JP7775358B2 - 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質 - Google Patents

Description

本出願は、２０１６年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／３３９，６８２号の利益を主張するものであり、この文献は参照によって全体として本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年５月１８日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７－７０３＿６０１＿ＳＥＱ．ｔｘｔのファイル名であり、２２，２１８バイトのサイズである。

引用による組み込み
本明細書で言及される公開物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の公開物、特許あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるべく具体的かつ個々に指示されるかのように、および、その全体にわたって、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

アルブミンは最も豊富な血漿タンパクであり、高溶解性であり、非常に安定していて、かつ、非常に長い循環型半減期を有している。アルブミンは、治療分子の循環型半減期を増加させる様々な方法で使用することができる。本開示は、治療分子の半減期を延長させるために使用可能な単一ドメインアルブミン結合タンパク質を提供する。

１つの実施形態では、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＦＧＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）に記載される通りであり、Ｘ_１はトレオニン、アルギニン、リジン、セリン、またはプロリンであり、Ｘ_２はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘ_３はセリン、アルギニン、またはリジンであり、Ｘ_４はセリン、リジン、アルギニン、またはアラニンであり；（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＩＳＧＳＧＸ_５Ｘ_６ＴＬＹＡＸ_７ＳＸ_８Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）で記載される通りであり、Ｘ_５はセリン、アルギニン、トレオニン、またはアラニンであり、Ｘ_６はアスパラギン酸、ヒスチジン、バリン、またはトレオニンであり、Ｘ_７はアスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、またはセリンであり、Ｘ_８はバリンまたはロイシンであり；および、（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＧＧＳＬＸ_９Ｘ_１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）で記載される通りであり、Ｘ_９はセリン、アルギニン、トレオニン、またはリジンであり、Ｘ_１０はアルギニン、リジン、バリン、プロリン、またはアスパラギンであり、ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０はそれぞれ同時にトレオニン、フェニルアラニン、セリン、セリン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、バリン、セリン、およびアルギニンではない。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、以下の式：ｆ１－ｒ１－ｆ２－ｒ２－ｆ３－ｒ３－ｆ４を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２であり、および、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３であり、ここで、ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３、およびｆ_４は、上記のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で記載されるアミノ酸配列に少なくとも８０パーセント同一であるように、選択されたフレームワーク残基である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７を含み、およびｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６を含み、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４を含み、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９を含み、およびｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ここで、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５を含み、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２を含み、およびｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７から選択されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として記載されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、およびマウス血清アルブミンから選択された血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、同等の結合親和性（Ｋｄ）を有するヒト血清アルブミンとカニクイザル血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ヒトとカニクイザルの血清アルブミンに対する上記タンパク質の結合親和性（Ｋｄ）よりも約１．５倍～約２０倍弱い結合親和性（Ｋｄ）を有するマウス血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、約１ｎＭ～約１００ｎＭ間のヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒト血清アルブミンに結合し、１ｎＭ～１００ｎＭ間のカニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザル血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、１ｎＭと約５ｎＭ、または約５ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約４ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、または約９ｎＭ～約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄの間の比率（ｈＫｄ：ｃＫｄ）は、約２０：１～約１：２に及ぶ。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約５ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４として記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、少なくとも１２時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、または少なくとも１００時間の消失半減期を含む。

別の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載された配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでいる単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質が提供され、ここで、ＣＤＲ１のアミノ酸位置２８、２９、３０、または３１；ＣＤＲ２の位置５６、５７、６２、または６４；あるいは、ＣＤＲ３の位置１０３、および１０４から選択された１つ以上のアミノ酸残基が置換され、ここで、アミノ酸位置２８はアルギニン、リジン、セリン、またはプロリンで置換され、アミノ酸位置２９はチロシンで置換され、アミノ酸位置３０はアルギニンまたはリジンで置換され、アミノ酸位置３１はリジン、アルギニン、またはアラニンで置換され、アミノ酸位置５６はアルギニン、トレオニン、またはアラニンで置換され、アミノ酸位置５７はヒスチジン、バリン、またはトレオニンで置換され、アミノ酸位置６２はヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、またはセリンで置換され、アミノ酸位置６４はロイシンで置換され、アミノ酸位置１０３はアルギニン、トレオニン、またはリジンで置換され、アミノ酸位置１０４はリジン、バリン、プロリン、またはアスパラギンで置換される。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合は、位置２８、２９、３０、３１、５６、５７、６２、６４、１０３、および１０４以外のアミノ酸位置で１つ以上の追加の置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置２９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置５６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置６２における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置６４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１および６２における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置３１がアルギニンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置３１がアルギニンで置換され、アミノ酸位置６２がグルタミン酸で置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１、５６、６４、および１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、位置３１がリジンで置換され、アミノ酸位置５６がアラニンで置換され、アミノ酸位置６４がロイシンで置換され、アミノ酸位置１０４がリジンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置２９と１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置２９がチロシンで置換され、アミノ酸位置１０４がリジンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１および５６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１がリジンで置換され、アミノ酸位置５６がトレオニンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１、５６、および６２における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１がリジンで置換され、アミノ酸位置５６がトレオニンで置換され、アミノ酸位置６２がグルタミン酸で置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１および１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１がアルギニンで置換され、アミノ酸位置１０４がリジンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１、５６、および１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１がリジンで置換され、アミノ酸位置５６がアルギニンで置換され、アミノ酸位置１０４がバリンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１、５６、６２、および１０４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、アミノ酸位置３１がリジンで置換され、アミノ酸位置５６がアルギニンで置換され、アミノ酸位置６２がグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置１０４がバリンで置換されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアルギニンで置換され、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアルギニンで置換され、アミノ酸位置６２はグルタミン酸で置換され、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はリジンで置換され、アミノ酸位置５６はアラニンで置換され、アミノ酸位置６４はロイシンで置換され、アミノ酸位置１０４はリジンで置換され、および、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置２９はチロシンで置換され、アミノ酸位置１０４はリジンで置換され、およびｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はリジンで置換され、アミノ酸位置５６はトレオニンで置換され、および単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミンはアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はリジンで置換され、アミノ酸位置５６はトレオニンで置換され、アミノ酸位置６２はグルタミン酸で置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアルギニンで置換され、アミノ酸位置１０４はリジンで置換され、および単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約５ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はリジンで置換され、アミノ酸位置５６はアルギニンで置換され、アミノ酸位置１０４はバリンで置換され、および単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はリジンで置換され、アミノ酸位置５６はアルギニンで置換され、アミノ酸位置６２はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置１０４はバリンで置換され、および、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。

