JP7765002B2

JP7765002B2 - Microarray kit, target detection method using microarray

Info

Publication number: JP7765002B2
Application number: JP2021111911A
Authority: JP
Inventors: 有希華竹口; 光芳大場; 稔也津田; 俊昭湯尻
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd; Yamaguchi University NUC
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd; Yamaguchi University NUC
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2025-11-06
Anticipated expiration: 2041-07-06
Also published as: JP2023008385A; WO2023282179A1

Description

本発明は、検出目的のターゲット核酸を検出する検出プローブ及び非ターゲット核酸を検出する検出プローブを備えるマイクロアレイを含むマイクロアレイキットに関し、また、当該マイクロアレイを用いたターゲット核酸の検出方法に関する。 The present invention relates to a microarray kit including a microarray equipped with detection probes for detecting target nucleic acids and detection probes for detecting non-target nucleic acids, and also to a method for detecting target nucleic acids using the microarray.

臨床医療、食品、環境等の様々な分野においてマイクロアレイを用いたターゲット核酸の検出が行われている。中でも、一塩基多型（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）は、疾患に対する罹患リスクや、薬剤に関する薬効の個人差に関連するため、マイクロアレイを用いて優れた感度及び特異度で多型を検出することが求められている。 Target nucleic acids are being detected using microarrays in a variety of fields, including clinical medicine, food, and the environment. In particular, single nucleotide polymorphisms (SNPs) are associated with disease risk and individual differences in drug efficacy, so there is a demand for microarrays to detect polymorphisms with excellent sensitivity and specificity.

例えば、特許文献１には、ターゲット核酸の検出に使用する核酸プローブを固定した検出スポットと、２種以上の核酸プローブを固定した基準スポットを有するマイクロアレイが開示されている。特許文献１に開示されたマイクロアレイや検出方法によれば、マイクロアレイの劣化や、核酸増幅反応等の検出手順の不良を基準スポットのシグナルに基づいて検出することができる。 For example, Patent Document 1 discloses a microarray having detection spots on which nucleic acid probes used to detect target nucleic acids are immobilized, and reference spots on which two or more types of nucleic acid probes are immobilized. The microarray and detection method disclosed in Patent Document 1 make it possible to detect deterioration of the microarray and defects in detection procedures such as nucleic acid amplification reactions based on the signal from the reference spots.

また、マイクロアレイの検出原理であるターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、測定対象のターゲット核酸を正確に検出するには、核酸プローブがターゲット核酸を正確に認識することが重要である。よって従来、ハイブリダイゼーションを行う際は、反応液の塩濃度や反応温度を適宜調節する方法や、核酸プローブと測定対象以外の核酸分子との非特異的なハイブリダイズを抑制するブロッキング剤を使用する方法が用いられている。ブロッキング剤としては、例えば、サケ精子ＤＮＡや酵母ｔＲＮＡなどの測定対象の核酸分子や核酸プローブに対して、相補的な塩基配列を有しない核酸成分、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎラウロイルサルコシン（Ｎ－ＬＳ）などの界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどのタンパク質が知られている。 Furthermore, in the hybridization between target nucleic acids and nucleic acid probes, which is the detection principle of microarrays, accurately detecting the target nucleic acid to be measured requires that the nucleic acid probe accurately recognize the target nucleic acid. Therefore, conventional hybridization methods involve appropriately adjusting the salt concentration and reaction temperature of the reaction solution, or using a blocking agent to suppress nonspecific hybridization between the nucleic acid probe and nucleic acid molecules other than those to be measured. Known blocking agents include, for example, nucleic acid components that do not have a complementary base sequence to the nucleic acid molecules or nucleic acid probes to be measured, such as salmon sperm DNA and yeast tRNA; surfactants such as SDS (sodium dodecyl sulfate) and N-lauroyl sarcosine (N-LS); and proteins such as bovine serum albumin (BSA) and casein.

特許文献２には、遺伝子多型における検出対象アレルを含むターゲット核酸と当該検出対象アレル以外のアレルを含む非ターゲット核酸と含むバッファー組成物に、非ターゲット核酸に特異的にハイブリダイズするブロッキング核酸を混合することで、ターゲット核酸を高精度に検出する方法が開示されている。 Patent Document 2 discloses a method for detecting a target nucleic acid with high accuracy by mixing a blocking nucleic acid that specifically hybridizes to the non-target nucleic acid with a buffer composition containing a target nucleic acid containing a target allele of a genetic polymorphism to be detected and a non-target nucleic acid containing an allele other than the target allele.

また、特許文献３には、核酸プローブによりターゲット核酸を検出するに際して、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の両方にハイブリダイズする共通プローブを使用する方法が開示されている。この共通プローブは、ターゲット核酸と非ターゲット核酸とに共通して存在する領域に相補的な塩基配列からなるヌクレオチドである。すなわち、共通プローブは、増幅核酸反応によりターゲット核酸と非ターゲット核酸とを同時に増幅する場合、反応液にターゲット核酸が存在するか、存在しないかに拘わらず当該増幅核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特許文献３に開示された方法では、野生型に対応する非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度を、共通プローブ由来のシグナル強度で割った値を用いて、変異の有無を判定している。特許文献３に開示された方法では、上記値を使用することで、野生型以外に複数の変異が存在しうる場合に、変異の有無を精度良く判定することができる。 Patent Document 3 also discloses a method for detecting a target nucleic acid using a nucleic acid probe, in which a common probe that hybridizes to both the target nucleic acid and non-target nucleic acid is used. This common probe is a nucleotide consisting of a base sequence complementary to a region present in both the target nucleic acid and non-target nucleic acid. In other words, when the target nucleic acid and non-target nucleic acid are simultaneously amplified by an amplification nucleic acid reaction, the common probe specifically hybridizes to the amplified nucleic acid, regardless of whether the target nucleic acid is present in the reaction solution. The method disclosed in Patent Document 3 determines the presence or absence of a mutation using a value obtained by dividing the signal intensity from a nucleic acid probe that detects a non-target nucleic acid corresponding to the wild type by the signal intensity from the common probe. By using this value, the method disclosed in Patent Document 3 can accurately determine the presence or absence of a mutation when multiple mutations other than the wild type may exist.

特許第５６０７３７３号Patent No. 5607373 特許第６６４４２９７号Patent No. 6644297 ＷＯ２０１９／００４３３４WO2019/004334

従来の技術においてブロッキング核酸を使用する場合、非ターゲット核酸に比べてターゲット核酸の存在量が僅かであっても高精度にターゲット核酸を検出すできる利点がある。しかしながら、非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度は、ブロッキング核酸を使用しない系と比較して低下する。非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナルは、例えば、ターゲット核酸の判定に利用したり、また、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたかを判定する際に利用することができる。 The use of blocking nucleic acids in conventional technology has the advantage of enabling highly accurate detection of target nucleic acids even when the amount of target nucleic acid present is small compared to non-target nucleic acids. However, the signal intensity from the nucleic acid probe detecting non-target nucleic acids is lower than in systems that do not use blocking nucleic acids. The signal from the nucleic acid probe detecting non-target nucleic acids can be used, for example, to determine the presence of the target nucleic acid or to determine whether the amplification reactions of the target nucleic acid and non-target nucleic acids have been carried out normally.

そこで、本発明は、このような実情に鑑み、非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度がブロッキング核酸の存在によって低下した場合であっても判定可能なマイクロアレイを含むマイクロアレイキット、及びターゲット核酸の検出方法を提供することを目的とする。 In light of these circumstances, the present invention aims to provide a microarray kit including a microarray that can make a determination even when the signal intensity from a nucleic acid probe detecting a non-target nucleic acid is reduced by the presence of a blocking nucleic acid, and a method for detecting a target nucleic acid.

上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＭＹＤ８８遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブと、を備えるマイクロアレイと、上記ＭＹＤ８８遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ブロッキング核酸を含むバッファーとを備えるマイクロアレイキット。 The present invention, which has achieved the above-mentioned objects, includes the following.
(1) A microarray kit comprising: a probe for detecting a target nucleic acid of the MYD88 gene, the probe having a base sequence complementary to a region containing a target base of a target nucleic acid containing, as a base to be detected, a genetic mutation in the MYD88 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia as the base to be detected; and a probe for detecting a non-target nucleic acid of the MYD88 gene, the probe having a sequence complementary to a region containing a non-target base of a non-target nucleic acid containing, as a non-target base, a wild-type corresponding to the genetic mutation of the MYD88 gene; and a buffer containing a blocking nucleic acid for the MYD88 gene, the blocking nucleic acid having a base sequence complementary to a region containing a non-target base of the non-target nucleic acid of the MYD88 gene.

