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JP7780951B2 - ヌクレオチド修飾に基づく枯渇のための組成物及び方法 - Google Patents
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JP7780951B2 - ヌクレオチド修飾に基づく枯渇のための組成物及び方法 - Google Patents

ヌクレオチド修飾に基づく枯渇のための組成物及び方法

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年４月９日に出願された米国仮出願第６２，８３１，３０２号の優先権及び利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列リストの組込み
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列リストのコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＡＲＣＢ＿０１３０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ、記録日：２０２０年４月６日、ファイルサイズ：１３ＫＢ）。
ヒトの臨床ＤＮＡサンプル及びＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリ等のサンプルライブラリには、有益な価値がほとんどなく、配列のコストが増加する配列が含まれている。これらの不要な配列を（例えば、ハイブリダイゼーション捕捉を介して）枯渇させ、目的の配列を濃縮するための方法が開発されてきたが、これらの方法は時間及び費用を要することが多い可能性がある。したがって、当技術分野では、ライブラリから不要な配列を枯渇させる方法が必要とされている。本発明は、目的の配列と枯渇の標的とされる配列との間のヌクレオチド修飾の違いを使用して、ライブラリから配列を枯渇させ、望ましい配列を濃縮するための方法を提供する。
本開示は、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法を提供し、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用することを含む。
本開示は、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法を提供し、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用することを含み、サイズ選択又は修飾感受性標的結合を含まない。
本開示は、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法を提供し、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用して、標的の核酸をアダプタに連結させ、枯渇の標的とされる核酸には連結させないことを含む。
本開示は、目的の核酸に対してサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素の複数の第１の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を最終的に脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくともいくつかの切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、（ｄ）複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸に対して濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、それぞれ、第１の修飾感受性制限酵素のための複数の第１の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、複数の第１の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチド修飾の頻度は、目的の核酸において、枯渇の標的とされる核酸と同じではない。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、第１の修飾感受性制限酵素の活性は、その同種の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸における複数の第１の認識部位は、目的の核酸における複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、第１の修飾感受性制限酵素は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位では活性ではない。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸における複数の第１の認識部位は、目的の核酸における複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、工程（ｄ）の前に、核酸のリン酸化末端からのヌクレオチドの連続的な除去を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）第２の修飾感受性制限酵素が第２の認識部位を切断することを可能にする条件下で、（ｄ）からのアダプタ連結核酸を第２の修飾感受性制限酵素と接触させることを更に含み、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが第２の修飾感受性制限酵素の複数の第２の認識部位を含み、第２の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位を標的し、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を標的とせず、それによって一端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる核酸のコレクション、及び両端がアダプタ連結される目的の核酸のコレクションが生成される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、工程（ｄ）後にサンプルを複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ここで、ｇＮＡは、枯渇の標的とされる核酸と相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである。
本開示は、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットは、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸の修飾感受性制限部位の切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させ、それにより、露出した末端リン酸を有する核酸を生成することと、（ｄ）核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下でサンプルをエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸はそれぞれ、修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸における複数の認識部位は、目的の核酸における複数の認識部位よりも頻繁に修飾される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｄ）からのサンプルをアダプタと接触させ、それによって５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、工程（ｄ）後にサンプルを複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ここで、ｇＮＡは、枯渇の標的とされる核酸と相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである。
本開示は、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットは、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、サンプルをアダプタと接触させることと、（ｃ）サンプル中の核酸の修飾感受性制限部位の切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方はそれぞれ、修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸における複数の認識部位は、目的の核酸における複数の認識部位よりも頻繁に修飾される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、工程（ｄ）後にサンプルを複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ここで、ｇＮＡは、枯渇の標的とされる核酸と相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである。