別の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３中に少なくとも１つの突然変異を含む単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で記載される通りの配列を含み、ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で記載される通りの配列を含み、ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で記載される通りの配列を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸位置１、２、７、８、９、または１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の位置１、３、６、１０、または１１、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の位置１または２にはない。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の位置３、４、５、および６、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７、８、１３、および１５、ならびにＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置５および６から選択されたアミノ酸位置で少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の位置３、４、５、および６、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７、８、１３、および１５、ならびにＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置５および６以外のアミノ酸位置において１つ以上の追加の置換を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６における突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６と、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置１３において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１５、ならびにＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置４と、ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６と、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６と、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１３において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６と、ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７、ならびにＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１３、ならびにＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６において突然変異を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はアルギニンに突然変異し、および単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はアルギニンに突然変異し、およびＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置１３はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１５はアラニンとロイシンにそれぞれ突然変異し、ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置４はチロシンに突然変異し、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、およびＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７はトレオニンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１３はトレオニンとグルタミン酸にそれぞれ突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はアルギニンに突然変異し、ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約５ｎＭと約１２ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７はアルギニンに突然変異し、ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６はバリンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はアミノ酸配列を含み、ここで、ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）のアミノ酸位置６はリジンに突然変異し、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸位置７および１３はアルギニンとグルタミン酸にそれぞれ突然変異し、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸位置６はバリンに突然変異し、ならびに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。

別の実施形態では、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供される。さらなる実施形態は、本明細書に開示されるようなポリヌクレオチドを含むベクターを記載している。別の実施形態は、本開示に係るベクターで形質転換された宿主細胞を記載している。１つの実施形態では、（ｉ）本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、本開示に係るポリヌクレオチド、本開示に係るベクター、または本開示に係る宿主細胞、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。

別の実施形態では、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の産生のためのプロセスが本明細書に記載され、上記プロセスは、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主を培養すること、および、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製することを含む。

本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の被験体への投与を含む、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病の処置または改善のための方法がさらに記載されている。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、方法はさらに、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を含む。

別の実施形態では、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性の結合タンパク質が記載されている。別の実施形態では、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む抗体が記載されている。

さらなる実施形態は、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む、多特異性抗体、二重特異性抗体、ｓｄＡｂ、可変重鎖ドメイン、ペプチド、またはリガンドについて記載している。１つの実施形態では、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む抗体が提供され、ここで、上記抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体はＩｇＧの重鎖可変領域に由来する。

１つの実施形態は、本開示に係る単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質とＣＤ３結合ドメインを含む多特異性の結合タンパク質または抗体について記載している。１つの実施形態では、本開示に係る多特異性抗体の被験体への投与を含む、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病の処置または改善のための方法が記載されている。

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
ＨＳＡ抗原とＣＤ３抗原へのＥＬＩＳＡ滴定によって決定されるような親の抗ＨＳＡファージの特異的結合を例証する。 ＥＬＩＳＡ滴定によって決定されるようなヒト、カニクイザル、およびマウスの血清アルブミンに対する抗ＨＳＡファージの交差反応性を例証する。 精製されたｓｄＡｂを使用して、より正確なＫｄ決定のために選択された９つのクローンの結合親和性プロフィールを提供する。 複数の抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ変異体のための疎水性の曝露（Ｔ_ｈ°Ｃ）の温度を例証する。 低いｐＨで二量体対単量体を形成するための、複数の抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ変異体の傾向を例証する。

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されているが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されることもあることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

特定の定義
本明細書で使用される用語は、特定のケースのみを記載することを目的としており、本発明を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、または、その変異形が発明を実施するための形態および／または請求項のいずれかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語に類似する手法で包括的であることを意図している。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは部分的には、その値がどのように測定または決定されるかに、例えば、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」とは、任意の値での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、特段の定めのない限り、「約」との用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものであると仮定されなければならない。

用語「個体」、「患者」、または「被験体」は交換可能に使用される。いかなる用語も、医療従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況を必要とせず、かつ、該状況に限定されない。

用語「フレームワーク」または「ＦＲ」残基（または領域）は、本明細書に定義されるようなＣＤＲまたは超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。

本明細書で使用されるように、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原について各々の特定の抗体の結合と特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、β－シート構造を接続する、場合によってはβ－シート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続された、β－シート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。「Ｋａｂａｔでのような可変ドメイン残基の番号付け」あるいは「Ｋａｂａｔでのようなアミノ酸位置の番号付け」、およびその変更形態は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖変数ドメインあるいは軽鎖変数ドメインのために使用された番号づけ方式を参照する。この番号付け方式を使用して、実際の線形のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含むことがある。残基のＫａｂａｔの番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔの番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同領域での整列によって任意の抗体について決定されることがある。本開示のＣＤＲはＫａｂａｔの番号付けの慣習に必ず対応するということを意図するものではない。

本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」との用語は、配列を整列させ、ギャップを導入して、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成した後に、かつ、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換を考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている利用可能なコンピューター・ソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長にわたって最大限の整列を達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。

