JP7766724B2 - オリゴデンドロサイト前駆細胞組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、「オリゴデンドロサイト前駆細胞組成物」と題する２０１６年３月３０日出願の米国仮特許出願第６２／３１５，４５４号の出願日の優先権の利益を主張し、その内容は参照として本明細書にその全体が組み込まれている。

本開示は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む組成物、並びにその作製方法及び使用方法に関する。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む多能性細胞を培養すると、その拡大期間中に、様々なレベルの自発的分化が生じ得る。そのような自発的分化は、その後ｈＥＳＣが、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む特定の細胞型への指向性分化を受ける能力を損なう。例えば、ｈＥＳＣのＨ１系は、従来の培養条件下で増殖させると自発的に分化し、栄養外胚葉系列に分化する傾向を有することがこれまでに明らかにされている（Ｄｒｕｋｋｅｒ Ｍ、Ｔａｎｇ Ｃ、Ａｒｄｅｈａｌｉ Ｒ、Ｒｉｎｋｅｖｉｃｈ Ｙ、Ｓｅｉｔａ Ｊ、Ｌｅｅ ＡＳ、Ｍｏｓｌｅｙ ＡＲ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ、Ｓｏｅｎ Ｙ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ，ｍｅｓｏｄｅｒｍ，ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年５月２７日；３０（６）：５３１～４２；Ｗａｎｇ Ｚ、Ｏｒｏｎ Ｅ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｂ、Ｒａｚｉｓ Ｓ、Ｉｖａｎｏｖａ Ｎ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＮＡＮＯＧ，ＯＣＴ４，ａｎｄ ＳＯＸ２ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１２年４月６日；１０（４）：４４０～５４）。この自発的分化は、ｈＥＳＣ内の内因性ＷＮＴシグナル伝達により部分的に調節されている（Ｋｕｍａｒ ＲＭ、Ｃａｈａｎ Ｐ、Ｓｈａｌｅｋ ＡＫ、Ｓａｔｉｊａ Ｒ、ＤａｌｅｙＫｅｙｓｅｒ ＡＪ、Ｌｉ Ｈ、Ｚｈａｎｇ Ｊ、Ｐａｒｄｅｅ Ｋ、Ｇｅｎｎｅｒｔ Ｄ、Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ＪＪ、Ｆｅｒｒａｎｔｅ ＴＣ、Ｒｅｇｅｖ Ａ、Ｄａｌｅｙ ＧＱ、Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＪ．Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．、２０１４年１２月４日；５１６（７５２９）：５６～６１）。しかしながら、この分野では、ＷＮＴ経路の活性化又は阻害が分化の制御において有益であるかどうか、意見が分かれている。すなわち、Ｋｕｒｅｋらは、ＷＮＴ経路の阻害は自発的分化を低下させることを示唆する（Ｋｕｒｅｋ Ｄ、Ｎｅａｇｕ Ａ、Ｔａｓｔｅｍｅｌ Ｍ、Ｔｕｙｓｕｚ Ｎ、Ｌｅｈｍａｎｎ Ｊ、ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｒｋｅｎ ＨＪ、Ｐｈｉｌｉｐｓｅｎ Ｓ、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｒ、Ｍａａｓ Ａ、ｖａｎ ＩＪｃｋｅｎ ＷＦ、Ｄｒｕｋｋｅｒ Ｍ、ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ Ｄ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＷＮＴ ｓｉｇｎａｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＢＭＰ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５年１月１３日；４（１）：１１４～２８）。

Ｈ１ ｈＥＳＣを拡大し、次にＯＰＣへの指向性分化に供すると、分化細胞は、転写因子を含む栄養外胚葉関連遺伝子の発現増加を示す。これは、神経外胚葉系列以外の細胞型は、分化期間中になおも存続することができることを示唆する。次に、このように分化期間中に非神経外胚葉系列マーカーが存続するということは、例えば、上皮細胞、軟骨前駆細胞、及び網膜色素上皮細胞を含む望ましくない細胞型が、最終的なＯＰＣ集団内に存在することと関連する。

いくつかのマーカーが、ＯＰＣ集団内の望ましくない細胞のレベルを定量化するのに使用されてきた。すなわち、このようなマーカーの検出は、細胞フェノタイピング法、例えばフローサイトメトリー及び遺伝子発現プロファイリング等により達成され得る。例えば、フローサイトメトリー分析は、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ／ＩＴＧＡ６、Ｅ－カドヘリン、サイトケラチン７（Ｋ７）、パン－サイトケラチン（ＰＣＫ）、ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６、エンドレペリン／パールカン、並びに表１に記載されているその他マーカーを含む、上皮細胞と関連したマーカーの存在に基づき、様々なレベルの上皮細胞を検出するのに利用可能である。更に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）による遺伝子発現プロファイリングは、ＯＬＲ１及びＲＰＥ６５の発現それぞれに基づき、様々なレベルの軟骨前駆細胞及び網膜色素上皮細胞を示すのに利用可能である。

望ましくない細胞型のレベルが低いＯＰＣの集団を産生するための努力がなされてきたものの、セルソーティング法及び抗体枯渇法等の手法は複雑であり、かつ高価でスケールアップに適さないカスタマイズされた試薬の生成をしばしば必要とする。

本開示の態様は、治療を必要とする対象内の１つ以上の神経学的機能を改善するための、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む組成物、並びにその作製方法及び使用方法を含む。本開示は、その１つの態様において、複数のＯＰＣ、及び１５％未満の望ましくない細胞型を含む細胞集団を含む組成物を含む。本開示は、その１つの態様において、複数のＯＰＣ、及び１５％未満の望ましくない細胞型を含む細胞集団を実現する方法を更に含む。また本開示は、その１つの態様において、複数のＯＰＣ、及び１５％未満の望ましくない細胞型を含む細胞集団を特徴付ける方法も含む。更に、本開示は、その１つの態様において、複数のＯＰＣ、及び１５％未満の望ましくない細胞型を含む細胞集団を使用する方法も含む。本開示は、その１つの態様において、複数のＯＰＣ、及び１５％未満の望ましくない細胞型を含む細胞集団を生成する方法を更に含む。

より具体的には、本開示は、ある態様において、組成物を含む容器であって、前記組成物が複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、１５％未満の望ましくない細胞型を含む、容器を含む。特定の態様では、細胞集団は、１５％未満の上皮系列細胞を含む。特定の態様では、細胞集団は、２％未満のＫ７陽性細胞を含む。特定の態様では、細胞集団は、５％未満のＰＣＫ陽性細胞を含む。

本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含み、前記複数のＯＰＣが、ヒト胚性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される１つ以上の幹細胞源のｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された後代を含む、容器である。

本開示の更なる態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成し得るものである、容器である。なおも別の態様では、細胞集団は、最大２０×１０^６個の細胞を中枢神経系損傷部位内に移植した場合、対象の２％未満において異所性組織を産生し得るものである。

本開示のなおも更なる態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、脳卒中、脊髄損傷、及び／又は多発性硬化症を治療するのに有用である容器である。

特許又は出願ファイルは、カラーの少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、必要な費用を支払えば、申請に応じて当局より提供される。

本開示に係るＳＢ４３１５４２の化学構造を示す図である。 本開示に係るドルソモルフィンの化学構造を示す図である。 本開示に係るＣＨＩＲ９９０２１の化学構造を示す図である。 本開示に係るパルモルファミンの化学構造を示す図である。 本開示の実施形態に係る方法により生成したＯＰＣ内で発現するＮＧ２、Ｋ７、及びＰＣＫマーカーレベルの変化について、未分化細胞を事前治療しない方法により生成した対応する対照と比較した、代表的な比較を示す図である。 左側及び中央のパネルは、本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの代表的なピクトグラフを示す図であり、本開示によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞アッセイにおいて、様々なレベルの嚢胞形成を表す。 右側のパネルは、本開示に従って未分化細胞を事前治療することを含む方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの代表的なピクトグラフを示す図であり、本開示によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞アッセイにおいて、嚢胞が形成されなかったことを表す。 頚髄損傷、及び本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの投与後９カ月経過した成熟雌ラットの一連の代表的な組織学を示す図である。 未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣのいくつかの集団における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞カウントに対するｉｎ ｖｉｖｏでの嚢胞形成頻度の直線回帰プロットを示す図である。 本開示に従って未分化細胞を事前治療することを含む方法を使用して生成したＯＰＣが生着したラット頚髄の代表的な顕微鏡写真を示す図である。 本開示に係る白質脳卒中のマウスモデルにおいて、移植したＯＰＣの効果を試験するための実験タイムラインの非限定的な例を示す図である。 グリッド歩行試験から生ずると予想される結果の非限定的な例を示す図であり、本開示の実施形態に係る方法により生成したＯＰＣを移植された脳卒中損傷マウスにおける性能改善を実証する。 シリンダー試験から生ずると予想される結果の非限定的な例を示す図であり、本開示の実施形態に係る方法により生成したＯＰＣを移植された脳卒中損傷マウスにおける性能改善を実証する。 歩行パラメーターの代表的な第１主成分分析を示す図であり、本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣを移植した損傷ラットにおける運動活性の改善を示す。 平均走行速度の代表的なプロットを示す図であり、本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣを移植された脊髄損傷ラットにおける走行速度の向上を示す。 右後ろ足のストライド頻度の代表的なプロットを示す図であり、本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣを移植された脊髄損傷ラットにおける運動障害の軽減を示す。 平均の右前足の縦方向の最大のずれについて、その代表的なプロットを示す図であり、本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣを移植された脊髄損傷ラットにおける、影響を受けた肢の縦方向の変位の回復を示す。 本開示に従って未分化細胞を事前治療しない方法により生成したＯＰＣの注射後４カ月におけるＯＰＣグラフトの代表的な切片を示す図である。 本開示に係る多発性硬化症のラットモデルにおいて、移植されたＯＰＣの効果を試験するための実験タイムラインの非限定的な例を示す図である。 本開示の実施形態に係る方法により生成したＯＰＣを移植した場合に生成すると予想される脳脊髄炎（ＥＡＥ）スコアのプロットの非限定的な例を示す図である。

この説明は、本開示が実施され得る方法につき、そのすべての異なる方法、又は本開示に付加され得るすべての特性の詳細なカタログを意図するものではない。例えば、１つの態様に関して説明された特性は、その他の態様に組み込むことができ、また特定の態様に関して説明された特性は、当該態様から削除され得る。したがって、本開示では、本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載する特性のいずれか又は特性の組合せが、除外又は省略可能であることも検討される。更に、本開示から逸脱しない、本明細書で示唆される様々な態様に対する非常に多くの変更及び付加が、本開示に照らし当業者にとって明白である。その他の事例では、本発明が不必要に不明確にならないように、周知の構造、インターフェース、及びプロセスについて詳細には示されていない。本明細書のいかなる部分も、本発明の全範囲のいずれかの部分を無効にするとは解釈されないように意図されている。したがって、下記の説明は、本開示のいくつかの特定の態様を説明するように意図されており、そしてそのすべての置換、組合せ、及び変更を網羅的に規定するようには意図されない。

別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書において、本開示を説明する際に使用される用語は、特定の態様を記載する目的に限定され、また本開示を制限するようには意図されない。

本明細書で引用されたすべての公開資料、特許出願、特許、及びその他の参照は、参照としてその全体が組み込まれる。

文脈が別途示唆しない限り、本明細書に記載する本開示の様々な特性は、任意の組合せで利用可能であることが特に意図される。更に、本開示では、本開示のいくつかの態様では、本明細書に記載する特性のいずれか又は特性の組合せは、除外又は省略可能であることについても検討される。

本明細書に開示する方法は、記載されている方法を達成するための１つ若しくは複数のステップ又は行為を含み得る。方法のステップ及び／又は行為は、本発明の範囲から逸脱せずに相互に交換可能である。換言すれば、ステップ又は行為の特定の順序が、本態様を適切に運用するのに必要とされない限り、特定のステップ及び／又は行為の順序及び／又は使用は、本発明の範囲から逸脱せず改変され得る。

本開示の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別途明示されない限り、複数形も含まれるように意図される。

本明細書で用いる場合、「及び／又は」は、列挙されている関連品目のうちの１つ以上のあらゆるすべての可能な組合せのほか、二者択一的に解釈される場合（「又は」）には、組合せの欠損を指し、またそれを含む。

用語「ほぼ（ａｂｏｕｔ）」及び「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、本明細書で使用する場合、測定可能な数値、例えばパーセンテージ（％）、密度、体積等を指す際には、所定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％の変動、又は±０．１％の変動も含むことを意味する。

本明細書で用いる場合、慣用句、例えば「ＸとＹの間」及び「ほぼＸとＹの間」等は、Ｘ及びＹを含むと解釈すべきである。本明細書で用いる場合、慣用句、例えば「ほぼＸとＹの間」等は、「ほぼＸとほぼＹの間」を意味し、また慣用句、例えば「ほぼＸ～Ｙ」等は、「ほぼＸ～ほぼＹ」を意味する。

本明細書で用いる場合、「オリゴデンドロサイト前駆細胞」（ＯＰＣ）とは、中枢神経系に見出される細胞型の特徴を有する神経外胚葉／グリア細胞系列の細胞を指し、オリゴデンドロサイトに分化し得るものである。このような細胞は、特徴的なマーカーであるネスチン、ＮＧ２、及びＰＤＧＦ－Ｒαを一般的に発現する。

本明細書で用いる場合、慣用句「異所性組織」とは、望まれない又は予期せぬ特徴を有する組織を指す。ＯＰＣを含む組成物を定義する文脈で使用される場合、「異所性組織」とは、神経外胚葉系列に由来しない組織を指す。より具体的には、「異所性組織」は、上皮、上皮嚢胞、中皮細胞由来の組織、軟骨、骨、又は中枢神経系に一般的に見出されないその他の組織と類似した組織である。

本明細書で用いる場合、用語「望ましくない細胞型」とは、移植した際に異所性組織形成を引き起こす、又は本明細書に記載するように、嚢胞アッセイにおいて、１つ若しくは複数の嚢胞形成を引き起こす神経外胚葉系列以外の細胞を指す。より具体的には、「望ましくない細胞型」には、Ｋ７及び／又はＰＣＫマーカーを発現する細胞が含まれる。ある態様では、「望ましくない細胞型」は、上皮系列細胞を含み得る。ある態様では、「望ましくない細胞型」は、絨毛細胞系列、例えばＨａｎｄ１等の特徴を有するマーカーを発現する細胞を含み得る。

用語「Ｋ７」、「ケラチン７」、及び「サイトケラチン７」は、本明細書では交換可能に使用され、またＫＲＴ７遺伝子又は任意のそのバリアントによりエンコードされるタンパク質を指す。

用語「ＰＣＫ」及び「パン－サイトケラチン」は、本明細書では交換可能に使用され、またサイトケラチンの酸性及び塩基性（Ｉ型及びＩＩ型）のサブファミリー、並びにその変異体を含むが、これらに限定されない、サイトケラチンタンパク質ファミリーの任意のメンバーを指す。ＰＣＫタンパク質の非限定的な例として、ＡＥ１／ＡＥ３モノクロナール抗体カクテルが結合したタンパク質が挙げられる（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＡＢ３４１２）。

本明細書で用いる場合、「上皮系列細胞」とは、外胚葉性であるが神経外胚葉／グリア細胞系列から派生した発達性の前駆体に由来する細胞を指す。ある態様では、「上皮系列細胞」は、表１に列挙されている１つ以上のマーカーにより識別され得る。このような細胞として、上皮－間葉転換（ＥＭＴ）を経た発達性の後代、及び栄養芽細胞に由来する上皮様細胞が挙げられる。

本明細書で用いる場合、慣用句「細胞富化」とは、所望の細胞型、この場合ＯＰＣを望ましくない細胞型と分離して精製することを意味する。精製は、陽性選択（ＯＰＣを標的とする）、又は陰性選択（望ましくない細胞型を標的とする）であり得る。抗体は、標的対象の細胞型との結合及びその物理的除去に使用され得る。抗体は、固体表面に連結して物理的分離効果を発揮し得る。固体表面は、一般的にマグネットビーズ、カラム、又はフラスコである。

本明細書で用いる場合、「移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」又は「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」とは、適する送達技術を使用した（例えば、注射デバイス使用した）標的組織への細胞集団の投与を意味する。

本明細書で用いる場合、「対象」とは、動物又はヒトを指す。

本明細書で用いる場合、「それを必要としている対象」とは、中枢神経系内に損傷した組織を有する動物又はヒトを指す。１つの態様では、動物又はヒトは、運動機能喪失を経験している。

