７１］、ＳＨＰ－７７、ＮＣＩ－Ｈ２０９［Ｈ２０９］、ＮＣＩ－Ｈ１４６［Ｈ１４６］、ＮＣＩ－Ｈ３４５［Ｈ３４５］、ＮＣＩ－Ｈ１３４１［Ｈ１３４１］、ＤＭＳ １５３、ＮＣＩ－Ｈ８２［Ｈ８２］、ＮＣＩ－Ｈ１０４８［Ｈ１０４８］、ＮＣＩ－Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＮＣＩ－Ｈ４４６［Ｈ４４６］、ＮＣＩ－Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ［Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ５１０］、Ｈ６９ＡＲ． ＨＬＦ－ａ、Ｈｓ ９１３Ｔ、ＧＣＴ［巨細胞腫瘍］、ＳＷ ９００［ＳＷ－９００、ＳＷ９００］、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）、ＨＢＥ１３５－Ｅ６Ｅ７、Ｔｅｒａ－２、ＮＣＩ－Ｈ２９２［Ｈ２９２］、ｓＮＦ０２．２、ＮＣＩ－Ｈ１７０３［Ｈ１７０３］、ＮＣＩ－Ｈ２１７２［Ｈ２１７２］、ＮＣＩ－Ｈ２４４４［Ｈ２４４４］、ＮＣＩ－Ｈ２１１０［Ｈ２１１０］、ＮＣＩ－Ｈ２１３５［Ｈ２１３５］、ＮＣＩ－Ｈ２３４７［Ｈ２３４７］、ＮＣＩ－Ｈ８１０［Ｈ８１０］、ＮＣＩ－Ｈ１９９３［Ｈ１９９３］およびＮＣＩ－Ｈ１７９２［Ｈ１７９２］を含むがこれらに限定されない。

本開示の別の態様は、病原体に感染した肺胞球を培養する方法であって、本開示の培養培地により肺細胞を培養するステップと、肺細胞を感染するのに有効な量で病原体を肺細胞に接種するステップとを含む、これからなるまたはこれから本質的になる方法を提供する。

本開示のさらに別の態様は、オルガノイド培養物において病原体感染を処置または予防することができる薬剤を同定するための方法であって、ｉ）本開示の培地において細胞を培養するステップと、ｉｉ）細胞を感染するのに有効な量で病原体を細胞に接種するステップと、ｉｉｉ）細胞を薬剤と接触させるステップと、ｉｖ）薬剤が、薬剤で処置されなかった細胞と比べて、細胞における病原体の量の低減を引き起こすか決定するステップとを含む、これからなるまたはこれから本質的になる方法を提供する。

一部の実施形態では、細胞に病原体を接種する前に、細胞またはオルガノイド培養物は、薬剤と接触される。病原体による感染前に細胞を薬剤と接触させるステップは、薬剤が、予防薬として作用することができる（例えば、病原体による感染を予防またはその重症度を低減することができる）か決定することができる。

他の実施形態では、細胞に病原体を接種した後に、細胞またはオルガノイド培養物は、薬剤と接触される。病原体による感染後に細胞を薬剤と接触させるステップは、薬剤が、病原体感染を処置することができるか決定することができる。

一部の実施形態では、薬剤で処置されなかった対照細胞と比べた、細胞における病原体の量の低減は、対照細胞または参照レベルと比較した、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の低減もしくは最大１００％かつ１００％を含む低減、または約２分の１以下もしくは約３分の１以下もしくは約４分の１以下もしくは約５分の１以下、約６分の１以下もしくは約７分の１以下もしくは約８分の１以下、約９分の１以下もしくは約１０分の１以下への低減または１０分の１もしくはそれに満たないいずれかの低減であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「感染する」または「感染」は、疾患を引き起こす病原体による人間、オルガノイドまたは細胞の罹患を指す。

病原体は、細菌、ウイルスまたは真菌であり得る。

一部の実施形態では、病原体は、ヒトまたは肺を持ついずれかの動物の肺に感染する細菌、ウイルスまたは真菌である。

肺に感染し得る細菌は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むがこれらに限定されない。

肺に感染し得るウイルスは、２２９Ｅ（アルファコロナウイルス）、ＮＬ６３（アルファコロナウイルス）、ＯＣ４３（ベータコロナウイルス）、ＨＫＵ１（ベータコロナウイルス）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群またはＭＥＲＳを引き起こすベータコロナウイルス）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群またはＳＡＲＳを引き起こすベータコロナウイルス）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス疾患２０１９またはＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす新型コロナウイルス）、インフルエンザ－Ａウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、低病原性鳥インフルエンザ、高病原性鳥インフルエンザまたはＨ５Ｎ１）、インフルエンザ－Ｂウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）またはエンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス７１）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

肺に感染し得る真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）を含むがこれに限定されない。

一部の実施形態では、病原体に感染され得る細胞は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系譜陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺導管細胞、人工多能性幹細胞由来肺幹細胞または肺胞２型上皮である。一部の実施形態では、病原体に感染され得る細胞は、肺胞２型上皮細胞（ＡＥＣまたはＡＴ２）である。

一部の実施形態では、上述の方法と共に使用される培養培地は、本開示の増殖培地、本開示の維持培地または本開示の分化培地である。

「薬剤」は、本明細書で使用される場合、疾患の処置、予防または緩和に使用することができる小分子、タンパク質、ペプチド、遺伝子、化合物または他の薬学的活性成分を指す。

本開示の別の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺胞球におけるウイルス力価を低減する方法であって、肺胞球がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に、肺胞球を薬剤と接触させるステップを含む、これからなるまたはこれから本質的になり、肺胞球が、薬剤と接触されなかった肺胞球と比べて低減されたウイルス力価を示す、方法を提供する。

上述の方法の一部の実施形態では、薬剤は、インターフェロンである。インターフェロンは、いくつかのウイルスの存在に応答して宿主細胞によって作製および放出されるシグナル伝達タンパク質の一群である。インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型インターフェロンであり得る。インターフェロンの例は、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－ε、ＩＮＦ－ｋ、ＩＮＦ－ｗ、ＩＮＦ－γ、ＩＬ１０Ｒ２およびＩＮＦＲ１を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮαおよびＩＦＮγである。

キット

本開示の別の態様は、肺胞上皮細胞の培養、増殖、維持および／または分化のための化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含む、これからなるまたはこれから本質的になるキットであって、本開示の培地および使用のための説明書を含む、これからなるまたはこれから本質的になるキットを提供する。

本開示の別の態様は、オルガノイド培養物において細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、本開示の培地および使用のための説明書を含む、これからなるまたはこれから本質的になるキットを提供する。

本開示の別の態様は、オルガノイド培養物またはその派生物においてｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細菌、ウイルスおよび真菌感染を処置または予防する薬剤を決定するための、化学的に規定された間質不含のオルガノイド培養システムを含むキットであって、本開示の培地および使用のための説明書を含む、これからなるまたはこれから本質的になるキットを提供する。

次の実施例は、説明として提供されており、限定として提供されるものではない。

材料と方法

マウス

Ｓｆｔｐ^{ｃｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ｂｌｈ}（Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ）、Ｒｏｓａ２６Ｒ－ＣＡＧ－ｌｓｌ－ｔｄＴｏｍａｔｏは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて維持した。ＮＵ／Ｊ（ヌード）、Ｂ６Ｊ．１２９（Ｃｇ）－Ｉｇｓ２^{ｔｍ１．１（ＣＡＧ－ｃａｓ９＊）Ｍｍｗ／}Ｊ（Ｈ１１－Ｃａｓ９）、Ｂ６．１２９Ｓ４－Ｋｒａｓｔｍ４Ｔｙｊ／Ｊ（Ｋｒａｓ－ｌｓｌ－Ｇ１２Ｄ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｃｔｇｆ－ＧＦＰは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓからご厚意により贈与された。Ｓｆｔｐｃ－ＧＦＰマウスは、以前に記載された（Ｂｌａｎｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４， １２４２２８１）。系譜追跡のため、マウスに、経口胃管栄養により０．２ｍｇ／ｇタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を与えた。ブレオマイシン傷害のため、２．５Ｕ／ｋｇブレオマイシンを、タモキシフェンの最終用量の２週間後に鼻腔内投与し、マウスを毎日モニターした。動物実験は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ施設内実験動物委員会によって承認された。

マウス肺組織解離およびＦＡＣＳ選別

肺解離およびＦＡＣＳを、以前に記載された通りに行った（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １４５（９）：１－１０）。簡潔に説明すると、肺を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２におけるディスパーゼ（５Ｕ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（０．３３Ｕ／ｍｌ）およびコラゲナーゼＩ型（４５０Ｕ／ｍｌ）を含有する酵素溶液１ｍｌにより気管内で膨張させた。分離された肺葉をさいの目に切り、３ｍｌ酵素溶液と共に３０分間３７℃で回転しつつインキュベートした。反応を等しい量のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地でクエンチし、１００μｍ濾過器を通して濾過した。細胞ペレットを、赤血球細胞溶解緩衝剤（１００μＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ）に５分間再懸濁し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄し、４０μｍ濾過器を通して濾過した。総細胞を４５０ｇで５分間４℃にて遠心分離し、ＦＡＣＳによってＡＴ２単離のために細胞ペレットを処理した。

ヒト肺組織解離

ヒト肺解離は、以前に記載された通りであった（Ｚａｃｈａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ．，
２０１８， Ｎａｔｕｒｅ ５５５， ２５１－２５５）。簡潔に説明すると、胸膜を除去し、残っているヒト肺組織（およそ２ｇ）を、１％抗生物質－抗真菌薬を含有するＰＢＳで洗浄し、小片になるようにカットした。目に見える小さい気道および血管を慎重に除去して、目詰まりを回避した。次に、試料を３０ｍｌの酵素混合物（コラゲナーゼＩ型：１．６８ｍｇ／ｍｌ、ディスパーゼ：５Ｕ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ：１０Ｕ／ｍｌ）により３７℃で１時間、回転しつつ消化した。細胞を、１００μｍ濾過器を通して濾過し、濾過器を通した１５ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地でリンスした。４５０ｇで１０分間の遠心分離後に上清を除去し、細胞ペレットを赤血球細胞溶解緩衝剤に１０分間再懸濁し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄し、４０μｍ濾過器を通して濾過した。総細胞を４５０ｇで５分間４℃にて遠心分離し、ＡＴ２単離のために細胞ペレットを処理した。