本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２１－２５（Ａｌｆｒｅｄ Ｇｏｏｄｍａｎ Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ Ａｌｆｒｅｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ ｅｄ．１９８０）に記載されるように、通常の意味で使用される。簡潔に言えば、この用語は、薬物排泄の時間的経過の定量的測度を包含することを目的としている。薬物濃度が消失プロセスの飽和に必要とされる濃度には通常接近しないので、ほとんどの医薬品の消失は指数関数的である（つまり、一次速度論に従う）。指数関数的なプロセスの速度は、１単位時間当たりの僅かな変化を表現するその速度定数ｋによって、あるいは、そのプロセスの５０％の完成のために必要とされる時間であるその半減時間ｔ１／２によって、表現されることがある。これらの２つの定数の単位はそれぞれｔｉｍｅ－１とｔｉｍｅである。反応の一次速度定数と半減時間は、単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、これに応じて交換されることがある。一次消失動力学は一定の比率の薬物が単位時間ごとに失われるように指令を出すため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初回の分布相の後（つまり、薬物の吸収と分布が完了している後）は常に線形である。薬物排泄のための半減時間はこうしたグラフから正確に決定することができる。

本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、それらの結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して発現される。２つ以上のタンパク質が、それらの結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に相当する。いくつかの実施形態では、「Ｋｄ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）を使用して放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）または表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。ある実施形態では、「ｏｎ－ｒａｔｅ」あるいは「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎまたはａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」あるいは「ｋｏｎ」、および「オフ率」あるいは「解離速度（ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」、または「ｋｏｆｆ」もＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴技術で決定される。追加の実施形態では、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、および「ｋｏｆｆ」は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システムズ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。

単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、医薬組成物、同様に、そのような単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を作るための核酸、組み換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書に記載されている。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を使用する方法も提供される。単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は血清アルブミンに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、他の標的抗原に関する結合ドメインと同様に、ＣＤ３結合ドメインなどの追加のドメインも含む。

＜単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質＞
単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質が本明細書で企図されている。血清アルブミンは肝臓によって生成され、血漿中に溶解して生じ、哺乳動物で最も豊富な血液タンパク質である。アルブミンは、血管と体内組織との間の体液の適切な分布に必要とされる膠質浸透圧の維持にとって不可欠であり；アルブミンなしでは、血管中の高い圧力はより多くの流体を組織へと送り込む。それはさらに、いくつかの疎水性のステロイドホルモンと非特異的に結合することによって血漿担体として、およびヘミンと脂肪酸のための輸送タンパク質として作用する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量～６７ｋＤａ）は、血漿中の最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトでは約２０日の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、コロイド状の血圧に貢献し、多くの代謝産物と脂肪酸の担体として機能し、および、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はカニクイザルからの血清アルブミンタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はＨＳＡとカニクイザルからの血清アルブミンタンパク質とに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はさらに、マウス血清アルブミンタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、マウス血清アルブミンへの結合親和性は、ヒトまたはカニクイザルの血清アルブミンに対する親和性よりも約１．５～約２０倍弱い。

アルブミンとの非共有会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延長する。例えば、ＦＡｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、ＦＡｂフラグメントのみの投与と比較して、マウスとウサギの静脈内にそれぞれ投与されたとき、２５倍と５８倍のインビトロクリアランスの減少、および、２６倍と３７倍の半減期延長を引き起こした。別の例において、インスリンがアルブミンとの会合を促進するために脂肪酸でアシル化されるとき、ウサギまたはブタに皮下注射された時に長期的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続的な作用／血清の半減期との間の関連性を実証するものである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、血清アルブミンに特異的な、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体、ペプチド、リガンド、または小分子実体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＨＳＡに特異的な、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体、ペプチド、リガンド、または小分子実体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の血清アルブミン結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、血清アルブミンに結合するあらゆるドメインである。ある実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、血清アルブミン結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは小分子である。単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はかなり小さく、いくつかの実施形態では、せいぜい２５ｋＤ、せいぜい２０ｋＤ、せいぜい１５ｋＤ、または、せいぜい１０ｋＤであることが企図される。ある例では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質結合は、ペプチドまたは小分子実体であれば、５ｋＤ以下である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質自体の変更された薬動力学と薬物動態学をもたらす半減期延長ドメインである。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはさらに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の組織分布、浸透、および拡散の変質を含む薬力学的な特性を変更する。いくつかの実施形態において、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織分布、組織浸透、組織内での拡散、増強した有効性をもたらす。１つの実施形態では、治療方法は、量を減少させた単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を有効かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の減少などの副作用の減少をもたらす。

さらに、その結合標的に対する単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の結合親和性は、特定の単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質中の特定の消失半減期を標的とするように選択することができる。したがって、いくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はその結合標的に対して高い結合親和性を有する。他の実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はその結合標的に対して中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はその結合標的に対して低いまたは中程度の結合親和性を有する。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高い）の、１０ｎＭ～１００ｎＭの間（中程度）の、および１００ｎＭを超える（低い）Ｋｄを含む。上記のように、結合標的に対する単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質への結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。

ある実施形態では、本明細書に開示された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するＨＳＡに結合する。ある実施形態では、本明細書に開示された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザル血清アルブミンに結合する。ある実施形態では、本明細書に開示された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザル血清アルブミンと、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するＨＳＡとに結合する。いくつかの実施形態において、ｈＫｄは１ｎＭ～１００ｎＭの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、ｈＫｄは１ｎＭ～１０ｎＭの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、ｃＫｄは１ｎＭ～１００ｎＭの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、ｃＫｄは１ｎＭ～１０ｎＭの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、ｈＫｄとｃＫｄの範囲は、約１ｎＭと約５ｎＭ、あるいは約５ｎＭと１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、およびマウス血清アルブミンから選択された血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、同等の結合親和性（Ｋｄ）を有するヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、およびマウス血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、約１ｎＭ～約１０ｎＭ間のヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒト血清アルブミンに結合し、約１ｎＭ～約１０ｎＭ間のカニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザル血清アルブミンに結合する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、約１０ｎＭと約５０ｎＭの間のマウスＫｄ（ｍＫｄ）を有するマウス血清アルブミンに結合する。

