JP7756402B2

JP7756402B2 - 新規微生物、新規微生物の培養物または抽出物、およびエルゴチオネインの生産方法

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Publication number: JP7756402B2
Application number: JP2023572359A
Authority: JP
Inventors: 竜行越山; 幸弘東山; 俊佐藤; 友岳森田; あずさ雜賀; 和乗牛丸
Original assignee: Kureha Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Kureha Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2025-10-20
Anticipated expiration: 2042-10-31
Also published as: JPWO2023132122A1; CN118574922A; EP4461804A1; US20250066713A1; EP4647501A2; EP4647501A3; EP4461804A4; WO2023132122A1

Description

NPMD

NITE BP-03572

NPMD

NITE BP-03573

本発明は、新規微生物、新規微生物の培養物または抽出物、および、エルゴチオネインの生産方法に関する。

エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種である。エルゴチオネインは、ビタミンＥの抗酸化作用よりも優れた抗酸化作用を有し、健康および美容等の分野において、利用価値の高い化合物として注目されている。

例えば、特許文献１および非特許文献１には、エルゴチオネイン生産能が増強された形質転換糸状菌が記載されている。

非特許文献２には、エルゴチオネイン生産能が増強された、形質転換したMethylobacrium属の微生物が記載されている。非特許文献２には、Aureobasidium属およびRhodotorula属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。

非特許文献３には、Pleurotus属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。

特許文献２には、Methylobactrium属およびRhodotorula属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。特許文献３には、Moniliella属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。特許文献４には、Dirkmeia属、Papiliotrema属およびApiotrichum属の微生物がエルゴチオネイン生産能を有することが記載されている。

国際公開第２０１６／１２１２８５号国際公開第２０１６／１２１２８５号国際公開第２０１９／００４２３４号国際公開第２０２１／１４０６９３号

S. Takusagawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, 181-184 (2019) Y. Fujitani et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 715-722 (2018) SY. Lin, Int. J. Med. Mushrooms, 17, 749-761 (2015)

エルゴチオネインは、ヒトの体内では生合成されず、一部の微生物で生合成されることが知られている。よって、上述の先行技術文献に記載されるように、エルゴチオネインを産生する微生物の探索、および、エルゴチオネインの生産が増強させるための微生物の改変等の研究開発が進められている。

遺伝子組換え技術により、エルゴチオネインの生産を増強させるように微生物を改変することができる。しかしながら、当該微生物により生産されたエルゴチオネインは食品産業等では利用できない。したがって、遺伝子組換えが行われておらず未改変である、エルゴチオネイン生産量が高い微生物の探索が強く望まれている。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、エルゴチオネインの生産量が高い新規微生物を提供することを目的とする。

本発明者らは、スクリーニングの結果、エルゴチオネインの生産量が高い新規微生物を見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の一態様に係る微生物は、ロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２）またはワンリヤ・ヒュミコーラ（Vanrija humicola）に近縁な種に属するワンリヤ・エスピーに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３）である。

また、本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法は、ロドスポリジオボラス属またはワンリヤ属に属する微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む、エルゴチオネインの生産方法である。

本発明の一態様によれば、エルゴチオネインの生産量が高い微生物を提供することができる。

本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。

〔新規微生物〕
本発明の一態様に係る微生物は、エルゴチオネインを生産する能力を有するロドスポリジオボラスに属する微生物、または、エルゴチオネインを生産する能力を有するワンリヤ属に属する微生物である。

本発明の一態様に係る微生物は、エルゴチオネインの生産量が高い。エルゴチオネインは、含硫アミノ酸の一種であり、優れた抗酸化作用を有する。また、本発明の一態様に係る微生物は遺伝子組換え技術等による改変が行われていないため、食品産業でも使用することができる。

（１．ロドスポリジオボラス・アゾリカスＥＢ１５２）
ロドスポリジオボラス・アゾリカス（Rhodosporidiobolus azoricus）ＥＢ１５２（以下、「酵母ＥＢ１５２」と略記する場合がある）は、植物の葉を分離源として初めて分離された微生物である。

リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＢ１５２はロドスポリジオボラス・アゾリカスに帰属された。また、炭素源としてのマルトースと水溶性でんぷんの資化性およびビタミン要求性以外は、ロドスポリジオボラス・アゾリカスとほぼ類似した生理・生化学的性状を示す。

酵母ＥＢ１５２は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２１年１２月１５日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２）。

