JP7773157B2

JP7773157B2 - 膀胱がん用抗がん剤の製造方法

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Publication number: JP7773157B2
Application number: JP2024051282A
Authority: JP
Inventors: 祐太篠原; 洋一中尾; 光史町田; ワイラムツェ; 達哉臼井; 晴山本; ユティンウェイ; 一昭佐々木
Original assignee: Waseda University; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Waseda University; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2024-03-27
Filing date: 2024-03-27
Publication date: 2025-11-19
Anticipated expiration: 2044-03-27
Also published as: JP2025150419A

Description

本発明は、膀胱がん用抗がん剤の製造方法に関する。

一般に、白樺の木に寄生するキノコとしてチャーガ（Ｃｈａｇａ、和名：カバノアナタケ）が知られている。チャーガは、β－Ｄ－グルカン、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）、リグニン等の機能性成分を含有し、摂取により免疫機能を増加させる作用等が期待されている。

従来より、チャーガ由来の成分を含有する組成物として特許文献１，２に開示されるような組成物が知られている。特許文献１は、チャーガ（カバノアナタケ）の抽出物を含む抗糖化剤について開示する。特許文献２は、米糠抽出物、米麹抽出物、チャーガ（カバノアナタケ）液体培養液の抽出物等を含む混合物を乳酸菌発酵することを特徴とする健康機能組成物について開示する。

特開２０１９－４３８８７号公報特開２００７－１５３８１３号公報

本発明は、チャーガ中において、優れた抗膀胱がん作用を発揮するトリテルペン類を発見したことに基づくものである。本発明は、新規な膀胱がん用抗がん剤の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記の課題を解決するべく研究した結果、イノノツサンＡ、イノノツトリオールＡ、２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン、又はイノノツサンＢが優れた抗膀胱がん活性を有することを見出した。

上記課題を解決する各態様を記載する。
態様１の膀胱がん用抗がん剤の製造方法は、イノノツサンＡ、２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン、及びイノノツサンＢから選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する膀胱がん用抗がん剤の製造方法であって、前記有効成分が、化学合成される工程を含む。

態様２は、態様１に記載の膀胱がん用抗がん剤の製造方法において、前記膀胱がんは、筋層浸潤性膀胱がんである。

本発明の膀胱がん用抗がん剤は、優れた抗膀胱がん作用を発揮できる。

図１は、チャーガから画分１５－９、画分２５－３、画分２５－５、及び画分２６－２を得るための分画スキームを示す。図２は、画分１５－９の質量分析において、ESI-MS（ポジティブモード）の結果を示す。図３は、画分２５－３の質量分析において、ESI-MS（ポジティブモード）の結果を示す。図４は、画分２５－５の質量分析において、ESI-MS（ポジティブモード）の結果を示す。図５は、画分２６－２の質量分析において、ESI-MS（ポジティブモード）の結果を示す。図６は、画分１５－９中の成分（イノノツサンＡ）について、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。図７は、画分２５－３中の成分（イノノツトリオールＡ）について、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。図８は、画分２５－５中の成分（２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン）について、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。図９は、画分２６－２中の成分（イノノツサンＢ）について、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。

以下、本発明の膀胱がん用抗がん剤を具体化した一実施形態を説明する。
本実施形態の膀胱がん用抗がん剤は、イノノツサンＡ（inonotusane A）、イノノツトリオールＡ（inonotsutriol A）、２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン（21,24-cyclopenta-3β,21,25‐trihydroxylanosta-8-ene）、及びイノノツサンＢ（inonotusane B）から選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する。

（有効成分）
イノノツサンＡは、下記一般式（１）に示される構造を有する。

イノノツトリオールＡは、下記一般式（２）に示される構造を有する。

２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エンは、下記一般式（３）に示される構造を有する。

イノノツサンＢは、下記一般式（４）に示される構造を有する。

上記４種類の有効成分は、いずれも分子式Ｃ₃₀Ｈ₅₀Ｏ₃、分子量約４５８である。また、ラノスタン型トリテルペンの共通骨格を有し、２１位及び２４位の相対配置がそれぞれ異なるのみの化合物群である。

上記４種類の有効成分は、化学合成品であってもよく、天然素材から水・親水性有機溶媒等を用いて抽出された粗抽出品又は精製品であってもよい。抽出原料として用いられる天然素材としては、チャーガが挙げられる。チャーガは、タバコウロコタケ科に属し、白樺の木に寄生するきのこの１種であり、学名はInonotus obliquusであり、和名はカバノアナタケである。チャーガの抽出原料としては、特に限定されず、子実体、菌糸体、菌糸体の液体培養物等のいずれを採用してもよい。

