JP7774254B2 - ナノ小胞とその核酸送達への使用 - Google Patents

Description

本出願は、２０１９年５月１３日に出願された欧州特許出願第１９３８２３７２．１号の利益を主張する。

本発明は、一般に、核酸、特に低分子ＲＮＡの送達に有用なナノ小胞の分野に関する。本発明は、とりわけ、ナノ小胞、これらのナノ小胞を調製するためのプロセス、及び癌（例えば、神経芽細胞腫）などの疾患の治療におけるそれらの使用を提供する。

ＲＮＡ治療は、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）などの低分子ＲＮＡを含むすべてのトランスクリプトームの周りに有望な数の標的を有する新しい分野である（非特許文献１）。ＲＮＡを利用した治療法は化学療法抵抗性腫瘍に対する代替手段となりうるが、血流中の低分子ＲＮＡの急速なクリアランス及び分解のために、ｉｎ ｖｉｖｏ投与は依然としてこの分野における課題である。

ナノ小胞は、核酸や薬物のカプセル化に使用できる可能性があるため、またこれらの臨床への応用のために、多くの研究の対象となっている。ナノ小胞の中でも、リポソームは最も研究されているものであるが、近年は非リポソーム脂質ナノ小胞への関心が高まっている。クアトソームは、均一な形態を有する安定な単層ナノ小胞であり、臭化セトリモニウム（ｃｅｔｒｉｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ：ＣＴＡＢ）、塩化ミリスタルコニウム（ｍｙｒｉｓｔａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＭＫＣ）又は塩化セチルピリジニウム（ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＣＰＣ）などの第四級アンモニウム界面活性剤、及びコレステロール又はβ－シトステロールなどのステロールを定義されたモル比で含む非リポソーム脂質ナノ小胞である（非特許文献２）。膨張有機溶液の減圧による懸濁液（Ｄｅｐｒｅｓｓｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ）法などの圧縮流体ベースの技術がクアトソームの製造に使用されてきた（非特許文献２；特許文献１）。

ナノ小胞は、核酸送達における有用性が期待されている反面、それらの内容物の細胞内放出については、ナノ小胞がエンドソーム内に取り込まれてリソソーム内で分解され、ナノ小胞のカーゴ内容物の細胞質内への放出が妨げられるおそれがあるという問題を有する。

国際公開ＷＯ２００６／０７９８８９号公報

Ｂｕｍｃｒｏｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６，２：７１１－７１９ Ｇｒｉｍａｌｄｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ２０１６，４５：６５２０－６５４５

この分野で知られていることから、癌性疾患などの治療薬として核酸を使用する疾患に対して、エンドソームからの脱出を通じて細胞質内に有用な核酸を効果的に放出する核酸送達方法を見出すことが依然として必要とされている。

本発明者らは、輸送された核酸がサイトゾル中でその活性を実行することを可能にする、核酸送達のためのツールを開発した。このツールはクアトソーム（ｑｕａｔｓｏｍｅ：ＱＳ）（以下、「本発明のナノ小胞」又は「本発明のＱＳ」と呼ぶ）であり、非脂質カチオン性界面活性剤（ＭＫＣなど）とＤＣ－コレステロール（特定の場合は１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を、例えばモル比１：１で含む。

本発明のＱＳは、１００ｎｍ未満の小さな単層小胞であり、低多分散性であり、球形であり、高い経時的コロイド安定性を有する（図１～図４を参照）。さらに、本発明のＱＳは緩衝効果を可能にするｐＨ感受性を有する（図５を参照）。

驚くべきことに、ＤＣ－Ｃｈｏｌは、非脂質カチオン性界面活性剤と組み合わせた場合に、テストしたすべての製剤でナノ小胞を形成するが、コレステロール又は他のコレステロール誘導体は必ずしもナノ小胞を形成しない（図６は、Ｃｈｏｌ－ＶＳと非脂質陽イオン界面活性剤（ＣＴＡＢ）とがリボンを形成したことを示しており、また図６Ｃは、１０％のｅｔＯＨコレステロール及び非脂質陽イオン界面活性剤ＭＫＣを含む水中で、リボン様のナノ構造を好適に形成したことを示している）ことが発見された。

本発明者らは、神経芽細胞腫細胞におけるｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ送達に本発明のナノ小胞を使用し、上記の核酸発現及びそれらの標的の発現の両方において驚くべき結果をもたらした。

本発明のＱＳは、他のステロールを含むＱＳと比較すると、高いＲＮＡ複合体形成効率（図８を参照）、及びそれらがｍｉＲＮＡと複合体を形成した場合の高い細胞生存率（図９を参照）を有する。驚くべきことに、本発明のＱＳは、ｍｉＲＮＡの運搬時にその発現も可能にする唯一のＱＳであり（図１０を参照）、神経芽細胞腫細胞におけるこのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ）の標的の発現を、ｍＲＮＡレベル（図１１を参照）及びタンパク質レベル（図１２を参照）で調節することができた。ステロールとして１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌを使用した本発明のクアトソーム（以下の例では「ＱＳ_４」と称される）は、ｍｉＲＮＡの送達に最適であった（図１１及び図１２を参照）。しかしながら、ステロールとしてほぼ５０％のＤＣ－Ｃｈｏｌを含む本発明のクアトソーム（以下の例では「ＱＳ_３」と称される）では、ＱＳからのｍｉＲＮＡ放出も遅いペースで生じる（図１３を参照）。神経芽細胞腫細胞における上記の効果に関して最も有効な複合体ＱＳ_４－ｓＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとＱＳ_４との質量比がそれぞれ１３．５・１０^－２及び２０．２４・１０^－２（表７及び図１５～図１６を参照）の複合体ＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（Ｖ）及びＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（ＶＩ）であった。本発明のＱＳ＿によるｍｉＲ－３２３ａ－５ｐのトランスフェクションは、神経芽細胞腫細胞株における細胞増殖を減少させ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）と比較して同様の効果を示した（図１７～図１８を参照）。また、本発明のＱＳでは、神経芽細胞腫細胞において、ｓｉＣＣＮＤ１を使用したｓｉＲＮＡによるトランスフェクションも可能であった（図１９～図２２を参照）。

以下に提供するデータから、本発明のＱＳが、癌などの核酸で治療することができる疾患、及び特定の例については神経芽細胞腫のための核酸送達システムとして使用できるという事実は注目に値する。

さらに、本発明のナノ小胞は、核酸カーゴをＲＮＡｓｅ Ａ分解から保護することが実証されている（図２５）。

本発明のＱＳは、例えば、これらの粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ追跡のために蛍光分子を使用して（Ｄｉｌを使用した機能化については、実施例５、図２３を参照）、特定の標的部位での生体分子の「選択的」送達を促進するためにペプチド又は抗体などの標的化ユニットを使用して、又は血液循環時間を改善するためにポリ（エチレングリコール）（ｐｏｌｙ－（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：ＰＥＧ）などのステルスポリマーを使用して、効率的に機能化することができる（Ｃａｂｒｅｒａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１３，１３（８），３７６６－３７７４）。ＱＳをＤｉｌで機能化しても、ｍｉＲＮＡの結合や送達は変化せず、機能化されていないＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体と同じ程度に神経芽細胞腫の増殖が減少した（図２４を参照）。

ｍｉＲ－対照又はｍｉＲ－３２３ａ－５ｐと結合したＱＳ_４の生体内分布分析は、単回投与の２４時間後、ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ対照と比較して、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの発現が肝臓、肺、脾臓、腎臓、及び皮下腫瘍で（それぞれ１５０倍、６６０００倍、１５０００倍、５７０倍及び１２５倍）増加したことを示している（図２６を参照）。毒性の肉眼的兆候も有害な副作用も観察されなかった。

したがって、本発明の第１の態様は、ステロールと非脂質カチオン性界面活性剤とを含み、ステロールがＤＣ－コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含むナノ小胞に関する。

本発明の第２の態様は、治療上有効量の本発明の第１の態様のナノ小胞と、薬学的に許容可能な賦形剤又はビヒクルとを含む医薬組成物に関する。

本発明の第３の態様は、送達システムとしての本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物は、例えば、ヒトの疾患の治療のための治療薬として核酸を使用する疾患の治療に使用することができる。

本発明の第４の態様は、薬剤として使用するための本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の第５の態様は、非感染性疾患の治療、好ましくは癌の治療に使用するための、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の第６の態様は、バイオイメージングツールとしての本発明の第１の態様のナノ小胞の使用に関する。

ＱＳは、ＱＳの堅牢性及び再現可能なスケールアップが保証され、前臨床試験と臨床試験との両方で十分な量のナノメディシンを調製することの可能な、ＣＯ_２ベースのＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法（国際出願番号第ＷＯ２００６０７９８８９号）によって調製することができる。

本発明の第７の態様は、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して本発明の第１の態様のナノ小胞を製造するためのプロセスに関する。