いくつかの実施形態において、ｈＫｄは、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、約２ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．２ｎＭ、約２．３ｎＭ、約２．４ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．６ｎＭ、約２．７ｎＭ、約２．８ｎＭ、約２．９ｎＭ、約３ｎＭ、約３．１ｎＭ、約３．２ｎＭ、約３．３ｎＭ、約３．４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３．６ｎＭ、約３．７ｎＭ、約３．８ｎＭ、約３．９ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９．０ｎＭ、約９．５ｎＭ、または約１０ｎＭである。

いくつかの実施形態において、ｃＫｄは、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、約２ｎＭ、約２．１ｎＭ、約２．２ｎＭ、約２．３ｎＭ、約２．４ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２．６ｎＭ、約２．７ｎＭ、約２．８ｎＭ、約２．９ｎＭ、約３ｎＭ、約３．１ｎＭ、約３．２ｎＭ、約３．３ｎＭ、約３．４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３．６ｎＭ、約３．７ｎＭ、約３．８ｎＭ、約３．９ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９．０ｎＭ、約９．５ｎＭ、または約１０ｎＭである。

いくつかの実施形態において、ｍＫｄは、約１０ｎＭ、約１１ｎＭ、約１２ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭ、約１５ｎＭ、約１６ｎＭ、約１７ｎＭ、約１８ｎＭ、約１９ｎＭ、約２０ｎＭ、約２１ｎＭ、約２２ｎＭ、約２３ｎＭ、約２４ｎＭ、約２５ｎＭ、約２６ｎＭ、約２７ｎＭ、約２８ｎＭ、約２９ｎＭ、約３０ｎＭ、約３１ｎＭ、約３２ｎＭ、約３３ｎＭ、約３４ｎＭ、約３５ｎＭ、約３６ｎＭ、約３７ｎＭ、約３８ｎＭ、約３９ｎＭ、約４０ｎＭ、約４１ｎＭ、約４２ｎＭ、約４３ｎＭ、約４４ｎＭ、約４５ｎＭ、約４６ｎＭ、約４７ｎＭ、約４８ｎＭ、または約５０ｎＭである。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７から選択されたアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約２．３ｎＭであり、ｃＫｄは約２．４ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約２．１ｎＭであり、ｃＫｄは約２．２ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約１．９ｎＭであり、ｃＫｄは約１．７ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約３．２ｎＭであり、ｃＫｄは約３．６ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約２．７ｎＭであり、ｃＫｄは約２．６ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約２．１ｎＭであり、ｃＫｄは約２ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄとｃＫｄは約５ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、ｈＫｄは約６ｎＭであり、ｃＫｄは約７．５ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約２．２ｎＭであり、ｃＫｄは約２．３ｎＭである。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１．６ｎＭであり、ｃＫｄは約１．６ｎＭである。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４として記載されるアミノ酸配列を有し、約１７ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として記載されるアミノ酸配列を有し、約１２ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として記載されるアミノ酸配列を有し、約３３ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として記載されるアミノ酸配列を有し、約１４ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、約１６ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として記載されるアミノ酸配列を有し、約１７ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６として記載されるアミノ酸配列を有し、約１７ｎＭのｍＫｄを有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７として記載されるアミノ酸配列を有し、約１６ｎＭのｍＫｄを有する。

いくつかの実施形態において、ｈＫｄとｃＫｄとの間の比率（ｈＫｄ：ｃＫｄ）は約２０：１～約１：２に及ぶ。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、または少なくとも１００時間の消失半減期を有する。

＜ＣＤ３結合ドメイン＞
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体によって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。Ｔ細胞受容体複合体を含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、Ｔ細胞受容体複合体のα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と会合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。

一態様では、本開示に従って単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ヒトのＣＤ３に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインをさらに含む。

さらなる実施形態では、多特異性タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖に特異的に結合するドメインをさらに含む。

ある実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。例によっては、多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差的に反応する。ある例では、ＣＤ３結合のヒトＫＤ：カニクイザルＫＤ（ｈＫｄ：ｃＫｄ）の比率は、２０：１と１：２との間である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などのＣＤ３結合抗体の抗原結合性フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲから構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、ならびに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体、からのドメインを含む、ＣＤ３に結合する任意のドメインであり得る。いくつかの例において、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含めることが、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。

したがって、１つの態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはヒト抗体または抗体フラグメント、あるいはマウスの抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載された、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの、１つ以上（例えば３つすべて）の、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、および／または本明細書に記載された、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの、１つ以上（例えば３つすべて）の、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含み、それは、例えば、１つ以上の、例えば３つすべてのＬＣ ＣＤＲ、および１つ以上の、例えば３すべてのＨＣ ＣＤＲを含む、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域はヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒトあるいはヒト以外の軽鎖ＣＤＲを含む。ある例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。

いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域中のヒトまたはヒト以外の重鎖ＣＤＲを含む。

ある例では、重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、ＴＲ－６６あるいはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、およびＷＴ－３１などの、既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。

ＣＤ３に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの；ＣＤ３に結合する、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質自体、またはそのＣＤ３結合ドメインの能力によって決定することができる。ＣＤ３に対する本開示に従う、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質自体、もしくはそのＣＤ３結合ドメインの結合能力は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）、または前記多特異性タンパク質自体もしくはそのＣＤ３結合ドメインを固定することによりアッセイ可能である。薬剤は、所定の温度で一定の期間インキュベートされた適切な緩衝液と結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高いｐＨの緩衝液などで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。

＜標的抗原結合ドメイン＞
記載された血清アルブミン結合およびＣＤ３ドメインに加えて、本明細書に記載される、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、ある実施形態において、標的抗原に結合するドメインも含む。標的抗原は疾患、障害、または疾病に関与する、おより／または関連している。特に、標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患に関連する。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍細胞上で発現された腫瘍抗原である。代替的に、いくつかの実施形態では、標的抗原はウイルスまたは細菌などの病原体に関連する。

