JP7759765B2 - スフェロイド及びその作製方法 - Google Patents

Description

本発明はスフェロイド及びその作製方法に関する。

近年、細胞を三次元培養することで、臓器の構造を模した組織を作製することに注目が集まっている。例えば、神経系の細胞と血管系の細胞とを含む神経系スフェロイドは、脳組織に類似した構造を有するため、アルツハイマー型認知症又は血管障害に起因する脳疾患の病理メカニズムの解明、及び創薬分野での薬剤スクリーニングへの応用が期待される。例えば、非特許文献１では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来の神経前駆細胞からなるスフェロイドと、血管内皮細胞からなるスフェロイドとを融合させることで脳様スフェロイドを作製する試みが報告されている。

L. Song et al., Sci. Rep. 9, 5977(2019)

神経系の細胞と血管系の細胞とを含む従来の神経系スフェロイドにおいて、血管構造は網状に形成されていなかった。本発明はかかる課題に鑑みてなされたものであり、網状の血管構造を有する神経系スフェロイドを提供することを目的とする。

本発明の一側面に係るスフェロイドは、神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを含み、且つ上記血管内皮細胞の集合が網状の血管構造を形成している。

スフェロイドは、グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを含んでよく、該グリア細胞はスフェロイド表面の少なくとも一部を覆っていてよい。グリア細胞はアストロサイトであってよく、血管内皮細胞は脳微小血管内皮細胞であってよく、幹細胞は脂肪由来幹細胞であってよい。

本発明の一側面に係るスフェロイドを作製する方法は、細胞接着性の細胞培養基材上で、神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程を備え、神経細胞又はグリア細胞、幹細胞、及び血管内皮細胞のそれぞれは、共培養の開始時にスフェロイドを形成していない。

神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程は、グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程であってよい。共培養は、神経幹細胞用培地と血管内皮細胞用培地との混合培地中で行ってもよい。共培養は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地中で行ってもよい。細胞接着性の細胞培養基材は、フッ素化ポリイミド樹脂を含む細胞培養基材であってよい。

本発明によれば、網状の血管構造を有する神経系スフェロイドが提供される。網状の血管構造を有する神経系スフェロイドは、脳組織により類似した構造を有するため、脳疾患の病理メカニズムの解明及び薬剤スクリーニングへの応用がより期待できる。

本発明の一実施形態に係るスフェロイドの模式的な断面図である。 図２の（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１のスフェロイドの形成過程を示す画像である。 図３の（Ａ）は実施例１のスフェロイドの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図３の（Ｂ）は実施例１のスフェロイドの水平方向の断面画像である。 図４は、実施例２のスフェロイドの形成過程を示す画像である。 図５の（Ａ）は実施例２のスフェロイドの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図５の（Ｂ）は実施例２のスフェロイドの水平方向の断面画像である。 図６の（Ａ）は実施例２のスフェロイドの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図６の（Ｂ）は実施例２のスフェロイドの水平方向の断面画像である。 図７は、実施例３のスフェロイドの形成過程を示す画像である。 図８の（Ａ）は実施例３のスフェロイド（ＲＯＣＫ阻害剤２０μＭ）の蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図８の（Ｂ）は実施例３の当該スフェロイドの水平方向の断面画像である。 図９は、実施例４のスフェロイドの形成過程を示す画像である。 図１０の（Ａ）は実施例４のスフェロイド（ＲＯＣＫ阻害剤１０μＭ）の蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図１０の（Ｂ）は実施例４の当該スフェロイドの水平方向の断面画像である。 図１１の（Ａ）は実施例４のスフェロイド（ＲＯＣＫ阻害剤２０μＭ）の蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像であり、図１１の（Ｂ）は実施例４の当該スフェロイドの水平方向の断面画像である。

本発明の一側面に係るスフェロイドは、神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを含み、該血管内皮細胞が集合して網状の血管構造を形成している。

神経細胞の由来は特に限定されず、ヒト由来又はヒト以外の動物由来の神経細胞を用いることができる。また、神経細胞は、中枢神経系神経細胞及び末梢神経系神経細胞のいずれであってもよいが好ましくは中枢神経系（脳又は脊髄由来）神経細胞であり、より好ましくは脳由来の神経細胞である。

グリア細胞は、アストロサイト、ミクログリア、及びオリゴデンドロサイトからなる群より選ばれる一種以上の細胞であってよい。グリア細胞の由来は特に限定されず、ヒト由来又はヒト以外の動物由来のグリア細胞を用いることができる。グリア細胞は、例えばヒトアストロサイト等のアストロサイトであってよい。