本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物を含むキットに関する。

本発明の第９の態様は、セラノスティックツールとしての本発明の第１の態様のナノ小胞の使用に関する。

本発明の第１０の態様は、ｐＨ緩衝剤としての本発明の第１の態様のナノ小胞に関する。

様々なステロール（Ｃｈｅｍｓ、コレステロール、又はＤＣ－Ｃｈｏｌ）との第四級アンモニウム界面活性剤（ＭＫＣ）の自己組織化によって形成された、上述のクアトソーム（ＱＳ）システムの物理化学的特性。Ｄｅｌｏｓ－ＳＵＳＰ調製の１週間後（Ａ）又は２か月後（Ｂ）にＤＬＳ技術によって測定された、上述のＱＳシステムの流体力学的直径及び表面電荷密度。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。 様々なステロール（Ｃｈｅｍｓ、コレステロール、又はＤＣ－Ｃｈｏｌ）との第四級アンモニウム界面活性剤（ＭＫＣ）の自己組織化によって形成された、上述のクアトソーム（ＱＳ）システムの物理化学的特性。ダイアフィルトレーションによるナノ小胞精製の１週間後（Ａ）又は２か月後（Ｂ）にＤＬＳ技術によって測定された、上述のＱＳシステムの流体力学的直径及び表面電荷密度。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。 （Ａ）ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰの調製後、又は（Ｂ）ダイアフィルトレーション後にＤＬＳによって測定された様々なＱＳシステムの狭い粒度分布。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。 ステロール組成を変化させたＱＳの高解像度の代表的なクライオＴＥＭ画像。ＱＳ_０（Ａ）、ＱＳ_１（Ｂ）、ＱＳ_２（Ｃ）、ＱＳ_３（Ｄ）、ＱＳ_４（Ｅ）、ＱＳ_５（Ｆ）、ＱＳ_６（Ｇ）、及びＱＳ_７（Ｈ）。スケールバー、２００ｎｍ。 ｐＨ感受性ステロールＤＣ－Ｃｈｏｌの様々な％でのＱＳの緩衝能力。グラフは、０．０１μＭから３μＭまでの酸性ＨＣｌ濃度でのｐＨ変化を示す。 様々な組成：ＣＳ－ＶＳ_１：（３２％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／６８％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_２：（４９％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／５１％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_３：（６６％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／３４％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_４：（７４％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／２６％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_５（１００％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／０％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ）でのＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ－ＶＳ／ＣＴＡＢ水性混合物の高解像度の代表的なクライオＴＥＭ画像。Ａ）調製の１４日後及び４０日後に撮影されたＣＳ－ＶＳ１システムの高解像度の代表的なクライオＴＥＭ画像。Ｂ）サンプル調製の１４日後に分析されたＣＳ－ＶＳ_２、ＣＳ－ＶＳ_３、ＣＳ－ＶＳ_４及びＣＳ－ＶＳ_５システムの高解像度の代表的なクライオＴＥＭ画像。Ｃ）ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰによるサンプル調製の７日後に、１０％のＥｔＯＨを含むステロールと界面活性剤とのモル比１：１の水中で形成された（１００％Ｃｈｏｌ／０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣナノ構造で構成されるＣＳ－ＣＨを表す高解像度のクライオＴＥＭ画像。 ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体の形態と層状性。ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体の様々なｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（ＩＩＩ（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、及びＭ｝；Ｖ（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋａｎｄ Ｎ｝；ＶＩ（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｌａｎｄ Ｏ｝｝、様々なＱＳシステム、ＱＳ_０（Ａ）－Ｃ｝｝、ＱＳ_１（Ｄ｝－Ｆ｝｝、ＱＳ_２（Ｇ｝－１｝｝、ＱＳ_３（Ｊ）－Ｌ））及びＱＳ_４（Ｍ｝－０））での様々な製剤を表す高解像度のクライオＴＥＭ画像。スケールバー、２００ｎｍ。 静電相互作用によるＱＳ_４とｍｉＲＮＡとの複合体形成効率。表７に記載されている様々なｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比でのＱＳ_４とのｍｉＲ－３２３ａ複合体のゲル電気泳動（レーン２～９）、及びネイキッドｍｉＲＮＡ（レーン１１～１４）の標準キャリブレーション。 化学療法抵抗性ＮＢ細胞株（ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２））におけるＱＳ及びＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体の高い細胞生存率。 ＱＳ_１－４－ｍｉＲ－対照複合体（Ｂ）のＱＳ（Ａ）のインキュベーションの２４時間後のＩＣ５０を測定する増殖研究。２回の実験から平均±ＳＥＭをプロットした。 ｍｉＲＮＡネイキッド（５０ｎＭ）、ｍｉＲＮＡ対ＭＫＣ質量比（Ｉ）でのＭＫＣ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐのミセル及び、上述のｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）、表７を参照）でのＱＳ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体でトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞におけるｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ発現レベル。ｍｉＲＮＡの発現レベルはｑＰＣＲによって測定された。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。 ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体トランスフェクション後のｍｉＲ－３２３ａ直接標的の調節。ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞におけるネイキッドｍｉＲＮＡ、ＭＫＣミセル及び上述のＱＳシステムによるｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ又はｍｉＲ－対照（５０ｎＭ）トランスフェクションの４８時間後のｍｉＲＮＡ－直接標的発現。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体トランスフェクション後のタンパク質レベルでのｍｉＲ－３２３ａ直接標的の調節。上述のＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体によるトランスフェクションの７２時間後のＮＢ細胞における上述のタンパク質の代表的なバンド強度の定量化。ヒストグラムは、３回の独立した実験からのバンド強度信号平均±ＳＥＭの定量化を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＮＢ細胞と共に一晩インキュベートした後のＱＳ_３又はＱＳ_４表面からのｍｉＲＮＡ放出。グラフは、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞に一晩トランスフェクションした後の、様々なＱＳ製剤を使用した^ＤｉｌＱＳ－ｍｉＲ－対照^Ｃｙ５複合体のＦＲＥＴ比を示す。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体の組成を表７に示す。 ＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体トランスフェクション後のｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ発現レベルの増加。ＳＫ－ＮＢＥ（２）におけるｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの発現レベルを、双方とも上述のｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）のＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体及びＱＳ_４－ｍｉＲ－対照複合体でのトランスフェクションの４８時間後にｑＰＣＲで測定した。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＮＢ細胞における上述のｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）のＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体によるトランスフェクションの４８時間後のｍＲＮＡ発現レベルでのｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ直接標的の修飾。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭの定量化を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＮＢ細胞における上述のｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）のＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体によるトランスフェクション後のタンパク質レベルでのｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ直接標的及び間接標的の修飾。ヒストグラムは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭの定量化を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 上述のｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶ）のＱＳ４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体によるトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞増殖の減少。トランスフェクションの９６時間後のＮＢ細胞において、ＱＳ_４との複合体を形成したｍｉＲ－３２３ａ－５ｐとｍｉＲＮＡ－対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）と比較したＱＳ４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体でのトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における細胞増殖分析。トランスフェクションの９６時間後のＮＢ細胞において、ＱＳ４又はリポソーム（すなわちＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）との複合体を形成したｍｉＲ－３２３ａ－５ｐとｍｉＲＮＡ－対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った。グラフは、３回の独立した実験の±ＳＥＭの平均を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＮＢ細胞における上述のｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）のＱＳ_４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体によるトランスフェクションの４８時間後のｍＲＮＡ発現レベルでのＣＣＮＤ１直接標的の修飾。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＮＢ細胞におけるＱＳ_４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）でのトランスフェクション後のタンパク質レベルでのＣＣＮＤ１直接標的及び間接標的修飾の修飾。ヒストグラムは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭの定量化を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＱＳ_４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体（Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩＩ）のトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞増殖の減少。トランスフェクションの９６時間後のＮＢ細胞において、ＱＳ_４との複合体を形成したｓｉＣＣＮＤ１とｓｉＲＮＡ対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った。グラフは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）と比較したＱＳ４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体でのトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における細胞増殖分析。トランスフェクションの９６時間後のＮＢ細胞において、ＱＳ_４との複合体を形成したｓｉＣＣＮＤ１とｓｉＲＮＡ対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った。グラフは、３回の独立した実験の±ＳＥＭの平均を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 第四級アンモニウム界面活性剤（ＭＫＣ）とＤＣ－Ｃｈｏｌステロールとの自己組織化によって形成され、Ｄｉｌフルオロフォアで機能化される（Ｄｉｌ－ＱＳ_４）か、又はＰＥＧステルスポリマーで機能化され（ＰＥＧ－ＱＳ_４）、１０％Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ／９０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ：ＭＫＣで構成された上述のクアトソーム（ＱＳ_４）システムの物理化学的特性。 精製の１週間後にＤＬＳ技術によって測定された、上述のＱＳシステムの流体力学的直径及び表面電荷密度。グラフは、３回の独立した実験の±ＳＥＭの平均を表す。 ^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体及び単純なＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体でトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞の細胞増殖分析。トランスフェクションの９６時間後のＮＢ細胞において、^ＤｉｌＱＳ_４又は単純なＱＳ_４との複合体を形成したｍｉＲ－３２３ａ－５ｐとｍｉＲＮＡ－対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った。グラフは、３回の独立した実験の±ＳＥＭの平均を表す。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。すべてのＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体を表７に示す。 ＱＳ_４はｍｉＲ－３２３ａ－５ｐをＲＮＡｓｅ Ａによる分解から保護する。ＲＮＡｓｅ Ａ存在下でのＱＳ_４複合体形成後のｍｉＲＮＡ保護のゲル電気泳動。ＱＳ_４をレーン２に添加し、添加量（Ｖ）でＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ複合体を添加し（レーン３～８）、ネガティブ対照としてネイキッドｍｉＲＮＡを添加した（レーン９～１４）。ＲＮＡｓｅ Ａ（２５μｇ／ｍＬ）複合体処理を３０分、１時間、２時間又は４時間行った（レーン５～１２）。ＳＤＳ（０．２５％）の脱複合体化を、複合体形成後（レーン４）、ＲＮＡｓｅ Ａ処理後（レーン５～１２）、及びネイキッドｍｉＲＮＡ（レーン１４）で実行した。 生体内分布分析。^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体（２ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡと１０ｍｇ／ｋｇのＱＳ_４）を無胸腺ヌードマウスに静脈内注射した。２４時間後、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの発現をｑＰＣＲで分析した。^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－対照を注射したマウスと比較して、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐが皮下神経芽細胞腫の腫瘍、肺、脾臓、腎臓、肝臓に蓄積されていた。Ｐ＜０．０５^＊、ｐ＜０．０１^＊＊、ｐ＜０．００１^＊＊＊。ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体調製プロトコルを表１１に示す。

発明の詳細な説明
本出願における本明細書で使用されるすべての用語は、特に明記しない限り、当技術分野で知られている通常の意味で理解されるものとする。本出願で使用される特定の用語の他のより具体的な定義は、以下に記載されており、他に明示的に定められた定義がより広い定義を提供しない限り、明細書及び特許請求の範囲全体に均一に適用されることを意図している。

ＤＣ－コレステロール、ＣＡＳ番号１３７０５６－７２－５は、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、コレステリルＮ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメート、又は３β－｛Ｎ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］カルバモイル｝コレステロール又は３－（Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）又は（Ｃ３２－Ｈ５６－Ｎ２－Ｏ２）又は（コレスト－５－エン－３－オール（３ベータ）－、（２－（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート）又は（３ベータ－（Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）としても知られている。

非脂質カチオン性界面活性剤には、非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明のカチオン性界面活性剤は脂質ではない。

非脂質第四級アンモニウム界面活性剤は、１つの窒素置換基が長鎖アルキル基である第四級アンモニウム塩である。非脂質第四級アンモニウム界面活性剤は水溶性であり、自己組織化して臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を超えるミセルを形成する。逆に、脂質第四級アンモニウム界面活性剤は、自己組織化して、小胞、平面二重層、逆ミセルなどの他の構造を形成する。本発明の第四級アンモニウム界面活性剤は脂質ではない。

本発明の第１の態様の実施形態では、非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤は、塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、ベンゼトニウムクロリド（ＢＺＴ）、ステアラルコニウムクロリド、セトリミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、及びそれらの組み合わせからなるリストから選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤は、塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）である。

塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、ＣＡＳ番号１３９－０８－２は、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド又はミリスチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はＮ－ベンジル－Ｎ－テトラデシルジメチルアンモニウムクロリド又はＮ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－テトラデシルベンゼンメタナミニウムクロリド又はテトラデシルベンジルジメチルアンモニウムクロリドとしても知られている。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である。

本発明の第１の態様は、ステロールと非脂質カチオン性界面活性剤とを含み、ステロールがＤＣ－コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含むナノ小胞に関する。

本発明の第１の態様の実施形態では、ステロールは、ＤＣ－Ｃｈｏｌを、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など、少なくとも５％含む。

本発明の第１の態様の実施形態では、総ステロールに対するＤＣ－Ｃｈｏｌのパーセンテージは、少なくとも２０％、あるいは少なくとも４７％、あるいは少なくとも９０％、あるいは１００％である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ステロールは、ＤＣ－Ｃｈｏｌとコレステロールとの混合物、あるいはＤＣ－ｃｈｏｌとコレステロール誘導体との混合物である。例えば、コレステロール誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。例えば、コレステロール誘導体はＣｈｏｌ－ＰＥＧｎ－Ｘであり、「ｎ」はＰＥＧ鎖の長さ（例えば、ｎ＝０、又は少なくとも１）であり、「Ｘ」は－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＨＯ、－ＯＣＨ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ、－ＣＨ_３、－Ｎ_３、－ＣＯＯＨ、－マレイミド、ペプチド、抗体又は糖である。ここで、ペプチドは、ＨＳＹＷＬＲＳペプチド（配列番号２２）（例えば、配列：ＹＳＨＳＨＳＹＷＬＲＳＧＧＧＣ（配列番号３５））、ＧＤ２模倣結合ペプチド（例えば、配列：ＲＣＮＰＮＭＥＰＰＲＣＷＡＡＥＧＤ（配列番号３６）又はＶＣＮＰＬＴＧＡＬＬＣＳＡＡＥＧＤ（配列番号３７））、ニューロペプチドＹ（例えば、配列：ＭＬＧＮＫＲＬＧＬＳＧＬＴＬＡＬＳＬＬＶＣＬＧＡＬＡＥＡＹＰＳＫＰＤＮＰＧＥＤＡＰＡＥＤＭＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹＧＫＲＳＳＰＥＴＬＩＳＤＬＬＭＲＥＳＴＥＮＶＰＲＴＲＬＥＤＰＡＭＷ（配列番号３８））、Ｐ７５ニューロトロフィン受容体（例えば、配列：ＣＥＮＬＹＦＱＳＧＳＭＡＦＩＰＹＦＡＲ）（配列番号３９）、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＶＧ）ペプチド（例えば、配列：ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号４０）又はＫＳＶＲＴＷＮＥＩＩＰＳＫＧＣＬＲＶＧＧＲＣＨＰＨＶＮＧＧＧ）（配列番号４１）、ドーパミン作動性ペプチド（例えば、配列：ＣＣＹＨＷＫＨＬＨＮＴＫＴＦＬ）（配列番号４２）、ＲＧＤ－ペプチド、及びＧＤ２抗体からなるリストから選択されてもよい。糖の例が、Ｄ－グルコース又はグルコサミン誘導体であってもよい。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は非リポソーム脂質ナノ小胞である。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ナノ小胞は、ステロールとしての１００％ＤＣ－ＣｈｏｌとＭＫＣとを１０：１から１：５の範囲のモル比で含むクアトソームである。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、ステロールとしての１００％ＤＣ－ＣｈｏｌとＭＫＣとを１：１の比で含むクアトソームである。本発明の第１の態様の別の実施形態では、ナノ小胞は、ステロールとしての１００％ＤＣ－ＣｈｏｌとＭＫＣとを１：２及び２：１の比で含むクアトソームである。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、球形であり、単層であり、均一なサイズであり、安定である。