ヒトおよびマウスＡＴ２細胞の単離

磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくプロトコールによって、ＡＴ２細胞を単離した。マウスＡＴ２単離のため、総肺細胞ペレットをＭＡＣＳ緩衝剤（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。製造業者の使用説明書に従ってＭＡＣＳビーズを使用して、ＣＤ３１／ＣＤ４５陽性細胞を枯渇させた。ＣＤ３１／ＣＤ４５枯渇後に、ＴｄＴｏｍａｔｏレポーターに基づきＡＴ２細胞を選別し、レポーターなしのＡＴ２細胞については、以前に記載された通りに、次の抗体を使用して細胞を染色した：ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３２６、ＰＤＧＦＲα／ＣＤ１４０ａおよびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（Ｋａｔｓｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １２（４）：６５７－６６６）。ヒトＡＴ２細胞の単離のため、およそ２百万～１千万個の総肺細胞をＭＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸと共に１５分間４℃で、続いてＨＴＩＩ－２８０（１：６０希釈）抗体と共に１時間４℃でインキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、次いで抗マウスＩｇＭマイクロビーズと共に１５分間４℃でインキュベートした。細胞をＬＳカラムにロードし、標識された細胞を磁気により採取した。ヒトＡＴ２細胞のＦＡＣＳに基づく精製のため、総肺細胞ペレットをＭＡＣＳ緩衝剤に再懸濁した。製造業者の使用説明書に従ってＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）マイクロビーズを使用して、細胞をＥｐＣＡＭ集団について正に選択した。ＣＤ３２６選択された細胞を、ＨＴＩＩ－２８０およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで３７℃にて２５分間、続いて二次Ａｌｅｘａ抗マウスＩｇＭ－４８８で１０分間３７℃にて染色した。ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥおよびＳＯＮＹ ＳＨ８００Ｓを使用して、選別を行った。

肺胞球（オルガノイド）培養

マウスの従来の肺胞球培養（ＭＴＥＣ培地を使用）を以前に記載された通りに行った（Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２３， ３０２５－３０３６）。簡潔に説明すると、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｌｓｌ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来のＦＡＣＳ選別された系譜標識されたＡＴ２（１～３×１０^３個）細胞、およびＰＤＧＦＲα^＋（５×１０^４個）細胞をＭＴＥＣ／Ｐｌｕｓまたは無血清培地に再懸濁し、等しい体積の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、＃３５４２３０）と混合した。

フィーダー不含培養のため、ＡＴ２（１～３×１０^３個）を無血清培地に再懸濁し、等しい量のＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ培養のため、２４ウェル０．４μｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｆａｌｃｏｎ）に１００μｌの培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物を播種した。液滴（ｄｒｏｐ）培養のため、５０μｌの細胞－培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物の液滴３個を６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。培地を１日おきに交換した。

無血清培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）、１μＭ ＢＩＲＢ７９６（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）、５μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌマウスＦＧＦ１０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）、インスリン－トランスフェリン－セレニウム（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１％Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および１％抗生物質－抗真菌薬（ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有した。肺胞増殖培地のため、１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ－１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１０ｎｇ／ｍｌマウスＴＮＦａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を無血清培地に添加した。肺胞維持培地のため、１０ｎｇ／ｍｌマウスノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）および１μＭ ＤＭＨ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）を肺胞増殖培地に添加した。肺胞分化培地は、改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２においてＩＴＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、５μｇ／ｍｌヘパリン、５ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌマウスＦＧＦ１０、１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質－抗真菌薬（ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）を含有した。

詳細なＳＦＦＦおよびＡＭＭ培地組成については、表１を参照されたい。

ヒト肺胞球培養のため、ＨＴＩＩ－２８０^＋ヒトＡＴ２（１～３×１０^３個）を無血清培地に再懸濁し、等しい量のＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、６ウェルプレートにプレーティングした。詳細なマウスおよびヒト無血清、フィーダー不含（ＳＦＦＦ）培地組成については、表１および表２を参照されたい。

肺胞球継代培養

上に記載されている通りの組成のＡＭＭ培地において、マウス肺胞球継代培養実験を行った。簡潔に説明すると、ＦＡＣＳ選別されたマウスＡＴ２細胞（２×１０^３個）をＡＭＭ培地に再懸濁し、等しい体積のＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。５０μｌの細胞－培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物の液滴３個を、生物学的複製（ｎ＝３）毎に６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。継代毎に、マウスＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を最初の４日間にわたり添加し、その後、培地をＩＬ－１βなしのＡＭＭに置き換えた。培地を３日毎に交換した。マウス肺胞球を１０日毎に継代した。ヒト肺胞球継代のため、ＡＴ２細胞（３×１０^３個）をＳＦＦＦ培地に再懸濁し、等しい体積のＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。５０μｌの細胞－培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物の液滴３個を、ドナー（ｎ＝３）毎に６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。肺胞球を１０～１４日毎に継代した。

ＡＴ２分化

詳細なマウスおよびヒトＡＴ２－分化培地（ＡＤＭ）組成については、表を参照されたい。分化のため、それ以外のことが記述されている場合を除いて、マウス肺胞球をＡＭＭ培地において１０日間培養し、これをＡＴ２－分化培地にスイッチし、続いてさらに７日間培養した。分化のため、それ以外のことが記述されている場合を除いて、ＳＦＦＦ培地において１０日間培養されたヒト肺胞球をＡＤＭにスイッチし、さらに１２～１５日間培養した。培地を３日毎に交換した。ヒトＡＴ２－分化培地は、ＦＢＳの代わりにヒト血清を含有する。分化培地は、血清の代わりにＩＬ－６（２０ｎｇ／ｍＬ）を含むこともできる。

バルクＲＮＡｓｅｑおよびｑＰＣＲ研究のための肺胞球感染実験

肺胞球培養物を感染させるために、細胞を１ｍｌ ＰＢＳで洗浄し、次いで１のＭＯＩでウイルスを細胞に添加した。ウイルスおよび細胞を３．５時間３７℃でインキュベートし、その後、ウイルスを除去し、細胞培養培地を添加した。感染を４８または１２０時間進行させ、次いで肺胞球をＰＢＳで洗浄し、上に記載されている通りに解離させた。最後に、肺胞球由来細胞をＴｒｉｚｏｌにおいて貯蔵し、－８０℃で貯蔵した。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＡＴ２肺胞球の感染

ヒト肺胞球培養物を５００μｌ １×ＰＢＳで短時間２回洗浄した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰ（ｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰ）ウイルスは、以前に記載された（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。簡潔に説明すると、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＷＡ１ゲノム全体を網羅する７種のｃＤＮＡ断片を増幅した。各断片の間のジャンクションは、非パリンドローム部位ＢｓａＩ（ＧＧＴＣＴＣＮ）またはＢｓｍＢＩ（ＣＧＴＣＴＣＮ）を含有し、それぞれ特有の４ヌクレオチド突出末端を有する。断片ＥおよびＦは、両末端に２個のＢｓｍＢＩ部位を含有するが、他の断片は、ジャンクションにＢｓａＩ部位を有する。各断片を高コピーベクターｐＵＣ５７にクローニングし、サンガー配列決定によって検証した。サイレントな突然変異Ｔ１５１０２Ａを、遺伝的マーカーとしてプラスミドＤのｎｓｐ１２における保存された領域に導入した。ＯＲＦ７遺伝子を置き換えることにより、ＧＦＰを挿入した。次に、培養物に、２００μｌの１×１０^７ＰＦＵ／ｍｌのｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰウイルス（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）または偽培養物のために２００μｌの１×ＰＢＳを接種した。５％ＣＯ２を補充した状態で肺胞球を３７℃で２時間インキュベートさせた。インキュベーション後に、接種材料を除去し、肺胞球培養物を５００μｌ １×ＰＢＳで３回洗浄した。１ｍＬのＳＦＦＦ培地を各培養物に添加した。肺胞球を３７℃で７２時間インキュベートし、感染中に２４時間毎に試料を採取した。試料採取するために、１００μｌの培地を除去した。次に、等しい体積の新鮮培地を培養物に添加して、試料採取された体積を置き換えた。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）におけるプラークアッセイによって、７２時間後にウイルス力価を最終的に決定した。３日後にニュートラルレッド染色によってウイルスプラークを可視化した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。組織学的解析のため、肺胞球を１０％ホルマリン溶液において７日間固定し、続いてＰＢＳにおいて３回洗浄した。

インターフェロン処置

インターフェロンおよびサイトカイン処置実験のため、Ｐ２またはＰ３継代由来のヒトＡＴ２細胞（２．５×１０^４個）をｍａｔｒｉｇｅｌの表面で培養した。細胞のプレーティングに先立ち、１２ウェルプレートを、ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１のｍａｔｒｉｇｅｌおよびＳＦＦＦＭミックス）で３０分間予めコーティングした。ＩＬ－１βなしのＳＦＦＦＭにおいてＡＴ２細胞を７～１０日間成長して、肺胞球を形成させた。ＲＮＡ単離および定量的ＰＣＲのため、肺胞球を２０ｎｇ／ｍｌインターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）で１２時間または７２時間処置した。組織学的解析のため、肺胞球を指し示されているインターフェロンで７２時間処置した。ウイルス感染に先立ち、ヒト肺胞球培養物を１０ｎｇ ＩＦＮαまたは１０ｎｇ ＩＦＮγで１８時間前処置した。ＩＦＮ阻害研究のため、培養時間全体にわたり肺胞球を１μＭルキソリチニブで処置した。