スフェロイドは、神経細胞若しくはグリア細胞のいずれか一方のみ又は両方を含むことができる。スフェロイドは、少なくともグリア細胞を含むことが好ましい。

幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞であってもよく、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）であってもよく、又は癌幹細胞であってもよい。間葉系幹細胞としては、由来は特に限定されず、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞、及び歯髄由来幹細胞が挙げられる。幹細胞の由来は特に限定されず、ヒト由来又はヒト以外の動物由来の幹細胞を用いることができる。幹細胞は、例えば、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＡｄＳＣ）であってよい。

血管内皮細胞は、脳微小血管内皮細胞、静脈由来内皮細胞、又は動脈由来内皮細胞であってよく、好ましくは脳微小血管内皮細胞である。血管内皮細胞の由来は特に限定されず、ヒト由来又はヒト以外の動物由来の血管内皮細胞を用いることができる。血管内皮細胞は、例えば、ヒト脳微小血管内皮細胞であってよい。

スフェロイドは、周皮細胞、平滑筋細胞等、血管内皮細胞以外の血管を構成する細胞をさらに含んでよい。血管を構成する細胞の由来は特に限定されず、ヒト由来又はヒト以外の動物由来の細胞を用いることができる。

幹細胞と血管内皮細胞の比は、例えば１：１～１０：１であってよく、より具体的には、例えば、５：１～１０：１、２：１～３：１、又は１：１～２：１であってよい。血管内皮細胞と神経細胞の比は、例えば１：０．５～１：２０であってよく、より具体的には、例えば、１：１０～１：２０、１：５～１：１０、又は１：０．５～１：３であってよい。血管内皮細胞とグリア細胞の比は、例えば１：０．５～１：３０であってよく、より具体的には、例えば、１：２０～１：３０、１：１０～１：１５、又は１：５～１：１０であってよい。

スフェロイドは、上記血管該内皮細胞を含む網状の血管構造を内部に有する。本明細書において、「血管構造」とは、未成熟な血管構造及び成熟した血管構造の両方を包含し、具体的には、管腔を形成する血管内皮細胞の連続的な単層を少なくとも有する構造を指す。血管内皮細胞の層は基底膜で覆われていてもよく、周皮細胞又は平滑筋細胞が接着していてもよい。網状の血管構造とは、血管が分岐し又は互いに接続することにより形成された、網状の構造を意味する。血管構造は、スフェロイドの全体にわたって形成されていることが好ましいが、スフェロイドの一部に局所的に形成されていてもよい。網状の血管構造を有することにより、栄養及び酸素がスフェロイドの全体に行き渡りやすい。なお、ドーム部と平坦部を含む形状のスフェロイドであって、平坦部から該平坦部に対して垂直方向に沿って複数の血管構造が形成されているスフェロイドについては、本発明の範囲に含めることを意図していない。

スフェロイドがグリア細胞を含む場合、グリア細胞は、スフェロイド表面の少なくとも一部を覆うように存在する。スフェロイドの表面の一部又は全体がグリア細胞により覆われていると、グリア細胞から産生された液性因子等のタンパク質がスフェロイド内部へ拡散し、細胞間の相互作用が強くなることで各細胞の機能発現が向上すると考えられる。一部のグリア細胞は、幹細胞とともにスフェロイドの内部に存在していてもよい。

スフェロイドは、例えば略球状であってよい。ただし、スフェロイドが細胞培養基材に接着している場合は、スフェロイドはその接着面において平坦部を有してもよい。スフェロイドの大きさは特に限定されず、スフェロイドは、例えば、１０～１５００μｍ、１０～１０００μｍ、又は１０～８００μｍの直径を有してよい。ここで、スフェロイドの直径は、例えば、画像解析ソフト又は粒度分布計を用いて常法により測定される。

図１に、一実施形態に係る略球状のスフェロイドの模式的な断面図を示す。スフェロイド１０は、グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞と、を含むスフェロイドであり、幹細胞の凝集体１と、幹細胞の凝集体１中に形成された網状の血管構造３と、幹細胞の凝集体１の表面を覆うグリア細胞の層５とを含む。を含む。

グリア細胞の層５は、幹細胞の凝集体１の表面の少なくとも一部又は全体を覆う、連続的又は断続的な層である。グリア細胞の層５の厚みは特に限定されず、グリア細胞の層５は、細胞単層であっても細胞重層であってもよい。グリア細胞の一部は幹細胞の凝集体１中に存在していてもよく、また、グリア細胞の層５はスフェロイド１０の内部に向かって延在していてもよい。