用語「中枢神経系」及び「ＣＮＳ」は、本明細書では交換可能に使用され、脊椎動物の脳及び脊髄を含むが、これらに限定されない、身体の１つ以上の活動を制御する神経組織の複合体を指す。

本明細書で用いる場合、状態又は疾患に関して「治療」又は「治療すること」とは、好ましくは、状態又は疾患が患者に現れた後の臨床結果を含む、有益又は所望の結果を得るためのアプローチである。疾患に関して有益な又は所望の結果として、下記のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない：疾患と関連した状態の改善、疾患の治癒、疾患の重症度の低減、疾患進行遅延、疾患と関連した１つ以上の症状の緩和、疾患罹患者の生活の質の向上、生存の延長、及び任意のこれらの組合せ。同様に、本開示の目的に照らせば、状態に関する有益な又は所望の結果として、下記のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない：状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の低減、状態の進行遅延、状態と関連した１つ以上の症状の緩和、状態に罹患したものの生活の質の向上、生存の延長、及び任意のこれらの組合せ。

多能性幹細胞を分化させる方法
本開示の態様は、多能性幹細胞を分化させる方法を含む。ある態様では、複数の神経細胞を含む細胞集団を産生する方法が提供される。ある態様では、複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生する方法が提供される。ある態様では、ヒト胚性幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生する方法が提供される。１つの態様では、霊長類多能性幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生する方法が提供される。ある態様では、誘導多能性幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生する方法が提供される。ある態様では、多能性幹細胞を分化させる方法は、複数の未分化幹細胞を事前治療することと関連する１つ以上のステップを含む。ある態様では、１つ以上の事前治療ステップを含む方法は、低レベルの望ましくない細胞型を含む細胞集団を産生し得るものである。ある態様では、１つ以上の事前治療ステップを含む方法は、約１５％未満の望ましくない細胞型を有する、複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生し得るものである。１つの態様では、１つ以上の事前治療ステップを含む方法は、複数のＯＰＣを含む細胞集団を産生する能力を有し、前記細胞集団は、本開示による嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成し得るものである。

未分化多能性幹細胞の増殖及び培養
ある態様では、方法は、多能性幹細胞系において実施可能である。別の態様では、方法は、胚性幹細胞系において実施可能である。ある態様では、方法は、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、又はＨ１４細胞系に由来する複数の未分化幹細胞において実施可能である。別の態様では、未分化幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）系に由来し得る。ある態様では、方法は、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞系において実施可能である。なおも別の態様では、未分化幹細胞は、単為生殖生物に由来する場合もあり、受精せずにｈＥＳＣを産生するように刺激された胚である。

未分化多能性幹細胞の増殖法及び培養法は、これまでに記載されている。多能性幹細胞の組織及び細胞の培養に関して、非常に多くの公開資料が当技術分野において利用可能であり、参考にすべきその任意の資料として、例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ． １９８７）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１、１９９８；及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００）が挙げられる。

１つの態様では、未分化多能性幹細胞は、フィーダー細胞を添加しないで未分化状態で維持され得る（例えば、（２００４）Ｒｏｓｌｅｒら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２２９：２５９を参照）。フィーダーを含まない培養は一般的に、分化させずに細胞の増殖を促進する因子を含有する栄養培地によって維持される（例えば、米国特許番号第６，８００，４８０号を参照）。１つの態様では、そのような因子を含有する条件調整された培地が利用可能である。条件調整された培地は、そのような因子を分泌する細胞を含む培地を培養することにより取得可能である。適する細胞として、放射線照射（約４，０００Ｒａｄ）された一次マウス胚性線維芽細胞、テロメル化マウス線維芽細胞、又はｐＰＳ細胞に由来する線維芽細胞様の細胞（米国特許第６，６４２，０４８号）が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、２０％の血清代替品及び４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたノックアウトＤＭＥＭ等の無血清培地中にフィーダーを播くことにより条件調整され得る。１～２日間条件調整された培地は、ｂＦＧＦで更に補充され、またｐＰＳ細胞培養を１～２日間維持するのに使用され得る（例えば、国際公開第０１／５１６１６号；Ｘｕら、（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１を参照）。

或いは、新鮮な又は条件調整されない培地が利用可能であり、同培地は未分化の形態で細胞の増殖を促進する添加因子（線維芽細胞増殖因子又はホルスコリン等）が補充されている。非限定的な例として、４０～８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充され、及びＳＣＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、又はＦｌｔ３リガンド（７５ｎｇ／ｍＬ）を任意選択的に含有するＸ－ＶＩＶＯ（商標）１０（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、又はＱＢＳＦ（商標）－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）等のベース培地が挙げられる（例えば、Ｘｕら、（２００５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２３（３）：３１５を参照）。このような培地処方物は、その他のシステムよりも２～３倍高い割合で細胞増殖を維持するという長所を有する（例えば、国際公開第０３／０２０９２０号を参照）。１つの態様では、未分化多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞等は、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβを含む培地中で培養され得る。ｂＦＧＦの濃度の非限定的な例として、約８０ｎｇ／ｍｌが挙げられる。ＴＧＦβの濃度の非限定的な例として、約０．５ｎｇ／ｍｌが挙げられる。

１つの態様では、未分化多能性細胞は、フィーダー細胞、一般的に胚組織又は胎児組織に由来する線維芽細胞の層上で培養され得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５）。１つの態様では、フィーダー細胞は、ヒト又はマウスに由来し得る。ヒトフィーダー細胞は、様々なヒト組織から単離可能、又はヒト胚性幹細胞から線維芽細胞への分化に由来し得る（例えば、国際公開第０１／５１６１６号を参照）。１つの態様では、利用可能なヒトフィーダー細胞として胎盤線維芽細胞（例えば、Ｇｅｎｂａｃｅｖら（２００５）Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７を参照）、卵管上皮細胞（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：９３３を参照）、包皮線維芽細胞（例えば、Ａｍｉｔら（２００３）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０を参照）、及び子宮内膜細胞（例えば、Ｌｅｅら（２００５）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７２（１）：４２を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な固体表面が、未分化多能性細胞の培養で利用可能である。そのような固体表面として、標準的な市販の細胞培養プレート、例えば６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、又は１４４ウェルプレート等が挙げられるが、これらに限定されない。その他の固体表面として、マイクロキャリア及びディスクが挙げられるが、これらに限定されない。未分化多能性細胞の増殖に適する固体表面は、ガラス、又はプラスチック、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、メリネックス（ｍｅｌｉｎｅｘ）、サーマノックス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）等、又はその組合せを含むが、これらに限定されない様々な物質からなり得る。１つの態様では、適する表面は、１つ以上のポリマー、例えば１つ以上のアクリレート等を含み得る。１つの態様では、固体表面は、三次元の形状であり得る。三次元固体表面の非限定的な例は、例えば米国特許公開第２００５／００３１５９８号に記載されている。

ある態様では、未分化幹細胞は、増殖基質上でフィーダーを含まない条件下で増殖し得る。ある態様では、増殖基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ）、組換えラミニン、又はビトロネクチンであり得る。ある態様では、未分化幹細胞は、様々な方法を使用して、例えばコラゲナーゼ、又は例えば手作業でのスクレーピング等を使用するなどして継代培養され得る。別の態様では、未分化幹細胞は、非酵素的手段、例えば０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ等を使用して、又は例えばＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用するなどして継代培養され得る。ある態様では、複数の未分化幹細胞は、細胞が約３～約１０日間のうちにコンフルエンスに達するのを可能にする播種密度で播種される、又は継代培養される。ある態様では、播種密度は、増殖表面に約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。別の態様では、播種密度は、増殖表面に約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、増殖表面に例えば約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。なおも別の態様では、播種密度は、増殖表面に約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、増殖表面に約２．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約３．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約４．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約７．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約６．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。ある態様では、播種密度は、増殖表面に約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば増殖表面に約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約１．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約２．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約２．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。

様々な任意の適する細胞培養技術及び継代培養技術が、標記方法の態様に従って細胞を培養するのに利用可能である。例えば、ある態様では、培養培地は、適する時間間隔で交換され得る。１つの態様では、培養培地は、細胞の継代培養後の約２日から始めて毎日完全に交換され得る。ある態様では、培養物が約９０％のコロニー被覆率に到達したら、サロゲートフラスコを犠牲にし、そして１つ以上の適する試薬、例えばコラゲナーゼＩＶ及び０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ等を連続して使用して計測を行い、定量化用の単細胞懸濁物を実現することができる。ある態様では、複数の未分化幹細胞は、次に継代培養した後、細胞が、適する期間、例えば約３～１０日間等においてコンフルエンスに達することが可能となる播種密度で、細胞を適する増殖基質（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス）上に播種することができる。１つの態様では、未分化幹細胞は、コラゲナーゼＩＶを使用して継代培養可能であり、また組換えラミニンマトリックス上で拡大可能である。１つの態様では、未分化幹細胞は、コラゲナーゼＩＶを使用して継代培養可能であり、またＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス上で拡大可能である。１つの態様では、未分化幹細胞は、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して継代培養可能であり、またビトロネクチンマトリックス上で拡大可能である。

ある態様では、播種密度は、増殖表面に約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。別の態様では、播種密度は、増殖表面に約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２、例えば増殖表面に約６．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約７．０×１０^３個／ｃｍ^２～約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば増殖表面に約７．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。なおも別の態様では、播種密度は、増殖表面に約１．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば増殖表面に約２．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約９．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば増殖表面に約３．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約８．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約４．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約７．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約５．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２～約６．０×１０^４個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。ある態様では、播種密度は、増殖表面の約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約５．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば増殖表面に約１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約１．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約４．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約２．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、又は例えば約２．５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約３．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等の範囲であり得る。

未分化多能性幹細胞の事前治療
別の態様では、分化前に、未分化幹細胞を事前治療することを含む方法が提供される。何らかの特定の理論に拘束されることなく、本発明者らは、多能性幹細胞の自発的分化の更なる低下を容易にし、これにより事前治療ステップを含まない分化方法について、更に改善することができる様々な事前治療ステップを識別した。ある態様では、本明細書に記載する１つ以上の事前治療ステップと関係する方法は、低レベルの望ましくない栄養芽細胞系列の細胞を含む細胞集団を産生することができる。別の態様では、本明細書に記載する１つ以上の事前治療ステップを含む方法は、低レベルの望ましくない上皮系列細胞を含む細胞集団を産生することができる。更に、本発明者らは、本開示に係る嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成する細胞集団の産生を容易にすることができる様々な事前治療ステップを識別した。事前治療ステップは、本明細書に詳細に記載されている。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、１つ以上の幹細胞分化調節分子と共にある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、幹細胞分化調節分子は、上皮系列と分離して後続する細胞分化を推進する分子であり得る。理論に拘束されることなく、本発明者らは、幹細胞を１つ以上の幹細胞分化調節分子と共にインキュベートすると、その結果上皮系列細胞を低下させることができることを識別した。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、下記の４種類の幹細胞分化調節分子のうちの１つ又は複数と共にある期間インキュベートすることを含む：（１）ＳＭＡＤ／ＴＧＦβ－ＲＩＩシグナル伝達経路の一部であるＡＬＫ５の阻害剤；（２）ＢＭＰＲＩシグナル伝達経路の一部であるＡＬＫ２の阻害剤；（３）ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化させるＧＳＫ３阻害剤；及び（４）ＳＨＨ経路を活性化させる平滑化作動薬（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、幹細胞分化調節因子は、小分子であり得る。ある態様では、小分子幹細胞分化調節因子は、ＡＬＫ５、ＡＬＫ２、若しくはＧＳＫ３の阻害剤である、又は平滑化作動薬である。ある態様では、ＡＬＫ５の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、及びその誘導体からなる群より選択可能である。別の態様では、ＡＬＫ２の阻害剤は、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、ノギンタンパク質、及びその誘導体からなる群より選択可能である。なおも別の態様では、ＧＳＫ３の阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６２、Ｗｎｔタンパク質、及びその誘導体からなる群より選択可能である。ある態様では、平滑化作動薬は、パルモルファミン、ＳＡＧ（ＣＡＳ３６４５９０－６３－６）、ＳＳＨタンパク質、及びその誘導体からなる群より選択可能である。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、４つの小分子：ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンと共にある期間インキュベートすることを含む。ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンの化学構造を図１～図４にそれぞれ示す。

ある態様では、方法は、本明細書に記載するように、拡大されたが未分化の幹細胞を、１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、２つ又はそれ超の幹細胞分化調節因子と共にある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、３つ又はそれ超の幹細胞分化調節因子と共にある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、４つ又はそれ超の幹細胞分化調節因子と共にある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、インキュベーション期間は、約１～約１０日間、例えば約２日間等、例えば約３日間等、例えば約４日間等、例えば約５日間等、例えば約６日間等、例えば約７日間等、例えば約８日間等、又は例えば約９日間等の範囲であり得る。ある態様では、インキュベーション期間は、約１～約５日間、例えば約１～約３日間等、又は例えば約２～約５日間等の範囲であり得る。別の態様では、インキュベーション期間は、約６～約１０日間、例えば約６～約８日間等、又は例えば約７～約１０日間等の範囲であり得る。なおも別の態様では、インキュベーション期間は、約３～約８日間、例えば約３～約５日間等、例えば約４～約６日間等、例えば約５～約７日間等、又は例えば約６～約８日間等の範囲であり得る。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞集団を、２つ又はそれ超の第１の幹細胞分化調節因子と共に、第１のインキュベーション期間インキュベートすること、及び前記集団を、２つ又はそれ超の第２の幹細胞分化調節因子と共に、第２のインキュベーション期間インキュベートすることを含む。ある態様では、第１のインキュベーション期間は、約１～約７日間、例えば約２日間等、例えば約３日間等、例えば約４日間等、例えば約５日間等、又は例えば約６日間等の範囲であり得る。ある態様では、第２のインキュベーション期間は、約１～約７日間、例えば約２日間等、例えば約３日間等、例えば約４日間等、例えば約５日間等、又は例えば約６日間等の範囲であり得る。