（２）上記マイクロアレイは、上記ＭＹＤ８８遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする（１）記載のマイクロアレイキット。 (2) The microarray kit according to (1), wherein the microarray further comprises a common probe for the MYD88 gene having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid of the MYD88 gene, the common region not overlapping with the region containing the non-target base.

（３）上記マイクロアレイは、ＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＣＸＣＲ４遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブとをさらに備え、上記バッファーは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ブロッキング核酸をさらに含むことを特徴とする（１）記載のマイクロアレイキット。 (3) The microarray kit according to (1), wherein the microarray further comprises: a target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene, the target nucleic acid containing, as a target base, a genetic mutation in the CXCR4 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia; and a non-target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene, the non-target nucleic acid containing, as a non-target base, a wild-type corresponding to the genetic mutation in the CXCR4 gene, the non-target base; and the buffer further comprises a blocking nucleic acid for the CXCR4 gene, the buffer having a base sequence complementary to a region containing the non-target base in the non-target nucleic acid of the CXCR4 gene.

（４）上記マイクロアレイは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする（３）記載のマイクロアレイキット。 (4) The microarray kit according to (3), wherein the microarray further comprises a common probe for the CXCR4 gene having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid of the CXCR4 gene, the common region not overlapping with the region containing the non-target base.

（５）検出対象塩基を含むターゲット核酸と前記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸との増幅反応後の反応液と；前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーとを準備する工程と、上記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用プローブと、上記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用プローブと、上記ターゲット核酸及び上記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを備えるマイクロアレイに対して、上記反応液及び上記ハイブリダイゼーション用バッファーを接触させる工程と、上記マイクロアレイにおける上記共通プローブからのシグナル強度が閾値を超える場合に上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたと判断する工程とを含む、ターゲット核酸の検出方法。 (5) A method for detecting a target nucleic acid, comprising the steps of: preparing a reaction solution resulting from an amplification reaction between a target nucleic acid containing a target base and a non-target nucleic acid containing a non-target base corresponding to the target base; and preparing a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid having a base sequence complementary to a region containing the non-target base in the non-target nucleic acid; contacting the reaction solution and the hybridization buffer with a microarray comprising: a target nucleic acid detection probe having a sequence complementary to a region containing the target base in the target nucleic acid; a non-target nucleic acid detection probe having a sequence complementary to a region containing the non-target base in the non-target nucleic acid; and a common probe having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid that does not overlap with the region containing the non-target base; and determining that the amplification reaction of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid has been performed normally if the signal intensity from the common probe on the microarray exceeds a threshold value.

（６）上記判断する工程の後、上記ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度、上記非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度に基づいてターゲット核酸の有無を判定することを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。 (6) The method for detecting a target nucleic acid according to (5), characterized in that after the determining step, the presence or absence of the target nucleic acid is determined based on the signal intensity from the target nucleic acid detection probe and the signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe.

（７）[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]／（[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]＋[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]）の値を算出し、当該値が閾値を超える場合にターゲット核酸が存在すると判定することを特徴とする（６）記載のターゲット核酸の検出方法。 (7) A method for detecting a target nucleic acid according to (6), characterized in that the value of [signal intensity from the target nucleic acid detection probe]/([signal intensity from the target nucleic acid detection probe]+[signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe]) is calculated, and if this value exceeds a threshold value, it is determined that the target nucleic acid is present.

（８）上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応は、鋳型核酸量がコピー数として1.79×10⁵～1.43×10⁶copiesであることを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。 (8) The method for detecting a target nucleic acid according to (5), wherein the amplification reaction of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid has a copy number of 1.79×10 ⁵ to 1.43×10 ⁶ copies of the template nucleic acid.

（９）上記ターゲット核酸に含まれる検出対象塩基は、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異及び/又はＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異であることを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。 (9) The method for detecting a target nucleic acid according to (5), wherein the base to be detected contained in the target nucleic acid is a genetic mutation in the MYD88 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia and/or a genetic mutation in the CXCR4 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia.

本発明に係るマイクロアレイキットは、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を正確に判定できる。 The microarray kit of the present invention can accurately determine genetic mutations in the MYD88 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia.

また、本発明に係るターゲット核酸の検出方法によれば、ブロッキング核酸の存在下で非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルが低かったとしても、共通プローブからのシグナル強度に基づいて、ターゲット核酸と非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたかを正確に判断できる。 Furthermore, according to the target nucleic acid detection method of the present invention, even if the signal from the non-target nucleic acid detection probe is low in the presence of a blocking nucleic acid, it is possible to accurately determine whether the amplification reaction of the target nucleic acid and non-target nucleic acid was carried out normally based on the signal intensity from the common probe.

野生型プローブの長さを変更したときの分離度を比較した結果を示す特性図である。FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of comparing the resolution when the length of the wild-type probe is changed. 共通プローブからの蛍光強度を測定した結果であり、（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果を示す特性図である。1A and 1B are characteristic diagrams showing the results of measuring the fluorescence intensity from the common probe, in which (a) shows the results measured in the presence of a blocking nucleic acid, and (b) shows the results measured in the absence of a blocking nucleic acid. 野生型プローブからの蛍光強度を測定した結果であり、（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果を示す特性図である。1A and 1B are characteristic diagrams showing the results of measuring the fluorescence intensity from a wild-type probe, in which (a) shows the results measured in the presence of a blocking nucleic acid, and (b) shows the results measured in the absence of a blocking nucleic acid. ブロッキング核酸の存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を示す特性図である。FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of calculating the resolution for each gene mutation in the presence of a blocking nucleic acid. ブロッキング核酸の非存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を示す特性図である。FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of calculating the resolution for each gene mutation in the absence of a blocking nucleic acid.

以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るターゲット核酸の検出方法は、検出対象塩基を含むターゲット核酸と当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とを増幅反応により増幅し、反応液に含まれるターゲット核酸にハイブリダイズするターゲット核酸検出用プローブと非ターゲット核酸にハイブリダイズする非ターゲット核酸検出用プローブとを備えるマイクロアレイで検出する方法である。また、本発明に係るマイクロアレイは、検出対象塩基を含むターゲット核酸と当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とを増幅反応により増幅して得られる反応液に含まれるターゲット核酸を検出するためのターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸を検出するための非ターゲット核酸検出用プローブを備えるものである。 The present invention will be described in detail below. The target nucleic acid detection method of the present invention involves amplifying a target nucleic acid containing a target base and a non-target nucleic acid containing a non-target base corresponding to the target base through an amplification reaction, and detecting the target nucleic acid and the non-target nucleic acid using a microarray equipped with a target nucleic acid detection probe that hybridizes to the target nucleic acid contained in a reaction solution and a non-target nucleic acid detection probe that hybridizes to the non-target nucleic acid. The microarray of the present invention also includes a target nucleic acid detection probe for detecting the target nucleic acid and a non-target nucleic acid detection probe for detecting the non-target nucleic acid contained in a reaction solution obtained by amplifying a target nucleic acid containing a target base and a non-target nucleic acid containing a non-target base corresponding to the target base through an amplification reaction.

特に、本方法では、核酸増幅反応で得られた反応液と、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーとを上記マイクロアレイに接触させる。このとき、反応液とハイブリダイゼーション用バッファーとは予め混合しておき、得られた混合液を上記マイクロアレイに接触させても良いし、反応液とハイブリダイゼーション用バッファーとをそれぞれ上記マイクロアレイに接触させても良い。このハイブリダイゼーション用バッファーを使用することで、非ターゲット核酸の一部をブロッキング核酸とハイブリダイズさせることで、当該非ターゲット核酸がターゲット核酸検出用プローブに対して非特異的にハイブリダイズすることを防ぐことができる。 In particular, in this method, the microarray is contacted with a reaction solution obtained from a nucleic acid amplification reaction and a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid that includes a base sequence complementary to a region containing a non-target base in the non-target nucleic acid. The reaction solution and hybridization buffer may be mixed in advance, and the resulting mixture may be contacted with the microarray, or the reaction solution and hybridization buffer may be contacted separately with the microarray. By using this hybridization buffer, a portion of the non-target nucleic acid is hybridized with the blocking nucleic acid, thereby preventing the non-target nucleic acid from nonspecifically hybridizing to the target nucleic acid detection probe.

