JP7773148B2 - Lithocholic acid derivatives with vitamin D activity - Google Patents
Lithocholic acid derivatives with vitamin D activityInfo
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Description
本発明は、ビタミンＤ活性を有するリトコール酸誘導体に関する。本発明はさらに、上記リトコール酸誘導体を含む、医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤並びにビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤に関する。 The present invention relates to a lithocholic acid derivative having vitamin D activity. The present invention further relates to a medicine, a vitamin D receptor activator, and an agent for preventing and/or treating vitamin D receptor-related diseases, each containing the lithocholic acid derivative.
ビタミンＤは、代謝活性化体である１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３がビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に結合し、特異的遺伝子の発現を制御する。この遺伝子の発現の制御により、ビタミンＤは、血中のカルシウム濃度維持、骨形成、免疫機能、細胞の分化・増殖制御などの重要な生理作用を担っている。これまでに、骨粗鬆症、乾癬及びがんなどの治療薬の開発を目的として、多数のＶＤＲリガンドが開発され、そのうちの幾つかは医薬品として臨床応用されている。既存のＶＤＲリガンドの多くは、天然型の１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と同様にセコステロイド骨格を有している。セコステロイド骨格は、高活性を有する誘導体の開発には有用であるが、一般に化学的安定性が低く、煩雑な合成を要し、ビタミンＤ作用の多様な医薬応用性が限られている。そのため、非セコステロイド型の骨格を有するＶＤＲリガンドの開発が望まれているが、そのような非セコステロイド型ＶＤＲリガンドの報告は少ない。 Vitamin D's metabolically activated form, 1α,25-dihydroxyvitamin D3, binds to the vitamin D receptor (VDR) and regulates the expression of specific genes. Through this regulation of gene expression, vitamin D is responsible for important physiological functions, including maintaining blood calcium levels, bone formation, immune function, and regulating cell differentiation and proliferation. Numerous VDR ligands have been developed to date with the aim of developing therapeutic drugs for osteoporosis, psoriasis, cancer, and other conditions, some of which are in clinical use as pharmaceuticals. Many existing VDR ligands share a secosteroid skeleton, similar to that of natural 1α,25-dihydroxyvitamin D3. While the secosteroid skeleton is useful for developing highly active derivatives, it generally exhibits low chemical stability, requires complex synthesis, and limits the diverse medicinal applications of vitamin D. Therefore, the development of VDR ligands with non-secosteroid skeletons is desirable, but there have been few reports of such non-secosteroid VDR ligands.
リトコール酸が、ＶＤＲの内因性リガンドであることが見いだされているが、リトコール酸のＶＤＲ親和性は非常に弱く、生理的意義は不明である。特許文献１には、リトコール酸誘導体であるリトコール酸プロピオネートがＶＤＲを活性化できることが記載され、非特許文献１には、リトコール酸アセテート及びリトコール酸プロピオネートが記載されている。特許文献２には、高いビタミンＤ３活性を有するリトコール酸誘導体が記載されている。 Lithocholic acid has been found to be an endogenous ligand for VDR, but its affinity for VDR is very weak, and its physiological significance is unknown. Patent Document 1 describes that lithocholic acid derivative lithocholic acid propionate can activate VDR, and Non-Patent Document 1 describes lithocholic acid acetate and lithocholic acid propionate. Patent Document 2 describes a lithocholic acid derivative with high vitamin D3 activity.
さらに、特許文献３には、リトコール酸アミド誘導体およびリトコール酸ジオール誘導体が記載されている。 Furthermore, Patent Document 3 describes lithocholic acid amide derivatives and lithocholic acid diol derivatives.
ビタミンＤ３活性を有するリトコール酸誘導体の報告はあるが、既存のリトコール酸誘導体はビタミンＤ３受容体に対する親和性が弱く、ビタミンＤ３活性は十分ではないものであった。特許文献２に記載のリトコール酸誘導体は高いビタミンＤ３活性を有しているが、体内動態において、血中から迅速に消失するという欠点があった。 Although there have been reports of lithocholic acid derivatives with vitamin D3 activity, existing lithocholic acid derivatives have weak affinity for vitamin D3 receptors and insufficient vitamin D3 activity. The lithocholic acid derivative described in Patent Document 2 has high vitamin D3 activity, but has the drawback of being rapidly eliminated from the blood in the body.
本発明は、十分なビタミンＤ３活性を有する新規なリトコール酸誘導体を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、並びに上記リトコール酸誘導体を含む医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤並びにビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤を提供することを解決すべき課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel lithocholic acid derivative that has sufficient vitamin D3 activity. A further object of the present invention is to provide a pharmaceutical, a vitamin D receptor activator, and a preventive and/or therapeutic agent for vitamin D receptor-related diseases, each containing the lithocholic acid derivative.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、３位にヒドロキシアルキル基を有するリトコール酸誘導体において、１７位の側鎖にカルバメートまたはウレアを導入した誘導体が、優れたビタミンＤ３活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive research to solve the above-mentioned problems, the inventors discovered that lithocholic acid derivatives having a hydroxyalkyl group at the 3-position, in which a carbamate or urea group was introduced into the side chain at the 17-position, possess excellent vitamin D3 activity, leading to the completion of the present invention.
