JP7773169B2 - ポリオキサゾリン結合アルブミン、人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液 - Google Patents
ポリオキサゾリン結合アルブミン、人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液Info
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Description
本発明は、ポリオキサゾリン結合アルブミン、人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液に関する。
血清アルブミンは、血漿タンパク質の約６０％を占める単純タンパク質であり、血流中では膠質浸透圧の維持や、各種内因性物質（代謝産物やホルモン等）・外因性物質（薬物等）の貯蔵運搬という役割を担っている。献血液（血漿分画）から分離精製されたアルブミンは、製剤化され、臨床で広く用いられている。アルブミン製剤を投与する目的は、膠質浸透圧を維持し、循環血液量（循環血漿量）を確保することである。具体的には、出血、毛細血管の浸透性の増加、肝臓のアルブミン合成低下、腎臓や腸からの排泄過剰、代謝の亢進、術中輸液による希釈等によって低アルブミン血症となった場合、アルブミン製剤が投与される。アルブミン製剤には、等張アルブミン製剤と高張アルブミン製剤の２種類がある。等張アルブミン製剤は、外傷による緊急出血性ショック時の他、敗血症、人工心肺を使用する心臓手術、循環動態が不安定な体外循環実施時、重症熱傷、妊娠高血圧症候群等の病態に用いられる。高張アルブミン製剤は、膠質浸透圧を上昇させ、血管内に水を引き込むことができるので、出血性ショック時の他、肝硬変に伴う難治性の腹水、難治性の浮腫、肺水腫を伴うネフローゼ症候群等の病態に用いられる。アルブミン製剤は、加熱によるウイルス不活化が可能であり、ウイルス感染のリスクは無い。しかしながら、日本におけるアルブミン製剤の自給率は６４％（２０１８年）と低く、血液法の基本理念である「国内自給」は達成されていない。少子高齢化が進行し、輸血の必要な高齢者数が増え、血液提供者（ドナー）数（若年層）が減少すると、自給率が更に低下する懸念もある。
アルブミン製剤の代替物、即ち、人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液としては、１９７０年代から多糖を用いた製剤が開発され、現在では低分子デキストラン製剤やヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）製剤が実用化されている（例えば、特許文献１、２参照）。しかしながら、ＨＥＳ製剤を投与した場合、血液凝固障害、腎機能障害、ショック、アミラーゼ上昇等の副作用を起こす場合がある。このような背景から、現在、新しい人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液の開発に期待が寄せられている。
一方、日本は犬猫飼育頭数１８１３万頭を超えるペット大国であり、その数は１５歳未満の子供の人口（１５１１万人）を遥かに上回る。また、ペットの高齢化も進み、動物医療に対する需要も年々高まり続けている。しかしながら、輸血治療については、そもそも動物用血液バンクが存在しないため、充分な体制が整っていないのが現状である。当然、血漿分画製剤としての動物用アルブミン製剤（例えば、イヌ血液から分離精製されたイヌ血清アルブミン製剤や、ネコ血液から分離精製されたネコ血清アルミン製剤）も存在しない。低アルブミン血症になった動物の治療には、その動物の血漿を入手し輸液する方法があるが、安定して確保するのは難しい。仕方なくＨＥＳ製剤を使用するものの、上述の副作用を起こしたり、血中滞留時間が短いという欠点もある。このような背景から、現在、より安全で長い血中滞留性を有する動物用人工血漿増量剤の開発に大きな期待が寄せられている。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体適合性に優れた水溶性の合成高分子である。異種タンパク質であっても、その分子表面をＰＥＧで被覆すれば、免疫学的ステルス性が付与される。しかしながら、ＰＥＧ結合アスパラギナーゼ、ＰＥＧ結合ウリカーゼによる治療を受けた患者の体内で、ＰＥＧに対する血清抗体が産生されることが報告されている。抗ＰＥＧ抗体が存在すると、投与されたＰＥＧ結合製剤は、速やかに体外へ排出されてしまう（例えば、非特許文献１、２参照）。更に、ＰＥＧ結合製剤による治療を受けたことがない患者も、２５％以上の割合で抗ＰＥＧ抗体を保有しているという報告がある（例えば、非特許文献３、４）。これは、市場に出回っている食品、化粧品等の様々な製品にＰＥＧが使用されていることが原因と考えられる。また、ＰＥＧ結合ヘモグロビンを繰り返し投与すると、細胞の空胞化が観測されることも明らかにされている（例えば、非特許文献５）。斯かる状況の下、ＰＥＧに置き換わる生体適合性を有する新しい水溶性高分子の開発に注目が集まっている。
Ｊ．Ｋ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１１０，１０３－１１１．
Ｍ．Ｒ．Ｓｈｅｒｍａｎら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００８，６，５９－６８．
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ヒト用及び動物用の人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液として、容易に入手可能な異種アルブミンからなる製剤を安全に使用することができれば、一般医療はもとより、動物医療にも大きな貢献をもたらすものと考えられる。その一つの方法は、異種アルブミンの表面にＰＥＧを結合して、免疫学的ステルス性を付与することであるが、ＰＥＧ抗体の産生が危惧される。従って、ＰＥＧの代わりに、生体適合性が高く（例えば、腎排泄が無く、腎機能障害や抗原抗体反応等の副作用が無く）、且つ調製（合成）が容易な水溶性高分子を結合したアルブミンからなる人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液の開発が強く望まれている。
本発明は、生体適合性が高く、且つ調製（合成）が容易な水溶性高分子を結合したアルブミン、並びに、それを有効成分とする人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液を提供することを目的とする。
本発明者らは、安全性・有効性に優れた人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液の開発に鋭意研究を重ねた結果、水溶性高分子であるポリオキサゾリンをアルブミンの表面に共有結合したポリオキサゾリン結合アルブミンが、異種動物に投与した場合も、免疫学的に不活性な人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液として作用し、上記目的を達成し得ることを見出した。
前記ポリオキサゾリンは、生体適合性が高く、且つ非免疫原性の疑似ポリペプチド構造からなる非イオン性の（電荷を持たない）水溶性高分子である。また、ＰＥＧの好ましい特性を多く示しながら、その欠点のいくつかを回避できる。ポリオキサゾリンの特筆すべき特徴を列挙すると次の通りである（カッコ内はＰＥＧの欠点）。（Ｉ）オキサゾリンの開環重合により容易に合成でき、様々な側鎖置換誘導体の調製も容易（ＰＥＧは重合が困難で、側鎖がない）、（ＩＩ）過酸化物を生成しない（ＰＥＧは過酸化物を生成する）、（ＩＩＩ）低粘度（ＰＥＧは高濃度で高粘度）、（ＩＶ）室温で安定（ＰＥＧは低温で安定であるが、室温では不安定）、（Ｖ）体内で分解し容易に除去される（ＰＥＧは蓄積する可能性あり）。本発明者らは、アルブミンを修飾する化合物として、ポリオキサゾリンが、ＰＥＧの代替材料になり得ることを見出した。
即ち、本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンは、コアとしてのアルブミンと、前記アルブミンに架橋剤を介して共有結合されたシェルとしてのポリオキサゾリンと、を有することを特徴とする。
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位が、リシン、タンパク質末端の１級アミン、又はシステインであることが望ましい。
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位が、下記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基であることが望ましい。
［一般式（１）中、Ｒ１は炭素数１～８の炭化水素基を表し、Ｒ２は、ヒドロキシル基、アミノ基、又は－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨを表し、ｎは反復単量体単位の数を表す。］
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（１）を含むことが望ましい。
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、マレイミド基導入剤に由来する構造を含むことが望ましい。
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記マレイミド基導入剤が、下記一般式（２）又は下記一般式（３）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種を含むことが望ましい。
［一般式（２）中、Ｒ２は水素原子又はＳＯ３
－Ｎａ＋を表し、Ｒ１は下記一般式（４）、下記一般式（５）又は下記化学式（１）、下記化学式（２）のいずれかを表す。また、一般式（３）中、Ｒ３は下記一般式（４）を表し、Ｒ４はＯＨ又はＣｌを表す。］
［一般式（４）中、ｎは１～１０の整数を表す。］
［一般式（５）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。］
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（２）を含むことが望ましい。
［構造（２）中、Ｒ１は、下記一般式（４）、下記一般式（５）又は下記化学式（１）、下記化学式（２）のいずれかを表す。］
［一般式（４）中、ｎは１～１０の整数を表す。］
［一般式（５）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。］
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、チオール基導入剤に由来する構造を更に含み、前記チオール基導入剤が、下記化学式（３）、下記一般式（６）、又は下記一般式（７）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物であることが望ましい。
［一般式（６）中、ｎは１～１０の整数を表す。］
［一般式（７）中、Ｒ１はＯＨ又はＣｌを表し、ｎ、ｍは、１～１０の整数を表す。］
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（３）又は構造（４）を含むことが望ましい。
［構造（３）、（４）中、ｍは１～１０の整数を表す。］
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンにおいて、前記ポリオキサゾリンは、重量平均分子量が５００～１００，０００ダルトンであることが望ましい。
また、本発明の人工血漿増量剤は、前記ポリオキサゾリン結合アルブミンを含むことを特徴とする。
また、本発明の出血ショックの蘇生液は、前記ポリオキサゾリン結合アルブミンを含むことを特徴とする。
本発明によれば、生体適合性が高く、且つ調製（合成）が容易である、新規なポリオキサゾリン結合アルブミン、人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液を提供することができる。
以下、本発明の実施の形態について、必要に応じて図面を参照して、具体的に例示説明する。
＜ポリオキサゾリン結合アルブミン＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、少なくともコアとしてのアルブミンと、シェルとしてのポリオキサゾリンとを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。前記アルブミンと前記ポリオキサゾリンとは、架橋剤を介して共有結合している。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、少なくともコアとしてのアルブミンと、シェルとしてのポリオキサゾリンとを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。前記アルブミンと前記ポリオキサゾリンとは、架橋剤を介して共有結合している。
例えば、図１に示すように、本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミン１００は、コアとしてのアルブミン１０と、シェルとしての６個のポリオキサゾリン２０とを有していてよい。図１において、アルブミン１０とポリオキサゾリン２０とは、架橋剤を介して共有結合されている。
［アルブミン］
前記アルブミンは、単純タンパク質であり、分子量が約６６５００ダルトンである。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、アルブミンに架橋剤を介してポリオキサゾリンが結合していればよい。
前記アルブミンは、単純タンパク質であり、分子量が約６６５００ダルトンである。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、アルブミンに架橋剤を介してポリオキサゾリンが結合していればよい。
前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒトを含む脊椎動物由来の血清から精製したもの等を使用できる。前記アルブミンとしては、ヒトアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、ウマアルブミン、イヌアルブミン、ネコアルブミン、組換えアルブミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ブタアルブミン、ウシアルブミンが、原料確保の点で好ましい。また、ＳＰＦ（特定病原体フリー）ブタ由来アルブミンが、安全性の観点から、特に好ましい。また、前記組換えアルブミンは、タンパク質合成（培養）により容易に製造することができる。