特に、本方法に使用するマイクロアレイは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブを備えている。共通領域とは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する塩基配列の領域であって、非ターゲット核酸における上述したブロッキング核酸がハイブリダイズする領域と重複しない領域である。すなわち、共通領域は、ターゲット核酸検出用プローブがハイブリダイズする領域とも、非ターゲット核酸検出用プローブがハイブリダイズする領域とも重複しない領域である。このように規定した共通プローブは、ターゲット核酸における共通領域にハイブリダイズできるとともに、ブロッキング核酸の存在下であっても非ターゲット核酸における共通領域にハイブリダイズすることができる。 In particular, the microarray used in this method is equipped with a common probe having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid. The common region is a region of base sequence common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid, and does not overlap with the region in the non-target nucleic acid to which the above-mentioned blocking nucleic acid hybridizes. In other words, the common region is a region that does not overlap with the region to which the target nucleic acid detection probe hybridizes or the region to which the non-target nucleic acid detection probe hybridizes. The common probe defined in this way can hybridize to the common region in the target nucleic acid, and can also hybridize to the common region in the non-target nucleic acid even in the presence of the blocking nucleic acid.

ここで、ターゲット核酸とは、検出対象塩基を含む核酸分子、すなわち核酸断片を意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＲＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＤＮＡとＲＮＡとを含む核酸分子（ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体）でもよい。また、核酸としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、並びに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工核酸を含む意味である。 Here, the term "target nucleic acid" refers to a nucleic acid molecule containing the base to be detected, i.e., a nucleic acid fragment. The target nucleic acid may be a nucleic acid molecule made of DNA, a nucleic acid molecule made of RNA, or a nucleic acid molecule containing DNA and RNA (DNA-RNA complex). The term "nucleic acid" also refers to adenine, cytosine, guanine, thymine, and uracil, as well as artificial nucleic acids such as peptide nucleic acid (PNA) and locked nucleic acid (LNA).

検出対象塩基とは、例えば染色体の所定の位置における１又は複数の核酸残基を意味しており、特に限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）等の塩基配列における特定の塩基の種類を意味している。例えば、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、いずれか一方の塩基、すなわち当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすることができる。ここで、検出対象塩基としては、遺伝子多型におけるメジャーアレル及びマイナーアレルのいずれでも良いし、リスクアレルであってもなくても良い。 The target base refers to, for example, one or more nucleic acid residues at a specific position in a chromosome, and is not particularly limited to, a specific type of base in a base sequence such as a single nucleotide polymorphism (SNP). For example, if a specific single nucleotide polymorphism can be A (adenine) or C (cytosine), either of the bases, i.e., A (adenine) in the single nucleotide polymorphism, can be used as the target base. Here, the target base may be either a major allele or a minor allele in a genetic polymorphism, and may or may not be a risk allele.

検出対象塩基を含むターゲット核酸は、検出対象塩基を含む所定の領域を核酸増幅法により増幅することで調整することができる。また、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞採取から採取した転写産物から逆転写反応により得られるｃＤＮＡとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば６０～１０００塩基とすることができ、６０～５００塩基とすることが好ましく、６０～２００塩基とすることがより好ましい。 A target nucleic acid containing the target base can be prepared by amplifying a predetermined region containing the target base using a nucleic acid amplification method. Alternatively, the target nucleic acid may be cDNA obtained by reverse transcription from a transcription product collected from an individual organism, tissue, or cell. The base length of the target nucleic acid is not particularly limited, but can be, for example, 60 to 1,000 bases, preferably 60 to 500 bases, and more preferably 60 to 200 bases.

なお、検出対象塩基を含むターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む核酸分子（核酸断片）を非ターゲット核酸と称する。例えば、染色体における所定の位置で取りうる複数の塩基のうち、１つの塩基を検出対象塩基とした場合、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基とする。より具体的に、所定の位置における一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうる場合、当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすると、当該一塩基多型におけるＣ（シトシン）が非検出対象塩基ということになる。 For a target nucleic acid containing a target base, a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) containing a non-target base corresponding to the target base is referred to as a non-target nucleic acid. For example, if one of the multiple bases possible at a given position in a chromosome is the target base, bases other than the target base are non-target bases. More specifically, if a single nucleotide polymorphism at a given position can be A (adenine) or C (cytosine), and A (adenine) in the single nucleotide polymorphism is the target base, then C (cytosine) in the single nucleotide polymorphism is the non-target base.

非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸は、染色体上に非検出対象塩基が存在する場合、上述のように検出対象塩基を含むターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。 When non-target bases are present on a chromosome, non-target nucleic acids containing non-target bases are simultaneously obtained when target nucleic acids containing target bases are obtained as described above. For example, when target nucleic acids are obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction, if one allele contains a non-target base, the non-target nucleic acids will be amplified along with the target nucleic acid.

ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を核酸増幅により取得するには、先ず、被検者由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、検出対象塩基又は非検出対象塩基を含む領域を増幅する工程とを含む一連の核酸増幅方法が適用できる。 To obtain target and non-target nucleic acids by nucleic acid amplification, a series of nucleic acid amplification methods can be applied, including the steps of first extracting genomic DNA from a sample derived from a subject, and then using the extracted genomic DNA as a template to amplify regions containing target or non-target bases.

被検者は通常ヒトであり、詳細を実施例に示すようなリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症が疑われる患者、その他、癌など遺伝子多型を検査することで診断可能な疾患に罹患した患者を挙げることができる。なお、健常者を被検者としてもよい。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織又は臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。 The subject is typically a human, and examples include patients suspected of having lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia, as detailed in the Examples, and patients suffering from diseases such as cancer that can be diagnosed by testing for genetic polymorphisms. Healthy individuals may also be used as subjects. There are no particular limitations on the sample derived from the subject. Examples include blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph, feces, cancer cells, tissue or organ fragments, and extracts.

被検者から採取した試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、ＣＴＡＢなどを用いたＤＮＡ抽出法を用いることができる。 The extraction method for extracting genomic DNA from a sample collected from a subject is not particularly limited. For example, DNA extraction methods using phenol/chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB, etc. can be used.

次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅されたターゲット核酸及び非ターゲット核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。 Next, an amplification reaction is carried out using the obtained genomic DNA as a template to amplify the target nucleic acid and non-target nucleic acid. Examples of applicable amplification reactions include polymerase chain reaction (PCR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN). In the amplification reaction, it is desirable to add a label so that the target nucleic acid and non-target nucleic acid can be distinguished after amplification. The method for labeling the amplified target nucleic acid and non-target nucleic acid is not particularly limited. For example, a method in which the primers used in the amplification reaction are pre-labeled may be used, or a method in which labeled nucleotides are used as substrates in the amplification reaction may be used. Labeling substances are not particularly limited, but include radioisotopes, fluorescent dyes, and organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin.

またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の塩基配列に基づいて設計された一対のプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。 This reaction system also contains a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling, a heat-stable DNA polymerase, a pair of primers designed based on the base sequences of the target nucleic acid and non-target nucleic acid, labeled nucleotide triphosphates (specifically, nucleotide triphosphates labeled with a fluorescent label, etc.), nucleotide triphosphates, magnesium chloride, etc.

一方、ハイブリダイゼーション用バッファーに含まれるブロッキング核酸は、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するように設計される。よって、ブロッキング核酸は、ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域にハイブリダイズすることができる。ブロッキング核酸としては、特に限定されないが、ターゲット核酸検出用プローブの塩基長に対して６０％以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング核酸は、ターゲット核酸検出用プローブの塩基長よりも短い長さであることが好ましい。例えばターゲット核酸検出用プローブの長さが２５塩基長とすると、ブロッキング核酸の塩基長は１５～２４塩基長であることが好ましい。 On the other hand, the blocking nucleic acid contained in the hybridization buffer is designed to have a base sequence complementary to a region containing non-target bases in the non-target nucleic acid. Therefore, the blocking nucleic acid can hybridize to a region containing non-target bases in the non-target nucleic acid under conditions that allow hybridization between the target nucleic acid and the target nucleic acid detection probe. The blocking nucleic acid is not particularly limited, but preferably has a length that is 60% or more of the base length of the target nucleic acid detection probe. Furthermore, the blocking nucleic acid is preferably shorter than the base length of the target nucleic acid detection probe. For example, if the target nucleic acid detection probe is 25 bases long, the blocking nucleic acid is preferably 15 to 24 bases long.