本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］ 下記一般式（Ｉ）で示される化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［２］ Ｒ１及びＲ２がメチルである、［１］に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［３］ Ｘが－Ｏ－を示し、Ｒ３がメチルまたはエチルを示す、［１］に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［４］ Ｘが－ＮＲ４－を示し、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して、水素原子又はメチル基を示す、［１］に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［５］ 下記の何れかの化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［７］ ［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグを含む、ビタミンＤ受容体活性化剤。
［８］ ［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグを含む、ビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤。
According to the present invention, the following inventions are provided.
[1] A compound represented by the following general formula (I), a salt thereof, or a prodrug thereof:
[2] The compound, salt, or prodrug thereof according to [1], wherein R 1 and R 2 are methyl.
[3] The compound according to [1], a salt thereof, or a prodrug thereof, wherein X represents —O— and R 3 represents methyl or ethyl.
[4] The compound, salt, or prodrug thereof according to [1], wherein X represents —NR 4 —, and R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or a methyl group.
[5] Any of the following compounds, salts thereof, or prodrugs thereof:
[7] A vitamin D receptor activator comprising the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof.
[8] A preventive and/or therapeutic agent for a vitamin D receptor-associated disease, comprising the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof.
本発明によればさらに以下の発明が提供される。
［９］ ［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグをヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、ビタミンＤ受容体を活性化する方法。
［１０］ ［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグをヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、ビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療のための方法。
［１１］ ビタミンＤ受容体の活性化において使用するための、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［１２］ ビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療において使用するための、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグ。
［１３］ 医薬の製造のための、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグの使用。
［１４］ ビタミンＤ受容体活性化剤の製造のための、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグの使用。
［１５］ ビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物、その塩、又はそのプロドラッグの使用。
The present invention further provides the following inventions.
[9] A method for activating a vitamin D receptor, comprising administering the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof to a mammal, including a human.
[10] A method for preventing and/or treating a vitamin D receptor-associated disease, comprising administering the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof to a mammal, including a human.
[11] The compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof for use in activating a vitamin D receptor.
[12] The compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof for use in the prevention and/or treatment of a vitamin D receptor-associated disease.
[13] Use of the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof for the manufacture of a medicament.
[14] Use of the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof for the manufacture of a vitamin D receptor activator.
[15] Use of the compound according to any one of [1] to [5], a salt thereof, or a prodrug thereof for the manufacture of an agent for the prophylaxis and/or treatment of a vitamin D receptor-associated disease.
本発明の化合物は、十分なビタミンＤ３活性を有する新規なリトコール酸誘導体である。本発明の化合物は、ビタミンＤ受容体活性化剤、並びにビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤等の医薬として有用である。また、本発明の化合物は、セコステロイド骨格を有さないことから、セコステロイド骨格を有する化合物より一般に化学的安定性が高い。 The compounds of the present invention are novel lithocholic acid derivatives with sufficient vitamin D3 activity. They are useful as vitamin D receptor activators and pharmaceuticals, such as agents for the prevention and/or treatment of vitamin D receptor-related diseases. Furthermore, because the compounds of the present invention do not have a secosteroid skeleton, they generally have higher chemical stability than compounds that have a secosteroid skeleton.
以下、本発明について更に具体的に説明する。
本発明の化合物は、下記一般式（１）で示される。
The compound of the present invention is represented by the following general formula (1).
本発明の化合物は、１７位の側鎖にカルボキシル基を有さないことから、体内動態において迅速に排泄されてしまうという問題が解消されることが想定される。 The compounds of the present invention do not have a carboxyl group in the side chain at position 17, which is expected to eliminate the problem of rapid excretion in the body.
本明細書における炭素数１から８のアルキル基は、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はこれらの組み合わせのいずれでもよい。炭素数１から６のアルキル基は、特に制限されないが、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などを挙げることができ、中でも、メチル基、エチル基を好ましく挙げることができ、メチル基が特に好ましい。炭素数１から８のアルキル基は、置換基を有していてもよく、置換基としては、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素など）、エーテル、芳香環などを挙げることができる。なお、エーテルまたは芳香環は、アルキル鎖の途中に存在していてもよい。 In this specification, the alkyl group having 1 to 8 carbon atoms may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is not particularly limited, but examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropylmethyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclobutyl, cyclobutylmethyl, cyclopentyl, and cyclohexyl. Among these, methyl and ethyl are preferred, with methyl being particularly preferred. The alkyl group having 1 to 8 carbon atoms may have a substituent, and examples of the substituent include halogen (such as fluorine, chlorine, bromine, or iodine), ether, and aromatic ring. The ether or aromatic ring may be present along the alkyl chain.
好ましくは、Ｘが－Ｏ－を示し、Ｒ３がメチルまたはエチルを示す。
好ましくは、Ｘが－ＮＲ４－を示し、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して、水素原子又はメチル基を示す。
Preferably, X represents --O-- and R3 represents methyl or ethyl.
Preferably, X represents —NR 4 —, and R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or a methyl group.
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、同一の基でも異なる基でもよいが、同一の基であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２がともにメチル基又はエチル基であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２がメチルであることが特に好ましい。 R1 and R2 may each independently be the same group or different groups, but are preferably the same group. It is preferable that R1 and R2 are both methyl groups or ethyl groups, and it is particularly preferable that R1 and R2 are both methyl groups.