スフェロイド１０に神経細胞が含まれる場合、神経細胞は、グリア細胞の有無にかかわらず、幹細胞とともに凝集体１を形成する。スフェロイド１０はグリア細胞を含むが、スフェロイド１０はグリア細胞を含まなくてもよく、その場合、グリア細胞の層５は形成されない。

一実施形態において、スフェロイドは、細胞接着性の細胞培養基材に接着されていてよい。細胞培養基材に接着されたスフェロイドには、スフェロイドを損傷することなく安全に運搬することができるという利点があり、また、スフェロイドを単離することなくスクリーニング又は各種評価に用いることが可能であるという利点もある。

細胞培養基材は細胞を接着できる基材であれば特に限定されず、公知の接着培養用の基材であってよく、より具体的には公知の接着培養用の培養容器であってよい。すなわち、基材の表面の一部又は全部は細胞接着性を有する。細胞接着性の表面とは、培養液中で細胞が該表面上に沈降したときに、該細胞がある一定の接着点で接着することのできる表面のことである。

より具体的には、基材は細胞接着性物質を含んでよい。細胞接着性物質は、例えば、タンパク質又は合成樹脂であってよい。タンパク質は、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、又はラミニンであってよい。合成樹脂は、例えば、フッ素樹脂、ポリイミド樹脂、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリジメチルシロキサン、又はこれらの混合物であってよい。合成樹脂は、好ましくはフッ素化ポリイミド樹脂である。フッ素化ポリイミド樹脂とは、いいかえれば含フッ素ポリイミド樹脂である。

フッ素化ポリイミド樹脂は、例えば、４，４’－ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）／１，４－ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）共重合体、６ＦＤＡ／１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＲ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’－オキシジフタル酸無水物（ＯＤＰＡ）／ＴＰＥＱ共重合体、４，４’－（４，４’－イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）／２，２－ビス［４－（４－アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）共重合体、６ＦＤＡ／２，２－ビス（４－（４－アミノフェノキシ）フェニル）プロパン（ＢＡＰＰ）共重合体、６ＦＤＡ／２，２’－ビス（トリフルオロメチル）ベンジジン（ＴＦＭＢ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル（ＢＡＰＢ）共重合体、又は６ＦＤＡ／２，２－ビス（４－（４－アミノフェノキシ）フェニル）スルホン（ＢＡＰＳ）共重合体であってよい。

フッ素化ポリイミド樹脂の重量平均分子量は、例えば、５０００～２００００００であり、好ましくは８０００～１００００００であり、より好ましくは２００００～５０００００である。なお、本明細書において、重量平均分子量は、下記手法により測定される。

（重量平均分子量の測定）
装置：ＨＣＬ－８２２０ＧＰＣ（東ソー株式会社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ－Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ_２Ｏ、リン酸入りＮ－メチルピロリドン）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ
測定方法：０．５質量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線に基づいて分子量を算出する。

一実施形態において、基材は、開口部を有する凹部を複数備えていてよい。凹部の底面は細胞接着性を有していてよく、より具体的には、凹部の底面は上記細胞接着性物質により構成されていてよい。

凹部の個数は特に限定されず、基材の１ｃｍ^２あたりの凹部の個数は、１個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、又は５０個以上であってよく、１０００個以下、５００個以下、３００個以下、２００個以下、又は１００個以下であってよい。本実施形態に係る基材における凹部の総数は、例えば、１個以上、１０個以上、１００個以上、１０００個以上、１００００個以上、又は５００００個以上であってよい。

凹部の開口部の形状は特に限定されず、例えば、円、多角形、又は楕円であってよい。開口部の口径は、例えば、２０００μｍ以下、１０～２０００μｍ、１０～１０００μｍ、１０～７００μｍ、１０～６００μｍ、又は１０～５００μｍであってよい。本明細書において、ある部位の口径とは、該部位に外接する円の直径、すなわち該部位の最大長さのことである。

凹部の底面の形状は特に限定されず、例えば、円、多角形、又は楕円であってよい。底面の形状は、開口部の形状と同一であっても異なってもよい。底面の口径は、開口部の口径と同一であっても異なってもよく、開口部の口径より小さくても大きくてもよい。底面の口径は、例えば、１０～２０００μｍ、１０～１０００μｍ、１０～７００μｍ、１０～６００μｍ、１０～５００μｍ、１０～４００μｍ、又は１０～３００μｍであってよい。凹部の底面は、平坦な面であってよく、平坦かつ平滑な面であってよい。