チャーガからの上記４種類の有効成分の抽出方法は、精製品又は標準品を指標とした公知の抽出法、例えば水、親水性有機溶媒、水／親水性有機溶媒等の混合溶媒を用いた抽出法、超臨界抽出法等が用いられる。本実施形態において用いられる親水性有機溶媒としては、水に溶解する性質を有するエタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトン等のケトン類を適宜選択して使用することができる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で抽出効率の観点から水が用いられることが好ましい。

溶媒として水を使用する場合、水の使用容量は、チャーガ原料粉末の質量に対して好ましくは５～３０倍量、より好ましくは１０～２５倍量である。水の使用容量が５倍量以上の場合、目的成分の抽出効率をより向上できる。水の使用容量が３０倍量以下の場合、濃縮等の工程時間の短縮を図り、作業効率を向上できる。

また、溶媒として水を用いて抽出する場合、目的成分の抽出効率を向上させるために、抽出処理前に採取時に混入するゴミ等の夾雑物を除去し、粉砕することが好ましい。抽出温度は５～４０℃であることが好ましい。抽出温度がかかる温度範囲の場合、目的成分の抽出効率を向上できる。なお、抽出操作は、前記抽出温度で撹拌しながら例えば４時間以上行なえばよい。そして、上記の抽出条件で目的成分を十分に抽出した後、濾紙濾過、珪藻土濾過などの濾過処理を行なうことにより粗抽出物を得ることができる。

次に、溶媒抽出物から１又は２以上のクロマトグラフィを用い、精製品又は標準品を指標として、本実施形態の上記４種類の有効成分を分離・精製することができる。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えばガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが抽出成分の分離効率が優れる観点から好ましい。それらを適宜組み合わせて、公知の使用方法で目的成分を精製することができる。

（作用）
上記４種類の有効成分は、高い抗膀胱がん作用を発揮する。より具体的には、膀胱がんの治療、予防、各種症状を緩和等の作用効果が期待される。したがって、抗膀胱がん作用を得ることを目的とし、上記４種類の有効成分の少なくとも一種を含有する膀胱がん用抗がん剤として適用することができる。

（使用形態）
具体的な配合形態として、膀胱がん用抗がん剤は、膀胱がん患者に対する医薬品、及び膀胱がんの各種症状を緩和又は予防するための飲食品等として好ましく適用することができる。

本実施形態の膀胱がん用抗がん剤を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）、血管内投与、経皮投与、腹腔内投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、各投与方法に適した剤形を適宜採用することができるが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、必要により、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態の膀胱がん用抗がん剤を飲食品に適用する場合、抗膀胱がん用の飲食品に適宜採用することができる。本実施形態の膀胱がん用抗がん剤を種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状等のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。

（本実施形態の効果）
本実施形態の膀胱がん用抗がん剤の効果について説明する。
（１）本実施形態の膀胱がん用抗がん剤は、イノノツサンＡ、イノノツトリオールＡ、２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン、及びイノノツサンＢから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する。これらの有効成分は、これまで報告例のない優れた抗膀胱がん作用を発揮できる。

（２）膀胱がんとして筋層浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）は、幹細胞性、転移性、及び治療抵抗性が高く、予後不良の膀胱がんであることが知られている。本実施形態の膀胱がん用抗がん剤により、かかる筋層浸潤性膀胱がんに対する抗膀胱がん作用を発揮が期待される。

（変更例）
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。上記実施形態及び以下の変更例は、技術的に矛盾しない範囲で互いに組み合わせて実施できる。

上記実施形態における膀胱がん用抗がん剤は、ヒトに対して適用することができるのみならず、犬等のペット、家畜等の飼養動物に対して適用してもよい。

以下、実施例に基づき、本発明についてより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。

＜試験例１：抗膀胱がん作用を有する成分の分離＞
図１に示される分画スキームにて、抽出原料としてチャーガ粉末を使用し、水抽出後、分離担体として各種シリカゲルを使用することにより分画した。犬膀胱がんオルガノイドに対する細胞毒性活性を指標として、かかる活性を有し、且つ単一ピークを有する画分（画分１５－９、画分２５－３、画分２５－５、画分２６－２）を得た。

（１）犬膀胱がんオルガノイドに対する細胞毒性の評価試験方法
犬の膀胱がんは、ヒトの膀胱がんと病因、病態、症状、遺伝的プロフィール、治療法において類似していることが確認されている。そのため、下記に示されるように、犬膀胱がんオルガノイド細胞（ＤＢＣＯ）を用いて細胞毒性を評価することにより抗がん活性をスクリーニングした。