本発明の化合物の具体例としては、以下の化合物を挙げることができる。
一般式（１）で示される化合物は、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、不斉炭素に基づく任意の光学活性体、ジアステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。 The compound represented by general formula (1) may have one or more asymmetric carbon atoms, and any optically active form based on the asymmetric carbon atoms, stereoisomers such as diastereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, etc., are all included within the scope of the present invention.
一般式（１）で示される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態で存在する場合もあるが、それらも本発明の範囲に包含される。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩を挙げることができ、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシン塩などのアミノ酸塩なども本発明の範囲に包含される。 The compound represented by general formula (1) may exist in the form of a salt, such as an acid addition salt or a base addition salt, and these salts are also included within the scope of the present invention. Examples of acid addition salts include mineral acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as p-toluenesulfonate, methanesulfonate, oxalate, tartrate, and maleate. Examples of base addition salts include metal salts such as sodium salt, potassium salt, magnesium salt, and calcium salt, and organic amine salts such as ammonium salt, triethylamine salt, and ethanolamine salt. In addition, amino acid salts such as glycine salt are also included within the scope of the present invention.
一般式（１）で示される化合物は、プロドラッグにしてもよい。プロドラッグは、生体に投与された後、酵素の作用や代謝的加水分解などにより、医薬的に活性な化合物になる。プロドラッグは、当業者に知られている酸誘導体であればよく、例えば、一般式（１）で示される化合物と適当なアルコールとの反応によって製造されるエステル、一般式（１）で示される化合物と適当なアミンとの反応によって製造されるアミド、カルボシル基の還元型として、２４－アルコール体などが挙げられるが特に限定されない。 The compound represented by general formula (1) may be made into a prodrug. After administration to a living body, the prodrug becomes a pharmaceutically active compound through the action of enzymes or metabolic hydrolysis. The prodrug may be an acid derivative known to those skilled in the art, and examples include, but are not limited to, esters produced by reacting a compound represented by general formula (1) with an appropriate alcohol, amides produced by reacting a compound represented by general formula (1) with an appropriate amine, and 24-alcohols as a reduced form of the carboxyl group.
一般式（１）で示される化合物、その塩及びそのプロドラッグは、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の範囲内のものである。溶媒和物における溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル等を挙げることができるが、特に限定されない。付加物（水和物又は溶媒和物）は、単独のものでもよいし、複数種の混合物でもよい。 The compound represented by general formula (1), its salt, and its prodrug may exist in the form of an adduct (hydrate or solvate) with water or various solvents, and these adducts are also within the scope of the present invention. Examples of solvents in solvates include, but are not limited to, methanol, ethanol, and acetonitrile. The adduct (hydrate or solvate) may be a single compound or a mixture of multiple compounds.
一般式（１）で示される化合物、その塩及びそのプロドラッグの任意の結晶形も本発明の範囲内のものである。 Any crystalline form of the compound represented by general formula (1), its salt, and its prodrug is also within the scope of the present invention.
一般式（１）に包含される代表的な化合物の製造方法を本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した。当業者は、実施例に記載された具体的製造方法を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に適宜の修飾ないし改変を加えることにより、一般式（１）に包含される化合物を製造することが可能である。 Methods for producing representative compounds encompassed by general formula (1) are described in detail and specifically in the Examples of this specification. Those skilled in the art can produce compounds encompassed by general formula (1) by appropriately selecting raw material compounds, reaction conditions, reagents, etc., while referring to the specific production methods described in the Examples, and by appropriately modifying or altering these methods as necessary.
一般式（１）に包含される代表的な化合物である化合物1a、化合物1b、化合物2aおよび化合物2bの合成は、特に限定されないが、後記の実施例に記載の方法に準じて行うことができる。化合物3を脱水ジクロロメタンに溶かし冷却し、イミダゾールとクロロトリメチルシランを加えて反応させることにより、化合物4を得ることができる。化合物4を脱水アセトンに溶かし、アルゴン置換した後に冷却し、トリエチルアミンとジフェニルリン酸アジドを加えて反応させることにより化合物5を得ることができる。 The synthesis of Compound 1a, Compound 1b, Compound 2a, and Compound 2b, which are representative compounds encompassed by General Formula (1), is not particularly limited, and can be carried out in accordance with the method described in the Examples below. Compound 4 can be obtained by dissolving Compound 3 in dehydrated dichloromethane, cooling, and then adding imidazole and chlorotrimethylsilane to cause a reaction. Compound 5 can be obtained by dissolving Compound 4 in dehydrated acetone, replacing the atmosphere with argon, cooling, and then adding triethylamine and diphenylphosphoryl azide to cause a reaction.
化合物5を脱水トルエンに溶かし、脱水メタノールを加えてアルゴン下、加熱還流することにより化合物1aを得ることができる。
化合物5を脱水トルエンに溶かし、脱水エタノールを加えてアルゴン下、加熱還流することにより化合物1bを得ることができる。
化合物5を脱水トルエンに溶かし、アンモニア水を加えてアルゴン下、加熱還流することにより化合物2aを得ることができる。
化合物5 を脱水トルエンに溶かし、アルゴン下攪拌し、メチルアミンを加えてアルゴン下で攪拌することにより化合物2bを得ることができる。
Compound 5 is dissolved in dehydrated toluene, dehydrated methanol is added, and the mixture is heated under reflux under argon to obtain compound 1a.
Compound 1b can be obtained by dissolving compound 5 in dehydrated toluene, adding dehydrated ethanol, and heating under reflux under argon.