ある態様では、２つ又はそれ超の第１の幹細胞分化調節因子は、２つ又はそれ超の第２の幹細胞分化調節因子とは異なる。ある態様では、２つ又はそれ超の第１の幹細胞調節因子は、２つ又はそれ超の第２の幹細胞調節因子と同一である。ある態様では、第１及び第２の幹細胞調節因子は、少なくとも１つの共通する調節因子を共有する。ある態様では、第１及び第２の幹細胞調節因子は、２つ又はそれ超の共通する調節因子、例えば３つ又はそれ超等の共通する調節因子、例えば４つ又はそれ超の共通する調節因子等を共有する。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、下記の分化調節因子：ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンのうちの１つ又は複数と共に、約１～１０日間インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンと共に約１～５日間インキュベートし、その後約１～５日間、ＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンと共に約４日間インキュベートし、その後ＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンと共に３日間インキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約１００μＭ、例えば約５μＭ等、約１０μＭ等、例えば約１５μＭ等、例えば約２０μＭ等、例えば約２５μＭ等、例えば約３０μＭ等、例えば約３５μＭ等、例えば約４０μＭ等、例えば約４５μＭ等、例えば約５０μＭ等、例えば約５５μＭ等、例えば約６０μＭ等、例えば約６５μＭ等、例えば約７０μＭ等、例えば約７５μＭ等、例えば約８０μＭ等、例えば約８５μＭ等、例えば約９０μ等、又は例えば約９５μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約２０μＭ、例えば約１μＭ～約１３μＭ等、例えば約８μＭ～約２０μＭ等、例えば約８μＭ～約１３μＭ等、又は例えば約９μＭ～約１１μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。なおも別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２０μＭ～約４０μＭ、例えば約２０μＭ～約３３μＭ等、例えば約２８μＭ～約４０μＭ等、例えば約２８μＭ～約３３μＭ等、又は例えば約２９μＭ～約３１μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約４０μＭ～約６０μＭ、例えば約４０μＭ～約５３μＭ等、例えば約４８μＭ～約５５μＭ等、例えば約４８μＭ～約５３μＭ等、又は例えば約４９μＭ～約５１μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約６０μＭ～約８０μＭ、例えば約６０μＭ～約７３μＭ等、例えば約６８μＭ～約７５μＭ等、例えば約６８μＭ～約７３μＭ等、又は例えば約６９μＭ～約７１μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約８０μＭ～約１００μＭ、例えば約８０μＭ～約９３μＭ等、例えば約８８μＭ～約９５μＭ等、例えば約８８μＭ～約９３μＭ等、又は例えば約８９μＭ～約９１μＭ等の範囲の濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０μＭの濃度のＳＢ４３１５４２と共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５０ｎＭ～約２５０μＭ、例えば約１μＭ、約１０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、又は約２００μＭ等の範囲の濃度のＡＬＫ５阻害剤と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５０ｎＭ～約２５μＭ、例えば約２５０ｎＭ～約１μＭ等、例えば約１μＭ～約１０μＭ等、又は例えば約１０μＭ～約２５μＭ等の範囲の濃度のＬＹ３６４９４７と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２．５μＭのＬＹ３６４９４７と共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２．５μＭ～約２５０μＭ、例えば約２．５μＭ～約１０μＭ等、例えば約１０μＭ～約１００μＭ等、又は例えば約１００μＭ～約２５０μＭ等の範囲の濃度のＲｅｐＳｏｘと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５μＭのＲｅｐＳｏｘと共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．２μＭ～約２０μＭ、例えば約０．５μＭ等、例えば約０．８μＭ等、例えば約１μＭ等、例えば約１．５μＭ等、例えば約２μＭ等、例えば約２．５μＭ等、例えば約３μＭ等、例えば約３．５μＭ等、例えば約４μＭ等、例えば約４．５μＭ等、例えば約５μＭ等、例えば約５．５μＭ等、例えば約６μＭ等、例えば約６．５μＭ等、例えば約７μＭ等、例えば約７．５μＭ等、例えば約８μＭ等、例えば約８．５μＭ等、例えば約９μＭ等、例えば約１０μＭ等、例えば約１１μＭ等、例えば約１２μＭ等、例えば約１３μＭ等、例えば約１４μＭ等、例えば約１５μＭ等、例えば約１６μＭ等、例えば約１７μＭ等、例えば約１８μＭ等、又は例えば約１９μＭ等の範囲の濃度のドルソモルフィンと共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．２μＭ～約１μＭ、例えば約０．２μＭ～約０．９μＭ等、例えば約０．３μＭ～約０．８μＭ等、例えば約０．４μＭ～約０．７μＭ等、又は例えば約０．５μＭ～約０．６μＭ等の範囲の濃度のドルソモルフィンと共にインキュベートすることを含む。なおも別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約１０μＭ、例えば約１μＭ～約９μＭ等、例えば約２μＭ～約８μＭ等、例えば約３μＭ～約７μＭ等、又は例えば約４μＭ～約６μＭ等の範囲の濃度のドルソモルフィンと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０μＭ～約２０μＭ、例えば約１０μＭ～約１９μＭ等、例えば約１２μＭ～約１８μＭ等、例えば約１３μＭ～約１７μＭ等、又は例えば約１４μＭ～約１６μＭ等の範囲の濃度のドルソモルフィンと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２μＭの濃度のドルソモルフィンと共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１ｎＭ～約２０μＭ、例えば約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、又は約１５μＭ等の範囲の濃度のＡＬＫ２阻害剤と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、例えば約１ｎＭ～約１０ｎＭ等、例えば約１０ｎＭ～約５０ｎＭ等、又は例えば約５０ｎＭ～約１００ｎＭ等の範囲の濃度のＬＤＮ１９３１８９と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９と共に、インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２ｎＭ～約２００ｎＭ、例えば約２ｎＭ～約１０ｎＭ等、例えば約１０ｎＭ～約１００ｎＭ等、又は例えば約１００ｎＭ～約２００ｎＭ等の範囲の濃度のノギンタンパク質と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２０ｎＭのノギンタンパク質と共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．３μＭ～約３０μＭ、例えば約０．５μＭ等、例えば約０．８μＭ等、例えば約１μＭ等、例えば約１．５μＭ等、例えば約２μＭ等、例えば約２．５μＭ等、例えば約３μＭ等、例えば約３．５μＭ等、例えば約４μＭ等、例えば約４．５μＭ等、例えば約５μＭ等、例えば約５．５μＭ等、例えば約６μＭ等、例えば約６．５μＭ等、例えば約７μＭ等、例えば約７．５μＭ等、例えば約８μＭ等、例えば約８．５μＭ等、例えば約９μＭ等、例えば約１０μＭ等、例えば約１１μＭ等、例えば約１２μＭ等、例えば約１３μＭ等、例えば約１４μＭ等、例えば約１５μＭ等、例えば約２０μＭ等、又は例えば約２５μＭ等の範囲の濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．３μＭ～約１μＭ、例えば約０．３μＭ～約０．９μＭ等、例えば約０．４μＭ～約０．８μＭ等、又は例えば約０．５μＭ～約０．７μＭ等の範囲の濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。なおも別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約１０μＭ、例えば約１μＭ～約９μＭ等、例えば約２μＭ～約８μＭ等、例えば約３μＭ～約７μＭ等、又は例えば約４μＭ～約６μＭ等の範囲の濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０μＭ～約２０μＭ、例えば約１１μＭ～約１９μＭ等、例えば約１２μＭ～約１８μＭ等、例えば約１３μＭ～約１７μＭ等、又は例えば約１４μＭ～約１６μＭ等の範囲の濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２０μＭ～約３０μＭ、例えば約２１μＭ～約２９μＭ等、例えば約２２μＭ～約２８μＭ等、例えば約２３μＭ～約２７μＭ等、又は例えば約２４μＭ～約２６μＭ等の範囲の濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１と共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５ｎＭ～約１００μＭ、例えば約１００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、又は約５０μＭ等の範囲の濃度のＧＳＫ３阻害剤と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約５００ｎＭ～約５０μＭ、例えば約５００ｎＭ～約１μＭ等、例えば約１μＭ～約１０μＭ等、又は例えば約１０μＭ～約５０μＭ等の範囲の濃度のＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約５μＭのＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）と共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約１００μＭ、例えば約１μＭ～約１０μＭ等、例えば約１０μＭ～約５０μＭ等、又は例えば約５０μＭ～約１００μＭ等の範囲の濃度のケンパウロンと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０μＭのケンパウロンと共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約５００ｎＭ～約５０μＭ、例えば約５００ｎＭ～約１μＭ等、例えば約１μＭ～約１０μＭ等、又は例えば約１０μＭ～約５０μＭ等の範囲の濃度のＳＢ２１６７６３と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約５μＭのＳＢ２１６７６３と共にインキュベートすることを含む。なおも別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５ｎＭ～約２．５μＭ、例えば約２５ｎＭ～約１００ｎＭ等、例えば約１００ｎＭ～約１μＭ等、又は例えば約１μＭ～約２．５μＭ等の範囲の濃度のＷｎｔタンパク質と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５０ｎＭのＷｎｔタンパク質と共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．０５μＭ～約５μＭ、例えば約０．０８μＭ等、例えば約０．１μＭ等、例えば約０．２μＭ等、例えば約０．３μＭ等、例えば約０．４μＭ等、例えば約０．５μＭ等、例えば約０．６μＭ等、例えば約０．７μＭ等、例えば約０．８μＭ等、例えば約０．９μＭ等、例えば約１μＭ等、例えば約２μＭ等、例えば約３μＭ等、例えば約４μＭ等の範囲の濃度のパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．０５μＭ～約０．１μＭ、例えば約０．０６μＭ～約０．０９μＭ等、又は例えば約０．０７μＭ～約０．０８μＭ等の範囲の濃度のパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．１μＭ～約１μＭ、例えば約０．２μＭ～約０．９μＭ等、例えば約０．３μＭ～約０．８μＭ等、例えば約０．４μＭ～約０．７μＭ等、又は例えば約０．５μＭ～約０．６μＭ等の範囲の濃度のパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。別の態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１μＭ～約５μＭ、例えば約１μＭ～約４μＭ等、例えば約２μＭ～約５μＭ等、又は例えば約２μＭ～約４μＭ等の範囲の濃度のパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約０．５μＭの濃度のパルモルファミンと共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２．５ｎＭ～約５μＭ、例えば約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１μＭ、又は約２．５μＭ等の範囲の濃度の平滑化作動薬と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１０ｎＭ～約１μＭ、例えば約１０ｎＭ～約１００ｎＭ等、例えば約１００ｎＭ～約５００ｎＭ等、又は例えば約５００ｎＭ～約１０００ｎＭ等の範囲の濃度のＳＡＧと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約１００ｎＭのＳＡＧと共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２．５ｎＭ～約２５０ｎＭ、例えば約２．５ｎＭ～約１０ｎＭ等、例えば約１０ｎＭ～約１００ｎＭ等、又は例えば約１００ｎＭ～約２５０ｎＭ等の範囲の濃度のＳＨＨタンパク質と共にインキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化のＥＳＣを、約２５ｎＭのＳＨＨタンパク質と共にインキュベートすることを含む。

ある態様では、未分化幹細胞は、事前治療に備えて増殖基質上で拡大させることができる。増殖基質の非限定的な例として、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス、組換えラミニン（例えば、組換えラミニン５２１）、及びビトロネクチンが挙げられる。ある態様では、培地は、未分化幹細胞の継代培養後約２日目から毎日完全に交換され得る。ある態様では、未分化幹細胞は、コラゲナーゼ及び手作業でのスクレーピング、又はその他の非酵素的手段、例えば０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ又はＲｅＬｅＳＲ（商標）等を使用して継代培養され得る。ある態様では、未分化幹細胞は、細胞が約３～約１０日間でコンフルエンスに達することができる播種密度で播種又は継代培養される。ある態様では、播種密度は、分化開始前の継代培養において、増殖表面に細胞約６．０×１０^３個／ｃｍ^２～細胞約５．０×１０^５個／ｃｍ^２、例えば細胞約１．０×１０^４個／ｃｍ^２等、例えば細胞約５．０×１０^４個／ｃｍ^２等、例えば細胞約１．０×１０^５個／ｃｍ^２等、又は例えば細胞約３．０×１０^５個／ｃｍ^２等の範囲であり得る。別の態様では、播種密度は、増殖表面に細胞約６．０×１０^３個～細胞約１．０×１０^４個／ｃｍ^２、例えば増殖表面に約６．０×１０^３個／ｃｍ^２～細胞約９．０×１０^３個／ｃｍ^２等、例えば細胞約７．０×１０^３個～細胞約１．０×１０^４個／ｃｍ^２等、例えば細胞約７．０×１０^３個～細胞約９．０×１０^３個／ｃｍ^２等、又は例えば細胞約７．０×１０^３個／ｃｍ^２～細胞約８．０×１０^３個／ｃｍ^２等の範囲であり得る。なおも別の態様では、播種密度は、増殖表面に細胞約１．０×１０^４個／ｃｍ^２～約１．０×１０^５個／ｃｍ^２、例えば増殖表面に細胞約２．０×１０^４個／ｃｍ^２～細胞約９．０×１０^４個等、例えば細胞約３．０×１０^４個／ｃｍ^２～細胞約８．０×１０^４個／ｃｍ^２等、例えば細胞約４．０×１０^４個／ｃｍ^２～細胞約７．０×１０^４個／ｃｍ^２等、又は例えば細胞約５．０×１０^４個／ｃｍ^２～細胞約６．０×１０^４個／ｃｍ^２等の範囲であり得る。ある態様では、播種密度は、分化開始前の継代培養において、増殖表面に細胞約１．０×１０^５個／ｃｍ^２～細胞約５．０×１０^５個／ｃｍ^２、例えば細胞約１．０×１０^５個／ｃｍ^２～細胞約４．５×１０^５個／ｃｍ^２等、例えば細胞約１．５×１０^５個／ｃｍ^２～細胞約４．０×１０^５個／ｃｍ^２等、例えば細胞約２．０×１０^５個／ｃｍ^２～細胞約３．５×１０^５個／ｃｍ^２等、又は例えば細胞約２．５×１０^５個／ｃｍ^２～細胞約３．０×１０^５個／ｃｍ^２等の範囲であり得る。ある態様では、未分化幹細胞が３０～５０％のコンフルエンスに達したら、培地は、本明細書に記載するような１つ以上の幹細胞分化調節因子を含有するグリア前駆細胞培地に変更される。ある態様では、本明細書に記載するような１つ以上の幹細胞分化調節因子を含むグリア前駆細胞培地は、約４日間、毎日交換される。ある態様では、本明細書に記載するような１つ以上の幹細胞分化調節因子を含む培地は、分化開始前の次の３日間、毎日交換される。

ある態様では、事前治療を実施する、又は実施しない未分化幹細胞の分化は、コラゲナーゼＩＶ及び０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡを連続して使用して、サロゲートフラスコを用いながら細胞を計測して定量化用の単細胞懸濁物を実現すること、及びコラゲナーゼＩＶ及び手作業でのスクレーピングを使用して残りの未分化幹細胞培養物を採取することにより開始可能である。ある態様では、未分化幹細胞培養は、約１×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約１４×１０^５個の細胞／ｃｍ^２、例えば約２×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約１３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約１２×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約４×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約１１×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約５×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約１０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約６×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約９×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等、例えば約７×１０^５個の細胞／ｃｍ^２～約８×１０^５個の細胞／ｃｍ^２等の範囲の密度で胚様体（ＥＢ）が形成するように、ウルトラローアタッチメント（ＵＬＡ）容器に播種可能である。１つの態様では、未分化幹細胞は、約８×１０^５個の細胞／ｃｍ^２で播種される。

ある態様では、分化の翌日に、Ｘ－ＶＩＶＯ１０とグリア前駆細胞培地（ＧＰＭ）との１：１混合物であって、ＧＰＭが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０５６５－０１８）、２％のＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１７５０４－０４４）、４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＰＨＧ０３１１）が補充された０．０４μｇのトリヨードチロニン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ５５１６－１ＭＧ）から構成される前記混合物を使用して完全培地交換が実施され得る。ある態様では、ＧＰＭは、ｈｂＦＧＦ、ＥＧＦ、及びレチノイン酸（ＲＡ）が補充され得る。ある態様では、分化を開始して２日目から、培地は、ＥＧＦ及びＲＡでのみ補充された１００％のＧＰＭであり得る。ある態様では、この培地は、９日目まで毎日置換される。ある態様では、９日目～２７日目にかけて、ＥＧＦが補充されたＧＰＭ培地は、約１日おきに交換される。ある態様では、２７日目に、ＥＢは、分化開始時に播種されたＵＬＡ１ｃｍ^２当たり約２ｃｍ^２の比で、コーティングされた容器上に播かれる。ある態様では、コーティングされた容器は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックス、組換えラミニン、又はビトロネクチンでコーティングされ得る。ある態様では、分化全体の残りの部分で使用される培養培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＰＭである。ある態様では、約２７日目以降、細胞培養物の完全な培地交換が１日おきに行われる。ある態様では、細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ、又はＢｅｎｚｏｎａｓｅ及び０．０１％のプルロニック－Ｆ６８が補充されたＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して約３４日目に採取可能、カウント可能、及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリックスコーティング容器上に約５×１０^４個の生存細胞／ｃｍ^２で播種可能である。ある態様では、ＧＰＭ培地は、約３４日目から約７日後の最終採取まで、１日おきに置換される。ある態様では、ＯＰＣは、約４１日目に、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ、又はＢｅｎｚｏｎａｓｅ及び０．０１％のプルロニック－Ｆ６８が補充されたＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを使用して採取される。ある態様では、剥離細胞が、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地とＢｅｎｚｏｎａｓｅ及び０．０１％のプルロニック－Ｆ６８が補充されたＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ ＦＲＳとの混合物中にプールされた後、カウントされ、そして凍結保存する前にＣｒｙｏＳｔｏｒ５中で再配合される。

ＯＰＣ組成物
上記の通り、本開示の態様は、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む組成物、並びにその作製方法、及び治療を必要とする対象内の１つ以上の神経学的機能を改善するためのその使用方法を含む。特定の態様では、複数のＯＰＣは、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である。特定の態様では、複数のＯＰＣは、ヒト胚性幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である。その他の態様では、複数のＯＰＣは、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した後代である。ある態様では、複数のＯＰＣ及び低レベルの望ましくない細胞型を含む細胞集団を含む組成物が提供される。

ある態様では、細胞集団は、共通の遺伝的背景を有し得る。ある態様では、細胞集団は、１つの宿主に由来し得る。ある態様では、細胞集団は、多能性幹細胞系に由来し得る。別の態様では、細胞集団は、胚性幹細胞系に由来し得る。ある態様では、細胞集団は、ｈＥＳＣ系に由来し得る。ある態様では、ｈＥＳＣ系は、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、又はＨ１４細胞系であり得る。別の態様では、細胞集団は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）系に由来し得る。ある態様では、細胞集団は、それを必要としている対象に由来し得る（例えば、細胞集団は、治療を必要としている対象に由来し得る）。なおも別の態様では、ｈＥＳＣ系は、受精せずにｈＥＳＣを産生するように刺激された胚である単為生殖生物に由来し得る。

