JP7779495B2

JP7779495B2 - 核酸検出用蛍光色素

Info

Publication number: JP7779495B2
Application number: JP2025503904A
Authority: JP
Inventors: 健二郎花岡; 栄太佐々木; 杏実鈴木; 薫秋元
Original assignee: Keio University; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Keio University; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2023-03-02
Filing date: 2024-02-27
Publication date: 2025-12-03
Anticipated expiration: 2044-02-27
Also published as: CN120731204A; WO2024181398A1; EP4674849A1; JPWO2024181398A1

Description

本発明は、核酸検出用蛍光色素及びこれを用いた核酸検出方法に関する。

従来から蛍光色素を用いた核酸の検出はよく知られており、蛍光色素としてシアニン色素が良く使用されている。例えば、特許文献１は、新規な非対称シアニン色素誘導体と、これを核酸に結合させることによる核酸の検出方法について開示している。非特許文献１は、代表的な市販の非対称シアニン色素であるSYBR(商標)Green IのDNA検出試薬としての性能を開示している。非特許文献２は、代表的な市販の非対称シアニン色素であるSYBR(商標) GoldのDNA検出試薬としての性能を開示している。

米国特許第5658751号

J. Fluoresc (2012) 22, 1189-1199 Nucleic Acid Research (2021) 49, 5143-5158

本発明が解決すべき課題は、核酸を高感度に検出できる蛍光色素及びこれを用いた核酸の検出方法を提供することにある。

本発明は、以下に記載の実施形態を包含する。
項１．
下記の式（I）の化合物。

（式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して、炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して、炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Aは、下記のいずれかであり、

（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2から6までの範囲の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2から6までの範囲の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2から6までの範囲の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^-はカウンターアニオンである。)
項２．
下記の式（Ia）の化合物である項１に記載の化合物。

（式中、
各R¹は独立してメチルまたはエチルであり、
Aは、下記のいずれかであり、

（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2～6の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2～6の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^-はカウンターアニオンである。)
項３．
項１又は２に記載の化合物からなる蛍光色素。
項４．
下記の式（II）の化合物。

（式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Bは、下記のいずれかであり、

（式中、R¹⁰は水素又は－COO－R¹¹で表されるエステルであり、R¹¹は炭素数1-6のアルキルであり、
R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）であり、
R⁹は水素又は－COO－R¹²で表されるエステルであり、R¹²は炭素数1-6のアルキルである。)
Y^-はカウンターアニオンである。)
項５．
項１又は２に記載の化合物を備えた、試料中の核酸を検出するためのキット。
項６．
試料中の核酸と、項１又は２に記載の化合物とを、接触させること、及び
前記核酸と前記化合物の複合体の蛍光強度を検出すること
を含む核酸の検出方法。
項７．
前記核酸を支持体上に固定化させる工程をさらに含み、
前記蛍光強度は、支持体上の前記核酸と前記化合物の複合体の蛍光強度を検出することを含む項６に記載の検出方法。
項８．
前記接触させる工程は、前記試料と前記化合物とを混合して混合液を調製することを含み、
前記固定化させる工程は、前記混合液を電気泳動によりゲル上に固定することを含む、項７に記載の検出方法。
項９．
前記核酸がDNA又はRNAである項６に記載の方法。

本発明によれば、核酸を高感度に検出できる蛍光色素が提供される。

市販の各蛍光色素の感度。 (A)SYBR（登録商標） Goldの構造式（左）、SYBR（登録商標） Goldで染色したDNAを泳動したゲル(右)、（B）SYBR（登録商標） Green Iの構造式（左）、SYBR（登録商標） Green I で染色したゲル（右）、(C) GelGreen（商標）の構造式（左）、GelGreen（商標）で染色したDNAを泳動したゲル(右)。矢印は140pg,50bpのDNAの位置を示す。蛍光プローブの分子設計。（A）-（E）各種色素の吸収スペクトル。（F）-（J）各種色素の蛍光スペクトル（495 nm励起）。（A）及び(F)SYBR Gold、(B)及び(G)SYBR Green I、(C)及び(H)化合物11、（D）及び(I)化合物13、（E）及び(J)化合物14。実線はDNA添加後、破線はDNA添加前。各種色素のDNA結合アッセイ。（A）SYBR Gold、(B)SYBR Green I、(C)化合物11、（D）化合物13、（E）化合物14。 DNA電気泳動試験（後染め）。左から順に、SYBR Gold、SYBR Green I、化合物11、化合物13、及び化合物14を用いてDNAを染色したゲル。 DNA電気泳動試験（DNA先染め）。上段左から順に、SYBR Gold、SYBR Green I、化合物11を用いてDNAを染色したゲル。下段左から順に、化合物11 2倍量、化合物13、及び化合物14を用いてDNAを染色したゲル。電気泳動の結果。四角枠で囲んだ部分はcfDNAの位置（～160 bp）を指す。レーン1: SYBR Gold (2 μM) + Ladder*、レーン2: SYBR Gold (2 μM) + cfDNA、レーン3: SYBR Gold (1 μM) + cfDNA、レーン4: SYBR Gold (0.5 μM) + cfDNA、レーン5: 化合物13 (2 μM) + Ladder*、レーン6: 化合物13 (2 μM) + cfDNA、レーン7: 化合物13 (1 μM) + cfDNA、レーン8: 化合物13 (0.5 μM) + cfDNA、レーン9: 化合物14 (2 μM) + Ladder*、レーン10: 化合物14 (2 μM) + cfDNA、レーン11: 化合物14 (1 μM) + cfDNA、レーン12: 化合物14 (0.5 μM) + cfDNA。*はGene Ruler 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific)で、1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bpのDNAを含む。図７の電気泳動結果の ImageJによる強度解析。（A）SYBR Gold、(B) 化合物13、(C)化合物14。レーン1-12は図７と同じ。