Compound 5 is dissolved in dehydrated toluene, and aqueous ammonia is added thereto, followed by heating under reflux under argon to obtain compound 2a.
Compound 5 is dissolved in dehydrated toluene, stirred under argon, and methylamine is added thereto, followed by stirring under argon to obtain compound 2b.
本発明の化合物は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に結合し、ＶＤＲを活性化することができる。本発明の化合物がビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に結合し、それを活性化することは、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞HL-60に対する細胞分化誘導作用を検定することにより検証することができる。細胞分化誘導の検定アッセイは、後記する試験例１に記載の通り、 Fujii et al. Bioorg. Med. Chem. 22 (2014) 5891-5901の「4.3.1. Assay of HL-60 cell differentiation-inducing activity」に記載の方法に準じた方法により行うことができる。 The compounds of the present invention can bind to and activate vitamin D receptors (VDR). The ability of the compounds of the present invention to bind to and activate vitamin D receptors (VDR) can be verified by assaying their cell differentiation-inducing activity on human acute promyelocytic leukemia cells, HL-60. The assay for cell differentiation induction can be performed according to the method described in "4.3.1. Assay of HL-60 cell differentiation-inducing activity" in Fujii et al. Bioorg. Med. Chem. 22 (2014) 5891-5901, as described in Test Example 1 below.
上記の通り、本発明の式（１）で示される化合物は、ＶＤＲを活性化する作用を有する。従って、式（１）で示される本発明の化合物、その塩、又はそのプロドラッグを有効成分として含む医薬は、ビタミンＤ受容体活性化剤、又はビタミンＤ作用剤として有用である。式（１）で示される本発明の化合物、その塩、又はそのプロドラッグは、ビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。ビタミンＤ受容体関連疾患としては、例えば、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、腎臓障害に基づく骨疾患や副甲状腺機能低下症、乾癬などの皮膚疾患、がん（白血病、乳がん、前立腺がん、大腸がん、膵臓がんなど）、自己免疫性疾患（慢性関節リウマチ、全身性ループスエリテマトーシスなど）、感染症（結核など）、非アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患などが挙げられるが、特に限定されない。 As described above, the compound of the present invention represented by formula (1) has the effect of activating VDR. Therefore, pharmaceuticals containing the compound of the present invention represented by formula (1), its salt, or its prodrug as an active ingredient are useful as vitamin D receptor activators or vitamin D agonists. The compound of the present invention represented by formula (1), its salt, or its prodrug can be used as an agent for preventing and/or treating vitamin D receptor-related diseases. Examples of vitamin D receptor-related diseases include, but are not limited to, rickets, osteomalacia, osteoporosis, bone diseases due to kidney damage, hypoparathyroidism, skin diseases such as psoriasis, cancer (e.g., leukemia, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, pancreatic cancer), autoimmune diseases (e.g., rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus), infectious diseases (e.g., tuberculosis), non-alcoholic steatohepatitis, and non-alcoholic fatty liver disease.
本発明の医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤及びビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分としては、一般式（１）で示される化合物、その塩、又はそのプロドラッグを用いることができる。本発明の医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤及びビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤としては、上記有効成分をそのまま投与してもよいが、一般的には、上記有効成分と１種又は２種以上の製剤用添加物を含む医薬組成物を調剤して投与することが望ましい。 The active ingredient of the medicament, vitamin D receptor activator, and agent for preventing and/or treating vitamin D receptor-related diseases of the present invention can be a compound represented by general formula (1), a salt thereof, or a prodrug thereof. The medicament, vitamin D receptor activator, and agent for preventing and/or treating vitamin D receptor-related diseases of the present invention may be administered as the active ingredient itself, but it is generally desirable to administer the active ingredient by dispensing a pharmaceutical composition containing the active ingredient and one or more formulation additives.
本発明の医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤及びビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤の投与経路は特に限定されず。経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与などが挙げられるが特に限定されない。 The route of administration of the pharmaceutical, vitamin D receptor activator, and preventive and/or therapeutic agent for vitamin D receptor-related diseases of the present invention is not particularly limited. They may be administered orally or parenterally. Examples of parenteral administration include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intradermal injection, rectal administration, and transmucosal administration.
経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができる。
非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点鼻剤、経皮吸収剤、軟膏剤、クリーム剤、及び貼付剤等を挙げることができる。
Examples of pharmaceutical compositions suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, and syrups.
Pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration include, for example, injections, drip infusions, suppositories, inhalants, nasal drops, transdermal agents, ointments, creams, and patches.
製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができ、医薬組成物の形態に応じて適宜のものを選択して使用することが可能である。 Examples of pharmaceutical additives that can be used include excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers or solubilizers, isotonicity agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, and adhesives, and appropriate additives can be selected and used depending on the form of the pharmaceutical composition.
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、D-マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。 Examples of pharmaceutical additives that can be used in preparing formulations for oral administration include excipients such as glucose, lactose, D-mannitol, starch, or crystalline cellulose; disintegrants or disintegration aids such as carboxymethylcellulose, starch, or calcium carboxymethylcellulose; binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, or gelatin; lubricants such as magnesium stearate or talc; coating agents such as hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, polyethylene glycol, or titanium oxide; and bases such as petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or hard fat.