開口部と、それに隣接する開口部との間の距離、すなわち間隙の長さは、特に限定されない。間隙の長さは、例えば、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下、又は１００μｍ以下であってよい。

凹部の深さは特に限定されず、例えば、１００ｎｍ～５００ｎｍ、１０μｍ～１０００μｍ、又は１０μｍ～３００μｍであってよい。

本実施形態において、基材の全表面のうち凹部の底面以外の表面、すなわち凹部の内側面と基材の上面（凹部の辺縁部ともいえる）は細胞非接着性であってよい。細胞非接着性の表面とは、細胞が全く接着しないか、一時的に弱く接着しても自然に脱離する、表面のことである。より具体的には、基材の全表面のうち凹部の底面以外の表面は、細胞非接着性物質から構成されていてよい。

細胞非接着性物質は、細胞の表面に存在するタンパク質、糖鎖等の分子に結合しない物質であれば特に限定されない。細胞非接着性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール及びその誘導体、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）及びその誘導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）及びその誘導体等を含む化合物あるいはそれら化合物の重合体、セグメント化ポリウレタン（ＳＰＣ）及びその誘導体等を含む化合物、アルブミン等のタンパク質、細胞が接着しない糖鎖（アガロース、セルロース等）等を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。これらの物質は、１種又は２種以上を使用することができる。なかでも、細胞接着性部位との接着性、基材の製造工程の簡素化、培養によって得られる細胞の均一性向上等の観点から、ＭＰＣ及びその誘導体あるいはそれらの重合体が好ましく、より好ましくはＭＰＣポリマーが挙げられる。

別の実施形態において、基材は、細胞接着性表面と細胞非接着性表面とで形成された微細パターンを備える、細胞培養用シートであってよい。一例として、細胞培養用シートは、細胞接着性物質の層と、該層の表面に設けられた細胞非接着性物質のマスクとで形成された微細パターンを有してよい。微細パターンは、例えば凹部であってよい。この場合、凹部の深さは細胞非接着性物質のマスクの厚みに依存する。したがって、凹部の深さの下限は、細胞がマスクの非接着性を認識できる最小厚みである。凹部の深さは、例えば、１０μｍ未満であってよく、１００ｎｍ～５００ｎｍであってよい。凹部の個数、凹部の開口部及び底面の形状及び口径、並びに凹部間の距離は、上記実施形態と同様であってよい。

微細パターンの形成は、例えば、マイクロコンタクトプリンティング法、スピンコーティング法、キャスティング法、ロールコーティング法、ダイコーティング法、グラビアコーティング法、スプレイコーティング法、バーコーティング法、フレキソ印刷法、ディップコーティング法、インクジェット法、又はパターニング法により行ってもよい。パターニング法とは、ベース材表面に形成された凹凸構造の間隙に、該間隙に生じる毛細管力を利用して所望の物質を注入することにより、微細パターンを形成する方法である。

顕微鏡を用いてスフェロイドを観察する観点から、基材の厚みは、好ましくは４００μｍ以下であり、より好ましくは２００μｍ以下である。基材の面積は特に限定されず、例えば、０．０１～１００００ｃｍ^２又は０．０３～５０００ｃｍ^２であってよい。

本発明の一側面に係るスフェロイドの作製方法は、細胞接着性の細胞培養基材上で、神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程を備える。神経細胞とグリア細胞の両方を含むスフェロイドを作製する場合、上記共培養する工程では、神経細胞と、グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する。この方法により、本発明の上記側面に係るスフェロイドを作製することができる。細胞接着性の細胞培養基材及び各細胞の詳細は上述のとおりである。

神経細胞又はグリア細胞、幹細胞、及び血管内皮細胞のそれぞれは、共培養の開始時にスフェロイドを形成していない。すなわち、上記共培養する工程は、異なる細胞からなるスフェロイド同士を共培養することによって融合させる工程ではない。

共培養に用いる培地は、細胞の増殖に必要な成分を含む培地であればよく、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ－１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ等の基本培地に、必要に応じて、血清、成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類等の成分を添加して得られる培地であってよい。スフェロイドの内部に網状の血管構造を形成する観点から、培地は、好ましくは血管内皮細胞用培地を含む培地であり、より好ましくは神経幹細胞用培地又はアストロサイト用培地と、血管内皮細胞用培地との混合培地であり、さらに好ましくは神経幹細胞用培地と血管内皮細胞用培地との混合培地である。