本明細書において、「含有する（comprise）」は、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」も包含する概念である。

まず、本発明の完成に先立ち、発明者らは従来の蛍光試薬の感度を調べた。（１）ゲル電気泳動を用いたDNAの検出方法には、DNAを電気泳動でゲルに流した後で、ゲルを蛍光試薬により染色する方法（ゲル後染め）と、（２）DNAを蛍光色素により染色したのちに、染色されたDNAを電気泳動でゲルに流す方法（DNA先染め）の２種類がある。（１）の方法は、感度が高く、（２）の方法は（１）よりも感度は劣るが簡便で迅速である。そこで、（２）の方法で、DNAサンプルにGene Ruler 50bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific)を使用し、このDNAサンプルを核酸蛍光染色色素としてよく知られているSYBR（登録商標） Gold(Invitrogen)、SYBR（登録商標） Green I（Invitrogen）、及びGelGreen（商標）（BIOTIUM）（SYBR（登録商標） Gold、SYBR（登録商標） Green I、及びGelGreen（商標）は、読み易さのため、以下単にSYBR Gold、SYBR Green I、及びGelGreenと表記する場合がある）の各々を用いて染色し（図１（A）－（C）の左側の化合物）、DNA量が表Ｉに示される量となるよう泳動し、蛍光を検出した（励起波長455-485nm、検出波長、露光時間1秒）。

その結果、図１（A）－（C）の右側の写真に示すように、DNAの長さが短いほど蛍光強度が下がり、矢印に示すように、DNA量が最も少ないレーンでは140pg、長さ50bpのDNAに対応する蛍光がほとんど観察されず、DNA先染め法では、既存の蛍光色素ではctDNAのような短いDNAを検出するには感度が不十分であることが判明した。

そこで図２に示すように、本発明者らは、従来の蛍光色素では、DNA 1に対して蛍光色素2が１箇所のみで相互作用しているためにDNA 1の長さが短くなると蛍光色素2がDNA 1に安定に挿入された状態を維持しにくくなると考え（左図）、2つの蛍光色素2を結合する適切な長さのリンカー3を導入し、一分子の蛍光色素2が2箇所でDNA 1に相互作用するようにすれば、安定な複合体が形成され、DNA 1に対する蛍光色素2の結合能が高まり、DNA 1の検出感度が向上すると考え、本発明を完成するに至った。

本発明の一つの態様によれば、下記の式（I）の化合物が提供される。

式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Aは、下記のいずれかであり、

（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2から6までの範囲の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2～6の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2～6の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^-はカウンターアニオンである。

式（I）の化合物はリンカーLを介して2つの単量体が結合された化合物であり、核酸に2箇所で結合することができるため、核酸分子に1箇所でしか結合することのできない単量体からなる化合物と比べて、核酸との結合力が向上し、核酸とより安定的に複合体を形成することができる。式（I）の化合物は核酸を検出するための蛍光色素として使用することができる。

R¹の炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態では、各R¹はメチル又はエチルである。

各R²の炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。各R²のハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素が挙げられる。

一つの実施形態では、sは0である。別の実施形態では、sは独立して1、2、3又は4であり、各R²は独立してメチル及びハロゲンから成る群から選択される基である。ハロゲンとしては、塩素、臭素、又はヨウ素が挙げられる。

一つの実施形態では、XはO（酸素）である。別の実施形態では、XはSである。

各R³の炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。各R³のハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素が挙げられる。

一つの実施形態では、tは0である。別の実施形態では、tは独立して1、2、3又は4であり、各R³は独立してメチル及びハロゲンから成る群から選択される基である。ハロゲンとしては、塩素、臭素、又はヨウ素が挙げられる。

各R⁴のフェニル基は未置換であっても置換されていてもよく、置換されている場合、炭素数1-6のアルキル、アミノ、又はハロゲンで置換され得るが、これらに限定されない。炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。

各R⁵の炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。

一つの実施形態では、各R⁵は水素である。

一つの実施形態では、mは０である。

一つの実施形態では、Aは、

である。

別の実施形態では、Aは、

であり、式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）である。R⁶及びR⁸は好ましくは独立して水素、メチル又はエチルである。

一つの実施形態では、Lは－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2～6の整数である）である。別の実施形態では、Lは－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）である。

一つの実施形態では、Y^-のカウンターアニオンの例としては、ハロゲンイオン（例えば、Cl^-、Br^-、I^-など）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン、エチル硫酸イオンなど）、有機スルホン酸イオン（例えば、メタンスルホナート、ｐ－トルエンスルホナート、CF₃SO₃ ^-、(CF₃SO₂）₂ N^-など）、過塩素酸イオン(ClO₄ ^-)、TsO^-などが挙げられるが、これらに限定されない。ハロゲンイオンとして、好ましくは、SbF₆ ^－、AsF₆ ^－、PF₆ ^－、BF₄ ^－、（FSO₂)₂ N^-、CF₃SO₂ ^-、CF₃ CO₂ ^-であり、より好ましくはBF₄ ^－、CF₃SO₂ ^-、CF₃ CO₂ ^-であり、さらに好ましくはCF₃ CO₂ ^-である。

