JP7757183B2 - トランスジェニックバルブ - Google Patents

Description

ATCC PTA-126570 ATCC PTA-126571

関連出願の相互参照
本出願は、2020年1月10日にPCT国際特許出願として出願されており、そして、2019年1月10日に出願され、Transgenic Orange Barbと題された米国仮特許出願第62/790,683号、及び2019年1月10日に出願され、Transgenic Purple Barbと題された米国仮特許出願第62/790,687号の優先権を主張するものである。それらの開示は、その全体として参照により本明細書に援用される。

本発明の分野
本発明は、トランスジェニック魚に関する。具体的には、本発明は、オレンジ色のトランスジェニックバルブに関する。具体的には、本発明は、紫色のトランスジェニックバルブに関する。

序論
トランスジェニック技術は、宿主が新しい遺伝形質を獲得することを可能にする宿主生物への外来遺伝子の導入を伴う。トランスジェニック技術は、多くの潜在的な用途を有する。例えば、新しい種類の魚を作成するために、導入遺伝子を魚に導入することに用いられ得る。魚に外来遺伝子を導入する方法には、次のような多くの方法を含む： マイクロインジェクション（例えば、Zhu et al., 1985; Du et al., 1992）、エレクトロポレーション（Powers et al., 1992）、精子媒介遺伝子導入（Khoo et al., 1992; Sin et al., 1993）、遺伝子ボンバードメントまたは遺伝子ガン（Zelenin et al., 1991）、リポソーム媒介遺伝子移入（Szelei et al., 1994）、および筋肉組織へのDNAの直接注射（Xu et al., 1999）。

最初のトランスジェニック魚の報告は、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーターおよびヒト成長ホルモン遺伝子からなるキメラ遺伝子構成物を使用してZhu et al.,(1985)によって公開された。初期のトランスジェニック魚の研究のほとんどは、急速に成長する魚を生成することを目的とした成長ホルモン遺伝子導入に集中している。初期の試みの大部分は、異種成長ホルモン遺伝子とプロモーターを使用し、これらの魚の生産に失敗したが（例えば、Chourrout et al., 1986; Penman et al., 1990; Brem et al., 1988; Gross et al., 1992）、アトランティックサーモン、いくつかの種のパシフィックサーモン、およびドジョウを含むいくつかの魚種でトランスジェニック魚の成長の強化が実証されている（例えば、Du et al., 1992; Delvin et al., 1994, 1995; Tsai et al., 1995）。

バルブは、非系統発生学的グループ中の条鰭類魚種の１つであり、Cyprinidae科、特にBarbus及びPuntius属のメンバーを含むが、他にも多くの魚種を含む。それらは以前はBarbinae亜科の中でバーベル（barbels）と統一されていたが、このグループは、Cyprininaeの側系統である。それらは通常溶存酸素量が高い荒れた岩がちの流れの遅い水中にいる。典型的な成体のバーベルは体長２５～１００ｃｍで、重量は２００ｇ～１０ｋｇであるが、一般的には２００ｇ程度である。この属は愛好家の間で多くの種が知られている。それらは他の種と仲が良く攻撃的ではないため、熱帯の淡水の混泳の水槽に良く適合する。しかしながら、観賞魚業界において、体の野生の着色は、様々な色の効果的な提示を補うものではない。蛍光タンパク質を用いた遺伝子組み換えによって色素形成が改変されたそのようなバルブの利用可能性は、様々な色をより良く見せることにより、観賞魚業界により良い製品をもたらすだろう。

多くの蛍光タンパク質が、当該技術分野で知られており、種々の緑色、赤色、ピンク色、黄色、オレンジ色、青、または紫色を示す蛍光タンパク質を含む、種々の細胞プロセス調査に使用されている。蛍光タンパク質を含むトランスジェニック実験は、遺伝子組換えの新しいマーカーおよびレポーターを提供するが、斯かるタンパク質を発現するバルブの開発および産生の分野での進歩は限られている。