－ヒトアルブミン－
前記ヒトアルブミンとしては、ヒト由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ヒトアルブミンとしては、ヒト由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－ブタアルブミン－
前記ブタアルブミンとしては、ブタ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、ＳＰＦブタ由来アルブミンとしては、ＳＰＦブタ由来の血清から精製したもの等が挙げられる。
前記ブタアルブミンとしては、ブタ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、ＳＰＦブタ由来アルブミンとしては、ＳＰＦブタ由来の血清から精製したもの等が挙げられる。
－ウシアルブミン－
前記ウシアルブミンとしては、ウシ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ウシアルブミンとしては、ウシ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－ウマアルブミン－
前記ウマアルブミンとしては、ウマ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ウマアルブミンとしては、ウマ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－イヌアルブミン－
前記イヌアルブミンとしては、イヌ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記イヌアルブミンとしては、イヌ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－ネコアルブミン－
前記ネコアルブミンとしては、ネコ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる
前記ネコアルブミンとしては、ネコ由来の血清から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる
－組換えアルブミン－
前記組換えアルブミンとしては、通常の遺伝子組換え操作、培養操作等により産生したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記組換えアルブミンとしては、通常の遺伝子組換え操作、培養操作等により産生したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
［架橋剤］
前記架橋剤としては、例えば、マレイミド基導入剤を含む架橋剤、チオール基導入剤を含む架橋剤等が挙げられ、具体的には、マレイミド基導入剤、チオール基導入剤等が挙げられる。前記架橋剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記架橋剤としては、例えば、マレイミド基導入剤を含む架橋剤、チオール基導入剤を含む架橋剤等が挙げられ、具体的には、マレイミド基導入剤、チオール基導入剤等が挙げられる。前記架橋剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
（マレイミド基導入剤）
前記マレイミド基導入剤としては、アルブミン又はポリオキサゾリンにマレイミド基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、マレイミド基を有する化合物が好ましく、反応効率の観点から、下記一般式（２）等の、一方の末端がスクシンイミジル基であり他方の末端がマレイミド基である二官能性の化合物、及び下記一般式（３）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
前記マレイミド基導入剤としては、アルブミン又はポリオキサゾリンにマレイミド基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、マレイミド基を有する化合物が好ましく、反応効率の観点から、下記一般式（２）等の、一方の末端がスクシンイミジル基であり他方の末端がマレイミド基である二官能性の化合物、及び下記一般式（３）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
一般式（２）中、Ｒ２は水素原子又はＳＯ３
－Ｎａ＋のいずれかを表し、Ｒ１は下記一般式（４）、下記一般式（５）又は下記化学式（１）、下記化学式（２）のいずれかを表す。
また、一般式（３）中、Ｒ３は下記一般式（４）を表し、Ｒ４はＯＨ又はＣｌを表す。
また、一般式（３）中、Ｒ３は下記一般式（４）を表し、Ｒ４はＯＨ又はＣｌを表す。
Ｒ４がＯＨである上記一般式（３）で表される化合物を用いてマレイミド基を導入する場合は、縮合剤と共に用いて、アルブミン又はポリオキサゾリンのＮＨ２末端又はＯＨ末端にマレイミド基を導入することが好ましい。縮合剤の例としては、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等が好ましい。また、Ｒ４がＯＨである上記一般式（３）で表される化合物は、例えば、塩化チオニル、塩化オキサリル等の化合物と反応させて、Ｒ４のＯＨをＣｌに変換してから用いてもよい。
上記マレイミド基導入剤としては、アルブミンのリシン残基のＮＨ２基、タンパク質末端の１級アミンのＮＨ２基、及びポリオキサゾリンの末端ＮＨ２基へのマレイミド基の導入には、上記一般式（２）又は上記一般式（３）で表される化合物が好ましく、ポリオキサゾリンの末端ＯＨ基へのマレイミド基の導入には上記一般式（３）で表される化合物が好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
例えば、前記マレイミド基導入剤におけるスクシンイミジル基と、アルブミンにおけるリシン残基のアミノ基（ＮＨ２基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）とを反応させることで、リシン残基のアミノ基（－ＮＨ２）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）にマレイミド基を導入することができる。
前記マレイミド基を導入するための方法としては、例えば、アルブミンとマレイミド基導入剤を０℃～３０℃で０．５時間～１０時間攪拌すること、等が挙げられる。
（チオール基導入剤）
前記チオール基導入剤としては、アルブミン又はポリオキサゾリンにチオール基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。反応効率の観点から、下記化学式（３）（２－イミノチオラン塩酸塩）、下記一般式（６）又は下記一般式（７）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
前記チオール基導入剤としては、アルブミン又はポリオキサゾリンにチオール基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。反応効率の観点から、下記化学式（３）（２－イミノチオラン塩酸塩）、下記一般式（６）又は下記一般式（７）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
Ｒ１がＯＨである上記一般式（７）で表される化合物を用いてチオール基を導入する場合は、縮合剤と共に用いて、アルブミン又はポリオキサゾリンのＮＨ２末端又はＯＨ末端にチオール基を導入することが好ましい。縮合剤の例としては、Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等が好ましい。また、Ｒ１がＯＨである上記一般式（７）で表される化合物は、例えば、塩化チオニル、塩化オキサリル等の化合物と反応させて、Ｒ１のＯＨをＣｌに変換してから用いてもよい。
上記チオール基導入剤としては、アルブミンのリシン残基のＮＨ２基、タンパク質末端の１級アミンのＮＨ２基、及びポリオキサゾリンの末端ＮＨ２基へのチオール基の導入には、上記化学式（３）、上記一般式（６）又は上記一般式（７）で表される化合物が好ましく、ポリオキサゾリンの末端ＯＨ基へのチオール基の導入には、上記一般式（７）で表される化合物が好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
［ポリオキサゾリン］
前記ポリオキサゾリンは、生体適合性が高く、且つ非免疫原性の疑似ポリペプチド構造からなる非イオン性の水溶性高分子である。ポリオキサゾリンは、大量合成が可能で、様々な官能基を導入でき、動物に安全に用いることができる。ポリオキサゾリンは、ＰＥＧが持つ優れた性質を多く示しながら、その欠点のいくつかを回避できる。更に、ポリオキサゾリンは、体内の組織に蓄積することなく、腎臓から排出される。
上記ポリオキサゾリンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ポリオキサゾリンは、生体適合性が高く、且つ非免疫原性の疑似ポリペプチド構造からなる非イオン性の水溶性高分子である。ポリオキサゾリンは、大量合成が可能で、様々な官能基を導入でき、動物に安全に用いることができる。ポリオキサゾリンは、ＰＥＧが持つ優れた性質を多く示しながら、その欠点のいくつかを回避できる。更に、ポリオキサゾリンは、体内の組織に蓄積することなく、腎臓から排出される。
上記ポリオキサゾリンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ポリオキサゾリンとしては、下記一般式（１）で表される化合物等が挙げられる。
一般式（１）中、Ｒ１は炭素数１～８の炭化水素基を表し、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基である。Ｒ２は、ヒドロキシル基、アミノ基、又は－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨを表す。ｎは反復単量体単位の数を表す。
ここで、前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位は、上記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基であることが望ましい。
前記ポリオキサゾリンは、ホモ重合体であってもよいし、ヘテロ重合体であってもよい。
ここで、前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位は、上記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基であることが望ましい。
前記ポリオキサゾリンは、ホモ重合体であってもよいし、ヘテロ重合体であってもよい。
前記ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００～１００，０００ダルトンが好ましい。
＜ポリオキサゾリン結合アルブミンの製造方法＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンの製造方法としては、前記アルブミン由来のアルブミン誘導体、及び前記ポリオキサゾリン由来のポリオキサゾリン誘導体を少なくとも用いて反応させる方法等が挙げられる。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンの製造方法としては、前記アルブミン由来のアルブミン誘導体、及び前記ポリオキサゾリン由来のポリオキサゾリン誘導体を少なくとも用いて反応させる方法等が挙げられる。
（アルブミン誘導体）
前記アルブミン誘導体は、マレイミド基導入アルブミン、チオール基導入アルブミン、非修飾アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。
前記アルブミン誘導体は、マレイミド基導入アルブミン、チオール基導入アルブミン、非修飾アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。
中でも、ポリオキサゾリン誘導体として末端チオール基ポリオキサゾリンを用いる場合、アルブミン誘導体はマレイミド基導入アルブミンを用いることが望ましい。
前記マレイミド基導入アルブミンは、アルブミンのリシン残基（ＮＨ２基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）に上記マレイミド基導入剤（例えば、前記一般式（２）で表される化合物）が結合して得られたマレイミド基導入アルブミンであることが望ましい。前記マレイミド基導入アルブミンは、例えば、アルブミン及びマレイミド基導入剤を、０℃～３０℃で０．５時間～１０時間攪拌する方法等により得ることができる。
前記マレイミド基導入アルブミンは、アルブミンのリシン残基（ＮＨ２基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）に上記マレイミド基導入剤（例えば、前記一般式（２）で表される化合物）が結合して得られたマレイミド基導入アルブミンであることが望ましい。前記マレイミド基導入アルブミンは、例えば、アルブミン及びマレイミド基導入剤を、０℃～３０℃で０．５時間～１０時間攪拌する方法等により得ることができる。
また、ポリオキサゾリン誘導体として末端マレイミド基ポリオキサゾリンを用いる場合、アルブミン誘導体はチオール基導入アルブミン又は非修飾アルブミンを用いることが望ましい。
前記チオール基導入アルブミンは、アルブミンのリシン残基のアミノ基（ＮＨ２基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）に上記チオール基導入剤（例えば、２－イミノチオラン塩酸塩）が結合して得られたチオール基導入アルブミンであることが望ましい。前記チオール基導入アルブミンは、例えば、アルブミン及び２－イミノチオラン塩酸塩等のチオール基導入剤を、０℃～３０℃で０．５時間～１０時間攪拌する方法等により得ることができる。
非修飾アルブミンとしては、還元剤で処理したアルブミンを用いてもよい。
前記チオール基導入アルブミンは、アルブミンのリシン残基のアミノ基（ＮＨ２基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ２基）に上記チオール基導入剤（例えば、２－イミノチオラン塩酸塩）が結合して得られたチオール基導入アルブミンであることが望ましい。前記チオール基導入アルブミンは、例えば、アルブミン及び２－イミノチオラン塩酸塩等のチオール基導入剤を、０℃～３０℃で０．５時間～１０時間攪拌する方法等により得ることができる。
非修飾アルブミンとしては、還元剤で処理したアルブミンを用いてもよい。
