JP7769743B2 - シグナル発生型デジタルアッセイにおけるノイズを低減する方法 - Google Patents

Description

本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１７年２月６日に出願された、米国特許仮出願第６２／４５５，４３６号明細書の利益を主張する。

本開示は、インク又は色素のような着色剤を使用して、シグナル発生型デジタルアッセイにおけるバックグラウンドノイズを低減する方法に関する。

試料中の目的の解析物を正確に解析しうる方法及びデバイスは、例えば、疾患、障害又は状態を診断する診断法のような診断法、予後診断法、環境評価、食品の安全性、化学兵器剤又は生物兵器剤の検出などに不可欠である。試料中の、低レベルの解析物分子を定量化するための、現行の技法の大半は、レポーター分子の数を増大させる増幅手順を使用して、測定可能なシグナルをもたらす。現行の技法の例は、抗体ベースのアッセイにおけるシグナルを増幅するための酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のほか、ＤＮＡベースのアッセイにおける標的ＤＮＡ鎖を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。大半の検出スキームは、シグナルの総体が検出閾値を上回るのに、集合した多数の分子が存在する必要がある。この要件は、大半の検出法の感度及びダイナミックレンジ（すなわち、検出されうる濃度の範囲）を制限する。さらに、公知の方法及び技法の多くは、バックグラウンドシグナルの増大により、正確に、又は再現可能な形で検出されうる濃度が制限されるという非特異的結合の問題を抱えている。

デジタルＥＬＩＳＡは、コンジュゲートを使用して、１つの酵素分子を検出しうるので、次世代のイムノアッセイの候補である。図１及び２を参照されたい。デジタルＥＬＩＳＡ手順において、個別の標的解析物は、抗体でコーティングされた固相（例えば、ビーズ）上に捕捉され、次いで、酵素とコンジュゲートされた検出抗体と反応させられる。結合していない検出抗体を除去した後で、ビーズが、酵素の基質と共に、各液滴チャンバー内に取り込まれ、ビーズが、重質油により封入される（図２のステップ３における黄色の層を参照されたい。）。図２のステップ３～８において、水性相は、重質油により置きかえられ、その後、除去される。通常、蛍光物質も含んだ水性相を完全に除去するのに、３０～４０分間かかる（図２のステップ１～７における空色の層を参照されたい）。図２に示された除去ステップ７は、手作業で実施されるため、このようなアッセイが実施される回数は、広範にわたり、その結果として、各アッセイの個別の差違のほか、被験試料の数に応じて、精度の問題が生じることを踏まえると、これは、難題を提起する。例を述べると、ステップ７が、不正確に実施される（すなわち、水性層の除去が不完全である）と、シグナル（「グロー」）バックグラウンドノイズは、デジタル計数デバイス（例えば、光学顕微鏡）下における、蛍光液滴の数のカウンティングを妨げる。加えて、室内灯のような、任意の光源も、高バックグラウンドノイズを引き起こしうる。結果として、バックグラウンドノイズ、すなわち、バックグラウンドシグナル（例えば、蛍光又はグロー）が低減され、高精度を伴う、ハイスループットアッセイに容易に適合可能な、改善されたデジタルアッセイが必要とされている。

（発明の要旨）
本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイを対象とする。アッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接合されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイを対象とする。イムノアッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイを対象とする。アッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイを対象とする。アッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、シーリング剤へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイを対象とする。イムノアッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイを対象とする。イムノアッセイは、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、シーリング剤へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。

本発明は、試料中の解析物を検出するのに使用されるシグナル発生型デジタルアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法を対象とする。方法は、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示し、デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップを含む。

本発明は、試料中の解析物を検出するのに使用される蛍光デジタルイムノアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法を対象とする。方法は、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示し、デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップを含む。

本明細書で明示された対象物の、その構造及び作動の両方についての詳細は、同じ参照番号が、同じ部分を指す、付属の図面を検討することにより明らかでありうる。図中の構成要素は、必ずしも縮尺通りではなく、対象物の原理を例示することに強調が置かれる。さらに、全ての例示は、概念を伝えることが意図され、相対的サイズ、形態及び他の詳細な属性は、文字通りに、又は正確にではなく、概略的に例示されうる。

蛍光デジタルＥＬＩＳＡアッセイの手順を示す図である。 油滴シーリングステップ及び水性相除去ステップを使用する蛍光デジタルＥＬＩＳＡアッセイの手順を示す図である。 置きかえられた水性相への「黒インクの添加」を使用する、蛍光デジタルＥＬＩＳＡアッセイの、改善された手順を示す図である。 ビーズの数をカウントするためのテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）フィルター及び蛍光液滴の数をカウントするためのフルオレセインフィルターを使用する、処理（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）についての画像解析データを示す図である。 処理（Ｂ）及び（Ｃ）についての、シグナル％（真のシグナル）を示す図である。 処理（Ｂ）及び（Ｃ）についての、シグナル％（真のシグナル）を示す図である。 フルオレセイン検出における、グロー画像の、２つの代表的なパターン（処理（Ｂ）についての、１６の解析不可能例）を示す図である。 酵素反応のための溶液との、黒インクの混合を使用する、蛍光デジタルＥＬＩＳＡアッセイの、改善された手順を示す図である。 開示された方法が、どのようにして、エバネッセント光検出システムと同様の光領域を制限しうるのかについての概略図である。 「黒インクプレミックス」研究の、シグナル％（真のシグナル）及びＳ／Ｎ比を示す図である。 Ａは、墨汁の例を示す図である。Ｂは、アシッドブラック２（「ＡＢｋ２」）の化学構造を示す図である。Ｃは、アシッドオレンジ７（「ＡＯ７」）の化学構造を示す図である。Ｄは、ディレクトブルー１４（「ＤＢｕ１４」）の化学構造を示す図である。 色素化合物プレミックス研究の、シグナル％（真のシグナル）及びＳ／Ｎ比を示す図である。 色素組合せ研究の、シグナル％（真のシグナル）を示す図である。黒インク：墨汁、ＡＢｋ２：アシッドブラック２、ＡＯ７：アシッドオレンジ７及びＤＢｕ１４：ディレクトブルー１４である。 Ａは、１５ｍＭのアシッドオレンジ７（ＡＯ７）と、４ｍＭのディレクトブルー１４（ＤＢｕ１４）との組合せについての吸収スペクトルを示す図である。Ｂは、フルオレセインについての発光スペクトル及び励起スペクトルを示す図である。注：発光ピークは、ＡＯ７とＤＢｕ１４との間の谷の近傍に位置する。 ３０分間後における、低濃度の抗原の検出（０．１ｆＭの抗原試料）のための、改善された蛍光デジタルイムノアッセイである、「添加法」及び「プレミックス法」についての、シグナル％（真のシグナル）及びＳ／Ｎ比を示す図である。抗原は、組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）であった。 バックグラウンドノイズを低減するための、代替的実施形態を示す図である。

本開示の実施形態は、水性相を除去する必要を伴わずに、デジタルＥＬＩＳＡのようなアッセイにおいて、バックグラウンドシグナル（例えば、蛍光）を低減するための、１つ以上の暗色／黒のインク又は色素のような、着色剤の使用に関する。例えば、デジタルイムノアッセイにおいて、目的の解析物は、固体支持体上の、捕捉分子と検出分子（シグナル発生化合物（例えば、酵素のような）に結合させた）との間で、捕捉分子－目的の解析物－検出分子複合体を形成して捕捉される。次いで、捕捉分子－目的の解析物－検出分子複合体を含有する固体支持体が、液滴内に取り込まれ、液滴は、反応槽（例えば、ウェル）のアレイへと移され、これが、反応槽の各々の中に、水性相を創出する。反応槽は、「溶媒ウェルシーリング」法において、水性相より大きな密度を有する、親水性溶媒又は疎水性溶媒のような、１つ以上の溶媒を含む、シーリング剤の添加によりシーリングされうる、又は覆われうる。シーリング剤が、反応槽へと添加された後で、シーリング剤は、その大きな密度のために、反応槽の底部へと移動し、水性相を置きかえ、これにより、水性相を、表面へと押し上げ、上方の水性相と下方の溶媒相との明確な分離を創出する。例えば、複数の反応槽は、重質フッ素化油で覆われる場合があり、水性相と油相とが交換される。水性相と油相とが交換された後で、水性相が除去される。上方の水性相は、当技術分野で公知である、規定の技法を使用して除去されうる。

溶媒シーリング法に関する問題の１つは、残留水性相が、バックグラウンドシグナル又は検出可能な標識（例えば、蛍光）を引き起こしうることである。バックグラウンドシグナルの別の発生源は、室内灯のような、任意の光である。別の問題は、検出の前に、水溶液を油から除去する必要であるが、これは、極めて時間のかかるステップであり、アッセイのスループットを大幅に低下させ、各試験のためのインキュベーション時間を大幅に変動させる。水性相又はシーリング剤（例えば、油）相を含む、任意の溶液相への、着色剤の、添加は、バックグラウンド蛍光ノイズを抑制し、水性相を除去する必要をなくし、アッセイを実施しうる容易さ及び解析時に得られる画像の品質を改善する。したがって、本発明は、アッセイを実施するのに必要とされるステップの数を低減することにより、デジタルアッセイのプロトコールを簡略化し、短縮する。例えば、検出の前に、水溶液を、油から除去する必要は、本明細書で開示された方法によりなくされる。加えて、本発明は、完全自動式分注システムに適用される、ハイスループットのアッセイにおける使用のために改変される場合があり、アッセイにより生成されるシグナルのバックグラウンドを低減し、データの精度を改善しうる。本発明は、デジタルアッセイ、特に、デジタルＥＬＩＳＡアッセイの低スループット問題及び個別の差違又は試験回数に応じたデータの精度問題の両方を解決しうる。加えて、本明細書で記載された、改善された方法は、走査型近接場光学顕微鏡のような、高価なデジタル計数デバイスの使用を要求せずに、「エバネッセント光検出システム」を模倣しうる、固有の適用を提供する。本明細書で開示された方法、例えば、図７Ａに示された方法は、光領域を制限しうる（図７Ｂにおいて示される通り）が、これは、エバネッセント光検出システムにおける光領域と同等である。

１．定義
本開示の実施形態が記載される前に、そのような実施形態は、当然ながら、変動しうるので、本発明は、記載される、特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用された用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とし、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。

本明細書において使用される「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」「～を有すること」、「～を有する」、「～でありうる」、「～を含有する」という用語は、さらなる行為又は構造の可能性を除外しない、オープンエンドな移行句、移行用語又は移行語である。単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」及び「その」は、文脈によりそうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。本開示はまた、特に明示されているのであれ、そうでないのであれ、本明細書において提示された実施形態又は要素「～を含み」、これら「からなり」、これら「から本質的になる」、他の実施形態も想定する。

本明細書において、数値範囲を列挙するために、それらの間に介在する、同じ精度を伴う各数が明示的に想定される。例えば、６～９の範囲について、６及び９に加えて、７及び８の数も想定され、６．０～７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数が、明示的に想定される。

本明細書で互換的に使用された「親和性」及び「結合親和性」とは、結合メンバーの、解析物への結合の傾向又は強度を指す。例えば、結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離速度（ｋ_ｄ）又は会合速度（ｋ_ａ）により表されうる。

本明細書で使用された「類似体」とは、目的の分子と類似の構造を有する分子（例えば、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、糖リン酸類似体、解析物類似体など）を指す。解析物類似体とは、解析物と構造的に類似するが、結合メンバーが、それに対して異なる親和性を有する分子である。

本明細書で互換的に使用された「解析物」、「標的解析物」、「目的の解析物」とは、本明細書で開示された方法及びデバイスにおいて測定される解析物を指す。本明細書において、目的の解析物は、さらに記載される。

本明細書において使用された「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全ヒト化抗体又は部分的ヒト化抗体）、鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）抗体、サメ抗体、クジラ抗体、及び非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）抗体又は非ヒト霊長動物（例えば、サル、チンパンジーなど）抗体を含む哺乳動物抗体のようであるがこれらに限定されない動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド連結型Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）又は三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作り出すための方法について、それらの各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（１１）：１２９０～１２９７（２００７）及びＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００１／０５８９５６号において記載されている）、並びに上記のうちのいずれかの、機能的に活性なエピトープ結合性断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち、解析物結合性部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの分子でありうる。簡潔さのために、本明細書において、解析物に対する抗体は、「抗解析物抗体」、又は、単に、「解析物抗体」と称されることが多い。

本明細書で使用された「抗体断片」とは、抗原結合性部位又は可変領域を含む、無傷抗体の部分を指す。部分は、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディー、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する単鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１つだけ含有する単鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチドを含むがこれらに限定されない。

本明細書において、「ビーズ」と「粒子」とは、互換的に使用され、実質的に球形の固体支持体を指す。

本明細書において、「結合性タンパク質」は、例えば、ポリペプチド、抗原、化学的化合物若しくは他の分子、又は任意の種類の基質のような、結合パートナーに結合し、これと共に複合体を形成する、単量体又は多量体のタンパク質を指すように使用される。結合性タンパク質は、結合パートナーに特異的に結合する。結合性タンパク質は、抗体のほか、当技術分野で公知であり、本明細書の下記で記載される、これらの抗原結合性断片及びこれらの他の多様な形態及び誘導体並びに抗原分子又は抗原分子上の特定の部位（エピトープ）に結合する、１つ以上の抗原結合性ドメインを含む他の分子を含む。したがって、結合性タンパク質は、四量体の免疫グロブリンである抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ_１分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、及び抗原に結合する能力を保持する、任意のこのような抗体の断片を含むがこれらに限定されない。

本明細書で使用された「捕捉分子」とは、生物学的試料中の、目的の解析物を捕捉又は固定化するのに使用される、特異的結合パートナー又は特異的結合メンバーを指す。捕捉分子は、目的の解析物に加えて、複合体の１つの構成要素であることが多く、また、１つ以上の検出分子も含有しうる。複合体は、任意選択的に、固体支持体に結合させられうる。

「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」又は「少なくとも１つの構成要素」とは、一般に、本明細書で記載された方法及び当技術分野で公知である他の方法に従う、患者の尿、血清、全血液、組織吸引物又は血漿試料のような被験試料についてのアッセイのためのキット内に含まれうる、捕捉抗体、検出試薬又はコンジュゲート、較正物質、対照物質、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素のための共因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液としての）、停止溶液などを指す。一部の構成要素は、溶液でありうる、又はアッセイにおける使用のための復元のために、凍結乾燥させられうる。

本明細書で使用された「～を接触させること」及びこの文法的同等物は、結合メンバーに特異的な、目的の解析物が、試料中に存在する場合、結合相互作用が生じるように、結合メンバーを、試料中の目的の解析物と、十分に近接させる、任意の種類の組合せ動作を指す。接触させることは、試料を、結合メンバーと組み合わせ、結合メンバーを、解析物へと近接させることにより、標的解析物を、結合メンバーへと曝露することなどを含む、様々な異なる形で達成されうる。

本明細書で使用された「対照」とは、当技術分野で公知である、若しくは許容可能であるか、又は一般に利用される、許容可能な手段を使用して、経験的に測定される、解析物についての参照標準物質を指す。「参照標準物質」とは、同様の物質のための測定ベースとして使用される標準化物質である。例えば、文書化された参照標準物質は、米国薬局方（ＵＳＰ－ＮＦ）、食品用公定化学品集及びＤｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（これらの全ては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇにおいて利用可能である）及び他の周知の出典において公表されている。参照物質を標準化するための方法は、文献において記載されている。また、解析物についての較正曲線の使用により、又は代替的な参照標準物質に照らした比較により、存在する解析物の量を定量化するための手段も周知である。検量線は、解析物の公知の濃度の系列希釈液又は溶液を使用して、質量分析、重量測定法により作成される場合があるが、当技術分野で公知の他の技法により作成される場合もある。文献において記載されている、代替的な参照標準物質は、標準添加（標準添加法としてもまた公知の）又はデジタルポリメラーゼ連鎖反応を含む。

本明細書で使用された「検出分子」とは、生物学的試料中の、目的の解析物の存在を検出し、かつ／又はこの量を定量化若しくは測定するのに使用される、特異的結合パートナー又は特異的結合メンバーを指す。検出分子は、１つ以上の捕捉分子及び目的の解析物を含有しうる複合体の、１つの構成要素であることが多い。複合体は、任意選択的に、固体支持体に結合させられうる。

本明細書で使用された「固定化された」は、第１の特異的結合メンバーの、固体支持体の表面との安定的会合を指す。「安定的会合」とは、会合の平均半減期が、例えば、生理学的条件下で、１日間以上である、２つの実体の間の物理的会合を意味する。ある特定の態様において、２つの実体の間の物理的会合は、ＰＢＳ中、４℃で、２日間以上、１週間以上、６カ月間以上、例えば、１年間以上を含む、１カ月間以上の平均半減期を有する。ある特定の実施形態に従い、安定的会合は、２つの実体の間の共有結合、２つの実体の間の非共有結合（例えば、イオン結合又は金属結合）又は水素結合、ファンデルワールス力などのような、化学的引力の他の形態から生じる。

本明細書で使用された「標識」及び「検出可能な標識」とは、抗体と解析物との反応を検出可能とするように、抗体又は解析物へと接着された部分を指し、このように標識化された抗体又は解析物は、「検出可能に標識化された」と称される。標識は、視覚手段又は計測手段により検出可能なシグナルを生成しうる。多様な標識は、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などのようなシグナル発生物質を含む。他の標識も、本明細書で記載されている。この点で、部分自体は、検出可能でない場合もあるが、さらに別の部分と反応すると、検出可能となりうる。「検出可能に標識化された」という用語は、このような標識化を包含することを意図する。

本明細書で使用された「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種である抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量で存在しうる、可能な天然の突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して方向付けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられた、異なる抗体を含むことが典型的な、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられている。本明細書におけるモノクローナル抗体は具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体のほか、それらが、所望の生体活性を呈する限りにおいて、このような抗体の断片も含む。

「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオ塩基が、糖リン酸連結（糖－リン酸骨格）により接続された、ヌクレオ塩基のポリマー又はオリゴマーを指す。例示的なポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、２’－デオキシリボヌクレオチドのポリマー（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドから完全に構成されうる、２’－デオキシリボヌクレオチドから完全に構成されうる、又はこれらの組合せでありうる。「核酸」は、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」を包含し、ヌクレオチド単量体の一本鎖ポリマー及び二本鎖ポリマーを含む。