いくつかの実施形態において、標的抗原はタンパク質、脂質、または多糖類などの細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷を受けた赤血球、動脈のプラーク細胞、または繊維性の組織細胞である。

本開示に従って単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質のデザインは、標的抗原に対する結合ドメインが、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む任意のタイプの結合ドメインであり得るという点で、結合ドメインを標的抗原に対して柔軟なものとする。いくつかの実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、つまり、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチドおよびモノボディなどの抗体模倣薬である。さらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に結合または会合するリガンドまたはペプチドである。またさらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインはノッチンである。またさらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは小分子実体である。

＜単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の修飾＞
本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物で融合され、または、（ｉｉｉ）リーダーまたは分泌配列、あるいは、免疫原ドメインを遮断するための、および／または、タンパク質の精製のための配列などの追加のアミノ酸がタンパク質に融合される、誘導体またはアナログを包含する。

典型的な修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドあるいはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の添加、およびユビキチン化が挙げられる。

修飾は、３結合タンパク質が、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル終端を含む、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のいかなる場所でも行われる。単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の修飾に役立つ特定の共通したペプチド修飾は、共有結合修飾とＡＤＰリボシル化による、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、ポリペプチド中のアミノ基もしくはカルボキシル基の遮断、またはその両方を含む。

＜単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド＞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。

ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーによって分離されるか、または、他の実施形態ではペプチド結合によって直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を組み合わせて、適切なプロモーター、および随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に連結された単一の遺伝子構築物にして、および、細菌または例えば、ＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系でそれを発現するなどの既知の方法によって構築される。

いくつかの実施形態では、本開示に従って単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も、提供される。いくつかの実施形態では、前記多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ＣＤ３結合ドメインのためのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、標的抗原結合ドメインのためのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ＣＤ３結合ドメインおよび標的抗原結合ドメインのためのコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。標的抗原結合ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、血清アルブミン結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３と標的抗原とに結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されるベクター系と宿主に依存して、任意の数の適切な転写、および構成的で誘導可能なプロモーターを含む翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターはそれぞれの宿主細胞でポリヌクレオチドの発現を駆り立てるように選択される。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組換えベクターは既知の方法によって構築可能である。特定の所望のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドを含んでいる。

様々な発現ベクター／宿主系は、記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ発現するために利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの実施例は、ｐＳＫＫ （Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００４） ２８５（１）：１１１－２７）、哺乳動物細胞における発現のためのｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ（商標）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＡＣＵＶＡＮＣＥ（商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）である。

したがって、本明細書に記載されているような単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、タンパク質ドメインが発現し、単離することもあり、随意にさらに精製されることもある条件下で上記宿主細胞を培養することにより、生成される。

＜単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の産生＞
いくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の産生のプロセスが本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、上記プロセスは、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主を、血清アルブミン結合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、および培養物から生成されたタンパク質を回収ならびに精製することを含む。

さらなる実施形態では、基準結合化合物と比較して、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、および／または本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の、１つ以上の特性、例えば親和性、安定性、耐熱性、交差反応性等を改善することを対象とされたプロセスが提供される。いくつかの実施形態において、異なるドメイン、または単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質もしくは基準結合化合物のアミノ酸セグメントに各々が対応する複数の単一置換ライブラリーが提供され、単一置換ライブラリーの各メンバーが、その対応するドメインまたはアミノ酸セグメントの単一のアミノ酸変化のみをコードするようなものである。（これにより、大きなタンパク質またはタンパク結合部位の起こりうるすべての置換を、少数の小さなライブラリーで調査することが可能となる。）いくつかの実施形態において、複数のドメインは、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質または基準結合化合物のアミノ酸のコンティグ配列を形成するか網羅する。様々な単一置換ライブラリーのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの他の単一置換ライブラリーのヌクレオチド配列と重複する。いくつかの実施形態において、すべてのメンバーが隣接するドメインをコードするそれぞれの単一置換ライブラリーのすべてのメンバーに重複するように、複数の単一置換ライブラリーは設計される。

こうした単一置換のライブラリーから発現された結合化合物は各ライブラリー中で変異体の部分集合を得るために別々に選択され、該変異体は、基準結合化合物と少なくとも同じぐらい優れた特性を有し、かつ、結果として生じたライブラリーはサイズが減少している。（すなわち、結合化合物の選択されたセットをコードする核酸の数は、元々の単一置換ライブラリーのメンバーをコードする核酸の数よりも少ない。）こうした特性としては、限定されないが、標的化合物への親和性、熱、高いまたは低いｐＨ、酵素分解、他のタンパク質に対する交差反応性など様々な条件に対する安定性が挙げられる。それぞれの単一置換ライブラリーからの選択された化合物は、「前候補化合物」または「前候補タンパク質」と本明細書では交換可能に呼ばれている。別々の単一置換ライブラリーからの前候補化合物をコードする核酸配列は、ＰＣＲベースの遺伝子シャッフリング技術を使用してＰＣＲでシャッフルされることで、シャッフルされたライブラリーが生成される。