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、界面活性剤等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のpH調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。 Formulation additives that can be used in preparing formulations for injection or infusion include solubilizers or solubilizing agents that can form aqueous or ready-to-use injections, such as distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, and surfactants; isotonicity agents such as glucose, sodium chloride, D-mannitol, and glycerin; and pH adjusters such as inorganic acids, organic acids, inorganic bases, and organic bases.
本発明の医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤及びビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤はヒトなどの哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬、ビタミンＤ受容体活性化剤及びビタミンＤ受容体関連疾患の予防及び／又は治療剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１０μg／ｋｇから５０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１００μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２～４回程度）に分けて投与してもよい。
The medicine, vitamin D receptor activator, and preventive and/or therapeutic agent for vitamin D receptor-related diseases of the present invention can be administered to mammals such as humans.
The dosage of the medicament, vitamin D receptor activator, and preventive and/or therapeutic agent for vitamin D receptor-related diseases of the present invention should be increased or decreased as appropriate depending on conditions such as the patient's age, sex, weight, symptoms, and route of administration, but is generally in the range of about 10 μg/kg to 5000 mg/kg, and preferably about 100 μg/kg to 1000 mg/kg, of the active ingredient per day for an adult. The above-mentioned dosage may be administered once a day or in divided doses (e.g., about 2 to 4 times a day).
また、本発明の一般式（１）で示される化合物、その塩又はそのプロドラッグは、実験用試薬として用いることもできる。ビタミンＤ受容体を有する細胞、組織、器官又は動物個体を本発明の一般式（１）で示される化合物、その塩又はそのプロドラッグで処理することによって、ビタミンＤ受容体を活性化させることができる。ビタミンＤ受容体を有する細胞としては、腎臓、腸管粘膜、骨髄、骨、乳腺、皮膚、神経由来の細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。また、株化された動物細胞にビタミンＤ受容体遺伝子を導入することにより得られる組換え細胞を用いることもできる。ビタミンＤ受容体を有する組織及び器官としては、腎臓、腸管粘膜、骨髄、リンパ組織、骨、乳腺、皮膚、神経などを挙げることができるが、特に限定されない。動物個体としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリなどを挙げることができるが、特に限定されない。ビタミンＤ受容体の活性化は、ＶＤＲ標的遺伝子（例えば、CYP24など）の発現誘導を測定することにより、確認することができるが特に限定されない。 The compound represented by general formula (1) of the present invention, its salt, or its prodrug can also be used as an experimental reagent. Vitamin D receptor activation can be achieved by treating cells, tissues, organs, or individual animals having vitamin D receptors with the compound represented by general formula (1) of the present invention, its salt, or its prodrug. Examples of cells having vitamin D receptors include, but are not limited to, cells derived from the kidney, intestinal mucosa, bone marrow, bone, mammary gland, skin, and nerves. Recombinant cells obtained by introducing a vitamin D receptor gene into an established animal cell line can also be used. Examples of tissues and organs having vitamin D receptors include, but are not limited to, the kidney, intestinal mucosa, bone marrow, lymphatic tissue, bone, mammary gland, skin, and nerves. Examples of individual animals include, but are not limited to, mice, rats, hamsters, rabbits, and chickens. Vitamin D receptor activation can be confirmed by, but is not limited to, measuring the induction of expression of VDR target genes (e.g., CYP24).
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。 The present invention will be explained in detail using the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
略称は以下を意味する。
ＴＭＣＬ：クロロトリメチルシラン
ＤＰＰＡ：ジフェニルリン酸アジド
The abbreviations mean the following:
TMCL: chlorotrimethylsilane DPPA: diphenylphosphoryl azide
[合成スキーム]
＜化合物4の合成＞
化合物3 (29 mg, 0.067 mmol)を脱水ジクロロメタン (5 mL)に溶かし、0℃に冷却した。イミダゾール (36 mg, 0.53 mmol)とクロロトリメチルシラン (44 mg, 0.40 mmol)を加え、室温で1時間30分攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水に加え、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を留去することで白色固体の化合物4 (32 mg, quant.) を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 2.40 (ddd, J = 15.6, 10.2, 5.4 Hz, 1 H), 2.26 (ddd, J = 16.5, 10.5, 5.4 Hz, 1 H), 1.96-1.92 (m, 1 H), 1.87-1.77 (m, 3 H), 1.74-1.70 (m, 1 H), 1.59-1.54 (m, 1H), 1.46-0.94 (m, 23 H), 1.22 (s, 3H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.64 (s, 3 H), 0.10 (s, 9 H).
<Synthesis of Compound 4>
Compound 3 (29 mg, 0.067 mmol) was dissolved in anhydrous dichloromethane (5 mL) and cooled to 0°C. Imidazole (36 mg, 0.53 mmol) and chlorotrimethylsilane (44 mg, 0.40 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour and 30 minutes. The reaction mixture was added to saturated aqueous sodium bicarbonate and extracted with diethyl ether. The organic layer was washed with saturated brine and then dehydrated over anhydrous sodium sulfate. The solvent was evaporated to give compound 4 (32 mg, quant.) as a white solid.
1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ 2.40 (ddd, J = 15.6, 10.2, 5.4 Hz, 1 H), 2.26 (ddd, J = 16.5, 10.5, 5.4 Hz, 1 H), 1.96-1.92 (m, 1 H), 1.87-1.77 (m, 3 H), 1.74-1.70 (m, 1 H), 1.59-1.54 (m, 1H), 1.46-0.94 (m, 23 H), 1.22 (s, 3H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.64 (s, 3 H), 0.10 (s, 9 H).