ある態様では、細胞集団は、細胞富化を受けていない。ある態様では、細胞集団は、ＯＰＣについて陽性選択が実施されない。ある態様では、ＯＰＣの陽性選択は、例えばフローサイトメトリー又はマグネットビーズを使用して、ネスチン、ＮＧ２、又はＰＤＧＦ－Ｒαについて抗体選択することであり得る。ある態様では、細胞集団は、望ましくない細胞型について陰性選択が実施されない可能性がある。ある態様では、ＯＰＣの陰性選択は、例えばフローサイトメトリー又はマグネットビーズを使用して、ＥｐＣＡＭ又はＣＤ４９ｆについて抗体選択することであり得る。

ある態様では、細胞集団の１つ以上の特徴は、フローサイトメトリーを使用して様々な細胞マーカーを定量することにより決定可能、例えば細胞集団のどれくらいのパーセンテージが、特定のマーカー又は一連のマーカーについて陽性か決定可能である。ある態様では、細胞集団は、約３０％～約１００％のＮＧ２陽性細胞、例えば少なくとも約３５％等、例えば少なくとも約４０％等、例えば少なくとも約４５％等、例えば少なくとも約５０％等、例えば少なくとも約５５％等、例えば少なくとも約６０％等、例えば少なくとも約６５％等、例えば少なくとも約７０％等、例えば少なくとも約７５％等、例えば少なくとも約８０％等、例えば少なくとも約８５％等、例えば少なくとも約９０％等、例えば少なくとも約９５％等、例えば少なくとも約９８％等、例えば少なくとも約９９％等、例えば少なくとも約９９．５％等、例えば少なくとも約９９．８％等、又は例えば少なくとも約９９．９％等のＮＧ２陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約３０％～約６０％のＮＧ２陽性細胞、例えば約３０％～約３５％等、例えば約３５％～約４０％等、例えば約４０％～約４５％等、例えば約４５％～約５０％等、例えば約３５％～約５５％等、例えば約４０％～５０％等、又は例えば約４３％～約４８％等のＮＧ２陽性細胞を含み得る。なおも別の態様では、細胞集団は、約４５％～約７５％のＮＧ２陽性細胞、例えば約４５％～約５０％等、例えば約５０％～約５５％等、例えば約５５％～約６０％等、例えば約６０％～約６５％等、例えば約６５％～約７０％等、例えば約７０％～約７５％等、例えば約５０％～約７０％等、例えば約５５％～約６５％等、又は例えば約５８％～約６３％等のＮＧ２陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約６０％～約９０％のＮＧ２陽性細胞、例えば約６０％～約６５％等、例えば約６５％～約７０％等、例えば約７５％～約８０％等、例えば約８５％～約９０％等、例えば約６５％～約８５％等、例えば約７０％～約８０％等、又は例えば約７３％～約７８％等のＮＧ２陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約７５％～約１００％のＮＧ２陽性細胞、例えば約７５％～約８０％等、例えば約８５％～約９０％等、例えば約９０％～約９５％等、例えば約９５％～約１００％等、例えば約８０％～約９５％等、例えば約８５％～約９０％等、又は例えば約７３％～約７８％等のＮＧ２陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、少なくとも約３０％のＮＧ２陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、少なくとも約４０％のＮＧ２陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、少なくとも約５０％のＮＧ２陽性細胞を含み得る。

ある態様では、細胞集団は、約８０％～約１００％のネスチン陽性細胞、例えば少なくとも約８５％等、例えば少なくとも約９０％等、例えば少なくとも約９５％等、例えば約９９％等、例えば少なくとも約９９．５％等、例えば少なくとも約９９．８％等、又は例えば少なくとも約９９．９％等のネスチン陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約８０％～約９０％のネスチン陽性細胞、例えば約８０％～約８５％等、又は例えば約８３％～約８８％等のネスチン陽性細胞を含み得る。なおも別の態様では、細胞集団は、約９０％～約１００％のネスチン陽性細胞、例えば約９０％～約９５％等、例えば約９５％～約９８％等、例えば約９８％～約９９％等、例えば約９９％～約９９．５％等、例えば約９９．５％～約９９．８％等、例えば約９９．８％～約９９．９％等、例えば約９９．９％～約１００％等、例えば約９０％～約９９．９％等、例えば約９５％～約９９．８％等、又は例えば約９８％～約９９．５％等のネスチン陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、少なくとも約９９％のネスチン陽性細胞を含み得る。

ある態様では、細胞集団は、約８０％～約１００％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞、例えば少なくとも約８５％等、例えば少なくとも約９０％等、例えば少なくとも約９５％等、例えば約９９％等、例えば約９９．５％等、例えば約９９．９％等、又は例えば少なくとも約１００％等のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約８０％～約９０％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞、例えば約８０％～約８５％等、例えば約８５％～約９０％等、又は例えば約８３％～約８８％等のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞を含み得る。なおも別の態様では、細胞集団は、約９０％～１００％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞、例えば約９０％～約９５％等、例えば約９５％～約９８％等、例えば約９８％～約９９％等、例えば約９９％～約９９．５％等、例えば約９９．５％～約９９．８％等、例えば約９９．８％～約９９．９％等、例えば約９９．９％～約１００％等、例えば約９０％～約９９．９％等、例えば約９５％～約９９．８％等、又は例えば約９８％～約９９．５％等のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、少なくとも約８０％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞を含み得る。

ある態様では、細胞集団は、約５０％のＮＧ２陽性細胞及び約８１％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約５０％のＮＧ２陽性細胞、約８１％のＰＤＧＦ－Ｒα陽性細胞、及び約９９％のネスチン陽性細胞を含み得る。

ある態様では、少なくとも約９０％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる。別の態様では、少なくとも約９０％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも２つを発現することができる。なおも別の態様では、少なくとも約９０％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうち少なくとも３つを発現することができる。別の態様では、少なくとも約９０％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも４つを発現することができる。ある態様では、少なくとも約９０％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２のすべてを発現することができる。ある態様では、約９０％～約１００％の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる。ある態様では、約９５％～約１００％、例えば約９８％～約１００％等、例えば約９９％～約１００％等、例えば約９９．５％～約１００％等、例えば約９９．８％～約１００％等、又は例えば約９９．９％～約１００％等の細胞集団が、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びＩＧＦ２からなる群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる。

ある態様では、細胞集団は、１つ以上の生物学的シグナル伝達因子を産生する能力を有し得る。ある態様では、細胞集団は、１つ以上の血管形成シグナル伝達因子を産生する能力を有し得る。ある態様では、血管形成シグナル伝達因子は、トロンボスポンジン－１、ｓｅｒｐｉｎｅ１、又はｓｅｒｐｉｎｅ２であり得る。ある態様では、細胞集団は、１つ以上の神経栄養シグナル伝達因子を産生する能力を有し得る。ある態様では、神経親和性シグナル伝達因子は、ＮＧＦ、ネトリン４、テネイシンＣ、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン３、ＳＬＩＴ１、又はＳＬＩＴ３であり得る。ある態様では、神経親和性シグナル伝達因子は、ＥＬＩＳＡにより検出可能である。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子は、グリア由来のネキシン１、ルミカン、ＴＩＭＰ２、ＩＧＦ２、ＭＭＰ１５、又はＶＥＧＦであり得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子は、デコリンであり得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子は、ミドカインであり得る。

ある態様では、生物学的シグナル伝達因子が、約５０ｐｇ／ｍｌを超える、例えば約１００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約２００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約３００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約４００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約５００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約１，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約２，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約３，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約４，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約５，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、例えば約６，０００ｐｇ／ｍｌを超える等、又は例えば約７，０００ｐｇ／ｍｌを超える等の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子が、約５０ｐｇ／ｍｌ～約１００，０００ｐｇ／ｍｌ、例えば約１００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８５０ｐｇ／ｍｌ等、例えば約９００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８，５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約９，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約９０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約９５，０００ｐｇ／ｍｌ等の範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子が、約５０ｐｇ／ｍｌ～約１，０００ｐｇ／ｍｌ、例えば約５０ｐｇ／ｍｌ～約１００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約１００ｐｇ／ｍｌ～約２００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２００ｐｇ／ｍｌ～約３００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３００ｐｇ／ｍｌ～約４００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４００ｐｇ／ｍｌ～約５００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５００ｐｇ／ｍｌ～約６００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６００ｐｇ／ｍｌ～約７００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７００ｐｇ／ｍｌ～約８００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８００ｐｇ／ｍｌ～約９００ｐｇ／ｍｌ等、又は例えば約９００ｐｇ／ｍｌ～約１，０００ｐｇ／ｍｌ等の範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子が、約１，０００ｐｇ／ｍｌ～約１０，０００ｐｇ／ｍｌ、例えば約１，０００ｐｇ／ｍｌ～約２，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２，０００ｐｇ／ｍｌ～約３，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３，０００ｐｇ／ｍｌ～約４，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４，０００ｐｇ／ｍｌ～約５，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５，０００ｐｇ／ｍｌ～約６，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６，０００ｐｇ／ｍｌ～約７，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７，０００ｐｇ／ｍｌ～約８，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８，０００ｐｇ／ｍｌ～約９，０００ｐｇ／ｍｌ等、又は例えば約９，０００ｐｇ／ｍｌ～約１０，０００ｐｇ／ｍｌ等の範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、生物学的シグナル伝達因子が、約１０，０００ｐｇ／ｍｌ～約１００，０００ｐｇ／ｍｌ、例えば約１０，０００ｐｇ／ｍｌ～約２０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約２０，０００ｐｇ／ｍｌ～約３０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約３０，０００ｐｇ／ｍｌ～約４０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約４０，０００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約５０，０００ｐｇ／ｍｌ～約６０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約６０，０００ｐｇ／ｍｌ～約７０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約７０，０００ｐｇ／ｍｌ～約８０，０００ｐｇ／ｍｌ等、例えば約８０，０００ｐｇ／ｍｌ～約９０，０００ｐｇ／ｍｌ等、又は例えば約９０，０００ｐｇ／ｍｌ～約１００，０００ｐｇ／ｍｌ等の範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含むに組成物より分泌され得る。

ある態様では、ミドカインが、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。別の態様では、デコリンが、約５００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。なおも別の態様では、ネトリン４が、約５００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、グリア由来のネキシン１が、約５００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ルミカンが、約５００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ＴＩＭＰ２が、約５００ｐｇ／ｍｌ～約５０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ＩＧＦ２が、約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０，０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ＭＭＰ１５が、約５０ｐｇ／ｍｌ～約５０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ＶＥＧＦが、約５０ｐｇ／ｍｌ～約５０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。ある態様では、ＮＧＦが、約５０ｐｇ／ｍｌ～約５０００ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＯＰＣを含む細胞集団を含む組成物により分泌され得る。

ある態様では、細胞集団は、本開示の実施例５に記載するような嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成する能力を有し得る。ある態様では、細胞集団は、本開示の実施例５に記載するような嚢胞アッセイにおいて、細胞約２００，０００個当たり、細胞約３００，０００個当たり、細胞約４００，０００個当たり、又は細胞約５００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成する能力を有し得る。

望ましくない細胞型
ある態様では、細胞集団は、約２０％未満の望ましくない細胞型、例えば約１９％未満等、例えば約１８％未満等、例えば約１７％未満等、例えば約１６％未満等、例えば約１５％未満等、例えば約１４％未満等、例えば約１３％未満等、例えば約１２％未満等、例えば約１１％未満等、例えば約１０％未満等、例えば約９％未満等、例えば約８％未満等、例えば約７％未満等、例えば約６％未満等、例えば約５％未満等、例えば約４％未満等、例えば約３％未満等、例えば約２％未満等、例えば約１％未満等、例えば約０．５％未満等、例えば約０．１％未満等、例えば約０．０５％未満等、又は例えば約０．０１％未満等の望ましくない細胞型を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約１５％～約２０％の望ましくない細胞型、例えば約１９％～約２０％等、例えば約１８％～約２０％等、例えば約１７％～約２０％等、例えば約１６％～約２０％等、例えば約１５％～約１９％等、又は例えば約１６％～約１８％等の望ましくない細胞型を含み得る。なおも別の態様では、細胞集団は、約１０％～約１５％の望ましくない細胞型、例えば約１４％～約１５％等、例えば約１３％～約１５％等、例えば約１２％～約１５％等、例えば約１１％～約１５％等、又は例えば約１２％～約１４％等の望ましくない細胞型を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約１％～約１０％の望ましくない細胞型、例えば約２％～約１０％等、例えば約１％～約９％等、例えば約２％～約８％等、例えば約３％～約７％等、又は例えば約４％～約６％等の望ましくない細胞型等を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．１％～約１％の望ましくない細胞型、例えば約０．２％～約１％等、例えば約０．１％～約０．９％等、例えば約０．２％～約０．８％等、例えば約０．３％～約０．７％等、又は例えば約０．４％～約０．６％等の望ましくない細胞型を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．０１％～約０．１％の望ましくない細胞型、例えば約０．０２％～約０．１％等、例えば約０．０１％～約０．０９％等、例えば約０．０２％～約０．０８％等、例えば約０．０３％～約０．０７％等、又は例えば約０．０４％～約０．０６％等の望ましくない細胞型を含み得る。ある態様では、低レベルの望ましくない細胞型は、約１５％未満の望ましくない細胞型の存在を示し得る。

ある態様では、望ましくない細胞型は、上皮系列細胞を含み得る。ある態様では、上皮系列細胞は、Ｋ７又はＰＣＫのうちの１つの存在により特徴付けられ得る。ある態様では、上皮系列細胞は、Ｋ７及びＰＣＫの両方の存在により特徴付けられ得る。

ある態様では、望ましくない細胞型は、Ｋ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約５％未満のＫ７陽性細胞、例えば約４％未満等、例えば約３％未満等、例えば約２％未満等、例えば約１．５％未満等、例えば約１％未満等、例えば約０．９％未満等、例えば約０．８％未満等、例えば約０．７％未満等、例えば約０．６％未満等、例えば約０．５％未満等、例えば約０．４％未満等、例えば約０．３％未満等、例えば約０．２％未満等、例えば約０．１％未満等、例えば約０．０９％未満等、例えば約０．０８％未満等、例えば約０．０７％未満等、例えば約０．０６％未満等、例えば約０．０５％未満等、又は例えば約０．０１％未満等のＫ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．０１％～約５％のＫ７陽性細胞、例えば約０．０５％等、例えば約０．１％等、例えば約０．２％等、例えば約０．３％等、例えば約０．４％等、例えば約０．５％等、例えば約０．６％等、例えば約０．７％等、例えば約０．８％等、例えば約０．９％等、例えば約１％等、例えば約１．５％等、例えば約２％等、例えば約２．５％等、例えば約３％等、例えば約３．５％等、例えば約４％等、又は例えば約４．５％等のＫ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約１％～約５％のＫ７陽性細胞、例えば約２％～約４％等、例えば約１％～約３％等、又は例えば約３％～約５％等のＫ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．１％～約１％、例えば約０．２％～約０．９％等、例えば約０．３％～約０．８％等、例えば約０．４％～約０．７％等、又は例えば約０．５％～約０．６％等のＫ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．０１％～約０．１％のＫ７陽性細胞、例えば約０．０２％～約０．０９％等、例えば約０．０３％～約０．０８％等、例えば約０．０４％～約０．０７％等、又は例えば約０．０５％～約０．０６％等のＫ７陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約２％未満のＫ７陽性細胞を含み得る。別の態様では、細胞集団は、約０．２％未満のＫ７陽性細胞を含み得る。