トランスジェニックバルブ
特定の実施形態において、本開示は、トランスジェニック蛍光を発する魚を作製すること、斯かる魚を観賞魚産業に供給することに関する。

いくつかの実施形態において、トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚の作製方法が提供される。特定の実施形態において、当該トランスジェニック魚は、繁殖力のある、トランスジェニックの、蛍光を発する魚である。特定の実施形態において、開示された構成物および方法で使用する魚は、バルブである。バルブの皮膚の色は、皮膚の色素細胞によって決定され、色素細胞は、メラノソーム（黒色または茶色）、キサントソーム（黄色）、エリトロソーム（オレンジ色または赤色）、またはイリドソーム（白色を含む虹色）と称される色素顆粒を含む。色素細胞当たりの色素顆粒の数、サイズ、および密度は、魚の皮膚の色に影響する。

この明細書において使用される場合「a」または「an」は1つ以上を意味し得る。本請求項で用いられる場合、「含む」という単語と併せて使用される際、「a」または「an」という単語は、1つまたは複数を意味し得る。

請求項における「または」という用語の使用は、代替案のみを示すように明示的に示されていない限り、または代替案が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、当該開示は、代替案および「および／または」のみを参照する定義をサポートする。本明細書で使用される「他の」とは、少なくとも2つ以上を意味する場合がある。

本出願全体を通して、用語「約」は、値が装置の誤差の固有の変動、値を決定するために採用されている方法、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。

本方法、キットおよび組成物の何れかの任意の実施形態は、記載された特徴および／または工程を含む（comprise）／含む（include）／含む（contain）／有する（have）よりむしろ、本質的になるまたはからなることが可能である。従って、請求項の何れかにおいて、用語「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consisting essentially of）」は、所定のクレームの範囲を他の方法で制限のない結合動詞を使用することから変更する目的で、上記に列挙された制限のない結合動詞の何れかと置き換えることで達成され得る。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の本質および範囲内の様々な変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるが、しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のみのために与えられていることを理解すべきである。

本発明の詳細な説明
トランスジェニック魚
いくつかの態様において、本開示は、トランスジェニック魚に関する。トランスジェニック魚の作製方法は、例えば、米国特許出願7,135,613；7,700,825；7,834,239に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、トランスジェニックオレンジバルブは、黄色蛍光タンパク質(YFP)、例えばZsYellow1などをコードする発現カセットを使用して生み出され得る。他の例において、紫色蛍光タンパク質（PFP）、例えばFP635などをコードする発現カセットを使用してトランスジェニック紫色バルブが生み出され得る。

商業的価値、特に観賞魚産業内の商業的価値のある魚の種および品種に属する魚を使用することが好ましい。斯かる魚としては、これだけに限定されるものではないが、コリドラス、ナマズ、ゼブラフィッシュおよび他のダニオ属、メダカ、カープ（carp）、ティラピア、金魚、テトラ、バーブ、シャーク（レインボーシャークなどのcyprinidaeファミリー）、エンジェルフィッシュ、ドジョウ、コイ、グラスフィッシュ、ディスカス、ウナギ、ハゼ、グラミー、グッピー、クシフォフォルス、ハチェットフィッシュ、モリーフィッシュ、またはパンガシウスが挙げられる。本開示の中で使用するための特定の魚は、バルブである。バルブは、人気が高まっている鑑賞動物であり、様々な色を加えることでの商業的価値が存在するであろう。バルブの胚は、簡単に利用可能であり、ほぼ透明である。バルブの皮膚の色は、メラノソームと称される色素顆粒を含む皮膚の色素細胞によって決定される。色素細胞当たりのメラノソームの数、サイズ、および密度は、魚の皮膚の色に影響する。

幾つかの態様において、トランスジェニック組込み事象、（本明細書中形質転換事象と称する）を含む、トランスジェニックバルブ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えばそれらが審美的に好ましいオレンジ色を呈するため、特に興味深い。これらの特定のトランスジェニック自称を含むトランスジェニック魚は、形質転換事象においてホモ接合又はヘテロ接合（例えばヘミ接合を含む）であってもよい。形質転換事象を欠いた魚を用いて繁殖されたホモ接合魚は殆どの場合１００％ヘテロ接合の子を生む。これらの特定の形質転換事象を含むため後、精子及び胚も、本発明の部分として含まれる。