現況技術において、本発明のナノ小胞を、例えばそれらの電位Ｚによって特性評価する周知の方法が存在する。ナノビークル（ｎａｎｏｖｅｈｉｃｌｅ）のサイズは、例えば動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）、質量分析、小角Ｘ線散乱（Ｓｍａｌｌ－ａｎｇｌｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＡＸＳ）、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）又は高解像度透過型電子顕微鏡（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＨＲ－ＴＥＭ）などの、専門家に周知の任意の方法によって測定することができる。

例えば、本発明のナノ小胞を特性評価するために、Ｄａｎａｅｉ，Ｍ．；ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｉｃ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１８，１０，５７に開示されているプロトコルに従う。

本発明において、「球形」という用語は、直径が、例えば５０～３００ｎｍなど、２０～５００ｎｍであることを指す。

「均一サイズ」という用語は、多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：ＰＤＩ）が、例えば０．１～０．３など、０．１～０．５であるナノ小胞を指す。
本発明のナノ小胞の安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定することができる。
例えば、本発明のナノ小胞の経時的安定性は、ＤＬＳによって測定することができ、流体力学的直径が３００ｎｍ未満を維持すること及びＰＤＩが０．１～０．３の範囲内であることを指す。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、平均直径が３００ｎｍ未満であり、ＰＤＩが０．１～０．３であり、少なくとも２か月まで安定である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、核酸、すなわち、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含む。

本発明の第１の態様の実施形態では、核酸はナノ小胞の内部にある。本発明の第１の態様の別の実施形態では、核酸はナノ小胞の外側にある。

「低分子ＲＮＡ」という用語は、２００ヌクレオチド長未満のＲＮＡを指す。それらは通常、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）などの、遺伝子発現のモジュレータである非コードＲＮＡ分子である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、腫瘍抑制機能を有する核酸を含む。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７、ｈａｓ－ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２－５ｐ、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。

実施形態では、上述のｍｉＲＮＡは、公開データベースｍｉＲＢａｓｅの識別番号（２０１９年４月３０日現在）に応じて、ＭＩＭＡＴ０００４６９６、ＭＩＭＡＴ０００２８２０、ＭＩＭＡＴ００００７３４、ＭＩＭＡＴ０００４９１８、ＭＩＭＡＴ０００３３３０、ＭＩＭＡＴ０００４９４８、ＭＩＭＡＴ００００４５９、ＭＩＭＡＴ０００３３２４、ＭＩＭＡＴ０００４７６５、ＭＩＭＡＴ０００４７６７、ＭＩＭＡＴ００００７３４、ＭＩＭＡＴ００１５０２３、ＭＩＭＡＴ０００４９４５、ＭＩＭＡＴ００００７５６、ＭＩＭＡＴ０００４９５２、ＭＩＭＡＴ０００４６１１、ＭＩＭＡＴ００００６８５、ＭＩＭＡＴ０００４５９６、ＭＩＭＡＴ００１８９５８、ＭＩＭＡＴ０００４９１０、ＭＩＭＡＴ００２６７３５、ＭＩＭＡＴ００１５００８、ＭＩＭＡＴ００１６９２２、ＭＩＭＡＴ０００４５８９、ＭＩＭＡＴ０００４９２０、ＭＩＭＡＴ０００４７６１、ＭＩＭＡＴ００１６９１９、ＭＩＭＡＴ００００４２２、ＭＩＭＡＴ０００５８７１、ＭＩＭＡＴ０００２８１９、ＭＩＭＡＴ０００４５６８、ＭＩＭＡＴ００１９２２５、ＭＩＭＡＴ００２０６００、ＭＩＭＡＴ０００４９１３、ＭＩＭＡＴ０００５９２９、ＭＩＭＡＴ００００６８７、ＭＩＭＡＴ０００４６０９、ＭＩＭＡＴ０００４５９４、ＭＩＭＡＴ０００４９７５、ＭＩＭＡＴ００１８１０１、ＭＩＭＡＴ０００４９２５、ＭＩＭＡＴ０００４９８３、ＭＩＭＡＴ００１９７２１、ＭＩＭＡＴ０００３２１９、ＭＩＭＡＴ０００４６９４、ＭＩＭＡＴ００１５０６１、ＭＩＭＡＴ００１５０２８、ＭＩＭＡＴ００２２２８６、ＭＩＭＡＴ０００４９２６、ＭＩＭＡＴ００１５００１、ＭＩＭＡＴ００１９７３８、ＭＩＭＡＴ００１６９２０、ＭＩＭＡＴ０００４５９５、ＭＩＭＡＴ０００５４５１、及びそれらの任意の組み合わせである。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐである。本発明の第１の態様の別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは配列番号１である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＣＣＮＤ１、ｓｉＣＨＡＦ１Ａ、ｓｉｌＮＣＥＮＰ、ｓｉＫＩＦ１１、ｓｉＣＤＣ２５Ａ、ｓｉＦＡＤＤ及びｓｉＢＣＬ－ＸＬからなるリストから選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、上述のｓｉＲＮＡは、公開データベースＧｅｎｂａｎｋの識別番号（２０１９年４月３０日現在）に従って以下の遺伝子の発現をサイレンシングするｓｉＲＮＡである：遺伝子ＩＤ３８３２（ＫＩＦ１１、キネシンファミリーメンバー１１）、遺伝子ＩＤ３６１９（ＩＮＣＥＮＰ、内部セントロメアタンパク質）、遺伝子ＩＤ１００３６（ＣＨＡＦ１Ａ、クロマチンアセンブリ因子１サブユニットＡ）、遺伝子ＩＤ９９３（ＣＤＣ２５Ａ、細胞分裂サイクル２５Ａ）、遺伝子ＩＤ８７７２（ＦＡＤＤ、デスドメインを介して関連するＦａｓ）、遺伝子ＩＤ５９５（ＣＣＮＤ１、サイクリンＤ１）、及び遺伝子ＩＤ５９８（ＢＣＬ－ＸＬ、１アイソフォームのようなＢＣＬ２）。

本発明の第１の態様の実施形態では、上述のｓｉＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号２及び／又は配列番号３、あるいは、配列番号４及び／又は配列番号５、あるいは、配列番号６及び／又は配列番号７、あるいは、配列番号８及び／又は配列番号９、あるいは、配列番号１０及び／又は配列番号１１、あるいは、配列番号１２及び／又は配列番号１３、あるいは、配列番号１４及び／又は配列番号１５である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｓｉＲＮＡはｓｉＣＣＮＤ１である。本発明の第１の態様の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１２の配列のｓｉＣＣＮＤ１である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比は、１×１０^－２～３００×１０^－２であり、別の実施形態では、１×１０^－２～１００×１０^－２であり、別の実施形態では、１×１０^－２～９０×１０^－２であり、別の実施形態では、２×１０^－２、３×１０^－２、４×１０^－２、５×１０^－２、６×１０^－２、７×１０^－２、８×１０^－２、９×１０^－２、１０×１０^－２、２０×１０^－２、３０×１０^－２、４０×１０^－２、５０×１０^－２、６０×１０^－２、７０×１０^－２、８０×１０^－２、８１×１０^－２、８２×１０^－２、８３×１０^－２、８４×１０^－２、８５×１０^－２、８６×１０^－２又は８７×１０^－２である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は、フルオロフォア、放射性医薬品、ペプチド、ポリマー、無機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体又は抗体の断片、抗原、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される要素にさらに結合する。

本発明の第１の態様の実施形態では、フルオロフォアはカルボシアニンフルオロフォアである。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、カルボシアニンフルオロフォアは、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩である。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、放射性医薬品は、^１３１ｌで標識されたメタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）である。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ナノ小胞は、オプソニン化プロセスを防止する親水性ポリマー（「ステルス」ポリマー）に結合している。本発明の第１の態様の別の実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｉｌｅｎｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧｎ）である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ナノ小胞は腫瘍標的化ペプチドに結合している。本発明の第１の態様の実施形態では、ペプチドは、神経芽細胞腫細胞などの癌細胞、及び／又は腫瘍関連内皮細胞を認識することの可能な、ＷＨＷＲＬＰＳ（配列番号１６）ペプチド、ＮＧＲ含有ペプチド、ＲＧＤペプチド、アミノペプチダーゼＡ（グルタミルアミノペプチダーゼ、ＡＰＡ）結合ペプチド又はなどのペプチドである。

本発明の第１の態様の実施形態では、ＮＧＲ含有ペプチドは、ペプチド配列番号１７（ＮＧＲＧＧＶＲＳＳＲＴＰＳＤＫＹＣ）、配列番号１８（ＣＮＧＲＣＧＶＲＳＳＲＴＰＳＤＫＹ）又は配列番号１９（ＧＮＧＲＧＧＶＲＳＳＲＴＰＳＤＫＹ）である。

ＲＧＤペプチド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐモチーフを含む）は、細胞膜に存在するインテグリンと相互作用することができるペプチドとして当技術分野で一般的に説明されているペプチドであり、細胞間及び、細胞と異なる組織又は基底膜との間の両方の細胞接着研究において特に注目されている。

アミノペプチダーゼＡ（グルタミルアミノペプチダーゼ、ＡＰＡ）は、ヒト腫瘍の血管新生血管及び血管周囲細胞で過剰発現する膜貫通細胞表面タンパク質である。本発明の第１の態様の実施形態では、ＡＰＡ結合ペプチドは、配列ＣＰＲＥＣＥＳ（配列番号２０）を含むペプチドである。本発明の第１の態様の別の実施形態では、ＡＰＡ結合ペプチドは、ペプチドＣＰＲＥＣＥＳＡＲＳＳＲＴＰＳＤＫＹ（配列番号２１）である。

本発明の第１の態様の実施形態では、腫瘍標的化ペプチドは、例えば、ＹＳＨＳＨＳＹＷＬＲＳＧＧＧ（配列番号２３）、ＲＡＬＫＹＳＨＳＨＳＹＷＬＲＳＧＧＧ（配列番号２４）又はＹＳＨＳＨＳＹＷＬＲＳＧＧＧＣ（配列番号３５）などの、ＨＳＹＷＬＲＳ含有ペプチド（配列番号２２）である。

本発明の第１の態様の実施形態では、腫瘍標的化ペプチドは、ＰＥＧに結合している。

本発明の第２の態様は、治療上有効量の本発明の第１の態様のナノ小胞と、薬学的に許容可能な賦形剤又はビヒクルとを含む医薬組成物に関する。

本明細書で使用される「治療上有効量」という表現は、投与されると、対象の疾患の１つ以上の症状の発症を予防するか、又はある程度緩和するのに十分な化合物（すなわち、本発明のナノ小胞）の量を指す。当然のことながら、本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、投与される化合物、投与経路、治療される特定の状態、及び同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。

「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体、又はビヒクル」という表現は、薬学的に許容可能な材料、組成物、又はビヒクルを指す。各成分は、医薬組成物の他の成分との適合性を有するという意味で薬学的に許容可能でなければならない。また、各成分は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又はその他の問題や合併症を伴わずに人間や動物の組織や臓器と接触させて使用するのに適し、かつ合理的な利益／リスク比と釣り合っている必要がある。

本発明の第３の態様は、送達システムとしての本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。この態様を、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物の送達システムとしての使用へと変更してもよい。

本発明の第３の態様の実施形態では、送達システムは薬物送達システムである。

本発明の第３の態様の実施形態では、送達システムは、遺伝子治療及び／又はエピジェネティックな治療のための、あるいはｍｉＲＮＡトランスフェクション又はｓｉＲＮＡトランスフェクションのための薬物送達システムである。

本発明の第３の態様の実施形態では、送達システムは、核酸トランスフェクト剤である。

本発明の第４の態様は、薬剤として使用するための本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の第４の態様を、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物の薬剤の製造のための使用として変更してもよい。

本発明の第５の態様は、癌の治療に使用するための本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の第５の態様の実施形態では、癌は神経芽細胞腫である。

本発明の第５の態様を、例えば神経芽細胞腫などの癌疾患の治療のための薬物の製造のための本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物の使用として変更してもよい。これを、治療上有効量の本発明のナノ小胞の第１の態様を、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に、これを必要としている人間を含む対象に投与することを含む、例えば神経芽細胞腫などの癌疾患の治療又は予防のための方法として変更することもできる。