一つの実施形態では、式（I）の化合物は、下記の式（Ia）の化合物である。

（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2～6の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2～6の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^- はカウンターアニオンである。

一つの実施形態では、Aは、

である。

別の実施形態では、Aは、

本発明の一つの態様によれば、下記の式（II）の化合物が提供される。

式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Bは、下記のいずれかであり、

（式中、R⁴は水素又は－COO－R¹¹で表されるエステルであり、R⁵は炭素数1-6のアルキルであり、
R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）であり、
R⁹は水素又は－COO－R¹²で表されるエステルであり、R¹²は炭素数1-6のアルキルである。)
Y^-はカウンターアニオンである。）
R⁹、R¹¹、及びR¹²の各々の炭素数1-6のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。

式(II)の化合物は、式（I）の製造のために使用される中間体である。式(II)中のR¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸、X、Y^-、m、s、tは式（I）に関して説明した通りである。

一つの実施形態では、Bは、

であり、R¹⁰は水素又は－COO－R¹¹で表されるエステルであり、R¹¹は炭素数1-6のアルキルである。

別の実施形態では、Bは、

であり、式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）であり、R⁹は炭素数1-6のアルキルである。R⁶及びR⁸は好ましくは独立して水素、メチル又はエチルである。

一つの実施形態では、式（II）の化合物は、下記の式（IIa）の化合物である。

式中、
各R¹は独立してメチルまたはエチルであり、
Bは、下記のいずれかであり、

（式中、R¹⁰は水素又は－COO－R¹¹で表されるエステルであり、R¹¹は炭素数1-6のアルキルであり、
R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）であり、
R⁹は水素又は－COO－R¹²で表されるエステルであり、R¹²は炭素数1-6のアルキルである。)
Y^-はカウンターアニオンである。）

一つの実施形態では、カウンターアニオンY^-は、ハロゲンイオン（例えば、Cl^-、Br^-、I^-など）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン、エチル硫酸イオンなど）、有機スルホン酸イオン（例えば、メタンスルホナート、ｐ－トルエンスルホナート、CF₃SO₃ ^-、(CF₃SO₂）₂ N^-など）、過塩素酸イオン(ClO₄ ^-)、TsO^-などが挙げられるが、これらに限定されない。ハロゲンイオンとして、好ましくは、SbF₆ ^－、AsF₆ ^－、PF₆ ^－、BF₄ ^－、（FSO₂)₂ N^-、CF₃SO₂ ^-、CF₃ CO₂ ^-であり、より好ましくはBF₄ ^－、CF₃SO₂ ^-、CF₃ CO₂ ^-であり、さらに好ましくはCF₃ CO₂ ^-である。

式(I)及び式（II）の化合物の各々が、光学異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体等の異性体を有する場合には、特に明記しない限り、いずれの異性体も、異性体の混合物も、式(I)及び式（II）の化合物の各々に包含される。例えば、式(I)及び式（II）の化合物の各々に光学異性体が存在する場合には、特に明記しない限り、ラセミ体から分割された光学異性体も式(I)及び式（II）の化合物の各々に包含される。これらの異性体は、自体公知の合成手法、分離手法（濃縮、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶など）によりそれぞれを単一化合物として得ることができる。

式(I)及び式（II）の化合物の各々は、結晶であってもよく、結晶形が単一であっても多形混合物であっても本発明化合物又はその塩に包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。式(I)及び式（II）の化合物は、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも式(I)及び式（II）の化合物の各々に包含される。

次に、式(I)の化合物の製造方法について説明する。

まず、DNAと相互作用することで強い蛍光を発することが知られている非対称シアニン色素の構造を元に、核酸と結合可能な単量体である式(II)の化合物を製造する。

式(II)の化合物は、例えば下記のスキーム１に従って合成することができる。スキーム１中のR¹、R²、R⁴、X、－（CH-CH）_m－は式 (II)で定義したものと同じである。

まず、ベンゾチアゾールとキノリンをモノエン又はポリエンで結合した化合物(1)の化合物は、特許文献１の米国特許第5658751号に記載の方法を含むがこれに限定されない公知の方法により合成することができる。

まず、化合物(1)と、第二級アミンのアルキルエステルである化合物(2) とを溶媒（例えば1,2-ジクロロエタン）中で反応させる。反応温度と時間は特に限定されないが、反応温度は例えば30～70℃であり、反応時間は30分～6時間である。化合物(1)中、R¹、R²、R⁴、X、－（CH-CH）_m－は式 (II)で定義したものと同じである。化合物(2)中、R¹³は

であり、R⁶、R⁷及びR⁸は式 (II)で定義したものと同じである。次に、反応溶液から溶媒を除去、精製し化合物(3)を得る。化合物(3)中、R¹⁵は

であり、R⁶、R⁷及びR⁸は式 (II)で定義したものと同じである。

次に、化合物(3)を酸（例えばトリフルオロ酢酸等）溶液中で加水分解する。加水分解の反応温度と時間は特に限定されないが、反応温度は例えば-4℃～4℃であり、反応時間は5分～12時間である。次に、反応溶液から溶媒を除去、精製し、化合物(4)を得る。