本明細書で使用された「所定のカットオフ」及び「所定のレベル」とは、所定のカットオフ／レベルに対するアッセイ結果を比較することにより、診断的、予後診断的又は治療的有効性結果を評価するのに使用される、アッセイカットオフ値を指し、この場合、所定のカットオフ／レベルが、多様な臨床パラメータ（例えば、疾患の存在、病期、疾患の重症度、疾患の進行、非進行又は改善など）と、既に連関又は関連させられている。本開示は、例示的な所定のレベルを提示する。しかし、カットオフ値は、イムノアッセイの性格（例えば、利用される抗体、反応条件、試料の純度など）に応じて変動しうることが周知である。さらに、本開示により提示された記載に基づき、他のイムノアッセイについて、イムノアッセイ特異的カットオフ値を得るように、本明細書における本開示を、他のイムノアッセイに適合させることも、当業者の技術範囲内にある。所定のカットオフ／レベルの正確な値は、アッセイ間で変動しうるが、本明細書で記載される相関は、一般に、適用可能であるものとする。

「前処理試薬」、例えば、本明細書で記載された診断アッセイにおいて使用される溶解試薬、沈殿試薬及び／又は可溶化試薬は、任意の細胞を溶解させ、かつ／又は被験試料中に存在する、任意の解析物を可溶化させる、溶解試薬、沈殿試薬及び／又は可溶化試薬である。前処理は、本明細書でさらに記載される通り、全ての試料に必要なわけではない。とりわけ、解析物の可溶化は、試料中に存在する全ての内因性結合タンパク質からの、解析物の放出を伴う。前処理試薬は、同種試薬（分離ステップを要求しない）又は異種試薬（分離ステップを要求する）でありうる。異種前処理試薬の使用では、アッセイの次のステップへと進む前に、沈殿した全ての解析物結合タンパク質の、被験試料からの除去がなされる。前処理試薬は、任意選択的に、（ａ）１つ以上の溶媒及び塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩及びデタージェント、（ｃ）デタージェント、（ｄ）デタージェント及び塩又は（ｅ）細胞の溶解及び／若しくは解析物可溶化に適切な、任意の試薬若しくは試薬の組合せを含みうる。

本明細書で記載されたイムノアッセイ及びキットの文脈における「品質管理試薬」は、較正物質、対照及び感度パネルを含むがこれらに限定されない。「較正物質」又は「基準」は、抗体又は解析物のような解析物の濃度を内挿するための、較正曲線（検量線）を確立するために使用される（例えば、複数のような、１つ以上の）ことが典型的である。代替的に、所定の陽性／陰性カットオフ近傍において、単一の較正物質も使用されうる。「感度パネル」を含むように、複数の較正物質（すなわち、１つを超える較正物質又は変動量の較正物質）が使用されうる。

本明細書で使用された「受容体」とは、内因性化学シグナルを認識し、これに応答するタンパク質分子を指す。このような内因性化学シグナルが、受容体に結合すると、何らかの、細胞／組織応答の形態を引き起こす。受容体の例は、神経受容体、ホルモン受容体、栄養物質受容体及び細胞表面受容体を含むがこれらに限定されない。

「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、組換え法により、１つ以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を、適切な発現ベクターへとクローニングし、その後、抗体を、適切な宿主細胞内で発現させるステップを含む、１つ以上のステップにより調製された抗体を指す。用語は、組換えにより作製されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全ヒト化抗体又は部分的ヒト化抗体）、抗体断片から形成された多特異性構造又は多価構造、二官能性抗体、ヘテロコンジュゲートＡｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ（登録商標）及び本明細書の（ｉ）において記載された他の抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作り出すための方法について、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０～１２９７（２００７）において記載されている）を含むがこれらに限定されない。本明細書において使用された「二官能性抗体」という用語は、１つの抗原性部位に対する特異性を有する第１のアーム及び異なる抗原性部位に対する特異性を有する第２のアームを含む抗体を指す、すなわち、二官能性抗体は、二重特異性を有する。

本明細書で使用された「試料」、「被験試料」、「生物学的試料」、「対象に由来する試料」、「体液中の生物学的試料」及び「患者試料」は、互換的に使用される場合があり、目的の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を指す。

本明細書で使用された「シグナル発生化合物」とは、シグナル発生基質のような、適する転換剤又は適切な転換剤へと曝露されると、検出可能な生成物又は検出可能な標識へと転換されうる、任意の分子、化合物、タンパク質などを指す。「検出可能な生成物」又は「検出可能な標識」とは、当技術分野で公知の、選択された技法を使用して検出される実体として作用することにより、検出を容易とする、任意の分子、粒子などである。シグナル発生化合物の例は、アミラーゼ、ポリヌクレオチダーゼ、アルギナーゼ、アデナーゼ、アミノポリペプチダーゼ、ペプシン、リパーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、グリコキサラーゼ、アルドラーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ（ベータ－ガラクトシダーゼのような）、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ及びヘキソキナーゼ又はこれらの組合せのような酵素である。

本明細書で使用された「シグナル発生基質」とは、シグナル発生化合物のような、適する転換剤又は適切な転換剤へと曝露されると、検出可能な生成物又は検出可能な標識へと転換されるシグナル発生化合物へと転換されうる、又はこれを結果としてもたらす、任意の分子、化合物、タンパク質、物質、粒子などを指す。「検出可能な化合物」又は「検出可能な標識」とは、当技術分野で公知の、選択された技法を使用して検出される実体として作用することにより、検出を容易とする、任意の分子、粒子などである。シグナル発生基質は、比色基質、化学発光基質又は化学蛍光基質でありうる。シグナル発生基質の例は、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）、（二ナトリウム４－クロロ－３－（メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸）、ＣＳＰＤ（登録商標）又は（二ナトリウム３－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸）のような化学発光基質；ｐ－ニトロフェニルリン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイルリン酸（ＢＣＩＰ）、４－ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）又はインドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）のような発光基質；４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）のような蛍光基質及び５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイルリン酸（ＢＣＩＰ）、二ナトリウム５－ブロモ－６－クロロ－インドイルリン酸又はｐ－ニトロフェニルリン酸のような色原性基質のような酵素基質である。

本明細書で互換的に使用された、「特異的結合パートナー」又は「特異的結合メンバー」とは、他の分子に対する、実質的に低度の認識と比較して、他の分子を特異的に認識する、２つ以上の異なる分子のうちの１つを指す。２つの異なる分子のうちの１つは、他の分子の、特定の空間構成及び極性構成に特異的に結合し、これにより、これと相補的であると規定される、表面上又は空隙内の領域を有する。分子は、特異的結合対のメンバーでありうる。例えば、特異的結合メンバーは、受容体、酵素及び抗体のようなタンパク質を含みうるがこれらに限定されない。

一般的なイムノアッセイの、抗原と抗体との特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチン及びアビジン（又はストレプトアビジン）、炭水化物及びレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子及び受容体分子、共因子及び酵素、酵素及び酵素阻害剤などを含みうる。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体、例えば、解析物類似体であるメンバーを含みうる。免疫反応性の特異的結合メンバーは、抗原、抗原断片及びモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のほか、単離されたものであれ、組換えにより生成されたものであれ、これらの複合体及び断片を含む抗体を含む。

本明細書で互換的に使用された、「固相」又は「固体支持体」とは、不溶性であるか、又は後続の反応により不溶性とされうる、任意の材料を指す。固相は、捕捉剤を誘引し、固定化する、その内因性の能力について選択されうる。代替的に、固相は、固相捕捉剤を誘引し、固定化する能力を有する、連結剤を付加されている。例えば、連結剤は、捕捉剤自体又は捕捉剤へとコンジュゲートされた帯電物質に対して、逆向きに帯電した帯電物質を含みうる。一般に、連結剤は、結合反応を介して、捕捉剤を固定化する能力を有する固相上に固定化された（固相へと接着された）、任意の結合パートナー（好ましくは特異的結合パートナー）でありうる。連結剤は、アッセイの実施前に、又はアッセイ又はアッセイの実施時に、捕捉剤の、固相材料への間接的結合を可能とする。例えば、固相は、例えば、試験管、マイクロ滴定ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者に公知の他の構成を含む、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性金属又は非磁性金属、ガラス又はシリコンでありうる。

本明細書で互換的に使用された、「対象」及び「患者」とは、任意の脊椎動物、を含むがこれらに限定されない、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル又はアカゲザル、チンパンジーなどのようなサル）及びヒト）を指す。一部の実施形態において、対象は、ヒト又は非ヒトでありうる。対象又は患者は、他の形態の処置を受けつつある場合がある。

本明細書で使用された「閾値」とは、それを上回れば、収集されたデータが、「シグナル」と考えられ、それを下回れば、収集されたデータが、「ノイズ」と考えられる、経験的に測定され、主観的である、カットオフレベルを指す。使用者からの閾値の入力に基づき、収集されたデータを処理し、イベントを検出するのに、ＣＵＳＵＭ（累積和アルゴリズム）に基づくコンピュータプログラムが利用される。可能な限り多くのイベントを検出し、その後、特殊な目的のために、データをフィルタリングすることにより使用者の間の変動が回避される。「ルースな」閾値により、少数のイベントが、シグナルとしてカウントされる。「タイトな」閾値により、多数のイベントが、シグナルとしてカウントされる。閾値を、ルース又はタイトに設定することは、アッセイに所望される感度又は特異度及び所与の評価において、偽陽性又は偽陰性が好ましいのかどうかに基づく、主観的選択である。

本明細書において、「～を処置する」、「～を処置すること」又は「処置」は各々、疾患又はこのような用語が適用される、このような疾患の、１つ以上の症状を好転させること、緩和すること又はこれらの進行を阻害することについて記載するのに、互換的に使用される。対象の状態に応じて、用語はまた、疾患を防止することも指し、疾患の発症を防止すること、又は疾患と関連する症状を防止することを含む。処置は、急性的に実施されうる、又は慢性的に実施されうる。用語はまた、疾患への罹患の前に、疾患又はこのような疾患と関連する症状の重症度を軽減することも指す。罹患の前における、疾患の重症度のこのような防止又は軽減は、本発明の抗体又は医薬組成物の、投与時において疾患に罹患していない対象への投与を指す。「～を防止すること」はまた、疾患又はこのような疾患と関連する、１つ以上の症状の再発を防止することも指す。「処置」及び「治療的に」とは、「～を処置すること」が、上記において規定される通りである場合の、処置する行為を指す。

そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用された、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。齟齬が生じる場合は、定義を含む本文献に従う。本発明の実施又は試験において、本明細書で記載される方法及び材料と同様又は同等な方法及び材料も使用されうるが、下記において、好ましい方法及び材料について記載される。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらとの関係で刊行物が引用された方法及び／又は材料を開示し、これらについて記載するように、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書で開示される材料、方法及び例は、例示的なものであるに過ぎず、限定を意図するものではない。

２．改善されたシグナル発生型デジタルアッセイ
本発明は、反応槽（１つ以上のウェルのような）のアレイを利用する、蛍光イムノアッセイのような、改善されたアッセイであって、溶媒によるウェルのシーリングを使用してシーリングされ、低減されたバックグラウンドノイズを呈する、改善されたアッセイに関する。

蛍光イムノアッセイにおいて、シグナル発生化合物の単一分子は、フェムトリットルチャンバー内で、シグナル発生基質から生成された、検出可能な標識を蓄積することにより、検出可能なシグナルを発生させうる。デジタルＥＬＩＳＡは、広範な潜在的可能性を有するが、欠点の１つは、アッセイが、多数のステップの実施を要求することである。これらのステップは、１）捕捉分子－目的の解析物－検出分子複合体を、固体支持体上で形成するステップ；２）複合体を、液滴中に捕捉するステップ；３）液滴を、反応槽へと移動させ、シグナル発生基質を添加して（同時に、又は液滴に対して、任意の順序で、逐次的に）、水性相を形成するステップ；４）フッ素化油（ＦＣ４０）のような溶媒を、反応槽へと添加し、水性相と溶媒相との切り替えを引き起こし、これにより、反応槽内で、水溶液の分離を結果としてもたらすステップ；５）水性相（反応槽内の上層又は最上層）を除去するステップ及び６）デジタル計数デバイス（光学顕微鏡のような）を使用して、反応槽の画像を収集するステップを含む。ステップ５における、水性相の除去は、バックグラウンドシグナル相を消失させることを目的とするが、極めて時間がかかる。具体的に述べると、水性相の不完全な除去は、残留バックグラウンドシグナル（蛍光ノイズ又はグローノイズ）を結果としてもたらすため、当業者は、水性相を、完全に除去することを確保しなければならない。このバックグラウンドノイズは、上方の水性相内に存在するシグナル（蛍光又はグロー）により引き起こされ、デジタル計数デバイス（光学顕微鏡のような）下における、シグナル発生液滴のカウンティングを妨げる。

シグナルバックグラウンドノイズを欠失させるために、本発明は、液滴を、反応槽へと添加する前に、若しくは添加した後で、又は液滴及びシグナル発生基質を、反応槽へと添加する前に、若しくは添加した後で、色素成分（例えば、黒インク）のような、１つ以上の着色剤を、溶液相（水性相又はシーリング剤（例えば、油）相）へと添加するステップを伴うデジタルアッセイを実行する、改善された方法を伴う。結果として、着色剤（黒インク又は混合黒インクのような）の添加は、水性相の除去と同じ結果を得、したがって、アッセイにおける、このステップに対する必要を、完全に消滅させる。本明細書で記載された色素混合法において、着色剤は、溶媒の添加により分離される水性相内のバックグラウンドシグナルノイズを抑制するだけでなく、また、デジタル計数デバイス内の任意の場所におけるバックグラウンドシグナルノイズも抑制する。結果として、バックグラウンドを含まない、真のシグナルが、色（黒のような）の深度の最も深い陰影を伴う画像から、容易に得られうる。いかなる理論にも束縛されないことを望むが、このような真のシグナルが得られうる理由は、反応槽の光経路の長さが、極めて短く（例えば、フェムトリットル単位の反応槽が、使用される場合、チャンバーは、わずかに、４マイクロメートルである）、真のシグナルの透過率が、溶液中の着色剤により、影響又は干渉されないことであることが考えられる。

本開示は、シーリング剤を伴う溶媒シーリング法を使用する、複数の反応槽を含むアレイを使用して、体液による生物学的試料中に存在する解析物を測定又は検出するための、改善された方法について記載する。例えば、図１及び２は、油滴シーリング法を使用する、デジタルイムノアッセイについての概略を示す。「デジタルＥＬＩＳＡ」は、何百万個もの、フェムトリットルサイズの、油中水（Ｗ／Ｏ）液滴によるアレイデバイスに基づく。デジタルイムノアッセイは、１Ｌ当たりおよそアットモル～フェムトモル未満のレベル（アット＝１０^－１８、フェムト＝１０^－１５）の濃度の標的分子を検出しうる、デジタルＥＬＩＳＡのような、超高感度イムノアッセイでありうる。油滴シーリングの他の方法は、例えば、それらの各々の内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｎｄｅｌｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（３）：３６１～３６５（２００５）、Ｋｉｍら、Ｌａｂ ｏｎ Ｃｈｉｐ１２（２３）：４９８６～４９９１（２０１２）、日本特許第３７２７０２６号並びに国際特許公開第２０１２／１２１３１０号及び同第２０１６／００６２０８号において記載されている方法を含む。一部の実施形態において、シグナル発生型デジタルイムノアッセイは、フェムトリットルの液滴アレイを含む。

解析物を測定又は検出するための方法は、体液中の生物学的試料を、複数の固体支持体へと曝露する、又はこれと接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、少なくとも１つの、第１の特異的結合メンバー（「特異的結合メンバー」と代替的に称され、下記で記載される「結合メンバー」）を含み、特異的結合メンバーのうちの、少なくとも一部の画分が、解析物に結合し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成し、特異的結合メンバーのうちの、少なくとも一部の画分が、解析物に結合しないステップ；混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加する、又は混合物と、これらを接触させ、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成し、第２の特異的結合メンバーが、シグナル発生化合物を含むステップ；シグナル発生基質を、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと添加するステップ；及び固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップを含む。改善された方法において、着色剤は、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離する（すなわち、フェムトリットルチャンバーの形成の）前に、又はこの後で添加される。

複数の反応槽は、重質フッ素化油のようなシーリング剤で覆われ、水性相と、シーリング剤相（例えば、油相）とが交換される。一部の実施形態において、複数の反応槽を傾けることにより、水性相と、シーリング剤相（例えば、油相）とが交換される。一部の実施形態において、重質フッ素化油は、ＦＣ－４０、ＦＣ－７２、ＦＣ－８４、ＦＣ－７７、ＦＣ－３２５５、ＦＣ－３２８３、ＦＣ－４３、ＦＣ－７０）、３Ｍ Ｎｏｖｅｃ ４２００、３Ｍ Ｎｏｖｅｃ ４３００、３Ｍ ＦＣ－４４３２、３Ｍ ＦＣ－４４３０又は３Ｍ ＦＣ－４４３４である。水性相と、シーリング剤相（例えば、油相）とが交換された後で、水性相が除去される。複数の反応槽は、蛍光顕微鏡のようなデジタル計数デバイスへと移され、検出可能なシグナルの存在又は非存在が検出される。検出可能なシグナルの存在の検出は、試料中の解析物の単一分子の存在を示す。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、蛍光画像を収集するために、蛍光顕微鏡のような光学顕微鏡を使用して検出される。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、蛍光画像を収集するために蛍光顕微鏡を使用して検出される。

一部の実施形態において、複数の反応槽は、マイクロウェルアレイ又はナノウェルアレイでありうる。一部の実施形態において、マイクロウェルアレイ又はナノウェルアレイは、少なくとも約４ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約６ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約８ｍｍ、少なくとも約９ｍｍ又は少なくとも約１０ｍｍの直径を有する。一部の実施形態において、マイクロウェルアレイは、６ｍｍの直径を有する。一部の実施形態において、マイクロウェルアレイ又はナノウェルアレイは、ウェル約１００，０００～約１，０００，０００個、ウェル約２００，０００～約７５０，０００個又はウェル約３００，０００～約５００，０００個を含有する。一部の実施形態において、マイクロウェルアレイは、ウェル約１００，０００、約２００，０００、約３００，０００、約３５０，０００、約３７５，０００、約４００，０００、約４２５，０００、約４５０，０００、約４７５，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００又は約１，０００，０００個を含有する。一部の実施形態において、マイクロウェルアレイは、ウェル４００，０００個を含有する。一部の実施形態において、ウェルは、ウェルの底部において、少なくとも約１μｍの直径、少なくとも約２μｍの直径、少なくとも約３μｍの直径、少なくとも約４μｍの直径、少なくとも約５μｍの直径、少なくとも約６μｍの直径、少なくとも約７μｍの直径、少なくとも約８μｍの直径、少なくとも約９μｍの直径又は少なくとも約１０μｍの直径を有しうる。一部の実施形態において、複数の反応槽は、６ｍｍの直径を有し、ウェルの底部において、５μｍの直径を有する、約４００，０００のウェルを含有する、マイクロウェルアレイ又はナノウェルアレイでありうる。