ある態様では、望ましくない細胞型は、ＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約１０％未満のＰＣＫ陽性細胞、例えば約９％未満等、例えば約８％未満等、例えば約７％未満等、例えば約６％未満等、例えば約５％未満等、例えば約４．５％未満等、例えば約４％未満等、例えば約３．５％未満等、例えば約３％未満等、例えば約２．５％未満等、例えば約２％未満等、例えば約１．５％未満等、例えば約１％未満等、例えば約０．５％未満等、例えば約０．１％未満等、例えば約０．０５％未満等、又は例えば、約０．０１％未満等のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．０１％～約１０％のＰＣＫ陽性細胞、例えば約０．０５％等、例えば約０．１％等、例えば約０．２％等、例えば約０．３％等、例えば約０．４％等、例えば約０．５％等、例えば約０．６％等、例えば約０．７％等、例えば約０．８％等、例えば約０．９％等、例えば約１％等、例えば約２％等、例えば約３％等、例えば約４％等、例えば約５％等、例えば約６％等、例えば約７％等、例えば約８％等、又は例えば約９％等のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約１％～約１０％のＰＣＫ陽性細胞、例えば約２％～約９％等、例えば約３％～約８％等、例えば約４％～約７％等、又は例えば約５％～約６％等のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．１％～約１％のＰＣＫ陽性細胞、例えば約０．２％～約０．９％等、例えば約０．３％～約０．８％等、例えば約０．４％～約０．７％等、又は例えば約０．５％～約０．６％等のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約０．０１％～約０．１％のＰＣＫ陽性細胞、例えば約０．０２％～約０．０９％等、例えば約０．０３％～約０．０８％等、例えば約０．０４％～約０．０７％等、又は例えば約０．０５％～約０．０６％等のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。ある態様では、細胞集団は、約５％未満のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。

ある態様では、ＯＰＣの集団は、約２％のＫ７陽性細胞及び約４％のＰＣＫ陽性細胞を含み得る。

配合物
ある態様では、本開示に係る組成物は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。ある態様では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含み得る。ある態様では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシドを含まない。ある態様では、組成物は、凍結保存用として適応され得る。

ある態様では、本開示に係る組成物は、対象の脊髄への直接注射により投与されるように配合され得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、対象への脳内、脳室内、髄腔内、鼻腔内、又は大槽内投与用として配合され得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、対象の脳内の梗塞キャビティー内、又はその直近への直接注射により投与されるように配合され得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、移植を通じて投与されるように配合され得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、溶液として配合され得る。

ある態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^６～約５×１０^８個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約１×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約３×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約４×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約５×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約６×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約７×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約８×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約９×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約１×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約３×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約４×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約５×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約６×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約７×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約８×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約９×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約１×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約３×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約４×１０^８個の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり約５×１０^８個の細胞等を含み得る。別の態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^８～約５×１０^８個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約１×１０^８～約４×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^８～約５×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約１×１０^８～約３×１０^８個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^８～約４×１０^８個の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり約３×１０^８～約５×１０^８個の細胞等を含み得る。なおも別の態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^７～約１×１０^８個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^７～約９×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約３×１０^７～約８×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約４×１０^７～約７×１０^７個の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり約５×１０^７～約６×１０^７個の細胞等を含み得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり約１×１０^６～約１×１０^７個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^６～約９×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約３×１０^６～約８×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり約４×１０^６～約７×１０^６個の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり約５×１０^６～約６×１０^６個の細胞等を含み得る。なおも別の態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０^６個の細胞、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約７×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約８×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約９×１０^６個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０^７個の細胞等、例えば１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０^７個の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０^７個の細胞等を含み得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、最大約１×１０^８個若しくはそれ超の細胞、例えば１ミリリットル当たり最大約２×１０^８個若しくはそれ超の細胞等、例えば１ミリリットル当たり最大約３×１０^８個若しくはそれ超の細胞等、例えば１ミリリットル当たり最大約４×１０^８個若しくはそれ超の細胞等、例えば１ミリリットル当たり最大約５×１０^８個若しくはそれ超の細胞等、又は例えば１ミリリットル当たり最大約６×１０^８個の細胞等を含み得る。

ある態様では、本開示に係る組成物は、１ミリリットル当たり約４×１０^７個～約２×１０^８個の細胞を含み得る。

なおも別の態様では、本開示に係る組成物は、約１０マイクロリットル～約５ミリリットル、例えば約２０マイクロリットル等、例えば約３０マイクロリットル等、例えば約４０マイクロリットル等、例えば約５０マイクロリットル等、例えば約６０マイクロリットル等、例えば約７０マイクロリットル等、例えば約８０マイクロリットル等、例えば約９０マイクロリットル等、例えば約１００マイクロリットル等、例えば約２００マイクロリットル等、例えば約３００マイクロリットル等、例えば約４００マイクロリットル等、例えば約５００マイクロリットル等、例えば約６００マイクロリットル等、例えば約７００マイクロリットル等、例えば約８００マイクロリットル等、例えば約９００マイクロリットル等、例えば約１ミリリットル等、例えば約１．５ミリリットル等、例えば約２ミリリットル等、例えば約２．５ミリリットル等、例えば約３ミリリットル等、例えば約３．５ミリリットル等、例えば約４ミリリットル等、又は例えば約４．５ミリリットル等の範囲の体積を有し得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、約１０マイクロリットル～約１００マイクロリットル、例えば約２０マイクロリットル～約９０マイクロリットル等、例えば約３０マイクロリットル～約８０マイクロリットル等、例えば約４０マイクロリットル～約７０マイクロリットル等、又は例えば約５０マイクロリットル～約６０マイクロリットル等の範囲の体積を有し得る。別の態様では、本開示に係る組成物は、約１００マイクロリットル～約１ミリリットル、例えば約２００マイクロリットル～約９００マイクロリットル等、例えば約３００マイクロリットル～約８００マイクロリットル等、例えば約４００マイクロリットル～約７００マイクロリットル等、又は例えば約５００マイクロリットル～約６００マイクロリットル等の範囲の体積を有し得る。なおも別の態様では、本開示に係る組成物は、約１ミリリットル～約５ミリリットル、例えば約２ミリリットル～約５ミリリットル等、例えば約１ミリリットル～約４ミリリットル等、例えば約１ミリリットル～約３ミリリットル等、例えば約２ミリリットル～約４ミリリットル等、又は例えば約３ミリリットル～約５ミリリットル等の範囲の体積を有し得る。ある態様では、本開示に係る組成物は、約２０マイクロリットル～約５００マイクロリットルの体積を有し得る。別の態様では、本開示に係る組成物は、約５０マイクロリットル～約１００マイクロリットルの体積を有し得る。なおも別の態様では、本開示に係る組成物は、約５０マイクロリットル～約２００マイクロリットルの体積を有し得る。別の態様では、本開示に係る組成物は、約２０マイクロリットル～約４００マイクロリットルの体積を有し得る。

容器
ある態様では、容器は、本開示に係る細胞集団を含む組成物を含み得る。ある態様では、容器は、凍結保存用として構成され得る。ある態様では、容器は、それを必要としている対象への投与用として構成され得る。ある態様では、容器はプレフィルドシリンジであり得る。

使用方法
本開示の態様は、治療を必要とする対象内の１つ以上の神経学的機能を改善するために、本明細書に記載するような複数のＯＰＣを含む細胞集団を使用する方法を含む。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、それを必要としている対象内に注射され得る、又は移植され得る。ある態様では、対象は、中枢神経系の機能的な改善を必要とし得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、脊髄損傷、脳卒中、又は多発性硬化症を治療するために、それを必要としている対象内に移植され得る。

ある態様では、本開示に係る細胞集団は、最大約１×１０^９個の細胞、例えば最大約１×１０^６個の細胞等、例えば最大約２５×１０^６個の細胞等、例えば最大約５０×１０^６個の細胞等、例えば最大約７５×１０^６個の細胞等、例えば最大約１００×１０^６個の細胞等、例えば最大約２００×１０^６個の細胞等、例えば最大約３００×１０^６個の細胞等、例えば最大約４００×１０^６個の細胞等、例えば最大約５００×１０^６個の細胞等、例えば最大約６００×１０^６個の細胞等、例えば最大約７００×１０^６個の細胞等、例えば最大約８００×１０^６個の細胞等、又は例えば最大約９００×１０^６個の細胞等を中枢神経系の損傷部位内に移植した場合、対象の約２％未満において異所性組織を産生する能力を有し得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、約１×１０^６個の細胞～約１×１０^９個の細胞、例えば約５０×１０^６個の細胞～約９００×１０^６個の細胞等、例えば約１００×１０^６個の細胞～約８００×１０^６個の細胞等、例えば約２００×１０^６個の細胞～約７００×１０^６個の細胞等、例えば約３００×１０^６個の細胞～約６００×１０^６個の細胞等、又は例えば約４００×１０^６個の細胞～約５００×１０^６個の細胞等を中枢神経系の損傷部位内に移植した場合、対象の約２％未満において異所性組織を産生する能力を有し得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、最大約１×１０^９個の細胞を中枢神経系の損傷部位内に移植した場合、対象の約２％未満において異所性組織を産生する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団は、最大約１×１０^９個の細胞を中枢神経系の損傷部位内に移植した場合、対象の約１％未満において異所性組織を産生する能力を有し得る。

ある態様では、本開示に係る細胞集団は、対象内の移植部位において脱有髄軸索の髄鞘形成を誘発する能力を有し得る。ある態様では、本開示の方法に従って事前治療を実施して生成した細胞集団は、事前治療を実施せずに産生された細胞集団と比較して、生着及び移動に関する能力において改善を示し得る。ある態様では、本開示の方法に従って事前治療を実施して生成した細胞集団は、事前治療を実施せずに産生された細胞集団と比較して、損傷後の修復又は神経組織の再生において改善を示し得る。

ある態様では、本開示に係る細胞集団は、該集団を、療法を必要とする対象に移植した後、該対象内の感覚機能を改善する能力を有し得る。ある態様では、感覚機能の改善は、脊髄損傷の神経学的分類に関する国際標準（ＩＳＮＣＳＣＩ）検査を使用して、例えばピンプリック及び瞬間的な接触感覚における右側及び左側の感覚レベルを決定するなどして評価され得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、該集団を、療法を必要とする対象に移植した後、該対象における運動機能を改善する能力を有し得る。ある態様では、細胞集団は、対象の運動機能を少なくとも２カ月間、持続可能に改善する能力を有し得る。ある態様では、細胞集団は、対象の運動機能を、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、又は少なくとも３年間、持続可能に改善する能力を有し得る。ある態様では、運動機能の改善は、立位能力若しくは体重支持の向上、四肢機能若しくは四肢強度の向上、歩行距離の向上、歩行速度の向上、腸若しくは膀胱機能の向上、腕若しくは手の動きの向上、又は握ること、掴むこと、若しくは捕捉することの向上であり得る。ある態様では、運動機能の改善は、ＩＳＮＣＳＣＩ検査等を使用して、例えば全身不随に対する右側及び左側の運動レベル、触診可能又は目視可能な収縮、能動運動、重力に対する最大関節可動域、及び十分な抵抗力を決定するなどして評価可能である。

ある態様では、本開示に係る細胞集団は、１２カ月以内に損傷誘発性の中枢神経系実質空洞の体積を低下させる能力を有し得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団は、６カ月以下、５カ月以下、４カ月以下、３カ月以下、２カ月以下、又は１カ月未満のうちに、損傷誘発性の中枢神経系実質空洞の体積を低下させる能力を有し得る。

ある態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、それを必要としている対象の中枢神経系内の第１の場所から１つ以上の第２の場所に移動する能力を有し得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脊髄から対象の脳内の患部組織に移動する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脊髄内の第１の場所から対象の脊髄内の患部組織に位置する第２の場所に移動する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脳内の第１の場所から対象の脳内の患部組織に位置する第２の場所に移動する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脳内の第１の場所から対象の脊髄内の患部組織に移動する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脊髄内の第１の場所から対象の脊髄内の患部組織に位置する第２の場所、並びに対象の脳内の１つ以上の患部組織に位置する１つ以上の場所に移動する能力を有し得る。１つの態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の脳内の第１の場所から対象の脳内の患部組織に位置する第２の場所、並びに対象の脊髄内の１つ以上の患部組織に位置する１つ以上の場所に移動する能力を有し得る。

ある態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の中枢神経系内の第１の場所から１つ以上の患部組織に位置する１つ以上の第２の場所に、約１５０日未満、例えば約１００日未満等、例えば約５０日未満等、又は例えば約１０日未満等のうちに移動する能力を有し得る。ある態様では、本開示に係る細胞集団に由来する１つ以上の細胞は、対象の中枢神経系内の第１の場所から１つ以上の患部組織に位置する１つ以上の第２の場所に、約１８０日以下で移動する能力を有し得る。

追加の実施形態
本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、１５％未満の望ましくない細胞型を含む、容器を含む。ある態様では、望ましくない細胞型は、上皮系列細胞を含む。ある態様では、上皮系列細胞は、Ｋ７及びＰＣＫからなる群から選択される１つ以上のマーカーの存在により特徴付けられる。ある態様では、細胞集団は、２％未満のＫ７陽性細胞を含む。ある態様では、細胞集団は、０．２％未満のＫ７陽性細胞を含む。ある態様では、細胞集団は、５％未満のＰＣＫ陽性細胞を含む。ある態様では、細胞集団は、共通の遺伝的背景を有する。ある態様では、細胞集団は、細胞富化を受けていない。ある態様では、容器は、凍結保存用に構成される。

本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成し得るものである、容器も含む。ある態様では、細胞集団は、損傷誘発性の中枢神経系実質空洞の体積を１２カ月以下で低下させる能力を有する。ある態様では、細胞集団は、対象の中枢神経系組織内の第１の場所から１つ以上の患部組織に位置する１つ以上の第２の場所に１８０日以下で移動し得るものである。ある態様では、中枢神経系組織は、脊髄組織である。ある態様では、中枢神経系組織は、脳組織である。ある態様では、細胞集団は、療法を必要とする対象に該集団を移植した後、該対象における運動機能を改善し得るものである。ある態様では、細胞集団は、少なくとも２カ月間、運動機能を持続可能に改善し得るものである。ある態様では、運動機能は、向上した立位能力又は体重支持である。ある態様では、運動機能は、向上した四肢機能又は四肢強度である。ある態様では、運動機能は、向上した歩行距離である。ある態様では、運動機能は、向上した歩行速度である。ある態様では、運動機能は、向上した腸又は膀胱機能である。ある態様では、運動機能は、向上した腕又は手の動きである。ある態様では、運動機能は、向上した握ること、掴むこと、又は捕捉することである。

本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、嚢胞アッセイにおいて、細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成し得るものである、容器も含む。ある態様では、細胞集団は、１つ以上の生物学的シグナル伝達因子を産生し得るものである。ある態様では、細胞集団は、血管形成シグナル伝達因子を産生し得るものである。ある態様では、血管形成シグナル伝達因子は、トロンボスポンジン－１、Ｓｅｒｐｉｎｅ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、及びその組合せからなる群から選択される。ある態様では、細胞集団は、神経栄養シグナル伝達因子を産生し得るものである。ある態様では、神経栄養因子は、ＮＧＦ、ネトリン４、テネイシンＣ、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン３、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ３、及びその組合せからなる群より選択される。ある態様では、１つ以上の生物学的シグナル伝達因子は、デコリンを含む。ある態様では、１つ以上の生物学的シグナル伝達因子は、ミドカインを含む。ある態様では、細胞集団は、対象内の移植部位において脱有髄軸索の髄鞘形成を誘発し得るものである。

本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含み、前記細胞集団が、最大１×１０^９個の細胞を中枢神経系損傷部位内に移植した場合、対象の２％未満において異所性組織を産生し得るものである、容器も含む。ある態様では、細胞集団は、最大１×１０^９個の細胞を中枢神経系損傷部位内に移植した場合、対象の１％未満において異所性組織を産生し得るものである。

本開示の上記態様は、細胞集団を含む組成物を更に含むことができ、前記細胞集団の少なくとも３０％が、ＮＧ２陽性細胞である。ある態様では、細胞集団の少なくとも４０％が、ＮＧ２陽性細胞である。ある態様では、細胞集団の少なくとも５０％が、ＮＧ２陽性細胞である。

本開示の態様は、組成物を含む容器であって、前記組成物が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の集団を含み、少なくとも９５％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９８％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９９％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９９．５％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する。ある態様では、１００％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９５％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９８％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９９％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する。ある態様では、少なくとも９９．５％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する。ある態様では、１００％のＯＰＣが、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する。

本開示の上記の態様は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。ある態様では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシドを含む。ある態様では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシドを含まない。

本開示の上記態様は、細胞集団を含む組成物を更に含むことができ、前記組成物は、１ミリリットル当たり少なくとも１×１０^６個の細胞を含む。ある態様では、組成物は、１ミリリットル当たり１×１０^６～５×１０^８個の細胞を含む。ある態様では、組成物は、１ミリリットル当たり４×１０^７～２×１０^８個の細胞を含む。ある態様では、組成物は、２０～５００マイクロリットルの体積を有する。ある態様では、組成物は、５０～２００マイクロリットルの体積を有する。ある態様では、組成物は、約１００マイクロリットルの体積を有する。ある態様では、組成物は、注射可能な溶液である。ある態様では、組成物は、凍結保存用に適合されている。