ＲＮＡ単離およびｑＲＴ－ＰＣＲ

ＲＮＡ単離のため、ＴｒｙｐＬＥ（商標）選択酵素を３７℃で１０分間使用して、肺胞球を解離して単一細胞懸濁液とした。細胞ペレットを３００μｌのＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬に再懸濁した。ＤＮａｓｅ Ｉ処置を用いて、製造業者の使用説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキットを使用して、全ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩとランダムヘキサマーまたはマイナス鎖特異的プライマーを使用して、各試料の６００ｎｇの単離された全ＲＮＡから逆転写を行った。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックスを使用して、定量的ＲＴＰＣＲアッセイを行った。標準曲線の方法を使用して、全標的遺伝子のｍＲＮＡの相対的な含量を決定した。各試料における標的遺伝子転写物をグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。使用されたプライマーを表３に収載する。

バルクＲＮＡ配列決定および差次的遺伝子発現解析

ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｅ７４９０）を使用して、各試料由来の精製されたＲＮＡ（１μｇ）をポリＡ ＲＮＡについて濃縮した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ
ＩＩ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｅ７７７０）を使用して、ライブラリーを調製した。試料毎に少なくとも１５００万個のリードによるＨｉＳｅｑ Ｘを使用して、ペアードエンド配列決定（リード毎に１５０ｂｐ）を行った。ＦａｓｔＱＣ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して、配列決定されたリードの品質を評価した。Ｃｕｔａｄａｐｔ（Ｍａｒｔｉｎ， ２０１１）を使用して、ポリＡ／Ｔテイルをトリミングした。アダプター配列をトリミングし、２４ｂｐよりも短いリードは、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）を使用してトリミングした。リードを、デフォルト設定によるＨｉｓａｔ２（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）を使用して、ＵＣＳＣから得たヒト（ｈｇ３８）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ｗｕｈＣｏｒ１）の参照ゲノムにマッピングした。ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９）を使用して、重複リードを除去した。ＳＵＢＲＥＡＤ（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）のｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓオプションを使用して、断片数を計数した。対照および処置の間で差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）の正規化および抽出は、Ｒ ｐａｃｋａｇｅ、ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）を使用して行った。

腫瘍オルガノイド培養物

ＣｒｅリコンビナーゼおよびＧＦＰを保有するアデノウイルス（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＬ１００７０６）を使用して、Ｋ－ｒａｓｌｓｌ－Ｇ１２Ｄ；Ｒｏｓａ２６Ｒ－ＣＡＧ－ｌｓｌ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスに腫瘍を誘導した。６～８週齢前後で、マウスを、１００μｌにおけるおよそ２．５×１０^７プラーク形成単位のウイルスに鼻腔内感染させた。腫瘍誘導の少なくとも８ヶ月後に肺を単離した。目に見える腫瘍小結節を顕微鏡下で手作業により解剖し、上に記載されている通りに解離した。細胞を抗ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３２６抗体およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色し、ＳＯＮＹ ＳＨ８００Ｓを使用することにより、腫瘍細胞をｔｄＴｏｍａｔｏ＋、ＥＰＣＡＭ＋およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ＋集団として選別した。ＦＡＣＳ選別された細胞を培地に再懸濁し、等しい量のＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。５０μｌに２×１０^３個の細胞を含有する液滴３個を、６ウェルプレートにプレーティングした。培地を１日おきに交換した。

オルガノイド由来細胞のグラフト

１０～１２日目にアクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と、それに続く０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処置により、オルガノイドを解離して単一細胞とし、１％Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを有する無血清培地に再懸濁した。ブレオマイシンの鼻腔内投与の１０日後に、ヌードマウスに、５～７×１０^５個の細胞を含有する培地８０μｌを気管内注射した。グラフトの少なくとも２ヶ月後に、肺を固定し解析した。

組織調製および切片作製

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ由来の肺および肺胞球を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でそれぞれ４℃にて４時間および室温にて３０分間固定した。液滴由来のオルガノイド培養物は、先ず１％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ）で浸漬し、４％で室温にて３０分間固定した。ＯＣＴ凍結ブロックのため、試料をＰＢＳで洗浄し、３０％スクロースと共に４℃で一晩インキュベートした。そして次に、試料を３０％スクロース／ＯＣＴの１：１混合物と共に４時間４℃でインキュベートし、ＯＣＴに包埋し、凍結切片作製した（１０μｍ）。パラフィンブロックのため、試料を脱水し、パラフィンに包埋し、７μｍで切片作製した。

免疫染色

パラフィン切片は、抗原回復の前に先ずワックス除去し、再水和した。抗原回復システム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）中の１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤またはウォーターバス（９０℃で１５分間）または５分間室温の０．０５％トリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）処置を使用することにより、抗原回復を行った。切片をＰＢＳで洗浄し、透過処理し、ＰＢＳにおける３％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で３０分間室温にてブロッキングし、続いて、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。次に、切片をＰＢＳにおける０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝剤における二次抗体と共に１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＰＩ入りのＦｌｕｏｒ Ｇ試薬を使用してマウントした。一次抗体は次の通りであった：プロサーファクタントタンパク質Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ ａｂ３７８６、１：５００）、ＲＡＧＥ／ＡＧＥＲ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＭＡＢ１１７９、１：２５０）、ＨＯＰＸ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ｓｃ－３０２１６、１：２５０、ｓｃ－３９８７０３、１：２５０）、Ｔ１ａ／ＰＯＤＯＰＬＡＮＩＮ（ＤＳＨＢ、クローン８．１．１、１：１０００）、ＫＲＴ８（ＤＳＨＢ、ＴＲＯＭＡ－Ｉ、１：５０）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＯＲＩＧＥＮＥ、ＡＢ８１８１－２００、１：５００）、ＣＬＤＮ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ３６－４８００、１：２００）、ＧＦＰ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＮＢ１００－１７７０、１：５００）。

ほぼ（ｎｅａｒ）単一細胞懸濁液において染色を定量化するために、ＴｒｙｐＬＥ（商標）選択酵素を３７℃で１５分間使用して、肺胞球バブル（ｂｕｂｂｌｅ）を解離した。活発なピペッティングによりＭａｔｒｉｇｅｌを破壊した。次に、肺胞球由来細胞を、ｍａｔｒｉｇｅｌで予めコーティングされた（５～１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌを３０分間）カバーガラスまたはチャンバースライドに２～３時間プレーティングした。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドにおいて固定した。

電子顕微鏡

オルガノイドを、０．１Ｍカコジル酸緩衝剤ｐＨ７．４（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）中２．５％グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）において３時間室温で固定した。次に、０．１Ｍカコジル酸塩において試料を３回、各１０分間洗浄し、０．１Ｍカコジル酸緩衝剤中１％タンニン酸（Ｓｉｇｍａ）において５分間室温で後固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝剤において再度３回洗浄した。オルガノイドを、０．１Ｍカコジル酸緩衝剤中１％四酸化オスミウム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＭＳ）において一晩暗所で４℃にて後固定した。試料を１０分間０．１Ｎ酢酸緩衝剤において３回洗浄し、１％酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）において１時間室温でブロック染色した。次に、試料を、氷上のアセトン：７０％、８０％、９０％、１００％により、各１０分間脱水し、次いで、プロピレンオキシドと共に室温で１５分間インキュベートした。試料は、ＥＭｂｅｄ ８１２（ＥＭＳ）へと交換して、３時間室温で放置した。新鮮なＥｍｂｅｄ ８１２へと交換し、一晩室温で放置し、その後、これを新鮮に調製されたＥＭｂｅｄ ８１２中に包埋し、一晩６０℃で重合させた。包埋された試料から７０ｎｍで薄切片作製し、グリッドを１％酢酸ウラニル水において５分間室温で、続いてクエン酸鉛において２．５分間室温で染色した。２２００×および１４５００×の拡大率でＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｔｗｉｎにおいてグリッド上の切片を撮像した。

ホールマウントイメージング

肺のホールマウントイメージングのため、肺を４％ＰＦＡで固定し、ＣＵＢＩＣ－１５によって透明化した。蛍光ステレオスコープ（Ｚｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ．Ｖ１２）を使用することにより、画像を得た。オルガノイドのため、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒｏｓａ２６Ｒ－ｌｓｌ－ｔｄＴｏｍａｔｏから単離されたＡＥＣ２細胞を、３５ｍｍガラス底培養皿上で肺胞増殖培地において成長し、オルガノイドを培養の７および１０日目に４％ＰＦＡにおいて３０分間室温で固定した。次に、試料をＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）において４回、各３０分間洗浄し、ブロッキング溶液（１×ＰＢＳ＋０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中１．５％ＢＳＡ）において１時間室温でブロッキングし、ブロッキング溶液における抗ＳＦＴＰＣ（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）および抗ＡＧＥＲ（１：５００ Ｒ＆Ｄ）と共に一晩３７℃でインキュベートした。次に、オルガノイドをＰＢＳＴ（４×３０分間）において洗浄し、ＰＢＳＴにおいて二次抗体と共に１時間３７℃でインキュベートし、３０分間ＰＢＳＴ＋ＤＡＰＩにおいて１回、ＰＢＳＴにおいて２回各３０分間室温で洗浄した。２０×または４０×対物レンズを使用したＯｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡ＦＶ３０００を使用して、画像を捕捉した。

ライブイメージング

Ｓｆｔｐｃ－ＧＦＰマウスから（ｆｏｒｍ）単離されたＡＥＣ２細胞を、３５ｍｍガラス底培養皿上で３日間、肺胞増殖培地において成長した。顕微鏡（ＶｉｖａＶｉｅｗ－Ｏｌｙｍｐｕｓ）により２０分間の間隔でＤＩＣ画像を取得した。３日間のイメージングの後に（培養の６日目）、培地を交換し、イメージングを再度開始し（培養の８日目）、さらに２日間続けた。