スクリーニングプロセスの典型的なワークフローが本明細書に記載される。前候補化合物のライブラリーは単一置換ライブラリーから生成され、標的タンパク質への結合のために選択され、その後、前候補ライブラリーはシャッフルされることで候補化合物をコードする核酸のライブラリーが精製され、これはファージミド発現系などの便利な発現ベクターへとクローン化される。その後、ファージ発現候補化合物は、標的分子への結合親和性などの所望の特性を改善するために１ラウンド以上の選択を経験する。標的分子は吸着されることもあれば、さもなければウェルまたは他の反応容器の表面へ付けられることもあり、あるいは、標的分子はビオチンなどの結合部分で誘導対化されてもよく、これは、候補結合化合物でのインキュベーション後に、洗浄のために、磁気ビーズなどのビーズに結合されたストレプトアビジンなどの相補的な部分で捕えられることもある。典型的な選択レジメンでは、標的分子からの非常に低い解離速度の候補化合物だけが選択されるように、候補結合化合物は長期間の洗浄工程を経験する。こうした実施形態のための典型的な洗浄時間は少なくとも８時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも２４時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも４８時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも７２時間である。選択後の単離されたクローンは増幅され、選択の追加サイクルにさらされるか、あるいは、例えば、配列決定によって、および、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合、バイオ層干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ， ＦｏｒｔｅＢｉｏ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）などにより結合親和性の比較測定を行うことによって、分析される。いくつかの実施形態では、プロセスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０のアミノ酸配列を有するタンパク質などの基準血清アルブミン結合タンパク質と比較して、耐熱性、選択された一組の結合標的に対する交差反応性が改善された、１つ以上の単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、および／または単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質を同定するために実行される。単一置換ライブラリーは、フレームワーク領域とＣＤＲ中の両方のコドンを含む、基準血清アルブミン結合タンパク質のＶＨ領域中のコドンを変えることにより調製され；別の実施形態では、コドンが変えられる位置は、基準血清アルブミン結合タンパク質の重鎖のＣＤＲ、あるいは単独でＣＤＲ１、単独でＣＤＲ２、単独でＣＤＲ３、またはそのついなどのこうしたＣＤＲのサブセットを含む。別の実施形態で、コドンが変えられる位置はもっぱらフレームワーク領域で生じる。いくつかの実施形態において、ライブラリーは１０～２５０までの範囲で番号付けられるＶＨとののフレームワーク領域だけの基準血清アルブミン結合タンパク質から単一のコドン変化のみを含む。別の実施形態では、コドンが変えられる位置は、基準血清アルブミン結合タンパク質の重鎖のＣＤＲ３、あるいはこうしたＣＤＲ３のサブセットを含む。別の実施形態では、ＶＨのコード領域のコドンが変えられる位置の数は、最大で１００の位置がフレームワーク領域にあるように、１０～２５０までの範囲にある。単一置換ライブラリーの調製後に、上に概説されるように、以下の工程が行われる：（ａ）前候補タンパク質として個々の単一置換ライブラリーの各メンバーを別々に発現する工程；（ｂ）元々の結合標的［例えば、所望の交差反応標的］とは異なることもあれば、異ならないこともある結合パートナーに結合する前候補タンパク質をコードする個々の単一置換ライブラリーのメンバーを選択する工程；（ｃ）シャッフルされたコンビナトリアルライブラリーを生成するためにＰＣＲで選択されたライブラリーのメンバーをシャッフルする工程；（ｄ）候補血清アルブミン結合タンパク質としてシャッフルされたライブラリーのメンバーを発現する工程；および、（ｅ）元々の結合パートナーと結合する候補血清アルブミン結合タンパク質についてシャッフルされたライブラリーのメンバーを１回以上選択する工程、および場合によっては（ｆ）所望の交差反応標的と結合するためにさらなる候補タンパク質を選択する工程であって、それによって、元々のリガンドに対する親和性を失うことなく基準血清アルブミン結合タンパク質に対する１つ以上の物質の交差反応性を強化した核酸でコードされた血清アルブミン結合タンパク質を提供する工程。さらなる実施形態では、方法は、以下の工程で工程（ｆ）を置き換えることによって、選択された交差反応する物質（複数可）または化合物（複数可）またはエピトープ（複数可）に対して、反応性が減少した血清アルブミン結合タンパク質を得るために実施されることもある：望ましくない交差反応化合物に結合する候補血清アルブミン結合タンパク質のサブセットから、１回以上、候補結合化合物を枯渇させる（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）工程。

最近の研究では、製造、貯蔵、およびインビボでの使用の間に、治療用抗体は多数の経路を介して分解する危険性があることが報告されている。タンパク質における最も頻繁に生じる化学分解反応には、アスパラギン（Ｎ）の脱アミド、およびアスパラギン酸（Ｄ）残基の異性化がある。とりわけ、ＮおよびＤの残基が抗原認識に関与する場合、それらの化学的変質は効力の大きな喪失を引きおこす可能性があると仮定されてきた。アスパラギンおよびアスパラギン酸の残基は環状のスクシンイミド中間体の形成を介して進む分解経路を共有することが知られている。抗体のアスパラギン酸部位における、スクシンイミド中間体、およびそれらの加水分解生成物（アスパラギン酸およびイソアスパラギン酸）の形成は、安定性の問題を示す。異性化が生じるとき、抗体の化学構造が変わり、これによって、例えば、凝集、より短い貯蔵寿命により示される、乏しい安定性を引き起こす可能性がある。それに応じて、本開示のいくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質が提供され、ここで、１つ以上のアスパラギン酸残基が突然変異し、それによって、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の異性化の可能性を減少させる。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸残基は、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のＣＤＲ２中にあり、アスパラギン酸残基はグルタミン酸に突然変異する。ある実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０により定義されたタンパク質の位置６２のアスパラギン酸残基は、グルタミン酸（Ｄ６２Ｅ）に突然変異する。いくつかの実施形態では、Ｄ６２Ｅの突然変異を含む単一ドメイン血清アルブミンタンパク質の血清アルブミン結合親和性は、突然変異によって影響を受けない。いくつかの実施形態では、Ｄ６２Ｅの突然変異を含む、およびその突然変異を含まない単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、血清アルブミンに対して同等の結合親和性を有する。

＜医薬組成物＞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含んでいる。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、保存剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに含むことがある。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって保証され得る。

医薬組成物のいくつかの実施形態において、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、ナノ粒子でカプセル化される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はリポソームに結合する。いくつかの例では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質はリポソームの表面へ共役する。いくつかの例では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、リポソームのシェル内にカプセル化される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。