特定のトランスジェニック組込み事象に関する少なくとも１つの態様において、オレンジトランスジェニックバルブ又はその子孫は、染色体に組み込まれたトランス遺伝子を有し、当該バルブは、「Orange Barb 1形質転換事象」を含み、当該Orange Barb 1形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126571でAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されている。染色体に組み込まれたトランス遺伝子は、１つの統合された発現カセット又は２つ以上の統合された発現カセット上に提示され得る。幾つかの側面において、そのようなトランスジェニックバルブは繁殖力のあるトランスジェニックバルブである。そのようなトランスジェニックバルブは、トランス遺伝子又は統合された発現カセットにおいてホモ接合又はヘテロ接合（例えばヘミ接合を含む）であり得る。

観賞魚市場にOrange Barb 1形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する方法も提供される。幾つかの態様において、この方法は、染色体に組み込まれたトランス遺伝子を含むトランスジェニックバルブ又はその子孫を得ること、ここで当該バルブは、「Orange Barb 1形質転換事象」を含み、Orange Barb 1形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126571でATCCに寄託されており、及び当該魚を観賞魚市場に卸すことを含む。そのような魚は育成者によって商業的卸業者に卸され得、又はそのような魚は、育成者又は商業的卸業者により、例えば観賞魚部門を有する多品種小売店等の小売店に卸される。

幾つかの側面において、トランスジェニックバルブを生産する方法が提供され、当該方法は、以下：
(a)蛍光を発し１つ以上の染色体に組み込まれたトランス遺伝子又は発現カセットを含むバルブを得ること、当該バルブは「Orange Barb 1形質転換事象」を含み、Orange Barb 1形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126571でATCCに寄託されている；及び
(b)得られたバルブを第二のバルブと交配してOrange Barb 1形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供すること；
を含む。第二のバルブは、トランスジェニック又は非トランスジェニックバルブであり得る。

更なる態様において、トランスジェニック生物を生産する方法が提供され、当該方法は、寄託番号PTA-126571で寄託されたOrange Barb 1形質転換事象を含む精子を用いてトランスジェニックの子孫を生産することを含む。そのような子孫は、例えばバルブ、Cyprinidae科の種、バルブに関連する魚種又は属、又は他の種若しくは属であり得る。幾つかの態様において、当該魚は、本分野で公知の又は本明細書中に記載のインビトロ受精技術を用いて生産され得る。

特定のトランスジェニック統合事象に関する幾つかの態様において、紫トランスジェニックバルブ又はその子孫が提供され、それらは、染色体に組み込まれたトランス遺伝子を含み、当該バルブは、「Purple Barb 1形質転換事象」を含み、Purple Barb 1形質転換事象形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126570でATCCに寄託されている。染色体に組み込まれたトランス遺伝子は、１つの統合された発現カセット又は２つ以上の統合された発現カセット上に提示され得る。幾つかの側面において、そのようなトランスジェニックバルブは繁殖力のあるトランスジェニックバルブである。そのようなトランスジェニックバルブは、トランス遺伝子又は統合された発現カセットにおいてホモ接合又はヘテロ接合（例えばヘミ接合を含む）であり得る。

観賞魚市場にPurple Barb 1形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する方法も提供される。幾つかの態様において、この方法は、染色体に組み込まれたトランス遺伝子を含むトランスジェニックバルブ又はその子孫を得ること、ここで当該バルブは、「Purple Barb 1形質転換事象」を含み、Purple Barb 1形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126570でATCCに寄託されており、及び当該魚を観賞魚市場に卸すことを含む。そのような魚は育成者によって商業的卸業者に卸され得、又はそのような魚は、育成者又は商業的卸業者により、例えば観賞魚部門を有する多品種小売店等の小売店に卸される。