固定化された第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体形成の後、結合していない全ての解析物が、試料と共に、第１の特異的結合メンバーの近傍から除去されうるが、第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体は、固体支持体とのその会合のために保持されうる。任意選択的に、固体支持体は、固体支持体に非特異的に結合した、全ての分子を除去するように、洗浄緩衝液と接触させられうる。

第１の接触ステップ並びに任意選択の試料の除去ステップ及び／又は任意選択の洗浄ステップの後で、第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体は、第２の特異的結合メンバーと接触させられ、これにより、解析物への、２つの結合メンバーによる結合がなされた、サンドイッチ複合体の形成をもたらしうる。第２のメンバーの、第１の特異的結合メンバー－解析物複合体との、任意選択の混合は、第２の接触ステップ時に実行されうる。一部の実施形態において、表面に対する解析物分子の固定化は、解析物分子を、表面から押しのける懸念を伴わずに、全ての過剰な第２の特異的結合メンバーを、溶液から除去する一助となりうる。一部の実施形態において、第２の特異的結合メンバーは、これへと接着されたシグナル発生化合物を含みうる。

上記で言及された通り、第２の接触させるステップは、解析物と、第２の特異的結合メンバーとの結合相互作用に十分な条件下で実行されうる。第２の接触させるステップの後、全ての結合していない第２の特異的結合メンバーが除去され、その後、任意選択の洗浄ステップが行われうる。一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない、第２の特異的結合メンバーは、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと空間的に分離する前に除去される。

一部の実施形態において、シグナル発生化合物は、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼ（ベータ－Ｇａｌ）でありうる。一部の実施形態において、シグナル発生基質は、シグナル発生化合物のための蛍光基質でありうる。例えば、シグナル発生基質は、４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）、二リン酸フルオレセイン（ＦＤＰ）、６，８－ジフルオロ－４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）、又は９Ｈ－（１，３－ジクロロ－９，９－ジメチルアクリジン－２－オン－７－イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）でありうる。一部の実施形態において、方法は、反応混合物中に、シグナル発生化合物の阻害剤をさらに含む。一部の実施形態において、阻害剤は、レバミソールである。

一部の実施形態において、方法は、混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加する前に、又は混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加した後で、混合物を、ある時間にわたりインキュベートするステップをさらに含み、この場合、時間は、インキュベーション時間であり、約４０分間～約３００分間である。一部の実施形態において、液体試料は、血清試料、血漿試料又は全血液試料である。

一部の実施形態において、方法は、液体試料を、複数の固体支持体へと接触させる前に、液体試料を、１つ以上のデタージェント、界面活性剤、非極性溶媒、超音波処理、加熱、又はこれらの組合せと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、式：ＣＯ＝２Ｓ／Ｎ、Ｓ／Ｎ ＣＯ＝２Ｓ／Ｎを使用して、カットオフ値を計算するステップをさらに含み、Ｓ／Ｎ比は、解析物を伴わない血清検体によるシグナル％で除された、解析物を伴う血清検体によるシグナル％から計算された。一部の実施形態において、固体支持体は、磁性固体支持体である。

本開示は、液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定する方法について記載する。方法は、解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップを含む。各固体支持体は、解析物に結合することが可能な、少なくとも１つの、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成する。混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体は、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するように、第１の洗浄緩衝液で洗浄される。解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーが、洗浄された混合物へと添加され、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が生成される。第２の特異的結合メンバーは、これへと接着されたシグナル発生化合物を含む。固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体は、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するように、第２の洗浄緩衝液で洗浄される。シグナル発生基質が、洗浄された固体支持体複合体へと添加される。シグナル発生化合物及びシグナル発生基質は、検出可能なシグナルを生成する。洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部は、複数の個別位置へと空間的に分離される。複数の個別位置は、上記で記載されたマイクロウェルアレイを含む。マイクロウェル又はナノウェルは、シーリング剤、例えば、重質フッ素化油で覆われる。水性相と、シーリング剤相（例えば、油相）とが交換される。検出可能なシグナルの存在又は非存在は、デジタル計数デバイスを使用して検出される。検出可能なシグナルの存在の検出は、試料中の解析物の単一分子の存在を示す。改善された方法において、着色剤は、洗浄された固体支持体複合体を、複数の個別位置へと、空間的に分離する（すなわち、フェムトリットルチャンバーの形成の）前に、又はこの後で添加される。

一部の実施形態において、解析物の検出の感度は、少なくとも約０．１ｆＭ～少なくとも約１０ｆＭ、少なくとも約０．５ｍＩＵ／ｍＬ、又は少なくとも約０．２４ｐｇ／ｍＬである。一部の実施形態において、解析物の検出の感度は、少なくとも約０．０５ｆＭ、少なくとも約０．０６ｆＭ、少なくとも約０．０７ｆＭ、少なくとも約０．０８ｆＭ、少なくとも約０．０９ｆＭ、少なくとも約０．１０ｆＭ、少なくとも約０．１１ｆＭ、少なくとも約０．１２ｆＭ、少なくとも約０．１３ｆＭ、少なくとも約０．１４ｆＭ、少なくとも約０．１５ｆＭ、少なくとも約０．５ｆＭ、少なくとも約１．０、少なくとも約５ｆＭ、少なくとも約１０ｆＭ、少なくとも約２０ｆＭ、少なくとも約３０ｆＭ、少なくとも約４０ｆＭ、少なくとも約５０ｆＭ、少なくとも約６０ｆＭ、少なくとも約７０ｆＭ、少なくとも約８０ｆＭ、少なくとも約９０ｆＭ、又は少なくとも約１００ｆＭである。

例えば、開示された方法は、生物学的試料中に存在する解析物を測定若しくは検出する、又は患者を診断する、又は血液供給をスクリーニングするために使用されうる。

例示的な場合には、方法は、試料を、第１の特異的結合メンバー（「特異的結合メンバー」と代替的に称され、下記で記載される「結合メンバー」）と接触させるステップであって、第１の特異的結合メンバーが、固体支持体上に固定化され、第１の特異的結合メンバーが、解析物に特異的に結合するステップ；解析物を、第２の特異的結合メンバーと接触させるステップであって、この第２の特異的結合メンバーが、解析物に特異的に結合し、この第２の特異的結合メンバーが、下記で記載される、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含むステップを含みうる。

ある特定の場合、第１の特異的結合メンバーは、固体支持体上に固定化されうる。結合試薬（１つ以上の特異的結合メンバーのような）が固定化されうる表面を有する、固体支持体は、マイクロ流体チップの表面、チャンバーの内表面、ビーズの外表面（本明細書で規定された）、又は多孔性ビーズの内表面及び／若しくは外表面のような、平面状コンフォメーション又は非平面状コンフォメーションにある、任意の簡便な表面でありうる。例えば、第１の特異的結合メンバーは、ビーズ、例えば、ラテックスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、トシル活性化ビーズ、エポキシビーズ、ポリスチレンビーズ、アミノビーズ、アミンビーズ、カルボキシルビーズなどへと、共有結合的に、又は非共有結合的に接着されうる。ある特定の実施形態において、ビーズは、粒子、例えば、微粒子でありうる。一部の実施形態において、微粒子は、約０．１ｎｍ～約１０ミクロンの間、約５０ｎｍ～約５ミクロンの間、約１００ｎｍ～約１ミクロンの間、約０．１ｎｍ～約７００ｎｍの間、約５００ｎｍ～約１０ミクロンの間、約５００ｎｍ～約５ミクロンの間、約５００ｎｍ～約３ミクロンの間、約１００ｎｍ～７００ｎｍの間又は約５００ｎｍ～７００ｎｍの間でありうる。例えば、微粒子は、約４～６ミクロン、約２～３ミクロン又は約０．５～１．５ミクロンでありうる。約５００ｎｍ未満粒子は、場合によって、ナノ粒子と考えられる。したがって、約０．１ｎｍ～約５００ｎｍの間、約１０ｎｍ～約５００ｎｍの間、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの間、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ又は約５００ｎｍの微粒子は、任意選択的に、ナノ粒子でありうる。

ある特定の実施形態において、ビーズは、磁気ビーズ又は磁性粒子でありうる。磁気ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体でありうる。例示的な強磁性材料は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ_２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、ＮｉＯ／Ｆｅを含む。フェリ磁性材料の例は、ＮｉＦｅ_２Ｏ_４、ＣｏＦｅ_２Ｏ_４、Ｆｅ_３Ｏ_４（又はＦｅＯ．Ｆｅ_２Ｏ_３）を含む。ビーズは、磁性であり、１つ以上の非磁性層により取り囲まれた固体コア部分を有しうる。代替的に、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層でありうる。第１の特異的結合メンバーが固定化される固体支持体は、乾燥形態又は液体で保管されうる。磁気ビーズは、第１の特異的結合メンバーが固定化される磁気ビーズを伴う試料と接触させる前に、又はこの後で、磁界下に置かれうる。

接触ステップの後で、試料及び第１の特異的結合メンバーは、結合メンバーと解析物との結合相互作用が生じることを可能とするのに十分な時間にわたりインキュベートされうる。加えて、インキュベートすることは、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝液中でありうる。第１の特異的結合メンバー及び／又は第２の特異的結合メンバーの結合親和性及び／又は特異性は、結合緩衝液を変えることにより、アッセイにおいて操作又は変更されうる。一部の実施形態において、結合親和性及び／又は特異性は、結合緩衝液を変えることにより、増大させられうる。一部の実施形態において、結合親和性及び／又は特異性は、結合緩衝液を変えることにより、減少させられうる。

第１の特異的結合メンバー及び／又は第２の特異的結合メンバーの結合親和性及び／又は特異性は、下記で記載される、開示された方法を使用して測定されうる。一部の実施形態において、試料の１つのアリコートは、１つの条件のセットを使用してアッセイされ、異なる条件のセットを使用してアッセイされる、試料の別のアリコートと比較され、これにより、条件の、結合親和性及び／又は特異性に対する影響が測定される。例えば、条件の変化又は変更は、標的解析物を、試料から除去すること、結合について、標的解析物又はリガンドと競合する分子を添加すること及びｐＨ、塩濃度又は温度を変化させることのうちの１つ以上でありうる。加えて、又は代替的に、時間の持続は、可変的であることが可能であり、条件の変化は、検出法を再度実施する前に、時間の持続にわたり待機することを含みうる。

結合緩衝液は、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性デタージェント（Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）のような、抗原－抗体間結合緩衝液に標準的な分子を含みうる。ある特定の場合、結合緩衝液は、試料を添加する前に、又はこの後で、マイクロ流体チップ、チャンバーなどへと添加されうる。ある特定の場合、第１の特異的結合メンバーは、試料と接触させる前に、結合緩衝液中に存在しうる。結合メンバーと解析物との結合相互作用が生じるための時間の長さは、経験的に測定される場合があり、結合メンバーと解析物との結合親和性及び結合アビディティーに依存しうる。ある特定の実施形態において、接触させること又はインキュベートすることは、１０秒間～３０分間又は１分間～１５分間又は５分間～１０分間、例えば、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間又は２時間のような、５秒間～１時間の時間にわたりうる。温度、塩濃度のような、結合相互作用についての他の条件もまた、経験的に、又は製造元の指示書に基づき測定されうる。例えば、接触させることは、室温（２１℃～２８℃、例えば、２３℃～２５℃）、３７℃又は４℃で実行されうる。ある特定の実施形態において、試料の、第１の特異的結合メンバーとの、任意選択の混合は、接触ステップ時に実行されうる。

固定化された第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体形成の後、結合していない全ての解析物は、試料と共に、第１の特異的結合メンバーの近傍から除去されうるが、第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体は、固体支持体とのその会合のために保持されうる。任意選択的に、固体支持体は、固体支持体に非特異的に結合した、全ての分子を除去するように、洗浄緩衝液と接触させられうる。

第１の接触ステップ並びに任意選択の試料の除去ステップ及び／又は任意選択の洗浄ステップの後で、第１の特異的結合メンバーと解析物との複合体は、第２の特異的結合メンバーと接触させられ、これにより、解析物への、２つの結合メンバーによる結合がなされた、サンドイッチ複合体の形成をもたらしうる。第２のメンバーの、第１の特異的結合メンバー－解析物複合体との、任意選択の混合は、第２の接触ステップ時に実行されうる。一部の実施形態において、表面に対する解析物分子の固定化は、解析物分子を、表面から押しのける懸念を伴わずに、全ての過剰な第２の特異的結合メンバーを、溶液から除去する一助となりうる。一部の実施形態において、第２の特異的結合メンバーは、これへと接着されたシグナル発生化合物を含みうる。

上記で言及された通り、第２の接触させるステップは、解析物と、第２の特異的結合メンバーとの結合相互作用に十分な条件下で実行されうる。第２の接触させるステップの後、結合していない全ての第２の特異的結合メンバーが除去され、その後、任意選択の洗浄ステップが行われうる。結合していない全ての第２の特異的結合メンバーは、液滴アクチュエーション、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電アクチュエーション、電界媒介法、電極媒介法、毛細管力、クロマトグラフィー、遠心分離又は吸引のような、適切な手段により、第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバーの複合体から分離されうる。結合していない全ての第２の特異的結合メンバーが、第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバーの複合体の近傍から除去されると、第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバーの複合体内に存在する、第２の特異的結合メンバーへと接着されたシグナル発生化合物は、適切な手段により分離されうる。

ある特定の実施形態において、第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体からの、シグナル発生化合物の分離が、複合体の破壊を結果としてもたらさない条件下で実行される結果として、シグナル発生化合物だけの、複合体からの放出がもたらされる。他の場合、第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体からの、シグナル発生化合物の分離が、複合体の破壊を結果としてもたらしうる条件下で実行される結果として、シグナル発生化合物のほか、第２の特異的結合メンバー、解析物、第１の特異的結合メンバーのうちの１つ以上の、複合体からの放出がもたらされる。

シグナル発生化合物分子の数は、試料中の解析物の濃度と比例する、複合体内の解析物分子の数と相関する。ある特定の実施形態において、シグナル発生化合物と解析物濃度との相関は、正相関でありうる（シグナル発生化合物分子が多いほど、解析物濃度が高くなるという関連がある。）。トレーサー（本明細書で規定された）のような、シグナル発生化合物でタグ付けされた競合物又は解析物が、試料と組み合わされ、これらのシグナル発生化合物でタグ付けされた競合物又は解析物が、第１の特異的結合メンバーへの結合について、試料中の解析物と競合する実施形態において、シグナル発生化合物と解析物濃度との相関は、逆相関でありうる（シグナル発生化合物分子が少ないほど、解析物濃度が高くなるという関連がある。）。シグナル発生化合物分子の数と解析物濃度との相関は、正相関であれ、逆相関であれ、線形相関又は対数相関でありうる。

ある特定の実施形態において、複数の異なる第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーを使用することにより、単一試料中の、複数の解析物の同時的な解析が実施されうるが、この場合、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーとの対は、試料中の単一の解析物に特異的である。これらの実施形態において、単一の解析物に特異的な、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーとの、第１の対の、第２の特異的結合メンバーと関連する、シグナル発生化合物は、異なる解析物に特異的な、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーとの、第２の対の、第２の特異的結合メンバーと関連する、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質と識別可能でありうる。上記で言及された通り、第１のシグナル発生化合物は、基質の差違に基づき、第２のシグナル発生化合物又はシグナル発生基質と識別可能でありうる。

一部の実施形態において、実質的に正確に測定されうる、解析物の液体試料中濃度は、約５０００ｆＭ（フェムトモル）未満、約３０００ｆＭ未満、約２０００ｆＭ未満、約１０００ｆＭ未満、約５００ｆＭ未満、約３００ｆＭ未満、約２００ｆＭ未満、約１００ｆＭ未満、約５０ｆＭ未満、約２５ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約５ｆＭ未満、約２ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約５００ａＭ（アットモル）未満、約１００ａＭ未満、約１０ａＭ未満、約５ａＭ未満、約１ａＭ未満、約０．１ａＭ未満、約５００ｚＭ（ゼプトモル）未満、約１００ｚＭ未満、約１０ｚＭ未満、約５ｚＭ未満、約１ｚＭ未満、約０．１ｚＭ未満又はこれ以下である。

場合によって、検出限界（例えば、溶液中で測定されうる、解析物の最低濃度）は、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、約１ｆＭ、約５００ａＭ（アットモル）、約１００ａＭ、約５０ａＭ、約１０ａＭ、約５ａＭ、約１ａＭ、約０．１ａＭ、約５００ｚＭ（ゼプトモル）、約１００ｚＭ、約５０ｚＭ、約１０ｚＭ、約５ｚＭ、約１ｚＭ、約０．１ｚＭ以下である。一部の実施形態において、実質的に正確に測定されうる、解析物の液体試料中濃度は、約５０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約３０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭ～約０．１ｚＭの間、約１００ｆＭ～約１ｚＭの間、約１００ａＭ～約０．１ｚＭの間又はこれ以下である。

検出の上限（例えば、溶液中で測定されうる、解析物の最高濃度）は、少なくとも約１００ｆＭ、少なくとも約１０００ｆＭ、少なくとも約１０ｐＭ（ピコモル）、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｎＭ（ナノモル）、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１０００μＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１０００ｍＭ以上である。

場合によって、解析物の、試料中の存在及び／又は試料中濃度は、迅速に、通例、約１時間未満で、例えば、４５分間、３０分間、１５分間、１０分間、５分間、１分間又は３０秒間で検出されうる。

一部の実施形態において、１つ以上の、検出されたシグナルは、結合メンバーの、解析物への結合イベントに対応する。一部の実施形態において、１つの、検出されたシグナルは、結合メンバーの、解析物への結合イベントに対応する。一部の実施形態において、２つ以上の、検出されたシグナルは、結合メンバーの、解析物への結合イベントに対応する。

一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーを含む固体支持体は、試料へと、逐次的に、又は同時に添加される。