本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、薬物としての使用のために企図されている。投与は様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、または皮内の投与によって達成される。いくつかの実施形態において、投与経路は、治療の種類と、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医と他の臨床因子によって決定される。任意の１人の患者のための投与量は、患者の背格好、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間と投与経路、治療の種類、健康状態、および同時に投与されている他の医薬品を含む多くの因子に依存する。「有効量」は、こうした病状の減少または緩解をもたらす、疾患の経過と重症度に影響するのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定されることもある。

＜処置方法＞
いくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、または本明細書に記載される単一ドメイン結成アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の投与を含む、必要としている個体の免疫系を刺激するための方法および使用も提供される。いくつかの例では、本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の投与は標的抗原を発現する細胞への細胞毒性を引き起こす、および／または持続させる。いくつかの例では、細胞は癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴまたはＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、あるいは繊維症の組織である。

［００７８］ さらに、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、または本明細書に記載される単一ドメイン結成アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質を個体に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病の処置のための方法と使用も本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病としては、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、または線維症が挙げられる。他の実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患である。１つの実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病は癌である。１つの例では、癌は血液の癌である。別の例では、癌は固形腫瘍癌である。

本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態では、「処置」あるいは「処置すること」あるいは「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、または疾患を遅らせる（減らす）こと、あるいは、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、あるいは疾患の程度の減少；疾病、障害、あるいは疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせること、または進行を遅らせること；疾病、障害、あるいは疾患状態の改善；および、検出可能であれ検出不可能であれ、または疾病、障害、あるいは疾患の亢進であれ改善であれ、緩解（部分的でも全体でも）。処置は過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態では、「処置」あるいは「処置すること」あるいは「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患のための遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせるか、あるいはその重症度を低下させることである。

本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、または本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、特定の疾患、障害もしくは疾病を処置するための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、および／または、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、および他の免疫療法に関する治療が挙げられる。いくつかの実施形態において、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質、または本明細書に記載された単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、および／または、非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質または本明細書に記載されるような単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質は、手術の前、間、もしくは後に投与される。

実施例１：親の抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体と同等の結合特性を有する、抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体変異体の生成
＜親の抗ＨＳＡファージの特徴づけ＞
ＨＳＡ抗原への親の抗ＨＳＡファージの特異的結合を、ＣＤ３を陰性対照として使用し測定し（図１）、かつヒト、カニクイザル、およびマウスの血清アルブミンに対する抗ＨＳＡファージの交差反応性を測定した（図２）。

＜単一置換ＨＳＡ ｓｄＡｂファージライブラリー＞
３つのＣＤＲドメインの各々に対して、単一置換ライブラリーを提供した。単一置換ライブラリーをＨＳＡに結合させ、その後、様々なレベルのＨＳＡを含む緩衝液で洗浄した。０時間および２４時間で結合されたファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅｄ）し、数え上げた。緩衝液中２．５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡで２４時間洗浄して選択されたファージを、２つの独立したコンビナトリアルファージライブラリーを作るために使用した。

＜コンビナトリアル抗ＨＳＡライブラリー＞
第１ラウンドでは、ＭＳＡを選択標的として使用した。ウェルを、２つの独立したライブラリーからのコンビナトリアルファージ結合の後、２４時間洗浄した。第２ラウンドでは、ＨＳＡを選択標的として使用した。ウェルを、両方のライブラリーの結合後に、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ中で２４時間洗浄した。第２ラウンドの選択からの挿入物ＰＣＲｅｄを、ＭＥ１０ Ｈｉｓ６発現ベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８として開示された（６ＸＨｉｓ配列）へとサブクローン化した。９６個のクローンを選び、ＤＮＡを精製し、配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトした。

＜結合親和性の測定＞
上澄み液を、オクテットプラットフォーム（Ｏｃｔｅｔ ｐｌａｔｆｏｒｍ）を使用して、ＨＳＡおよびＣＳＡに対するＫｄを評価するために使用した。９個のクローンを、さらなる特徴づけのために、親のｓｄＡｂに比較された結合親和性、ならびにロバストな産生、凝集、および安定性のプロファイルに基づいて、選択した（図３）。

実施例２：抗ＨＳＡの単一ドメイン抗体を含む三重特異性抗体の薬物動態
実施例１の抗ＨＳＡの単一ドメイン抗体を使用して、三重特異性抗体を調製し、これを動物実験における半減時間を排除するために評価する。

三重特異性抗体は、筋肉内への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注入として、カニクイザルに投与される。他のカニクイザル群は、結合ドメインを有する、ＣＤ３およびＣＤ２０に対して大きさが同等であるが、ＨＳＡ結合が欠如しているタンパク質を受ける。第３および第４の群は、それぞれＣＤ３およびＨＳＡ結合ドメインを有する抗体、ならびにＣＤ２０およびＨＳＡ結合ドメインを有するタンパク質を受け、その両方共、三重特異性抗体に対して大きさが同等である。各試験群は、５匹のサルからなる。血清サンプルを、指示された時点でとり、連続的に希釈し、そしてタンパク質の濃度を、ＣＤ３および／またはＣＤ２０に対して、結合ＥＬＩＳＡを使用して測定する。