薬剤は、非経口投与、皮膚投与、経口投与、硬膜外投与、舌下投与、経鼻投与、髄腔内投与、経気管支投与、経リンパ投与、経直腸投与、経皮投与又は吸入投与に適合した形態で提供することができる。非経口投与に適合した形態は、その注射可能な投与を可能にすることができる、すなわち、好ましくは液体状態である物理的状態を指す。非経口投与は、筋肉内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与又は骨内投与によって実施することができるが、これらのタイプの非経口投与経路に限定されない。経口投与に適合した形態は、ドロップ剤、シロップ剤、煎じ薬剤、エリキシル剤、懸濁液剤、用時懸濁液剤、飲用バイアル剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、スタンプ剤（ｓｔａｍｐ）、ピル剤、錠剤、トローチ剤、舐剤、又は凍結乾燥剤を含むがこれらに限定されないリストから選択される。経直腸投与に適合した形態は、坐剤、直腸カプセル、直腸分散液又は直腸軟膏を含むがこれらに限定されないリストから選択される。経皮投与に適合した形態は、経皮パッチ又はイオントフォレーシスを含むがこれらに限定されないリストから選択される。

本発明の第４及び第５の態様の実施形態では、薬剤は、静脈内投与に適合した形態で提供される。本発明の第４及び第５の態様の別の実施形態では、薬剤は、経口投与に適合した形態で提供される。

本発明の第４又は第５の態様の実施形態では、薬剤は週に２回投与される。

本発明の第５の態様の第４の別の実施形態では、薬剤は、少なくとも６、８、１２、２４、４８時間ごとに投与される。本発明の第５の態様の第４の別の実施形態では、薬剤は、少なくとも週に１回又は週に２回投与される。

本発明の第４及び第５の態様の実施形態では、薬剤は、マウスに投与するための、例えば１０～３０μＭのｍｉＲＮＡ、別の例では１５～２０μＭのｍｉＲＮＡ、さらに別の例では１７．７μＭのｍｉＲＮＡ（マウスでは０．２５ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｋｇに相当する）などの、治療量の本発明の第１の態様のナノ粒子を含む。本発明の第４及び第５の態様の別の実施形態では、薬剤は、ヒトにおける０．２～３ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡ、別の例では、０．３～２ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡ、さらに別の例では、０．２７μＭのｍｉＲＮＡの治療量の本発明の第１の態様のナノ粒子を含む。

有利なことに、本発明の第１の態様のナノ小胞は、例えば、超解像顕微鏡法によって観察される蛍光色素で（例えば、Ａｒｄｉｚｚｏｎｅ ｅｔ ａｌ，ＳＭＡＬＬ，２０１８，１４に記載されているように）容易に機能化することができる。これらの蛍光ナノ小胞は、蛍光マイクロＲＮＡに結合すると、ＱＳ－ｍｉＲＮＡの細胞内在化及び細胞内分布の追跡に使用できる蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）シグナルを示す。本発明の第１の態様のナノ小胞は、核酸の内在化及び送達を追跡するためのバイオイメージングツールとして使用することができる。

本発明のナノ小胞は、例えば染料で標識されてもよく、部位特異的標識のためのターゲティングリガンドで機能化されてもよく、最終的に治療薬（例えば、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ）を送達してもよい。

したがって、本発明の第６の態様は、バイオイメージングツールとしての本発明の第１の態様のナノ小胞の使用に関する。

本発明の第６の態様の実施形態では、本発明の第１の態様のナノ小胞は、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の内在化及び送達を追跡するためのバイオイメージングツールとして使用される。

「バイオイメージングツール」は、この説明に従って、細胞又は特定の組織のいくつかの区画を追跡するために生物学の分野で使用されるイメージング技術で使用される試薬として理解されるべきである。バイオイメージングツールの例には、化学発光化合物、蛍光及び燐光化合物、Ｘ線又はアルファ、ベータ、又はガンマ線放出化合物などが含まれる。

本発明の第１の態様のナノ小胞は、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｌと非脂質カチオン性界面活性剤（すなわち、ＭＫＣ）との自己組織化によって形成することができる。

本発明の第１の態様のナノ小胞は、超音波処理（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ：ＵＳ）、薄膜水和法（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ：ＴＨＦ）、及び膨張有機溶液の減圧による懸濁液（ＤＥＬＯＳ－ｓｕｓｐ）と呼ばれる、ＣＯ_２膨張溶媒を使用するワンステップスケーラブル法などの様々な技術によって形成することができる（国際出願番号第ＷＯ２０１７１４７４０７号；Ｃａｎｏ－Ｓａｒａｂｉａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００８，２４，２４３３－２４３７；Ｅｌｉｚｏｎｄｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２０１２，７，１３９１－１４０８）。

本発明の第７の態様は、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して本発明の第１の態様のナノ小胞を製造するためのプロセスに関する。

本発明の第７の態様の実施形態では、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法は、
ａ）非脂質カチオン性界面活性剤（すなわちＭＫＣ）の水溶液を調製することと、
ｂ）ＤＣ－Ｃｈｏｌを有機溶媒に溶解し、圧縮流体（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｆｌｕｉｄ：ＣＦ）を使用して溶液を膨張させることと、
ｃ）工程ｂ）で得られた溶液を工程ａ）で得られた溶液中で減圧することによってナノ小胞を合成することと、
を含む。

本発明の第７の態様の別の実施形態では、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法は、
ａ）水溶液を提供することと、
ｂ）ＤＣ－Ｃｈｏｌと非脂質カチオン性界面活性剤（すなわちＭＫＣ）とを有機溶媒に溶解し、圧縮流体（ＣＦ）を使用して溶液を膨張させることと、
ｃ）工程ｂ）で得られた溶液を工程ａ）の水溶液中で減圧することによってナノ小胞を合成することと、
を含む。

本発明の第７の態様の実施形態では、この方法は、非水溶性有機染料を含む蛍光ナノ小胞を調製するために、
工程ｂ）において、ＤＣ－Ｃｈｏｌと非水溶性有機染料とを有機溶媒に溶解し、圧縮流体（ＣＦ）を使用して溶液を膨張させることと、
工程ｃ）において、工程ｂ）で得られた溶液を減圧することによって蛍光ナノ小胞を合成することと、
をさらに含む。

本発明の別の態様はまた、本発明の第７の態様の方法によって得られるナノ小胞である。

本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物を含むキットに関する。キットはまた、本発明の第１の態様のナノ小胞に含まれる核酸の送達のための説明書を含むことができる。

キットは、ナノ小胞を視覚化するためのさらなる手段をさらに含み得る。

また、本発明の一部は、本発明の上記の又は以下の他の態様に記載されている用途のための、本発明の第８の態様のキットの使用である。

また、本発明の一部は、本発明の第１の態様からのナノ小胞の放出又は本発明の第２の態様からの医薬組成物の放出のための装置を含むとともに、本発明の第１の態様からのナノ小胞又は本発明の第２の態様からの医薬組成物も含むキットである。

また、本発明の一部は、本発明の第１の態様からのナノ小胞の放出、又はナノ小胞を含む本発明の第２の態様の医薬組成物からのナノ小胞の放出のための装置である。

本発明の第１の態様のナノ小胞は、治療の治療効率を監視しながら、投与量の正確な時空間制御を用いて、標的の患部を同時に診断、画像化、及び治療することができる。したがって、本発明の第９の態様は、セラノスティックツールとしての本発明の第１の態様のナノ小胞の使用に関する。

本発明によれば、本発明の第１の態様のナノ小胞は、ｐＨ緩衝能力を示す（図５を参照）。したがって、本発明の第１０の態様は、ｐＨ緩衝剤としての本発明の第１の態様のナノ小胞、又は本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。

本発明の別の態様は、本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物の抗菌剤又は抗真菌剤としての使用である。

本発明の第１の態様のナノ小胞又は本発明の第２の態様の医薬組成物の抗菌作用は、例えば、細菌の細胞溶解を引き起こす、細菌の原形質膜の摂動を介して生じさせることができる。抗菌作用は、バイオフィルムモデル、細菌の生存率を測定するアラマーブルーアッセイ、クリスタルバイオレット染色などの、この分野の専門家に知られている方法で測定することができ、例えば、黄色ブドウ球菌、枯草菌、大腸菌などの既知のモデル病原体などのグラム陽性菌又はグラム陰性菌で証明することができる。

抗菌作用は、例えばアスペルギルス・ニガー又はカンジダ・アルビカンスに対して、この分野の専門家によって知られている方法によって測定することができる。

説明及びクレーム全体を通して、「含む」という単語及びその単語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、構成要素、又はステップを除外することを意図するものではない。さらに、「含む」という言葉は、「からなる」の場合を包含する。本発明のさらなる目的、利点、及び特徴は、説明を検討することで当業者に明らかになるか、又は本発明を実施することで理解され得る。以下の実施例及び図面は、例示として提供されており、本発明を限定することを意図するものではない。図面に関連し、クレームの括弧内に配置された参照記号は、クレームの理解を助けることのみを目的としており、クレームの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを包含する。

１．クアトソーム合成

１．１ クアトソームの合成及び物理化学的特性

材料及び方法
コレステン－３β－オール（Ｃｈｏｉ、純度９５％；＃Ａ０８０７；ＣＡＳ番号：５７－８８－５）及び水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、純度≧９８．０％）を、ＰａｎＲｅａｃ（Ｃａｓｔｅｌｌａｒ ｄｅｌ Ｖａｌｌｅｓ、スペイン）から入手した。コレステリルＮ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメート（ＤＣ－Ｃｈｏｌ、純度≧９８％；＃９２２４３）及びコレステリルヘミコハク酸（Ｃｈｅｍｓ、純度≧９８％；＃Ｃ６５１２；ＣＡＳ番号：１５１０－２１－０）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。

ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド（ＭＫＣ；純度≧９９％；＃２６２３９３）を、ＡｔｔｅｎｄＢｉｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＬ（Ｓａｎｔａ Ｃｏｌｏｍａ ｄｅ Ｇｒａｍｅｎｅｔ、スペイン）から入手した。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、分子生物学用ｕｌｔｒａ）をＦｌｕｋａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１，１´－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチル－インドカルボシアニン過塩素酸塩（Ｄｉｌ）をＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから入手した。エタノールをＴｅｋｎｏｃｈｒｏｍａ（Ｓａｎｔ Ｃｕｇａｔ ｄｅｌ Ｖａｌｌｅｓ、スペイン）から購入した。コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（ｍＰＥＧ－ＣＬＳ；ｍＰＥＧ鎖：１０００；＃ＭＦ００１０９５－１Ｋ）を、ＢｉｏＣｈｅｍＰＥＧ（米国マサチューセッツ州ウォータータウン ０２４７２）から購入した。二酸化炭素（純度９９．９％）をＣａｒｂｕｒｏｓ Ｍｅｔaｌｉｃｏｓ Ｓ．Ａ．（Ｃｏｒｎｅｌｌａ ｄｅ Ｌｌｏｂｒｅｇａｔ、スペイン）から購入した。すべての化学物質はさらに精製することなく使用され、すべての溶液は前処理されたＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｂｅｒｉｃａ、マドリッド、スペイン）を使用して調製された。

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（＃１１６６８０１９）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。

ヒト合成ｍｉＲＮＡ模倣物、Ｄｙ５４７標識－ｍｉＲ－対照－１（＃ＣＰ－００４５００－０１；表１）及びｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（＃ＣＰ－３０１０８５－０１；表１）を、現在のＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ（米国コロラド州ラファイエット）から入手した。

対照ｓｉＲＮＡ（５’ＧＵＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＵＵＡＵＣＧＣ３’）（配列番号２５）及びｓｉＣＣＮＤ１（５’ＣＣＵＡＣＧＡＵＡＣＧＣＵＡＣＵＡＵＡＵＵ３’）（配列番号１２）をＳｉｇｍａから購入した（表２）。

ｓｉＲＮＡは供給業者から凍結乾燥されたものを受け取り、後で所望の濃度で使用するために水に再懸濁した。

ＱＳ合成
クアトソーム（ＱＳ）を、Ｃｈｏｉ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、又はＣｈｅｍｓなどのステロールと、ＭＫＣやＣＴＡＢなどの正電荷の高い非脂質カチオン性界面活性剤とで構成した。Ｃｈｏｌと修飾ステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ又はＣｈｅｍｓ）との比率を調整することにより、様々なＱＳを作成した。