酵母ＥＢ１５２の培養方法は、ロドスポリジオボラス属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および／または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地としては、ロドスポリジオボラス属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類等の必要な栄養源を含有する培地を使用してもよい。培養ｐＨは３～８が好ましく、培養温度は２０℃～３０℃が好ましく、培養時間は２～１４日が好ましい。

（２．ワンリヤ・エスピーＥＢ８９１）
ワンリヤ・エスピー（Vanrija sp.）ＥＢ８９１（以下、「酵母ＥＢ８９１」と略記する場合がある）は、担子菌子実体を分離源として初めて分離された微生物である。

リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。そして、テクノスルガラボ微生物同定システム（TechnoSuruga Laboratory, Japan）データベースDB-FU13.0および国際塩基配列データベース（DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank）に対するBLAST相同検索を行った。その結果、ＥＢ８９１はワンリヤ・ヒュミコーラ（Vanrija humicola）に近縁であることが示された。また、炭素源イヌリンおよび水溶性でんぷんの資化性、窒素源硝酸塩の資化性、ビタミン要求性、50% D-グルコースおよび10% NaCL/5% グルコースにおける生育性に関して相違が認められた以外は、ワンリヤ・ヒュミコーラとほぼ類似した生理・生化学的性状を示す。

酵母ＥＢ８９１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した（原寄託日：２０２１年１２月１５日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３）。

酵母ＥＢ８９１の培養方法は、ワンリヤ属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に炭素源および／または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地としては、ワンリヤ属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類等の必要な栄養源を含有する培地を使用してもよい。培養ｐＨは３～８が好ましく、培養温度は２０℃～３０℃が好ましく、培養時間は２～１４日が好ましい。

〔培養物〕
本発明の一態様に係る培養物は、酵母ＥＢ１５２または酵母ＥＢ８９１の培養物である。本発明の一態様に係る培養物には、培養上清、培養沈殿物、培地、培養菌体、培養菌体破砕物、培養菌体の凍結乾燥物等の培養菌体処理物等が含まれる。本発明の一態様に係る培養物にはエルゴチオネインが含まれる。

〔抽出物〕
本発明の一態様に係る抽出物は、酵母ＥＢ１５２または酵母ＥＢ８９１の抽出物である。本明細書において「微生物の抽出物」とは、微生物に対して抽出処理を行うことにより得られるもの、および微生物の培養物に対して抽出処理を行うことにより得られるものを指す。したがって、本発明の一態様に係る抽出物は、例えば、酵母ＥＢ１５２もしくは酵母ＥＢ８９１の抽出処理、または、酵母ＥＢ１５２もしくは酵母ＥＢ８９１の培養物を抽出処理することによって得られる。本発明の一態様に係る抽出物にはエルゴチオネインが含まれる。

抽出処理として、熱水抽出；有機溶媒等による溶媒抽出；加圧抽出；酵素および界面活性剤等による化学的抽出；超音波抽出；アルカリ抽出；酸抽出；浸透圧による抽出；粉砕による抽出；すり潰しによる抽出；凍結融解による抽出；液体窒素による抽出；高速撹拌による抽出；等が挙げられる。優れた植物生長効果を発揮する点等で、抽出処理は熱水抽出であることが好ましい。抽出処理は１種類であってもよいし、２種類以上の抽出処理を行ってもよい。

熱水抽出は、熱水に抽出対象物を一定時間接触または浸漬させる抽出である。熱水抽出に用いる水の温度は、４０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。

本発明の一態様に係る抽出物は、酵母ＥＢ１５２または酵母ＥＢ８９１である微生物の、熱水抽出物、有機溶媒等による溶媒抽出物；加圧抽出物；酵素および界面活性剤等による化学的抽出物；超音波抽出物；アルカリ抽出物；酸抽出物；浸透圧による抽出物；粉砕による抽出物；すり潰しによる抽出物；凍結融解による抽出物；液体窒素による抽出物；または、高速撹拌による抽出物；であってもよい。

本発明の一態様に係る培養物または抽出物の用途として、当該培養物または抽出物を有効成分として含む植物生長調整剤等が挙げられる。

〔エルゴチオネインの生産方法〕
本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法は、ロドスポリジオボラス属またはワンリヤ属に属する微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。

本発明の一態様に係るエルゴチオネインの生産方法において、エルゴチオネインの生産量が高い点で、ロドスポリジオボラス属に属する微生物は、ロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する微生物であることが好ましく、酵母ＥＢ１５２であることがより好ましい。また、エルゴチオネインの生産量が高い点で、ワンリヤ属に属する微生物は、ワンリヤ・ヒュミコーラに近縁な種に属するワンリヤ・エスピーに属する微生物であることが好ましく、酵母ＥＢ８９１であることがより好ましい。