スキーム１における溶媒の除去には蒸留、反応生成物の精製にはクロマトグラフィー等、公知の方法を使用することができる。

化合物(3)及び化合物(4)は式(II)の化合物に包含される。

次に、非対称シアニン色素を元に製造した単量体をリンカーで繋ぐことによって、分子内に２箇所のDNA結合部位を有する式(I)の化合物を合成する。

式(I)の化合物は、例えば下記のスキーム２に従って合成することができる。スキーム２中のR¹、R²、R⁴、X、－（CH-CH）_m－は式 (I)で定義したものと同じである。

まず、参照例として、化合物(4)から蛍光色素の単量体である化合物(5)を得ることができる。化合物(4)の化合物を溶媒（例えばジクロロメタンなど）中に溶解し、トリエチルアミンと塩化アセチルを添加し、撹拌して反応させる。反応温度と時間は特に限定されないが、反応温度は例えば-4℃～4℃であり、反応時間は5分～60分である。任意選択で溶媒（例えばメタノール）をさらに添加し、撹拌する。次に、反応溶液から溶媒を除去、精製し、蛍光色素の単量体である化合物(5)を得る。

他方、化合物(4)の化合物を溶媒（例えばN,N-ジメチルホルムアミドなど）に溶解し、リンカーの構成成分であるポリエーテル構造を有してもよいアルカン二酸(10)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシこはく酸イミド（HOSu）及びN, N-ジイソプロピルエチルアミンを加えて撹拌する。次に、反応溶液から溶媒を除去、精製し、2分子の化合物(4)の化合物がリンカーを介して縮合した化合物を得る。化合物(10)中、f及びgはそれぞれ独立して1～3の整数であり、jは2～6の整数であり、s及びtはいずれも１又は2である。

例えばポリエーテル構造を有してもよいアルカン二酸(10)が3,6-ジオキサオクタン二酸の場合は化合物(6)が得られ、3,6,9-トリオキサウンデカン二酸の場合は化合物(7)が得られ、3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン二酸の場合は化合物(8)が得られる。化合物(6)-(8)中、R¹⁶は

であり、R⁶、R⁷及びR⁸は式 (I)で定義したものと同じである。

スキーム２における溶媒の除去には蒸留、反応生成物の精製にはクロマトグラフィー等、公知の方法を使用することができる。

化合物(6)、化合物(7)及び化合物(8)は式(I)の化合物に包含される。

なお、化合物(10)のアルカン二酸の代わりに、アルカンの両端にハロゲンなどの脱離能の高い置換基（脱離基）の付いた化合物を用いて、これを化合物(4)と反応させ、式(I)においてLが－（CH₂）_q－(ｑは2～6の整数である）であるリンカーを形成することもできる。

本発明の一態様によれば、試料中の核酸と、上記式(I)の化合物とを、接触させること、及び核酸と式(I)の化合物の複合体の蛍光強度を検出することを含む核酸の検出方法が提供される。

試料は、生体から得られた試料であることが好ましく、哺乳動物から得られた試料であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられるがこれに限定されず、好ましくはヒト、マウス、又はラットであり、より好ましくはヒトである。また、生体から得られた試料は、体液、組織、又は細胞であってもよい。体液としては、血液（例えば全血）、血球、血清、血漿、胸水、腹水、髄液、唾液、尿、便などが挙げられる。組織としては、心臓、動脈、腎臓、肺、内耳、副鼻腔、皮膚、神経、その他の臓器の血管などが挙げられる。細胞はかかる組織から得られる細胞が挙げられる。生体の非侵襲性の点では、生体から得られた試料は、体液であることが好ましく、血液、血清又は血漿であることがより好ましい。核酸はDNAであってもよく、RNAであってもよい。DNAは一本鎖DNA、二本鎖DNA、三本鎖DNA、又は四本鎖DNAであってよい。RNAは一本鎖又は二本鎖であってよい。核酸は天然の重合体（ポリマー）又は合成の重合体（ポリマー）であってよい。本検出方法によれば、式(I)の化合物を用いることにより、核酸を好感度に検出することができる。

式(I)の化合物からなる蛍光色素は、溶媒中で溶解させることにより、使用のために調製される。溶媒は、例えば水、またはジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、メタノールまたはエタノールのような低級アルコールなどの水に混和性の有機溶媒が挙げられる。

式(I)の化合物の有効量は、核酸を検出可能な蛍光シグナルを与えるのに充分な量である。核酸との混合前の染色溶液中の式(I)の化合物の濃度は、バックグラウンドの蛍光を最小にする一方、蛍光シグナルを与えるに充分な量で試料中の核酸と接触するのに充分でなければならない。ゲルに適用するための染色溶液中の蛍光色素の濃度は、一般的には0.1μM～10μM、より一般的には0.5μM～２μMであり得る。遊離核酸の検出および定量のための染色溶液中の蛍光色素の濃度は、一般的には0.1μM～２μMであり得る。

核酸を含む試料と、上記式(I)の化合物とを混合することにより、混合液中で核酸と式(I)の化合物とが接触する。式(I)の上記シアニン色素化合物は、核酸と会合していない場合には低い固有の蛍光を有するが、核酸と結合すると蛍光性になり、核酸に対する式（I）の化合物の結合が、検出可能な蛍光シグナルの形で検出される。