ＱＳ_０：（０％Ｃｈｏｌ／１００％Ｃｈｅｍｓ）：ＭＫＣ；ＱＳ_１：（１００％Ｃｈｏｌ／０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_２：（９１％Ｃｈｏｌ／９％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_３：（５３％Ｃｈｏｌ／４７％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_４：（０％Ｃｈｏｌ／１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ、ＱＳ_５：（９０．５％Ｃｈｏｌ／９．５％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＱＳ_６：（５１％Ｃｈｏｌ／４９％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＱＳ_７：（０％Ｃｈｏｌ／１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ。１：３のモル比で調製されたＱＳ_１を除いて、すべてのＱＳを様々なステロールと界面活性剤（ＭＫＣ又はＣＴＡＢ）とのモル比１：１で調製した。さらに、ＱＳ_４膜にＤｉｌを挿入して、Ｄｉｌで機能化されたＱＳ_４を調製した。また、いくつかのＤＣ－Ｃｈｏｌ分子をＰＥＧで置き換えることによってＰＥＧ－ＱＳ_４を機能化し、ＱＳ_４：（１０％Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ／９０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣの最終組成をモル比１：１で達成した。

ＣＦを使用する方法でＱＳを作成した（Ｆｅｒｒｅｒ－Ｔａｓｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１３ Ｊｕｎ ４；２９（２２）：６５１９－２８）。簡単に説明すると、Ｃｈｏｉ、Ｃｈｅｍｓ、又はＤＣ－Ｃｈｏｌなどのステロール又はその誘導体（表３を参照）を３１３～３１８Ｋで１０分間、ＥｔＯＨ（Ｖ_ＥｔＯＨ）に溶解した。次に、有機相を運転温度（Ｔｗ＝３１１Ｋ）及び大気圧で容器に添加した。次に、ＣＯ_２を添加して、高圧（Ｐｗ＝１１．５ＭＰａ）、３１１Ｋ、及び所定のＣＯ_２モル分率（Ｘ_ＣＯ２＝０．６）で脂質の体積膨張溶液を得た。１時間の均質化後、このＣＯ_２膨張溶液を、表３の非脂質陽イオン界面活性剤（すなわち、ＭＫＣ又はＣＴＡＢ）（Ｖ_Ｈ２０＝８．３Ｖ_ＥｔＯＨ）を含む水溶液中で、作動圧（Ｐｗ）から大気圧まで減圧し、ＱＳシステムの形の均一な単層ナノ小胞を得た。この方法を、連続モード又はバッチモードで実施してもよい。

例えば非水溶性有機色素などの蛍光色素を用いて機能化されたクアトソームを調製するために、この方法はさらに、ステロールとＥｔＯＨ（Ｖ_ＥｔＯＨ）とによって形成される有機相にＤｉｌフルオロフォア（７０μＭ）を添加し、次に高圧（Ｐｗ＝１１．５ＭＰａ）、３１１Ｋ、及び所定のＣＯ_２モル分率（ＸＣＯ_２＝０．６）でＣＯ_２を添加することにより、脂質の溶液をＤｉｌで膨張させることを含む。１時間の均質化後、このＣＯ_２膨張溶液を、表３の非脂質陽イオン界面活性剤（すなわち、ＭＫＣ又はＣＴＡＢ）（Ｖ_Ｈ２０＝８．３Ｖ_ＥｔＯＨ）を含む水溶液中で、作動圧（Ｐｗ）から大気圧まで減圧し、均一な単層蛍光ナノ小胞を得た。

１週間の安定化後、すべてのサンプルを、ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｉｉ ＴＦＦシステム（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＲｅｐｌｉｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）を使用したダイアフィルトレーションによって精製した。サイズ排除ｍＰＥのＭｉｃｒｏＫｒｏｓフィルタカラム（分子量カットオフ１００ＫＤａ、表面積２０ｃｍ^２）を使用してサンプルをダイアフィルトレーションし、エタノールとＱＳにカプセル化されていない過剰な物質とを除去することにより、最終的にＱＳがＭｉｌｌｉＱ水媒質中に残った。

ステロールとして１００％ＤＣ－ＣｈｏｌとＭＫＣとを１：２及び２：１の比率で含むナノ小胞も調製した（データは図示していない）。

ｍｉＲＮＡ－ＱＳ複合体の調製：
ａ）必要なｍｉＲＮＡ／ＱＳ添加量に応じて、対応するμＬ単位の体積のＱＳ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験については表７、ｉｎ ｖｉｖｏ実験については表１１を参照）を新しいエッペンドルフに添加した。
ｂ）対応するμＬ単位の体積のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの必要な最終濃度に応じて；すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で２．５μＭのｍｉＲＮＡ最終濃度を達成するためには２．５μＬ（ストック濃度２０μＭ）、ｉｎ ｖｉｖｏ実験で２１．３μＭのｍｉＲＮＡ最終濃度を達成するためには４２．６μＬ（ストック濃度１００μＭ）のｍｉＲＮＡ）（表７及び表１１を参照をＱＳ溶液に添加した。
ｃ）複合体を１倍のＰＢＳで希釈して混合を確実にし、凝集を回避し、様々なＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体間でｍｉＲＮＡ濃度を一定に維持した。
ｄ）上下に２回ピペッティングした後（５分未満のインキュベーション）、複合体が形成された。
ｅ）必要に応じて、形成された複合体を細胞に加えた。

物理化学的特性

動的光散乱
ＱＳの粒子サイズ、多分散性、及び表面電荷密度を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マルバーン、英国）による動的光散乱（ＤＬＳ）技術を使用して評価した。測定の３つの複製からの流体力学的直径及び多分散性指数（ＰＤＩ）を、ホモダイン検出で４ｍＷの入射Ｈｅ－Ｎｅレーザ光、波長６３３ｎｍ、及び１７３°に固定された検出器角度を使用して得た。サンプルを、修飾や希釈を行うことなく、生成後すぐに２９８Ｋで測定した。さらに、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用した別の非侵襲的後方散乱技術により、ＤＴＳ１０７０使い捨て折り畳みキャピラリーキュベット内で２９８ＫでＺ電位を測定した。報告された値は、サンプル間の流体力学的直径の平均±標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）又はＺ電位±標準偏差（ＳＤ）であった。実験を少なくとも３回行った。

ＱＳの経時的安定性を、サンプルの調製又は精製から１週間、２週間、１か月、３か月、６か月、及び１年後にＤＬＳによって測定した。ＱＳは、２か月まで流体力学的直径が３００ｎｍ未満のままであり、かつＰＤＩが０．１～０．３の範囲内にとどまった場合、経時的に安定であると見なされた。

クライオＴＥＭ
クライオＴＥＭ画像を、ＪＥＯＬ ＪＥＭ ２０１１透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京、日本）を使用して２００ＫＶで取得した。サンプルを、穴あきポリマーフィルムでコーティングされたホーリーカーボングリッド又は銅グリッド上に配置した後に、液体エタンで凍結した。Ｇａｔａｎ６２６クライオトランスファーシステムを顕微鏡に挿入した。Ｇａｔａｎ Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ＵＳ１０００ ＣＣＤカメラを使用して画像を記録し、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ１．８プログラムで分析した。

ｐＨ緩衝能力
ＱＳの緩衝能力を、酸塩基滴定によって測定した。簡単に説明すると、ＱＳは水溶液中で５ｍｇ／ｍＬの最終濃度であった。得られた溶液を水酸化ナトリウム（０．０１Ｍ）でｐＨ９に調整した。滴定曲線を、塩酸（０．０１Ｍ）の１０μＬアリコートを段階的に添加することによって求めた。添加後、ｐＨ計（Ｈａｎｎａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国ロードアイランド州ウーンソケット）を使用して、ｐＨ２に達するまでｐＨを測定した。

結果：
ＱＳを、場合ごとにステロールと界面活性剤との組成を変えて調製した（ＱＳ_０：（０％Ｃｈｏｌ／１００％Ｃｈｅｍｓ）：ＭＫＣ；ＱＳ_１：（１００％Ｃｈｏｌ／０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_２：（９１％Ｃｈｏｌ／９％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_３：（５３％Ｃｈｏｌ／４７％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ；ＱＳ_４：（０％Ｃｈｏｌ／１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ、ＱＳ_５：（９０．５％Ｃｈｏｌ／９．５％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＱＳ_６：（５１％Ｃｈｏｌ／４９％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＱＳ_７：（０％Ｃｈｏｌ／１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ。ＤＬＳ測定（表４を参照）及びクライオＴＥＭ画像（図４）により、得られたすべてのクアトソーム（ＱＳ）は、均一なサイズ、球形、単層のナノ小胞であることが分かった。ＤＬＳ測定（図３を参照）では、平均サイズが約１００ｎｍの単峰性のサイズ分布が明らかとなった。加えて、ＱＳは、すべてのＱＳで観察されたサイズ分布の変動がわずかであったため、低い多分散性と高い経時的コロイド安定性とを示した（図１及び図２）。ＱＳからの正電荷により、静電相互作用による低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）の負電荷との高い複合体形成効率が保証された。

さらに、組成物中にＤＣ－Ｃｈｏｌが多く存在するＱＳは、ｐＨに敏感な挙動を示し、酸性条件下でｐＨを一定に維持した。ＱＳ_４（（０％Ｃｈｏｌ／１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌ）：ＭＫＣ）の緩衝能力が最も高かった（図５）。

２．コロイド構造

２．１－水性媒体中にコレステロール、Ｃｈｏｌ－ＶＳ及びＣＴＡＢを含むコロイド構造

材料及び方法：
コレステン－３β－オール（Ｃｈｏｉ、純度９５％；＃Ａ０８０７）を、ＰａｎＲｅａｃ（Ｃａｓｔｅｌｌａｒ ｄｅｌＶａｌｌeｓ、スペイン）から入手した。

臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、分子生物学用ｕｌｔｒａ）をＦｌｕｋａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。コレスト－５－エン、３－［２－（エテニルスルホニル）エトキシ］－、（３ｂ）－（Ｃｈｏｌ－ＶＳ）を合成し、特性評価した。エタノールをＴｅｋｎｏｃｈｒｏｍａ（Ｓａｎｔ Ｃｕｇａｔ ｄｅｌ Ｖａｌｌeｓ、スペイン）から購入した。二酸化炭素（純度９９．９％）をＣａｒｂｕｒｏｓ Ｍｅｔaｌｉｃｏｓ Ｓ．Ａ．（Ｃｏｒｎｅｌｌa ｄｅ Ｌｌｏｂｒｅｇａｔ、スペイン）から購入した。すべての化学物質はさらに精製することなく使用され、すべての溶液は前処理されたＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｂeｒｉｃａ、マドリッド、スペイン）を使用して調製された。

コレスト－５－エン、３－［２－（エテニルスルホニル）エトキシ］－、（３β）－（Ｃｈｏｌ－ＶＳ）の合成

コレステロール（３００ｍｇ、０．７７ミリモル）のＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液に、ジビニルスルホン（０．１２ｍｌ、１．１６ミリモル）及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（９ｍｇ、０．０７７ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で１時間磁気的に撹拌した。次に、Ａｍｂｅｒｌｉｔａ ＩＲ １２０Ｈを添加し、磁気撹拌をさらに３０分間継続した。濾過後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物のＴＬＣはコレステロールの存在を示した。得られた粗製物に無水酢酸（８ｍｌ）及びピリジン（４ｍｌ）を加え、新しい反応混合物を室温で１６時間維持した。粗反応のアセチル化により、化合物Ｃｈｏｌ－ＶＳの分離が可能になった。減圧下での蒸発により粗製物が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（エテンヘキサン１：２）により精製して、化合物Ｃｈｏｌ－ＶＳを固体として得た（２０４ｍｇ、５２％）。

Ｍ．Ｐ．１３３～１３５°Ｃ；［α］_Ｄ－１９（ｃ１、クロロホルム）；ｖ_ｍａｘ（ＫＢｒ）／ｃｍ^－１：３４０９、１４６１、１３７３、１３１９、１１１５、及び１０５２；^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣＩ_３、４００ＭＨｚ）：δ６．７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１６．７及び９．９Ｈｚ）、６．４０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１６．７Ｈｚ）、６．０７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．９Ｈｚ）、５．３５（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．８８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、３．２３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、３．１９（ｍ、１Ｈ）、２．３５～１．８４（数ｍ、７Ｈ）、１．５６～０．９５（数ｍ、２１Ｈ）、０．９９（ｓ、３Ｈ）、０．９２（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、０．８６（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．６７（ｓ、３Ｈ）；^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３、１２５ＭＨｚ）：δ１４０．２、１３８．０、１２８．５、１２２．１、７９．８、６１．５、５６．７、５６．１、５５．４、５０．１、４２．３、３９．７、３９．５、３８．８、３７．０、３６．８、３６．２、３５．８、３１．９、３１．８、２８．２、２８．１、２８．０、２４．３、２３．８、２２．９、２２．５、２１．０、１９．３、１８．７、１１．８；Ｃ_３１Ｈ_５２Ｏ_３ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］^＋のＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）（ＦＡＢ＋）計算値：５２７．３５３５；実測値：５２７．３５３５。