薬物動態分析を、被験物質の血漿中濃度を用いて実施する。各被験物質に関する群平均血漿データは、投与後の時間に対してプロットされた場合に、多重指数関数的なプロファイルに一致する。データは、ボーラス投入を用いた標準的な２区画モデル、および分布相および排出相のための一次速度定数によって適合される。ｉ．ｖ．投与に関するデータを最良適合するための一般的な式は：ｃ（ｔ）＝Ａｅ^－αｔ＋Ｂｅ^－βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は時間ｔにおける血漿中濃度であり、ＡおよびＢはＹ軸状の切片であり、そしてαおよびβは、それぞれ分布相および排出相の外見上の一次速度定数である。α－位相は、クリアランスの位相定数であり、タンパク質の分布を動物のすべての細胞外液へと反映するが、崩壊曲線の第２の位相部分またはβ－位相部分は、真性血漿クリアランスを表わす。そのような式を適合させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）であって、αおよびβ（α＞βの間）は、二次方程式：ｒ^２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の乗根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝区画１から区画２への移動速度（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒａｔｅ）、およびｋ２１＝区画２から区画１への移動速度、ならびにＤ＝投与量、の推定パラメータを用いる。

データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標） Ｖ． ３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７． Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅａｄｉｎｇ， Ｐａ．）を使用して作成する。報告可能なものよりも小さいもの（ＬＴＲ）として報告された値は、ＰＫ分析において含まれておらず、グラフに示されていない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ． ３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標） Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９． Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）を使用して、区画解析によって測定する。薬物動態パラメータを、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ， １９９９， ＩＮ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．において記載されているように計算する。

実施例１の抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体を含む三重特異性抗体が、ＨＳＡ結合ドメインが欠如しているタンパク質と比較して、消失半減期の増大などの薬物動態パラメータを向上させることが予想される。

実施例３：抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体の変異体の耐熱性
タンパク質の疎水的曝露の温度（Ｔ_ｈ）は、ピーク染料蛍光の変曲点の導関数に相当し、タンパク質安定性の尺度である融解温度（Ｔ_ｍ）と相関することが知られている。この研究の目的はいくつかの抗ＨＡＳ単一ドメイン抗体の変異体のＴ_ｈを評価することであった。

＜タンパク質産生＞
抗ｈｕＡＬＢ単一ドメイン抗体の配列を、リーダー配列が前にあり、６ｘヒスチジンタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）が後ろにあるｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）は、Ｅｘｐｉ ２９３培地中の０．２～８ｘ１ｅ６細胞／ｍＬ間でＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）の懸濁液中で維持された。精製されたプラスミドＤＮＡは、Ｅｘｐｉ２９３発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ａ１４６３５）プロトコルに合わせてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞へトランスフェクトされ、トランスフェクション後４－６日間、維持される。調整培地は、親和性と脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製された。抗ｈｕＣＤ３ｅｓｃＦｖタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、賦形剤を含む中性の緩衝液中で分解させた。画分貯留と最終的な純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと解析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した。精製されたタンパク質溶液の吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して２８０ｎｍで決定され、ＵＶ透過性の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６３５）とその濃度はモル吸光係数から計算された。

＜示差走査型蛍光定量法＞
精製された抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体タンパク質を、賦形剤を含む中性の緩衝液中に、０．１５％のＤＭＳＯ終濃度で、５ｘＳＹＰＲＯのオレンジ色染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５１）とともに、０．２～０．２５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ光学マイクロプレートと接着剤フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４４８３４８５ ａｎｄ ４３１１９７１）へと入れた。希釈されたタンパク質と染料混合物を含むプレートは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）に充填し、２５°Ｃ～９５°Ｃの複数工程の温度勾配にさらした。温度勾配は、各１つの摂氏度における２分間の保持から構成し、５００ｎｍでの励起を用い、放射をＲＯＸフィルターで集める。摂氏度のＴ_ｈは、図４の精製された抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体タンパク質について提示される。

実施例４：ｐＨ低下にさらされた場合の抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体の変異体の二量化の相対的な傾向
抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体タンパク質を、上述のように、Ｅｘｐｉ２９３－Ｆ細胞中で発現させた。各変異体のための調整培地を、カラム内に充填されたプロテインＡアガロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， １７５１９９０１）に適用し、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水で広範囲に洗浄し、ｐＨ３の０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸で溶離させ、ｐＨ ５までの部分中和前に最大１０分間室温で保持し、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７０５８４０１）を用いて、賦形剤を含む中性の緩衝液中に脱塩した。

実施例３に記載されるように、精製された抗ＨＳＡ単一ドメイン抗体の変異体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。精製されたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびＹａｒｒａ ２０００ ＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ００Ｈ－４５１２－Ｅ０）を使用する解析的ＳＥＣによって評価し、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、１２００ＬＣ上で、溶媒を含むリン酸塩緩衝液中で分析した。二量体および単量体に対応するピークを手動でまとめ、値を図５で示す。

Claims (15)

1. 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１５を含み、ＣＤＲ２は配列番号１９を含み、およびＣＤＲ３は配列番号２４を含み、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、単一ドメイン抗体である、ポリヌクレオチド。
2. 多特異性の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記多特異性の結合タンパク質は単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含み、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１５を含み、ＣＤＲ２は配列番号１９を含み、およびＣＤＲ３は配列番号２４を含み、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、単一ドメイン抗体である、ポリヌクレオチド。
3. 前記多特異性の結合タンパク質はリンカーをさらに含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 抗体をコードするポリヌクレオチドであって、前記抗体は単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含み、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１５を含み、ＣＤＲ２は配列番号１９を含み、およびＣＤＲ３は配列番号２４を含む、ポリヌクレオチド。
5. 前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、単一ドメイン抗体である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
7. 前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質は、少なくとも１２時間の消失半減期を有する、請求項１から６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
8. 請求項１から７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
9. 請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
10. （ｉ）請求項１から７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の宿主細胞、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
11. 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む抗体の産生のためのプロセスであって、
    前記プロセスは、前記単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養すること、および、
    培養物から生成されたタンパク質を回収および精製することを含む、プロセス。
12. 請求項１１に記載のプロセスによって産生された抗体。
13. 単一ドメイン抗体である、請求項１２に記載の抗体。
14. 必要とする被験体における、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病の処置または改善に使用される、請求項１から７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
15. 必要とする被験体における、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病の処置または改善に使用される、請求項８に記載のベクター。