エルゴチオネインを含む培養物からのエルゴチオネインの回収は、例えば、通常の微生物培養物からエルゴチオネインを回収し精製する方法で行えばよい。例えば、培養物を遠心分離等して菌体を回収する。次に、回収した菌体を熱水抽出に供する等により、エルゴチオネインを含む抽出液を得る。そして、当該抽出液を精製することによって、エルゴチオネインを回収することができる。微生物のエルゴチオネインの生産量は、例えば、得られた抽出液を、高速液体クロマトグラフィー装置およびＬＣＭＳ等の質量分析装置によって測定することによって、定量することができる。

〔まとめ〕
本発明の態様１に係るに係る微生物は、ロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２）またはワンリヤ・ヒュミコーラに近縁な種に属するワンリヤ・エスピーに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３）である。

本発明の態様２に係る培養物は、前記微生物の培養物である。

本発明の態様３に係る抽出物は、前記微生物の抽出物である。

本発明の態様４に係るエルゴチオネインの生産方法は、ロドスポリジオボラス属またはワンリヤ属に属する微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。

本発明の態様５に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記の態様４において、前記ロドスポリジオボラス属に属する微生物がロドスポリジオボラス・アゾリカスであってもよい。

本発明の態様６に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記の態様４または５において、前記ワンリヤ属に属する微生物がワンリヤ・ヒュミコーラに近縁な種に属するワンリヤ・エスピーであってもよい。

本発明の態様７に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記の態様４～６のいずれかにおいて、前記ロドスポリジオボラス属に属する微生物がロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２）であってもよい。

本発明の態様８に係るエルゴチオネインの生産方法は、上記の態様４～７のいずれかにおいて、前記ワンリヤ属に属する微生物がワンリヤ・ヒュミコーラに近縁な種に属するワンリヤ・エスピーに属する微生物（ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３）であってもよい。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。

（１）環境から採取した分離源での集積培養
まず、植物および土壌等の環境からの微生物サンプル採取を２回に分けて行った。その結果、合計１５０個のサンプル（１回目９０個、２回目６０個）を採取した。

次に、スクリーニング培地２ｍＬを含む１５ｍＬのプラスチックチューブに採取したサンプルをそれぞれ浸漬し、２００ｒｐｍにおいて、３～５日間２５℃にて培養した。スクリーニング培地は抗生物質を含むＹＭ培地を使用した。具体的には、１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．０１％ストレプトマイシン硫酸塩、０．００５％クロラムフェニコールを含む培地を使用した。

そして、目視により培地が濁った（微生物が増殖した）、１２６個のサンプル（１回目７０個、２回目５６個）を選抜した。

（２）酸化ストレス負荷によるサンプルの選抜
上記（１）で選抜した１２６個のサンプルの培養液を、ＹＭ培地で１００倍または１０００００倍に希釈した。そして、ＹＭ寒天培地、および、３ｍＭのＨ_２Ｏ_２が添加されたＹＭ寒天培地（以下、Ｈ_２Ｏ_２含有ＹＭ寒天培地と略記する。）に希釈した培養液を塗布し、２５℃において２～５日間培養した。

ＹＭ寒天培地上に生育したコロニーの数と、Ｈ_２Ｏ_２含有ＹＭ寒天培地上に生育したコロニーの数をカウントした。そして、ＹＭ寒天培地およびＨ_２Ｏ_２含有ＹＭ寒天培地の両方においてコロニーが生育した１１２個のサンプルを選抜した。

さらに、選抜した１１２個のサンプルの寒天培地上で生育したコロニーについて、目視で形態および色を観察し、種類が異なる酵母様のコロニー１８１個（１回目１０６個、２回目７５個）を選抜した。

（３）選抜コロニーの９６ウェルにおける培養
上記（２）で選抜したコロニー１８１個を、１ｍＬのＹＭ培地を含む９６ウェルプレートに植菌し、１６００ｒｐｍにおいて、３～４日間２５℃にて培養した。培養後、回収した培養液を２０００ｒｐｍにおいて、１０分間４℃にて遠心分離させた。遠心分離により得られた菌体ペレットを純粋１ｍＬで洗浄し、再度遠心分離に供した。

遠心分離により得られた菌体ペレットに０．１ｍＬの純水を加えて懸濁した。得られた懸濁液を９６℃において１０分間加熱して、菌体内成分を抽出した。そして、抽出した菌体内成分を遠心分離に供して菌体残渣を取り除き、抽出液が得られた。