コロイド構造の合成
コロイド構造（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：ＣＳ）を、Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ－ＶＳなどのステロールと、ＣＴＡＢなどの高い正電荷を持つ第四級アンモニウム界面活性剤とによって、ステロール（Ｃｈｏｉ＋Ｃｈｏｌ－ＶＳ）とＣＴＡＢ界面活性剤とのモル比１：１で構成した。

コロイド構造を、前述の方法（Ｆｅｒｒｅｒ－Ｔａｓｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１３ Ｊｕｎ ４；２９（２２）：６５１９－２８）を使用して調製した。簡単に説明すると、Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ－ＶＳなどのステロール又はその誘導体（表５を参照）を３０８ＫでＥｔＯＨに溶解した。次に、有機相を運転温度（Ｔｗ＝３０８Ｋ）及び大気圧で容器に添加した。次に、ＣＯ_２を添加して、高圧（Ｐｗ＝１０ＭＰａ）、３１１Ｋ、及び所定のＣＯ_２モル分率（ＸＣＯ_２＝０．８）で脂質の体積膨張溶液を得た。１時間の均質化後、このＣＯ_２膨張溶液を、非脂質陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢ（表５を参照）を含む連続水流中で、作動圧（Ｐｗ）から大気圧まで減圧し、ＣｈｏｉとＣｈｏｌ－ＶＳとの比率に応じて様々なコロイド構造を得た。

結果：
ＣＳ－ＶＳを、場合ごとにステロールと界面活性剤との組成を変えて調製した（ＣＳ－ＶＳ_０：（０％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／１００％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_１：（３２％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／６８％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_２：（４９％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／５１％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_３：（６６％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／３４％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_４：（７４％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／２６％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ；ＣＳ－ＶＳ_５（１００％Ｃｈｏｌ－ＶＳ／０％Ｃｈｏｌ）：ＣＴＡＢ。ＤＬＳ測定（表６を参照）及びクライオＴＥＭ画像（図６を参照）は、ビニルスルホンを有する新規コレステロール分子（Ｃｈｏｌ－ＶＳ）による、等モル混合物Ｃｈｏｌ：ＣＴＡＢ中でのコレステロール分子の漸進的置換の自己組織化が、異なるコロイド自己組織化挙動につながることを明らかにした。

一方では、ＱＳ－ＶＳ_２からＱＳ－ＶＳ_４までのＱＳ－ＶＳシステムのＤＬＳ測定は、大きな構造が存在するために品質基準を満たしていなかった。その上、すべてのクライオＴＥＭ画像は、主として薄いマイクロメートル長のリボン（ナノリボン）と少数の単層球形との共在を示した。一方、ＣｈｏｌをＣｈｏｌ－ＶＳ、ＣＳ－ＶＳ_５システムで完全に置換した場合のクライオＴＥＭ画像では、小胞状の集合体は形成されず、ナノリボン集合体のみが見つかった。

２．２－コレステロールとＭＫＣとを含むコロイド構造

このシステムを、１００％Ｃｈｏｌ／０％ＤＣ－Ｃｈｏｌ：ＭＫＣで構成し、１０％のＥｔＯＨを含むｍｉｌｌｉＱ純水でステロールと界面活性剤とのモル比１：１で調製した。

ＣＦを使用する方法でＣＳ－ＣＨを作成した（Ｆｅｒｒｅｒ－Ｔａｓｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１３ Ｊｕｎ ４；２９（２２）：６５１９－２８）。簡単に説明すると、ステロール（Ｃｈｏｌ）をＥｔＯＨ（Ｖ_ＥｔＯＨ）に３１３～３１８Ｋで１０分間溶解した。次に、有機相を運転温度（Ｔｗ＝３１１Ｋ）及び大気圧で容器に添加した。次に、ＣＯ_２を添加して、高圧（Ｐｗ＝１１．５ＭＰａ）、３１１Ｋ、及び所定のＣＯ_２モル分率（Ｘ_ＣＯ２＝０．６）で脂質の体積膨張溶液を得た。１時間の均質化後、このＣＯ_２膨張溶液を、非脂質陽イオン界面活性剤（すなわち、ＭＫＣ）（Ｖ_Ｈ２０＝８．３Ｖ_ＥｔＯＨ）を含む水溶液中で、作動圧（Ｐｗ）から大気圧まで減圧し、コロイド構造を得た。この方法を、連続モード又はバッチモードで実施した。ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法によるＣＳ－ＣＨシステムの調製に使用される組成物ＣＳ－ＣＨシステムの調製に使用された組成物は、有機相としてＥｔＯＨ中のＣｈｏｉ（０．０７０Ｍ）を有し、水相として水中のＭＫＣ（０．００８Ｍ）を有し、膜成分濃度は５．６ｍｇ／ｍＬであり、％Ｄ－Ｃｈｏｌ／（Ｃｈｏｌ＋Ｄ－Ｃｈｏｌ）は０％であった。

結果：
システムＣＳ－ＣＨはナノ小胞を形成しなかった。ＤＬＳ測定とクライオＴＥＭ画像（図６Ｃを参照）は、等モル混合物中でのＭＫＣによるコレステロール分子の自己組織化が異なるコロイド自己組織化挙動をもたらし、好ましくはナノリボンを形成することを明らかにした。ＣＳ－ＣＨシステムのＤＬＳ測定は、大きな構造が存在するために品質基準を満たしていなかった：流体力学的直径（Ｄ）（ｎｍ）、Ｄ＝１７４．３±３３．２；多分散性指数（Ｐｄｌ）＝０．５６±０．０９。その上、すべてのクライオＴＥＭ画像は、主として薄いマイクロメートル長のリボン（ナノリボン）と少数の単層球形との共在を示した。

実施例３：ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体形成

材料及び方法：
ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を、ＱＳ－ｓＲＮＡ添加量と呼ばれる様々なｓＲＮＡ対ＱＳ質量比（ｗ／ｗ）でＱＳと低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を混合することによって形成した。まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で、ＱＳをＤｅｐｃ処理水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；＃７５００２４）で希釈して、ＱＳ_０の場合は３．９８ｍｇ／ｍＬ、ＱＳ_１の場合は１．１５ｍｇ／ｍＬ、ＱＳ_２の場合は１．７６ｍｇ／ｍＬ、ＱＳ_３の場合は１．８８ｍｇ／ｍＬ、ＱＳ_４の場合は１．９９ｍｇ／ｍＬなどの目的の濃度を達成した。ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を形成するために、２．５μＬのｓＲＮＡを適切な体積（μＬ）のＱＳ溶液に加えて、目的のｓＲＮＡとＱＳとの質量比（ｗ／ｗ）とし、一定のｓＲＮＡ濃度を維持した（表７を参照）。ｓＲＮＡの一定の最終濃度（２．５μＭ）を達成するために、ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を目的の最終体積（２０μＬ）に達するまで１倍のＰＢＳで希釈し、次に上下に２回ピペッティングして混合した（５分未満のインキュベーション）。得られたＱＳ－ｓＲＮＡ複合体は、ＱＳの表面の正電荷とｓＲＮＡの負電荷との間のイオン相互作用によって生成された。ＱＳ組成に応じて、ＱＳ質量とｓＲＮＡ質量との様々なｓＲＮＡ対ＱＳ質量比（ｗ／ｗ）を計算した。

ゲル電気泳動：
アガロース電気泳動ゲルを、Ｔｒｉｓ／Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ（１倍のＴＡＥ）中の２．５％のアガロース及び０．００５％のエチジウムブロマイドで調製した。ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を調製し、５分間のインキュベーション後、複合体をＰＢＳ添加緩衝剤（２．５％のグリセロール）中のゲルの各ウェルに添加した。ｍｉＲＮＡをＱＳから分離するために、０．２５％のＳＤＳを特定のウェルに添加した。ゲル電気泳動を１２０Ｖで１時間行った。電気泳動画像を、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して取得した。

結果：
ＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体は、ＱＳ組成、及びＱＳとｍｉＲＮＡとの質量比に応じて様々な形態を示した。ＱＳ_０－２は、束構造を示すＱＳ_３－４よりも多くの多層構造を示した。一方、ｍｉＲＮＡ対ＱＳの質量比が高いと、ｍｉＲＮＡ対ＱＳの質量比が低い場合よりも凝集体が大きくなる（図７を参照）。

ＱＳ_０は、ＱＳあたりのｍｉＲＮＡの添加量が低い場合（（Ｉ及びＩＩなど）でも、１００％の効率でｍｉＲＮＡを複合化できなかった。複合体形成効率は、ＱＳのＤＣ－Ｃｈｏｌ組成の増加に正比例していた。したがって、ＱＳ_１（０％のＤＣ－Ｃｈｏｌ）は、ＱＳ_２－４よりも複合化効率が低かった。ただし、ＱＳ_２－４はＱＳ－ｍｉＲＮＡ（ＶＩ）の添加時にすでに１００％の複合体形成を示したが、ＱＳ_１ではＱＳ－ｍｉＲＮＡ（ＩＶ）の添加時に完全な複合体形成が見られた。

実施例４：細胞生存率の調査

材料及び方法：
細胞培養
ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）を、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（英国ソールズベリー）から入手し、液体窒素で保存した。蘇生後、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｐｒｅｍｉｕｍ、１％のインスリン－トランスフェリン－セレンサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５μｇ／ｍＬプラズモシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を添加したＩｓｃｏｖｅの改良ダルベッコ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で培養した。すべての培養物を、９５％空気及び５％ＣＯ_２の飽和雰囲気中で３７℃に維持した。ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、マイコプラズマ汚染について定期的にテストした。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞にＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を添加し、抗生物質を含まない完全な細胞培養培地（ＩＭＤＭ、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｐｒｅｍｉｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌe、フランス））へと逆トランスフェクトした。一晩（ｏ／ｎ）インキュベーションした後、培地を１０％ＦＢＳと抗生物質とを添加したＩＭＤＭに交換した。

細胞生存率アッセイ
ＱＳ又はＱＳ－ｍｉＲＮＡ複合体の細胞毒性をテストするために、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を９６ウェルプレートに１８×１０^３細胞／ウェル（６回／条件）で播種し、ＱＳ（０．７μｇ／ｍＬ～５２μｇ／ｍＬ；表８）で処理するか、又は、様々なｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（ＱＳ－ｍｉＲＮＡ添加量）（Ｉ～ＶＩＩＩ）でＱＳと複合体化させた２．５μＭのｍｉＲ－対照Ｄｙ５４７（表１に開示されているｅｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡ対照１と同じ配列を持つ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ（米国コロラド州ラファイエット））で逆トランスフェクトし、５０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度を達成した。

結果：
ＱＳ_１－４は、ＱＳ－ｍｉＲＮＡ（ＩＩＩ）などの低いｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（ＱＳ－ｍｉＲＮＡ添加量）でも、高い生存率（８０～９０％）を示した。ＱＳ_１－４－ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの負電荷によるＱＳからの正電荷の遮蔽により、複合体を形成していないＱＳ_１－４よりも高い生存率を示した（図９）。

実施例５：ＱＳを使用したｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの発現とＱＳの機能化

材料及び方法：
ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体の有効性アッセイでは、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を９６ウェルプレートに９×１０^３細胞／ウェル（６複製／条件）で播種し、５０ｎＭのｓＲＮＡ最終濃度で逆トランスフェクトした。ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を、実施例１で説明したように形成した。トランスフェクションの２４時間後又は９６時間後に、細胞を１％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定し、０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。結晶を１５％酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニューハンプシャー州ハンプトン）に溶解し、Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国バーモント州ウィヌースキ）を使用して５９０ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率に対するＱＳ－ｓＲＮＡ複合体の効果を、モック対照をトランスフェクトした細胞に対して正規化した。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｌａｓ Ｍａｔａｓ、スペイン）を使用して、ｓｍａｌｌＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ ＲＴキット（＃４３６６５９６；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｍＲＮＡを逆転写（０．５μｇトータルＲＮＡ）し、Ｔａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（＃４４４００４７；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元の推奨事項に従って使用して、成熟ｍｉＲＮＡ発現分析を定量化した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ７００ＳＤＳ装置を使用した２Ｘ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した標準的なＲＴ－ｑＰＣＲ手法によって定量化した。遺伝子発現を、ｍＲＮＡのＬ２７ハウスキーピング遺伝子及びｍｉＲＮＡ分析用のＲＮＵ－４４低分子ＲＮＡに対して正規化した（＃４４２７９７５）。プライマ配列をそれぞれ表９と表１０に示す。相対的な倍数変化遺伝子発現の相対的な定量化を、比較２^{（－ΔΔＣＴ）}法（Ｌｉｖａｋ ＫＪ、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５：４０２－４０８）を使用して実行した。