犬膀胱がんオルガノイド細胞を培養する培地中のゲルを５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で溶かしてオルガノイド細胞を回収した。０．０５％トリプシンにより３７℃５分間処理した。７０μｍのセルストレーナーに通し、細胞数をカウントした。細胞をゲル１０μＬと混合し、９６ｗｅｌｌに細胞播種（２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、インキュベーターでゲルを固めて培養液を１００μＬ添加した。翌日サンプルを処理し、７２時間後にプレストブルーを１０μＬ添加した。４時間後に蛍光強度（５７０ｎｍ）を測定し、ブランクを引いてコントロールの生存率を１とした場合の生存率の相対値として算出した。

（２）画分１５－９の分取
チャーガ粉末１００ｇに水２．５Ｌに懸濁し、室温で抽出処理した。遠心分離により上清を得た。

次に、得られた上清を、下記のカラムクロマトグラフィの下記分離条件１で分画処理し、全７画分（画分１－１～１－７）を得た。
（分離条件１）
カラム：ＯＳＤｆｌａｓｈＣＣ（内径５×５ｃｍ）（YMC社製）
移動相：H₂O, 20%, 50%, 70%, 100% MeOH, CHCl₃ / MeOH / H₂O(6:4:1), 100% MeOH + 0.05% TFA
カラム温度：室温
分離条件１で得られた100% MeOHの画分１－５（８６．９ｍｇ）について、さらに下記のカラムクロマトグラフィの分離条件２で分画処理を行い、全７画分（画分３－１～３－７）を得た。

（分離条件２）
カラム：ＳｉＯ_２ｏｐｅｎＣＣ（内径２×１０ｃｍ）（富士シリシア化学社製）
移動相：n-hexane/ EtOAc (7:3, 6:4, 5:5)、CHCl₃, CHCl₃ / MeOH (19:1, 9:1)、CHCl₃ / MeOH/ H₂O (6:4:1)
カラム温度：室温
画分３－３（１２．２ｍｇ）について、さらに下記のカラムクロマトグラフィの分離条件３で分画処理を行い、全１２画分（画分１５－１～１５－１２）を得た。

（分離条件３）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ_１８ＡＲ－ＩＩ（内径１０×２５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）
溶媒：６０％水／アセトニトリル（０～６分）
６０％→９０％水／アセトニトリルグラジエント（６～５６分）
９０％アセトニトリル（５６～１００分）
流速：２ｍＬ／分
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
カラム温度：室温
溶出時間７６．８～７９．２分の画分１５－９（０．６ｍｇ）について、単一ピークが得られた。また、画分１５－９において、犬膀胱がんオルガノイド細胞の生存率（対コントロール）を測定したところ１０μｇ／ｍＬの濃度において０．６５１であった。画分１５－９成分の犬膀胱がんオルガノイド細胞に対する抗がん作用が認められた。

（３）画分２５－３及び画分２５－５の分取
上記分離条件３の分画処理により得られた溶出時間６２．４～６５．４分の画分１５－６（１．９ｍｇ）について、さらに下記のカラムクロマトグラフィの分離条件４で分画処理を行い、全６画分（画分２５－１～２５－６）を得た。

（分離条件４）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ_１８ＡＲ－ＩＩ（内径１０×２５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）
溶媒：メタノール：水＝８４：１６
流速：２ｍＬ／分
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
カラム温度：室温
溶出時間４７．４～４９．８分の画分２５－３（０．７ｍｇ）について、単一ピークが得られた。また、犬膀胱がんオルガノイド細胞の生存率（対コントロール）を測定したところ１０μｇ／ｍＬの濃度において０．６９７であった。画分２５－３成分の犬膀胱がんオルガノイド細胞に対する抗がん作用が認められた。

溶出時間６０～６３．５分の画分２５－５（０．４ｍｇ）について、単一ピークが得られた。
また、犬膀胱がんオルガノイド細胞の生存率（対コントロール）を測定したところ１０μｇ／ｍＬの濃度において０．２８０であった。画分２５－５成分の犬膀胱がんオルガノイド細胞に対する抗がん作用が認められた。

（４）画分２６－２の分取
上記分離条件２の分画処理により得られた画分３－５（６．２ｍｇ）について、さらに下記のカラムクロマトグラフィの分離条件５で分画処理を行い、全１１画分（画分１９－１～１９－１１）を得た。