また、ブロッキング核酸において、非検出対象塩基に相補的な塩基は、ブロッキング核酸を構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなるブロッキング核酸については５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。 In addition, in a blocking nucleic acid, the base complementary to the non-target base is preferably located at the center of a character string when the bases constituting the blocking nucleic acid are viewed as a character string. Note that the center of the character string includes cases where the base is shifted by one base toward the 5' end or 3' end for blocking nucleic acids consisting of an even number of bases.

さらに、ブロッキング核酸は、非ターゲット核酸に含まれる非検出対象塩基以外の塩基に対応する位置にミスマッチな塩基（相補的でない塩基）を含んでいても良い。ブロッキング核酸が１５塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。また、ブロッキング核酸が２４塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。 Furthermore, the blocking nucleic acid may contain mismatched bases (non-complementary bases) at positions corresponding to bases other than the non-target bases to be detected contained in the non-target nucleic acid. When the blocking nucleic acid is 15 bases long, the number of mismatched bases can be 1 to 3, preferably 1 to 2. When the blocking nucleic acid is 24 bases long, the number of mismatched bases can be 1 to 3, preferably 1 to 2.

さらにまた、ハイブリダイゼーション用バッファーにおいて、ブロッキング核酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、非ターゲット核酸の濃度及び/又はターゲット核酸の濃度に応じて適宜設定することができる。具体的にブロッキング核酸の組成物中の濃度は、０．０１～１μＭとすることができ、０．０５～０．７５μＭとすることが好ましく、０．１２５～０．５μＭとすることがより好ましい。 Furthermore, the concentration of the blocking nucleic acid in the hybridization buffer is not particularly limited, but can be set appropriately depending on, for example, the concentration of the non-target nucleic acid and/or the concentration of the target nucleic acid. Specifically, the concentration of the blocking nucleic acid in the composition can be 0.01 to 1 μM, preferably 0.05 to 0.75 μM, and more preferably 0.125 to 0.5 μM.

なお、所定のターゲット核酸に対して複数の非ターゲット核酸が存在する場合、全ての非ターゲット核酸についてそれぞれブロッキング核酸を準備しても良いし、一部の非ターゲット核酸についてブロッキング核酸を準備しても良い。 When multiple non-target nucleic acids exist for a given target nucleic acid, blocking nucleic acids may be prepared for all of the non-target nucleic acids, or blocking nucleic acids may be prepared for some of the non-target nucleic acids.

また、ブロッキング核酸は、より好ましくは一本鎖ＤＮＡであり、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。 More preferably, the blocking nucleic acid is single-stranded DNA, which can be chemically synthesized, for example, using a nucleic acid synthesizer. Examples of nucleic acid synthesizers that can be used include DNA synthesizers, fully automated nucleic acid synthesizers, and automated nucleic acid synthesizers.

以上のように構成されたハイブリダイゼーション用バッファーは、ブロッキング核酸を含むため、非ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、ハイブリダイゼーション用バッファーを使用することによって、例えばターゲット核酸が低濃度であるような場合であっても、ターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。また、ブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーを使用することによって、例えば、ターゲット核酸に対して一塩基のみが相違する非ターゲット核酸が存在する場合であっても、ターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。 The hybridization buffer configured as described above contains a blocking nucleic acid, which can suppress nonspecific hybridization between non-target nucleic acids and target nucleic acid detection probes, preventing inhibition of specific hybridization between the target nucleic acid and target nucleic acid detection probes. Therefore, by using a hybridization buffer, the target nucleic acid can be detected with high accuracy using the target nucleic acid detection probe, even when the target nucleic acid is present at a low concentration, for example. Furthermore, by using a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid, the target nucleic acid can be detected with high accuracy using the target nucleic acid detection probe, even when a non-target nucleic acid that differs from the target nucleic acid by only a single base is present.

以下、ターゲット核酸を検出する際に使用されるマイクロアレイについて説明する。マイクロアレイは、担体（基板、中空繊維、微粒子を含む）にターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸検出用プローブ及び共通プローブを固定し、固定化したターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を検出（定性、定量を含む）するものである。 The following describes microarrays used to detect target nucleic acids. Microarrays have target nucleic acid detection probes, non-target nucleic acid detection probes, and common probes immobilized on a carrier (including substrates, hollow fibers, and microparticles), and the immobilized target nucleic acid detection probes are used to detect (both qualitatively and quantitatively) target nucleic acids.

マイクロアレイにおける担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。 Materials for the carrier in the microarray can be any known material in the art and are not particularly limited. Examples include precious metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten, and their compounds, as well as conductive materials such as carbon, represented by graphite and carbon fiber; silicon materials, represented by single crystal silicon, amorphous silicon, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride, and composite materials of these silicon materials, represented by SOI (silicon-on-insulator); inorganic materials, such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, forsterite, and photosensitive glass; polyethylene, ethylene, and polypropylene. Examples of suitable carriers include organic materials such as cyclic polyolefins, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyesters, fluorine-containing resins, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resins, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resins, polycarbonate, polyamides, phenolic resins, urea resins, epoxy resins, melamine resins, styrene-acrylonitrile copolymers, acrylonitrile-butadiene styrene copolymers, polyphenylene oxide, and polysulfone. The shape of the carrier is not particularly limited, but a flat plate shape is preferred.

なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：ＤｉａｍｏｎｄＬｉｋｅＣａｒｂｏｎ）等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。 The carrier preferably has a carbon layer such as diamond-like carbon (DLC) on its surface, and chemically modified groups such as amino groups, carboxyl groups, epoxy groups, formyl groups, hydroxyl groups, and active ester groups. Carriers having a carbon layer and chemically modified groups on their surface include those having a carbon layer and chemically modified groups on the surface of a substrate, and those having chemically modified groups on the surface of a substrate made of a carbon layer. Materials known in the art can be used for the substrate, and there are no particular restrictions, and the same materials as those listed above as carrier materials can be used.

上述したターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸検出用プローブ及び共通プローブは、その５’末端を直接担体に固定しても良いし、リンカーを介して担体に固定してもよい。 The 5' ends of the above-mentioned target nucleic acid detection probe, non-target nucleic acid detection probe, and common probe may be immobilized directly to a support, or may be immobilized to a support via a linker.

ターゲット核酸検出用プローブは、検出対象塩基を含むターゲット核酸における当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するものとして設計される。ターゲット核酸検出用プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、ターゲット核酸検出用プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなるターゲット核酸検出用プローブについては５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。 The target nucleic acid detection probe is designed to have a base sequence complementary to a region containing the target base in the target nucleic acid. The target nucleic acid detection probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 25 bases long. Furthermore, when the bases constituting the target nucleic acid detection probe are viewed as a character string, the base complementary to the target base is preferably located at the center of the character string. Note that the center of the character string includes cases where the base is shifted by one base toward the 5' or 3' end for target nucleic acid detection probes consisting of an even number of bases.

同様に、非ターゲット核酸検出用プローブは、非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸を検出するものであって、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するものとして設計される。非ターゲット核酸検出用プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、非検出対象塩基に相補的な塩基は、非ターゲット核酸検出用プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる非ターゲット核酸検出用プローブについては５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。 Similarly, a non-target nucleic acid detection probe is used to detect non-target nucleic acids containing non-target bases, and is designed to have a base sequence complementary to at least a region of the non-target nucleic acid containing the non-target base. The non-target nucleic acid detection probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 25 bases long. Furthermore, when the bases constituting the non-target nucleic acid detection probe are viewed as a character string, the base complementary to the non-target base is preferably located at the center of the character string. Note that, for non-target nucleic acid detection probes consisting of an even number of bases, the center of the character string includes cases where the base is shifted by one base toward the 5' end or 3' end.

特に、本方法に使用するマイクロアレイは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブを備えている。共通プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。 In particular, the microarray used in this method is equipped with a common probe having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid. The common probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 25 bases long.