核酸を含む試料は、式(I)の化合物と直接混合されてもよいし、電気泳動液、シーブマトリックスまたはランニングバッファーなどの分離溶液中で混合されてもよいし、沈殿物(例えば、スクロース)もしくは密度勾配(例えば、CsCl含有密度勾配)中で混合されてもよいし、膜、ゲル、基板などのマトリックス、または他の任意の支持体上に固定化した核酸を、式(I)の化合物と接触させてもよい。膜としてはニトロセルロース膜、メチルセルロース膜などが挙げられる。ゲルとしてはアガロースゲル、アルギン酸ヒドロゲル、ポリアクリルアミドゲルなどが挙げられる。基板としては、ガラス基板、石英基板などが挙げられる。

蛍光色素は必要に応じて、ゲルまたはキャピラリー電気泳動、勾配遠心分離、または他の分離工程の前、分離中、または核酸が分離した後に、核酸を含む試料と接触させてもよい。例えば、試料中の核酸を電気泳動又は勾配遠心分離により分離し、その後、分離された核酸に蛍光色素を結合させ、核酸と蛍光色素の複合体（以下、「核酸－色素複合体」とも称する）の蛍光強度を検出又は測定することにより核酸を検出してもよい。代わりに、試料中の核酸と蛍光色素とを混合して核酸と蛍光色素を結合させ、その後、混合液を電気泳動又は勾配遠心分離により分離し、核酸と蛍光色素の複合体の蛍光強度を検出又は測定することにより核酸を検出してもよい。

支持体を使用する場合、試料中の核酸を電気泳動により固定化させ、その後、固定化された核酸に蛍光色素を結合させ、核酸と蛍光色素の複合体の蛍光強度を検出又は測定することにより核酸を検出してもよい（後染め法）。代わりに、試料中の核酸と蛍光色素とを混合して核酸と蛍光色素を結合させ、その後、混合液を電気泳動にかけ、混合物中の核酸を電気泳動より支持体上に分離し、核酸と蛍光色素の複合体の蛍光強度を検出又は測定することにより核酸を検出してもよい（先染め法）。

好ましくは、蛍光色素は、当該蛍光色素の操作パラメーター内で、核酸の生物学的活性の最適な温度(通常5℃と50℃との間)で核酸を含む試料と混合又は核酸と接触される。インビトロでのアッセイのために、蛍光色素は室温(15～25℃の間)で核酸を含む試料と混合又は核酸と接触させられる。蛍光色素による核酸の染色が平衡状態に達する時間は条件によって変わり得るが、好ましい実施形態では、核酸と蛍光色素を接触させて数分以内、例えば１分以内に核酸－色素複合体の蛍光が観察される。

試料中の核酸を本発明の蛍光色素で染色することにより形成される核酸－色素複合体は、１または２以上の蛍光色素分子と非共有結合する核酸ポリマーとを含む。核酸－色素複合体は蛍光シグナルを生じ、そのシグナルは蛍光色素単独の蛍光よりも著しく増強される。

核酸－色素複合体の蛍光は当該複合体の色素の部分により吸収される波長で試料を励起し、放射される波長を測定することによって定性的にまたは定量的に検出される。励起波長は、好ましくは455-500nmの範囲であり、検出波長は、好ましくは505-560nmの範囲である。発光は目視検査、CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター、プレートリーダー、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメーター、キャピラリー電気泳動検出器のような現行の機器の使用により検出される。

色素－核酸復合体が形成されると、その存在が蛍光シグナルとして検出され、そして試料中の核酸の存在、位置、もしくは種類の指標として使用され得る。このような定性分析における使用に加え、試料中の核酸はまた、核酸－色素複合体の蛍光と試料中の核酸の濃度との間の公知の関係を比較することによって定量され得る。

本発明の検出方法は、検出感度が高く、少量の核酸を用いても、強い蛍光シグナルを与える。例えば、電気泳動ゲルの１バンド当たり1ng以下、特には100pg～800pg程度の二本鎖DNAを検出することが可能である。色素濃度をより高くすれば、より少ない量の核酸を検出することも可能であり、例えば電気泳動ゲルの１バンド当たり数pg～数十pg程度の二本鎖DNAを検出することも可能である。

また、本発明の検出方法は、一分子中に2箇所のDNA相互作用部位を有する蛍光色素を使用するため、長さの短いDNAでも高感度に検出することができる。例えば、cfDNAや、200bp以下のDNA、特には90bp～150bp程度の二本鎖DNAである腫瘍cDNAを検出することが可能である。がん患者の血中を循環する腫瘍由来DNA断片（ctDNA）は、腫瘍全体のDNAを反映するため、腫瘍の全体像の把握を可能にするとともに半減期が短いため、リアルタイムの腫瘍の情報が得られ、がんの早期診断や予後の経過観察に有用である。しかしながら、ctDNAの大きさは短い上、血液検体中に含まれるctDNAの量はごく微量であるため（Sci Transl Med. 2018 November 07; 10(466)）、従来技術として広く使われている核酸検出色素では、さまざまな患者由来のctDNAを洩れなく検出するには感度が不十分であった。本発明の蛍光色素を用いた検出方法は、ctDNA分析にも使用することができる。
本発明の上記態様の核酸検出方法は、特定塩基配列を含む標的DNA又はRNAの定性又は定量分析方法として利用することができる。また、本方法は、疾患の診断、疾患の診断補助、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用である。