ａ）着色剤
本発明において、着色剤は、フェムトリットルチャンバーの形成の前に、又はこの後で添加される。着色剤は、水性相を除去する、時間のかかるステップを必要とせずに、上相内の蛍光物質のグローを抑制する。一部の実施形態において、着色剤は、シグナル発生基質と同時に添加される。一部の実施形態において、着色剤は、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の前に添加される。一部の実施形態において、着色剤は、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の後で添加される。一部の実施形態において、着色剤は、置きかえられた水性相又はシーリング剤相（例えば、油相）へと添加される。

一部の実施形態において、着色剤は、黒インク、色素成分又は顔料ベースの組成物のような、黒色インク又は暗色インクのような、黒の着色剤である。一部の実施形態において、着色剤は、墨汁、アシッドブラック２、アシッドオレンジ７、ディレクトブルー１４又はこれらの組合せである。任意の適切な色素成分は、デジタル測定法における、シグナルの検出に使用される蛍光材料に応じて選択されうる。例えば、ＡＯ７と試薬ＤＢｕ１４試薬との組合せは、この組合せは、フェムトリットルチャンバー内のフルオレセインシグナルに、効果的に影響を及ぼしうるので、使用されうる。一部の実施形態において、色素の組合せは、任意のアッセイのために、標的（好ましい）発光シグナルを観察するように選択されうる（例えば、図１２を参照されたい。）。

ｉ）墨汁
墨汁（墨液としてもまた公知である）とは、液体を形成するように、水と組み合わされた、油煙として公知の、様々な微粒煤から構成される、単純黒色又は有色のインクである。炭素分子は、コロイド状懸濁状態にあり、乾燥後に、防水層を形成する。乾燥したときのインクの耐久性を大きくするように、ゼラチン又は、より一般に、シェラックのような結合剤が添加されうるが、結合剤は、不要である。墨汁は、ボトル形態又は使用の前に、すり潰し、水と混合しなければならない、墨としての固体形態でありうる（最も一般に、墨でありうる）。結合剤を使用する場合、墨汁は、防水性又は非防水性でありうる。

ｉｉ）アシッドブラック２
ニグロシンとしてもまた公知のアシッドブラック２とは、主に、アニリンから得られる、濃黒色の顔料（又は色素）である。アシッドブラック２の化学構造は、図９Ｂに示される。

ｉｉｉ）アシッドオレンジ７
２－ナフトールオレンジ、オレンジＩＩ又はアシディックオレンジＩＩとしてもまた公知のアシッドオレンジ７（「ＡＯ７」）とは、２－ナフトール又はβ－ナフトールと、スルファニル酸のジアゾニウム化合物との間カップリング反応により生成される色素である。アシッドオレンジ７の化学構造は、図９Ｃに示される。

ｉｖ）ディレクトブルー１４
トリパンブルー及びＶｉｓｉｏｎＢｌｕｅとしてもまた公知のディレクトブルー１４（「ＤＢＵ１４」）とは、染料として、広く使用される、ジアゾナフタレンスルホネートである。ディレクトブルー１４の化学構造は、図９Ｃに示される。

ｂ）「添加」法
着色剤は、「添加」法を使用して、バックグラウンド蛍光を低減するのに使用されうる。「添加」法は、フェムトリットルチャンバー内の、バックグラウンド蛍光ノイズを、効果的に低減するように、水性相が、シーリング剤（例えば、油）（すなわち、蛍光物質を含む上部液相）により置きかえられた後で、着色剤を、水性相又は水性相溶液へと添加する、又は着色剤を、シーリング剤（例えば、油）へと添加するステップを含む。着色剤は、上部液相中又は水性相中の、蛍光物質のグローを抑制する。例えば、「黒インクの添加」法は、黒インクを、シーリング剤（例えば、油）による、水性相の置きかえの後における、水性相若しくは水性相溶液へと、又はシーリング剤（例えば、油）へと添加するステップを伴うので、水性相溶液を除去する、時間のかかるステップは、必要でない。

ｃ）「プレミックス」法
着色剤は、「プレミックス」法を使用して、バックグラウンド蛍光を低減する（図７Ａを参照されたい。）のに使用されうる。「プレミックス」法は、水性相又は水性相溶液自体が、黒色のような暗色であるため、シーリング剤（例えば、油）によるシーリングの後の、さらなる手順を必要とせず、したがって、シーリング剤（例えば、油）の反転だけが必要とされるので、手順は、簡略化され、より効率的である。黒インクのような着色剤が、シグナル発生基質と共に、それへと接着されたシグナル発生化合物を含む、洗浄された固体支持体複合体を含む、水性相又は水性相溶液へと添加される、又はシグナル発生基質が、洗浄された固体支持体複合体へと添加される前に、シグナル発生化合物又は洗浄された固体支持体複合体を含有する、水性相又は水性相溶液へと添加される。黒インクのような着色剤を、水性相又は水性相溶液と、あらかじめ混合すれば、上部液相（水性相）が、蛍光物質を含んでもなお、フルオレセインのグローを抑制しうる。例えば、「黒インクプレミックス」法は、黒インクを、反応させたシグナル発生化合物／シグナル発生基質（すなわち、酵素／基質）溶液と混合するステップを伴うので、水性相溶液を除去する、時間のかかるステップは必要でない。

ｄ）シーリング剤
本発明において、反応槽は、水性相より大きな密度を有する、親水性溶媒又は疎水性溶媒のようなシーリング剤を使用して、１つ以上の溶媒を添加すること（「溶媒ウェルシーリング」）により、シーリングされる、又は覆われる。使用されうる親水性溶媒は、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル溶媒、ジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド又はこれらの混合物を含む。親水性アルコールの例は、エタノール、メタノール、プロパノール及びグリセリンを含む。親水性エーテルの例は、テトラヒドロフラン、酸化ポリエチレン及び１，４－ジオキサンを含む。ケトンの例は、アセトン及びメチルエチルケトンを含む。ニトリル溶媒の例は、アセトニトリルを含む。使用されうる疎水性溶媒は、炭水化物、不飽和炭水化物、芳香族炭水化物、シリコーン油、ペルフルオロカーボン、ハロゲン溶媒、疎水性イオン性液体及びこれらの混合物を含む。飽和炭水化物の例は、デカン及びヘキサデカンのようなアルカンを含む。不飽和炭水化物の例は、スクアレンを含む。芳香族炭水化物の例は、ベンゼン及びトルエンを含む。ペルフルオロカーボンの例は、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、ＦＣ－４０、ＦＣ－７２、ＦＣ－８４、ＦＣ－７７、ＦＣ－３２５５、ＦＣ－３２８３、ＦＣ－４３、ＦＣ－７０）、３Ｍ Ｎｏｖｅｃ ４２００、３Ｍ Ｎｏｖｅｃ ４３００、３Ｍ ＦＣ－４４３２、３Ｍ ＦＣ－４４３０又は３Ｍ ＦＣ－４４３４を包含する。ハロゲン溶媒の例は、クロロホルム、塩化メチレン及びクロロベンゼンを包含する。疎水性のイオン性液体とは、少なくとも水中で解離しない、イオン性液体を表す。イオン性液体の例は、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートを含む。

ｅ）シグナル発生化合物及びシグナル発生基質
解析物の検出に、検出可能な生成物又は検出可能な標識、すなわち、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質により発生したシグナルにより相関付けられる。一部の実施形態において、少なくとも１つのシグナル発生化合物は、酵素であり、少なくとも１つのシグナル発生基質は、酵素に対する基質である。一部の実施形態において、酵素に対する基質は、比色基質、蛍光発生（非蛍光発生）基質又は色原性基質である。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、蛍光シグナルである。例えば、酵素は、ポリヌクレオチダーゼ、アルギナーゼ、アデナーゼ、アミノポリペプチダーゼ、ペプシン、リパーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、グリコキサラーゼ、アルドラーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ（ベータ－ガラクトシダーゼのような）、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ及びヘキソキナーゼ又はこれらの組合せでありうる。使用されうる酵素基質の例は、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）、（二ナトリウム４－クロロ－３－（メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸）、ＣＳＰＤ（登録商標）又は（二ナトリウム３－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝－４－イル）フェニルリン酸）のような化学発光基質；ｐ－ニトロフェニルリン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイルリン酸（ＢＣＩＰ）、４－ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）又はインドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）のような発光基質；４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）のような蛍光基質及び５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイルリン酸（ＢＣＩＰ）、二ナトリウム５－ブロモ－６－クロロ－インドイルリン酸又はｐ－ニトロフェニルリン酸のような色原性基質を含む。

一部の態様において、使用されうる酵素は、酵素の活性結合部位以外の部位に結合した阻害剤分子（タンパク質、ペプチドなどのような）を含有する酵素を含む。このような阻害剤分子は、酵素の活性結合部位のコンフォメーションを変化させ、酵素が、基質に結合することを防止する。阻害剤分子の例は、プロテアーゼ阻害剤を含む。阻害剤は、酵素が、基質に結合することを可能とし、これにより、シグナル発生反応が生じることを可能とするように、当技術分野で公知である、規定の技法を使用して、酵素から除去されうる。

一部の実施形態において、酵素は、非蛍光基質を、蛍光基質へと転換しうる。一部の実施形態において、酵素は、色原性基質を使用して、発色しうる。

３．蛍光デジタルイムノアッセイにおいて、蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法
開示された方法はまた、上記で記載された、試料中の解析物を検出するのに使用される蛍光デジタルイムノアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法にも関する。ＣＹＴＯＰ、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）及び他の樹脂のような固相材料は、一部のバックグラウンドノイズを増大させることにより、検出に影響を及ぼす、自己蛍光を有する。開示された方法は、黒色デバイスを含むデジタル計数デバイスを使用する。黒色デバイスは、カーボンブラックを含む固相材料又は透明デバイスに接着された黒色薄膜シートを含む。カーボンブラック又は黒色薄膜シートを含む固相材料は、自己蛍光を低減しうる。一部の実施形態において、固相材料は、ＣＹＴＯＰ、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。一部の実施形態において、固相材料は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリカーボネート（ＰＣ）又はポリプロピレン（ＰＰ）を含む。一部の実施形態において、黒色デバイスは、ナノウェルへの励起光及びナノウェルからのシグナル光が伝搬するように、十分に厚い。一部の実施形態において、デバイスの厚さは、約０．１ｍｍ～約１ｍｍの間、約０．５ｍｍ～約１ｍｍの間、約０．１ｍｍ～約０．７５ｍｍ、約０．５ｍｍ～約０．７５ｍｍである。一部の実施形態において、デバイスの厚さは、約１ｍｍ未満、約０．９ｍｍ未満、約０．８ｍｍ未満、約０．７ｍｍ未満、約０．６ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約０．４ｍｍ未満、約０．３ｍｍ未満、約０．２ｍｍ未満又は約０．１ｍｍ未満である。

一部の実施形態において、方法は、解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；複数の反応槽を、シーリング剤（例えば、油）で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤（例えば、油）により置きかえられるステップ；及びデジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップを含む。一部の実施形態において、方法は、上記で記載された着色剤を添加するステップをさらに含む。一部の実施形態において、着色剤は、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質と同時に添加される、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の前に添加される、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の後で添加される、置きかえられた水性相へと添加される、又は上記で記載されたシーリング剤（例えば、油）へと添加される。

４．特異的結合メンバー
当業者により理解される通り、結合メンバーは、解析される解析物により測定される。多種多様な標的分子に対する結合メンバーが公知であるか、又は公知の技法を使用して、たやすく見出されうる、若しくは開発されうる。例えば、標的解析物が、タンパク質である場合、結合メンバーは、タンパク質、特に、抗体又はこの断片（例えば、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の動物に由来する重鎖可変ドメイン（「ＶＨＨ」；「ＶＨＨ断片」としてもまた公知である）（ＶＨＨ及びそれらを作製する方法は、Ｇｏｔｔｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１４：７７～８５（２００９）において記載されている）、組換えＶＨＨ単一ドメイン抗体及びＶ_ＮＡＲ断片のような単一ドメイン抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体並びに上記のうちのいずれかの、機能的に活性のエピトープ結合性断片、全長ポリクローナル抗体又は全長モノクローナル抗体、抗体様断片など）、受容体タンパク質、プロテインＡ、プロテインＣなどのような、他のタンパク質を含みうる。解析物が、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質のような低分子である場合、第１の特異的結合メンバー及び／又は第２の特異的結合メンバーは、足場タンパク質（例えば、リポカリン）又は受容体でありうる。場合によって、タンパク質解析物に対する結合メンバーは、ペプチドでありうる。例えば、標的解析物が、酵素である場合、適切な結合メンバーは、酵素基質及び／又はペプチド、低分子などでありうる酵素阻害剤を含みうる。場合によって、標的解析物が、リン酸化分子種である場合、結合メンバーは、リン酸結合剤を含みうる。例えば、リン酸結合剤は、米国特許第７，０７０，９２１号及び米国特許出願第２００６／０１２１５４４号において記載されている金属イオン親和性培地のような、金属イオン親和性培地を含みうる。

標的分子が、炭水化物である場合、潜在的に適切な捕捉構成要素（本明細書で規定された）は、例えば、抗体、レクチン及びセレクチンを含む。当業者により理解される通り、目的の標的分子と、特異的に会合しうる、任意の分子は、潜在的に、結合メンバーとして使用されうる。

ある特定の実施形態について、適切な標的解析物／結合メンバー複合体は、抗体／抗原、抗原／抗体、受容体／リガンド、リガンド／受容体、タンパク質／核酸、酵素／基質及び／又は阻害剤、炭水化物（糖タンパク質及び糖脂質を含む）／レクチン及び／又はセレクチン、タンパク質／タンパク質、タンパク質／低分子などを含みうるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、第１の特異的結合メンバー及び／又は第２の特異的結合メンバーは、結合メンバーの、支持体への接着を容易とする、支持体及び／又は結合メンバーの任意の部分、官能化、又は修飾を含みうる、連結を介して、固体支持体へと接着されうる。結合メンバーと支持体との連結は、１つ以上の化学的結合若しくは物理的結合（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、静電相互作用、疎水性／親水性相互作用などを介する非特異的接着）及び／又はこのような結合をもたらす化学的スペーサーを含みうる。

ある特定の実施形態において、固体支持体はまた、検出時の偽陽性シグナル又はシグナルの喪失につながる可能性のあるアッセイ中における、非捕捉構成要素（例えば、解析物分子、結合メンバー）の結合表面への非特異的接着を除去、又は最小化する保護、ブロッキング、又は不動態化（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， ｂｌｏｃｋｉｎｇ， ｏｒ ｐａｓｓｉｖａｔｉｎｇ）層も含みうる。ある特定の実施形態において、保護層を形成するのに用いられうる材料の例は、タンパク質の非特異的結合に反発するポリ（エチレングリコール）のようなポリマー；血清アルブミン及びカゼインのような、この特性を伴う天然のタンパク質；界面活性剤、例えば、スルホベタインのような両性イオン性界面活性剤；天然の長鎖脂質；ポリマーブラシ及びサケ精子ＤＮＡのような核酸を含むがこれらに限定されない。

ある特定の実施形態は、タンパク質又はポリペプチドである結合メンバーを用いる。当技術分野で公知の通り、任意の数の技法が、ポリペプチドを、多種多様な固体支持体へと接着するのに使用されうる。反応性部分を、タンパク質へと付加するのに、多種多様な技法、例えば、米国特許第５，６２０，８５０号において概括されている方法が公知である。さらに、タンパク質を、表面へと接着するための方法が公知である（例えば、Ｈｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照されたい。）。

本明細書で説明される通り、結合メンバーと解析物との結合は、例えば、結合メンバーと解析物とが、結合対の相補的部分である場合にそうであるように、特異的である。ある特定の実施形態において、結合メンバーは、解析物に特異的に結合する。「～に特異的に結合する」又は「結合特異性」により、結合メンバーは、解析物分子と他の構成要素又は被験試料の夾雑物とを差別化するのに十分な特異性で、解析物分子に結合することが意味される。例えば、一実施形態に従う結合メンバーは、解析物上のエピトープに特異的に結合する抗体でありうる。一実施形態に従う抗体は、目的の解析物に特異的に結合することが可能な、任意の抗体でありうる。例えば、適切な抗体は、モノクローナル抗体、二特異的抗体、ミニボディー、ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｈｏｌｔら（２０１４）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：４８４～４９０において記載されているようなｄＡｂであり、天然のｓｄＡｂ、例えば、軟骨魚及びラクダ科動物におけるｓｄＡｂである、若しくは合成のｓｄＡｂ、例えば、ナノボディーである、単一ドメイン抗体のｓｄＡｂ、ＶＨＨ、又は他のドメイン構造を含む）、合成抗体（場合によって、抗体模倣体と称する）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（場合によって、「抗体コンジュゲート」と称する）及び各々それぞれの断片を含むがこれらに限定されない。別の例として述べると、解析物分子は、抗体であることが可能であり、第１の特異的結合メンバーが、抗原であることが可能であり、第２の特異的結合メンバーは、標的抗体に特異的に結合する二次抗体でありうる、又は第１の特異的結合メンバーが、標的抗体に特異的に結合する二次抗体であることが可能であり、第２の特異的結合メンバーは、抗原でありうる。

一部の実施形態において、結合メンバーは、化学的プログラム抗体（ｃｐＡｂ）（Ｒａｄｅｒ（２０１４）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２：１８６～１９７において記載されている）、二特異的ｃｐＡｂ、抗体動員分子（ＡＲＭ）（ＭｃＥｎａｎｅｙら（２０１２）、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、７：１１３９～１１５１において記載されている）、３リガンド捕捉剤のような分枝状捕捉薬剤（Ｍｉｌｌｗａｒｄら（２０１１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３３：１８２８０～１８２８８において記載されている）、モノボディー（ヒトフィブロネクチンの、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来する）、アフィボディー（Ａ型免疫グロブリン結合性タンパク質に由来する）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートモジュールに基づく）、アンチカリン（リポカリンである、ビリン結合性タンパク質及びヒト２型リポカリンに由来する）及びシステインノットペプチド（ノッチン）（Ｇｉｌｂｒｅｔｈ及びＫｏｉｄｅ（２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２２：１～８；Ｂａｎｔａら（２０１３）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１５：９３～１１３において記載されている）のような、非抗体足場に由来する、操作結合タンパク質、ＷＷドメイン（Ｐａｔｅｌら（２０１３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２６（４）：３０７～３１４において記載されている）、転用受容体リガンド、アフィチン（Ｂｅｈａｒら（２０１３）、２６：２６７～２７５において記載されている）及び／又はＡｄｈｉｒｏｎ（Ｔｉｅｄｅら（２０１４）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２７：１４５～１５５において記載されている）でありうる。