血管内皮細胞用培地とは、血管内皮細胞の培養に適した組成を有する培地であって、典型的には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ－β）、ヘパリン等の成分を基本培地中に含む。血管内皮細胞用培地としては、例えば、ロンザ社製のＥＧＭ（登録商標）－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（カタログ番号：ＣＣ－３１６２）を用いて調製されるＥＧＭ（登録商標）－２培地等の市販品を用いることができる。ＥＧＭ（登録商標）－２培地には、ｈＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｒ３インスリン様成長因子１（Ｒ３ ＩＧＦ－１）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ－β、ヘパリン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びゲンタマイシン等の抗生物質が含まれる。

神経幹細胞用培地とは、神経幹細胞の培養に適した組成を有する培地であって、典型的には、ｈＥＧＦ、ｈＦＧＦ－β、神経生存因子－１（ＮＳＦ－１）等の成分を基本培地中に含む。神経幹細胞用培地としては、例えば、コージンバイオ社製のＫＢＭ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ等の市販品を用いることができる。ＫＢＭ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌには、コージンバイオ社製のＫＢＭ ＸＢ２を添加してもよい。

アストロサイト用培地とは、アストロサイトの培養に適した組成を有する培地であって、典型的には、ｈＥＧＦ、Ｌ－グルタミン酸、インスリン等の成分を基本培地中に含む。アストロサイト用培地としては、例えば、ロンザ社製のＡＧＭ（登録商標） ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（カタログ番号：ＣＣ－３１８６）を用いて調製されるＡＧＭ（登録商標） Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、サイエンセル社製のアストロサイト用培地（カタログ番号：１８０１）等の市販品を用いることができる。ＡＧＭ（登録商標） Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍには、ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン酸、インスリン、ｈＥＧＦ、アスコルビン酸、及びゲンタマイシン等の抗生物質が含まれる。

細胞の生存を維持し、かつ細胞を増殖させる観点から、共培養に用いる培地は、好ましくは血清を含む。また、スフェロイドの形成率を向上させる観点から、共培養に用いる培地はＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をさらに含むことが好ましい。培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、０．０１～５０μＭであってよく、具体的には、例えば０．０１～１μＭ又は５～５０μＭであってよい。

培養温度は特に限定されないが、通常は２５～４０℃程度である。培養時の相対湿度は特に限定されず、例えば、４０～９５％ＲＨであってよい。

培養の時間は特に限定されず、細胞の増殖速度と所望のスフェロイドの大きさに応じて、適宜決定することができる。培養の時間は、例えば、４時間～３０日（４時間～７２０時間）、１日～１４日（２４時間～３３６時間）、又は１日～７日（２４時間～１６８時間）であってよい。

幹細胞と血管内皮細胞の比は、例えば１：１～１０：１であってよく、具体的には、例えば、５：１～１０：１、２：１～３：１、又は１：１～２：１であってよい。血管内皮細胞と神経細胞の比は、例えば１：０．５～１：２０であってよく、具体的には、例えば、１：１０～１：２０、１：５～１：１０、又は１：０．５～１：３であってよい。血管内皮細胞とグリア細胞の比は、例えば１：０．５～１：３０であってよく、具体的には、例えば、１：２０～１：３０、１：１０～１：１５、又は１：５～１：１０であってよい。

細胞を培養する前に、細胞培養基材を脱泡することが好ましい。脱泡処理の方法は特に限定されず、霧吹き、ピペッティング、振盪、加温及び冷却、遠心処理、真空脱気、超音波処理等の一般的な方法を利用することができる。

＜ヒト神経細胞（ＮＨＮ）の準備＞
培養フラスコ（培養面積２５ｃｍ^２）にＡｌｐｈａＢｉｏＣｏａｔ（カタログ番号：ＡＣ００１、ニューロミクス社製）を２ｍＬ加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で３０分静置した後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で培養フラスコを２回洗浄して、フラスコ内の培養面をＡｌｐｈａＢｉｏＣｏａｔでコーティングした。ヒト神経細胞（脳由来；カタログ番号：ＮＨＣ００１、ニューロミクス社より購入）の凍結細胞を３７℃の恒温水槽で溶解させ、１０ｍＬの神経細胞専用培地（カタログ番号：ＨＮＭ００１、ニューロミクス社製）に加えた。この細胞懸濁液を上記培養フラスコに加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培地交換は２～３日に一度行った。培養後、培養フラスコから培地を除去して細胞剥離液アキュターゼ（登録商標）（プロモセル社製）を２ｍＬ添加し、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養フラスコを５分程度静置して細胞を剥離した。次いで、細胞剥離液をチューブに回収し、培養フラスコを８ｍＬの培地で洗浄して、該培地をチューブへ移した。５００×ｇで３分間遠心処理を施し、細胞を０．５ｍＬの神経幹細胞専用培地で懸濁させて、細胞数をカウントした。