本発明の一態様によれば、上記式(I)の化合物を備えた、試料中の核酸を検出するためのキットが提供される。

試料は、生体から得られた試料であることが好ましく、哺乳動物から得られた試料であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられるがこれに限定されず、好ましくはヒト、マウス、又はラットであり、より好ましくはヒトである。また、生体から得られた試料は、体液、組織、又は細胞であってもよい。体液としては、血液（例えば全血）、血球、血清、血漿、胸水、腹水、髄液、唾液、尿、便などが挙げられる。組織としては、心臓、動脈、腎臓、肺、内耳、副鼻腔、皮膚、神経、その他の臓器の血管などが挙げられる。細胞はかかる組織から得られる細胞が挙げられる。生体の非侵襲性の点では、生体から得られた試料は、体液であることが好ましく、血液、血清又は血漿であることがより好ましい。核酸はDNAであってもよく、RNAであってもよい。DNAは一本鎖DNAであっても二本鎖DNAであってもよい。本キットは式(I)の化合物を備えることにより、核酸を高感度に検出することができる。

上記キットを用い、上記本発明の核酸の検出方法を行うことにより、核酸を検出することができる。このため、キットはさらに、核酸の検出方法を記載した説明書をさらに備えてもよい。キットはさらに、任意選択で、サイズマーカーとして用いられる核酸断片、追加的な検出試薬（例えばDNAのみに特異的な染色化合物）をさらに備えてもよい。

本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。

実施例１色素骨格の合成
下記スキーム３に従って、色素の骨格となる化合物を合成した。化合物８は、化合物１を出発原料として特許文献１の米国特許第5658751号に記載の方法などを参考に、以下の手順に従って合成した。

（１）化合物３の合成
化合物１（2.42 g, 15.2 mmol）、化合物２（3.70 g, 30.4 mmol）、酢酸銅(II)（2.75 g, 15.2 mmol）、ピリジン（1.23 mL, 15.2 mmol）、トリエチルアミン（2.12 mL, 7.6 mmol）、モレキュラーシーブス３A（1 g）を50 mLのジクロロメタンに加えて、室温で一晩攪拌した。反応溶液を濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで溶媒留去した。
残留物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥させた後、溶液を濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで溶媒留去した。残留物をアミノシリカゲルを用いたクロマトグラフィー（酢酸エチル:ヘキサン = 10：90から 30：70の直線勾配）によって精製し、白色の固体である化合物３（1.7 g, 7.2 mmol, 収率48%）を得た。

（２）化合物４の合成
化合物３（820 mg, 3.5 mmol）を35 mLのジクロロメタン（超脱水）に溶解し、塩化ホスホリル（1.1 mg, 7.0 mmol）と触媒量のN,N-ジメチルホルムアミドを加えて50℃で6時間還流した。室温に戻した後、反応液をロータリーエバポレーターで溶媒留去し、残留物を酢酸エチル:ジエチルエーテル = １：１の溶媒で洗うことで、化合物４の粗精製物を得た。

（３）化合物７の合成
化合物５（3.6 g, 20 mmol）と化合物６（3.1 mL, 20 mmol）を混合し、130℃で3時間加熱した後に室温に戻すことで、淡黄色の化合物７（7.2 g, 20 mmol）を得た。

（４）化合物８の合成
化合物４（粗精製物, ～3.5 mmol）に化合物７（900 mg, 2.45 mmol）を加え、室温で激しく攪拌した後に、トリエチルアミン（6 mL）を加えて、さらに5分間攪拌した。この反応液に15 mLの濃塩酸を加え、0℃で30分間撹拌した。暗紫色の反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥させた後、溶液を濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで溶媒留去した。残留物をC18カラムを用いた逆相クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 10：90から 30：70の直線勾配）で粗精製することで、化合物８の粗精製物を得た。

（５）化合物９の合成
化合物８の粗精製物（0.52 g）に1-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン（1.2 g, 54 mmol）と1,2-ジクロロエタン（20 mL）を加え、50℃で2時間撹拌した。室温に冷ました後に、反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去した。さらに、残留物をアミノシリカゲルを用いたクロマトグラフィー（メタノール:酢酸エチル = 0：100から 50：50の直線勾配）によって粗精製し、化合物９の粗精製物を得た。

（６）化合物10の合成
化合物９の粗精製物にトリフルオロ酢酸（3 mL）を加えて0℃で20分間撹拌した後、反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去した。残留物をC18カラムを用いた逆相クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 1：99から 100：0の直線勾配）で精製することで、赤色固体としての化合物10（193 mg, 0.34 mmol, 収率9.8%（化合物３を出発原料とした４ステップ））を得た。

実施例２リンカーの縮合
スキーム４に従って、実施例１で合成した化合物をリンカーで結合し、本発明の式（I）の化合物に包含される、DNA結合部位を二箇所有する新規蛍光色素群の合成に成功した。

（１）化合物11の合成
化合物10（20 mg, 0.035 mmol）を3 mLのジクロロメタン（超脱水）に溶解し、トリエチルアミンを1滴と塩化アセチルを１滴加え、0℃で30分間撹拌した。反応液に2 mLのメタノールを加え、さらに5分間室温で撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去し、残留物をC18カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 30：70から100：0の直線勾配）で精製することで、赤色固体としての化合物11（16 mg, 0.026 mmol, 収率75%）を得た。