プラスミド構築、ＡＡＶ６産生およびオルガノイドにおけるＨＩＴＩに基づく遺伝子編集

骨格としてＡＡＶ：ＩＴＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ｈＳｙｎ－Ｃｒｅ－２ＡＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ－ＷＰＲＥ－ｓｈｏｒｔＰＡ－ＩＴＲ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６０２３１）を使用することにより、Ｓｆｔｐｃ特異的ｇＲＮＡベクターを調製した。先ず、ｈＳｙｎ－Ｃｒｅ－２Ａ－ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ－ＷＰＲＥカセットをＸｂａＩおよびＲｓｒＩＩ消化によって除去し、ｇＲＮＡ結合配列に隣接するＥＧＦＰ遺伝子をプラスミドへとクローニングした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を選択するためのウェブツール「ＣＨＯＰＣＨＯＰ」を使用することにより、Ｓｆｔｐｃ特異的ｇＲＮＡを、コード領域の末端の近くに設計し、Ｕ６プロモーターの下流のＳａｐＩ部位に挿入した。本研究において使用されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列（２０ｂｐ標的および３ｂｐ ＰＡＭ配列（下線が引かれている））は、ＧＧＡＴＧＣＴＡＧＡＴＡＴＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号０１）である。小規模ＡＡＶ産生は、近年発表された方法に従った。手短に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートにプレーティングし、次いで、細胞密度が６０～８０％集密度に達したら、ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ；２４７６５）によりウェル当たり０．４μｇ ＡＡＶプラスミド、０．８μｇヘルパープラスミドｐＡｄ－ＤｅｌｔａＦ６および０．４μｇ血清型２／６プラスミドをトランスフェクトした。１２時間後、細胞を次に、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；３５０５００６１）および１０％ＦＢＳを補充したグルタミン不含ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；１１９６００４４）において２日間インキュベートした。ＡＡＶ含有上清培地を採取し、０．４５μｍフィルター管を通して濾過し、使用まで４℃で貯蔵した。遺伝子編集のため、ＡＥＣ２（ＥＰＣＡＭ＋Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ＋細胞）をＨ１１－Ｃａｓ９マウスから単離した。ＡＥＣ２（５×１０^４個）を肺胞増殖培地に再懸濁し、１００μｌのＡＡＶ含有上清と共に３７℃で１時間回転しつつインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、肺胞増殖培地に再懸濁し、等しい量のＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、６ウェルプレートにプレーティングした。肺胞増殖培地を１日おきに交換した。オルガノイドが成長されたら、これを上に記載されている通りに解離して単一細胞とし、ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳによって精製した。

小滴に基づく単一細胞ＲＮＡ配列決定（Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ）

Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋されたオルガノイドを、アクターゼと共に３７℃で２０分間インキュベートし、続いて、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡと共に３７℃で１０分間インキュベーションした。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２ Ｈａｍを使用してトリプシンを不活性化し、次いで、細胞を、０．０１％ＢＳＡを補充したＰＢＳに再懸濁した。細胞は３，０００μｌ／時間、ｍＲＮＡ捕捉ビーズは３，０００μｌ／時間および小滴生成油は１３，０００μｌ／時間の流速でマイクロ流体チャネルに通すために、４０μｍ濾過器を通して濾過された細胞を１００個の細胞／μｌで利用した。予め増幅するステップ（１サイクルの９５℃３分間、１５～１７サイクルの９８℃１５秒間、６５℃３０秒間、６８℃４分間および１サイクルの７２℃１０分間、８から採用）のためのＤＮＡポリメラーゼを、Ｔｅｒｒａ ＰＣＲ Ｄｉｒｅｃｔポリメラーゼ（＃６３９２７１、Ｔａｋａｒａ）によって置き換えた。他のプロセスは、本来のＤｒｏｐ－ｓｅｑプロトコール９に記載されている通りに行った。ＨｉＳｅｑ Ｘと１５０ｂｐペアードエンド配列決定を使用して、ライブラリーを配列決定した。

Ｄｒｏｐ－ｓｅｑのための計算解析

ｄｒｏｐＳｅｑＰｉｐｅ ｖ０．３（ｈｏｏｈｍ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｄｒｏｐＳｅｑＰｉｐｅ）を使用してＦＡＳＴＱファイルを処理し、アノテーションバージョン９１によりＧＲＣｍ３８ゲノムにマッピングした。次に、Ｒ ｐａｃｋａｇｅ Ｓｅｕｒａｔ ｖ３．０．６（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）を使用して、特有の分子識別子（ＵＭＩ）計数をさらに解析した。ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ ｖ０．２（Ｈａｆｅｍｅｉｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｔｉｊａ， ２０１９）を使用して、ＵＭＩ計数を正規化した。Ｊａｃｋｓｔｒａｗプロットに基づき有意である主（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）成分を、ｔ－ＳＮＥプロットを生成するために使用した。重複（ｄｕｐｌｅｔ）を除外した後に、ｔＳＮＥプロットにおけるＳｆｔｐｃ、Ｓｆｔｐａ１、Ｓｆｔｐａ２、Ｓｆｔｐｂ、Ｌａｍｐ３、Ａｂｃａ３、Ｈｏｐｘ、Ａｇｅｒ、Ａｋａｐ５、Ｅｐｃａｍ、Ｖｉｍ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｐｔｐｒｃ、Ｐｅｃａｍ１およびＭｋｉ６７の濃縮に基づき、特異的な細胞クラスターを同定した。

ＣＯＶＩＤ－１９患者肺の単一細胞ＲＮＡ配列決定のための計算解析

６名の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者肺（ＧＳＥ１４５９２６（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，
２０２０， Ｃｅｌｌ， １８１（７）：１４７５－１４８８））および対照肺（ＧＳＥ１３５８９３（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９））の公開されている単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）から得た。ＬＡＭＰ３、ＡＢＣＡ３、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１５、ＤＮＡＨ１、ＦＯＸＪ１、ＳＣＧＢ３Ａ１およびＳＣＧＢ１Ａ１に基づき、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者肺におけるＥｐＣＡＭ陽性上皮細胞クラスターをさらにクラスター化した。ＬＡＭＰ３、ＮＫＸ２－１およびＡＢＣＡ３の≧１ ＵＭＩ計数を有するＡＴ２細胞を、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者肺および対照肺の間の比較に利用した。ＵＭＩ計数を、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍを使用して、ミトコンドリア遺伝子のパーセンテージに対して正規化および回帰した。ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓを使用して、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者および対照肺において濃縮された遺伝子を抽出し、Ｒ ｐａｃｋａｇｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｖｏｌｃａｎｏ
ｖ１．５．４によって導かれたボルケーノプロットに示した。≧２ ｌｏｇ２倍の変化を有する遺伝子を、Ｅｎｒｉｃｈｒ（Ｋｕｌｅｓｈｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）クエリーのためのインプットとして使用して、データベース － ＢｉｏＰｌａｎｅｔにより濃縮されたシグナル伝達経路を得た。

統計

標本サイズは、予め決定されなかった。データは、各実験内の変動を指し示すために、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を伴う平均値として提示した。Ｅｘｃｅｌ、ＰｒｉｓｍおよびＲにおいて統計解析を行った。両側スチューデントｔ検定を、２種の実験条件の間の比較に使用した。３種以上の条件による実験のため、ＡＮＯＶＡとそれに続くチューキー・ＨＳＤ方法によって統計有意性を計算した。シャピロ・ウイルク検定を使用して、データが正規分布しているか検査し、非正規分布を示した２種の条件の間の比較のためにウィルコクソン順位和検定を使用した。３種以上の条件のため、本出願人らは、スチール・ドワス検定を使用した。
（実施例１）
肺胞オルガノイド培養物のための化学的に規定された条件の確立

以前の研究は、肺常在性ＰＤＧＦＲａ＋線維芽細胞が、血清および多くの未知の構成成分（詳細については方法セクションを参照）を含有するＭＴＥＣ培地において共培養された場合に、ＡＥＣ２の成長を支持することができることを実証した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ａｎｎ． Ａｍ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｏｃ． １５，
Ｓ１９２－Ｓ１９７、Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２３， ３０２５－３０３６、Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １７， ２３１２－２３２５、Ｋａｔｓｕｒａ
ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２， ６５７－６６６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃｅｌｌ １５６， ４４０－４５５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ． ４８， ２８８－２９８）。興味深いことに、ＡＥｃ２は、ＰＤＧＦＲａ＋線維芽細胞の非存在下で複製せず、線維芽細胞から発出するパラクリンまたは接触媒介性シグナルのいずれかが、ＡＥＣ２増殖に必須であることを暗示する。

情報交換（すなわち、パラクリンまたは接触媒介性）の性質を精査するために、ＡＥＣ２－線維芽細胞共培養システムを３種の異なるモードでセットアップした：ｉ）ＡＥＣ２細胞のみ（条件Ａ）；ｉｉ）ＡＥＣ２および線維芽細胞は物理的に分離された（条件Ｂ）；ならびにｉｉｉ）線維芽細胞と混合されたＡＥＣ２（条件Ｃ）。条件Ｃが、最大コロニー形成効率（ＣＦＥ）（８．７１％±０．９２％）を生じ、条件Ｂにおいて中等度～低（２．４０％±０．１０％）が生じ、オルガノイドなし（０％±０％）が条件Ａにおいて観察されたことが見出された（図１Ａ～図１Ｃ）。これらのデータは、接触媒介性シグナル伝達の必要がなく、短い範囲のパラクリンシグナル伝達が、線維芽細胞およびＡＥＣ２の間の情報交換を媒介していることを示唆する。