更に、本開示の態様は、多能性幹細胞を分化させる方法を含み、該方法は、複数の未分化幹細胞を事前治療することと関連する１つ以上のステップを含む。ある態様では、事前治療することと関連する１つ以上のステップは、拡大されたが未分化の幹細胞を、ある期間インキュベートすることを含み、その期間中に、未分化幹細胞は、１つ以上の幹細胞分化調節分子と接触する。ある態様では、１つ以上の幹細胞分化調節分子は、（１）ＳＭＡＤ／ＴＧＦβ－ＲＩＩシグナル伝達経路の一部であるＡＬＫ５の阻害剤；（２）ＢＭＰＲＩシグナル伝達経路の一部であるＡＬＫ２の阻害剤；（３）ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化させるＧＳＫ３阻害剤；及び（４）ＳＨＨ経路を活性化させる平滑化作動薬からなる群から選択される。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞を、４つの小分子：ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１、及びパルモルファミンと共に、ある期間インキュベートすることを含む。ある態様では、方法は、拡大されたが未分化の幹細胞集団を第１の期間インキュベートし、その期間中に、未分化幹細胞が２つ又はそれ超の第１の幹細胞分化調節因子と接触すること、及び該集団を第２の期間インキュベートし、その期間中に、該細胞が、２つ又はそれ超の第２の幹細胞分化調節因子と接触することを含む。ある態様では、２つ又はそれ超の第１の幹細胞分化調節因子は、２つ又はそれ超の第２の幹細胞分化調節因子とは異なる。ある態様では、２つ又はそれ超の第１の幹細胞調節因子は、２つ又はそれ超の第２の幹細胞調節因子と同一である。ある態様では、第１及び第２の幹細胞調節因子は、少なくとも１つの共通する調節因子を共有する。ある態様では、第１及び第２の幹細胞調節因子は、２つ又はそれ超の共通する調節因子、例えば３つ又はそれ超の共通する調節因子等、例えば４つ又はそれ超の共通する調節因子等を共有する。

ここまで、本発明について一般的に記載してきたが、本発明は、下記の実施例を参照することにより、より容易に理解される。但し、該実施例は実例として提示され、また規定されない限り本開示を制限するように意図されない。

実施例１－事前治療を含むＯＰＣ集団を産生する方法
Ｈ１系に由来する未分化ヒト胚性幹細胞（ｕｈＥＳＣ）（ＷＡ０１；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ ＪＪ、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＶＳ、Ｊｏｎｅｓ ＪＭ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８年１１月６日；２８２（５３９１）：１１４５－７）を、８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＨＧ０２６３）、及び０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２４０－Ｂ）が補充されたＸ－ＶＩＶＯ１０培地で１：３０希釈した、ＫＯ－ＤＭＥＭ中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ上で培養した。細胞の継代培養後の２日から始めて培地を毎日完全に交換した。未分化ヒト胚性幹細胞を、コラゲナーゼ及び手作業でのスクレーピングを使用して継代培養した。

ｕｈＥＳＣを小分子の混合物に曝露して細胞を刺激した後、分化を誘発した。分化開始前の継代培養では、細胞を、約０．８～１．０×１０^５個の細胞／ｃｍ^２で播種し、そして前回培養と同様に培養した。ｕｈＥＳＣが３０～５０％のコンフルエンスに達したら、培地を、最終濃度がＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４３１７）について１０μＭ、ドルソモルフィン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ｐ５４９９）について２μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号０４－０００４）について３μＭ、及びパルモルファミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号０４－０００９）について０．５μＭの小分子が添加されたグリア前駆細胞培地に変更した。小分子を含むグリア前駆細胞培地を、４日間、毎日交換した。４日目に、グリア前駆細胞培地を、小分子の添加について、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．５μＭのパルモルファミン、及び１５０μＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ４５４４）とする更なる変更を加えて交換した。添加小分子を含む培地を、次の３日間、毎日交換した後、分化を開始した。

事前治療されたｕｈＥＳＣのＯＰＣへの分化を、コラゲナーゼＩＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７１０４－０１９）及び０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２５３００－０５４）を連続して使用して、サロゲートフラスコを用いながら細胞を計測して定量化用の単細胞懸濁物を実現すること、及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用して残りの事前治療された細胞培養物を採取することにより開始した。ｕｈＥＳＣ培養物を、ウルトラローアタッチメント（ＵＬＡ）容器内に播種して、Ｘ－ＶＩＶＯ１０とグリア前駆細胞培地（ＧＰＭ）の１：１混合物中、７．３３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の密度で胚様体（ＥＢ）を形成した。分化の翌日、Ｘ－ＶＩＶＯ１０とＧＰＭの１：１混合物を使用して完全な培地交換を実施した。この当日、ＧＰＭを、２ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、及び１０μＭのレチノイン酸を含むＤＭＳＯ（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ－２６２５）で補充した。分化の２日目以降、培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び１０μＭのＲＡのみが補充された１００％のＧＰＭであった。この培地を９日目まで毎日置換した。９日目から２７日目まで、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＧＰＭ培地を１日おきに交換した。２７日目に、分化開始時に播種されたＵＬＡ表面１ｃｍ^２当たり２ｃｍ^２の比で、ＥＢをＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲでコーティングされた容器上に播いた。分化全体の残りの部分で使用される培養培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＧＰＭであった。２７日目から、完全培地交換を、細胞培養物に１日おきに施した。３４日目に、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して剥離させた細胞培養物をカウントし、そしてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲコーティング容器上に５×１０^４個の生存細胞／ｃｍ^２で播種した。ＧＰＭを、３４日目から７日経過した最終採取まで１日おきに置換した。

４１日目のＯＰＣの採取は、２０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅが補充された０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｐ２４－５５１３Ｐ３）と、０．０１％のプルロニック－Ｆ６８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２４０４０－０３２）の混合物を含む。ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地と、２０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ及び０．０１％のプルロニック－Ｆ６８が補充されたＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ ＦＲＳ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カタログ番号１０１１０４）との１：１混合物中に、剥離細胞をプールした後、カウントを行い、そして凍結保存前にＣｒｙｏＳｔｏｒ５中で再配合した。

図５Ａは、実施例に係る方法により生成したＯＰＣ中に発現したＮＧ２、Ｋ７、及びＰＣＫマーカーレベルの変化を、本明細書に記載する小分子を用いた事前治療を行わずに生成したＯＰＣと比較して示す。事前治療ステップを実施して生成したＯＰＣは、より高レベルのＮＧ２、及びより低レベルのＫ７及びＰＣＫを発現する。

実施例２－事前治療を含むＯＰＣ集団を産生する代替法の比較
Ｈ１系に由来する未分化ヒト胚性幹細胞（ｕｈＥＳＣ）（ＷＡ０１；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ ＪＪ、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＶＳ、Ｊｏｎｅｓ ＪＭ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年１１月６日；２８２（５３９１）：１１４５～７）を、下記のマトリックスのうちの１つの上で培養した：ＫＯ－ＤＭＥＭ中で１：３０に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ、組換えラミニン５２１（Ｃｏｒｎｉｎｇセルフコート、カタログ番号３５４２２１又はＰｕｒｅＣｏａｔ）、又は８０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＨＧ０２６３）及び０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２４０－Ｂ）が補充されたＸ－ＶＩＶＯ１０培地を用いたＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ希釈バッファー（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７１８３）に溶解したビトロネクチン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７１８０）。細胞の継代培養後の２日から始めて、培地を毎日完全に交換した。未分化ヒト胚性幹細胞を、コラゲナーゼ及び手作業でのスクレーピング又はその他の非酵素的手段、例えばＰＢＳ又はＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号５８７２）に溶解した０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５７５－０２０）等を使用して継代培養した。

ｕｈＥＳＣを、小分子の混合物に曝露して細胞を刺激した後、分化を誘発した。分化開始前の継代培養では、細胞を、約０．２～１．３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２で播種し、そしてこれまでの継代培養と同様に培養した。ｕｈＥＳＣが３０～５０％のコンフルエンスに達したら、培地を、最終濃度がＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４３１７）について１０μＭ、ドルソモルフィン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ｐ５４９９）について２μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号０４－０００４）について３μＭ、及びパルモルファミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号０４－０００９）について０．５μＭで添加された小分子を含むグリア前駆細胞培地（ＧＰＭ、本明細書に記載の通り）に変更した。小分子を含むグリア前駆細胞培地を、４日間、毎日交換した。４日目に、グリア前駆細胞培地を、小分子の添加について、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．５μＭのパルモルファミン、及び１５０μＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ４５４４）とする更なる変更を加えて交換した。添加された小分子を含む培地を、次の３日間、毎日交換した後、分化を開始した。

事前治療されたｕｈＥＳＣのＯＰＣへの分化を、次に、コラゲナーゼＩＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７１０４－０１９）及び０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２５３００－０５４）を連続して使用して、サロゲートフラスコを用いながら細胞を計測して定量化用の単細胞懸濁物を実現すること、及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用して残りの事前治療された培養物を採取することにより開始した。事前治療されたｕｈＥＳＣ培養物を、ウルトラローアタッチメント（ＵＬＡ）容器内に播種すると、Ｘ－ＶＩＶＯ１０と、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１０５６５－０１８、２％のＢ２７サプリメント、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１７５０４－０４４、４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＧ０３１１）が補充された０．０４μｇのトリヨードチロニン、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ５５１６－１ＭＧから構成されるグリア前駆細胞培地（ＧＰＭ）との１：１混合物中、７．３３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の密度で胚様体（ＥＢ）が形成された。或いは、ＵＬＡ組織培養容器を使用するのではなく、事前治療された培養物を撹拌された懸濁系、例えば、１．８×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度、及び２５ｒｐｍで撹拌された０．１ＬのデスポーザブルＰＢＳスピナーフラスコ等中で培養してＥＢを形成した。分化の翌日、Ｘ－ＶＩＶＯ１０とグリア前駆細胞培地又はＧＰＭの１：１混合物を使用して、完全な培地交換を実施した。この当日、ＧＰＭを、２ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、及び１０μＭのレチノイン酸を含むＤＭＳＯ（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ－２６２５）で補充した。分化の２日目から始めて、培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び１０μＭのＲＡのみが補充された１００％のＧＰＭであった。この培地を９日目まで毎日置換した。９日目から始めて２７日目まで、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＧＰＭ培地を１日おきに交換した。２７日目に、分化開始時に播種されたＵＬＡ１ｃｍ^２、又は懸濁物３０ｍＬ当たり２ｃｍ^２の比で、ＥＢをＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ、又は組換えラミニン又はビトロネクチンでコーティングされた容器上に播いた。分化全体の残りの部分で使用される培養培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＧＰＭであった。２７日目から、完全培地交換を細胞培養物に１日おきに施した。３４日目に、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ、又はＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２８５９）を使用して剥離させた細胞培養物をカウントし、そしてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ、組換えラミニン、又はビトロネクチンでコーティングした容器上に、５×１０^４個の生存細胞／ｃｍ^２で播種した。ＧＰＭを、３４日目から７日経過した最終採取まで１日おきに置換した。

４１日目のＯＰＣの採取は、２０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｐ２４－５５１３Ｐ３）が補充された０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ又はＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔと、０．０１％のプルロニック－Ｆ６８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２４０４０－０３２）の混合物を使用した。ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地と、２０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ及び０．０１％のプルロニック－Ｆ６８が補充されたＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ ＦＲＳ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カタログ番号１０１１０４）との１：１混合物中に剥離細胞をプールした後、カウントし、そして凍結保存前にＣｒｙｏＳｔｏｒ５中で再配合した。

実施例に従って、小分子を用いてｕｈＥＳＣを事前治療した場合、そのＯＰＣにおけるＮＧ２、Ｋ７、及びＰＣＫマーカーレベル発現に与える効果を、異なる培養条件にわたり評価した（図５Ｂ～図５Ｆを参照）。事前治療ステップを実施して生成したＯＰＣは、より高レベルのＮＧ２、及びより低レベルのＫ７及びＰＣＫを発現する。ｕｈＥＳＣの拡大段階において下記の条件下でＯＰＣが生成した：ＸＶＩＶＯ１０培養培地及び組換えラミニンマトリックス、拡大したＥＳ細胞を採取するのにコラゲナーゼＩＶを使用（図５Ｂ１－Ａを参照）。ｕｈＥＳＣの拡大段階において下記の条件下でＯＰＣが生成した：ＸＶＩＶＯ１０培養培地及び組換えラミニンマトリックス、拡大したＥＳ細胞を採取するのにコラゲナーゼＩＶを使用；事前治療された培養物を、その後、デスポーザブルＰＢＳスピナーフラスコ内で培養する一方、対照とされた培養物をＵＬＡ容器内で培養する（図５Ｂ２－Ａを参照）。ｕｈＥＳＣの拡大段階において下記の条件下でＯＰＣが生成した：ＸＶＩＶＯ１０培養培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ、拡大したＥＳ細胞を採取するのにコラゲナーゼＩＶを使用；事前治療された培養物及び対照培養の両方を、その後デスポーザブルＰＢＳスピナーフラスコ内で培養する（図５Ｃを参照）。ｕｈＥＳＣの拡大段階において下記の条件下でＯＰＣが生成した：ＸＶＩＶＯ１０培養培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＧＦＲ、拡大したＥＳ細胞を採取するのにコラゲナーゼＩＶを使用（図５Ｄ及び図５Ｅを参照）。ｕｈＥＳＣの拡大段階において下記の条件下でＯＰＣが生成した：拡大したＥＳ細胞を採取するのにＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用したＸＶＩＶＯ１０培養培地及びビトロネクチンマトリックス；培養物を、その後ビトロネクチンマトリックス上で培養しながら、これに短い事前治療を施し、そしてＥＤＴＡを用いた分化前に採取する（図５Ｆを参照）。

実施例３－フローサイトメトリーによる細胞集団の特徴付け
特別なマーカーの同定を通じて、分化した集団中に存在するＯＰＣの相対的な割合を定量化するのにフローサイトメトリーを使用した。特に、マーカー、例えばＮＧ２、ネスチン、及びＰＤＧＦ－Ｒα等を、各集団について定量した。

細胞表面マーカーの発現を検出するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして非特異的結合部位をブロックするために１０％のヤギ血清を含有する染色バッファー（２％のＦＢＳ及び０．５％のアジ化ソーダを含むＰＢＳ）中でインキュベートした。次に、目的とするマーカー（とりわけ例えば、ＮＧ２、ネスチン、ＰＤＧＦ－Ｒα、Ｋ７、パン－サイトケラチン等）を特異的に認識する抗体、及びそのアイソタイプ対照を、細胞と共にインキュベートした。未結合の抗体を、染色バッファーを用いて洗浄することにより除去し、そして抗体が蛍光物質と結合していない場合、細胞に結合した抗体を、蛍光物質と共役した抗抗体を使用して検出した。細胞を洗浄し、そしてヨウ化プロピジウムを、次に死細胞を区別するために添加した。細胞をフローサイトメーター、例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ等上で取得し、そして生存細胞のみを分析した。所与のマーカーを発現する細胞のパーセンテージを、特異的抗体に結合した細胞のパーセントからアイソタイプ対照抗体と非特異的結合した細胞のパーセントを減じることにより計算した。細胞１個当たりのマーカー発現の程度をアイソタイプ対照染色細胞の蛍光強度に対するマーカー位置集団の蛍光強度の比として計算した。

表２は、本開示の実施形態に係る方法により、未分化細胞の事前治療を実施した場合、又は実施しない場合に産生したＯＰＣ間の代表的なマーカー発現の比較である。本明細書に記載するような事前治療を含む方法は、事前治療を実施しない分化法と比較して、それよりも有意に高いＯＰＣマーカーであるＮＧ２及びＰＤＧＦ－Ｒα、並びに低い非ＯＰＣマーカー、例えばＯｃｔ４、Ｔｒａ－１－６０、Ｋ７、及びＰＣＫ等を発現するＯＰＣを産生した。

表３は、本開示の実施形態に係る方法の変法により産生したＯＰＣ間の代表的なマーカー発現の比較である。カラムの表題「ステージＩ培地」及び「ステージＩプロセス」は、ｕｈＥＳＣの拡大段階期間中に適用した条件を表す一方、カラムの表題「ステージＩＩプロセス」は適用された事前治療ステップの種類を表す：（１）対照－培養物にフラスコ又はスピナーフラスコ内での事前治療を実施しない；（２）事前治療；（３）スピナーフラスコ内での事前治療、又は（４）ビトロネクチンマトリックス上での培養と並行して行われる短い事前治療。すべての試験条件において、対照と比較したとき、事前治療を実施して産生したＯＰＣにおいてＮＧ２の発現が増加する一方、上皮マーカーであるＫ７及びＰＣＫは、対照と比較したとき、事前治療を実施して産生したＯＰＣにおいて減少した。