（ポリオキサゾリン誘導体）
前記ポリオキサゾリン誘導体は、末端チオール基ポリオキサゾリン、末端マレイミド基ポリオキサゾリンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましく、下記一般式（８）～（１３）で表される化合物から選択される少なくとも１種であることがより望ましい。
中でも、アルブミン誘導体がマレイミド基導入アルブミンである場合、末端チオール基ポリオキサゾリンが望ましく、アルブミン誘導体がチオール基導入アルブミン又は非修飾アルブミンである場合、末端マレイミド基ポリオキサゾリンが望ましい。
前記ポリオキサゾリン誘導体は、例えば、化合物（例えば、末端にチオール基を有する化合物、末端にマレイミド基を有する化合物等）に、ポリオキサゾリンを導入する際の架橋剤として用いることができる。
前記ポリオキサゾリン誘導体は、末端チオール基ポリオキサゾリン、末端マレイミド基ポリオキサゾリンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましく、下記一般式（８）～（１３）で表される化合物から選択される少なくとも１種であることがより望ましい。
中でも、アルブミン誘導体がマレイミド基導入アルブミンである場合、末端チオール基ポリオキサゾリンが望ましく、アルブミン誘導体がチオール基導入アルブミン又は非修飾アルブミンである場合、末端マレイミド基ポリオキサゾリンが望ましい。
前記ポリオキサゾリン誘導体は、例えば、化合物（例えば、末端にチオール基を有する化合物、末端にマレイミド基を有する化合物等）に、ポリオキサゾリンを導入する際の架橋剤として用いることができる。
－末端チオール基ポリオキサゾリン－
前記末端チオール基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（８）～（１０）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端チオール基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００～１００，０００ダルトンが好ましい。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（８）～（１０）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端チオール基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００～１００，０００ダルトンが好ましい。
前記末端チオール基ポリオキサゾリン中の繰り返し単位の各構造は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンは、末端にマレイミド基を有する化合物（例えば、マレイミド基修飾をしたタンパク質等）にポリオキサゾリンを付加する架橋剤として用いることができる。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンは、例えば、ポリオキサゾリンと、上記一般式（７）の化合物等のチオール基導入剤とを反応（例えば、２５℃で１時間～９６時間撹拌する反応等）させることにより得ることができる。混合比としては、ポリオキサゾリン１モルに対して、上記一般式（７）の化合物等のチオール基導入剤２～２０モルの割合としてよい。反応後に、還元剤で処理をしたり、遠心分離、フィルターろ過、ゲルろ過等による精製を行ったりしてもよい。
得られる末端チオール基ポリオキサゾリンは、１Ｈ－ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
得られる末端チオール基ポリオキサゾリンは、１Ｈ－ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
－末端マレイミド基ポリオキサゾリン－
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１１）～（１３）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００～１００，０００ダルトンが好ましい。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１１）～（１３）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００～１００，０００ダルトンが好ましい。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリン中の繰り返し単位の各構造は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、末端にＳＨ基を有する化合物（例えば、タンパク質中のシステイン残基、チオール基修飾をしたタンパク質等）にポリオキサゾリンを付加する架橋剤として用いることができる。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、例えば、ポリオキサゾリンと、上記一般式（３）の化合物等のマレイミド基導入剤とを反応（例えば、Ｒ４がＣｌの場合はそのまま、ＯＨの場合は縮合剤を入れて２５℃で１時間～９６時間撹拌する反応等）させることにより得ることができる。混合比としては、ポリオキサゾリン１モルに対して、上記一般式（３）の化合物等のマレイミド基導入剤２～２０モルの割合としてよい。反応後に、遠心分離、フィルターろ過、ゲルろ過等により精製してもよい。
得られる末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、１Ｈ－ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
得られる末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、１Ｈ－ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
前記一般式（８）～（１３）においては、いずれもＲ１がメチル基であるものは、ＰＥＧよりも高い水溶性を示す傾向にあり、Ｒ１がプロピル基であるものは、加熱により水への溶解度が下がる傾向にある。そのため、いずれも、Ｒ１がエチル基であるものが、親疎水性のバランスが取れているという点で好ましい。
前記一般式（８）～（１３）においては、いずれも、ｍが、化学的な安定性が高く、最小の２であるものが好ましい。
前記ポリオキサゾリン結合アルブミンの製造方法としては、より具体的には、例えば以下の（ａ）～（ｃ）の方法等が挙げられる。
－ポリオキサゾリン結合アルブミンの製造例（ａ）－
前記末端チオール基ポリオキサゾリンと、前記マレイミド基導入アルブミンとを反応させることにより、前記末端チオール基ポリオキサゾリンにおけるチオール基が、マレイミド基導入アルブミンのマレイミド基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、マレイミド基導入アルブミンと末端チオール基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンと、前記マレイミド基導入アルブミンとを反応させることにより、前記末端チオール基ポリオキサゾリンにおけるチオール基が、マレイミド基導入アルブミンのマレイミド基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、マレイミド基導入アルブミンと末端チオール基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
－ポリオキサゾリン結合アルブミンの製造例（ｂ）－
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記チオール基導入アルブミンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、チオール基導入アルブミンのチオール基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、チオール基導入アルブミンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記チオール基導入アルブミンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、チオール基導入アルブミンのチオール基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、チオール基導入アルブミンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
－ポリオキサゾリン結合アルブミンの製造例（ｃ）－
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記非修飾アルブミンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、非修飾アルブミンのシステインと共有結合を形成する。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、非修飾アルブミンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記非修飾アルブミンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、非修飾アルブミンのシステインと共有結合を形成する。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、非修飾アルブミンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを０℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、等が挙げられる。
＜ポリオキサゾリン結合アルブミンの特徴＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンやタンパク質末端の１級アミン、又はシステインであることが望ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位が、上記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基であることが望ましい。
前記マレイミド基導入アルブミンにおける前記末端チオール基ポリオキサゾリンとの結合部位は、導入したマレイミド基であることが望ましい。前記チオール基導入アルブミンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位は、導入したチオール基であることが望ましい。前記非修飾アルブミンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位は、システイン残基であることが望ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンやタンパク質末端の１級アミン、又はシステインであることが望ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位が、上記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基であることが望ましい。
前記マレイミド基導入アルブミンにおける前記末端チオール基ポリオキサゾリンとの結合部位は、導入したマレイミド基であることが望ましい。前記チオール基導入アルブミンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位は、導入したチオール基であることが望ましい。前記非修飾アルブミンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位は、システイン残基であることが望ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、前記架橋剤を介した結合が、マレイミド基導入剤及び／又はチオール基導入剤に由来する構造を含むことが好ましく、マレイミド基導入剤とチオール基導入剤とのみに由来する構造であることがより好ましい。
上記架橋剤を介した結合は、以下の構造（１）：
を含むことが好ましく、以下の構造（２）、構造（３）又は構造（４）：
［構造（２）中、Ｒ１は、上述の一般式（４）、一般式（５）又は上述の化学式（１）、化学式（２）のいずれかを表す。］
［構造（３）、（４）中、ｍは１～１０の整数を表す。］
の構造を有することがより好ましく、以下の構造（５）又は構造（６）：
［構造（５）、構造（６）中、Ｒ１は、上述の一般式（４）、一般式（５）又は上述の化学式（１）、化学式（２）のいずれかを表し、ｍは１～１０の整数を表す。］
の構造を有することが更に好ましい。
上記架橋剤を介した結合は、以下の構造（１）：
の構造を有することがより好ましく、以下の構造（５）又は構造（６）：
の構造を有することが更に好ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、合成等が容易であるにもかかわらず、三次元構造は明確である。ポリオキサゾリン結合アルブミンの平均粒径は、８～３０ｎｍが好ましく、１０～２０ｎｍがより好ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンのコアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数としては、１～１０本が好ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンにおける、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数の測定方法としては、ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定する方法が挙げられる。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンにおける、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数の測定方法としては、ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定する方法が挙げられる。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、非修飾アルブミンに比べ、膠質浸透圧が高く、生体に投与した場合、同濃度の非修飾アルブミンよりも循環血液量の維持に効果を発揮する。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、コアアルブミンの周囲が、ポリオキサゾリンで覆われているため、異種動物に投与した場合も免疫原性を発現しない。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、血液と混合した場合でも沈殿及び凝集は惹起せず、血液適合性が高い。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、生体内に投与した場合、腎排泄、血管内皮細胞からの漏出がないため、非修飾アルブミンに比べて血中滞留時間が長い。また、ポリオキサゾリンは、水溶性が高く、代謝に優れる。