（２）化合物12の合成
3,6-ジオキサオクタン二酸（6.4 mg, 0.036 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（46 mg, 0.24 mmol）、N-ヒドロキシこはく酸イミド（27.5 mg, 0.24 mmol）、N, N-ジイソプロピルエチルアミン（80 μL, 0.46 mmol）を3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解し、3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解した化合物10（54 mg, 0.096 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去し、残留物をC18カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 30：70から 100：0の直線勾配）で精製することで、赤色固体としての化合物12（7.1 mg, 0.056 mmol, 収率16%）を得た。

（３）化合物13の合成
3,6,9-トリオキサウンデカン二酸（2.8 mg, 0.016 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（4.0 mg, 0.021 mmol）、N-ヒドロキシこはく酸イミド（2.0 mg, 0.017 mmol）、N, N-ジイソプロピルエチルアミン（8.0 μL, 0.046 mmol）を3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解し、3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解した化合物10（17 mg, 0.030 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去し、残留物をC18カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 30：70から 100：0の直線勾配）で精製することで、赤色固体としての化合物13（3.3 mg, 0.0025 mmol, 収率17%）を得た。

（４）化合物14の合成
3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン二酸（3.2 mg, 0.012 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（7.4 mg, 0.039 mmol）、N-ヒドロキシこはく酸）を3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解し、3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド（超脱水）に溶解した化合物10（17 mg, 0.030 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで溶媒留去し、残留物をC18カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル（0.1% トリフルオロ酢酸を含む）：水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） = 30：70から 100：0の直線勾配）で精製することで、赤色固体としての化合物14（2.2 mg, 0.0016 mmol, 収率14%）を得た。

実施例３各種蛍光色素の吸収／蛍光スペクトルの測定
SYBR Gold、SYBR Green I、実施例２で製造した化合物11、化合物13、及び化合物14をそれぞれ約1 μMとなるようにTEバッファー（pH 8.0）800 μLに溶解し、光路長0.5 cmの石英製セルを用いて吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。次に、それぞれの溶液にデオキシリボ核酸（サケ精液由来）500-1000 bpのTE buffer溶液 (970 ng/μl)を10 μlずつ加え、同様にして吸収・蛍光スペクトルを測定した。
（結果）
図３(H)、(I)、(J)に示されるように、化合物11、化合物13、及び化合物14はDNAを添加することで、強い蛍光増大が見られた。化合物11、化合物13、及び化合物14は、DNAとの結合によって波長520nmの蛍光が500倍以上に上昇した。リンカーの鎖長による蛍光強度の大きな違いは見られなかった。

実施例４各種蛍光色素のDNA結合アッセイ
SYBR Gold、SYBR Green I、化合物11、化合物13、化合物14のそれぞれの色素（終濃度：200、400、800 nM）とデオキシリボ核酸（サケ精液由来）500-1000 bp （終濃度：0.5、1、2、3、4、6、8.5、12 μM）のTEバッファー（pH 8.0）溶液を96ウェルプレート上で調製し、プレートリーダーを用いて蛍光強度を測定した（励起波長：475 nm、蛍光波長：520 nm）。得られた結果をMcGhee-von Hippelの式（数１）でフィッティングすることによって、解離定数（K_d）と色素が結合する部位に占める塩基対の数（N）を求めた。

（結果）
図４(A)-(E)はDNA濃度と各化合物の蛍光強度を示すグラフである。表１に、解離定数K_dと色素が結合する部位に占める塩基対の数Nを示す。

化合物13及び化合物14は、分子内の２箇所のDNA結合部位がDNAと相互作用するため、１箇所のみで相互作用する化合物11と比べてDNAとの結合力が向上する。表１の解離定数K_d値は、二量体である化合物13と化合物14では低下し、結合能が向上した。
化合物13（n=3）が最も高いDNA結合能力を示した。化合物13は、市販の蛍光試薬と比較して低い解離定数を示した。また、化合物13と化合物14では色素が結合する部位に占める塩基対の数Nの値が増加しており、二箇所の塩基対に同時にインターカレートしていることが示された。

実施例５ DNA電気泳動試験－後染め試験
Gene Ruler 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific)に含まれる50, 100, 150, 200 bpのDNA量がそれぞれ3500, 700, 140, 70, 23 pgとなる溶液を8%ポリアクリルアミドゲルにロードし、TBEバッファーを用いて100 Vで30分間の電気泳動を行った。泳動後のゲルをSYBR Gold、SYBR Green I、化合物11、化合物13または化合物14のTEバッファー溶液（各1 μM）で30分間染色し、ゲルイメージャー iBright FL1500 Imaging System（Thermo Fisher Scientific）で蛍光検出した（励起波長：455-485 nm、蛍光波長：508-557 nm、露光時間：2秒）。
（結果）
図５に示されるように、どの色素を用いても、検出感度に大きな差は見られなかった。その理由としては、本条件下ではDNAに対する色素量が過剰であったためと考えられる。SYBR Goldはバックグラウンドノイズの強度が高いが、化合物11、化合物13、及び化合物14はSYBR Gold に比較してバックグラウンドノイズの強度が低く、DNA結合時の蛍光強度との差がより明確であった。