解析物が、生体細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、他の脊椎動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞など）である一実施形態に従い、結合メンバーは、細胞表面抗原（例えば、細胞表面受容体）に対する特異的親和性を有するリガンドでありうる。一実施形態において、結合メンバーは、標的細胞型の表面上で発現がなされる細胞接着分子に対する結合特異性を有する、接着分子受容体又はこの一部でありうる。使用においては、接着分子受容体は、標的細胞の細胞外表面上の接着分子と結合し、これにより、細胞を固定化する、又は捕捉し、次いで、結合がなされた細胞は、第１の特異的結合メンバーと同じでありうる、又は細胞の表面上で発現がなされる、異なる分子に結合しうる第２の特異的結合メンバーを使用することにより検出されうる。

一部の実施形態において、解析物分子と結合メンバーとの結合親和性は、非特異的に結合がなされた分子又は粒子を除去する洗浄ステップを含む、アッセイ条件下で、結合を維持するのに十分であるものとする。場合によって、例えば、ある特定の生体分子を検出するとき、解析物分子の、その相補的な結合メンバーに対する結合定数は、少なくとも約１０^４～約１０^６Ｍ^－１の間、少なくとも約１０^５～約１０^９Ｍ^－１の間、少なくとも約１０^７～約１０^９Ｍ^－１の間、及び約１０^９Ｍ^－１以上でありうる。

５．例示的な標的解析物
当業者により理解される通り、第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーにより、特異的な結合がなされうる任意の解析物は、本開示の方法及びデバイスを使用して検出し、任意選択的に、定量化されうる。

一部の実施形態において、解析物は、生体分子又は生物学的分子でありうる。生体分子及び生物学的分子の非限定例は、タンパク質、脂質及び炭水化物のような高分子を含む。ある特定の場合、解析物は、ホルモン、抗体、増殖因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経受容体、ホルモン受容体、栄養物質受容体及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド、がんマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦアルファ）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン、クレアチニンキナーゼ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ－プロＢＮＰ、ＣＫ－ＭＢ、ガレクチン３など）、甲状腺マーカー（例えば、抗Ｔｇ、抗ＴＰＯ、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４、Ｔ取込み、全Ｔ３、全Ｔ４、ＴＳＨ）、毒素、薬物（例えば、中毒性薬物）、代謝性薬剤（例えば、ビタミンを含む）などでありうる。タンパク質解析物の非限定的実施形態は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などを含む。一部の実施形態において、解析物は、外傷性脳損傷、敗血症又は凝固についてのバイオマーカーのようなバイオマーカー、一般化学反応に関与する解析物（例えば、アンモニア、ＡＳＴ、コレステロールなど）、タンパク質（例えば、トランスフェリン、ＣＲＰなど）、治療薬のモニタリングのための解析物（例えば、メトトレキサート）、移植のための解析物（例えば、タクロリムス）、乱用薬物、又は遺伝障害についてのバイオマーカーでありうる。

ある特定の実施形態において、解析物は、翻訳後修飾されたタンパク質（例えば、リン酸化タンパク質、メチル化タンパク質、グリコシル化タンパク質）であることが可能であり、第１の特異的結合メンバー又は第２の特異的結合メンバーは、翻訳後修飾に特異的な抗体でありうる。修飾タンパク質は、固体支持体上に固定化された、第１の特異的結合メンバーに結合することが可能であり、この場合、第１の特異的結合メンバーは、修飾タンパク質に結合するが、非修飾タンパク質に結合しない。他の実施形態において、第１の特異的結合メンバーは、非修飾タンパク質及び修飾タンパク質の両方に結合することが可能であり第２の特異的結合メンバーは、翻訳後修飾タンパク質に特異的でありうる。

一部の実施形態において、解析物は、循環腫瘍細胞のような細胞、病原性細菌、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、フィロウイルス（例えば、西ナイルウイルス、エボラウイルス及びジカウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型）；ＨＰＶ、パルボウイルスなどを含む）、芽胞などでありうる。

本明細書における方法により解析されうる解析物は、Ａβ４２アミロイドベータ－タンパク質、フェチュイン－Ａ、タウ、セクレトグラニンＩＩ、プリオンタンパク質、アルファ－シヌクレイン、タウタンパク質、ニューロフィラメント軽鎖、パーキン、ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼ１、ＤＪ－１、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、突然変異ＡＴＰ１３Ａ２、ＡｐｏＨ、セルロプラスミン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子１アルファ（ＰＧＣ－１α）、トランスサイレチン、ビタミンＤ結合性タンパク質、活性Ｂ１２、Ｂ１２、コルチゾール、葉酸、フストサミン、ホモシステイン、無傷ＰＴＨ、ペプシノーゲンＩ及びＩＩ、ＤＨＥＡ－Ｓ、エストラジオール、ｈＣＧ、プロゲステロン、プロラクチン、ＳＨＢＧ、テストステロン、アポトーシス促進性キナーゼＲ（ＰＫＲ）及びそのリン酸化ＰＫＲ（ｐＰＫＲ）、ＩＬ－１２ｐ４０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ－８、Ｄｋｋ－３（精液）、ｐ１４エンドカン断片、血清、ＡＣＥ２、ＣＤ２５に対する自己抗体、ｈＴＥＲＴ、ＣＡＩ２５（ＭＵＣ１６）、ＶＥＧＦ、ｓＩＬ－２、オステオポンチン、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、アルファ－フェトタンパク質、アルブミン、アルブミン尿、微量アルブミン尿、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、シスタチンＣ、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、腎損傷分子１（ＫＩＭ－１）、肝脂肪酸結合性タンパク質（Ｌ－ＦＡＢＰ）、ＬＭＰ１、ＢＡＲＦ１、ＩＬ－８、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＩ、ＥＧＲＦ、ＦＧＦ１９、ＦＲＳ２、ＧＲＥＢ１及びＬＺＴＳ１、アルファ－アミラーゼ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、チオレドキシン、ウイルスのベータ－２マイクログロブリンレベルモニター活性、ウイルスの腫瘍壊死因子アルファ受容体モニター活性、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＨＥ－４、ＰＩＶＫＡ－１１、ＰｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ＴＩＡＭ１（Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）、Ｎ－カドヘリン、ＥＣ３９、アンフィレグリン、ｄＵＴＰアーゼ、分泌性ゲルソリン（ｐＧＳＮ）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、サイモシンβ１５、インスリン、血漿Ｃ－ペプチド、グリコシル化ヘモグロビン（ＨＢＡ１ｃ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＡＲＨＧＤＩＢ（Ｒｈｏ ＧＤＰ－ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２）、ＣＦＬ１（コフィリン１）、ＰＦＮ１（プロフィリン１）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ）、Ｓ１００Ａ１１（Ｓ１００－Ａ１１タンパク質）、ＰＲＤＸ６（ペルオキシレドキシン６）、ＨＳＰＥ１（１０ｋＤａのミトコンドリア性熱ショックタンパク質）、ＬＹＺ（リゾチームＣ前駆体）、ＧＰＩ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ（ヒストンＨ２Ａ ２－Ａ型）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＳＰＧ２（基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（ガレクチン３結合性タンパク質前駆体）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ前駆体）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ前駆体）、ＩＱＧＡＰ１（Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質であるＩＱＧＡＰ１）、ＣＰ（セルロプラスミン前駆体）及びＩＧＬＣ２（ＩＧＬＣ１タンパク質）、ＰＣＤＧＦ／ＧＰ８８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ４、ＩＧＦ－ＩＲ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、Ａｋｔ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＨＩＰ、Ｇｒｂ２、Ｇａｂ２、ＰＤＫ－１（３－ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１）、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｍＴＯＲ、ＭＩＧ－６（ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害剤１）、Ｓ６Ｋ、ｓｒｃ、ＫＲＡＳ、ＭＥＫマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１、ｃＭＹＣ、ＴＯＰＯＩＩトポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ１７０ｋＤａ、ＦＲＡＰ１、ＮＲＧ１、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＧＲ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＥＤＤ４－１、ＦＯＸＯ３Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＸＮ、ＥＬＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＡＲ、ＥＰＨＢ２、ＫＬＦ６、ＡＮＸＡ７、ＮＫＸ３－１、ＰＩＴＸ２、ＭＫＩ６７、ＰＨＬＰＰ、アジポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、レプチン（ＬＥＰ）、終末糖化産物特異的受容体（ＲＡＧＥとしても知られるＡＧＥＲ）、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、ＣＤ１４分子（ＣＤ１４）、フェリチン（ＦＴＨ１）、インスリン様増殖因子結合性タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ２ＲＡ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）及びフォンウィレブラント因子（ＶＷＦ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＩＬ１α、ＴＮＦα、核周囲型抗好中球細胞質抗体（ｐ－ＡＮＣＡ）、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ウィルムス腫瘍１タンパク質、アクアポリン１、ＭＬＬ３、ＡＭＢＰ、ＶＤＡＣ１、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンテロトキシン（易熱性外毒素、耐熱性エンテロトキシン）、インフルエンザＨＡ抗原、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス菌毒素、志賀毒素、志賀様毒素Ｉ、志賀様毒素ＩＩ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及びＢなどを含む。

環境試料、対象の方法を使用して、それを必要とする患者又は対象から得られる生物学的試料のような試料中で測定されうる、例示的な標的は、乱用薬物（例えば、コカイン）、タンパク質バイオマーカー（を含むがこれらに限定されない、ヌクレオリン、核内因子ｋＢ必須モジュレーター（ＮＥＭＯ）、ＣＤ－３０、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＭＵＣ１糖形態、免疫グロブリンμ重鎖（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンＥ、αｖβ３インテグリン、α－トロンビン、ＨＩＶｇｐ１２０、ＮＦ－κＢ、Ｅ２Ｆ転写因子、ＨＥＲ３、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、テネイシンＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、胃がん細胞であるＨＧＣ－２７；細胞（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん細胞（ＤＬＤ－１）、Ｈ２３肺腺がん細胞、ラモス細胞、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＨＬ６０）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞、ＮＣＩＨ６９、ヒト神経膠芽腫細胞、Ｕ１１８－ＭＧ、ＰＣ－３細胞、ＨＥＲ－２過剰発現性ヒト乳がん細胞、ＳＫ－ＢＲ－３、膵臓がん細胞系（Ｍｉａ－ＰａＣａ－２）を含むがこれらに限定されない）及び感染作用物質（マイコバクテリウム・ツベルキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、シゲラ・ジセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｏ８及びサルモネラ・エンテリチジス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を含むがこれらに限定されない）を含む。

対象の方法を使用して、それを必要とする患者又は対象から得られる試料中で測定されうる、例示的な標的は、ＨＢＶコアカプシドタンパク質、ＣＤＫ２、Ｅ２Ｆ転写因子、チミジル酸シンターゼ、Ｒａｓ、ＥＢ１及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）を含むがこれらに限定されない。

６．試料
本明細書で使用された「試料」、「被験試料」、「生物学的試料」とは、目的の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を指す。試料は、任意の適切な供給源に由来しうる。場合によって、試料は、液体、流動性の粒子状固体、又は固体粒子の懸濁流体を含みうる。場合によって、試料は、本明細書で記載された解析の前に処理されうる。例えば、試料は、解析の前に、その供給源から、分離又は精製されうるが、ある特定の実施形態において、解析物を含有する非処理試料が、直接的アッセイされうる。解析物分子の供給源は、合成供給源（例えば、検査室内で生成された）、環境（例えば、空気試料、土壌試料、液体試料、例えば、給水など）、動物、例えば、哺乳動物、植物又はこれらの任意の組合せでありうる。特定の例において、解析物の供給源は、ヒト体内物質（例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄液、脳脊髄液、糞便、組織、臓器など）である。組織は、骨格筋組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、心筋組織、脳組織、骨髄、子宮頸部組織、皮膚などを含みうるがこれらに限定されない。試料は、液体試料又は固体試料の液体抽出物でありうる。ある特定の場合、試料の供給源は、組織の分解／細胞の溶解により可溶化させられうる、臓器又は生検試料のような組織でありうる。

広範にわたる容量の液体試料が解析されうる。少数の例示的な実施形態において、試料容量は、約０．５ｎＬ、約１ｎＬ、約３ｎＬ、約０．０１μＬ、約０．１μＬ、約１μＬ、約５μＬ、約１０μＬ、約１００μＬ、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬなどでありうる。場合によって、液体試料の容量は、約０．０１μＬ～約１０ｍＬの間、約０．０１μＬ～約１ｍＬの間、約０．０１μＬ～約１００μＬの間又は約０．１μＬ～約１０μＬの間である。

場合によって、液体試料は、アッセイにおける使用の前に希釈されうる。例えば、解析物分子の供給源が、ヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態において、体液は、適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝液のような緩衝液）で希釈されうる。液体試料は、使用の前に、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍以上希釈されうる。

場合によって、試料は、解析前処理を経る。解析前処理は、非特異的タンパク質の除去及び／又は効果的であるが廉価で実施可能な混合機能性のような、さらなる機能性をもたらしうる。解析前処理の一般的方法は、動電トラッピング、ＡＣ動電現象、表面音響波、等速電気泳動、誘電泳動、電気泳動又は当技術分野で公知である、他の前濃縮法の使用を含みうる。場合によって、液体試料は、アッセイにおける使用の前に濃縮されうる。例えば、解析物分子の供給源が、ヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態において、体液は、沈殿、蒸発、濾過、遠心分離又はこれらの組合せにより濃縮されうる。液体試料は、使用の前に、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍以上濃縮されうる。

ある特定の実施形態において、解析物は、解析物の測定の前に増幅されない（すなわち、解析物のコピー数は、増大させられない）。例えば、解析物が、ＤＮＡ又はＲＮＡである場合、解析物は、解析物のコピー数を増大させるように複製されない。ある特定の場合、解析物は、タンパク質又は低分子である。

７．方法の変化形
試料中に存在する目的の解析物の存在又は量を測定する、開示された方法は、上記で記載された通りでありうる。方法はまた、解析物を解析するための他の方法を念頭に置いて、適合させられる場合もある。周知の変化形の例は、酵素による検出を含む、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、モノクローナル－ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ））、競合的阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、酵素多重化イムノアッセイ法（ＥＭＩＴ）、競合的結合アッセイのようなイムノアッセイ、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、同種アッセイ、異種アッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイなどを含むがこれらに限定されない。ある場合に、下記の記載は、上記で記載された方法と重複することがあるが、他の場合に、下記の記載は、代替法を提示することもある。

ａ）イムノアッセイ
目的の解析物及び／又はこのペプチド若しくは断片は、イムノアッセイを使用して解析されうる。目的の解析物の存在又は量は、本明細書に記載された抗体を使用し、目的の解析物への特異的結合を検出して測定される。任意のイムノアッセイが用いられうる。イムノアッセイは、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フォワード競合的阻害アッセイ若しくはリバース競合的阻害アッセイのような競合的阻害アッセイ又は競合的結合アッセイでありうる。一部の実施形態において、１つのシグナル発生化合物又はシグナル発生基質が、捕捉抗体及び検出抗体へと接着される。代替的に、捕捉のために利用される微粒子はまた、検出のためにも機能しうる。

同種フォーマットが使用されうる。例えば、被験試料が、対象から得られた後で、混合物が調製される。混合物は、解析物について評価される被験試料、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーを含有する。混合物を形成するように、被験試料、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。被験試料は、第１の特異的結合パートナー及び第２の特異的結合パートナーと同時に接触させられる。一部の実施形態において、第１の特異的結合パートナー及び被験試料中に含有される、任意の目的の解析物は、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物－抗原複合体を形成することが可能であり、第２の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物－第２の特異的結合パートナー複合体を形成しうる。一部の実施形態において、第２の特異的結合パートナー及び被験試料中に含有される、任意の目的の解析物は、第２の特異的結合パートナー－目的の解析物－抗原複合体を形成することが可能であり、第１の特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物－第２の特異的結合パートナー複合体を形成しうる。さらに、第２の特異的結合パートナーは、本明細書で記載された、検出可能な標識で標識化される、又はこれを含有する。

異種フォーマットが使用されうる。例えば、被験試料が、対象から得られた後で、第１の混合物が調製される。混合物は、目的の解析物について評価される被験試料及び第１の特異的結合パートナーを含有し、この場合、第１の特異的結合パートナー及び被験試料中に含有される、任意の目的の解析物は、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、目的の解析物に対する抗体又はこの断片である。混合物を形成するように、被験試料及び第１の特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは、固相上に固定化される。イムノアッセイで使用される固相（第１の特異的結合パートナー、及び、任意選択的に、第２の特異的結合パートナー）は、磁性粒子、ビーズナノビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子、微粒子、膜、足場形成分子、薄膜、濾紙、ディスク又はチップ（例えば、マイクロ流体チップ）のようであるがこれらに限定されない、当技術分野で公知である、任意の固相でありうる。固相がビーズである実施形態において、ビーズは、磁気ビーズ又は磁性粒子でありうる。磁気ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は磁性流体でありうる。例示的な強磁性材料は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ_２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ及びＮｉＯ／Ｆｅを含む。フェリ磁性材料の例は、ＮｉＦｅ_２Ｏ_４、ＣｏＦｅ_２Ｏ_４、Ｆｅ_３Ｏ_４（又はＦｅＯ．Ｆｅ_２Ｏ_３）を含む。ビーズは、磁性であり、１つ以上の非磁性層により取り囲まれた固体コア部分を有しうる。代替的に、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層でありうる。第１の特異的結合メンバーが固定化される固体支持体は、乾燥形態又は液体で保管されうる。磁気ビーズは、第１の特異的結合メンバーが固定化される磁気ビーズを伴う試料と接触させる前に、又はこの後で、磁界下に置かれうる。

第１の特異的結合パートナー－目的の解析物複合体を含有する混合物が形成された後、結合していない全ての目的の解析物は、当技術分野で公知の、任意の技法を使用して、混合物から除去されうる。例えば、結合していない、目的の解析物は、洗浄することにより除去されうる。しかし、第１の特異的結合パートナーは、被験試料中に存在する、全ての目的の解析物への、第１の特異的結合パートナーによる結合がなされるように、被験試料中に存在する、任意の目的の解析物に対して、過剰量で存在することが所望される。