本実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンは、出血ショック状態の生体に投与した場合、循環血液量を回復させ、血圧の改善をもたらす。
以上より、本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンは、生体適合性（安全性）と有効性を併せ持った類例のない人工血漿増量剤及び出血ショックの蘇生液として機能し得る。
＜人工血漿増量剤＞
本実施形態の人工血漿増量剤は、上記実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンを含む。なお、前記人工血漿増量剤とは、膠質浸透圧を有する物質であり、生体に投与した場合には、その動物が持つアルブミンの代替物として機能するものである。
上記人工血漿増量剤は、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウサギ等の脊椎動物のアルブミンの代替物として用いることができる。
本実施形態の人工血漿増量剤は、上記実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンを含む。なお、前記人工血漿増量剤とは、膠質浸透圧を有する物質であり、生体に投与した場合には、その動物が持つアルブミンの代替物として機能するものである。
上記人工血漿増量剤は、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウサギ等の脊椎動物のアルブミンの代替物として用いることができる。
＜出血ショックの蘇生液＞
本実施形態の出血ショックの蘇生液は、上記実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンを含む。なお、前記出血ショックの蘇生液とは、膠質浸透圧を有する物質であり、生体に投与した場合には、その動物が持つアルブミンの代替物として機能するものである。
上記出血ショックの蘇生液は、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウサギ等の脊椎動物のアルブミンの代替物として用いることができる。
本実施形態の出血ショックの蘇生液は、上記実施形態のポリオキサゾリン結合アルブミンを含む。なお、前記出血ショックの蘇生液とは、膠質浸透圧を有する物質であり、生体に投与した場合には、その動物が持つアルブミンの代替物として機能するものである。
上記出血ショックの蘇生液は、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ウサギ等の脊椎動物のアルブミンの代替物として用いることができる。
以下、本発明について、実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
－調製例１：マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の調製－
ブタアルブミン（ＰＳＡ）にマレイミド基を導入するために、以下の操作を行った。
サンプル瓶（８ｍＬ容量）にＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）１１９．８ｍｇを入れ、ジメチルスルホキシド３ｍＬで溶解し、０．１５ＭのＳＭＰ溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（１００ｍＬ容量）にブタアルブミン（１ｍＭ）３０ｍＬを入れ、ＳＭＰ溶液を３ｍＬ（Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート／アルブミン（ＳＭＰ／ＰＳＡ）＝１５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、２５℃で１時間撹拌した。フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過した後、その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰のＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネートを除去した。
得られた溶液にＰＢＳを加え、９０ｍＬに定容した。
－調製例１：マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の調製－
ブタアルブミン（ＰＳＡ）にマレイミド基を導入するために、以下の操作を行った。
サンプル瓶（８ｍＬ容量）にＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）１１９．８ｍｇを入れ、ジメチルスルホキシド３ｍＬで溶解し、０．１５ＭのＳＭＰ溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（１００ｍＬ容量）にブタアルブミン（１ｍＭ）３０ｍＬを入れ、ＳＭＰ溶液を３ｍＬ（Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート／アルブミン（ＳＭＰ／ＰＳＡ）＝１５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、２５℃で１時間撹拌した。フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過した後、その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰のＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネートを除去した。
得られた溶液にＰＢＳを加え、９０ｍＬに定容した。
－調製例２：末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の調製－
末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
化学反応式（１）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
３口ナスフラスコ（３００ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）５ｇ、３，３’－ジチオジプロピオン酸（３，３’－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）（ＤＴＤＰＡ、東京化成工業社）１．２６ｇ、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ、東京化成工業社）１．２６ｇ及び４－ジメチルアミノピリジン（４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（ＤＭＡＰ、東京化成工業社）１６０ｍｇを入れ、窒素通気を行った後、テトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬社）６０ｍＬを加え、２５℃で７２時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、真空ポンプを用いて白色の固体を乾燥した。そこに純水５０ｍＬを加え、遠心分離で沈殿物を除去した。５Ｍ ＮａＯＨ溶液（富士フイルム和光純薬社）を用いてｐＨを７に調整後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）１．８５ｇを加え、窒素を５分間通気した後、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）＝１２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。溶液をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、透析膜（分画分子量３５００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて透析を行い、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量した。４，４’－ジチオピリジン（４，４’－Ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（４，４’－ＤＴＰ）は、遊離チオール（ＳＨ）基と反応し、４－チオピリジノン（４－Ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ）（４－ＴＰ）を生じるので、チオール基導入ポリオキサゾリンに４，４’－ジチオピリジン（４，４’－ＤＴＰ）を加え、生成した４－チオピリジノン（４－ＴＰ）の量を測ることにより、チオール基の量が定量できる。得られた濃度から、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９６％であった。
末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
３口ナスフラスコ（３００ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）５ｇ、３，３’－ジチオジプロピオン酸（３，３’－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）（ＤＴＤＰＡ、東京化成工業社）１．２６ｇ、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ、東京化成工業社）１．２６ｇ及び４－ジメチルアミノピリジン（４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（ＤＭＡＰ、東京化成工業社）１６０ｍｇを入れ、窒素通気を行った後、テトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬社）６０ｍＬを加え、２５℃で７２時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、真空ポンプを用いて白色の固体を乾燥した。そこに純水５０ｍＬを加え、遠心分離で沈殿物を除去した。５Ｍ ＮａＯＨ溶液（富士フイルム和光純薬社）を用いてｐＨを７に調整後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）１．８５ｇを加え、窒素を５分間通気した後、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）＝１２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。溶液をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、透析膜（分画分子量３５００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて透析を行い、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量した。４，４’－ジチオピリジン（４，４’－Ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（４，４’－ＤＴＰ）は、遊離チオール（ＳＨ）基と反応し、４－チオピリジノン（４－Ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ）（４－ＴＰ）を生じるので、チオール基導入ポリオキサゾリンに４，４’－ジチオピリジン（４，４’－ＤＴＰ）を加え、生成した４－チオピリジノン（４－ＴＰ）の量を測ることにより、チオール基の量が定量できる。得られた濃度から、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９６％であった。
－調製例３：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の調製－
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（３００ｍＬ容量）に調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）９０ｍＬを入れ、調製例２で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）のＰＢＳ溶液（３．７５ｍＭ）６０ｍＬを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝７．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（３００ｍＬ容量）に調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）９０ｍＬを入れ、調製例２で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）のＰＢＳ溶液（３．７５ｍＭ）６０ｍＬを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝７．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例２）
－調製例１：末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）の調製－
末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