実施例６ DNA電気泳動試験－DNA先染め試験
Gene Ruler 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific)に含まれる50, 100, 150, 200 bpのDNA量がそれぞれ3500, 700, 140 pgとなり、SYBR Gold、SYBR Green I、化合物11、化合物13または化合物14がそれぞれ最終濃度0.67 μMとなる溶液各6 μLを8%ポリアクリルアミドゲルにロードし、TBEバッファーを用いて100 Vで30分間の電気泳動を行った。泳動後のゲルをゲルイメージャー iBright FL1500 Imaging System（Thermo Fisher Scientific）で蛍光検出し（励起波長：455-485 nm、蛍光波長：508-557 nm、露光時間：0.4秒）、それぞれのバンドの蛍光強度を定量解析した。
（結果）
図６及び表２に示すように、化合物13及び化合物14は、二量体であることで、DNA 検出力が向上し、化合物11の単量体と比較してDNA 結合力が向上したことが示された。また、化合物13（n = 3）は化合物14（n = 4）に比較して検出感度が高く、鎖長として最適である可能性がある。化合物13は、市販の蛍光試薬と比較して低い解離定数を示し、DNA先染め条件での電気泳動試験において高い蛍光を示すことに成功した。

実施例７ DNA電気泳動試験－DNA先染め試験
Gene Ruler 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific)に含まれる全DNA量が10 ngとなり、SYBR Gold、化合物13または化合物14が最終濃度2 μMとなる溶液各4 μL、または、がん患者の実検体から抽出したcfDNAサンプルに含まれる全DNA量が3.9 ngとなり、SYBR Gold、化合物13または化合物14が最終濃度0.5 μM、１ μM，または2 μMとなる溶液各4 μLを12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、TBEバッファーを用いて350 Vで30分間の電気泳動を行った。泳動後のゲルにゲル撮影装置（Bio-Pyramid；Mecan Imaging製）に内蔵された470 nmのLED光を照射し、デジタルカメラ（XZ-2；OLYMPUS製）で撮影した（露光時間8秒）。
（結果）
図７に四角枠で囲んで示すように、cfDNA/ctDNAに特徴的な160bp付近のバンドが染色できた。バンドの蛍光強度をImageJにより定量解析したところ、160 bp付近のcfDNAのピークの蛍光強度は、化合物13 と化合物14ではほぼ同じで、いずれの化合物の蛍光強度もSYBR Goldより強かった（図８）。検出試薬に市販のSYBRGoldを用いたときよりも、今回開発した化合物13(n=3)や化合物14(n=4)のほうがより高感度にcfDNA/ctDNAのバンドを検出できることが示された。

このように、実検体サンプル（ガン患者から抽出したcfDNA）を用いた試験でも、化合物13, 14 は、SYBR Goldよりも高感度でcfDNA (or ctDNA)を検出可能であることが示された。

Claims

下記の式（I）の化合物。
（式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して、炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して、炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Aは、下記のいずれかであり、
（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2から6までの範囲の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2から6までの範囲の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2から6までの範囲の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^-はカウンターアニオンである。)
下記の式（Ia）の化合物である請求項１に記載の化合物。
（式中、
各R¹は独立してメチルまたはエチルであり、
Aは、下記のいずれかであり、
（式中、R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）である。)
Lは、－CO－（CH₂－O－CH₂）_n－CO－（nは2～6の整数である）、－CO－（CH₂CH₂－O－CH₂CH₂）_p－CO－（pは2～6の整数である）、又は－（CH₂）_q－(qは2～6の整数である）であり、
Y^-はカウンターアニオンである。)
請求項１又は２に記載の化合物からなる蛍光色素。
下記の式（II）の化合物。
（式中、
各R¹は独立して炭素数1-6のアルキルであり、
各R²は独立して炭素数1-6のアルキル及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
XはS又はOであり、
各R³は独立して炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
各R⁴はフェニル基であり、
各R⁵は独立して水素、炭素数1-6のアルキル、及びハロゲンから成る群から選択される基であり、
mは0、1又は2であり、
sは独立して0、1、2、3又は4であり、
tは独立して0、1、2、3又は4であり、
Bは、下記のいずれかであり、
（式中、R¹⁰は水素又は－COO－R¹¹で表されるエステルであり、R¹¹は炭素数1-6のアルキルであり、
R⁶及びR⁸は独立して水素又は炭素数1-6のアルキルであり、R⁷は－（CH₂）_r－(rは2～6の整数である）であり、
R⁹は水素又は－COO－R¹²で表されるエステルであり、R¹²は炭素数1-6のアルキルである。)
Y^-はカウンターアニオンである。)
請求項１又は２に記載の化合物を備えた、試料中の核酸を検出するためのキット。
試料中の核酸と、請求項１又は２に記載の化合物とを、接触させること、及び
前記核酸と前記化合物の複合体の蛍光強度を検出すること
を含む核酸の検出方法。
前記核酸を支持体上に固定化させる工程をさらに含み、
前記蛍光強度は、支持体上の前記核酸と前記化合物の複合体の蛍光強度を検出することを含む請求項６に記載の検出方法。
前記接触させる工程は、前記試料と前記化合物とを混合して混合液を調製することを含み、
前記固定化させる工程は、前記混合液を電気泳動によりゲル上に固定することを含む、請求項７に記載の検出方法。
前記核酸がDNA又はRNAである請求項６に記載の方法。