幾つかの側面において、トランスジェニックバルブを生産する方法が提供され、当該方法は、以下：
(a)蛍光を発し１つ以上の染色体に組み込まれたトランス遺伝子又は発現カセットを含むバルブを得ること、当該バルブは「Purple Barb 1形質転換事象」を含み、Purple Barb 1形質転換事象を含む精子は、寄託番号PTA-126570でATCCに寄託されている；及び
(b)得られたバルブを第二のバルブと交配してPurple Barb 1形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供すること；
を含む。第二のバルブは、トランスジェニック又は非トランスジェニックバルブであり得る。

更なる態様において、トランスジェニック生物を生産する方法が提供され、当該方法は、寄託番号PTA-126570で寄託されたPurple Barb 1形質転換事象を含む精子を用いてトランスジェニックの子孫を生産することを含む。そのような子孫は、例えばバルブ、Cyprinidae科の種、バルブに関連する魚種又は属、又は他の種若しくは属であり得る。幾つかの態様において、当該魚は、本分野で公知の又は本明細書中に記載のインビトロ受精技術を用いて生産され得る。

商業的水産養殖において、オレンジバルブ及び紫バルブは天然にペアで生み出される。バルブの１つの交配ペアは、人工産卵マット及びエアレーションを備えた小さな水槽に入れられるべきである。水槽内の水位は２～３インチで７５～８５゜Ｆとすべきである。低い塩分濃度（伝導度100-200uS/cm）及び弱酸性（~pH 6.9）が産卵を促進するが必須ではない。魚は天然又は午前８時に開始し午後１０時に終了する人工の照明サイクルに晒されてもよい。翌日の昼頃魚を除去し、水槽中の卵を回収する。翌日には稚魚が孵化し、２～３日後には泳ぎ回るようになる。泳ぐようになったら稚魚を成育及び成熟させるためバットや外の池に移しても良い。

バルブの繁殖ストックは屋内の水槽、好ましくは３００ガロン以上の容積の水槽内で維持されてもよいが、典型的には土の池中屋外で調整される。繁殖用に調整したバルブを屋外の土の池から屋内の大型のホールディングバットに移す。バルブは毎週産卵出来；２又は３週間置きの産卵が好ましい。

凍結精子からの受精
魚の精子の凍結方法は本分野で周知であり、例えばそれらの全体が本明細書中に参照により援用されるWalker and Streisinger (1983)及びDraper and Moens (2007)を参照されたい。本明細書中に開示のトランスジェニック魚を得るため、凍結バルブ精子を用いて卵の受精が行われ得る。

要するに、バルブの１つ又は２つの交配ペアが人工産卵マットを備えた小型水槽に入れられるべきである。水槽内の水位は２～３インチで７５～８５゜Ｆとすべきである。低い塩分濃度（伝導度100-200uS/cm）及び弱酸性（~pH 6.9）が産卵を促進するが必須ではない。魚は天然又は午前８時に開始し午後１０時に終了する人工の照明サイクルに晒されてもよい。翌朝、卵を除去及び廃棄する。バルブは16mg/100mLのトリカイン水溶液に沈めて麻酔され得る。鰓の動きが緩慢になってきたら、雌を取り出して、水中で洗い、そして半乾きのペーパータオルでそっと腹を拭く。受精が妨げられるので卵を水に接触させるべきではない。親指と人指し指で脇腹の両側を軽く圧迫して指を生殖孔に動かすことにより、僅かに窪んだ表面に卵をそっと絞り出す。産卵直前の雌はとても簡単に卵を放出するので、魚を拭いているときに卵を絞らないように留意すべきである。良い卵は黄色がかっており透明である。雌の腹中に長く留まり過ぎていた卵は白色で不透明である。雌は１時間程度だけ卵を放出する。幾つかの雌から採取した卵を纏めても良く、それらは数分間未授精で維持され得る。精子は１８～２０秒間３３℃のウォーターバスで融解される。更にバイアルに７０μlの室温のHanks溶液を添加し、混合する。そして精子を直ちに前記卵に加え、静かに混合する。精子と卵に７５０μlのフィッシュウォーター（fish water）を添加して混合することにより活性化する。この混合物を5分間室温でインキュベーションする。そしてディッシュをフィッシュウォーターで満たし、２８度でインキュベーションする。２～３時間後、受精胚を小さいディッシュに移し、それらはそこで更に培養される。