化学反応式（２）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（１００ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）２００ｍｇ、及びＮ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ、東京化成工業社）１２４ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート／ポリオキサゾリン（ＳＰＤＰ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）２０ｍＬを加え、２５℃で１５時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水１２ｍＬ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）１２４ｍｇを加え、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、ＰＤ－１０）にかけ、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９５％であった。
－調製例１：末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）の調製－
末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
２口ナスフラスコ（１００ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）２００ｍｇ、及びＮ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ、東京化成工業社）１２４ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート／ポリオキサゾリン（ＳＰＤＰ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）２０ｍＬを加え、２５℃で１５時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水１２ｍＬ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）１２４ｍｇを加え、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、ＰＤ－１０）にかけ、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９５％であった。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＭ－ＰＳＡ）の調製－
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（３０ｍＬ容量）に実施例１における調製例１で得たマレイミド基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）９．０ｍＬを入れ、実施例２における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）のＰＢＳ溶液（３．７５ｍＭ）６．０ｍＬを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝７．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（３０ｍＬ容量）に実施例１における調製例１で得たマレイミド基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）９．０ｍＬを入れ、実施例２における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ）のＰＢＳ溶液（３．７５ｍＭ）６．０ｍＬを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝７．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例３）
－調製例１：末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）の調製－
実施例１における調製例２で、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）の代わりに、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ＯＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例２と同様な方法に従って、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を調製した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９５％であった。
－調製例１：末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）の調製－
実施例１における調製例２で、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）の代わりに、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ＯＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例２と同様な方法に従って、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を調製した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）のチオール基の導入率を算出したところ、約９５％であった。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例４）
－調製例１：マレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ヒトアルブミンを用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を調製した。
－調製例１：マレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ヒトアルブミンを用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を調製した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例４における調製例１で得たマレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例４における調製例１で得たマレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
（実施例５）
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例４における調製例１で得たマレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例４における調製例１で得たマレイミド基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
（実施例６）
－調製例１：マレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ウシアルブミンを用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を調製した。
－調製例１：マレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ウシアルブミンを用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を調製した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＢＳＡであった。
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＢＳＡであった。
（実施例７）
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＢＳＡであった。
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ウシアルブミン（ＢＳＡ－Ｍ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＢＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＢＳＡであった。
（実施例８）
－調製例１：マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）の調製－
実施例１における調製例１で、Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）の代わりにＮ－スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、富士フイルム和光純薬社）を用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を調製した。
－調製例１：マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）の調製－
実施例１における調製例１で、Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）の代わりにＮ－スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、富士フイルム和光純薬社）を用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を調製した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例８における調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
実施例１における調製例３で、マレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例８における調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例９）
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例８における調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１における調製例３で、末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＨ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＨ）を用い、更にマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－Ｍ）の代わりに、実施例８における調製例１で得たマレイミド基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＭＣ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭＣ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例１０）
－調製例１：チオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の調製－
ブタアルブミンにチオール基を導入するために、以下の操作を行った。
マイクロチューブ（１．５ｍＬ容量）に２－イミノチオラン塩酸塩（２－ＩＴ、富士フイルム和光純薬社）１３．８ｍｇを入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍＬで希釈し、０．１Ｍの２－イミノチオラン溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（１０ｍＬ容量）にブタアルブミン（１ｍＭ）１ｍＬを入れ、２－イミノチオラン溶液４００μＬ（２－イミノチオラン／アルブミン（２－ＩＴ／ＰＳＡ）＝４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、２５℃で３時間撹拌した。その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰の２－イミノチオラン（２ＩＴ）を除去した。
得られた溶液２０ｍＬを遠心濃縮器（Ｍｅｒｃｋ社、アミコンウルトラ－１５、限外分子量１０ｋＤａ）に入れ、遠心分離することにより、２．５ｍＬまで濃縮した（０．４ｍＭ）。
－調製例１：チオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の調製－
ブタアルブミンにチオール基を導入するために、以下の操作を行った。
マイクロチューブ（１．５ｍＬ容量）に２－イミノチオラン塩酸塩（２－ＩＴ、富士フイルム和光純薬社）１３．８ｍｇを入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍＬで希釈し、０．１Ｍの２－イミノチオラン溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（１０ｍＬ容量）にブタアルブミン（１ｍＭ）１ｍＬを入れ、２－イミノチオラン溶液４００μＬ（２－イミノチオラン／アルブミン（２－ＩＴ／ＰＳＡ）＝４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、２５℃で３時間撹拌した。その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰の２－イミノチオラン（２ＩＴ）を除去した。
得られた溶液２０ｍＬを遠心濃縮器（Ｍｅｒｃｋ社、アミコンウルトラ－１５、限外分子量１０ｋＤａ）に入れ、遠心分離することにより、２．５ｍＬまで濃縮した（０．４ｍＭ）。
－調製例２：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の調製－
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