＜化合物5の合成＞
化合物4 (23 mg, 0.045 mmol)を脱水アセトン (8 mL)に溶かし、アルゴン置換した後0℃に冷却した。トリエチルアミン (15 μL, 0.11 mmol)とジフェニルリン酸アジド (20 μL, 0.093 mmol)を加え、0℃で2時間攪拌した。反応液を飽和食塩水にあけ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後に溶媒を留去することで粗生成物5 (206 mg, 53%) を得た。精製を行わずに次の反応に進んだ。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 2.37 (ddd, J = 14.7, 11.1, 4.8 Hz, 1 H), 2.26 (ddd, J = 15.0, 9.9, 6.6 Hz, 1 H), 1.95-1.90 (m, 1 H), 1.87-1.72 (m, 5 H), 1.59-0.94 (m, 23 H), 1.22 (s, 3H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.63 (s, 3 H), 0.09 (s, 9 H).
<Synthesis of Compound 5>
Compound 4 (23 mg, 0.045 mmol) was dissolved in anhydrous acetone (8 mL), purged with argon, and cooled to 0 °C. Triethylamine (15 μL, 0.11 mmol) and diphenylphosphoryl azide (20 μL, 0.093 mmol) were added, and the mixture was stirred at 0 °C for 2 hours. The reaction mixture was poured into saturated brine and extracted with dichloromethane. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated to give crude product 5 (206 mg, 53%). This was used in the next reaction without further purification.
1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ 2.37 (ddd, J = 14.7, 11.1, 4.8 Hz, 1 H), 2.26 (ddd, J = 15.0, 9.9, 6.6 Hz, 1 H), 1.95-1.90 (m, 1 H), 1.87-1.72 (m, 5 H), 1.59-0.94 (m, 23 H), 1.22 (s, 3H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.63 (s, 3 H), 0.09 (s, 9 H).
＜化合物1aの合成＞
化合物5 (313 mg)を脱水トルエン (8 mL)に溶かし、脱水メタノール (50 μL, 1.24 mmol)を加えてアルゴン下、90℃で17時間加熱還流した。室温に戻した後に反応液を水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を留去したのち、PTLC (AcOEt : n-hexane = 1 : 5)で精製し、n-へキサンで再結晶を行うことで白色固体状の化合物1a (3.0 mg)を得た。
化合物1a：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ4.54 (br, 1 H), 3.64 (s, 3 H), 3.28-3.21 (m, 1 H), 3.12-3.06 (m, 1 H), 1.95-1.91 (m, 1 H), 1.86-1.77 (m, 3 H), 1.75-1.71 (m, 1 H), 1.60-0.95 (m, 28 H), 1.21 (s, 3 H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.89 (s, 3 H), 0.62 (s, 3 H) ; 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 157.00, 71.44, 56.44, 56.06, 51.93, 51.18, 43.50, 42.68, 40.41, 40.10, 38.52, 37.38, 36.01, 35.85, 35.75, 34.93, 34.63, 33.68, 29.97, 29.93, 29.72, 28.31, 27.35, 26.40, 24.11, 23.92, 20.72, 18.53, 11.93; HRMS calcd for C29H51NNaO3 (M + Na)+ 484.3766, found 484.3761.
<Synthesis of Compound 1a>
Compound 5 (313 mg) was dissolved in anhydrous toluene (8 mL), anhydrous methanol (50 μL, 1.24 mmol) was added, and the mixture was heated under reflux at 90°C for 17 hours under argon. After returning to room temperature, the reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dehydrated over sodium sulfate. After distilling off the solvent, the residue was purified by PTLC (AcOEt: n-hexane = 1:5) and recrystallized from n-hexane to obtain compound 1a (3.0 mg) as a white solid.
Compound 1a: 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ4.54 (br, 1 H), 3.64 (s, 3 H), 3.28-3.21 (m, 1 H), 3.12-3.06 (m, 1 H), 1.95-1.91 (m, 1 H), 1.86-1.77 (m, 13C NMR ( 150 MHz, CDCl 3 ) δ 157.00, 71.44, 56.44, 56.06, 51.93, 51.18, 43.50, 42.68, 40.41, 40.10, 38.52, 37.38, 36.01, 35.85, 35.75, 34.93, 34.63, 33.68, 29.97, 29.93, 29.72, 28.31, 27.35, 26.40, 24.11, 23.92, 20.72, 18.53, 11.93; HRMS calcd for C29H51NNaO3 (M + Na) + 484.3766, found 484.3761.