実施例４－遺伝子発現プロファイリングによる細胞集団の特徴付け
遺伝子発現プロファイリングが、最終ＯＰＣ集団、及び開始ｈＥＳＣ集団からの誘導期間中の両方に存在する細胞型を更に特徴付けるのに利用可能である。遺伝子発現プロファイリングには、マイクロアレイ及びＲＮＡ－ｓｅｑ等の方法を使用するグローバルトランスクリプトームプロファイリング、及び高感度化した方法、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等を使用する標的化遺伝子プロファイリングの両方が含まれる。

遺伝子発現プロファイリングを実施するために、製造業者のガイドラインにより、細胞を、ＱｉａｇｅｎのＲＬＴ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ番号７９２１６）等の核酸安定化溶液中で溶解し、そしてＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ番号７４１０６）等の標準的な抽出キットを使用して精製した。ｑＰＣＲに基づく分析では、精製後のＲＮＡを、次に、製造業者のガイドラインに従い、ＱｉａｇｅｎのＲＴ２ Ｅａｓｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ番号３３０４２１）等の標準的な方法によりｃＤＮＡに変換した。標的遺伝子及び参照ハウスキーピング遺伝子の相対的な発現レベルを、次に、事前に作製したｑＰＣＲアレイ、例えばＱｉａｇｅｎのＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ番号３３０２３１）等、又は個々のプローブ、例えばＱｉａｇｅｎのＲＴ２ ｑＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ（Ｑｉａｇｅｎ番号３３０００１）等を使用して、製造業者のガイドラインにより定量化した。所与の標的遺伝子について、その一連の相対的な発現レベルを決定するために、ＰＣＲ反応を、標準的なリアルタイムＰＣＲ機器、例えばＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等又は同等機上で実施した。各標的遺伝子を、１つ以上の参照遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ等に対して標準化して、その相対的な発現レベルを決定した。

マイクロアレイ分析では、精製後のＲＮＡが、製造業者のガイドラインにより、標準的な方法、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＷＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ番号９０２２８１）等を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築するのに利用可能、全トランスクリプトームアレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＵＧＥＮＥ２．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ番号９０２１１３）等にハイブリダイズ可能、及び標準的な装置、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ３０００ ７Ｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｅｍｅｔｒｉｘ番号００－０２１３）等を使用して分析可能である。得られたマイクロアレイデータは、次に標準化可能であり、そして相対的な遺伝子発現に関する後続的分析が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）又は同等品を用いて実施可能である。

表４は、本開示の実施形態に係る方法により、未分化細胞の事前治療を実施して、又は実施しないで生成したＯＰＣ内の神経／グリア前駆細胞遺伝子、外胚葉／神経外胚葉系列遺伝子、及び非神経外胚葉系列遺伝子の代表的なｑＰＣＲ分析結果を示す。ここでは、ＲＮＡサンプルを、分化の９日目に収集し、そして上記方法を使用してｑＰＣＲ用に処理した。４つの神経／グリア前駆細胞遺伝子：ＦＡＢＰ７、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＫＸ２．２、及びＯＬＩＧ２について定量する。４つの初期外胚葉／神経外胚葉系列遺伝子：ＦＧＦ５、ＦＯＸＡ１、ＧＡＤ１、及びＧＡＤ２について定量した。５つの初期非神経外胚葉系列遺伝子：ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＭＹＬ３、ＮＰＰＡ、及びＯＴＸ２について定量した。Ｈ１ ｈＥＳＣ６ＯＰＣ ｄ９に対する倍数を、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として、ΔΔＣＴ法を使用して計算した。

表４を参照すると、本開示の態様に従って事前治療を伴う方法により生成したＯＰＣは、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣと比較して、神経／グリア前駆細胞遺伝子発現の有意な増加を示す。すなわち、神経／グリア細胞前駆体遺伝子であるＦＡＢＰ７、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＫＸ２．２、及びＯＬＩＧ２は、事前治療を伴う方法により産生したＯＰＣ内で多く発現した。初期外胚葉／神経外胚葉系列遺伝子ＧＡＤ２も、事前治療を実施しないで生成したＯＰＣと比較して、事前治療を伴う方法により生成したＯＰＣ内で有意に低下した。更に、事前治療を実施しない方法と比較したとき、本開示に係る事前治療を含む方法は、栄養芽細胞系列遺伝子、Ｈａｎｄ１の発現低下を含む、分化プロセス期間中に非神経外胚葉系列遺伝子の発現低下を引き起こした。

本開示に従って、事前治療を実施しない方法により産生したＯＰＣと、事前治療を実施する方法を使用して産生したＯＰＣを比較するのに、遺伝子発現プロファイリングを使用したとき、類似性及び相違性の両方が認められた。両種類の方法は、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＤＣＮ、及びＩＧＦ２等のマーカーも発現したＮＧ２－陽性ＯＰＣの集団を産生した。しかしながら、本開示に従って、事前治療を含む方法を使用してＯＰＣを生成したとき、Ｋ７やＣＤＨ１／Ｅ－カドヘリン等の上皮関連遺伝子を含む、その他の細胞型と関連した遺伝子の発現は低下した。

実施例５－ＩＮ ＶＩＴＲＯでの嚢胞アッセイを使用した、望ましくない上皮系列細胞の評価
ｈＥＳＣから生成したＯＰＣ集団中の望ましくない上皮系列細胞の存在を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞アッセイを使用して試験した。Ｄｅｂｎａｔｈらの記載に従い、但し下記の改変を加えて、嚢胞アッセイを実施した：（１）２４ウェルプレート内、各ウェルに細胞４０，０００個のインプットで細胞を培養した；（２）上皮細胞が増殖し、そして上皮構造が拡大する時間をより多く確保するために、最長３５日間、細胞を培養した；（３）免疫蛍光染色法及びＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は類似した自動化画像システムを使用した全ウェル画像取得により、嚢胞構造を検出した；並びに（４）嚢胞の頻度及びサイズを、分析ソフトウェア、例えばＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）等を使用して定量化した。（Ｄｅｂｎａｔｈ Ｊ、Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ ＳＫ、Ｂｒｕｇｇｅ ＪＳ、Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＭＣＦ－１０Ａ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｃｉｎｉ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３年６月；３０（３）：２５６～６８）。

特に、嚢胞形成能力を試験するために、上皮嚢胞形成を刺激することが公知の因子の存在下で、２０～３５日間、細胞を３Ｄ培養システム内で増殖させた。嚢胞の視覚的検出に付加して、上皮マーカー、ＣＤ４９ｆの基底部タンパク質発現を含む嚢胞構造の存在も、免疫細胞化学を使用して評価した。更に、嚢胞アッセイにより測定される活性レベルとｉｎ ｖｉｖｏでの嚢胞活性との間の相関関係を確認するために、受傷齧歯類を対象として上皮マーカー及び嚢胞形成を検出するのに、フローサイトメトリーを利用した。

事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞アッセイにおいて試験したとき、様々なレベルの上皮嚢胞形成が認められた。図６Ａを参照すると、左側及び中央のパネルは、事前治療を実施しない方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの代表的なピクトグラフであり、大型及び小型の嚢胞構造をそれぞれ示す。一方、本開示に従って、事前治療を実施する方法により生成したＯＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞アッセイにおいて試験したとき、異なる結果が認められた。図６Ａの右側のパネルは、本開示に係る事前治療を含む方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの代表的なピクトグラフであり、嚢胞構造が存在しないことを示す。

嚢胞アッセイにおいて嚢胞を形成したＯＰＣロットを、成熟齧歯類の損傷した脊髄に投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏで上皮様の嚢胞構造が形成された。図６Ｂを参照すると、頚髄損傷及び事前治療を実施しない方法により生成したＨ１ ｈＥＳＣ由来のＯＰＣの投与から９カ月後の成熟雌ラットの代表的な組織学を、異なる倍率、異なる組織学的染色で示す。図６Ｂの上段パネルは、損傷／ＯＰＣグラフト部位を含有するヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色脊髄組織の低倍率画像である。黒色のボックスは、上皮嚢胞構造の場所を示す。図６Ｂの下段パネルは、様々な組織学的染色で染色された上皮嚢胞構造の高倍率画像を示す。下段左側のパネルは、Ｈ＆Ｅ染色法を示す。下段中央のパネルは、エオシンとヒト特異的プローブ、ｈＡＬＵによる染色を示し、構造内にヒト細胞の存在が確認された。下段右側のパネルは、エオシンと細胞増殖マーカー、Ｋｉ６７による染色を示し、嚢胞内細胞増殖活性が最小限にとどまることを示している。最後に、図６Ｃは、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣのいくつかの集団における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの嚢胞カウントに対するｉｎ ｖｉｖｏでの嚢胞形成頻度の直線回帰プロットであり、この動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された嚢胞の数は、嚢胞形成頻度と相関関係を有することが確認された。

対照的に、事前治療を実施する本開示に係る方法を使用して生成したＯＰＣは、フローサイトメトリーによれば低レベルの上皮マーカーを発現し、また嚢胞アッセイにおいて上皮嚢胞を形成しなかった（図６Ａ、右側パネル）。表５を参照すると、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣは、本開示に従って、事前治療を実施する方法を使用して産生したＯＰＣと比較して、それよりも有意に多くの嚢胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生した。

嚢胞アッセイにおいて形成される嚢胞の形成頻度及び嚢胞のサイズは、齧歯類の損傷した脊髄において異所性嚢胞構造を形成する集団の相対的な能力と正の相関関係を有するので、本開示に従って、事前治療を実施する方法を使用して生成したＯＰＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで上皮嚢胞を形成しないと期待される。

実施例６－ＯＰＣの生着
哺乳動物の中枢神経系内に生着し、及び損傷部位に向かって移動するＯＰＣ集団の能力は、その生物学的活性の重要な指標であり、またその能力の潜在的指標である。更に、損傷誘発性の空洞及び損傷部位内の有髄軸索の存在は、損傷後の修復／再生の潜在的代用指標として測定可能である。

脊髄損傷の齧歯類モデルにおいて生着／移動及び損傷後の修復／再生を評価するために、成熟雌胸腺欠損ヌードラットを使用した。ＯＰＣ移植前に、所望の損傷場所（例えば、頚椎損傷の場合、Ｃ５－Ｃ６）において、ラットに椎弓切除術を施し、そしてＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ Ｉｍｐａｃｔｏｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ番号ＩＨ－０４００又は同等機器）を使用して、製造業者のガイドラインによって半挫傷／挫滅傷を引き起こした。損傷後、約１週間～１カ月において、ＯＰＣを２．４×１０^５～２．４×１０^６の用量で、損傷部位に隣接した脊髄に直接移植した。移植後、２週間～１２カ月において、動物を絶命させ、そして組織を標準的な組織学的方法を使用して処理する。生着及び移動を評価するために、製造業者のガイドラインによって、固定した脊髄組織切片を、ヒト特異的プローブ、例えば抗ヒト核抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＭＡＢ１２８１）等で染色した後、適切な比色分析法又は蛍光剤コンジュゲート型二次抗体が続いた。損傷誘発性の空洞を評価するために、固定した脊髄組織切片を、標準的な組織学的方法を使用して、ヘマトキシリン及びエオシン溶液で染色した。明視野観察法による収集画像を、標準的な画像化ソフトウェア、例えばＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）等を使用して空洞面積を測定するのに使用した。損傷部位内の有髄線維の相対的存在量を評価するために、固定した脊髄組織切片を、標準的な組織学的方法を使用してエリオクロムシアニンで染色し、そして明視野観察法により画像化した。

ＯＰＣが、事前治療を実施しない方法により生成し、そして上記のように評価したとき、いくつかの観察所見が認められた。第１に、移植された細胞は、移植後最長１２カ月間、ロバストな生着を示し、また移植後２週間ほどの早期に損傷部位まで移動する。脊髄損傷が施され、媒体が移植されたラットと比較して、このようなＯＰＣが移植されたラットは、移植後２週間ほどの早期に、損傷誘発性の空洞の低下を示したが、またこの効果は移植後最長１２カ月間持続した。更に、有髄軸索が損傷部位内で目視可能であり、それは移植後約３カ月に開始して、移植後最長１２カ月まで増加したものの、有髄軸索は、媒体で治療された受傷ラットに一般的に認められる空洞部位を横断することはできなかった（このような観察所見の例としてＰｒｉｅｓｔ ＣＡ、Ｍａｎｌｅｙ ＮＣ、Ｄｅｎｈａｍ Ｊ、Ｗｉｒｔｈ ＥＤ ３ｒｄ、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ＪＳ、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ、Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１５年１１月；１０（８）：９３９～５８を参照）。

図７を参照すると、成熟雌ラットにＣ５頚髄挫傷を施し、本開示に従って事前治療を伴う方法を使用して生成したＯＰＣを移植した。移植後、２週間において、生着した細胞を標識するために抗ヒト核抗体（ｈＮＵＣ）を用いて、またすべての細胞核を標識するためにＤＡＰＩを用いて、縦方向の脊髄切片を免疫蛍光的に染色した。図７は、ＤＡＰＩ（左側パネル）及びｈＮＵＣ（右側パネル）で標識され、そしてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２上で画像化された損傷部位（白矢印）を示す。本開示に従って事前治療を伴う方法により生成したＯＰＣは、移植後２週間においてロバストな生着、及び損傷部位に向かう移動を示した。

実施例７－脳卒中を治療するためのＯＰＣ集団の使用
本開示に係る方法を使用して生成したＯＰＣは、脳卒中を治療するのに利用可能である。機能的な改善を示すために、これまでに確立された皮質下白質脳卒中のマウスモデル（Ｓｏｚｍｅｎら（２００９）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ１８０（２）：２６１；Ｈｉｎｍａｎら（２０１３）、Ｓｔｒｏｋｅ４４（１）：１８２）が、免疫不全ＮＳＧマウスに適用可能である（Ｓｈｕｌｔｚら（２００７）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０：１１８；ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｎｏｄ－ｓｃｉｄ－ｇａｍｍａ）。

特に、限局性虚血性病変を誘発するために、Ｎ５－（１－イミノエチル）－Ｌ－オルニチン、ジヒドロクロリド（Ｌ－Ｎｉｏ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を各マウス脳の脳梁に直接注射する。その後、１００，０００個のＯＰＣ／マウス（高用量）、又は１０，０００個のＯＰＣ／マウス（低用量）を、脳卒中後７日目に、脳卒中病変コアに隣接して、１μＬの単回用量として注射する。実験タイムラインの例を図８に示す。神経学的回復を毎月の行動試験により評価する。

２種類の行動試験が、この研究で実施され得る：グリッド歩行試験及びシリンダー試験。

グリッド歩行試験では、動物は、開口部を有する持ち上げられた水平化されたグリッド上に配置される。脳の損傷がない動物は、一般的に、グリッドに沿って移動しながら自身を保持するためにその足をワイヤーフレーム上に正確に配置する。開口したグリッドに足を滑らせる毎に、「フットフォールト」が記録される。肢毎の対側性及び同側性のフォールトについて、その両方の数を、ステップを踏んだ合計数と比較し、次いでフットフォールトインデックスを使用してスコア化する。

シリンダー試験では、動物は、透明なプレキシガラスシリンダーに配置され、観察される。マウスは、その後肢上で棒立ちとなり、その前肢及び鼻毛を用いて表面を探索することにより、垂直方向の表面を積極的に探索する。シリンダー内での行動を評価する際には、右側前肢、左側前肢、及び両側前肢同時について認められた独立した壁面配置の数が記録される。

試験群は、合計７２匹のマウスを使用して構成され得るが、各１２匹のマウスが下記のサブグループに割り振られる：（１）対照（偽手術）、（２）脳卒中単独、（３）非脳卒中動物へのＯＰＣ移植（低用量ＯＰＣで半数に移植、高用量ＯＰＣで他方の半分に移植）、（４）低用量ＯＰＣを脳卒中病変に隣接して脳卒中動物に移植、（５）高用量ＯＰＣを脳卒中病変に隣接して脳卒中動物に移植、及び（６）高用量ＯＰＣを脳卒中動物の脳卒中病変中に移植。

実施例に従って実施された実験から生成され得る予想データを図９及び図１０に示す。

図９を参照すると、グリッド歩行試験における性能は、脳卒中及び本開示の態様に従って生成したＯＰＣ移植後４カ月において、良好な運動制御及び歩行の改善を示すものと期待される。