（分離条件５）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ_１８ＡＲ－ＩＩ（内径１０×２５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）
溶媒：５０％水／アセトニトリル（０～６分）
５０％→８０％水／アセトニトリルグラジエント（６～５６分）
８０％アセトニトリル（５６～７６分）
流速：２ｍＬ／分
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
カラム温度：室温
溶出時間６３．６～６４．８の画分１９－９（０．６ｍｇ）について、さらに下記のカラムクロマトグラフィの分離条件６で分画処理を行い、全４画分（画分２６－１～２６－４）を得た。

（分離条件６）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ_１８ＡＲ－ＩＩ（内径１０×２５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）
溶媒：メタノール：水＝８４：１６
流速：２ｍＬ／分
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ
カラム温度：室温
溶出時間４２～４４．５分の画分２６－２（０．５ｍｇ）について、単一ピークが得られた。

また、犬膀胱がんオルガノイド細胞の生存率（対コントロール）を測定したところ１０μｇ／ｍＬの濃度において０．７４５であった。画分２６－２成分の犬膀胱がんオルガノイド細胞に対する抗がん作用が認められた。

＜試験例２：画分１５－９、画分２５－３、画分２５－５、及び画分２６－２の構造解析＞
（１）質量分析による分子量の測定
画分１５－９、画分２５－３、画分２５－５、及び画分２６－２についてそれぞれ分子量を測定した。分子量は質量分析計（Compact QTOF, Bruker社製）を採用して行った。図２～５に、画分１５－９、画分２５－３、画分２５－５、及び画分２６－２の各ＭＳスキャンデータから、所定のｍ／ｚの強度を抽出した抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の結果をそれぞれ示す。

その結果、各画分は、それぞれｍ／ｚ：４８１．３６１７［Ｍ＋Ｎａ］^＋にピークを示した。各画分は、それぞれ分子量４５８．３３０６１、分子式：Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_３と推定された。

（２）画分１５－９の核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いた構造決定
画分１５－９の分子量４５８の成分について、核磁気共鳴装置（Avance 600 MHz、Bruker社製）を用いて^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった（以下、同様）。試料はＣＤＣｌ_３重水素クロロホルムに溶解させた。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を図６に示す。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲの測定結果を表１に示す。

なお、各画分の構造決定にあたり、「21,24-Cyclolanostanes revisited: Structural revision and biological evaluation」 Fitoterapia、Volume156、January 2022、105101、「Triterpenoids from Inonotus obliquus and their antitumor activities」 Fitoterapia、2015 Mar:101：34-40の記載も参酌した。

その結果、画分１５－９中の化合物は、上記化学式（１）に示されるイノノツサンＡ（inonotusane A、分子量４５８、分子式：Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_３）であると同定した。

（３）画分２５－３の核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いた構造決定
画分２５－３の分子量４５８の成分について、^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。試料はＣＤＣｌ_３重水素クロロホルムに溶解させた。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を図７に示す。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲの測定結果を表２に示す。

その結果、画分２５－３の化合物は、上記化学式（２）に示されるイノノツトリオールＡ（inonotsutriol A、分子量４５８、分子式：Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_３）であると同定した。

（４）画分２５－５の核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いた構造決定
画分２５－５の分子量４５８の成分について、^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。試料はＣＤＣｌ_３重水素クロロホルムに溶解させた。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を図８に示す。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲの測定結果を表３に示す。

その結果、画分２５－５の化合物は、上記化学式（３）に示される２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン（21,24-cyclopenta-3β,21,25‐trihydroxylanosta-8-ene、分子量４５８、分子式：Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_３）であると同定した。

（５）画分２６－２の核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いた構造決定
画分２６－２の分子量４５８の成分について、^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。試料はＣＤＣｌ_３重水素クロロホルムに溶解させた。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を図９に示す。核磁気共鳴スペクトル^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲの測定結果を表４に示す。

その結果、上記画分２６－２の化合物は、上記化学式（４）に示されるイノノツサンＢ（inonotusane B、分子量４５８、分子式：Ｃ_３０Ｈ_５０Ｏ_３）であると同定した。

上記化学式（１）～（４）の化合物は、これまで抗膀胱がん作用を有することが知られておらず、本試験により新規な作用効果を見出した。

Claims

イノノツサンＡ、２１，２４－シクロペンタ－３β，２１，２５－トリヒドロキシラノスタ－８－エン、及びイノノツサンＢから選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する膀胱がん用抗がん剤の製造方法であって、
前記有効成分が、化学合成される工程を含む膀胱がん用抗がん剤の製造方法。
前記膀胱がんは、筋層浸潤性膀胱がんである請求項１に記載の膀胱がん用抗がん剤の製造方法。