結合していない全ての目的の解析物が除去された後で、第２の特異的結合パートナーが、混合物へと添加されて、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物－第２の特異的結合パートナー複合体を形成する。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは、第１の特異的結合パートナーによる結合がなされた、目的の解析物上のエピトープとは異なる、目的の解析物上のエピトープに結合する、目的の解析物に対する抗体である。さらに、また、第２の特異的結合パートナーも、上記で記載されたシグナル発生化合物又はシグナル発生基質で標識される、又はこれを含有することが好ましい。

固定化された抗体又はこの断片の使用は、イムノアッセイへと組み込まれうる。抗体は、磁性粒子又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、ラテックス粒子又は表面修飾ラテックス粒子、ポリマー又はポリマー薄膜、プラスチック又はプラスチック薄膜、平面状基質、マイクロ流体表面、固体基質材料の小片などのような、様々な支持体へと固定化されうる。

ｂ）サンドイッチイムノアッセイ
サンドイッチイムノアッセイは、抗体の２つの層（すなわち、捕捉抗体（すなわち、少なくとも１つの捕捉抗体）及び検出抗体（すなわち、少なくとも１つの検出抗体））の間の抗原の量を測定する。捕捉抗体及び検出抗体は、抗原、例えば、目的の解析物上の、異なるエピトープに結合する。捕捉抗体の、エピトープへの結合は、検出抗体の、エピトープへの結合に干渉しないことが好ましい。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、サンドイッチイムノアッセイにおける、捕捉抗体及び検出抗体として使用されうる。

一般に、少なくとも２つの抗体が、被験試料中の目的の解析物を分離し定量化するために利用される。より特定すると、少なくとも２つの抗体は、目的の解析物又は目的の解析物断片の、ある特定のエピトープに結合し、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成する。１つ以上の抗体は、被験試料（これらの抗体は、しばしば、１つ以上の「捕捉」抗体と称される）中の目的の解析物を捕捉するのに使用され、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を伴い、また、目的の解析物にも結合する、１つ以上の抗体（これらの抗体は、しばしば、１つ以上の「検出」抗体と称される）は、サンドイッチを完成させるのに使用されうる。サンドイッチアッセイにおいて、抗体の、そのエピトープへの結合は、アッセイ中の、任意の他の抗体の、そのそれぞれのエピトープへの結合により減少しないことが所望される。言い換えれば、抗体は、目的の解析物を含有することが疑われる被験試料と接触させた、１つ以上の第１の抗体が、第２の抗体又は後続の抗体により認識されるエピトープの全部又は一部に結合し、これにより、１つ以上の第２の検出抗体が、目的の解析物に結合する能力に干渉することがないように選択される。上記で記載された捕捉抗体は、捕捉分子の例である。上記で記載された検出抗体は、検出分子の例である。

好ましい実施形態において、目的の解析物を含有することが疑われる被験試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（又は複数の捕捉抗体）及び少なくとも１つの検出抗体と、同時に、又は逐次的に接触させられうる。サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、目的の解析物を含有することが疑われる被験試料（膜に会合した目的の解析物、可溶性の目的の解析物、膜に会合した目的の解析物の断片、可溶性の目的の解析物の断片、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物又は可溶性の目的の解析物）の変異体又はこれらの任意の組合せ）は、まず、抗体－目的の解析物複合体の形成を可能とする条件下で、特定のエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの捕捉抗体と、接触させられる。１つを超える捕捉抗体が使用される場合、複数の捕捉抗体－目的の解析物複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、被験試料中で予測される、目的の解析物又は目的の解析物断片の最大量に対する、モル過剰量で使用される。

任意選択的に、被験試料を、少なくとも１つの、第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗体は、抗体－目的の解析物複合体の、被験試料からの分離を容易とする固体支持体に結合させられうる。当技術分野で公知である、任意の固体支持体であって、平面状基質又はビーズなどの形態のポリマー材料から作製された固体支持体を含むがこれらに限定されない固体支持体が使用されうる。抗体（又は複数の抗体）は、吸着により、そのような結合が、目的の解析物又は目的の解析物断片に結合する抗体の能力に干渉しないという条件で、当技術分野で公知の化学的カップリング剤又は他の手段を使用して、共有結合により、固体支持体に結合させられうる。さらに、必要な場合、固体支持体は、抗体上の多様な官能基との反応性を可能とするように、誘導体化されうる。このような誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキニル及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのようであるがこれらに限定されない、ある特定のカップリング剤の使用を要求する。

目的の解析物を含有することが疑われる、被験試料が、少なくとも１つの捕捉抗体と接触させた後で、被験試料は、捕捉抗体（又は複数の捕捉抗体）－目的の解析物複合体の形成を可能とするために、インキュベートされる。インキュベーションは、約４．５～約１０．０のｐＨ、約２℃～約４５℃の温度で、少なくとも約１分間～約１８時間、約２～６分間又は約３～４分間にわたり実行されうる。

次いで、捕捉抗体（複数の捕捉抗体）－目的の解析物複合体の形成の後、複合体は、少なくとも１つの検出抗体と接触させられる（捕捉抗体（複数の捕捉抗体）－目的の解析物－検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成を可能とする条件下で）。捕捉抗体－目的の解析物複合体が、１つを超える検出抗体と接触させられる場合、捕捉抗体（複数の捕捉抗体）－目的の解析物－検出抗体（複数の検出抗体）検出複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも１つの検出（後続の）抗体が、捕捉抗体－目的の解析物複合体と接触させられる場合、捕捉抗体（複数の捕捉抗体）－目的の解析物－検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成のために、上記で記載された条件と同様の条件下におけるインキュベーション時間が要求される。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含有する。シグナル発生化合物又はシグナル発生基質は、捕捉抗体（複数の捕捉抗体）－目的の解析物－検出抗体（複数の検出抗体）複合体の形成の前に、これと同時に、又はこの後で、少なくとも１つの検出抗体に結合させられうる。

アッセイのための混合物を形成するように、被験試料及び特異的結合パートナーが添加される順序は、それほど重要ではない。第１の特異的結合パートナーが、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質へと接着される場合、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質が接着された第１の特異的結合パートナー－目的の解析物複合体が形成される。代替的に、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーが、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質へと接着される場合、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質が接着された、第１の特異的結合パートナー－目的の解析物－第２の特異的結合パートナーの複合体が形成される。結合していない全ての特異的結合パートナーは、標識されている場合であれ、標識されていない場合であれ、洗浄のような、当技術分野で公知の、任意の技法を使用して、混合物から除去されうる。

次に、目的の解析物又はこの断片の存在を示すシグナルが発生する。発生するシグナルのパラメータに基づき、試料中の目的の解析物の量が定量化されうる。任意選択的に、検量線は、目的の解析物の公知の濃度の系列希釈液又は溶液を使用して、質量分析、重量測定法により作成される場合があるが、当技術分野で公知の他の技法により作成される場合もある。

ｃ）フォワード競合的阻害
フォワード競合的フォーマットにおいて、目的の解析物抗体への結合について、被験試料中の、目的の解析物と競合するように、公知の濃度の、標識化された目的の解析物のアリコートが使用される。

フォワード競合アッセイにおいて、固定化された特異的結合パートナー（抗体のような）は、被験試料及び標識化された目的の解析物、目的の解析物断片又は目的の解析物の変異体と、逐次的に、又は同時に接触させられうる。目的の解析物ペプチド、目的の解析物断片又は目的の解析物変異体は、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質と接着されうる。このアッセイにおいて、抗体は、固体支持体へと固定化されうる。代替的に、抗体は、微粒子又は平面状基質のような固体支持体上に固定化された、抗分子種抗体のような抗体へとカップリングされうる。

標識化された目的の解析物、被験試料及び抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記で記載された条件と同様の条件下でインキュベートされる。次いで、抗体－目的の解析物複合体の、２つの異なる分子種が作出されうる。具体的に述べると、作出された抗体－目的の解析物複合体のうちの１つが、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含有するのに対し、他の抗体－目的の解析物複合体は、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含有しない。抗体－目的の解析物複合体は、検出可能な生成物又は検出可能な標識の定量化の前に、残りの被験試料から分離されうるが、そうしなくともよい。次いで、抗体－目的の解析物複合体が、残りの被験試料から分離されるのかどうかにかかわらず、抗体－目的の解析物複合体内で検出可能な生成物又は検出可能な標識（例えば、検出可能なシグナル）の量が定量化される。次いで、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物、可溶性の目的の解析物、可溶性の目的の解析物の断片、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物又は可溶性の目的の解析物）の変異体又はこれらの任意の組合せのような）の、被験試料中濃度が、例えば、上記で記載された通りに測定されうる。有用な場合、測定は、抗体－目的の解析物複合体内の、検出可能な生成物又は検出可能な標識（例えば、検出可能なシグナル）の数量を、検量線と比較することによりなされうる。検量線は、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物、可溶性の目的の解析物、可溶性の目的の解析物の断片、目的の解析物（膜に会合した目的の解析物又は可溶性の目的の解析物）の変異体又はこれらの任意の組合せのような）の系列希釈液を使用して作成される場合があり、この場合、濃度は、質量分析、重量測定法により測定されるが、当技術分野で公知の他の技法よっても測定される。

任意選択的に、抗体－目的の解析物複合体は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記で論じられた固体支持体のような固体支持体へと、抗体を結合させ、次いで、残りの被験試料を、固体支持体との接触から除去することにより、被験試料から分離されうる。

ｄ）リバース競合アッセイ
リバース競合アッセイにおいて、固定化された目的の解析物は、被験試料及び少なくとも１つの標識化された抗体と、逐次的に、又は同時に接触させられうる。目的の解析物は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記で論じられた固体支持体のような固体支持体に結合させられうる。

固定化された目的の解析物、被験試料及び少なくとも１つの標識化された抗体は、サンドイッチアッセイフォーマットとの関連において、上記で記載された条件と同様の条件下でインキュベートされる。次いで、目的の解析物－抗体複合体の、２つの異なる分子種が作出されうる。具体的に述べると、作出された目的の解析物－抗体複合体のうちの１つが、固定化され、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含有するのに対し、他の目的の解析物－抗体複合体は、固定化されず、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含有しない。固定化されなかった目的の解析物－抗体複合体及び残りの被験試料は、洗浄のような、当技術分野で公知の技法を介して、固定化された目的の解析物－抗体複合体の存在から除去される。次いで、固定化されなかった目的の解析物－抗体複合体が除去されたら、固定化された、目的の解析物－抗体複合体内の、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質の量が定量化される。次いで、目的の解析物の、被験試料中濃度が、上記で記載された通り、検出可能なシグナルの数量を比較することにより測定されうる。有用な場合、測定は、検量線の使用によりなされうる。検量線は、公知の濃度の目的の、解析物又は目的の解析物断片の系列希釈液を使用して作成される場合があり、この場合、濃度は、質量分析、重量測定法により測定されるが、当技術分野で公知の他の技法よっても測定される。

ｅ）ワンステップイムノアッセイ又はキャプチャーオンザフライアッセイ
ワンステップイムノアッセイ又はキャプチャーオンザフライアッセイにおいて、固体基質は、固定化剤であらかじめコーティングされている。捕捉剤、解析物及び検出剤が、固体基質へと併せて添加されるのに続き、検出の前に、洗浄ステップがなされる。捕捉剤は、解析物に結合することが可能であり、固定化剤のためのリガンドを含む。捕捉剤及び検出剤は、本明細書で記載される、又は当技術分野で公知の捕捉又は検出が可能な、抗体又は他の任意の部分でありうる。リガンドは、ペプチドタグを含むことが可能であり、固定化剤は、抗ペプチドタグ抗体を含みうる。代替的に、リガンド及び固定化剤は、キャプチャーオンザフライアッセイのために利用されるように、併せて結合することが可能な薬剤の任意の対（例えば、特異的結合対及び当技術分野で公知であるような他の対）でありうる。１つを超える解析物が測定されうる。一部の実施形態において、固体基質は、抗原でコーティングされる場合があり、解析される解析物は、抗体である。

一部の実施形態において、固定化剤（ビオチン、ストレプトアビジンなどのような）であらかじめコーティングされた固体支持体（微粒子のような）並びに少なくとも第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバー（それぞれ、捕捉試薬及び検出試薬として機能する）を使用する。第１の特異的結合メンバーは、固定化剤のためのリガンド（例えば、固体支持体上の固定化剤が、ストレプトアビジンである場合、第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、ビオチンでありうる）を含み、また、目的の解析物にも結合する。第２の特異的結合メンバーは、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質を含み、目的の解析物に結合する。固体支持体並びに第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーは、被験試料へと（逐次的に、又は同時に）添加されうる。第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、固体支持体上の固定化剤に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体を形成する。試料中に存在する、任意の目的の解析物は、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／解析物複合体を形成する。第２の特異的結合メンバーは、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／解析物複合体に結合し、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質が検出される。検出の前に、任意選択の洗浄ステップが利用されうる。ある特定の実施形態において、ワンステップアッセイにおいて、１つを超える解析物が測定されうる。ある特定の他の実施形態において、２つを超える特異的結合メンバーが利用されうる。ある特定の他の実施形態において、複数のシグナル発生化合物又はシグナル発生基質が添加されうる。ある特定の他の実施形態において、複数の、目的の解析物が検出されうる。

ワンステップイムノアッセイ又はキャプチャーオンザフライアッセイの使用は、本明細書で記載され、当技術分野で公知である、様々なフォーマットでなされうる。例えば、フォーマットは、上記で記載されたようなサンドイッチアッセイでありうるが、代替的に、競合アッセイであることも可能であり、単一特異性の結合メンバーを利用しうる、又は公知であるような、他の変動も使用しうる。

ｆ）組合せアッセイ（微粒子の、Ａｇ／Ａｂによる共コーティング）
組合せアッセイにおいて、微粒子のような固体基質は、抗体及び抗原のそれぞれを、試料から捕捉するように、抗原及び抗体で共コーティングされる。固体支持体は、２つの以上異なる抗体を、試料から捕捉するように、２つの以上異なる抗原で共コーティングされうる。固体支持体は、２つの以上異なる抗原を、試料から捕捉するように、２つの以上異なる抗体で共コーティングされうる。

加えて、本明細書で記載された方法は、アッセイ化合物間の、特異的結合反応又は非特異的結合反応（例えば、ＨＡＭＡの懸念）を防止するように、保護剤を使用しうる。薬剤（及び、任意選択的に、任意の対照）が、支持体上に固定化されたら、支持体上の、薬剤の残りの結合部位は、保護されうる。当業者に公知である、任意の適切な保護試薬が使用されうる。例えば、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、カゼインのリン酸緩衝生理食塩液（「ＰＢＳ」）中溶液、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）又は他の適切な界面活性剤のほか、他の保護試薬が利用されうる。

本開示から明らかである通り、変動を含む、本明細書で開示された方法は、疾患、障害又は状態を有することが疑われる対象における、疾患、障害又は状態を診断するために使用されうる。例えば、試料解析は、がんマーカー、心臓状態についてのマーカーのような疾患マーカー、毒素、ウイルス、細菌のような病原体又はこれらの一部を検出するために有用でありうる。方法はまた、生物学的試料中に存在する解析物を測定するためにも使用されうる。方法はまた、標的解析物を検出するための、血液スクリーニングアッセイにおいても使用されうる。血液スクリーニングアッセイは、血液供給をスクリーニングするのに使用されうる。

８．マルチプレックス化
方法は、マルチプレックス化アッセイにおいて、試料中の１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）標的解析物を検出するように、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）特異的結合メンバーを含みうる。１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）特異的結合メンバーの各々は、異なる標的解析物に結合し、各特異的結合メンバーは、異なるシグナル発生化合物又はシグナル発生基質へとコンジュゲートされる。例えば、第１の特異的結合メンバーは、第１の標的解析物に結合し、第２の特異的結合メンバーは、第２の標的解析物に結合し、第３の特異的結合メンバーは、第３の標的解析物に結合するなどし、第１の特異的結合メンバーは、第１のシグナル発生化合物又は第１のシグナル発生基質で標識され、第２の特異的結合メンバーは、第２のシグナル発生化合物又は第２のシグナル発生基質で標識され、第３の特異的結合メンバーは、第３のシグナル発生化合物又は第３のシグナル発生基質で標識されるなどする。一部の実施形態において、試料の条件は、アッセイ中の多様な時点において変化させられる場合があり、第１のシグナル発生化合物又は第１のシグナル発生基質、第２のシグナル発生化合物又は第２のシグナル発生基質、第３のシグナル発生化合物又は第３のシグナル発生基質などの検出を可能とし、これにより、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）標的解析物を検出する。一部の実施形態において、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）シグナル発生化合物又はシグナル発生基質が、同時に検出される。一部の実施形態において、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）シグナル発生化合物又はシグナル発生基質が、逐次的に検出される。一部の実施形態において、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）シグナル発生化合物又はシグナル発生基質は、蛍光シグナルの異なる波長のような、異なる、検出可能なシグナルを発生させる。

代替的に、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）特異的結合メンバーの各々は、異なる標的解析物に結合し、各特異的結合メンバーは、異なるフルオロフォアビーズのような、異なる固体支持体へとコンジュゲートされる。例えば、第１の特異的結合メンバーは、第１の標的解析物に結合し、第２の特異的結合メンバーは、第２の標的解析物に結合し、第３の特異的結合メンバーは、第３の標的解析物に結合するなどし、第１の特異的結合メンバーは、第１のシグナル発生化合物又は第１のシグナル発生基質で標識され、第２の特異的結合メンバーは、第２のシグナル発生化合物又は第２のシグナル発生基質で標識され、第３の特異的結合メンバーは、第３のシグナル発生化合物又は第３のシグナル発生基質で標識されるなどし、第１の特異的結合メンバーは、第１の固体支持体上に固定化され、第２の特異的結合メンバーは、第２の固体支持体上に固定化され、第３の特異的結合メンバーは、第３の固体支持体上に固定化されるなどする。一部の実施形態において、１つ以上の（又は、代替的に、２つ以上の）シグナル発生化合物又はシグナル発生基質は、異なる波長又は蛍光シグナルのような、異なる、検出可能なシグナルを発生させ、異なる固体支持体は、同時に、又は逐次的に検出される。