本発明に係るターゲット核酸の検出方法では、上述したブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーを上記マイクロアレイに接触させる。ここで、先ず、共通プローブからのシグナルに基づいて、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたかを判断する。具体的には、共通プローブからのシグナルが所定の値（閾値）を超える場合には、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたと判断する。上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたと判断した後は、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいてターゲット核酸が存在するか否かを判断することができる。 In the target nucleic acid detection method of the present invention, a hybridization buffer containing the above-mentioned blocking nucleic acid is brought into contact with the microarray. First, it is determined whether the above-mentioned series of nucleic acid amplification methods was performed normally based on the signal from the common probe. Specifically, if the signal from the common probe exceeds a predetermined value (threshold), it is determined that the above-mentioned series of nucleic acid amplification methods was performed normally. After it is determined that the above-mentioned series of nucleic acid amplification methods was performed normally, it is possible to determine whether or not the target nucleic acid is present based on the signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe.

仮に、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたかを共通プローブではなく、非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルで判断する場合、十分なシグナルが得られずに、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたか正確に判断できない場合がある。例えば、鋳型となるゲノムＤＮＡ量が少ない場合や、ブロッキング核酸が存在する場合には、非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルが十分に得られない。 If the normality of the above-described series of nucleic acid amplification methods is determined based on the signal from the non-target nucleic acid detection probe rather than the common probe, a sufficient signal may not be obtained, making it impossible to accurately determine whether the above-described series of nucleic acid amplification methods was performed normally. For example, if the amount of genomic DNA used as a template is small or if a blocking nucleic acid is present, a sufficient signal may not be obtained from the non-target nucleic acid detection probe.

本発明に係る方法では、ターゲット核酸と、ブロッキング核酸がハイブリダイズした非ターゲット核酸とがともにハイブリダイズできる共通プローブからのシグナルを利用するため、鋳型となるゲノムＤＮＡ量が少ない場合やブロッキング核酸が存在する場合であっても、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたか正確に判断することができる。 The method of the present invention utilizes signals from a common probe that can hybridize with both the target nucleic acid and the non-target nucleic acid hybridized with a blocking nucleic acid. Therefore, even when the amount of genomic DNA used as a template is small or when a blocking nucleic acid is present, it is possible to accurately determine whether the above-described series of nucleic acid amplification methods was performed correctly.

このように、上述した一連の核酸増幅反応が正常に行われたと判断した後、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応後の反応液にターゲット核酸が存在するかを判断することができる。このとき、上述した本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファーを使用することで、ブロッキング核酸によって非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。 In this way, after determining that the above-described series of nucleic acid amplification reactions have been carried out normally, it is possible to determine whether target nucleic acid is present in the reaction solution after the amplification reaction based on the signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe. By using the hybridization buffer according to the present invention described above, non-specific hybridization between non-target nucleic acids and nucleic acid probes can be suppressed by the blocking nucleic acid.

ここで、ハイブリダイゼーション用バッファーを用いたハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、ハイブリダイゼーション用バッファーには、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばSSCや、公知のブロッキング剤、例えばSDSが含まれていても良い。なお、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。 Here, hybridization reactions using a hybridization buffer are preferably performed under stringent conditions. Stringent conditions refer to conditions under which specific hybrids are formed and nonspecific hybrids are not formed. For example, these conditions include a 16-hour hybridization reaction at 50°C, followed by washing in 2xSSC/0.2% SDS at 25°C for 10 minutes and 2xSSC at 25°C for 5 minutes. Specifically, the hybridization buffer may contain salts necessary for the hybridization reaction, such as SSC, or known blocking agents, such as SDS. Note that if the probe strand length is short, a lower hybridization temperature is preferred; if the probe strand length is long, a higher hybridization temperature is preferred. Needless to say, a higher salt concentration increases the specific hybridization temperature, and a lower salt concentration decreases the specific hybridization temperature.

また、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液とその他の組成物（ブロッキング核酸等）を予め混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズを行った後、反応液をマイクロアレイに接触させて、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸と共通プローブとのハイブリダイズ、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイズ、非ターゲット核酸と非ターゲット核酸検出用プローブとのハイブリダイズを進行させても良い。或いは、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液とその他の組成物（ブロッキング核酸等）とをマイクロアレイ上にて混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズ、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸と共通プローブとのハイブリダイズ、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイズ、非ターゲット核酸と非ターゲット核酸検出用プローブとのハイブリダイズを同時に進行させても良い。 Alternatively, a reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid after the amplification reaction may be mixed with other compositions (such as a blocking nucleic acid) in advance to allow specific hybridization between the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid, and then the reaction solution may be contacted with a microarray to allow hybridization between the target nucleic acid and non-target nucleic acid and a common probe, hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe, and hybridization between the non-target nucleic acid and the probe for detecting the non-target nucleic acid to proceed. Alternatively, a reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid after the amplification reaction may be mixed with other compositions (such as a blocking nucleic acid) on a microarray to allow specific hybridization between the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid, hybridization between the target nucleic acid and non-target nucleic acid and the common probe, hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe, and hybridization between the non-target nucleic acid and the probe for detecting the non-target nucleic acid to proceed simultaneously.

例えば、標識として蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて各プローブからの蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。 For example, if fluorescent labels are used as labels, the fluorescent signal from each probe can be detected using a fluorescent scanner, and the signal intensity can be quantified by analyzing it using image analysis software.

ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいてターゲット核酸が存在するか否かを判断する場合、具体的には、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度])を使用する方法が挙げられる。 When determining whether or not a target nucleic acid is present based on signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe, the signal intensities of the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe are measured, and a judgment value for evaluating the signal intensity from the target nucleic acid detection probe is calculated. An example of how to calculate the judgment value is to use the formula: [signal intensity from the target nucleic acid detection probe]/([signal intensity from the target nucleic acid detection probe]+[signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe]).

判定値を算出する式としては、この他に、[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]も知られているが、ターゲット核酸が所定の遺伝子変異であり、非ターゲット核酸がその遺伝子変異に対応する野生型である場合には、上述した式：[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度])を使用する方が、変異の検出感度が高く、好ましい。 Another known formula for calculating the judgement value is [signal intensity from the target nucleic acid detection probe]/[signal intensity from the common probe]. However, when the target nucleic acid is a specific genetic mutation and the non-target nucleic acids are the wild type corresponding to that genetic mutation, it is preferable to use the above-mentioned formula: [signal intensity from the target nucleic acid detection probe]/([signal intensity from the target nucleic acid detection probe]+[signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe]), as this provides higher sensitivity for detecting mutations.

そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸にターゲット核酸が含まれると判断し、判定値が閾値を下回る場合には増幅核酸にターゲット核酸が含まれないと判断する。このように判定値を利用することで、被検者における上述したＳＮＰ等の検出対象塩基の有無（遺伝子変異の有無、疾患に関連するマイナーアレルの有無等）を判定することができる。 Then, the determination value calculated by the above formula is compared with a predetermined threshold (cutoff value), and if the determination value exceeds the threshold, it is determined that the amplified nucleic acid contains the target nucleic acid, and if the determination value is below the threshold, it is determined that the amplified nucleic acid does not contain the target nucleic acid. By using the determination value in this way, it is possible to determine the presence or absence of the target base, such as the SNP described above, in the subject (presence or absence of a genetic mutation, presence or absence of a minor allele associated with a disease, etc.).

ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、上述した各遺伝子変異等の検出対象塩基を有しないことが確定している検体、すなわちターゲット核酸が増幅されない検体を用いて上記式により算出された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、各遺伝子変異等の検出対象塩基を有しないことが確定している複数の検体を用いて複数の判定値を算出し、その平均値＋３σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる。なお、平均値＋２σや平均値＋σの値を閾値とすることもできる。 The threshold value here is not particularly limited, but can be determined, for example, based on a judgment value calculated using the above formula using a sample that has been confirmed to not contain the target base of each of the above-mentioned gene mutations, etc., i.e., a sample in which the target nucleic acid is not amplified. More specifically, multiple judgment values can be calculated using multiple samples that have been confirmed to not contain the target base of each of the gene mutations, etc., and the average value + 3σ (σ: standard deviation) can be used as the threshold. Note that the average value + 2σ or the average value + σ can also be used as the threshold.

上述したように、ブロッキング核酸、共通プローブを用いたターゲット核酸の検出方法では、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を増幅する際に使用する鋳型のゲノムＤＮＡ量が少ない場合であっても、増幅反応が正常に行われたかを正確に判断でき、且つ、ターゲット核酸の存在を正確に検出できる。ここで、鋳型なるゲノムＤＮＡ量は、特に限定さないが、例えば、１００～８００ｆｇといった量であっても核酸増幅反応の成否を正確に判断することができる。 As described above, the method for detecting target nucleic acids using blocking nucleic acids and common probes makes it possible to accurately determine whether the amplification reaction was successful and accurately detect the presence of target nucleic acids, even when the amount of genomic DNA used as a template when amplifying target and non-target nucleic acids is small. Here, the amount of genomic DNA used as a template is not particularly limited, but even when the amount is, for example, 100 to 800 fg, it is possible to accurately determine the success or failure of the nucleic acid amplification reaction.