その全体が参照により援用されるParichy and Johnson, 2001は、インビトロ受精に関する追加の例を提供する。

本開示はさらに、オレンジバルブ形質転換事象を含むトランスジェニック魚の子孫、ならびにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、またはゲノム組込み型トランスジェニック構成物を含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の2匹のトランスジェニック魚の交配、または本発明の第一のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第二の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第二の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、または他のトランスジェニック魚であり得る。第二の魚は同じ種でも、異なる種または属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。

オレンジバルブ1形質転換事象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚がオレンジ色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。

本開示はさらに、紫バルブ形質転換事象を含むトランスジェニック魚の子孫、ならびにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、またはゲノム組込み型トランスジェニック構成物を含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の2匹のトランスジェニック魚の交配、または本発明の第一のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第二の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第二の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、または他のトランスジェニック魚であり得る。第二の魚は同じ種でも、異なる種または属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。

紫バルブ1形質転換事象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚が紫色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。

本発明の特定の実施形態は、以下の実施例を参照にしてされに説明される。これらの実施例は、本発明の単なる例示であることを意図しており、本発明の範囲を限定または制限することを決して意図しておらず、条件、パラメーター、試薬、または本発明の技術を実施するために排他的に利用されなければならない出発物質を提供するものとして解釈されるべきではない。
実施例1－オレンジトランスジェニックバルブ

オレンジ色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック事象は、「オレンジバルブ1形質転換事象」と表される。これらの魚の精子を用いてバルブ卵を受精し、それによってこれらの特定のトランスジェニック組込み事象を含むトランスジェニックバルブを繁殖させることができる。この系統の精子は、「オレンジバルブ1」としてブダペスト条約の規定に基づき、ATCC, 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA、に寄託された。（この寄託は寄託番号PTA-126571と指定された）
実施例2－紫トランスジェニックバルブ

紫色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック事象は、「紫バルブ1形質転換事象」と表される。これらの魚の精子を用いてバルブ卵を受精し、それによってこれらの特定のトランスジェニック組込み事象を含むトランスジェニックバルブを繁殖させることができる。この系統の精子は、「紫バルブ1」としてブダペスト条約の規定に基づき、ATCC, 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA、に寄託された。（この寄託は寄託番号PTA-126570と指定された）

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用される。安定的に発現するトランスジェニック系統は、トランスジェニック固体を野生型魚、突然変異体魚、または他のトランスジェニック魚と交配することにより開発され得る。目的のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、またはトランスジェニック魚のオレンジ色又は紫色の可視化を可能にする他の有用な照明条件で魚を観察することにより、非トランスジェニック魚と区別され得る。

蛍光トランスジェニック魚は、細胞系統や細胞移行の追跡などの胚研究に使用できるため、科学研究のツールの市場でも貴重なはずである。加えて、これらの魚は、遺伝子モザイク実験および魚の癌モデルにおいて細胞をマークするために用いられ得る。

本明細書において開示および請求される組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、作製および実行され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、本質および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法の組成物および／または方法、ならびに工程または一連の工程において、変形が適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代わりに使用し、同じまたは類似の結果を達成できることは明らかであろう。当業者に明らかな斯かる類似の置換および改変の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本質、範囲、および概念の範疇にあるとみなされる。

上記の明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用に関する完璧な説明を提供する。本発明の多くの実施形態が本発明の主旨および範囲から逸脱することなく作製され得るので、本発明は以下に添付した請求項の中に存在する。

Claims (24)