一部の実施形態において、第１の特異的結合メンバーは、第１の標的解析物に結合し、第２の特異的結合メンバーは、第２の標的解析物に結合し、第３の特異的結合メンバーは、第３の標的解析物に結合するなどし、第１の特異的結合メンバー、第２の特異的結合メンバー、第３の特異的結合メンバーなどは、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質で標識され、第１の特異的結合メンバーは、第１の固体支持体上に固定化され、第２の特異的結合メンバーは、第２の固体支持体上に固定化され、第３の特異的結合メンバーは、第３の固体支持体上に固定化されるなどする。一部の実施形態において、シグナル発生化合物又はシグナル発生基質は、異なる波長又は蛍光シグナルのような、検出可能なシグナルを発生させ、異なる固体支持体は、同時に、又は逐次的に検出される。

９．キット
本明細書においてまた、上記で記載された方法の実施における使用のためのキットも提示される。キットは、開示された方法により、解析物を解析するための指示書を含みうる。キット内に含まれる指示書は、パッケージング材料に貼付されうる、又はパッケージの添付文書として含まれうる。指示書は、文書又は印刷物でありうるが、このようなものに限定されない。このような指示書を保存し、それらを使用者へと通信することが可能な、任意のメディアが、本開示により想定される。このようなメディアは、電子保存メディア（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学メディア（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用された「指示書」は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。

代替的に、又は加えて、キットは、較正物質若しくは対照、例えば、精製され、任意選択的に凍結乾燥させた、目的の解析物又は液体、ゲル若しくは他の形態にある、目的の解析物、及び／又は上記で記載された方法による使用のための、少なくとも１つの容器（例えば、チューブ、マイクロ滴定プレート又はストリップ）、及び／又はそれらのうちの一方が濃縮溶液として提供されうる、アッセイ緩衝液若しくは洗浄緩衝液のような緩衝液を含みうる。一部の実施形態において、キットは、アッセイを実施するのに必要な、全ての構成要素、すなわち、試薬、基準、緩衝液、希釈剤などを含む。指示書はまた、検量線を作成するための指示書も含みうる。

キットは、目的の解析物を定量化するための参照標準物質をさらに含みうる。参照標準物質は、目的の解析物濃度を、内挿及び／又は外挿するための検量線を確立するのに利用されうる。キットは、濃度レベルとの関係で変動する参照標準物質を含みうる。例えば、キットは、高濃度レベル、中濃度レベル、又は低濃度レベルに関する、１つ以上の参照標準物質を含みうる。参照標準物質についての濃度範囲との関係で、これは、アッセイごとに最適化することができる。参照標準物質についての例示的な濃度範囲は、例えば、約１０ｆｇ／ｍＬ、約２０ｆｇ／ｍＬ、約５０ｆｇ／ｍＬ、約７５ｆｇ／ｍＬ、約１００ｆｇ／ｍＬ、約１５０ｆｇ／ｍＬ、約２００ｆｇ／ｍＬ、約２５０ｆｇ／ｍＬ、約５００ｆｇ／ｍＬ、約７５０ｆｇ／ｍＬ、約１０００ｆｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約７５０ｐｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２．５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２２５ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２７５ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４２５ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４６５ｎｇ／ｍＬ、約４７５ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約５２５ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５７５ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約７２５ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７６５ｎｇ／ｍＬ、約７７５ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約８２５ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８７５ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、約９２５ｎｇ／ｍＬ、約９５０ｎｇ／ｍＬ、約９７５ｎｇ／ｍＬ、約１０００ｎｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約２０００μｇ／ｍＬ、約３０００μｇ／ｍＬ、約４０００μｇ／ｍＬ、約５０００μｇ／ｍＬ、約６０００μｇ／ｍＬ、約７０００μｇ／ｍＬ、約８０００μｇ／ｍＬ、約９０００μｇ／ｍＬ又は約１００００μｇ／ｍＬを含むがこれらに限定されない。

キット内に提供される、任意の特異的結合メンバーは、少なくとも１つのシグナル発生化合物、１つ以上のシグナル発生基質などを組み込むことが可能であるか、又はキットは、特異的結合メンバーを標識付けするための試薬若しくは特異的結合メンバーを検出するための試薬及び／又は解析物を標識付けするための試薬若しくは解析物を検出するための試薬を含みうる。所望の場合、キットは、１つ以上の異なるシグナル発生化合物及び／又はシグナル発生基質を含有しうる。特異的結合メンバー、較正物質及び／又は対照物質は、個別の容器内に用意される、又は適切なアッセイフォーマットへとあらかじめ分注される。

キットは、例えば、マルチプレックス化アッセイにおいて、試料中の、１つ以上の標的解析物を検出するための、１つ以上の特異的結合メンバーを含みうる。キット内の特異的結合メンバーの異なる種類の数は、キットの意図された使用に応じて、広範囲でありうる。キット内の特異的結合メンバーの数は、１～約１０以上の範囲でありうる。例えば、キットは、１つ～１０の特異的結合メンバー、１つ～９つの特異的結合メンバー、１つ～８つの特異的結合メンバー、１つ～７つの特異的結合メンバー、１つ～６つの特異的結合メンバー、１つ～５つの特異的結合メンバー、１つ～４つの特異的結合メンバー、１つ～３つの特異的結合メンバー、１つ～２つの特異的結合メンバー、２つ～１０の特異的結合メンバー、２つ～９つの特異的結合メンバー、２つ～８つの特異的結合メンバー、２つ～７つの特異的結合メンバー、２つ～６つの特異的結合メンバー、２つ～５つの特異的結合メンバー、２つ～４つの特異的結合メンバー、３つ～１０の特異的結合メンバー、３つ～９つの特異的結合メンバー、３つ～８つの特異的結合メンバー、３つ～７つの特異的結合メンバー、３つ～６つの特異的結合メンバー、３つ～５つの特異的結合メンバー、３つ～４つの特異的結合メンバー、４つ～１０の特異的結合メンバー、４つ～９つの特異的結合メンバー、４つ～８つの特異的結合メンバー、４つ～７つの特異的結合メンバー、４つ～６つの特異的結合メンバー、５つ～１０の特異的結合メンバー、５つ～９つの特異的結合メンバー、５つ～８つの特異的結合メンバー、５つ～７つの特異的結合メンバー、５つ～６つの特異的結合メンバー、６つ～１０の特異的結合メンバー、６つ～９つの特異的結合メンバー、６つ～８つの特異的結合メンバー、６つ～７つの特異的結合メンバー、７つ～１０の特異的結合メンバー、７つ～９つの特異的結合メンバー、７つ～８つの特異的結合メンバー、８つ～１０の特異的結合メンバー、８つ～９つの特異的結合メンバー又は９つ～１０の特異的結合メンバーを含みうる。１つ以上の特異的結合メンバーの各々は、異なる標的解析物に結合することが可能であり、各特異的結合メンバーは、異なるシグナル発生化合物及び／又はシグナル発生基質と会合させられうる。例えば、キットは、第１の標的解析物に結合する、第１の特異的結合メンバー、第２の標的解析物に結合する、第２の特異的結合メンバー、第３の標的解析物に結合する、第３の特異的結合メンバーなどを含むことが可能であり、第１の特異的結合メンバーは、第１のシグナル発生化合物及び／又は第１のシグナル発生基質と会合させられ、第２の特異的結合メンバーは、第２のシグナル発生化合物及び／又は第２のシグナル発生基質と会合させられ、第３の特異的結合メンバーは、第３のシグナル発生化合物及び／又は第３のシグナル発生基質と会合させられるなどである。１つ以上の特異的結合メンバーに加えて、キットは、適切な緩衝媒体などのような、１つ以上のさらなるアッセイ構成要素をさらに含みうる。キットはまた、シグナル発生化合物及び／又はシグナル発生基質を検出し、測定するためのデバイスであって、上記で記載されたようなデバイスも含みうる。最後に、キットは、対象の発明に従う解析物検出の方法において、特異的結合メンバーを使用するための指示書であって、キットの梱包材上及び／又はパッケージの添付文書上に存在しうる、使用のための指示書を含みうる。

任意選択的に、キットは、品質管理のための構成要素（例えば、感度パネル、較正物質及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野で周知であり、様々な免疫診断用生成物のための添付シート上に記載されている。感度パネルメンバーは、アッセイ性能の特徴を確立するのに、任意選択的に使用され、さらに、任意選択的に、キット試薬の完全性及びアッセイの標準化についての、有用な指標である。

キットはまた、任意選択的に、診断的アッセイを行うのに要求される、又は品質管理査定を容易とする、他の試薬であって、緩衝液、塩、酵素、酵素共因子、基質、検出試薬などのような試薬も含みうる。被験試料の単離及び／又は処理のための緩衝液及び溶液（例えば、前処理試薬）のような、他の構成要素もまた、キットに含まれうる。キットは、加えて、１つ以上の他の対照も含みうる。キットの構成要素のうちの１つ以上は、凍結乾燥させられる場合があり、この場合、キットは、凍結乾燥させた構成要素の復元に適する試薬をさらに含みうる。構成要素のうちの１つ以上は、液体形態でありうる。

キットの多様な構成要素は、必要に応じて、任意選択的に、適切な容器により提供される。キットは、さらに、試料（例えば、尿試料、唾液試料、血漿試料、脳脊髄液若しくは血清試料のための容器、又は組織吸引物を創出するように、組織を保存する、輸送する、若しくは加工するのに適する容器）を保持又は保存するための容器を含みうる。適切な場合、キットはまた、任意選択的に、反応槽、混合容器及び試薬又は被験試料の調製を容易とする他の構成要素も含有しうる。キットはまた、マイクロサンプリングデバイス、マイクロニードル又は侵襲が最小限である、他の無痛血液回収法のような、多様な血液回収／移送デバイスのような、被験試料を得ることの一助となる、１つ以上の試料回収／収集装置；血液回収チューブ；ランセット；キャピラリー血液回収チューブ；他の単回の指先穿刺による血液回収法；口腔スワブ、鼻腔／咽頭スワブ；１６ゲージ又は他のサイズの注射針、パンチ生検のための環形刃（例えば、１～８ｍｍ、又は他の適切なサイズ）、手術用ナイフ又はレーザー（例えば、特に、携帯型）、シリンジ、滅菌容器又は組織試料を得る、保存する、若しくは吸引するためのカニューレなども含みうる。キットは、関節吸引、錐体生検、パンチ生検、細針吸引生検、画像誘導型経皮注射針吸引生検、気管支肺胞洗浄、内視鏡生検及び腹腔鏡生検の一助とするための、１つ以上の装置を含みうる。

所望の場合、キットは、磁性粒子、ビーズ、膜、足場形成分子、薄膜、濾紙、ディスク又はチップのような固相を含有しうる。

所望の場合、キットは、被験試料を、感染性疾患、心臓の疾患、代謝性疾患、甲状腺疾患などのような疾患状態又は障害についてのバイオマーカーのようなバイオマーカーでありうる、別の解析物についてアッセイするために、１つ以上の構成要素を、単独で、又は指示書とさらに組み合わせて、さらに含みうる。

本発明は、以下の非限定的な実施例により例示される、複数の態様を有する。

１．実施例
［実施例１］
「黒インクの添加」法
図３に示された「黒インクの添加」法は、シーリング剤（例えば、油）による水性相の置きかえの後における、墨汁のような黒インクの、水性相（蛍光基質を含む上部液相）への添加（図３のステップ７を参照されたい。）を伴う。アッセイのための基質は、フルオレセイン二リン酸（ＦＤＰ）であった。酵素反応のための緩衝液は、１Ｍのジエタノールアミン（ＤＥＡ）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び３００μのＭＦＤＰ、ｐＨ９．２５であった。黒インクを水性相へと添加し、水性相を除去しない「黒インクの添加」法を使用するデジタルＥＬＩＳＡ（Ｃ；図３を参照されたい。）を、水性相を除去しないデジタルＥＬＩＳＡ（Ａ）及び水性相を除去するデジタルＥＬＩＳＡ（Ｂ）と比較した。標的分子の数を、フルオレセインフィルターを使用して、光学顕微鏡下で、蛍光液滴の数をカウントすることにより測定した。同時に、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）フィルターを使用して、ビーズの総数をカウントした。「黒インクの添加」法を伴うデジタルＥＬＩＳＡは、蛍光液滴の数のカウンティング及び解析可能な画像の数の増大についての改善（図４及び５及び表１）を示した。

図４において示される通り、ＴＲＩＴＣ及びフルオレセインの両方にフィルターをかけた画像は、黒インクを添加してもなお、鮮明であった。上方の水性相中に存在する蛍光物質は、光学顕微鏡下における蛍光液滴の数のカウンティングを妨げた。水性相を除去しなかった「Ａ」において、上方の水性相中に存在する蛍光物質の、強い明るさのために、フルオレセインデータは得られなかった（図４及び表３）。上方の水溶液を手作業で除去した「Ｂ」について、上方の水性相の不完全な除去において存在する蛍光物質のために、得られた画像は、解析可能な画像のうち、わずかに２９枚であった。この不完全な除去により、一部の上方の水性相がウェル内に残存し、これが、データ１６枚で蛍光液滴の数のカウンティングを妨げたのである（図４及び表３）。これに対し、水性相の除去を伴わずに、「黒インクの添加」法を使用して、４５枚のうち４４枚の画像を収集した。

「Ｂ」について解析不可能であったデータ１６枚について、収集された画像中に、グロー画像の２つのパターンが見られた（図６上左及び上右の画像）。１つのパターン（１６枚中１５枚）は、広範にわたるグローのために、フルオレセインフィルターを用いても、高バックグラウンド画像を示し（上左画像）、他のパターン（１６枚中１枚）は、縁辺部近傍で強くグローする画像を示した（上右画像）。図６の下画像において、黒インクを、蛍光反応物を含有するデバイスウェルのシーリング剤（例えば、油）へと添加した。左下画像において、黒インクを添加することにより、フルオレセインフィルターを用いても高バックグラウンド画像を示した１５枚が、鮮明な画像を示したので、上方の水性相の不完全な除去に起因する高バックグラウンドは消滅したことから、手作業による上方の水溶液の除去が不完全であってもなお、黒インクの添加は、バックグラウンド蛍光を低減しうることが示される。他方、縁辺部近傍で強くグローする画像を示した１枚において見られる右画像パターンは、このグローシグナルが、デバイス側の残留水性相（デバイスウェルの下側）に由来したので、黒インクを添加してもなお、解析することができなかった。

［実施例２］
「黒インクプレミックス」法
不完全でありうる、水性相を除去する、時間のかかるステップの問題を解決するために、「黒インクプレミックス」法を開発した。図７Ａにおいて示される通り、「黒インクプレミックス」法は、酵素反応物を、デバイスウェルへと添加する前における、墨汁のような黒インクの、酵素反応物の溶液への添加を伴う。「黒インクプレミックス」法を伴う（すなわち、黒インクを、基質溶液へと添加する）デジタルＥＬＩＳＡは、「黒インクの添加」法と比較して、蛍光液滴の数のカウンティングの改善及び解析可能な画像の増大を示した。表２は、実験条件及び各試料中の黒インクの最終濃度を示す。アッセイのための基質は、フルオレセイン二リン酸（ＦＤＰ）であった。酵素反応のための緩衝液は、１Ｍのジエタノールアミン（ＤＥＡ）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び３００μのＭＦＤＰ、ｐＨ９．２５であった。図８において示される通り、シグナル％レベルは、ほぼ同じであったことから、全ての画像を、「黒インクプレミックス」法により、真のシグナルの検出（シグナル％）に対して、ほとんど又は全く影響を及ぼさずに解析しえたことが示される。

「黒インクの添加」法（「添加」）で処理された試料について、一部の画像は、グローシグナルが、デバイス側の残留水性相（デバイスウェルの下側）から生じたために、解析することができなかった。「黒インクプレミックス」法で処理された試料中において、水性相中の蛍光のグローは、水性相が存在するのか、しないのかに関わらず抑制された。したがって、グローシグナルを、黒インク／基質溶液により消失させたため、全ての画像は、完全に解析された。さらに、「黒インクプレミックス」法による、３．３％、６．７％、１０％の黒インクは、「黒インクの添加」法の１０％による結果と同様の結果を得た（図８を参照されたい。）。これらの結果は、黒インクが、溶液中の酵素反応に影響を及ぼさなかったことを示した。加えて、バックグラウンドが完全に黒であってもなお、真のシグナルを観察することができた。

［実施例３］
他の色素
「黒インクの添加」法及び「黒インクプレミックス」法の両方において、バックグラウンドグローノイズを低減するように、別の色素成分であるアシッドブラック２（「ＡＢｋ２」）を使用した。１０％の墨汁及び２５ｍＭのアシッドブラック２を比較し、閾値を最適化したシグナル検出のための、同様の画像を得た。図１０及び表３を参照されたい。デジタルアッセイの画像を解析する場合、明るいスポットを、検出のための閾値として使用した。画像を構成する、全てのピクセルは、明るさと対応する、固有の強度値を有した。暗いピクセルは、明るいピクセルより低値を有した。閾値は、ピクセルが、明るいのか、暗いのかを測定（二値化）するように設定した。黒インク法を使用する場合、適切な閾値は、先行するアッセイに対して異なったので、新たな閾値を設定した（「閾値最適化」）。「黒インクの添加」法又は「黒インクプレミックス」法を使用したところ、墨汁（「黒インク」）及びアシッドブラック２（「ＡＢｋ２」）のいずれも、バックグラウンド蛍光（「グローノイズ」）を、効果的に低減した。

他の色素である、アシッドオレンジ７（ＡＯ７）及びディレクトブルー１４（ＤＢｕ１４）（図９Ａ及び９Ｂを参照されたい。）を、黒インク、すなわち、ＡＢｋ２と組み合わせ、比較した。表４及び図１１を参照されたい。色素の組合せは、「黒インクの添加」法又は「黒インクプレミックス」法におけるバックグラウンドグローノイズを低減した。

１５ｍＭのアシッドオレンジ７（ＡＯ７）と４ｍＭのディレクトブルー１４（ＤＢｕ１４）との組合せは、「黒インクの添加」におけるバックグラウンドグローノイズを低減した。図１１を参照されたい。５ｍＭのＡＯ７と１ｍＭのＤＢｕ１４との組合せは、「黒インクプレミックス」法におけるバックグラウンドグローノイズを低減した。「黒インクプレミックス」法による、高濃度のＡＯ７及びＤＢｕ１４（それぞれ、１５ｍＭ及び４ｍＭ）もまた、バックグラウンドグローノイズを低減したが、１０ｆＭの抗原による陽性シグナルは、低度であった。

［実施例４］
低濃度の抗原の検出
低濃度の抗原である、０．１ｆＭの試料を使用して、「黒インクの添加」法及び「黒インクプレミックス」法の検出能力を査定した（表５及び図１３を参照されたい。）。