図１０を参照すると、シリンダー試験における性能は、本開示の１つ以上の態様に従って生成したＯＰＣの移植後、４カ月目において改善を示すものと期待される。

実施例８－脊髄損傷を治療するためのＯＰＣ集団の使用
本開示に係る方法を使用して生成したＯＰＣは、脊髄損傷を治療するのに利用可能である。行動評価及び組織学的評価の両方を使用して、頚髄損傷のラットモデルを対象にＯＰＣを試験するために、有効性の研究を実施した。この研究は、最も一般的なヒト脊髄損傷、頸部挫傷をモデルとし、並びに動物の確実な生存を確保するため、及び合理的な動物飼育要件を維持するために半挫傷に限定された。本開示に従って事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを用いて、初期の研究を実施した。

２５０ｋｄｙｎｅの挫傷力を加えるように設定したＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ Ｉｍｐａｃｔｏｒを使用して、頚椎レベルＣ－６片側性（右側）脊髄挫傷を雌胸腺欠損ＲＮＵラットに施した。１週間後、挫傷させた動物に、２．４×１０^５個のＯＰＣ、又は媒体（ＨＢＳＳ）、又は偽手術を施した。抗アシアロＧＭ１抗体を用いて、すべての動物に免疫抑制を施した。研究期間中の４つの時点（ベースライン、及び移植後１カ月、２カ月、又は４カ月）において、行動試験及び運動試験を実施し、その後組織学評価用として脊髄を収集する。

ＯＰＣ又は媒体を投与するために、定位固定式マニプレータアームを使用して、シリンジを脊髄内に進入させた。媒体又はＯＰＣを、損傷部位に対して後端側の背側脊髄実質内に、２．４μＬの単回注射により投与した。

損傷及び治療後の行動上の回復を評価するために、この研究には、９０の異なる運動特性及び歩行メカニクスについて定量測定を可能にするＴｒｅａｄＳｃａｎ歩行分析システム（Ｃｌｅｖｅｒ Ｓｙｓ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｔｏｎ、ＶＡ）が組み込まれた。

ＴｒｅａｄＳｃａｎ分析では、動物をモーター付きの透明なトレッドミル上に配置し、そして無拘束運動期間中に高速度カメラを使用して２０秒間、腹側面から画像化した。ＴｒｅａｄＳｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを、次に４足のそれぞれに由来する歩行特性を計算するのに使用した。

このような歩行パラメーターを使用しつつ、多因子法を使用して全データセットを統計的に分析した。４つの時点のそれぞれにおいて、動物４３匹それぞれについて、９０個のＴｒｅａｄＳｃａｎ個別測定を１つの数値にまとめるために、第１主成分（ＰＣ）分析を実施した。ベースラインからプロットし、第１ＰＣ（図１１）は、損傷後、最初の１カ月において、損傷を受けた動物と損傷を受けない偽手術群との相違を示す。最初の１カ月後、ＯＰＣを投与された動物では、歩行活動が若干回復した一方、ＨＢＳＳ媒体を投与された動物は、回復をほとんど示さなかった（ｐ≦０．０５）。機能的改善は、移植後２カ月目に現れ始め、そして４カ月まで継続的に増加した。

第１主成分を生成するのに使用される多変量分析でも、全体スコアに最も関係する個々のパラメーターが識別された。トップ３のパラメーターは、走行速度、右後ろ足のストライド頻度、及び右前足の縦方向の最大のずれであった。この３パラメーターを、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを投与された受傷ラットについて、図１２、図１３、及び図１４にそれぞれプロットした。

図１２を参照すると、損傷を受けない偽手術ラット、媒体を投与された受傷ラット、及びＯＰＣを投与された受傷ラットの平均走行速度を、４つの指定された時点においてプロットした。ベースラインでは、動物は、すべての群にわたり、類似した速度で走行した。損傷後１カ月において、ＯＰＣ又は媒体（ＨＢＳＳ）で治療された動物は、偽手術動物よりも低速度で走行し、損傷の効果が示唆される。２カ月及び４カ月において、偽手術群及びＯＰＣ治療群の走行速度はいずれも高まり、その改善の程度は類似した。対照的に、ＨＢＳＳ媒体群は、研究全体を通じて走行速度の増加をほとんど示さなかった。ＯＰＣを移植した動物は、治療後２カ月目及び４カ月目の両方において媒体対照群内の動物よりも統計的に有意に速い走行速度を有した（ｐ≦０．０５）。

図１３を参照すると、損傷を受けない偽手術ラット、媒体を投与された受傷ラット、及びＯＰＣを投与された受傷ラットの右後ろ足のストライド頻度を４つの指定された時点においてプロットした。事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを投与された動物は、移植後の障害はそれほど重症ではなかった。特に、ＯＰＣで治療された動物は、右後ろ足について、ＨＢＳＳ媒体で治療された受傷ラットのストライド頻度よりも偽手術動物のストライド頻度に近いストライド頻度を有し（図１３）、また媒体群のストライド頻度とは有意に異なった（ｐ≦０．０５）。

図１４を参照すると、損傷を受けない偽手術ラット、媒体を投与された受傷ラット、及び事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを投与された受傷ラットについて、右前足の縦方向の最大のずれを、４つの指定された時点においてプロットした。これは、短体軸（ウエスト軸）に対する右前足（受傷側）の最大距離を測定する。この場合、ＯＰＣを投与された動物は、影響を受けた右前肢について、偽手術動物の変位により類似し、またＨＢＳＳ媒体を投与された動物とは統計的に異なる縦方向の変位を示した（図１４）。

有効性の研究に由来する事後の組織学分析から、ＯＰＣ治療ラットでは、ＯＰＣが生存し、実質キャビティー形成が低下し、及び損傷部位を横断する有髄線維が存在することが明らかとなった（図１５）。細胞核は、ヒト核抗原で染色されたが、またミエリンは、エリオクロムシアニンで染色される。神経経路探索により、ＯＰＣグラフト内、及び損傷部位に対して後端側に位置する赤核脊髄路及び網様体脊髄路から軸索線維が識別された。図１５の左側パネルを参照すると、移植したＯＰＣにより、病変キャビティーが完全に充填されていることが認められた。図１５の右側パネルは、ＯＰＣグラフト内の有髄軸索（矢印）の存在を示す。

総じて、ＴｒｅａｄＳｃａｎ分析より、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣは、ラット頚髄への挫傷を原因とする運動障害を反転可能であることが明らかとなった。したがって、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣを移植した受傷動物において、動態計測及び脊髄組織の組織学の両方について改善が認められた。

事前治療を実施する方法により生成したＯＰＣを移植すれば、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣの移植により提供される機能的改善と、少なくとも同一レベルの機能的改善を提供するものと期待される。

実施例９－多発性硬化症を治療するためのＯＰＣ集団の使用
本開示に係る方法を使用して生成したＯＰＣは、中枢神経系内の軸索の脱髄を引き起こす自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）を治療するのに利用可能である。損傷を受けた軸索を再有髄化し、また運動機能を復元するＯＰＣの能力を試験するために、実質的にＳｔｏｓｉｃ－Ｇｒｕｊｉｃｉｃらにより記載されるようなＭＳの齧歯類モデルを採用する（Ｓｔｏｓｉｃ－Ｇｒｕｊｉｃｉｃ Ｓ、Ｒａｍｉｃ Ｚ、Ｂｕｍｂａｓｉｒｅｖｉｃ Ｖ、Ｈａｒｈａｊｉ Ｌ、Ｍｏｓｔａｒｉｃａ－Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ Ｍ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｎｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ ｒａｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４．１３６：４９～５５）。モデルとして、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ＭＯＧ_{１－１２５}を用いた免疫により、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を発症させたＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉラットを使用する。免疫後３０日目にＯＰＣを移植する実験概要の非限定的な例を図１６に示す。

試験動物の行動に対するＯＰＣ移植の効果を調べるために、Ｓｔｏｓｉｃ－Ｇｒｕｊｉｃｉｃら、２００４に記載されているスコアリングシステムを使用して、各動物について臨床スコアを決定する。この実施例に従って実施した実験から生成され得る、及び対照群と本開示の態様に従って生成したＯＰＣを移植した動物とを比較することから取得され得る予想データを図１７に示す。脱髄した動物モデルを対象として、事前治療を実施しないで生成したＯＰＣの移植について行われた組織学的分析及び電子顕微鏡検査から、移植されたＯＰＣは生着し、またミエリンを産生することが示唆される。

総じて、このような結果は、事前治療を実施しない方法により生成したＯＰＣの移植は、ＥＡＥモデルにおける運動機能障害及び髄鞘形成不全を反転させる可能性を有することを実証する。

事前治療を実施する方法により生成したＯＰＣの移植は、ＭＳのＥＡＥモデルにおいて、少なくとも類似したレベルの再ミエリン化及び機能改善を提供するものと期待される。

本開示は、特定の態様を参照しながら記載されてきたが、本開示の範囲から逸脱せずに、様々な変更を加えることができ、またその要素について同等のものが置換可能であるものと当業者は理解する。更に、特定の状況又は材料に適合するように、本開示の教示に対して多くの改変を、本開示の範囲から逸脱せずに加えることができる。

したがって、本開示は、本開示を実施するために検討される最良のモードとして開示される特定の態様に限定されず、むしろ本開示は、添付の特許請求の範囲及び精神に内包されるすべての態様を含むように意図される。

Claims (31)

1. 複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含む組成物であって、前記ＯＰＣがネスチンと、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、ＦＡＢＰ７及びＮＥＵＲＯＧ２から選択される１つ以上のマーカーとを発現し、前記細胞集団が、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、およびＲｅｐＳｏｘから選択されるＡＬＫ５の阻害剤、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、およびノギンタンパク質から選択されるＡＬＫ２の阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６２、およびＷｎｔタンパク質から選択されるＧＳＫ３の阻害剤、並びに、パルモルファミン、ＳＡＧ（ＣＡＳ３６４５９０－６３－６）、およびＳＳＨタンパク質から選択される平滑化作動薬（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）を含む１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にインキュベートすることによって産生され、拡大されたが未分化の幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞を含み、前記細胞集団が、望ましくない細胞型の含有量が１５％未満である、組成物。
2. １つ以上の幹細胞分化調節因子が、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１及びパルモルファミンを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 望ましくない細胞型が、Ｋ７及びＰＣＫからなる群から選択される１つ以上のマーカーの存在によって特徴付けられる上皮系列細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 細胞集団が、ＰＣＫ陽性細胞の含有量が５％未満である、請求項３に記載の組成物。
5. 細胞集団が共通の遺伝的背景を有する、請求項１に記載の組成物。
6. 細胞集団が、細胞富化を受けていない、請求項５に記載の組成物。
7. 複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含む組成物であって、前記ＯＰＣがネスチンと、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、ＦＡＢＰ７及びＮＥＵＲＯＧ２から選択される１つ以上のマーカーとを発現し、前記細胞集団が、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、およびＲｅｐＳｏｘから選択されるＡＬＫ５の阻害剤、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、およびノギンタンパク質から選択されるＡＬＫ２の阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６２、およびＷｎｔタンパク質から選択されるＧＳＫ３の阻害剤、並びに、パルモルファミン、ＳＡＧ（ＣＡＳ３６４５９０－６３－６）、およびＳＳＨタンパク質から選択される平滑化作動薬（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）を含む１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にインキュベートすることによって産生され、拡大されたが未分化の幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞を含み、前記細胞集団が嚢胞アッセイにおいて細胞１００，０００個当たり１個以下の上皮嚢胞を形成し得る、組成物。
8. 細胞集団が、１２カ月以内に、損傷誘発性の中枢神経系実質空洞の体積を低下させ得る、請求項７に記載の組成物。
9. 細胞集団が、１８０日以内に、対象の中枢神経系組織内の第１の場所から、１つ以上の第２の場所に位置する１つ以上の患部組織に移動し得る、請求項７に記載の組成物。
10. 中枢神経系組織が脊髄組織又は脳組織である、請求項９に記載の組成物。
11. 細胞集団が、治療を必要とする対象において、前記集団を前記対象に移植した後、運動機能を改善し得る、請求項７に記載の組成物。
12. 細胞集団が、少なくとも２カ月間、運動機能を持続的に改善し得る、請求項１１に記載の組成物。
13. 運動機能が、向上した立位能力、向上した体重支持、向上した四肢機能、向上した四肢強度、向上した歩行距離、向上した歩行速度、向上した腸機能、向上した膀胱機能、向上した腕の動き、向上した手の動き、向上した握ること、向上した掴むこと、及び／又は、向上した捕捉することから選択される、請求項１１に記載の組成物。
14. 細胞集団が、１つ以上の生物学的シグナル伝達因子を産生し得る、請求項７に記載の組成物。
15. 細胞集団が、トロンボスポンジン１、Ｓｅｒｐｉｎｅ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、及びこれらの組合せからなる群から選択される血管形成シグナル伝達因子を産生し得る、請求項１４に記載の組成物。
16. 細胞集団が、ＮＧＦ、ネトリン４、テネイシンＣ、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン３、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ３、及びこれらの組合せからなる群から選択される神経栄養シグナル伝達因子を産生し得る、請求項１４に記載の組成物。
17. １つ以上の生物学的シグナル伝達因子が、デコリン又はミドカインを含む、請求項１４に記載の組成物。
18. 細胞集団が、対象内の移植部位において脱有髄軸索の髄鞘形成を誘発し得る、請求項７に記載の組成物。
19. 複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含む組成物であって、前記ＯＰＣがネスチンと、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、ＦＡＢＰ７及びＮＥＵＲＯＧ２から選択される１つ以上のマーカーとを発現し、前記細胞集団が、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、およびＲｅｐＳｏｘから選択されるＡＬＫ５の阻害剤、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、およびノギンタンパク質から選択されるＡＬＫ２の阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６２、およびＷｎｔタンパク質から選択されるＧＳＫ３の阻害剤、並びに、パルモルファミン、ＳＡＧ（ＣＡＳ３６４５９０－６３－６）、およびＳＳＨタンパク質から選択される平滑化作動薬（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）を含む１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にインキュベートすることによって産生され、拡大されたが未分化の幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞を含み、前記細胞集団が、最大１×１０^９個の細胞を中枢神経系損傷部位内に移植した場合、対象の２％未満において異所性組織を産生し得る、組成物。
20. 細胞集団が、最大１×１０^９個の細胞を中枢神経系損傷部位内に移植した場合、対象の１％未満において異所性組織を産生し得る、請求項１９に記載の組成物。
21. 細胞集団の少なくとも３０％が、ＮＧ２陽性細胞である、請求項１、７又は１９に記載の組成物。
22. 複数のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む細胞集団を含む組成物であって、前記ＯＰＣがネスチンと、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、ＦＡＢＰ７及びＮＥＵＲＯＧ２から選択される１つ以上のマーカーとを発現し、前記細胞集団が、拡大されたが未分化の幹細胞を、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ３６４９４７、およびＲｅｐＳｏｘから選択されるＡＬＫ５の阻害剤、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、およびノギンタンパク質から選択されるＡＬＫ２の阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６２、およびＷｎｔタンパク質から選択されるＧＳＫ３の阻害剤、並びに、パルモルファミン、ＳＡＧ（ＣＡＳ３６４５９０－６３－６）、およびＳＳＨタンパク質から選択される平滑化作動薬（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ）を含む１つ以上の幹細胞分化調節因子と共にインキュベートすることによって産生され、拡大されたが未分化の幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、霊長類多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞を含み、前記ＯＰＣの少なくとも９５％が、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する、組成物。
23. ＯＰＣの少なくとも９８％が、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択されるマーカーを発現する、請求項２２に記載の組成物。
24. ＯＰＣの少なくとも９５％が、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＩＧＦ２、Ｎｋｘ２．２、Ｏｌｉｇ１、及びネスチンからなる群から選択される第２のマーカーを発現する、請求項２２に記載の組成物。
25. 組成物が、薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 薬学的に許容される担体が、ジメチルスルホキシドを含む、請求項２５に記載の組成物。
27. 薬学的に許容される担体が、ジメチルスルホキシドを含まない、請求項２５に記載の組成物。
28. 組成物が、１ミリリットル当たり少なくとも１×１０^６個の細胞を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の組成物。
29. 組成物が、２０～５００マイクロリットルの体積を有する、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の組成物。
30. 組成物が、注射可能な溶液である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の組成物。
31. 組成物が、凍結保存に適合されている、請求項１、７、１９又は２２に記載の組成物。