これらの細胞の間で情報交換するパラクリンシグナルを同定するために、上述の共培養システム由来の細胞において単一細胞トランスクリプトーム解析を行った。品質管理フィルタリングの後に、ｋ－平均クラスタリングを行い、確率的近傍埋込み（ｔ－ＳＮＥ）によって細胞を可視化し、ＥｐＣＡＭ＋上皮細胞およびＶｉｍｅｎｔｉｎ＋／Ｐｄｇｆｒａ間質細胞からなる２個の主要クラスターを同定した。注目すべきことに、Ｐｅｃａｍ＋内皮細胞およびＰｔｐｒｃ＋免疫細胞からなる２個の小さいクラスター（それぞれ＜１０個の細胞）が観察された（図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ）。上皮細胞クラスター内で、Ｓｆｔｐｃ＋ＡＥＣ２、Ａｇｅｒ＋ＡＥＣ１およびＳｆｔｐｃ＋／Ｍｋｉ６７＋増殖ＡＥＣ２からなる３個のサブクラスターが観察された。注目すべきことに、Ｐｄｇｆｒａ＋細胞内のＡｃｔａ２＋／Ｐｄｇｆｒａ＋筋線維芽細胞が見出された。これらのデータは、３次元オルガノイド培養物が、そのｉｎ ｖｉｖｏ対応物（ｃｏｕｎｔｅｒ ｐａｒｔ）と同様の細胞多様性および遺伝子発現プロファイルに似ていることを指し示す。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、肺胞オルガノイド培養物における上皮および間質細胞の間の発生経路における受容体－リガンド相互作用を指し示した。しかし、これらのプロセスは、自発的に発生し、おそらく、間質および血清含有培養条件によって媒介される。

より規定された培養システムを達成するために、上述のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータをマイニングして、上皮および線維芽細胞において発現されるリガンド－受容体ペアを見出した。ＡＥＣ２および線維芽細胞において差次的に濃縮される多くのシグナル伝達経路構成成分が見出された。とりわけ、線維芽細胞においてｗｎｔ（ｗｎｔ４、ｗｎｔ５ａ）、ＢＭＰ（Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ５）、ＴＧＦｂ（Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｆｂ３）およびＦＧＦ（Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ７、Ｆｇｆ１０）シグナル伝達経路の多くのリガンドが見出され、一方、対応する受容体が、ＡＥＣ２において同定された；ｗｎｔ（Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２）、ＢＭＰ（Ｂｍｐｒ１ａ、Ｂｍｐｒ２）、ＴＧＦｂ（Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｇｆｂｒ２）およびＦＧＦ（Ｆｇｆｒ１、Ｆｇｆｒ２）（図２Ｄおよび図２Ｅ）。興味深いことに、ＢＭＰ（Ｆｓｔ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｒｅｍ１）およびＴＧＦβ（Ｌｔｂｐ１、Ｌｔｂｐ２、Ｌｔｂｐ３）の阻害剤も、線維芽細胞において濃縮されていることも見出された。これらのデータは、線維芽細胞が、ＡＥＣ２の増殖および分化の両方を動的および空間的に調節することができることを指し示す。

ＡＥＣ２培養のための無血清かつ化学的に規定された培地を開発するために、経路モジュレーションのための特異的な受容体に対する小分子モジュレーターまたはリガンドを使用した。以前の研究は、ｗｎｔおよびＥＧＦ経路の活性化ならびにＴＧＦβ経路の阻害が、ＡＥＣ２複製に必須であることを実証した。加えて、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑガイドインタラクトーム解析は、ＡＥＣ２維持および複製のための、ｗｎｔおよびＥＧＦの要求ならびにＴＧＦβ経路の阻害をさらに支持した（図２Ｄおよび図２Ｅ）。したがって、細胞成長に重大な意味を持つ必須栄養素を既知濃度で含有する基礎培地を調合し、本培地に、ＣＨＩＲ、ＥＧＦおよびＳＢ４３１５４２を補充した。本培地をＡＥＣ２－線維芽細胞共培養システムにおいて検査したところ、低いＣＦＥおよびコロニーサイズにもかかわらず、ＡＥＣ２が、血清およびウシ下垂体抽出物に由来する他の未知の因子の必要がなく、本培地において増殖することができることを見出した。本培地を基礎培地として使用し、ｐ３８キナーゼ阻害（ＥＧＦ経路を増強することが公知）、ＦＧＦ７、ＦＧＦ９およびＦＧ１０を含む他の経路を検査した。ＡＥＣ２増殖におけるｐ３８阻害の中程度の効果が観察されたが、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０単独または組合せの両方が、最大ＣＦＥを生じた。ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０の両方がオルガノイド培養物に添加された場合、オルガノイドのＣＦＥ（ＳＣＥにおける１０．７％±２．６％、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉにおける１３．５％±１．２％、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７における１５．９％±０．６％、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ１０における１６．５％±０．７％、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７＋１０における１５．４％±０．７％［ｎ＝３］１５日目；平均±ＳＥＭ）またはサイズ（ＳＣＥにおける６２９．７±１７０．７μｍ、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉにおける８２３．８±２２８．３μｍ、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７における９６７．６±３０４．８μｍ、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ１０における９２１．１±２７１．２μｍ、対、ＳＣＥ＋ｐ３８ｉ＋ＦＧＦ７＋１０における８１２．３±２５６．２μｍ［ｎ＝３］；平均±ＳＥＭ）における相加効果はなかった（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）。とりわけ、新たに調合された培地におけるＣＦＥ（ＭＴＥＣにおける９．８％±０．８％［ｎ＝３］、対、無血清における２２．０％±０．５％［ｎ＝３］、１０日目；平均±ＳＥＭ）およびコロニーサイズ（ＭＴＥＣにおける５０５．０±１０４．７μｍ、対、無血清における１２２８．２±３６３．７μｍ［ｎ＝３］；平均±ＳＥＭ）の有意な増加が見出された（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ）。

ＡＥＣ２（ＳＦＴＰＣ）およびＡＥＣ１（ＲＡＧＥとしても公知のＡＧＥＲ）マーカーに対する免疫蛍光解析は、オルガノイドが、ＡＥＣ２およびＡＥＣ１の両方で構成されていることを明らかにした（データ図示せず）。注目すべきことに、ＡＥＣ２およびＡＥＣ１マーカーを同時発現する多くの細胞が観察された。

これらのデータは、本実施例に記載されている新たな培地が、以前に使用されたＭＴＣ培地に存在する血清およびウシ下垂体抽出物に取って代わることができることを明らかにした。
（実施例２）
一過性ＩＬ１処置は、オルガノイド培養物における線維芽細胞依存性を克服する

上述の培地が、線維芽細胞なしでＡＥＣ２細胞成長を支持することができるか検査するために、ＡＥＣ２オルガノイド培養物を線維芽細胞の非存在下でセットアップした。非常に小さく、より少ないオルガノイドが、これらの条件で観察され、ＡＥＣ２が、自身の成長のために追加的な因子を要求することを指し示す。以前の研究は、ＩＬ１β／ＴＮＦａ媒介性ＮＦｋＢシグナル伝達が、傷害後のＡＥＣ２細胞複製および再生に必須であり、ＡＥＣ２ニッチの構成成分として機能することを実証した（Ｋａｔｓｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２， ６５７－６６６）。したがって、ＩＬ１ｓおよびＴＮＦａが、上述の無血清培地に添加され、これらの条件が、ＡＥＣ２オルガノイド培養物において線維芽細胞に取って代わることができるか検査された。対照（ＩＬ１β／ＴＮＦａなし）と比較してサイズが有意により大きい多数のオルガノイドが観察された。注目すべきことに、ＩＬ１β処置培養におけるＣＦＥは、線維芽細胞含有条件と同様の効率に達した。加えて、免疫蛍光解析は、これらのオルガノイドが、ＡＥＣ２およびＡＥＣ１の両方で構成されていることを示唆する。同様のオルガノイドサイズ（ＩＬ１ｓ／ＴＮＦａなしの４３３．４±７７．７μｍ、対、ＩＬ１β／ＴＮＦａありの８５７．２±３３９．５μｍ［ｎ＝３］；平均±ＳＥＭ）およびＣＦＥ（ＩＬ１β／ＴＮＦａなしの４．０％±０．３％［ｎ＝３］、対、ＩＬ１β／ＴＮＦａありの２１．０％±１．３％［ｎ＝３］、１５日目；平均±ＳＥＭ）が、ＩＬ１β単独またはＴＮＦａ単独または組合せにおいて観察され、ＩＬ１ｓまたはＴＮＦａのいずれかが、ＡＥＣ２自己再生および分化を維持しつつ、線維芽細胞に取って代わるのに十分であることを指し示す（図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃ、ならびにデータ図示せず）。ＩＬ１β／ＴＮＦａ媒介性ＮＦｋＢシグナル伝達は、細胞増殖、生存およびアポトーシスを調節する多面的な機能を有することが公知であり、ｉｎ ｖｉｖｏで組織傷害修復プロセスの初期ステージに関連する。ＬａＣａｎｎａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２９， ２１０７－２１２２；Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ． １， ａ０００１４１、ＤｉＤｏｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２４６，
３７９－４００、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｂａｌｔｉｍ． Ｍｄ １９５０ １７８， ６５０４－６５１３。

したがって、ＩＬ１β処置が、初期ステージにおいてまたは培養期間全体にわたり必要であるかが問われた。これを検査するために、オルガノイド培養物セットアップ後の異なる日数の時点でＩＬ１βを除去した。連続的補充（２０．９１％±１．６１％、ｎ＝３；平均±ＳＥＭ）と比較して、３日目（１９．８５％、ｎ＝２）または５日目（２０．３５％±０．３０％、ｎ＝３）または７日目（１９．３３％±０．８４％、ｎ＝３）に培養培地からＩＬ１βが除去された場合であっても、ＣＦＥの減少は観察されなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。

ヒト肺胞球培養物においてヒトＩＬ－１βの影響も検査した。７日目に、３名の個々のドナー由来のヒト肺胞球を含有する培地からヒトＩＬ－１βを除去し、さらに７～１５日間培養した（図７Ａ）。ＩＬ－１βによる処置は、オルガノイドの数およびサイズ（これは成長速度を反映する）を有意に増強した（図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄ）。

まとめると、これらのデータは、ＡＥＣ２が、新たに確立された無血清フィーダー不含条件（以降、肺胞増殖培地と称される）において培養される場合、オルガノイド培養物の初期ステージにおける一過性ＩＬ１β刺激が、線維芽細胞に取って代わるのに十分であることを明らかにした。
（実施例３）
規定された培養条件由来のＡＥＣ２は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで機能的である