本開示は、目的の核酸に対してサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素の複数の第１の認識部位を含み、第１の修飾感受性制限酵素の活性が、同種認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断されることと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくともいくつかの切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、（ｄ）複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸に対して濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、それぞれ、第１の修飾感受性制限酵素のための複数の第１の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、複数の第１の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチド修飾の頻度は、目的の核酸において、枯渇の標的とされる核酸と同じではない。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸における複数の第１の認識部位は、目的の核酸における複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、アダプタを使用してそれらの５’及び３’末端でアダプタ連結される目的の核酸を増幅、シークエンシング又はクローニングすることを更に含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾は、アデニン修飾又はシトシン修飾を含む。いくつかの実施形態では、アデニン修飾は、アデニンメチル化を含む。いくつかの実施形態では、アデニンメチル化は、Ｄａｍメチル化又はＥｃｏＫＩメチル化を含む。いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む。いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、シトシンメチル化を含む。いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣメチル化又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、Ｄｃｍメチル化、ＤＮＭＴ１メチル化、ＤＮＭＴ３Ａメチル化又はＤＮＭＴ３Ｂメチル化を含む。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、宿主核酸を含み、目的の核酸は、非宿主核酸を含む。
図１は、本開示の例示的な方法を示す図である。サンプル中の核酸は脱リン酸化され、次いで制限酵素認識部位における修飾の存在によって遮断される制限酵素で消化される。次に、消化によって露出したリン酸を使用して、アダプタを目的の核酸に連結させる。
図２は、本開示の例示的な方法を示す図である。サンプル中の核酸は脱リン酸化され、次いで、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む制限酵素部位を認識する制限酵素で消化される。次に、切断された核酸を、露出した末端リン酸を使用するエキソヌクレアーゼで消化し、アダプタを残りの目的の核酸に連結させる。
図３は、本開示の例示的な方法を示す図である。サンプル中の核酸はアダプタ連結され、次に、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む制限酵素部位を認識する制限酵素で消化され、両端でアダプタ連結される目的の核酸が得られる。
図４は、本開示の例示的な方法を示す図である。サンプル中の核酸はアダプタ連結され、次に、枯渇の標的とされる核酸を切断する核酸誘導型ヌクレアーゼで切断され、両端でアダプタ連結される目的の核酸が得られる。この方法は、本開示のヌクレオチド修飾に基づく方法と組み合わせて使用することができる。
ゲノム内のエピジェネティックなヌクレオチド修飾は種によって異なる。例えば、ヌクレオチド修飾の頻度及び種類は、脊椎動物と細菌、真菌、ウイルスとの間で異なる。更に、メチル化等の修飾は、ヒトゲノム等の一部のゲノムでは、転写活性部位（遺伝子及び／又は遺伝子のプロモータ等）でより頻繁に発生し、ゲノムの他の部位（反復領域等）ではあまり発生しない。一部の制限酵素は、同種の認識部位又はその隣接部位でのヌクレオチド修飾に感受性がある。配列間のヌクレオチド修飾の違いを利用して、修飾感受性制限酵素を使用して目的の核酸のサンプルを濃縮することが可能である。
本開示は、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾頻度の差を使用することを含む、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供する。本開示の方法は、ライブラリの複雑さの低減、及びＰＣＲ増幅、クローニング、ハイスループットシークエンシング、混合集団における稀な配列の同定及びライブラリ内の配列の定量化を含むがこれらに限定されない様々な下流の用途で使用できる配列の濃縮を可能にする。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、２００倍、約５００倍、又は約１０００倍に濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について少なくとも約２倍濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について少なくとも約３倍濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について少なくとも約２倍～約３倍濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について少なくとも約１２倍濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の核酸について少なくとも約１５倍濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、枯渇の標的とされる核酸について少なくとも約５０％～約７０％枯渇する。いくつかの実施形態では、サンプルは、枯渇の標的とされる核酸について少なくとも約９５％枯渇する。
本開示は、目的の核酸に対してサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、少なくとも目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素の複数の第１の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくともいくつかの切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、（ｄ）複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸に対して濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示は、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットは、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を最終的に脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸の修飾感受性制限部位の切断を可能にする条件下で（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させ、それにより、露出した末端リン酸を有する核酸を生成することと、（ｄ）核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下でサンプルをエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、目的の核酸が濃縮されたサンプルが生成することと、を含む。
本開示は、目的の核酸に対してサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素の複数の第１の認識部位を含み、第１の修飾感受性制限酵素の活性が、同種の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断されることと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、（ｃ）サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくともいくつかの切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、（ｄ）複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸に対して濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示は、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供し、（ａ）目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、少なくとも枯渇の標的とされる核酸は、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、（ｂ）サンプル中の複数の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、サンプルをアダプタと接触させることと、（ｃ）サンプル中の核酸の修飾感受性制限部位の切断を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させ、これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む。