（４）ＬＣＭＳによる抽出液中のエルゴチオネインの定量分析
上記（３）で得られた抽出液０．１５ｍＬとアセトニトリル０．３５ｍＬとを混合した溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過した。得られた濾液をＬＣＭＳ測定のサンプルとして使用した。

ＬＣＭＳ分析には、島津製作所社製ＬＣＭＳ－２０２０を用いた。また、ＬＣのカラムには、ＳＨＯＤＥＸ社製Asahipak NH2P-40 2D+ガードカラムを使用した。ＬＣの移動相として、１０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭギ酸アンモニウム／アセトニトリル＝３０／７０（ｖ／ｖ））を使用した。また、流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、２５℃において分析を行った。

ＭＳ検出においては、ＥＳＩイオン化とＡＰＣＩイオン化とを同時に行うＤＵＩＳモードでイオン化させた。また、エルゴチオネインを検出可能なｍ／ｚ＝２３０（＋）のＳＩＭモードで検出を行った。

上記（２）で選抜したコロニー１８１個の抽出液を分析した結果、エルゴチオネインの生産量が高かった２２個のコロニー（１回目７個、２回目１５個）を選抜した。

（５）エルゴチオネイン生産微生物のフラスコにおけるスケールアップ培養
上記（４）で選抜した２２個のコロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、７日間２５℃にて培養した（ｎ＝１）。

培養３～７日目の培養液を適宜採取した。上記（３）と同様に、菌体を遠心分離および洗浄後、熱水抽出により抽出液を回収した。

得られた抽出液を、上記（４）と同様に、ＬＣＭＳにより分析を行い、エルゴチオネインの生産量が高かった２株（ＥＢ１５２、ＥＢ８９１）を選抜した。

選抜した２株のコロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬフラスコに植菌し、２００ｒｐｍにおいて、５日間２５℃にて培養した（ｎ＝３）。そして、５日目のエルゴチオネインの生産量を、ＬＣＭＳにより測定した。

選抜した２株のコロニーのエルゴチオネインの生産量と生産速度を表１に示す。表２は、公知の微生物の生産量と生産速度を示す。表１および２中、特に記載がない限り、エルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量の単位はｍｇ／Ｌであり、ＥＧＴの生産速度はｍｇ／Ｌ／ｄ（１日当たりのエルゴチオネインの生産量）である。また、表１のＥＧＴの生産量は、培養５日目のエルゴチオネインの生産量を示す。

表１の「抽出物中のＥＧＴ量」について、抽出物は、ＹＭ培地２Ｌを入れた５Ｌジャーファーメンターを用いて、当該微生物を５日間２５℃にて好気的に培養し、培養後の乾燥菌体から熱水抽出することによって得た。そして、ＬＣＭＳによって抽出物中のＥＧＴ量を測定した。

表１および２より、選抜した２株のエルゴチオネインの生産量は、既知のエルゴチオネイン生産微生物のエルゴチオネインの生産量の同等以上だったことが分かった。また、選抜した２株のエルゴチオネインの生産速度も、既知のエルゴチオネイン生産微生物の生産速度の同等以上であったことが分かった。また、選抜した２株の抽出物について、エルゴチオネインが豊富に含まれていることを確認した。

（６）選抜した２株の同定
選抜した２株の帰属分類群の推定は、リボソームＲＮＡ遺伝子の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域の塩基配列の解析により行った。

（７）ＥＢ１５２株の分子系統学的位置および生理学的性質
ＥＢ１５２株の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域塩基配列およびＩＴＳ－５．８ｒＤＮＡ塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるロドスポリジオボラス・アゾリカスの複数の塩基配列に対して、９８．４～１００％の同一性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、ＥＢ１５２株はロドスポリジオボラス属で構成される系統群に含まれた。そして、ロドスポリジオボラス・アゾリカスＪＣＭ１１２５１^Ｔと同一の分子系統学的位置を示した。

ＥＢ１５２株を、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃３日間培養し、形成されたコロニーを観察した。コロニーの周縁の形状は全縁であり、隆起状態はクッション形だった。また、コロニーの表面の形状は平滑であった。さらに、コロニーはバター様および湿性を有し、ピンク色～薄橙色であった。

また、ＥＢ１５２株を、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃３日間培養後、細胞形態性状についても観察した。栄養細胞は楕円形～卵形であり、増殖は出芽によることが認められた。培養開始６週間以上経過した平板で有性生殖器官の形成は認められなかった。