層状体の存在は、ＡＥＣ２の同一性および機能を規定するためのベンチマークアッセイとして使用される（Ｂｅｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５７， １８－２７）。本出願人らのオルガノイド培養物由来ＡＥＣ２における層状体の存在を検査するために、電子顕微鏡解析を行った。１０および１５日目の、ＳＦＦＦ培地において培養された標識された（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）細胞に由来する肺胞球の概略図および代表的な画像を図８Ａに示す。オルガノイド由来のＡＥＣ２における多数の層状体（図８Ｂ）。

マウスＡＥＣ２を継代することができるか検査するために、オルガノイド由来細胞を５継代にわたりサブ（ｓｕｂ）継代した。５継代にわたる細胞数の定量化は、継代にわたる細胞の総数の指数関数的増加を明らかにし、これが自己再生し、マーカーの発現を維持することができることを明らかにする（図９Ａおよび図９Ｂ）。

ヒトＡＥＣ２を継代することができるか検査するために、ヒトドナーからＨＴＩＩ－２８０＋細胞を単離および精製した（図１０Ａ）。ＳＦＦＦ培地において培養されたオルガノイドにおける細胞数のイメージングおよび定量化は、１０継代のうち数継代にわたるＡＥＣ２マーカーの発現および自己再生を維持した（図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅおよび図１０Ｆ）。ＩＬ－１βにおいて培養されたオルガノイドは、数継代にわたりＡＥＣ２マーカーの発現および自己再生を維持した（図１０Ｇ、図１０Ｈ、図１０Ｉおよび図１０Ｊ）。ＩＬ－１βにおけるオルガノイド培養物は、数継代にわたり分化能を維持し（図１０Ｋおよび図１０Ｌ）、ＳＦＦＦ培地において培養されたオルガノイドは、１０継代のうち数継代にわたり分化能を維持した（図１０Ｍおよび図１０Ｎ）。

次に、オルガノイド培養物が、Ｃａｓ９／Ｃｒｉｓｐｒ媒介性ゲノム編集に受け入れられるか検査された。これを検査するために、Ｓｆｔｐｃ遺伝子コード配列の３’末端にＴ２Ａ－ＧＦＰコードＤＮＡを挿入するための、近年記載された相同性に依存しない導入遺伝子組込み（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（ＨＩＴＩ）方法を使用した。成功した遺伝子編集は、クローナルに派生したＡＥＣ２オルガノイドにおけるＧＦＰ発現によって可視化された（図１１Ａ）。これらのデータは、本出願人らのオルガノイド条件が、遺伝子編集および疾患モデル化に受け入れられることの概念実証として機能する。近年の研究は、オルガノイドに基づく腫瘍モデルを使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍形成を研究した。実際に、近年の研究は、ＭＴＥＣ培地を使用して、線維芽細胞の存在下で肺腺癌細胞を培養した。

新たに確立された培養培地が、線維芽細胞の非存在下で肺腫瘍由来細胞の培養に適しているか検査するために、Ｋｒａｓ Ｇ１２Ｄ／ｔｄＴｏｍａｔｏマウスから腫瘍小結節を単離し、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋腫瘍細胞を精製した（図１１Ｂ）。本出願人らの新たに確立された培地において間質細胞の非存在下でこのような腫瘍細胞を使用して、オルガノイド培養物をセットアップし、これをＭＴＥＣ培地と直接的に比較した。興味深いことに、腫瘍細胞は、新たな培地において多数のオルガノイドを発生したが、ＭＴＥＣ培地においては発生しなかった（ＣＦＥ、ＭＴＥＣにおける０．７％±０．２％、対、肺胞増殖培地における２０．０％±１．４％［ｎ＝３］、５日目；平均±ＳＥＭ）（図１１Ｃ、図１１Ｄおよび図１１Ｅ）。これらのデータは、新たに確立された培地条件が、間質細胞の非存在下であってもｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞成長を支持することを明らかにした。

最後に、オルガノイド由来細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで生着するその能力について検査した。これを検査するために、ｔｄＴｏｍａｔｏ標識細胞懸濁液を、肺を損傷するためにブレオマイシンを投与されたヌードマウスの肺に気管内注射した（図１１Ｆ）。注射の２ヶ月後に、傷害された肺におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞パッチのパッチを観察した（図１１Ｇおよび図１１Ｈ）。免疫蛍光および組織学的解析は、生着した細胞が、再生された組織へと統合され、ＡＥＣ２およびＡＥＣ１のマーカーを発現したことをさらに明らかにし、オルガノイド由来細胞の成功した生着を指し示す（図１１Ｉ）。まとめると、新たに確立された培地由来のオルガノイド由来細胞は、ＡＥＣ２のｉｎ ｖｉｖｏ相関物に似ており、遺伝子編集に受け入れられ、生着アッセイにおいて再生する組織へと機能的に統合されることができる。
（実施例４）
ＡＥＣ２維持および分化のための化学的に規定された条件

肺胞増殖培地に由来するオルガノイドにおけるＡＥＣ２およびＡＥＣ１マーカーに対する免疫蛍光解析は、細胞の大部分（ほぼ８０％）が、ＡＥＣ２と共にＡＥＣ１マーカーを同時発現したことを指し示し、これらの条件が、同じ細胞においてＡＥＣ２およびＡＥＣ１同一性の両方を促進していることを指し示す（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ）。興味深いことに、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑガイド上皮－間質細胞インタラクトームは、ＢＭＰシグナル伝達のリガンド（Ｂｍｐ４）および阻害剤（Ｆｓｔ、Ｆｓｔｌ１およびＧｒｅｍ１）が、それぞれＡＥＣ２および間質細胞において発現されることを明らかにした（図２Ｄおよび図２Ｅ）。さらに、近年の研究は、ＡＥＣ２からＡＥＣ１への分化にＢＭＰシグナル伝達が関与することを示唆した（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ． ａｌ．， ２０１８， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５， ｄｅｖ１６３０１４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｃｅｌｌ １５６， ４４０－４５５）。したがって、間質細胞の非存在下で、ＡＥＣ２細胞によって産生されたＢＭＰリガンドが、オートクリン様式で作用し、分化を誘導することが仮定された。

ＢＭＰシグナル伝達の阻害が、ＡＥＣ２細胞同一性を維持しつつ、ＡＥＣ１同一性の出現を遮断するか検査するために、肺胞増殖培地に、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（ノギンおよびＤＭＨ１）を補充した。ＳＦＴＰＣおよびＲＡＧＥに対するホールマウント免疫染色および定量化は、各オルガノイドにおけるＲＡＧＥ発現オルガノイドの数（３０％まで低下）およびＲＡＧＥ発現細胞の数（＞５％）の劇的な低減を明らかにした（図１２Ｄおよび図１２Ｅ）。ＡＥＣ２およびＡＥＣ１のマーカー解析は、肺胞維持培地において培養されたオルガノイドが、６継代にわたり自己再生特性を維持したことをさらに明らかにした（図１２Ｆ～図１２Ｊ）。これらのデータは、ＢＭＰ 阻害剤入りの肺胞増殖培地（肺胞維持培地と称される）が、このようなオルガノイドにおけるＡＥＣ１細胞の誘導を抑圧しつつ、ＡＥＣ２細胞同一性を維持することを明らかにした（図１３）。

これらのデータは、ＢＭＰシグナル伝達が、ＡＥＣ１分化に必要であるという以前の研究と合致している。しかし、オルガノイドがＢＭＰ４リガンドで処置された場合のＡＥＣ２からＡＥＣ１細胞への完全分化は、観察されず、ＢＭＰシグナル伝達は、必要であるが、分化の誘導に十分ではないことを示唆する。

ＡＥＣ２からＡＥＣ１への分化を誘導し得る因子を見出すために、分化を促進すると以前に考えられた様々な分子を検査した（デキサメタゾン、Ｔ３、ＢＭＰ４、ＴＧＦｓおよびＩＢＭＸ（ホスホジエステラーゼ阻害剤））。血清含有ＭＴＥＣ培地を使用した上述の実験において、ＡＥＣ２細胞の自発的分化を観察した。したがって、少量の血清と組み合わせた、ＡＥＣ２成長を促進する因子の減少または完全排除が、分化を刺激し得ると考えられた。これを検査するために、マウス肺由来のＡＥＣ２を維持培地において１０日間培養し、次いで、ＴＧＦおよびｐ３８キナーゼの阻害剤を除去し、ＥＧＦおよびＦＧＦの量を（１０分の１に）減少させ、１０％ウシ胎仔血清を培地に添加し（以降、肺胞－Ｄｉｆｆ培地と称される）、細胞を１０日間培養した（図１４Ａ）。肺胞－Ｄｉｆｆ培地におけるＲＡＧＥ、ＨＯＰＸおよびＴ１ａ＋細胞の数の有意な増加が観察された。肺胞－Ｄｉｆｆ培地由来細胞における単一細胞トランスクリプトーム解析は、このようなオルガノイドが、多数のＡＥＣ１細胞で構成されていることを明らかに指し示した。注目すべきことに、増殖するＡＥＣ２細胞の数の有意な減少が観察され、このことは、血清中に存在する因子が、ＡＥＣ２増殖を防止し得ることを指し示し、開発され、上に記載された肺胞増殖培地の重要性をさらに断定する（図１４Ｂ、図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。

まとめると、また、本明細書に記載されている通り、器官型培養におけるＡＥＣ２の増殖、維持および分化のための培養条件が決定された。
（実施例５）
肺胞幹細胞分化のための化学的に規定された（無血清）条件

ＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化を誘導し得る因子を同定するために、線維芽細胞と共培養したオルガノイドからｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータをマイニングした。ＡＥＣ２の受容体で結合し得る、線維芽細胞において発現される分子を探索した。ＩＬ６転写物の濃縮が、線維芽細胞において同定された（図１５Ａ）。以前の研究は、ＡＥＣ２が、ＩＬ６受容体を発現することを明らかにした（Ｚｅｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｅｌｌ， １７０（６）：１１３４－１１４８）。ＩＬ６が、ＡＥＣ２分化の誘導に十分であるか検査するために、肺胞維持培地においてマウスＡＥＣ２を１０日間培養して、オルガノイド培養物においてＡＥＣ２を増殖した。次に、オルガノイドを、血清を欠如するが、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した肺胞分化培地で処置し、これをさらに１０日間培養した。本培地において培養したオルガノイドの免疫染色解析は、ＡＧＥＲを含むＡＥＣ１マーカーの強い発現を明らかにした（図１５Ｂ）。同様に、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＡＤＭ（血清なし）に培地を置き換える前に、ヒトＡＥＣ２をＳＦＦＦ培地において１４日間培養した（図１５Ｃ）。これらの研究は、ＩＬ６処置が、培養物においてＡＥＣ１へのマウスおよびヒトＡＥＣ２の両方の分化の誘導に十分であることをさらに明らかにした。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、肺胞球由来ＡＴ２細胞に感染することができるか検査するために、ＧＦＰ融合タンパク質を有する、近年開発されたリバースエンジニアリングされた（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを利用した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｃｅｌｌ， １８２（２）：４２９－４４６）。ＳＦＦＦ培地（ＩＬ１βを欠如）におけるｍａｔｒｉｇｅｌ表面にヒト肺胞球を１０～１２日間培養し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＧＦＰと共に２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して、残留ウイルス粒子を除去し、次いで、７２時間にわたり解析のために採取した（図１６Ａ）。ＧＦＰは、ウイルス曝露された肺胞球において、感染４８時間後もの初期に検出されたが、対照肺胞球においては検出されなかった（図１６Ｂ）。培養上清を使用したその後のプラーク形成アッセイは、ウイルス放出が、２４時間目にピークとなるが、後に減退したことを明らかにした（図１６Ｃ）。この観察は、３名の異なるドナー由来の細胞にわたって一貫していた。注目すべきことに、ＰＢＳによる多数の洗浄にもかかわらず、感染の直後に有意な数のウイルス粒子が観察された。この結果は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のウイルスの封入が原因である可能性が高かった。にもかかわらず、ウイルス力価は、２４ｈｐｉで増加し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、ＡＥＣ細胞において生産的に複製することを実証する（図１６Ｃ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、対照と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞におけるウイルスＲＮＡの存在をさらに明らかにした（図１６Ｄ）。ウイルス複製をさらに確認するために、ウイルスのマイナス鎖を特異的に認識するプライマーを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。実際に、肺胞球培養物におけるウイルス複製が観察された（図１６Ｅ）。
（実施例７）
ＡＴ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答してインターフェロンおよび炎症性経路を活性化する

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）に対するＡＴ２の応答への洞察を得るために、感染の４８時間後の肺胞球培養物における不偏のゲノムワイドトランスクリプトームプロファイリングを行った。全ての配列決定されたリードのうち、ウイルス転写物は、４．７％を占め、ヒト転写物は、９５．３％を占め、ウイルスがＡＴ２において増殖していたことを指し示す。以前の研究は、ウイルス感染に応答して、標的細胞が、典型的に、Ｉ型（ＩＦＮ－Ｉ）およびＩＩＩ型（ＩＦＮ－ＩＩＩ）インターフェロン（それぞれａ／ｂおよびλ）を産生し、これらがその後、抗ウイルス防御機構の発揮に進む、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）、炎症性ケモカインおよびサイトカインを含む、転写因子ＩＲＦ、ＳＴＡＴ１／２およびＮＦ－κＢの標的を活性化することを示した（Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０， １５７４－１５８３）。したがって、感染対非感染肺胞球の差次的遺伝子発現解析が、複数のインターフェロン（ＩＦＮ）およびそれらの標的を含む、一般的なウイルス応答遺伝子に関係する転写物の濃縮を明らかにしたことが重要であった。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＡＴ２は、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１およびＩＦＮＥ）と共にＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２およびＩＦＮＬ３）の転写物が濃縮されていたが、ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮＧ）リガンドは濃縮されていなかった（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。Ｉ型（ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２）、ＩＩ型（ＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２）およびＩＩＩ型（ＩＦＮＬＲ１およびＩＬ１０ＲＢ）ＩＦＮの受容体は、対照ＡＴ２細胞において発現され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後にＩＦＮＡＲ２およびＩＦＮＧＲ２の中程度の増加が見出された（図１７Ａおよび図１７Ｃ）（Ｐｌａｔａｎｉａｓ， ２００５；Ｓｙｅｄｂａｓｈａ
ａｎｄ Ｅｇｌｉ， ２０１７）。

これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答して、ＡＴ２が、それらのコグネート受容体を活性化するようにオートクリンまたはパラクリン（ＡＴ２の近隣）機構のいずれかを介して潜在的に作用し得る、ＩおよびＩＩＩ型ＩＦＮリガンドを産生することを指し示す。実際に、ＩＦＮ刺激性遺伝子（ＩＳＧ）、ＩＦＮ誘導性タンパク質コード遺伝子（ＩＦＩ）およびテトラトリコペプチドリピートコード遺伝子によるＩＦＮ誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ）を含む多数のＩＦＮ標的遺伝子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＡＴ２において上方調節された（図１７Ａおよび図１７Ｄ）。その上、ＩＦＮ受容体の下流のシグナル伝達経路の構成成分であることが公知の鍵となる転写因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２もまた、感染ＡＴ２細胞において上方調節された。

経路解析は、全３クラスのＩＦＮ標的が上方調節されたが、最も顕著なものがＩ型およびＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達であったことを明らかにした。ＩＩ型ＩＦＮリガンド（ＩＦＮＧ）の非存在にもかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＡＴ２細胞におけるＩＦＮγ応答メディエーターの正準標的の有意な上方調節が観察された（図１７Ａおよび図１７Ｄ）。この知見は、以前に記載された通りに（Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９；Ｂａｒｔｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、下流標的の有意な重複および異なるクラスのＩＦＮ経路の間のクロストークが存在することを示唆する。他の顕著な上方調節された遺伝子は、ケモカイン（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１およびＣＸＣＬ１７）およびプログラム細胞死関連遺伝子（ＴＮＦＳＦ１０、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ５およびＣＡＳＰ７）を含む（図１７Ａ）。対照的に、感染ＡＴ２細胞におけるＤＮＡ複製および細胞周期に関連する転写物（ＰＣＮＡ、ＴＯＰ２Ａ、ＭＣＭ２およびＣＣＮＢ２）の有意な下方調節が観察された（図１７Ａ）。選択された標的（ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＬ１、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＣＳＣＬ１０）は、感染後の初期（４８時間）および後期（１２０時間）時点における独立した定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して検証された。まとめると、トランスクリプトーム解析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に応答した肺胞球由来ＡＴ２における、増殖関連転写物の下方調節と並んで、インターフェロン、炎症性および細胞死シグナル伝達の有意な上方調節を明らかにした。
（実施例８）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、サーファクタントの喪失および肺細胞死を誘導する

初代ＡＴ２細胞が、どのようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して初期に応答するのかについてさらなる洞察を得るために、免疫組織化学的検査を使用して、感染の２４時間～７２時間後の肺胞球における細胞変化を解析した。感染肺胞球の定量化は、２９．２２％がＳＡＲＳ＋であることを明らかにした（図１８Ａ）。免疫染色は、感染肺胞球におけるＧＦＰおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の同時発現を明らかにした。各肺胞球におけるＧＦＰ＋細胞の数の変動が見出された。したがって、肺胞球は、各肺胞球におけるＳＡＲＳ＋細胞の数に応じて、低（１～１０個の細胞）および高（＞１０個）へと広くカテゴリー化された（図１８Ｂ）。次に、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＢおよびＨＴＩＩ－２８０を含むＡＴ２細胞マーカーの解析は、感染細胞（ＧＦＰ＋またはＳＡＲＳ＋）におけるサーファクタントタンパク質ＳＦＴＰＣおよびＳＦＴＰＢの発現の劇的な喪失または減少を明らかにしたが、これは、対照肺胞球においては見られなかった（図１８Ｃ）。注目すべきことに、ＨＴＩＩ－２８０発現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト肺胞球において免疫染色によって可視化される通り、変化しなかった。サーファクタントタンパク質発現の喪失は、免疫染色によって可視化される通り、高感染肺胞球においてより明らかであった。ＧＦＰ＋細胞の一部は、ＡＴ１細胞に似ている僅かに細長い形態を示したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＡＧＥＲを検出するための同時免疫染色により可視化される通り、ＡＴ１細胞マーカーに対する免疫染色は、感染細胞がＡＴ１細胞へと分化しなかったことを明らかにした。これらのデータは、ＡＴ２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答してサーファクタント発現を下方調節するという、本出願人らのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致する。

病理組織学的証拠は、ＣＯＶＩＤ－１９肺において肺胞実質の喪失があることを示唆する（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｌａｎｃｅｔ Ｌｏｎｄ． Ｅｎｇｌ．
３９５， ４９７－５０６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が細胞死を誘導するか検査するために、アポトーシス細胞のマーカーである活性カスパーゼ３に対する免疫染色を行った。アポトーシス細胞は、ウイルスに曝露された肺胞球において見出されたが、対照においては見出されず、ＡＴ２細胞が、ＳＡＲＳＣｏＶ－２感染に応答して細胞死を起こすことを示唆する。著しいことに、細胞死は、ＳＡＲＳ＋およびＳＡＲＳ－細胞の両方において観察され、非感染近隣細胞におけるパラクリン機構誘導性細胞死を示唆する（図１８Ｄ）。さらに、増殖細胞のマーカーであるＫｉ６７に対する免疫染色は、対照と比較して、ウイルス曝露された肺胞球における全体的な細胞複製の明らかな差を明らかにしなかった（図１８Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、細胞自律性および非自律性機構の両方を介して、ＡＴ２細胞においてサーファクタントタンパク質の下方調節および細胞死の増加を誘導することを示す。
（実施例９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肺胞球およびＣＯＶＩＤ－１９肺由来のＡＴ２におけるトランスクリプトーム全体にわたる類似性