特に、本発明に係る方法は、リンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関する確定診断に用いるデータを取得する態様に適用できる。例えば、ＩｇＭ型Ｍ蛋白血症を有するＢ細胞リンパ腫患者が状態悪化（Ｍ蛋白増加傾向等）した際に、ＭＹＤ８８遺伝子における所定の一塩基多型を検出する際、また治療薬としてイブルチニブの効果予測するためにＣＸＣＲ４遺伝子における所定の一塩基多型を検出する際に適用することができる。なお、リンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関しては、参考文献（ＮＣＣＮＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ（ＮＣＣＮＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）、ＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍＭａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ／ＬｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃＬｙｍｐｈｏｍａ、Ｖｅｒｓｉｏｎ１．２０２１－Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１，２０２０）に詳述されている。 In particular, the method of the present invention can be applied to obtaining data used for a definitive diagnosis of lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia. For example, the method can be applied to detecting a specific single nucleotide polymorphism in the MYD88 gene when a B-cell lymphoma patient with IgM M-proteinemia shows a worsening condition (e.g., a tendency for M-protein to increase), or to detecting a specific single nucleotide polymorphism in the CXCR4 gene to predict the effectiveness of ibrutinib as a therapeutic agent. For more information on lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia, please see the reference (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines), Waldenstrom Macroglobulinemia/Lymphoplasmacytic Lymphoma, Version 1.2021 - September 1, 2020).

より具体的には、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異として、Ｌ２６５Ｐ等のアミノ酸置換変異をコードする遺伝子変異を挙げることができる。また、ＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異として、Ｓ３３８Ｘ、Ｒ３３４Ｘ等のアミノ酸置換変異をコードする遺伝子変異を挙げることができる。 More specifically, genetic mutations in the MYD88 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia include genetic mutations encoding amino acid substitution mutations such as L265P. Furthermore, genetic mutations in the CXCR4 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia include genetic mutations encoding amino acid substitution mutations such as S338X and R334X.

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be explained in more detail below using examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.

〔実施例１〕
本実施例では、IgM型M蛋白血症を有するB細胞リンパ腫患者が状態悪化（M蛋白増加傾向等）した際に、WM/LPL患者の確定診断、診療補助として有効なMYD88とCXCR4遺伝子の解析を行った。表１にMYD88/CXCR4の対象検査変異を示した。また解析対象箇所を増幅するためのプライマーセットを表２に示した。 Example 1
In this example, when a B-cell lymphoma patient with IgM M-proteinemia showed a worsening condition (e.g., an increase in M-protein), we analyzed the MYD88 and CXCR4 genes, which are useful for definitively diagnosing and aiding in the treatment of WM/LPL patients. Table 1 shows the target mutations in MYD88/CXCR4. Table 2 also shows the primer sets used to amplify the target regions.

なお、表２に示したプライマーMYD_F、IC5-MYD_R、CXCR_F及びIC5-CXCR_Rの塩基配列をそれぞれ配列番号１～４とした。 The base sequences of primers MYD_F, IC5-MYD_R, CXCR_F, and IC5-CXCR_R shown in Table 2 are SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively.

以下のように調整したDNAサンプルを用いて、MYD88及びCXCR4の2つの対象領域をそれぞれPCRにて増幅した。 The two target regions of MYD88 and CXCR4 were amplified by PCR using DNA samples prepared as follows:

PCRの温度条件は表４に示すように設定した。 The PCR temperature conditions were set as shown in Table 4.

そして、予め準備したMYD88/CXCR4解析チップ（WMチップ）を用いてハイブリダイズ反応を行った。調整したハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）、PCR産物を冷凍庫から取り出し、常温に戻した。ハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）は表５に示したブロッキング核酸を添加した。ブロッキング核酸は、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるように、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計した。 Then, a hybridization reaction was carried out using a previously prepared MYD88/CXCR4 analysis chip (WM chip). The adjusted hybridization buffer (2.25x SSC, 0.23% SDS) and PCR product were removed from the freezer and returned to room temperature. The blocking nucleic acids shown in Table 5 were added to the hybridization buffer (2.25x SSC, 0.23% SDS). The blocking nucleic acids were added to suppress nonspecific hybridization of the mutation detection probe, ensuring sufficient detection sensitivity even when the mutation rate of the target gene is low, and were designed to hybridize specifically with the wild-type amplification product.

ここでICHIhybは、後述する表８に示した位置プローブ（ICHI）とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。ICHIhybと位置プローブ（ICHI）とのハイブリダイズに基づいて、マイクロアレイの劣化の有無や、マイクロアレイ上のプローブの位置を示すことができる。ICHIhybは、検出対象変異とは無関係の配列からなり、ブロッキング核酸とともにハイブリダイズ緩衝液に添加される。なお、表５に示したブロッキング核酸MYD_B、CXCR_1012B、CXCR_1000B、CXCR_952B及びICHIhybの塩基配列を配列番号５～９とした。PCR産物30μlとハイブリダイズ緩衝液15μlを混合し、自動化検出装置(HySHOT HT-32又はBIOSHOT HT-32、東洋鋼鈑株式会社製)にセットした。洗浄液（0.1×SSC/0.1%SDS溶液）、リンス液及び検出液（1×SSC）を調製し、装置の取り扱い説明書に従い、混合液、洗浄液、リンス液をBIOHSHOTにセットした。その後、蛍光強度推定法により測定した。装置の試験条件を表６に示した。 Here, ICHIhyb is an oligonucleotide that hybridizes with the positional probe (ICHI) shown in Table 8 below. Based on the hybridization between ICHIhyb and the positional probe (ICHI), the presence or absence of microarray degradation and the position of the probe on the microarray can be indicated. ICHIhyb consists of a sequence unrelated to the target mutation and is added to the hybridization buffer along with a blocking nucleic acid. The base sequences of the blocking nucleic acids MYD_B, CXCR_1012B, CXCR_1000B, CXCR_952B, and ICHIhyb shown in Table 5 are designated SEQ ID NOS: 5 to 9. Thirty microliters of PCR product was mixed with 15 μl of hybridization buffer and placed in an automated detection device (HySHOT HT-32 or BIOSHOT HT-32, manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.). A cleaning solution (0.1x SSC/0.1% SDS solution), rinse solution, and detection solution (1x SSC) were prepared, and the mixed solution, cleaning solution, and rinse solution were loaded into the BIOHSHOT according to the instrument's instruction manual. Measurements were then taken using the fluorescence intensity estimation method. The instrument test conditions are shown in Table 6.

[実験１]
本実験１では、野生型のプローブ長に対する判定値及び分離度について評価を行った。
・試験条件
MYD88の変異に対応する変異プローブとこれに対する野生型プローブを表７に示した。 [Experiment 1]
In this experiment 1, the judgement value and resolution for the wild-type probe length were evaluated.
Test conditions
The mutant probes corresponding to the MYD88 mutations and the corresponding wild-type probes are shown in Table 7.

なお、表７に示したプローブMYD_W1、MYD_W2及びMYD_M01の塩基配列をそれぞれ配列番号１０～１２とした。 The base sequences of probes MYD_W1, MYD_W2, and MYD_M01 shown in Table 7 are SEQ ID NOs: 10 to 12, respectively.

各プローブの蛍光強度から強度比である判定値を下記式から算出した。
判定値＝変異型プローブの強度/（野生型プローブの強度＋変異型プローブの強度） The judged value, which is the intensity ratio of the fluorescence intensity of each probe, was calculated using the following formula.
Judgment value = mutant probe intensity/(wild-type probe intensity + mutant probe intensity)

・結果
図１に示すようにW1/M1と比較して、MYD88の塩基長を短くTmが低くなったW2/M1のプローブ組み合わせの方が分離度(変異5%判定値-野生型判定値)は大きくなった。これは野生型プローブを短くすることで、PCR産物がプローブに結合する特異性が高まったものだと考えられる。よって、判定性能を高めるためには、プローブ長を短くすることは有効であることが示唆された。 Results: As shown in Figure 1, compared to W1/M1, the probe combination W2/M1, which has a shorter MYD88 base length and a lower Tm, had a higher resolution (mutation 5% judgement value - wild-type judgement value). This is thought to be because shortening the wild-type probe increased the specificity of the PCR product binding to the probe. This suggests that shortening the probe length is effective in improving judgement performance.