1. 蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含むトランスジェニックバルブであって、ここで、当該バルブは、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７１で寄託されたオレンジバルブ１形質転換事象を含む「オレンジバルブ１形質転換事象」精子を含む、トランスジェニックバルブ。
2. 繁殖力のあるトランスジェニックバルブとしてさらに定義される、請求項１に記載のトランスジェニックバルブ。
3. 前記トランスジェニックバルブが、前記組込み型発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックバルブ。
4. 前記トランスジェニックバルブが、前記組込み型発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックバルブ。
5. トランスジェニックバルブを作製する方法であって、以下の：
   （ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含むバルブを得る工程、ここで、当該バルブは、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７１で寄託されたオレンジバルブ１形質転換事象を含む「オレンジバルブ１形質転換事象」精子を含む；および
   （ｂ）得られたバルブと第二のバルブを交配し、前記オレンジバルブ１形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する工程、を含む方法。
6. 前記第二のバルブが、トランスジェニックバルブではない、請求項５に記載の方法。
7. 蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含む、請求項１に記載のトランスジェニックバルブの子孫魚であって、ここで、前記トランスジェニックバルブおよび子孫魚が蛍光を発し、かつ、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７１で寄託されたオレンジバルブ１形質転換事象を含む「オレンジバルブ１形質転換事象」精子を含む、トランスジェニックバルブの子孫魚。
8. 繁殖力のあるトランスジェニックバルブとしてさらに定義される、請求項７に記載の子孫魚。
9. 前記子孫魚が、前記組込み型発現カセットに対してホモ接合性である、請求項７に記載の子孫魚。
10. 前記子孫魚が、前記組込み型発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項７に記載の子孫魚。
11. トランスジェニックバルブを作製する方法であって、以下の：
    （ａ）請求項７に記載のトランスジェニックバルブの子孫魚を得る工程；および
    （ｂ）得られた子孫魚と第二のバルブを交配し、前記オレンジバルブ１形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する工程、を含む方法。
12. 前記第二のバルブが、トランスジェニックバルブではない、請求項１１に記載の方法。
13. 蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含むトランスジェニックバルブであって、ここで、当該トランスジェニックバルブは、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７０で寄託された紫バルブ１形質転換事象を含む「紫バルブ１形質転換事象」精子を含む、トランスジェニックバルブ。
14. 繁殖力のあるトランスジェニックバルブとしてさらに定義される、請求項１３に記載のトランスジェニックバルブ。
15. 前記トランスジェニックバルブが、前記組込み型発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１３に記載のトランスジェニックバルブ。
16. 前記トランスジェニックバルブが、前記組込み型発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１３に記載のトランスジェニックバルブ。
17. トランスジェニックバルブを作製する方法であって、以下の：
    （ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含むバルブを得る工程、ここで、当該バルブは、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７０で寄託された紫バルブ１形質転換事象を含む「紫バルブ１形質転換事象」精子を含む；および
    （ｂ）得られたバルブと第二のバルブを交配し、前記紫バルブ１形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する工程、を含む方法。
18. 前記第二のバルブが、トランスジェニックバルブではない、請求項１７に記載の方法。
19. 蛍光タンパク質をコードする染色体組込み型発現カセットを含む、請求項１３に記載のトランスジェニックバルブの子孫魚であって、ここで、前記トランスジェニックバルブおよび子孫魚が蛍光を発し、かつ、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ－１２６５７０で寄託された紫バルブ１形質転換事象を含む「紫バルブ１形質転換事象」精子を含む、トランスジェニックバルブの子孫魚。
20. 繁殖力のあるトランスジェニックバルブとしてさらに定義される、請求項１９に記載の子孫魚。
21. 前記子孫魚が、前記組込み型発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１９に記載の子孫魚。
22. 前記子孫魚が、前記組込み型発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１９に記載の子孫魚。
23. トランスジェニックバルブを作製する方法であって、以下の：
    （ａ）請求項１９に記載のトランスジェニックバルブの子孫魚を得る工程；および
    （ｂ）得られた子孫魚と第二のバルブを交配し、前記紫バルブ１形質転換事象を含むトランスジェニックバルブを提供する工程、を含む方法。
24. 前記第二のバルブが、トランスジェニックバルブではない、請求項２３に記載の方法。