＜化合物1bの合成＞
化合物5 (207 mg)を脱水トルエン (6 mL)に溶かし、脱水エタノール (50 μL)を加えてアルゴン下、70℃で46時間加熱還流した（0.8563 mmol, 16.4 eq.)。室温に戻した後に反応液を水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を留去したのち、 PTLC (AcOEt : n-hexane = 1 : 5)で精製し、n-へキサンで再結晶を行うことで白色固体状の化合物1b (4.4 mg)を得た。
化合物1b：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ4.53 (br, 1 H), 4.1 (q, J = 7.2, 6.6 Hz, 2 H), 3.28-3.21 (m, 1 H), 3.12-3.06 (m, 1 H), 1.95-1.91 (m, 1 H), 1.86-1.77 (m, 3 H), 1.75-1.71 (m, 1 H), 1.60-0.95 (m, 31 H), 1.22 (s, 3 H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.63 (s, 3 H) ; 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 159.99, 71.67, 60.60, 56.50, 56.12, 51.24, 49.35, 43.56, 42.74, 40.46, 40.16, 37.43, 36.06, 35.90, 35.81, 34.98, 34.69, 33.74, 30.02, 29.99, 29.77, 28.36, 27.41, 26.46, 24.16, 23.97, 20.77, 18.58, 14.67, 11.98; HRMS calcd for C30H53NNaO3 (M + Na)+ 498.3906, found 498.3918.
<Synthesis of Compound 1b>
Compound 5 (207 mg) was dissolved in anhydrous toluene (6 mL), anhydrous ethanol (50 μL) was added, and the mixture was heated under reflux at 70°C for 46 hours under argon (0.8563 mmol, 16.4 eq.). After returning to room temperature, the reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dehydrated over sodium sulfate. After distilling off the solvent, the residue was purified by PTLC (AcOEt: n-hexane = 1:5) and recrystallized from n-hexane to obtain compound 1b (4.4 mg) as a white solid.
Compound 1b: 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ4.53 (br, 1 H), 4.1 (q, J = 7.2, 6.6 Hz, 2 H), 3.28-3.21 (m, 1 H), 3.12-3.06 (m, 1 H), 1.95-1.91 (m, 1 H), 1.86-1.77 (m, 3 H), 1.75-1.71 (m, 1 H), 1.60-0.95 (m, 31 H), 1.22 (s, 3 H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.90 (s, 3 H), 0.63 (s, 3 H); 13C NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ 159.99, 71.67, 60.60, 56.50, 56.12, 51.24, 49.35, 43.56, 42.74, 40.46, 40.16, 37.43, 36.06, 35.90, 35.81, 34.98, 34.69, 33.74, 30.02, 29.99, 29.77, 28.36, 27.41, 26.46, 24.16, 23.97, 20.77, 18.58, 14.67, 11.98; Na) + 498.3906, found 498.3918.
＜化合物2aの合成＞
化合物5 (313 mg)を脱水トルエン (8 mL)に溶かし、28%アンモニア水 (0.5 mL)を加えてアルゴン下、70℃で21時間加熱還流した。室温に戻した後に反応液を水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を留去したのち、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3 : MeOH = 100 : 1)で精製し、エタノールとn-ヘキサンで再結晶を行うことで白色固体状の化合物2a (9.8 mg)を得た。
化合物2a：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ5.77 (br, 1H), 5.29 (br, 2H), 3.04-2.99 (m, 1 H), 2.88-2.82 (m, 1 H), 1.92-1.89 (m, 1 H), 1.82-1.74 (m, 3 H), 1.69-1.66 (m, 1 H), 1.53-0.90 (m, 25 H), 1.06 (s, 6 H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 3 H), 0.88 (s, 3 H), 0.61 (s, 3 H);
<Synthesis of Compound 2a>
Compound 5 (313 mg) was dissolved in anhydrous toluene (8 mL), 28% aqueous ammonia (0.5 mL) was added, and the mixture was heated to reflux at 70°C under argon for 21 hours. After returning to room temperature, the reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dehydrated over sodium sulfate. After distilling off the solvent, the residue was purified by flash silica gel column chromatography (CHCl 3 : MeOH = 100 : 1) and recrystallized from ethanol and n-hexane to obtain compound 2a (9.8 mg) as a white solid.
Compound 2a: 1 H NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ5.77 (br, 1H), 5.29 (br, 2H), 3.04-2.99 (m, 1 H), 2.88-2.82 (m, 1 H), 1.92-1.89 (m, 1 H), 1.82-1.74 (m, 3 H), 1.69-1.66 (m, 1 H), 1.53-0.90 (m, 25 H), 1.06 (s, 6 H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 3 H), 0.88 (s, 3 H), 0.61 (s, 3 H);
＜化合物2bの合成＞
化合物5 を含むクルード(206 mg)を脱水トルエン (6 mL)に溶かし、アルゴン下、65℃で1 時間攪拌した。室温に戻し、メチルアミン (40%, メタノール溶液, 10 μL, 0.2901 mmol, 12.1 eq.)を加えてアルゴン下で17.5 時間攪拌した。室温に戻した後に反応液を水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を留去したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2 : MeOH = 25 : 1)で精製し、エタノールとn-ヘキサンで再結晶を行うことで白色固体状の化合物2b (3.3 mg, 0.007168 mmol, 30%)を得た。
化合物2b：1H NMR (600 MHz, MD3OD) δ3.10-3.06 (m, 1 H), 2.95-2.91 (m, 1 H), 2.57 (s, 3 H), 1.92-1.88 (m, 1 H), 1.82-1.74 (m, 3 H), 1.70-1.66 (m, 1 H), 1.55-0.88 (m, 25 H), 1.08 (s, 6 H), 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.84 (s, 3 H), 0.58 (s, 3 H) ; 13C NMR (150 MHz, MD3OD) δ 147.13, 72.00, 68.35, 61.91, 57.94, 57.72, 56.35, 52.07, 45.13, 43.91, 41.88, 41.56, 38.67, 37.45, 37.25, 36.20, 35.80, 35.04, 30.98, 29.91, 29.89, 29.39, 28.61, 27.73, 25.27, 24.52, 21.91, 19.10, 12.41; HRMS calcd for C29H52N2NaO2 (M + Na)+ 483.3923, found 483.3921.