＜ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）の準備＞
ヒトアストロサイト（カタログ番号：ＣＣ－２５６５、ロンザ社より購入）の凍結細胞を３７℃の恒温水槽で溶解させ、１５ｍＬのアストロサイト専用培地（カタログ番号：ＣＣ－３１８６、ロンザ社製、又はカタログ番号：１８０１、サイエンセル社製）に加えた。この細胞懸濁液を培養フラスコ（培養面積７５ｃｍ^２）に加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培地交換は２日に一度行った。培養後、培養フラスコから培地を除去して細胞剥離液アキュターゼ（登録商標）を５ｍＬ添加し、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養フラスコを５分程度静置して細胞を剥離した。次いで、細胞剥離液をチューブに回収し、培養フラスコを１０ｍＬの培地で洗浄して、該培地をチューブへ移した。２１０×ｇで５分間遠心処理を施し、細胞を１ｍＬの神経幹細胞専用培地又はアストロサイト専用培地で懸濁させて、細胞数をカウントした。

＜ヒト脂肪由来幹細胞（ＡｄＳＣ）の準備＞
ヒト脂肪由来幹細胞（カタログ番号：ＰＴ－５００６、ロンザ社より購入）の凍結細胞を３７℃の恒温水槽で溶解させ、５％ＦＢＳ及び１％抗生物質を含む９ｍＬの脂肪由来幹細胞専用培地（商品名：ＫＢＭ ＡＤＳＣ－１、コージンバイオ社製）に加えた。次いで、２１０×ｇで５分間の遠心処理を施した後、上清を除去して１ｍＬの脂肪由来幹細胞専用培地に細胞を分散させた。この細胞懸濁液１５ｍＬ（３．０×１０^５細胞）を培養フラスコ（培養面積７５ｃｍ^２）に加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培地交換は２日に一度行った。培養後、培養フラスコから培地を除去して細胞剥離液アキュターゼ（登録商標）を５ｍＬ添加し、室温で培養フラスコを５分程度静置して細胞を剥離した。次いで、細胞剥離液をチューブに回収し、培養フラスコを１０ｍＬの培地で洗浄して、該培地をチューブへ移した。２１０×ｇで５分間遠心処理を施し、アストロサイト専用培地又はＫＢＭ ＸＢ２（コージンバイオ社製）を含む神経幹細胞専用培地１ｍＬで細胞を懸濁させて、細胞数をカウントした。

＜ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＥＣ）の準備＞
培養フラスコ（培養面積７５ｃｍ^２）にＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ（登録商標）（商品番号：４Ｚ０－２１０、セルシステムズ社製）を５ｍＬ加え、直ちに吸引して、フラスコ内の培養面をＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒでコーティングした。ヒト脳毛細血管内皮細胞（商品番号：ＡＣＢＲＩ ３７６、セルシステムズ社から購入）の凍結細胞を３７℃の恒温水槽で溶解させ、１５ｍＬの血管内皮細胞専用培地（商品番号：４Ｚ０－５００－Ｒ、セルシステムズ社製）に加えた。この細胞懸濁液を上記培養フラスコに加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培地交換は２日に一度行った。培養後、培養フラスコから培地を除去して細胞剥離液アキュターゼ（登録商標）を５ｍＬ添加し、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養フラスコを２分程度静置して細胞を剥離した。次いで、細胞剥離液をチューブに回収し、培養フラスコを１０ｍＬの培地で洗浄して、該培地をチューブへ移した。２１０×ｇで５分間遠心処理を施し、アストロサイト専用培地又はＫＢＭ ＸＢ２を含む神経幹細胞専用培地０．５ｍＬで細胞を懸濁させて、細胞数をカウントした。

＜培養容器の準備＞
以下の実施例において、培養容器としては、直径約３００μｍの円状の開口部及び底面を有する穴（キャビティ）を４００個備える培養容器を用いた。かかる培養容器は６ＦＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体を底面に含み、底面以外はＭＰＣポリマーでコートされている。培養容器には、使用前に脱泡処理を行った。具体的には、培養容器に１ｍＬ程度のＰＢＳを加えてピペッティングを行い、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養容器を１５～３０分間静置した。次いで、再びピペッティングを行った後、ＰＢＳをアスピレーターで吸うことで脱泡を完了した。