[実験２]
本実験２では、共通プローブを用いたときの最少DNA量を検討した。遺伝子検査キット(WMチップ)の対象検体は、骨髄及びホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded; FFPE）標本が想定されている。一般的にFFPE標本は、固定化処理時の薬品の影響でDNAの断片化が起こりやすく、増幅可能なDNA量が低下することが知られている。そのためWMチップを使用する場合、判定可能なDNA量を改善する、すなわちより少量のDNAで判定できることが非常に重要である。 [Experiment 2]
In Experiment 2, we investigated the minimum amount of DNA required when using a common probe. The target specimens for the genetic testing kit (WM chip) are bone marrow and formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) specimens. FFPE specimens are generally known to be prone to DNA fragmentation due to the effects of chemicals used during the fixation process, reducing the amount of DNA that can be amplified. Therefore, when using the WM chip, it is extremely important to improve the amount of DNA that can be determined, i.e., to enable determination with a smaller amount of DNA.

一方で、WMチップを使用する場合、野生型ターゲットに相補的な配列を持つブロッキング核酸を用いている。ブロッキング核酸は、変異型プローブに非特異的にハイブリダイズする野生型ターゲットにハイブリダイズすることで、野生型ターゲットが変異型プローブにハイブリダイズすることを防いでいる。これにより、より少量の変異型ターゲットの検出感度を高めることができる。 On the other hand, when using a WM chip, a blocking nucleic acid with a sequence complementary to the wild-type target is used. The blocking nucleic acid hybridizes to the wild-type target, which hybridizes nonspecifically to the mutant probe, thereby preventing the wild-type target from hybridizing to the mutant probe. This increases the detection sensitivity for smaller amounts of mutant target.

しかし、ブロッキング核酸を使用した場合には、野生型プローブと特異的に反応する野生型ターゲットの量を低下させるという問題があった。野生型ターゲット及び変異型ターゲットを増幅する増幅反応が正常に行われたかを野生型プローブの蛍光強度に基づいて判断する場合、ブロッキング核酸により野生型プローブにハイブリダイズ可能な野生型ターゲットが少なくなるため、充分な蛍光量が得られず、判定不能（増幅不能）となる問題を抱えていた。 However, the use of blocking nucleic acids poses the problem of reducing the amount of wild-type target that specifically reacts with the wild-type probe. When determining whether the amplification reaction for amplifying the wild-type target and mutant target has proceeded normally based on the fluorescence intensity of the wild-type probe, the blocking nucleic acid reduces the amount of wild-type target that can hybridize to the wild-type probe, resulting in insufficient fluorescence and making it impossible to determine (amplification not possible).

本実施例では、ブロッキング核酸の存在下であっても野生型ターゲットと変異型ターゲットにハイブリダイズできる共通プローブを設計した。この共通プローブからは、対象の変異有無に関係なく産物量（野生型ターゲットと変異型ターゲットの合計量）に依存して蛍光強度が検出される。そのため共通プローブからのシグナルを増幅の指標として用いることで、野生型プローブでは蛍光強度の基準に満たさなかった検体でも、判定が可能となり最少DNA検出量が改善できると考えられた。 In this example, we designed a common probe that can hybridize to both wild-type and mutant targets even in the presence of blocking nucleic acid. Fluorescence intensity detected from this common probe depends on the amount of product (total amount of wild-type and mutant targets), regardless of whether the target mutation is present or not. Therefore, by using the signal from the common probe as an indicator of amplification, it is possible to make a judgment even for samples that do not meet the fluorescence intensity criteria with the wild-type probe, and it is thought that the minimum amount of DNA detected can be improved.

・試験条件
変異型ターゲットに対応する変異型プローブ、野生型ターゲットに対応する野生型プローブ、共通プローブの各配列を表８に示した。 Test conditions The sequences of the mutant probes corresponding to the mutant targets, the wild-type probes corresponding to the wild-type targets, and the common probes are shown in Table 8.

なお、表８に示したプローブMYD88_W、MYD88_M、CXCR4_952_W、CXCR4_952_M、CXCR4_1000_W、CXCR4_1000_M、CXCR4_1012_W、CXCR4_1012_M1、CXCR4_1012_M2、CXCR4_1012_M3、MYD_C、CXCR4_C及びICHIの塩基配列をそれぞれ配列番号１３～２５とした。 The base sequences of probes MYD88_W, MYD88_M, CXCR4_952_W, CXCR4_952_M, CXCR4_1000_W, CXCR4_1000_M, CXCR4_1012_W, CXCR4_1012_M1, CXCR4_1012_M2, CXCR4_1012_M3, MYD_C, CXCR4_C, and ICHI shown in Table 8 are set as SEQ ID NOs: 13 to 25, respectively.

検査対象の変異部位が含まれる野生型、変異型の人工遺伝子3200fgを鋳型とし、PCRにて増幅した。その後、PCR増幅産物をTEで希釈し、鋳型量が10～3200fgとなるサンプルを調製した。試験は蛍光強度と分離度を比較した。判断基準として、当該検査システムでの安定的な解析のために必要な蛍光強度は1000に設定した。また野生型ターゲットと変異ターゲット（５％）が十分に判定可能かどうかの指標を分離度が0.25以上になることと設定した。試験条件を表９に示した。なお、表９に示すように、試験条件1は、ブロッキング核酸が存在する条件であって野生型、変異型及び共通プローブの評価である。 3200 fg of wild-type and mutant artificial genes containing the mutation site to be tested were used as templates and amplified by PCR. The PCR amplified products were then diluted with TE to prepare samples with template amounts ranging from 10 to 3200 fg. The test compared fluorescence intensity and resolution. As a criterion, the fluorescence intensity required for stable analysis in this test system was set to 1000. A resolution of 0.25 or greater was set as an indicator of whether the wild-type target and mutant target (5%) could be sufficiently distinguished. The test conditions are shown in Table 9. As shown in Table 9, test condition 1 was a condition in which a blocking nucleic acid was present, and the wild-type, mutant, and common probe were evaluated.

・試験結果
ブロッキング核酸の存在下で各プローブからの蛍光強度を評価した結果を表１０に示し、ブロッキング核酸の非存在下で各プローブからの蛍光強度を評価した結果を表１１に示した。蛍光強度が1000以上になった条件を〇、それ以外を×とした。なお、共通プローブからの蛍光強度を測定した結果を図２に示した。図２（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、図２（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果である。また、野生型プローブからの蛍光強度を測定した結果を図３に示した。図３（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、図３（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果である。 Test Results Table 10 shows the results of evaluating the fluorescence intensity from each probe in the presence of a blocking nucleic acid, and Table 11 shows the results of evaluating the fluorescence intensity from each probe in the absence of a blocking nucleic acid. Conditions under which the fluorescence intensity was 1000 or higher were marked with an ◯, and all other conditions were marked with an ×. The results of measuring the fluorescence intensity from the common probe are shown in Figure 2. Figure 2(a) shows the results measured in the presence of a blocking nucleic acid, and Figure 2(b) shows the results measured in the absence of a blocking nucleic acid. Figure 3 shows the results of measuring the fluorescence intensity from the wild-type probe. Figure 3(a) shows the results measured in the presence of a blocking nucleic acid, and Figure 3(b) shows the results measured in the absence of a blocking nucleic acid.

表１０に示したように、ブロッキング核酸の存在下では、共通プローブは鋳型DNA100fg以上で蛍光強度が検出、野生型プローブは鋳型DNA800fg以上の条件で全てのプローブで蛍光強度を検出した。一方、表１１に示したように、ブロッキング核酸の非存在下の場合、鋳型DNA200fg以上で共通プローブ、野生型プローブ共に蛍光強度が検出できた。 As shown in Table 10, in the presence of blocking nucleic acid, fluorescence intensity was detected for the common probe at 100 fg or more of template DNA, while fluorescence intensity was detected for all wild-type probes at 800 fg or more of template DNA. On the other hand, as shown in Table 11, in the absence of blocking nucleic acid, fluorescence intensity was detectable for both the common probe and the wild-type probe at 200 fg or more of template DNA.