ＲＮＵ４４を、分析されたサンプルのｓｍａｌｌＲＮＡ含有量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子として共通に使用した。ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ及びＲＮＵ４４について製造元の指示に従って実行されたｑＰＣＲでは、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙは、ｃＤＮＡ合成中にｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ及びＲＮＵ４４に対して標的特異的なステムループプライマを使用して、リアルタイムＰＣＲ用のテンプレートを作成した）。

ウエスタンブロット
タンパク質抽出物を、１倍のＥＤＴＡフリーの完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｓａｎｔ ＣｕｇａｔｄｅｌＶａｌｌeｓ、スペイン）を添加した１倍のＲＩＰＡ緩衝剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得した。タンパク質濃度の定量化を、Ｌｏｗｒｙアッセイ（ＤＣタンパク質アッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。３０μｇのタンパク質を、１倍の添加緩衝剤及び１倍のサンプル還元剤を含む１倍のＲＩＰＡ緩衝剤で調製し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル電気泳動を１５０Ｖ、ＲＴで１時間行った。ゲルをｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｔａｃｋｓ ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１１０Ｖ、４℃で１時間３０分転写した。膜をブロッキング溶液（５％ウシ血清アルブミンを含むＴｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ））とともにＲＴで１時間インキュベートし、次に上述の一次抗体：抗ＣＣＮＤ１（１：１０００細胞シグナル伝達；ａｂ １３４１７５）、抗ＣＨＡＦ１Ａ（１：１０００細胞シグナル伝達；＃５４８０Ｓ）、ｐ２７（１：１０００細胞シグナル伝達；＃３６８６）及びリン酸化Ｒｂ（ｐＲＢ）（１：１０００細胞シグナル伝達；＃８５１６）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、膜を、ヤギで産生された抗ウサギＩｇＧ－ペルオキシダーゼ抗体（１：１０，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；＃Ａ０５４５）を含むペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに１時間３０分インキュベートした。抗アクチンＨＲＰ（１：４０，０００ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ｓｃ－１６１６）を添加対照として使用した。膜を、ＥＺ－ＥＣＬ化学発光検出キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を使用して最終的に現像した。ウエスタンブロットの定量化を、ｌｍａｇｅＪ３を使用して実行した。分析された各タンパク質バンド強度を、アクチンの強度に対して正規化した。

共焦点顕微鏡イメージング
ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、イメージングの４８時間前に８ウェルＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋチャンバスライドに播種した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）。細胞をＱＳ_４－Ｄｉｌ－ｍｉＲＮＡ（Ｃｙ５）複合体とともに３０分間インキュベートした後、内部移行していない複合体を除去するために細胞培地を交換した。使用したｍｉＲＮＡは、以前に使用したものと同じｍｉＲＮＡ 対照１であったが、機能化されており、ｍｉｃｒｏＲＮＡのセンス鎖の５’末端にＤｙ５４７の代わりにＣｙ５があった。ＱＳ_４－Ｄｉｌ（^ＤｉｌＱＳ_４）を、実施例１で前述したように形成した。共焦点画像を、ＬＳＭ８００顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用して、２分後、３０分後、又は一晩インキュベートの場合には指定された時刻に取得した。明視野画像を、４８８ｎｍレーザを使用して取得した。Ｄｉｌフルオロフォア及びＣｙ５フルオロフォアを、それぞれ５３０ｎｍ及び６３３ｎｍレーザを使用して励起し、これらの信号を、それぞれ５５０～６２０ｎｍ及び６４０～７５０ｎｍから収集した。Ｄｉｌ信号及びＣｙ５信号を、２つの異なるチャネルで収集し、これらの間のクロストークを除去する処理を行った。複合体の画像を処理して、ＦＲＥＴ比の経時変化を取得した。ＦＲＥＴ比グラフの場合、各システムを、トリプリケートでのテクニカルトリプリケートの平均±ＳＥＭとして表した。

統計分析
特に明記しない限り、数値は３回の独立した実験の平均の平均±ＳＥＭ値を表す。統計的有意性を、対応のない両側スチューデントのｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）によって測定した。^＊はｐ＜０．０５を意味し、^＊＊はｐ＜０．０１を意味し、^＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。

結果：
ｍｉＲＮＡ：
ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞でｍｉＲ－３２３ａの発現レベルを上げるには、ｍｉＲＮＡをＱＳシステムでトランスフェクトする必要があった。これは、ｍｉＲＮＡがネイキッドであるか、又はＭＫＣミセルと複合体を形成したｍｉＲＮＡがｑＰＣＲでｍｉＲＮＡの発現レベルを上げることができなかったためである（図１０）。

ｑＰＣＲ及びウエスタンブロットによるｍｉＲ－３２３ａ標的修飾（図１１～図１２）：ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐにＱＳ_４をトランスフェクトした場合にのみ、ＲＮＡレベル（図１１）及びタンパク質レベル（図１２）でのｍｉＲ－３２３ａ標的発現（ＣＨＡＦ１ Ａ及びＣＣＮＤ１）が減少した。ＱＳ_１－２はｍｉＲＮＡの内部移行を可能にしたが、ｍｉＲＮＡの放出は可能にしなかった。

ＱＳ_３では、ｍＲＮＡレベルでのｍｉＲ－３２３ａ標的発現（ＣＨＡＦ１Ａ及びＣＣＮＤ１）が減少した。ＱＳ_４は、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ標的をｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで一貫して修飾したが、ＱＳ_３は、ＱＳ_３－ｍｉＲＮＡ（ＶＩ）を添加すると、ｍＲＮＡでＣＨＡＦ１Ａ及びＣＣＮＤ１のみを減少させた。これらの結果は、ＱＳ_４と比較して、ＱＳ_３から放出されるｍｉＲＮＡでは、放出されるｍｉＲＮＡの量及び放出に要する時間が異なることによって説明される。ＱＳ_３－ｍｉＲＮＡ複合体では、ｍｉＲＮＡはＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ複合体よりも遅いペースで放出された（図１３を参照）。

ＱＳ－ｍｉＲ－３２３ａ複合体のトランスフェクションにより、ＱＳ_４にｍｉＲＮＡが高添加量（（Ｖ～ＶＩＩＩ））で存在する場合でもｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの発現レベルを増加させることができた（図１４）。ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ（Ｖ）及び（ＶＩ）などのｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（中程度の添加量）でＱＳ_４をトランスフェクトしたｍｉＲ－３２３ａ－５ｐは、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでのＣＣＮＤ１やＣＨＡＦ１Ａなどの直接ｍｉＲ－３２３ａ標的発現を修飾した。ただし、ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ（ＶＩＩＩ）などのｍｉＲＮＡとＱＳとの質量比（高添加量）では、ｍｉＲ－３２３ａ標的修飾はなかった。

さらに、ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ（Ｖ）や（ＶＩ）などの様々な添加量（ｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）でＱＳ_４をトランスフェクトしたｍｉＲ－３２３ａ－５ｐは、リン酸化Ｒｂ（ｐＲｂ）及びｐ２７などのｍｉＲ－３２３ａの間接標的を、ｍＲＮＡ（図１５）及びタンパク質レベルで修飾した（図１６Ａ、ＣＨＡＦ１Ａ；図１６Ｂ、ＣＣＮＤ１；図１６Ｃ、ｐＲｂ；図１６Ｄ、ｐ２７）。

ＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体の過剰発現は、ｍｉＲＮＡが（Ｖ）や（ＶＩ）などのｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（添加量）でＱＳ_４でトランスフェクトされた場合、９６時間後にＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞増殖を減少させた。（図１７）。

ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐが高い場合、ＣＣＮＤ１の発現が失われ、ｐＲＢがリン酸化されなかったため、細胞周期の進行が阻害された。さらに、ｐ２７レベルが増加し、ＣＤＫ４／６複合体の機能を阻害するのに役立った。

さらに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）と比較したＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体（ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ（Ｖ））でのトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞の増殖分析は、同様の結果（対照と比較してｐ＜０．００１^＊＊＊の減少）を示した。トランスフェクションの９６時間後にＮＢ細胞でＱＳ_４又はリポソーム（すなわちＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）と結合したｍｉＲ－３２３ａ－５ｐとｍｉＲ－対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った（図１８）。

ｓｉＲＮＡ：
（Ｖ）及び（ＶＩ）などの様々なＱＳ_４－ｓｉＲＮＡ添加量（ｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）でＱＳ_４をトランスフェクトしたｓｉＣＣＮＤ１は、ｍＲＮＡ（図１９）レベル及びタンパク質レベル（図２０Ａ）でＣＣＮＤ１発現を低下させた。ただし、添加量（ＶＩＩＩ）などの高ＱＳ_４－ｓｉＲＮＡ添加量（ｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）は、他の添加量ＱＳ_４－ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）（Ｖ）及び（ＶＩ）と同様にＣＣＮＤ１発現を低下させなかった。

さらに、添加量（ｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）（Ｖ）及び（ＶＩ）でＱＳ_４でトランスフェクトされたｓｉＣＣＮＤ１は、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで、ｐＲｂ及びｐ２７などのＣＣＮＤ１の間接標的を修飾した（それぞれ図２０Ｂ及び図２０Ｃを参照）。ＣＣＮＤ１の枯渇は、細胞増殖に対する一般的な影響だけでなく、リン酸化Ｒｂ（ｐＲｂ）レベルとｐ２７蓄積の減少とに対する、最良のｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ過剰発現を反映していた。

ＱＳ_４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体の過剰発現は、ＱＳ_４－ｓｉＲＮＡが添加量（ｓｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）（Ｖ）及び（ＶＩ）でトランスフェクトされた場合、９６時間後にＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞増殖を減少させた（図２１）。

さらに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）と比較したＱＳ_４－ｓｉＣＣＮＤ１複合体（ＱＳ_４－ｓｉＲＮＡ（Ｖ））でのトランスフェクション後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞の細胞増殖分析は、同様の結果（対照と比較してｐ＜０．００１^＊＊＊の減少）を示した。トランスフェクションの９６時間後にＮＢ細胞でＱＳ_４と複合体を形成したｓｉＣＣＮＤ１とｓｉ対照（５０ｎＭ）とを比較する増殖実験を行った（図２２）。

機能化研究：
実施例１で説明したように、ＱＳ_４をＤｉｌフルオロフォアで機能化するか、ナノ小胞膜のＤＣ－Ｃｈｏｌステロールの１０％をＣｈｏｌ－ＰＥＧ_１０００ポリマーに置き換えた。ＱＳ_４－Ｄｉｌ（^ＤｉｌＱＳ_４）及びＰＥＧ－ＱＳ_４機能化ＱＳは、同様のサイズ（３０～７０ｎｍ）、球形、コロイド安定性、及びＱＳ_４と同様の表面正電荷を示した（図２３を参照）。ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ及びＱＳ_４－（Ｄｉｌ）－ｍｉＲＮＡ複合体は、同じＱＳ対ｍｉＲＮＡ添加量で同様の形態を示した。

Ｄｉｌ／ＰＥＧ機能化の有無にかかわらず、ＱＳ_４は、^ＤｉｌＱＳ_４の場合の（ＶＩＩＩ）やＰＥＧ－ＱＳ_４の場合の（ＶＩ）などの高いｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比（添加量ＱＳ－ｍｉＲＮＡ）でも１００％の効率でｍｉＲＮＡの完全な複合体形成効率を示す。さらに、ＱＳ－ｍｉＲＮＡをＳＤＳで脱複合体化することにより、ＱＳからのｍｉＲＮＡの放出がほぼ１００％可能になった。

ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）生細胞の共焦点イメージングにより、ＱＳ_４－（Ｄｉｌ）－ｍｉＲ－対照（ｍｉＲ－対照１）複合体がＱＳ_４－（Ｄｉｌ）－ｍｉＲ－対照トランスフェクションの３０分後という短時間でＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞に内在化することが観察された。

ＦＲＥＴ比実験：ＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ複合体は、細胞培地での内在化時間の間安定したままであった。ｍｉＲＮＡ（Ｃｙ５）（ｍｉＲ－対照^ｃｙ５）及びＱＳ_４－Ｄｉｌは、ＱＳ_４－Ｄｉｌ－ｍｉＲＮＡ（Ｃｙ５）の付着により、高いＦＲＥＴ比効率を示す。