＜スフェロイドの観察＞
以下の実施例において、得られたスフェロイドを次のようにして観察した。まず、スフェロイドを４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液で１５分処理して固定した。次いで、各細胞を蛍光染色した。ＮＨＮは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７色素で標識された抗ＭＡＰ２抗体（アブカム社製）で染色した。ＮＨＡは、抗グリア線維性酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体（アブカム社製）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８色素で標識された２次抗体（サーモフィッシャー社製）を用いて染色した。ＨＢＥＣは、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４色素で標識された２次抗体（サーモフィッシャー社製）を用いて染色した。核はＤＡＰＩで染色した。染色されたスフェロイドに透明化試薬ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ（登録商標）－Ｓ４（富士フイルム和光純薬株式会社製）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。透明化処理を行うことでスフェロイドの全体、すなわち底面から頂点までの観察が可能となった。透明化処理したスフェロイドを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

＜実施例１＞
培養容器に、２５０細胞／穴のＮＨＮ、７５０細胞／穴のＮＨＡ、２００細胞／穴のＡｄＳＣ、及び１００細胞／穴のＨＢＥＣを播種した。培養容器を安全キャビネット内で１５分静置した後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターに入れて４時間静置した。次いで、培養容器に神経幹細胞専用培地（ＫＢＭ ＸＢ２を添加したＫＢＭ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、いずれもコージンバイオ社製）及び血管内皮細胞専用培地（カタログ番号：ＣＣ－３１６２、ロンザ社製）を等量で混合して得られた混合培地（１％の血清を含む）を５ｍＬ加え、培養容器を再び３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーターに入れて３日間培養することで、スフェロイドを作製した。

スフェロイドの形成過程を図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。播種４時間後には一部の穴でスフェロイドが形成し始め（図２の（Ａ））、３日目には各穴にスフェロイドが形成していた（図２の（Ｂ））。播種３日後のスフェロイドの蛍光画像を図３の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図３の（Ａ）は、ＨＢＥＣの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像である。図３の（Ｂ）はスフェロイドの水平方向の断面画像を示し、細胞核（左上）、ＮＨＡ（中央上）、ＨＢＥＣ（右上）、及びＮＨＮ（左下）の其々の蛍光（白色）、並びにスフェロイドの明視野画像（中央下）示す。これらの画像が示すように、スフェロイド内に、ＨＢＥＣにより形成された管腔を有する網状の血管構造が形成されていた。また、ＮＨＡはスフェロイドの表面及び内部に存在していた。

スフェロイドの粒子径を、顕微鏡画像から画像解析ソフト（ＷｉｎＲＯＯＦ、三谷商事株式会社製）を用いて計測した。スフェロイドの粒子径は２０６±２９μｍであった（ｎ＝１００）。

＜実施例２＞
播種する細胞を１０００細胞／穴のＮＨＡ、２００細胞／穴のＡｄＳＣ、並びに１００又は２００細胞／穴のＨＢＥＣに変更し、混合培地の量を４ｍＬに変更した以外は、実施例１と同様にしてスフェロイドを作製した。

スフェロイドの形成過程を図４に示す。播種４時間後には一部の穴でスフェロイドが形成し始め、３日目には各穴にスフェロイドが形成していた。ＨＢＥＣの播種数が１００細胞／穴の場合の播種３日後のスフェロイドの蛍光画像を図５の（Ａ）及び（Ｂ）に示し、ＨＢＥＣの播種数が２００細胞／穴の場合の播種３日後のスフェロイドの蛍光画像を図６の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図５の（Ａ）及び図６の（Ａ）は、ＨＢＥＣの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像である。図５の（Ｂ）及び図６の（Ｂ）はスフェロイドの水平方向の断面画像を示し、細胞核（左上）、ＮＨＡ（右上）、及びＨＢＥＣ（左下）の其々の蛍光（白色）、並びにスフェロイドの明視野画像（右下）を示す。これらの画像が示すように、ＨＢＥＣの播種数によらず、スフェロイド内に、ＨＢＥＣにより形成された管腔を有する網状の血管構造が形成されていた。また、ＮＨＡはスフェロイドの表面を覆うように存在していた。

＜実施例３＞
混合培地にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、富士フィルム和光純薬社製）を終濃度で１０又は２０μＭ添加した以外は、実施例２と同様にしてスフェロイドを作製した。ＨＢＥＣの播種数は１００細胞／穴に調整した。