また、ブロッキング核酸の存在下で分離度を評価した結果を表１２に示し、ブロッキング核酸の非存在下で分離度を評価した結果を表１３に示した。分離度が0.25以上になった条件を〇、それ以外を×とした。なお、ブロッキング核酸の存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を図４に示し、ブロッキング核酸の非存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を図５に示した。 The results of evaluating the degree of resolution in the presence of blocking nucleic acid are shown in Table 12, and the results of evaluating the degree of resolution in the absence of blocking nucleic acid are shown in Table 13. Conditions where the degree of resolution was 0.25 or higher were marked with an ◯, and all other conditions were marked with an ×. The results of calculating the degree of resolution for each gene mutation in the presence of blocking nucleic acid are shown in Figure 4, and the results of calculating the degree of resolution for each gene mutation in the absence of blocking nucleic acid are shown in Figure 5.

表１２に示したように、ブロッキング核酸の存在下では、鋳型100fg以上で分離度が0.25以上になった。一方、表１３に示したように、ブロッキング核酸の非存在下では、全ての条件で分離度が0.25未満になった。この結果から、高感度に変異を検出するには、ブロッキング核酸が必須であることが示された。 As shown in Table 12, in the presence of blocking nucleic acid, the resolution was 0.25 or higher when the template was 100 fg or more. On the other hand, as shown in Table 13, in the absence of blocking nucleic acid, the resolution was less than 0.25 under all conditions. These results demonstrate that blocking nucleic acid is essential for highly sensitive mutation detection.

以上の結果を表９の試験条件１～４について整理し、各蛍光強度と分離度を評価した試験結果を表１４に示した。なお、表１４には、蛍光強度が1000以上かつ分離度が0.25以上になった条件:〇、それ以外は×を示した。 The above results were compiled for test conditions 1 to 4 in Table 9, and the test results evaluating each fluorescence intensity and resolution are shown in Table 14. In Table 14, conditions where the fluorescence intensity was 1000 or more and the resolution was 0.25 or more are marked with a circle, and all other conditions are marked with an ×.

本実施例の結果から、ブロッキング核酸の存在下では、DNA鋳型量100fg以上であれば判定十分な分離度を確認できた。しかし、試験条件２の野生型プローブでの蛍光強度検出限界はDNA鋳型量800fgであった。このことから、野生型プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応の成否を決定する従来の方法では100～800fgの検体では蛍光強度が不足するため判定不能となっていた。これに対して、試験条件１のように、共通プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応の成否を決定することで、DNAが低濃度でも増幅を確認でき変異を検出できることが確認できた。 The results of this example confirmed that, in the presence of blocking nucleic acid, sufficient resolution was achieved for determination when the DNA template amount was 100 fg or more. However, the fluorescence intensity detection limit for the wild-type probe under test condition 2 was 800 fg of DNA template. This means that conventional methods that determine the success or failure of the amplification reaction based on the signal from the wild-type probe are unable to determine the success or failure of the amplification reaction in samples between 100 and 800 fg due to insufficient fluorescence intensity. In contrast, by determining the success or failure of the amplification reaction based on the signal from the common probe, as in test condition 1, it was confirmed that amplification can be confirmed and mutations can be detected even at low DNA concentrations.

ここで、試験に使用した人工遺伝子の分子量をもとにDNA鋳型量の単位を重量からコピー数に換算すると、100fg＝1.79×10⁵copies、800fg＝1.43×10⁶copies、である。したがって試験条件１においては少なくとも検体が1.79×10⁵copiesあれば検出が可能であるといえる。また1.43×10⁶copiesを下回ると野生型プローブは蛍光強度が不足することから、共通プローブの有用性が示されたといえる。 Here, if we convert the unit of DNA template amount from weight to copy number based on the molecular weight of the artificial gene used in the test, 100 fg = 1.79 x ¹⁰ copies, and 800 fg = 1.43 x ¹⁰ copies. Therefore, under test condition 1, detection is possible if the sample contains at least 1.79 x ¹⁰ copies. Furthermore, the fluorescence intensity of the wild-type probe is insufficient below 1.43 x ¹⁰ copies, demonstrating the usefulness of the common probe.

Claims

a microarray comprising: a target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene, which has a base sequence complementary to a region containing a target nucleic acid containing a genetic mutation in the MYD88 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia as a detection target base ; a non-target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene, which has a sequence complementary to a region containing a non-target base containing a wild-type corresponding to the genetic mutation in the MYD88 gene as a non-target base; and a common probe for the MYD88 gene, which has a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid of the MYD88 gene, which does not overlap with the region containing the non-target base ;
a buffer containing a blocking nucleic acid for the MYD88 gene , the blocking nucleic acid having a base sequence complementary to a region containing a non-target base in the non-target nucleic acid of the MYD88 gene,
the probe for detecting a target nucleic acid for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 14,
the non-target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and/or 13,
the common probe for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 23,
The blocking nucleic acid for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
The microarray kit .

the microarray further comprises: a target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene, which has a base sequence complementary to a region including a target base of a target nucleic acid containing, as a base to be detected, a genetic mutation in the CXCR4 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia; a non-target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene , which has a sequence complementary to a region including a non-target base of a non-target nucleic acid containing, as a non-target base , a wild-type corresponding to the genetic mutation in the CXCR4 gene; and a common probe for the CXCR4 gene, which has a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and non-target nucleic acid of the CXCR4 gene, which does not overlap with the region including the non-target base ;
the buffer further comprises a blocking nucleic acid for the CXCR4 gene, the blocking nucleic acid having a base sequence complementary to a region including a non-target base in the non -target nucleic acid of the CXCR4 gene;
the probe for detecting a target nucleic acid for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 18, and 20 to 22;
the non-target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15, 17, and 19;
the common probe for the CXCR4 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 24,
The blocking nucleic acid for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 to 8.
The microarray kit according to claim 1 .

preparing a reaction solution obtained after an amplification reaction between a target nucleic acid containing a target base that is a genetic mutation in the MYD88 gene and/or CXCR4 gene associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia and a non-target nucleic acid containing a wild-type non-target base that corresponds to the target base; and a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid that contains a base sequence complementary to a region containing the non-target base in the non-target nucleic acid;
contacting the reaction solution and the hybridization buffer with a microarray comprising: a target nucleic acid detection probe having a sequence complementary to a region containing a base to be detected in the target nucleic acid; a non-target nucleic acid detection probe having a sequence complementary to a region containing a base to be detected in the non-target nucleic acid; and a common probe having a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non -target nucleic acid, the common region not overlapping with the region containing the base to be detected;
determining that the amplification reaction of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid has been performed normally when the signal intensity from the common probe in the microarray exceeds a threshold;
determining the presence or absence of a target nucleic acid based on the signal intensity from the target nucleic acid detection probe and the signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe;
A method for detecting a target nucleic acid, comprising:
the target nucleic acid detection probe is a probe for detecting a target nucleic acid for the MYD88 gene or a probe for detecting a target nucleic acid for the CXCR4 gene,
the non-target nucleic acid detection probe is a non-target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene or a non-target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene,
the common probe is a common probe for the MYD88 gene or a common probe for the CXCR4 gene,
the blocking nucleic acid is a blocking nucleic acid for the MYD88 gene or a blocking nucleic acid for the CXCR4 gene;
the probe for detecting a target nucleic acid for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 14,
the non-target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and/or 13,
the common probe for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 23,
The blocking nucleic acid for the MYD88 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 5,
the probe for detecting a target nucleic acid for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 18, and 20 to 22;
the non-target nucleic acid detection probe for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15, 17, and 19;
the common probe for the CXCR4 gene comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 24,
The blocking nucleic acid for the CXCR4 gene comprises at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 to 8.
The method for detecting a target nucleic acid .

The method for detecting a target nucleic acid according to claim 3, characterized in that the value of [signal intensity from the probe for detecting a target nucleic acid]/([signal intensity from the probe for detecting a target nucleic acid]+[signal intensity from the probe for detecting a non-target nucleic acid] ) is calculated, and if this value exceeds a threshold value , it is determined that the target nucleic acid is present.

5. The method for detecting a target nucleic acid according to claim 3 , wherein the amplification reaction of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid has a copy number of 1.79×10 ⁵ to 1.43×10 ⁶ copies of the template nucleic acid.