<Synthesis of compound 2b>
The crude product containing compound 5 (206 mg) was dissolved in anhydrous toluene (6 mL) and stirred under argon at 65°C for 1 hour. After returning to room temperature, methylamine (40% methanol solution, 10 μL, 0.2901 mmol, 12.1 eq.) was added and stirred under argon for 17.5 hours. After returning to room temperature, the reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dehydrated over sodium sulfate. After distilling off the solvent, the residue was purified by silica gel column chromatography ( CH2Cl2 :MeOH = 25:1) and recrystallized from ethanol and n - hexane to give compound 2b (3.3 mg, 0.007168 mmol, 30%) as a white solid.
Compound 2b: 1 H NMR (600 MHz, MD 3 OD) δ3.10-3.06 (m, 1 H), 2.95-2.91 (m, 1 H), 2.57 (s, 3 H), 1.92-1.88 (m, 1 H), 1.82-1.74 (m, 3 H), 1.70-1.66 (m, 1 H), 1.55-0.88 (m, 25 H), 1.08 (s, 6 H), 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3 H), 0.84 (s, 3 H), 0.58 (s, 3 H); 13 C NMR (150 MHz, MD 3 OD) δ 147.13, 72.00, 68.35, 61.91, 57.94, 57.72, 56.35, 52.07, 45.13, 43.91, 41.88, 41.56, 38.67, 37.45, 37.25, 36.20, 35.80, 35.04, 30.98, 29.91, 29.89, 29.39, 28.61, 27.73, 25.27, 24.52, 21.91, 19.10, 12.41; HRMS calcd for C29H52N 2 NaO2 (M + Na) + 483.3923, found 483.3921.
試験例１：HL-60細胞における細胞分化誘導検定
実施例１の化合物1a及び化合物1bに関して、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞HL-60に対する細胞分化誘導作用を検討した。比較として活性型ビタミンD3を用いた。
Test Example 1: Cell differentiation induction assay in HL-60 cells Compounds 1a and 1b of Example 1 were examined for their cell differentiation induction activity in human acute promyelocytic leukemia cells HL-60. Active vitamin D3 was used for comparison.
細胞分化誘導の検定アッセイは、 Fujii et al. Bioorg. Med. Chem. 22 (2014) 5891-5901の「4.3.1. Assay of HL-60 cell differentiation-inducing activity」に記載の方法と同様に行った。具体的には以下の通りである。 The assay for cell differentiation induction was performed in the same manner as described in "4.3.1. Assay of HL-60 cell differentiation-inducing activity" in Fujii et al. Bioorg. Med. Chem. 22 (2014) 5891-5901. Specifically, the procedure is as follows.
ＨＬ－６０細胞を、５％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）、ペニシリンG及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地において、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０（５％ＦＢＳ）で８．０×１０４細胞／ｍＬに希釈し、被験化合物のエタノール溶液を、最終濃度１０－１０～１０－５Ｍになるように添加した。対照の細胞は、同量のエタノールのみで処理した。１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３は陽性対照として同時にアッセイした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。分化した細胞の割合は、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の還元能測定により測定した。細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０（５％ＦＢＳ）と、ＮＢＴ（０．２％）及び12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセテート (TPA; 200 ng/mL)を含む同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において３７℃で２０分間インキュベートした。濃い藍色のホルマザンを含む細胞の割合を、最低限の２００細胞において測定した。
ＮＢＴ還元能から算出した分化した細胞の割合（％）を、図１に示す。
HL-60 cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 5% FBS (fetal bovine serum), penicillin G, and streptomycin at 37°C and 5% CO2 . The cells were diluted to 8.0 x 104 cells/mL with RPMI-1640 (5% FBS), and an ethanol solution of the test compound was added to a final concentration of 10-10 to 10-5 M. Control cells were treated with the same volume of ethanol alone. 1α,25-dihydroxyvitamin D3 was assayed simultaneously as a positive control. The cells were incubated at 37°C and 5% CO2 for 4 days. The percentage of differentiated cells was determined by measuring the reduction potential of nitroblue tetrazolium (NBT). Cells were incubated for 20 min at 37°C in an equal volume of RPMI-1640 (5% FBS) and phosphate-buffered saline (PBS) containing NBT (0.2%) and 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA; 200 ng/mL). The percentage of cells containing blue-black formazan was determined in a minimum of 200 cells.
The percentage (%) of differentiated cells calculated from the NBT reducing activity is shown in FIG.
図１の結果から分かるように、本発明の化合物1a及び化合物1bは、活性型ビタミンD3と同様にHL-60細胞に対する分化誘導作用が高い。 As can be seen from the results in FIG. 1, Compounds 1a and 1b of the present invention have a strong differentiation-inducing effect on HL-60 cells, similar to active vitamin D3 .
Claims (8)
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| BMC Biochemistry 2011，Vol.12:5，p.1-19，http://www.biomedcentral.com/1471-2091/12/5 |
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| Journal of Lipid Research，2013年03月31日，Vol.5，p.2206-2213 |
| Journal of Medicinal Chemistry，2020年12月28日，Vol.64，p.516-526 |
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