肺胞球におけるＡＴ２におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導性応答を、ＣＯＶＩＤ－１９肺に見られる変化と直接的に比較するために、６名の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者から得た気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）由来の公開されているｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを利用した（Ｂｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｃｅｌｌ， １８１（７）：１４７５－１４８８；Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２６：８４２－８４４）。先ず、ＣＯＶＩＤ－１９患者肺由来のＡＴ２と、健康な肺由来のＡＴ２細胞の遺伝子発現プロファイルを比較した（図１９）。ＣＯＶＩＤ－１９患者ＡＴ２細胞におけるケモカイン（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１４およびＩＬ３２）、インターフェロン標的（ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５およびＩＦＩ６）および細胞死（ＴＮＦＳＦ１０、ＡＮＸＡ５およびＣＡＳＰ４）経路関連転写物の有意な上方調節が見出された（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。興味深いことに、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＡ２、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣおよびＳＦＴＰＤを含むサーファクタント遺伝子、ならびにプロ形態（ｐｒｏ－ｆｏｒｍ）のサーファクタントタンパク質の成熟タンパク質へのプロセシングを触媒する遺伝子産物であるＮＡＰＳＡが、ＣＯＶＩＤ－１９患者ＡＴ２細胞において有意に下方調節された一方、他のＡＴ２細胞マーカーの変化は、最小かつごく僅かであった（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。経路解析は、ＣＯＶＩＤ－１９ ＡＴ２細胞におけるＩ型およびＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達、炎症性プログラムおよび細胞死経路の有意な濃縮を明らかにした。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したｅｘ ｖｉｖｏ培養物およびＣＯＶＩＤ－１９患者肺由来のＡＴ２の間の転写物を直接的に比較した。これにより、上方調節された転写物における際だった類似性が明らかになった。これらは、ＩＦＮリガンドおよびその標的を含むケモカインおよびサイトカインの上方調節を含み、肺胞球に由来するＡＴ２が、ＳＡＲＳＣｏＶ－２感染後にヒト肺由来のＡＴ２と同様に応答することを指し示す。
（実施例１０）
ＡＴ２は、外因的ＩＦＮに応答し、ＳＡＲＳＣｏＶ－２感染に関連する特色を再現する

トランスクリプトーム解析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の肺胞球およびヒト肺由来のＡＴ２におけるインターフェロンシグネチャーにおける際だった類似性を明らかにした。以前の研究は、ＩＦＮが、文脈依存性様式で細胞変化を誘導することを示した。例えば、ＩＦＮａおよびＩＦＮｂは、肺においてインフルエンザウイルス感染に応答して保護効果を提供し、一方、ＩＦＮｇは、慢性炎症に応答して腸細胞においてアポトーシスを誘導する（Ｋｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８１， ２０２５－２０３０；Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｓｃｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４（４２））。ＡＴ２におけるＩＦＮの直接的な効果を検査するために、肺胞球を、ＳＦＦＦ培地における精製された組換えＩＦＮａ、ＩＦＮｂおよびＩＦＮｇで処置し、これらを７２時間培養した。先ず、全処置において脱離された細胞を観察し、ＩＦＮｇ処置肺胞球において最大ほぼ３倍増加した効果があった（図２１Ａ）。活性カスパーゼ３に対する免疫染色は、全ＩＦＮ処置に応答した細胞死の有意な誘導を明らかにし、最大の効果はＩＦＮｇによる（図２１Ｂ）。対照的に、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７に対する免疫染色によって明らかにされる通り、ＩＦＮｂおよびＩＦＮｇ処置における細胞増殖の有意な低減が観察された（図２１Ｃ）。著しいことに、免疫染色は、対照と比較して、全ＩＦＮで処置された肺胞球におけるＳＦＴＰＢ発現の低減を明らかにした。同様の傾向は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価される通り、ＳＦＴＰＣおよびＳＦＴＰＢ転写物について観察された（図２１Ｄおよび図２１Ｅ）。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のＡＴ２肺胞球由来のトランスクリプトームデータと一致する。注目すべきことに、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂおよびＩＦＮｇによる処置は、ＡＣＥ２のレベルを有意に増強したが、ＴＭＰＲＳＳ２転写物を増強せず、このことは、他の細胞型における以前の研究と合致する（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０２０；Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）（図２１Ｆおよび図２１Ｇ）。同様の傾向が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞において観察され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染をその後に増幅する、ＩＦＮおよびＡＣＥ２が関与する正のループを示唆する（図２１Ｈ）。
（実施例１１）
ＩＦＮによる前処置は、肺胞球におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を低減する

近年の研究は、ＩＦＮによる前処置が、Ｃａｌｕ－３およびＶｅｒｏ－２細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を低減したことを示唆した。ＩＦＮ処置単独由来の上述のデータは、ＡＴ２細胞死の増加を生じたため、ウイルス感染前のＩＦＮによる肺胞球の前処置の効果を検査した。したがって、ウイルス感染に先立ち、肺胞球を、より低い用量のＩＦＮαおよびＩＦＮγ（１０ｎｇ）で１８時間前処置した（図２２Ａ）。感染後２４時間目および４８時間目の、その後のプラーク形成アッセイは、ＩＦＮによる前処置が、肺胞球におけるウイルス力価を有意に低減したことを明らかにした（図２２Ｂ）。加えて、ウイルス複製におけるＩＦＮシグナル伝達阻害の効果も検査した。これを行うために、肺胞球を、ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤であるルキソリチニブで１８時間前処置し、ウイルス感染後に処置を続けた（図２２Ａ）。プラーク形成アッセイは、ウイルス複製の増加を明らかにした（図２２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＩＦＮによる前処置が予防的効果を与え、一方、ＩＦＮ阻害がウイルス複製を促進することを示唆する。

考察

肺胞球培養物を使用して、ＡＴ２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、ＡＣＥ２を発現し、ウイルス感染に対して感受性であることが実証された。トランスクリプトームプロファイリングは、ＡＴ２が、感染後のより後の時点において多数のＩＦＮ、サイトカイン、ケモカインおよび細胞死関連遺伝子の発現を活性化する「炎症性状況」の出現をさらに明らかにした。これらのデータは、より後の時点まで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（２００３）感染後の遅延した宿主自然免疫応答を示す前の研究と一致する（Ｍｅｎａｃｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ｍＢｉｏ， ５（３）： ｅ０１１７４－１４）が、感染後の異なる時点における宿主応答の動力学的解析の必要も強調する。トランスクリプトームおよび免疫組織化学的解析の両方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肺胞球におけるサーファクタントタンパク質の下方調節を明らかにした。典型的に、ウイルス感染によって細胞において活性化されるのはＩ型およびＩＩＩ型経路であるため、ＩＩ型ＩＦＮ経路が、ｅｘ ｖｉｖｏでＡＴ２細胞において活性化されるという知見は、驚くべきことである（Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０， １５７４－１５８３；Ｂａｒｔｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １１， ３７８－３８３）。著しいことに、肺胞球由来ＡＴ２由来のこれらの予想外の知見は、ＣＯＶＩＤ－１９患者肺由来のＡＴ２細胞における応答を反映し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２研究のための肺胞球由来ＡＴ２の関連性をさらに支持する。

本研究は、ＩＦＮによる前処置が、肺胞球における予防的有効性を示すことの証拠をさらに提供した。

オルガノイド培養物において成長されたＡＴ２細胞が、Ｃａｌｕ－３、Ａ５４９、ＶｅｒｏおよびＨ１２９９等の現在使用されている細胞系よりも好まれることには、いくつかの理由が存在する。例えば、ヒト肺腺癌に由来するＡ５４９細胞は、ウイルス感染研究において肺胞上皮細胞の代替物として広範に使用されてきた。しかし、Ａ５４９細胞系は、上皮タイトジャンクションを形成する能力を含む、肺上皮細胞の中核的特色を欠如する；これは、多数の遺伝的変更も有する（Ｏｓａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅｓ ２１， ６７３－６８３）。より重要なことに、Ａ５４９細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体、ＡＣＥ２を発現せず、ウイルス感染研究は、この受容体の異所的発現に頼る。したがって、形質転換された細胞系は、ネイティブ肺上皮細胞を忠実に再現しない（Ｍａｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， １９８０， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６１７：３６－５０）。対照的に、肺胞幹細胞（ＡＴ２）に基づく肺胞球は、分子的、形態的特色を保持し、適した条件下でＡＴ１細胞へと分化する能力を維持する、高度に極性化した上皮構造である。

当業者であれば、本開示が、目的を実行し、言及されている目標および利点ならびにそれらに固有のものを得るように十分に適応されることを容易に認めるであろう。本明細書に記載されている本開示は、好まれる実施形態の現在の代表であり、例示的であり、本開示の範囲における限定として意図するものではない。その変化および他の使用は、当業者によって想起され、それらは、特許請求の範囲によって規定される本開示の精神の内に包含される。

本明細書において引用されているいずれかの非特許または特許文書を含むいずれかの参考文献が、先行技術を構成することは承認されない。特に、他に記述がなければ、本明細書におけるいずれかの文書の参照が、これらの文書のいずれかが、米国または他のいずれかの国における当技術分野の共通一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことが理解されるであろう。参考文献についてのいずれかの記述は、その著者が断定する事柄を記すものであり、本出願人は、本明細書に引用されている文書のいずれかの正確性および妥当性を検証する権利を留保する。それ以外のことが明確に指し示されない限り、本明細書に引用されているあらゆる参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

引用されている参考文献に見出されるいずれかの定義および／または記載の間にいずれかの相違がある場合、本開示が優先するものとする。

Claims (1)

1. インターフェロン－アルファ（ＩＦＮα）またはインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺胞球に由来する肺胞２型上皮（ＡＴ２）細胞におけるウイルス力価を低減する方法における使用のための組成物であって、前記方法は、肺胞球がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に、前記肺胞球をＩＦＮαまたはＩＦＮγと接触させるステップを含み、前記肺胞球に由来する前記ＡＴ２細胞が、ＩＦＮαまたはＩＦＮγと接触されなかった肺胞球に由来するＡＴ２細胞と比べて低減されたウイルス力価を示す、組成物。