化学反応式（３）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）１２０ｍｇ、及び３－マレイミドプロピオン酸（３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に塩化チオニルを反応させて調製した３－マレイミドプロパノイルクロリド（３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＭＰＣ）４５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（３－マレイミドプロパノイルクロリド／ポリオキサゾリン（ＭＰＣ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬ、及びトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社）６６μＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水３ｍＬを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿物を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）を用いて精製した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）１２０ｍｇ、及び３－マレイミドプロピオン酸（３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に塩化チオニルを反応させて調製した３－マレイミドプロパノイルクロリド（３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＭＰＣ）４５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（３－マレイミドプロパノイルクロリド／ポリオキサゾリン（ＭＰＣ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬ、及びトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社）６６μＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水３ｍＬを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿物を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）を用いて精製した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。
－調製例３：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）の調製－
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に調製例１で得たチオール基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－ＳＨ、０．４ｍＭ）６２５μＬを入れ、調製例２で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）１２．５ｍｇを加え、２５℃で１４時間撹拌した（末端マレイミド基ポリオキサゾリン／チオール基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ／ＰＳＡ－ＳＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に調製例１で得たチオール基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－ＳＨ、０．４ｍＭ）６２５μＬを入れ、調製例２で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）１２．５ｍｇを加え、２５℃で１４時間撹拌した（末端マレイミド基ポリオキサゾリン／チオール基導入アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ／ＰＳＡ－ＳＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例１１）
－調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）の調製－
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
化学反応式（４）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）５０ｍｇ、及びＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）２６．５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート／ポリオキサゾリン（ＳＭＰ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水２ｍＬを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿物を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、未反応のＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（ＳＭＰ）を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。
－調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）の調製－
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２、Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）５０ｍｇ、及びＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）２６．５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート／ポリオキサゾリン（ＳＭＰ／ＰＯｘ（５ｋ）－ＮＨ２）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水２ｍＬを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿物を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、未反応のＮ－スクシンイミジル ３－マレイミドプロピオネート（ＳＭＰ）を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、１Ｈ ＮＭＲによって構造を同定した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭＳ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１１における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭＳ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１１における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ａＭＳ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例１２）
－調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）の調製－
実施例１０における調製例２で、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）の代わりに、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ＯＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例２と同様な方法に従って、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を調製した。
－調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）の調製－
実施例１０における調製例２で、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ＯＨ）の代わりに、末端がヒドロキシ基であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ＯＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例２と同様な方法に従って、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を調製した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）の調製－
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１２における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１２における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＰＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＰＳＡであった。
（実施例１３）
－調製例１：チオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１０における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ヒトアルブミンを用いた以外は、実施例１０における調製例１と同様な方法に従って、チオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を調製した。
－調製例１：チオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－Ｍ）の調製－
実施例１０における調製例１で、ブタアルブミンの代わりに、ヒトアルブミンを用いた以外は、実施例１０における調製例１と同様な方法に従って、チオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を調製した。
－調製例２：ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１０における調製例３で、チオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の代わりに、実施例１３における調製例１で得たチオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
実施例１０における調製例３で、チオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の代わりに、実施例１３における調製例１で得たチオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
（実施例１４）
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１２における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を用い、更にチオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の代わりに、実施例１３における調製例１で得たチオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
－調製例１：ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）の調製－
実施例１０における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＭ）の代わりに、実施例１２における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（重量平均分子量１０，０００Ｄａ、ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭ）を用い、更にチオール基導入ブタアルブミン（ＰＳＡ－ＳＨ）の代わりに、実施例１３における調製例１で得たチオール基導入ヒトアルブミン（ＨＳＡ－ＳＨ）を用いた以外は、実施例１０における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＭＳ－ＨＳＡ）を調製した。ポリオキサゾリン結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出したところ、約６本／ＨＳＡであった。
実施例１～１４の要旨を表１に示す。
表１に示すように、種々のアルブミン誘導体とポリオキサゾリン誘導体から、ポリオキサゾリン結合アルブミンを調製できることが分かる。
（実施例１５）
－動的光散乱（ＤＬＳ）測定－
実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定をゼータ電位・粒径・分子量測定システム（大塚電子社、ＥＬＳＺ－２０００）を用いて行った。また、同様にして、非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）の平均粒径は８ｎｍであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の平均粒径は１３ｎｍであった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、分子サイズが増大することが分かった。
－動的光散乱（ＤＬＳ）測定－
実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定をゼータ電位・粒径・分子量測定システム（大塚電子社、ＥＬＳＺ－２０００）を用いて行った。また、同様にして、非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）の平均粒径は８ｎｍであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の平均粒径は１３ｎｍであった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、分子サイズが増大することが分かった。