スフェロイドの形成過程を図７に示す。播種４時間後には一部の穴でスフェロイドが形成し始め、３日目には各穴にスフェロイドが形成していた。播種３日後のスフェロイド（ＲＯＣＫ阻害剤２０μＭを培地に添加したもの）の蛍光画像を図８の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図８の（Ａ）は、ＨＢＥＣの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像である。図８の（Ｂ）はスフェロイドの水平方向の断面画像を示し、細胞核（左上）、ＮＨＡ（右上）、及びＨＢＥＣ（左下）の其々の蛍光（白色）、並びにスフェロイドの明視野画像（右下）を示す。これらの画像が示すように、スフェロイド内に、ＨＢＥＣにより形成された管腔を有する網状の血管構造が形成されていた。また、ＮＨＡはスフェロイドの表面を覆うように存在していた。一部のＮＨＡはスフェロイド内部にも存在していた。

下式に従いスフェロイド形成率を算出した。
スフェロイド形成率（％）＝｛スフェロイドの数（個）｝／｛穴の合計数（個）｝×１００
スフェロイド形成率は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１０μＭのときは９９％であり、２０μＭのときは８４％であった。比較として、培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加せず同様の実験を行ったところ、スフェロイドの形成率は７４％であった。神経幹細胞専用培地と血管内皮細胞専用培地との混合培地には１％含まれるが、該培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加することで、細胞の過剰な運動が抑制されて、スフェロイドの形成率が向上することがわかった。

＜実施例４＞
混合培地にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、富士フィルム和光純薬社製）を終濃度で１０又は２０μＭ添加した以外は、実施例１と同様にしてスフェロイドを作製し、実施例３と同様にしてスフェロイド形成率を算出した。ＨＢＥＣの播種数は１００細胞／穴に調整した。

スフェロイドの形成過程を図９に示す。播種４時間後には一部の穴でスフェロイドが形成し始め、３日目には各穴にスフェロイドが形成していた。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度によらず、いずれの条件でもスフェロイドが形成された。播種３日後のスフェロイドの蛍光画像を図１０（ＲＯＣＫ阻害剤１０μＭ）、図１１（ＲＯＣＫ阻害剤２０μＭ）の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図１０、図１１の（Ａ）は、ＨＢＥＣの蛍光画像のｚ－スタックを横から見た画像である。図１０、図１１の（Ｂ）はスフェロイドの水平方向の断面画像を示し、細胞核（左上）、ＮＨＡ（上中央）、ＨＢＥＣ（右上）、及びＮＨＮ（左下）の其々の蛍光（白色）、並びにスフェロイドの明視野画像（中央下）を示す。これらの画像が示すように、スフェロイド内に、ＨＢＥＣにより形成された管腔を有する網状の血管構造が形成されていた。また、ＮＨＡは一部スフェロイドの表面を覆うように存在していた。一部のＮＨＡはスフェロイド内部にも存在していた。ＮＨＮはスフェロイドの表面近傍、及び内部に存在していた。スフェロイド形成率は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１０μＭのときは９５％であり、２０μＭのときは９２％であった。比較として、培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加せず同様の実験を行ったところ、スフェロイドの形成率は７５％であった。実施例３の細胞と併せて神経細胞を用いた場合も、培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加することで、細胞の過剰な運動が抑制されてスフェロイドの形成率が向上することがわかった。

１・・・幹細胞の凝集体、３・・・網状の血管構造、５・・・グリア細胞の層、１０・・・スフェロイド。

Claims (10)

1. 神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを含み、且つ
   前記血管内皮細胞の集合が網状の血管構造を形成している、スフェロイド。
2. グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを含み、
   該グリア細胞はスフェロイド表面の少なくとも一部を覆っている、請求項１に記載のスフェロイド。
3. グリア細胞がアストロサイトである、請求項２に記載のスフェロイド。
4. 血管内皮細胞が脳微小血管内皮細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載のスフェロイド。
5. 幹細胞が脂肪由来幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載のスフェロイド。
6. 細胞接着性の細胞培養基材上で、神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程を備え、
   神経細胞又はグリア細胞、幹細胞、及び血管内皮細胞のそれぞれは、共培養の開始時にスフェロイドを形成していない、請求項１～５のいずれか一項に記載のスフェロイドを作製する方法。
7. 神経細胞又はグリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程が、グリア細胞と、幹細胞と、血管内皮細胞とを共培養する工程である、請求項６に記載の方法。
8. 共培養を、神経幹細胞用培地と血管内皮細胞用培地との混合培地中で行う、請求項６又は７に記載の方法。
9. 共培養を、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む培地中で行う、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 細胞接着性の細胞培養基材が、フッ素化ポリイミド樹脂を含む細胞培養基材である、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。