ｍｉＲＮＡは、細胞培地でゆっくりとしたペースで一晩インキュベートした後、^ＤｉｌＱＳ_３から放出されたが、ＱＳ_４からは２時間以内に放出された。ｍｉＲ－対照^Ｃｙ５及び^ＤｉｌＱＳ_４は、ｍｉＲ－対照^Ｃｙ５と^ＤｉｌＱＳ_４との分離により、低いＦＲＥＴ比効率を示した（図１３を参照）。

ｍｉＲＮＡは、細胞培地で一晩インキュベートした後、ＱＳ_４－Ｄｉｌから放出された。ｍｉＲＮＡ（Ｃｙ５）及びＱＳ_４－Ｄｉｌは、ｍｉＲＮＡ（Ｃｙ５）とＱＳ_４－Ｄｉｌとの分離により、低いＦＲＥＴ比効率を示した。

また、添加量（ＶＩ）での^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの過剰発現は、９６時間後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞増殖を、単純なＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐと同等又はそれ以上の効果で減少させた。

^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体及び単純なＱＳ_４－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ複合体でトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞の細胞増殖分析については、図２４を参照されたい。

ＱＳ_３－ｍｉＲＮＡ複合体とＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ複合体は、細胞の種類と細胞のコンフルエンスとに応じて、添加量（ｍｉＲＮＡ対ＱＳ質量比）（ＩＶ）から（ＶＩＩ）で機能する可能性がある。さらに、ＱＳ_３－ｍｉＲＮＡ複合体は、タンパク質レベルでｍｉＲＮＡ標的修飾を誘導するために４８時間以上、すなわち７２時間を必要とした。

実施例６：ＱＳ４複合体形成後のＲＮＡｓｅ Ａ分解からのｍｉＲＮＡ保護

材料及び方法：
前に説明したように、アガロース電気泳動ゲルとＱＳ_４－ｍｉＲＮＡ複合体とを調製した。ネイキッドｍｉＲＮＡと比較してｍｉＲＮＡをＲＮＡｓｅ Ａ分解から保護するＱＳの能力を確認するために、複合体（図２５；レーン５～８）とｍｉＲＮＡネイキッド（図２５；レーン９～１２）との両方を、３１０Ｋのウォーターバスで３０分、１時間、２時間及び４時間、２５μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ Ａで処理した。その後、選択した複合体（図２５；レーン４～８）とｍｉＲＮＡネイキッド（図２５；レーン９～１３）をＳＤＳ０．２５％で処理し、ＲＮＡｓｅ Ａによって分解されないｍｉＲＮＡの放出を確保した。次いで、すべての調製物をＰＢＳ添加緩衝剤（グリセロール０．００８％）中のゲルに添加した。最後に、ゲル電気泳動を行い、画像を撮影した。アガロースゲル実験を２回行い、代表的な画像を示す。

結果：
ＱＳ_４製剤は、超生理学的条件（＞１μｇ／ｍＬ）でのＲＮＡｓｅ Ａインキュベーションの４時間後に、リボヌクレアーゼ媒介分解からｍｉＲＮＡを保護する能力を示した（図２５）。ＳＤＳの添加後、ｍｉＲＮＡはＲＮＡｓｅ Ａによって分解されず、ＱＳ_４から放出され、アガロースゲルで検出されることができた。したがって、ＱＳ_４はｍｉＲ－３２３ａ－５ｐを分解から保護し（レーン５～８）、循環中の半減期が短いネイキッドｍｉＲＮＡ（３０分；レーン９～１２）と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ循環でのｍｉＲＮＡの半減期を延長する可能性がある。

実施例７：ｉｎ ｖｉｖｏ実験：異種移植片マウスモデルにおける^ＤｉｌＱＳ_４：ｍｉＲＮＡ複合体の組織生体内分布

材料及び方法：
ＱＳを、前のセクションで示したように調製した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を形成するために、適切な体積のＱＳ_４を新しいエッペンドルフに添加し、添加量（Ｖ）及び（ＶＩ）それぞれについて、２００μＬの各注射でＱＳ_４の最終濃度２．７ｍｇ／ｍＬ及び１．８ｍｇ／ｍＬを達成した。次に、４２．６μＬのｓＲＮＡを適切な体積（μＬ）のＱＳ溶液に加えて、目的のｓＲＮＡ対ＱＳ質量比（ｗ／ｗ）とし、一定のｓＲＮＡ濃度を維持した（表１１を参照）。ｓＲＮＡの一定の最終濃度（すなわち２１．３μＭ）を達成するために、ＱＳ－ｓＲＮＡ複合体を目的の最終体積（すなわち２００μＬ）に達するまで１倍のＰＢＳで希釈し、次に撹拌及び上下に２回ピペッティングすることにより激しく混合した（５分未満のインキュベーション）。得られたＱＳ－ｓＲＮＡ複合体は、ＱＳの表面の正電荷とｓＲＮＡの負電荷との間のイオン相互作用によって生成された。ＱＳ質量とｓＲＮＡ質量との様々なｓＲＮＡ対ＱＳ質量比（ｗ／ｗ）を計算した。

３００μＬのＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）中のＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞（５×１０^６）を、６～８週齢の雌の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウス（ｎ＝３マウス／条件）の右側腹部に注射した。腫瘍体積を２～３日ごとに測定した。腫瘍が約１００～２００ｍｍ^３になると、マウスを２つのグループにランダム化した。マウスに２ｍｇ／ＫｇのｍｉＲ－対照（ｎ＝３）又は^ＤｉｌＱＳ_４と結合したｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（ｎ＝３）を注射した。２４時間後、肝臓、肺、脳、脾臓、腎臓、腫瘍を摘出し、重量を測定した。組織をＢｅａｄ－Ｒｕｐｔｏｒ１２（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；米国ジョージア州）ホモジナイザ（速度５ｍＡで２０秒、完全に均質化するまで２～３サイクル）で均質化させ、前に説明したプロトコルを使用して全ＲＮＡを抽出した。成熟したｍｉＲＮＡ発現分析を、前に説明したようにｑＰＣＲによって定量化した。これらの結果を、３匹の独立したマウスの平均±ＳＥＭとしてプロットした。

結果：
^ＤｉｌＱＳ_４製剤は、マウスの肺、脾臓、腎臓、肝臓、皮下神経芽細胞腫の腫瘍で、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐの発現を、^ＤｉｌＱＳ_４－ｍｉＲ－対照と比較して、それぞれ１５０倍、６６０００倍、１５０００倍、５７０倍、１５０倍、１２５倍に増加させる能力を示した（図２６を参照）。

毒性の肉眼的兆候も有害な副作用も観察されなかった。

引用文献
特許文献
WO2006079889
WO2017147407
非特許文献
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Grimaldi N. et al. Chem Soc Rev 2016, 45:6520-6545.
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Danaei, M.; et al. “Impact of Particle Size and Polydispersity Indexon the Clinical Applications of Lipidic Nanocarrier Systems” Pharmaceutics2018, 10, 57.

完全を期すために、本願発明の種々の面を以下の番号の項に提示する。
第１項．ステロールと非脂質カチオン性界面活性剤とを含み、前記ステロールはＤＣ－コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含む、ナノ小胞。
第２項．前記非脂質カチオン性界面活性剤は第四級アンモニウム型である、第１項に記載のナノ小胞。
第３項．前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤は、塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、メンゼトニウムクロリド（ＢＺＴ）、ステアラルコニウムクロリド、セトリミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、第２項に記載のナノ小胞。
第４項．前記ナノ小胞は、前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤がＭＫＣであり、前記ステロールが１００％ＤＣ－Ｃｈｏｌであり、これらのモル比が好ましくは１：１であるクアトソームである、第３項に記載のナノ小胞。
第５項．球形であり、単層であり、均一なサイズであり、安定である、第１項から第４項のいずれか一項に記載のナノ小胞。
第６項．核酸、好ましくはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを含む、第１項から第５項のいずれか一項に記載のナノ小胞。
第７項．前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７、ｈａｓ－ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２－５ｐ、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択されるか、あるいは、前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＣＣＮＤ１、ｓｉＣＨＡＦ１Ａ、ｓｉｌＮＣＥＮＰ、ｓｉＫＩＦ１１、ｓｉＣＤＣ２５Ａ、ｓｉＦＡＤＤ、ｓｉＢＣＬ－ＸＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、第６項に記載のナノ小胞。
第８項．フルオロフォア、ペプチド、ポリマー、無機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体又は抗体の断片、抗原、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される要素にさらに結合する、第６項又は第７項に記載のナノ小胞。
第９項．治療上有効量の第１項から第８項のいずれか一項に記載のナノ小胞と、薬学的に許容可能な賦形剤又はビヒクルとを含む医薬組成物。
第１０項．送達システムとしての第１項から第８項のいずれか一項に記載のナノ小胞又は第９項に記載の医薬組成物。
第１１項．薬剤として使用するための第１項から第８項のいずれか一項に記載のナノ小胞又は第９項に記載の医薬組成物。
第１２項．ヒトの疾患の治療、好ましくは癌の治療に使用するための、第１項から第８項のいずれか一項に記載のナノ小胞又は第９項に記載の医薬組成物。
第１３項．前記癌は神経芽細胞腫である、第１２項に記載の使用のためのナノ小胞又は医薬組成物。
第１４項．第１項から第８項のいずれか一項に記載のナノ小胞のバイオイメージングツールとしての使用。
第１５項．ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して第１項から第８項のいずれかに記載のナノ小胞を製造するためのプロセス。

Claims (20)

1. ステロールと非脂質カチオン性界面活性剤とを含み、前記ステロールはＤＣ－コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含み、前記ステロールに対するＤＣ－Ｃｈｏｌのパーセンテージが少なくとも４７モル％である、ナノ小胞。
2. 前記ナノ小胞は非リポソームナノ小胞である、請求項１に記載のナノ小胞。
3. 前記ステロールは、ＤＣ－Ｃｈｏｌとコレステロールとの混合物、あるいは、ＤＣ－ｃｈｏｌとコレステロール誘導体との混合物である、請求項１又は２に記載のナノ小胞。
4. 前記コレステロール誘導体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項３に記載のナノ小胞。
5. 前記非脂質カチオン性界面活性剤は第四級アンモニウム型である、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノ小胞。
6. 前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤は、塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、メンゼトニウムクロリド（ＢＺＴ）、ステアラルコニウムクロリド、セトリミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、請求項５に記載のナノ小胞。
7. 前記ナノ小胞は、前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤がＭＫＣ又はＣＴＡＢであるクアトソームである、請求項６に記載のナノ小胞。
8. 前記ナノ小胞は、前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤がＭＫＣであり、前記ステロールが１００モル％ＤＣ－Ｃｈｏｌであるクアトソームである、請求項７に記載のナノ小胞。
9. 球形であり、単層であり、均一なサイズであり、安定である、請求項１から８のいずれか一項に記載のナノ小胞。
10. 前記ナノ小胞は、平均直径が３００ｎｍ未満であり、多分散性指数（ＰＤＩ）が０．１～０．３であり、少なくとも２か月まで安定である、請求項９に記載のナノ小胞。
11. 核酸を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のナノ小胞。
12. 前記核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び／又はｓｈＲＮＡである、請求項１１に記載のナノ小胞
13. 前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７、ｈａｓ－ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９１３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２－５ｐ、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択されるか、あるいは、前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＣＣＮＤ１、ｓｉＣＨＡＦ１Ａ、ｓｉｌＮＣＥＮＰ、ｓｉＫＩＦ１１、ｓｉＣＤＣ２５Ａ、ｓｉＦＡＤＤ、ｓｉＢＣＬ－ＸＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、請求項１２に記載のナノ小胞。
14. フルオロフォア、ペプチド、ポリマー、無機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、酵素、抗体又は抗体の断片、抗原、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される要素にさらに結合する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
15. 治療上有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載のナノ小胞と、薬学的に許容可能な賦形剤又はビヒクルとを含む医薬組成物。
16. 送達システムとしての請求項１から１４のいずれか一項に記載のナノ小胞又は請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 薬剤として使用するための請求項１から１４のいずれか一項に記載のナノ小胞又は請求項１５に記載の医薬組成物。
18. ヒトの疾患の治療に使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のナノ小胞又は請求項１５に記載の医薬組成物。
19. 前記ヒトの疾患が癌である、請求項１８に記載のナノ小胞又は医薬組成物。
20. ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して請求項１から１４のいずれかに記載のナノ小胞を製造する方法。