（実施例１６）
－膠質浸透圧測定－
実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）の膠質浸透圧測定をコロイド浸透圧計（ＯＳＭＯＭＡＴ ０５０、Ｇｏｍｏｔｅｃ社）を用いて行った。また、同様にして、実施例３における調製例２で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）及び非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ、５ｇ／ｄＬ）の膠質浸透圧は１８ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の膠質浸透圧は３６ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の膠質浸透圧は６２ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、膠質浸透圧が増大することが分かった。
－膠質浸透圧測定－
実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）の膠質浸透圧測定をコロイド浸透圧計（ＯＳＭＯＭＡＴ ０５０、Ｇｏｍｏｔｅｃ社）を用いて行った。また、同様にして、実施例３における調製例２で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）及び非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタアルブミン（ＰＳＡ、５ｇ／ｄＬ）の膠質浸透圧は１８ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の膠質浸透圧は３６ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の膠質浸透圧は６２ｍｍＨｇであった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、膠質浸透圧が増大することが分かった。
（実施例１７）
－調製例１：ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の調製－
ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に実施例１における調製例１で得たマレイミド基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）１．７ｍＬを入れ、末端チオール基ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＥＧ（５ｋ）－ＳＨ、日本油脂社）２８ｍｇを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリエチレングリコール／マレイミド基導入アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリエチレングリコールを除去した。ポリエチレングリコール結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリエチレングリコールの結合数を算出したところ、約８本／ＰＳＡであった。
－調製例１：ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ）結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の調製－
ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に実施例１における調製例１で得たマレイミド基導入アルブミン溶液（ＰＳＡ－Ｍ、３３３μＭ）１．７ｍＬを入れ、末端チオール基ポリエチレングリコール（重量平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＥＧ（５ｋ）－ＳＨ、日本油脂社）２８ｍｇを加え、２５℃で２４時間撹拌した（末端チオール基ポリエチレングリコール／マレイミド基導入アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ＳＨ／ＰＳＡ－Ｍ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液を循環型限外ろ過（Ｍｅｒｃｋ社、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ ｃａｓｅｔｔｅ、限外分子量１００ｋＤａ）にかけ、未反応のポリエチレングリコールを除去した。ポリエチレングリコール結合アルブミンの乾燥重量を測定することにより、コアアルブミンに対するポリエチレングリコールの結合数を算出したところ、約８本／ＰＳＡであった。
－ラットを用いた免疫原性試験－
Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約１８０ｇ）の尾静脈からアルブミン（ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）、実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）及び実施例１７における調製例１で得たポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を投与した（２００ｍｇ－ＰＳＡ／ｋｇ－ｒａｔ）。０、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８日後に尾静脈から１００μＬ採血し、遠心分離して得た上清を－８０℃で保存した。２８日後以降に、各上清を間接ＥＬＩＳＡ測定し、ＰＳＡに対するＩｇＭ抗体の産生量を定量した。
アルブミン（ＰＳＡ）投与群では投与４日後をピークとして抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生が観測された。ポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）投与群ではアルブミン（ＰＳＡ）投与群と同程度の抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生が観測された。これに対して、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）投与群での抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生は著しく低かった（図２参照）。ポリオキサゾリン結合が優れた免疫学的ステルス性を示すことが明らかとなった。
Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約１８０ｇ）の尾静脈からアルブミン（ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）、実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）及び実施例１７における調製例１で得たポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を投与した（２００ｍｇ－ＰＳＡ／ｋｇ－ｒａｔ）。０、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８日後に尾静脈から１００μＬ採血し、遠心分離して得た上清を－８０℃で保存した。２８日後以降に、各上清を間接ＥＬＩＳＡ測定し、ＰＳＡに対するＩｇＭ抗体の産生量を定量した。
アルブミン（ＰＳＡ）投与群では投与４日後をピークとして抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生が観測された。ポリエチレングリコール結合アルブミン（ＰＥＧ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）投与群ではアルブミン（ＰＳＡ）投与群と同程度の抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生が観測された。これに対して、ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）投与群での抗ＰＳＡ ＩｇＭ抗体の産生は著しく低かった（図２参照）。ポリオキサゾリン結合が優れた免疫学的ステルス性を示すことが明らかとなった。
（実施例１８）
－血液適合性試験－
ＥＤＴＡ入り真空採血管を用いて、Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）から採血し、転倒攪拌によりＥＤＴＡとよく混和させた。得られたラットの血液と実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液の体積比が０、１０、２０、４０％となるように混合した（全量：６００μＬ）。試料を３７℃の恒温装置内に静置し、０（混合直後）、１、２、３、４、５、６時間後に５０μＬを分取して、多項目血球計数装置（ｐｏｃＨ－１００ｉＶ Ｄｉｆｆ、Ｓｙｓｍｅｘ社）を用いて赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、血小板（ＰＬＴ）数を測定した（ｎ＝３）。
ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液の混合比が１０、２０、４０％のとき、各血球数はポリオキサゾリン結合アルブミン溶液を混合していない血液中の血球数（基準値）の９０、８０、６０％となった（図３参照）。血球数は６時間後まで変化せず、ポリオキサゾリン結合アルブミンの血液適合性は高いことが明らかとなった。
－血液適合性試験－
ＥＤＴＡ入り真空採血管を用いて、Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）から採血し、転倒攪拌によりＥＤＴＡとよく混和させた。得られたラットの血液と実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液の体積比が０、１０、２０、４０％となるように混合した（全量：６００μＬ）。試料を３７℃の恒温装置内に静置し、０（混合直後）、１、２、３、４、５、６時間後に５０μＬを分取して、多項目血球計数装置（ｐｏｃＨ－１００ｉＶ Ｄｉｆｆ、Ｓｙｓｍｅｘ社）を用いて赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、血小板（ＰＬＴ）数を測定した（ｎ＝３）。
ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液の混合比が１０、２０、４０％のとき、各血球数はポリオキサゾリン結合アルブミン溶液を混合していない血液中の血球数（基準値）の９０、８０、６０％となった（図３参照）。血球数は６時間後まで変化せず、ポリオキサゾリン結合アルブミンの血液適合性は高いことが明らかとなった。
（実施例１９）
－ラットにおける血中滞留性測定－
Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（丸石製薬）（５．０％ ｉｎ ａｉｒ）で導入麻酔を行ったＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）をＳｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（３．０～４．０％ ｉｎ ａｉｒ）吸入麻酔下で保温パッド（ＤＣ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、ブレインサイエンス・イデア）上に仰臥位で固定した。右頸静脈にカテーテル（ＳＰ－３１）を３ｃｍほど挿入し、先が右心房へ入るようにした。カテーテルの逆側の末端は皮下を通して背中外皮上に固定した。Ｃｙ５．５で蛍光標識した実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を右頸静脈から投与（５％トップロード）した（投与量は、ラットの循環血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の５％量（１４０ｍｇ／ｋｇ－ｒａｔ）、蛍光標識体：非蛍光標識＝１：９）。投与から３分後を０分とし、０、５、１５、３０分後、１、３、６、１２、１８、２４時間後に右頸静脈から２００μＬ採血し、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、５分）で得た血清成分（１００μＬ）を分取して、冷蔵・遮光保存した。血清成分２０μＬとＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢ溶液１２μＬ、ＰＢＳ溶液２８μＬを混合し（血清成分：３倍希釈、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：１％（ｗ／ｖ））、冷蔵・遮光下で一晩静置した。この溶液を３ｍｍミクロ石英セル（最小試料容量：５０μＬ）に入れ、蛍光分光光度計（ＪＡＳＣＯ ＦＰ－８３００）を用いてＣｙ５．５で蛍光標識したポリオキサゾリン結合アルブミンの蛍光スペクトルを測定した。０分に採血した血清の７１０ｎｍの蛍光強度を１００％とし、蛍光強度の減少度からポリオキサゾリン結合アルブミンの血中消失半減期（ｔ１／２）を算出した。また、同様にして、実施例３における調製例２で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）及び非修飾ブタ血清アルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタ血清アルブミン（ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は７．３時間であった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は１５．３時間であった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は２１．５時間であった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、血中消失半減期（ｔ１／２）が延長することが分かった。
－ラットにおける血中滞留性測定－
Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（丸石製薬）（５．０％ ｉｎ ａｉｒ）で導入麻酔を行ったＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）をＳｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（３．０～４．０％ ｉｎ ａｉｒ）吸入麻酔下で保温パッド（ＤＣ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、ブレインサイエンス・イデア）上に仰臥位で固定した。右頸静脈にカテーテル（ＳＰ－３１）を３ｃｍほど挿入し、先が右心房へ入るようにした。カテーテルの逆側の末端は皮下を通して背中外皮上に固定した。Ｃｙ５．５で蛍光標識した実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）を右頸静脈から投与（５％トップロード）した（投与量は、ラットの循環血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の５％量（１４０ｍｇ／ｋｇ－ｒａｔ）、蛍光標識体：非蛍光標識＝１：９）。投与から３分後を０分とし、０、５、１５、３０分後、１、３、６、１２、１８、２４時間後に右頸静脈から２００μＬ採血し、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、５分）で得た血清成分（１００μＬ）を分取して、冷蔵・遮光保存した。血清成分２０μＬとＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢ溶液１２μＬ、ＰＢＳ溶液２８μＬを混合し（血清成分：３倍希釈、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：１％（ｗ／ｖ））、冷蔵・遮光下で一晩静置した。この溶液を３ｍｍミクロ石英セル（最小試料容量：５０μＬ）に入れ、蛍光分光光度計（ＪＡＳＣＯ ＦＰ－８３００）を用いてＣｙ５．５で蛍光標識したポリオキサゾリン結合アルブミンの蛍光スペクトルを測定した。０分に採血した血清の７１０ｎｍの蛍光強度を１００％とし、蛍光強度の減少度からポリオキサゾリン結合アルブミンの血中消失半減期（ｔ１／２）を算出した。また、同様にして、実施例３における調製例２で得たポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）及び非修飾ブタ血清アルブミン（ＰＳＡ）についても試験した。
非修飾ブタ血清アルブミン（ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は７．３時間であった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は１５．３時間であった。ポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（１０ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）の血中消失半減期（ｔ１／２）は２１．５時間であった。ポリオキサゾリンがアルブミンに結合することで、血中消失半減期（ｔ１／２）が延長することが分かった。
（実施例２０）
－ラット５０％出血性ショックモデルによる有効性評価－
Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（丸石製薬）（５．０％ ｉｎ ａｉｒ）で導入麻酔を行ったＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）をＳｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（３．０％ ｉｎ ａｉｒ）吸入麻酔下で保温パッド（ＤＣ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、ブレインサイエンス・イデア）上に仰臥位で固定した。右頸動脈に血圧測定および脱血用にカテーテル（ＳＰ－３１、内径：０．５ｍｍ、外径：０．８ｍｍ、夏目製作所）を中枢側に向かって挿入し、逆側の末端を血圧測定装置（ＰＡＳ－１０１、スターメディカル）に接続した。また、右頸静脈に試料投与用に同カテーテルを挿入した。気管カニューレを行い、人工呼吸器を用いて呼吸管理を行った。動脈カテーテルより全血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の５０％を脱血することで（１ｍＬ／ｍｉｎ）、出血性ショック状態を作成した。１５分後に静脈カテーテルより、実施例１における調製例３で調製したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）（ｎ＝６）及びヒドロキシエチルスターチ水溶液（大塚製薬株式会社、ボルベン輸液６％）（ｎ＝６）を投与（１ｍＬ／ｍｉｎ）することで蘇生した（投与量は、全血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の３０％相当量）
バイタルサイン（平均動脈血圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、呼吸数、直腸温）は以下の１０時点で記録した。（１）５０％脱血前、（２）５０％脱血直後、（３）試料投与直前、（４）試料投与直後、（５）投与５分後、（６）投与１５分後、（７）投与３０分後、（８）投与１時間後、（９）投与１．５時間後、（１０）投与２時間後。
約１００ｍｍＨｇであった平均動脈血圧（ＭＡＰ）は脱血後に約３０ｍｍＨｇまで低下したが、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により上昇し、投与２ｈ後では約９０ｍｍＨｇまで回復した（図４（Ａ）参照、＊＊ｐ＜０．０１ 対ヒドロキシエチルスターチ）。一方、ヒドロキシエチルスターチ投与群では投与２ｈ後に約６０ｍｍＨｇまでしか上昇しなかった。また、約４００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎであった心拍数（ＨＲ）は脱血後に約３００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまで低下したが、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により上昇し、投与２時間後では約４００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまで回復した（図４（Ｂ）参照、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ 対ヒドロキシエチルスターチ）。一方、ヒドロキシエチルスターチ投与群では投与２時間後に約３２０ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまでしか上昇しなかった。ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与が出血性ショック状態からの蘇生に有効であることが分かった。その他のバイタルサイン、及び血液ガスパラメーターも、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により初期値まで回復した。
－ラット５０％出血性ショックモデルによる有効性評価－
Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（丸石製薬）（５．０％ ｉｎ ａｉｒ）で導入麻酔を行ったＷｉｓｔｅｒ ｒａｔ（雄性、７週令、約２３０ｇ、Ｃｈａｒｌｓ ｒｉｖｅｒ）をＳｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ（３．０％ ｉｎ ａｉｒ）吸入麻酔下で保温パッド（ＤＣ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、ブレインサイエンス・イデア）上に仰臥位で固定した。右頸動脈に血圧測定および脱血用にカテーテル（ＳＰ－３１、内径：０．５ｍｍ、外径：０．８ｍｍ、夏目製作所）を中枢側に向かって挿入し、逆側の末端を血圧測定装置（ＰＡＳ－１０１、スターメディカル）に接続した。また、右頸静脈に試料投与用に同カテーテルを挿入した。気管カニューレを行い、人工呼吸器を用いて呼吸管理を行った。動脈カテーテルより全血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の５０％を脱血することで（１ｍＬ／ｍｉｎ）、出血性ショック状態を作成した。１５分後に静脈カテーテルより、実施例１における調製例３で調製したポリオキサゾリン結合アルブミン（ＰＯｘ（５ｋ）－ｅＳＭ－ＰＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、［ＰＳＡ］＝５ｇ／ｄＬ）（ｎ＝６）及びヒドロキシエチルスターチ水溶液（大塚製薬株式会社、ボルベン輸液６％）（ｎ＝６）を投与（１ｍＬ／ｍｉｎ）することで蘇生した（投与量は、全血液量（５６ｍＬ／ｋｇ）の３０％相当量）
バイタルサイン（平均動脈血圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、呼吸数、直腸温）は以下の１０時点で記録した。（１）５０％脱血前、（２）５０％脱血直後、（３）試料投与直前、（４）試料投与直後、（５）投与５分後、（６）投与１５分後、（７）投与３０分後、（８）投与１時間後、（９）投与１．５時間後、（１０）投与２時間後。
約１００ｍｍＨｇであった平均動脈血圧（ＭＡＰ）は脱血後に約３０ｍｍＨｇまで低下したが、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により上昇し、投与２ｈ後では約９０ｍｍＨｇまで回復した（図４（Ａ）参照、＊＊ｐ＜０．０１ 対ヒドロキシエチルスターチ）。一方、ヒドロキシエチルスターチ投与群では投与２ｈ後に約６０ｍｍＨｇまでしか上昇しなかった。また、約４００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎであった心拍数（ＨＲ）は脱血後に約３００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまで低下したが、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により上昇し、投与２時間後では約４００ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまで回復した（図４（Ｂ）参照、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ 対ヒドロキシエチルスターチ）。一方、ヒドロキシエチルスターチ投与群では投与２時間後に約３２０ｂｅａｔｓ／ｍｉｎまでしか上昇しなかった。ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与が出血性ショック状態からの蘇生に有効であることが分かった。その他のバイタルサイン、及び血液ガスパラメーターも、ポリオキサゾリン結合アルブミン溶液投与により初期値まで回復した。
本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンを有効成分とする人工血漿増量剤は、生体内に投与する場合も安全性の高い代用血漿剤として利用できる。対象は人間に限ることはなく、動物（イヌやネコ等のペット、家畜等）にも投与可能な人工血漿増量剤となる。本発明のポリオキサゾリン結合アルブミンを有効成分とする人工血漿増量剤は、出血、毛細血管の浸透性の増加、肝臓のアルブミン合成低下、腎臓や腸からの排泄過剰、代謝の亢進、術中輸液による希釈等によって低アルブミン血症となった場合に投与される。具体的には、出血性ショック時の他、敗血症、人工心肺を使用する心臓手術、循環動態が不安定な体外循環実施時、重症熱傷、妊娠高血圧症候群等の病態、肝硬変に伴う難治性の腹水、難治性の浮腫、肺水腫を伴うネフローゼ症候群、蛋白質喪失性腸症等の治療剤としての利用が期待できる。
１００：ポリオキサゾリン結合アルブミン
１０：アルブミン
２０：ポリオキサゾリン
１０：アルブミン
２０：ポリオキサゾリン
Claims (9)
- コアとしてのアルブミンと、前記アルブミンに架橋剤を介して共有結合されたシェルとしてのポリオキサゾリンと、を有し、
前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（２）を含み、
前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位が、リシン、又はタンパク質末端の１級アミンであることを特徴とする、ポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記ポリオキサゾリンにおける前記架橋剤との結合部位が、下記一般式（１）で表されるポリオキサゾリンの末端ヒドロキシル基又はアミノ基である、請求項１に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記架橋剤を介した共有結合が、マレイミド基導入剤に由来する構造を含む、請求項１又は２に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記マレイミド基導入剤が、下記一般式（２）又は下記一般式（３）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項３に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記架橋剤を介した共有結合が、チオール基導入剤に由来する構造を更に含み、
前記チオール基導入剤が、下記化学式（３）、下記一般式（６）、又は下記一般式（７）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物である、請求項３又は４に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（３）又は構造（４）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 前記ポリオキサゾリンは、重量平均分子量が５００～１００，０００ダルトンである、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合アルブミン。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合アルブミンを含むことを特徴とする、人工血漿増量剤。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合アルブミンを含むことを特徴とする、出血ショックの蘇生液。
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