上記のＥＢ１５２株の形態学的性質は、Ｄ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域のＤＮＡ配列解析で帰属されたロドスポリジオボラス・アゾリカスの特徴にほぼ一致していた。ＥＢ１５２株の生理学的性質を表３に示す。

表３中、「＋」は陽性を示す。「－」は陰性を示す。「Ｗ」は弱い陽性を示す。「Ｄ」は試験開始後１週間以上の時間をかけて徐々に陽性になったことを示す、「Ｌ」は試験開始後２週間以降に急速に陽性になったことを示す。

分子系統学的位置および生理学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＢ１５２株はロドスポリジオボラス・アゾリカスに帰属される新規微生物と判断した。

（８）ＥＢ８９１株の分子系統学的位置および生理学的性質
ＥＢ８９１株の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるワンリヤ・ヒュミコーラ（Vanrija humicola）の複数の塩基配列に対して、９９．０～９９．８％の同一性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、ＥＢ８９１株はワンリヤ属で構成される系統群に含まれ、ワンリヤ・ヒュミコーラＣＢＳ５７１^Ｔとクラスターを形成し、近縁であることが示された。一方で、ＥＢ８９１株のＩＴＳ－５．８ｒＤＮＡ塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるワンリヤ・ヒュミコーラ（Vanrija humicola）の複数の塩基配列に対して、９８．５～１００％の同一性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、ＥＢ８９１株はワンリヤ属で構成される系統群に含まれ、ワンリヤ・ヒュミコーラの複数の塩基配列と９９％の高いブートストラップ値で支持されるクラスターを形成し、ワンリヤ・ヒュミコーラに帰属する可能性が示された。

ＥＢ８９１株を、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃３日間培養し、形成されたコロニーを観察した。コロニーの周縁の形状は全縁であり、隆起状態は平坦～クッション状だった。また、コロニーの表面の形状は平滑～やや粗面であった。さらに、コロニーはバター様で湿性を有し、白色～クリーム色であった。

また、ＥＢ８９１株を、ＹＭ寒天平板培地上で２５℃３日間培養後、細胞形態性状についても観察した。栄養細胞は楕円形～棍棒形であり、増殖は出芽によることが認められた。培養開始６週間以上経過した平板で有性生殖器官の形成は認められなかった。

上記のＥＢ８９１株の形態学的性質は、Ｄ１／Ｄ２領域およびＩＴＳ領域のＤＮＡ配列解析で帰属されたワンリヤ・ヒュミコーラの特徴にほぼ一致していた。ＥＢ８９１株の生理学的性質を表３に示す。

表４中、「＋」は陽性を示す。「－」は陰性を示す。「Ｗ」は弱い陽性を示す。「Ｄ」は試験開始後１週間以上の時間をかけて徐々に陽性になったことを示す、「Ｌ」は試験開始後２週間以降に急速に陽性になったことを示す。

分子系統学的位置および生理学的性質ならびにエルゴチオネインの生産量の測定より、ＥＢ８９１株はワンリヤ・ヒュミコーラまたはそれに近縁な種に帰属される新規微生物と判断した。

塩基配列の解析の結果、ＥＢ１５２株はロドスポリジオボラス・アゾリカス、ＥＢ８９１株はワンリヤ・ヒュミコーラまたはそれに近縁な種に属すると推定された。

本発明の微生物は、エルゴチオネインの生産量が高く、健康および美容等の分野において利用可能である。

ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２
ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３

Claims

ロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２として寄託された微生物またはワンリヤ属に属する受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３として寄託された微生物。
請求項１に記載の微生物の培養物。
ロドスポリジオボラス属またはワンリヤ属に属する微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む、エルゴチオネインの生産方法。
前記ロドスポリジオボラス属に属する微生物がロドスポリジオボラス・アゾリカスである、請求項３に記載のエルゴチオネインの生産方法。
前記ワンリヤ属に属する微生物の２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域塩基配列が、ワンリヤ・ヒュミコーラの２６ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域塩基配列と９９％以上の同一性を有する、請求項３に記載のエルゴチオネインの生産方法。
前記ロドスポリジオボラス属に属する微生物がロドスポリジオボラス・アゾリカスに属する受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３５７２として寄託された微生物である、請求項３に記載のエルゴチオネインの生産方法。
前記ワンリヤ属に属する微生物が受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３５７３として寄託された微生物である、請求項３に記載のエルゴチオネインの生産方法。