０．１ｆＭの試料の検出についてのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は、「黒インクの添加」法を使用するＡＢｋ２について、４．４、「黒インクプレミックス」法を使用するＡＢｋ２について、３．１、及び「黒インクプレミックス」法を使用するＡＯ７及びＤＢｕ１４の組合せについて、１．９であった。

［実施例５］
ブラックデバイス
「ブラックデバイス」は、黒インクを、デジタルアッセイへと添加することに対する代替物として、バックグラウンドグローノイズ（図１４を参照されたい。）を低減するように調製されうる。図１４の左画像は、ガラス又はＣＯＰポリマー、ＰＤＭＳポリマー上に調製された透明なＣＹＴＯＰを使用する現行のデバイスを示す。図１４の右画像は、バックグラウンドグローノイズを低減するための、黒の色素又は材料の、デバイスへの添加、例えば、カーボンブラックの、ＣＹＴＯＰ又はポリマーへの添加、又は透明デバイスに接着する黒色薄膜シートを示す。

最後に、本明細書において、それらの全てが、従来通りになされうる、又は実行されうる、多様な実施形態及び具体例に関して、本発明の多様な態様及び特色が記載されたが、本発明は、付属の特許請求の範囲の全範囲内において、保護を受ける資格を有することが理解される。

前出の、発明を実施するための形態、及び付随する実施例は、例示的なものであるに過ぎず、付属の特許請求の範囲及びそれらの均等物だけによって規定される本発明の範囲に対する限定として理解すべきものではないことが理解される。

開示された実施形態に対する、多様な変化及び改変は、当業者に明らかである。限定せずに述べると、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、又は本発明の使用の方法に関する変化及び改変を含む、このような変化及び改変は、その精神及び範囲から逸脱せずになされる限りにおいて、なされうる。

完全を期すために、本発明の多様な態様を、以下の番号付けされた条項に明示する。

条項１．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイの方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項２．シグナル発生型デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、条項１に記載の方法。

条項３．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項４．着色剤が、シグナル発生基質と同時に添加される、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項５．着色剤が、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の前に添加される、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項６．着色剤が、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の後で添加される、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。

条項７．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイの方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項８．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型デジタルアッセイの方法であって、
（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、シーリング剤へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項９．シグナル発生型デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、条項７又は８に記載の方法。

条項１０．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項１１．液体試料中の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；（ｈ）着色剤を、シーリング剤へと添加するステップ；及び（ｉ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示すステップ
を含む方法。

条項１２．着色剤が、黒の着色剤である、条項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

条項１３．着色剤が、顔料ベースの組成物である、条項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

条項１４．着色剤が、墨汁、アシッドブラック２、アシッドオレンジ７、ディレクトブルー１４又はこれらの組合せのうちの１つである、条項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

条項１５．蛍光デジタルイムノアッセイが、低減されたバックグラウンド蛍光を有する、条項２～６及び９～１４のいずれか一項に記載の方法。

条項１６．１つ以上の、第２の特異的結合メンバーが、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーへと、同時に、又は逐次的に添加される、条項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

条項１７．シグナル発生化合物が、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼである、条項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

条項１８．シグナル発生基質が、シグナル発生化合物のための蛍光基質である、条項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

条項１９．シグナル発生基質が、４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）又は二リン酸フルオレセイン（ＦＤＰ）である、条項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

条項２０．検出可能なシグナルが、蛍光画像を収集するために蛍光顕微鏡を使用して検出される、条項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

条項２１．シーリング剤が、水性相より大きな密度を有する、条項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

条項２２．シーリング剤が、油である、条項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

条項２３．油が、重質フッ素化油である、条項２２に記載の方法。

条項２４．重質フッ素化油が、ＦＣ－４０である、条項２３に記載の方法。

条項２５．複数の反応槽が、ナノウェルアレイである、条項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

条項２６．ステップ（ｅ）において、シグナル発生化合物の阻害剤をさらに含む、条項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

条項２７．阻害剤が、レバミソールである、条項２６に記載の方法。

条項２８．混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加する前に、又は混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加した後で、混合物を、ある時間にわたりインキュベートするステップをさらに含み、時間が、インキュベーション時間であり、約４０分間～約３００分間である、条項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

条項２９．液体試料が、血清試料、血漿試料又は全血液試料である、条項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

条項３０．液体試料を、複数の固体支持体へと接触させる前に、液体試料を、１つ以上のデタージェント、界面活性剤、非極性溶媒、超音波処理、加熱、又はこれらの組合せと接触させるステップをさらに含む、条項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

条項３１．固体支持体が、磁性固体支持体である、条項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

条項３２．水性相が、複数の反応槽を傾けることにより、ステップ（ｇ）におけるシーリング剤により置きかえられる、条項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

条項３３．解析物が、生物学的分子である、条項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

条項３４．生物学的分子が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、糖又は脂質である、条項３３に記載の方法。

条項３５．試料中の解析物を検出するのに使用されるシグナル発生型デジタルアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示し、デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップを含む方法。

条項３６．シグナル発生型デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、条項３５に記載の方法。

条項３７．試料中の解析物を検出するのに使用される蛍光デジタルイムノアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法であって、（ａ）解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；（ｂ）混合物中の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄して、解析物に結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された混合物を生成するステップ；（ｃ）洗浄された混合物へと、解析物に結合することが可能な、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、第２の特異的結合メンバーが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；（ｄ）固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄して、第１の特異的結合メンバーに結合した解析物に結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去し、これにより、洗浄された固体支持体複合体を生成するステップ；（ｅ）洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質を添加するステップであって、シグナル発生化合物及びシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；（ｆ）洗浄された固体支持体複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、洗浄された固体支持体複合体が、水性相中に存在するステップ；（ｇ）複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、水性相が、反応チャンバー内のシーリング剤により置きかえられるステップ；及び（ｈ）デジタル計数デバイスを使用して、検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、検出可能なシグナルの存在の検出が、試料中の解析物の単一分子の存在を示し、デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップを含む方法。

条項３８．黒色デバイスが、カーボンブラックを含む固相材料又は透明デバイスに接着された黒色薄膜シートを含む、条項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

条項３９．固相材料が、ＣＹＴＯＰ、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である、条項３８に記載の方法。

条項４０．着色剤を、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質と同時に添加するステップ、着色剤を、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の前に添加するステップ、着色剤を、洗浄された固体支持体複合体へと、シグナル発生基質の後で添加するステップ、着色剤を、置きかえられた水性相へと添加するステップ、又は着色剤を、シーリング剤へと添加するステップをさらに含む、条項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

条項４１．着色剤が、顔料ベースの組成物である、条項４０に記載の方法。

条項４２．着色剤が、墨汁、アシッドブラック２、アシッドオレンジ７、ディレクトブルー１４又はこれらの組合せのうちの１つである、条項４０又は４１に記載の方法。

条項４３．着色剤が、アシッドオレンジ７と、ディレクトブルー１４との組合せである、条項４２に記載の方法。

条項４４．１つ以上の、第２の特異的結合メンバーが、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーへと、同時に、又は逐次的に添加される、条項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。

条項４５．シグナル発生化合物が、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼである、条項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。

条項４６．シグナル発生基質が、シグナル発生化合物のための蛍光基質である、条項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。

条項４７．シグナル発生基質が、４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）又は二リン酸フルオレセイン（ＦＤＰ）である、条項３５～４６のいずれか一項に記載の方法。

条項４８．検出可能なシグナルが、蛍光画像を収集するために蛍光顕微鏡を使用して検出される、条項３５～４７のいずれか一項に記載の方法。

条項４９．シーリング剤が、水性相より大きな密度を有する、条項３５～４８のいずれか一項に記載の方法。

条項５０．シーリング剤が、油である、条項３５～４９のいずれか一項に記載の方法。

条項５１．油が、重質フッ素化油である、条項５０に記載の方法。

条項５２．重質フッ素化油が、ＦＣ－４０である、条項５１に記載の方法。

条項５３．複数の反応槽が、ナノウェルアレイである、条項３５～５２のいずれか一項に記載の方法。

条項５４．ステップ（ｅ）において、シグナル発生化合物の阻害剤をさらに含む、条項３５～５３のいずれか一項に記載の方法。

条項５５．阻害剤が、レバミソールである、条項５４に記載の方法。

条項５６．混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加する前に、又は混合物へと、１つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加した後で、混合物を、ある時間にわたりインキュベートするステップをさらに含み、時間が、インキュベーション時間であり、約４０分間～約３００分間である、条項３５～５５のいずれか一項に記載の方法。

条項５７．液体試料が、血清試料、血漿試料又は全血液試料である、条項３５～５６のいずれか一項に記載の方法。

条項５８．液体試料を、複数の固体支持体へと接触させる前に、液体試料を、１つ以上のデタージェント、界面活性剤、非極性溶媒、超音波処理、加熱、又はこれらの組合せと接触させるステップをさらに含む、条項３５～５７のいずれか一項に記載の方法。

条項５９．固体支持体が、磁性固体支持体である、条項３５～５８のいずれか一項に記載の方法。

条項６０．水性相が、複数の反応槽を傾けることにより、ステップ（ｇ）におけるシーリング剤により置きかえられる、条項３５～５９のいずれか一項に記載の方法。

条項６１．解析物が、生物学的分子である、条項３５～６０のいずれか一項に記載の方法。

条項６２．生物学的分子が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、糖又は脂質である、条項６１に記載の方法。

条項６３．蛍光デジタルイムノアッセイが、フェムトリットルの液滴アレイを含む、条項３６～６２のいずれか一項に記載の方法。

Claims (84)

1. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型蛍光デジタルアッセイの方法であって、
   （ａ）前記２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
   （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
   （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
   （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
   （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；及び
   （ｆ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
   を含む、方法。
2. 前記シグナル発生型蛍光デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、請求項１に記載の方法。
3. 前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項５に記載の方法。
7. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、
   （ａ）前記２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、２種類以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
   （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
   （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質及び着色剤を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
   （ｄ）前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
   （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；及び
   （ｆ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
   を含む方法。
8. 前記２つ以上の解析物のうちの前記１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着された異なるシグナル発生化合物を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれに対するシグナル発生化合物からの検出可能なシグナルが異なる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれからの検出可能なシグナルが、同時に、逐次的に、またはそれらの組み合わせで検出される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体の各種類が、異なる固体支持体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記着色剤が、シグナル発生基質と同時に添加される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記着色剤が、シグナル発生基質の前に、洗浄された固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体に添加される、請求項６又は１１に記載の方法。
18. 前記着色剤が、シグナル発生基質の後に、洗浄された固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体に添加される、請求項６又は１１に記載の方法。
19. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型蛍光デジタルアッセイの方法であって、
    （ａ）前記２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び前記少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；
    （ｆ）着色剤を、前記置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び
    （ｇ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
    を含む方法。
20. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するためのシグナル発生型蛍光デジタルアッセイの方法であって、
    （ａ）２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び前記少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；
    （ｆ）着色剤を、前記シーリング剤へと添加するステップ；及び
    （ｇ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
    を含む方法。
21. 前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
22. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着された異なるシグナル発生化合物を含む、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれに対するシグナル発生化合物からの検出可能なシグナルが異なる、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれからの検出可能なシグナルが、同時に、逐次的に、またはそれらの組み合わせで検出される、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体の各種類が、異なる固体支持体を含む、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記シグナル発生型蛍光デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、
    （ａ）２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；
    （ｆ）着色剤を、前記置きかえられた水性相へと添加するステップ；及び
    （ｇ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
    を含む方法。
31. 液体試料中の２つ以上の解析物の単一分子の存在又は非存在を測定するための蛍光デジタルイムノアッセイの方法であって、
    （ａ）２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる前記液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び前記少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；
    （ｆ）着色剤を、前記シーリング剤へと添加するステップ；及び
    （ｇ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物についての前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示すステップ
    を含む方法。
32. 前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着された異なるシグナル発生化合物を含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれに対するシグナル発生化合物からの検出可能なシグナルが異なる、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれからの検出可能なシグナルが、同時に、逐次的に、またはそれらの組み合わせで検出される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体の各種類が、異なる固体支持体を含む、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記着色剤が、墨汁、アシッドブラック２、アシッドオレンジ７、ディレクトブルー１４又はこれらの組合せのうちの１つである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記着色剤が、顔料ベースの組成物である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記着色剤が、黒の着色剤である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記蛍光デジタルイムノアッセイが、低減されたバックグラウンド蛍光を有する、請求項２、７、３０及び３１のいずれか一項に記載の方法。
44. 試料中の２つ以上の解析物を検出するのに使用されるシグナル発生型蛍光デジタルアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法であって、
    （ａ）２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの単一の解析物に結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；及び
    （ｆ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示し、前記デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップ
    を含む方法。
45. 前記シグナル発生型蛍光デジタルアッセイが、蛍光デジタルイムノアッセイである、請求項４４に記載の方法。
46. 前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
47. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項４８に記載の方法。
50. 試料中の２つ以上の解析物を検出するのに使用される蛍光デジタルイムノアッセイにおける蛍光バックグラウンドノイズを低減するための方法であって、
    （ａ）２つ以上の解析物を含有する、又はこれを含有することが疑われる液体試料を、複数の固体支持体と接触させて、混合物を創出するステップであって、各固体支持体が、前記２つ以上の解析物の単一分子に結合することが可能な、１つ以上の、第１の特異的結合メンバーを含み、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を生成するステップ；
    （ｂ）前記混合物へと、各々が前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合することが可能な、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加し、これにより、各々が前記２つ以上の解析物の異なる解析物を含む、２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を生成するステップであって、前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着されたシグナル発生化合物を含むステップ；
    （ｃ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、少なくとも１つのシグナル発生基質を添加するステップであって、少なくとも１つのシグナル発生化合物及び少なくとも１つのシグナル発生基質が、検出可能なシグナルを生成するステップ；
    （ｄ）前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体の少なくとも一部を、複数の個別位置へと、空間的に分離するステップであって、前記複数の個別位置が、複数の反応槽を含み、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体が、水性相中に存在するステップ；
    （ｅ）前記複数の反応槽を、シーリング剤で覆うステップであって、前記水性相が、反応チャンバー内の前記シーリング剤により置きかえられるステップ；及び
    （ｆ）デジタル計数デバイスを使用して、少なくとも１つのシグナル発生化合物からの前記検出可能なシグナルの存在又は非存在を検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在の検出が、前記試料中の２つ以上の解析物のうちの１つの単一分子の存在を示し、前記デジタル計数デバイスが、黒色デバイスを含むステップ
    を含む方法。
51. 前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての固体支持体－第１の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
52. 除去するステップが、前記混合物中の前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体を、第１の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記第１の特異的結合メンバーに結合した前記２つ以上の解析物のうちの１つに結合していない全ての第２の特異的結合メンバーを除去するステップをさらに含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 除去するステップが、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体を、第２の洗浄緩衝液で洗浄することを含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、これへと接着された異なるシグナル発生化合物を含む、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれに対するシグナル発生化合物からの検出可能なシグナルが異なる、請求項４４～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記２つ以上の第２の特異的結合メンバーのそれぞれからの検出可能なシグナルが、同時に、逐次的に、またはそれらの組み合わせで検出される、請求項４４～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記２種類以上の固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物複合体の各種類が、異なる固体支持体を含む、請求項４４～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記黒色デバイスが、カーボンブラックを含む固相材料又は透明デバイスに接着された黒色薄膜シートを含む、請求項４４～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記固相材料が、ＣＹＴＯＰ、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である、請求項５９に記載の方法。
61. 着色剤を、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、前記少なくとも１つのシグナル発生基質と同時に添加するステップ、着色剤を、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、前記少なくとも１つのシグナル発生基質の前に添加するステップ、着色剤を、前記固体支持体－第１の特異的結合メンバー－解析物－第２の特異的結合メンバー複合体へと、前記少なくとも１つのシグナル発生基質の後で添加するステップ、着色剤を、前記置きかえられた水性相へと添加するステップ、又は着色剤を、前記シーリング剤へと添加するステップをさらに含む、請求項４４～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記着色剤が、顔料ベースの組成物である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記着色剤が、墨汁、アシッドブラック２、アシッドオレンジ７、ディレクトブルー１４又はこれらの組合せのうちの１つである、請求項６１又は６２に記載の方法。
64. 前記着色剤が、アシッドオレンジ７と、ディレクトブルー１４との組合せである、請求項６３に記載の方法。
65. 前記２つ以上の、第２の特異的結合メンバーが、前記２種類以上の、第１の特異的結合メンバーへと、同時に、又は逐次的に添加される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記シグナル発生化合物が、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼである、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記シグナル発生基質が、前記シグナル発生化合物のための蛍光基質である、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記シグナル発生基質が、４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）又は二リン酸フルオレセイン（ＦＤＰ）である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記検出可能なシグナルが、蛍光画像を収集するために蛍光顕微鏡を使用して検出される、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記シーリング剤が、前記水性相より大きな密度を有する、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記シーリング剤が、油である、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記油が、重質フッ素化油である、請求項７１に記載の方法。
73. 前記重質フッ素化油が、ＦＣ－４０である、請求項７２に記載の方法。
74. 前記複数の反応槽が、ナノウェルアレイである、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。
75. ステップ（ｃ）において、シグナル発生化合物の阻害剤をさらに含む、請求項１～７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記阻害剤が、レバミソールである、請求項７５に記載の方法。
77. 前記混合物へと、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加する前に、又は前記混合物へと、２つ以上の、第２の特異的結合メンバーを添加した後で、前記混合物を、ある時間にわたりインキュベートするステップをさらに含み、前記時間が、インキュベーション時間であり、４０分間～３００分間である、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記液体試料が、血清試料、血漿試料又は全血液試料である、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記液体試料を、前記複数の固体支持体へと接触させる前に、前記液体試料を、１つ以上のデタージェント、界面活性剤、非極性溶媒、超音波処理、加熱、又はこれらの組合せと接触させるステップをさらに含む、請求項７７～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記固体支持体が、磁性固体支持体である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記水性相が、前記複数の反応槽を傾けることにより、ステップ（ｅ）における前記シーリング剤により置きかえられる、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記２つ以上の解析物が、生物学的分子である、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記生物学的分子が、それぞれ独立に、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、糖又は脂質である、請求項８２に記載の方法。
84. 前記蛍光デジタルイムノアッセイが、フェムトリットルの液滴アレイを含む、請求項２～１８、３０～３９、４３、３５及び５０～５４のいずれか一項に記載の方法。