本開示は、枯渇の標的とされる核酸の消化によって枯渇の標的とされる核酸を枯渇させ、それにより、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供する。
本開示は、枯渇の標的とされる核酸及び目的の核酸への示差的アダプタ付着によって、標的とされる核酸の消化によって枯渇の標的とされる核酸を枯渇させ、それによって目的の核酸のサンプルを濃縮する方法を提供する。
本開示は、サイズ選択を使用せずに、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる方法を提供する。
本開示は、修飾感受性標的結合を使用せずに、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させ、それにより、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供する。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる方法は、ＣｐＧ感受性標的化結合を使用しない。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素を含む本開示の方法は、目的の核酸についてサンプルを濃縮するための独立した方法として使用される。代替の実施形態では、ヌクレオチド修飾の違いに基づく本開示の方法は、サンプル濃縮の１つ又は複数の追加の方法と組み合わされる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される濃縮方法のいずれかは、本明細書に開示される他の任意の追加の濃縮方法と組み合わされる。いくつかの実施形態では、追加の方法は、ヌクレオチド修飾に基づく方法である。いくつかの実施形態では、追加の方法は、ガイド核酸（ｇＮＡ）及び核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを使用する。いくつかの実施形態では、追加の方法は、ヌクレオチド修飾に基づく濃縮方法と、ガイド核酸（ｇＮＡ）及び核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを使用する濃縮方法との組合せである。いくつかの実施形態では、追加の方法は、枯渇の標的とされる核酸の消化によって、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。いくつかの実施形態では、追加の方法は、本開示の方法を使用して、示差的アダプタ付着による枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。いくつかの実施形態では、追加の方法は、サイズ選択を使用せずに、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。いくつかの実施形態では、追加の方法は、修飾感受性標的化結合を使用することなく、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。いくつかの実施形態では、追加の方法は、ＣｐＧ感受性標的化結合を使用することなく、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全て技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の又は同等のいかなる方法及び材料も本開示の実施又はテストに使用することができるが、好ましい方法及び材料を説明する。
数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。
この仕様を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。以下に記載されている定義が、参照により本書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、記載されている定義が優先するものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、複数形の参照を含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体に向けられた実施形態を含む（及び説明する）。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの改変バージョンから選択される１つ又は複数のサブユニットを含むことができる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びそれらの組合せ、又は誘導体を含む。核酸は一本鎖及び／又は二本鎖であり得る。
核酸は、「ヌクレオチド」を含み、これは、本明細書で使用される場合、プリン及びピリミジン塩基、並びにそれらの修飾バージョンを含む部分を含むことを意図している。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、任意の長さ、例えば、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、最大約１０，０００又は１０，０００超の核酸ポリマーを説明するために使用され、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成され、酵素的又は合成的に生成され得（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそこに引用される参考文献に記載されるＰＮＡ）、類似の配列特異的方法で天然に存在する２つの核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン－クリック塩基対相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニン、及びチミン（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＴ）が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡはデオキシリボース及びリボース糖バックボーンをそれぞれ有し、ＰＮＡバックボーンは繰り返しＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位によって構成され、ペプチド結合によって連結している。ＰＮＡでは様々なプリン及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によってバックボーンに連結している。アクセスできないＲＮＡと呼ばれることが多いロックされた核酸（ＬＮＡ）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素及び４’炭素を接続する追加のブリッジで修飾されている。ブリッジは、３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）コンフォメーションでリボースを「ロック」し、これは、Ａ型デュプレックスでよく見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、必要に応じてオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合できる。「非構造化核酸」又は「ＵＮＡ」という用語は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含む核酸である。例えば、構造化されていない核酸は、Ｇ’残基及びＣ’残基を含み得、これらの残基は、天然に存在しない形態、すなわち、互いに安定性が低下した塩基対であるＧ及びＣの類似体であるが、それぞれ天然に存在するＣ及びＧ残基の塩基対の能力を保持する。非構造化核酸は米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号に記載されており、ＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
「修飾ヌクレオチド」には、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、アルキル化リボースあるいは他の複素環が含まれるが、これらに限定されない。例示的な修飾には、シトシン修飾、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンが含まれるがこれだけに限定されない。
本明細書で使用される「切断」とも呼ばれる「開裂」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖の２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し、それによってＤＮＡ分子の二本鎖破壊をもたらす反応を指す。
本明細書で使用される「ニッキング」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖のみにおいて２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し、それによってＤＮＡ分子の一本鎖の破壊をもたらす反応を指す。
本明細書で使用される「開裂部位」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子が開裂された部位を指す。
「捕捉」及び「濃縮」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、目的の配列、目的の標的部位、目的ではない配列、又は目的ではない標的部位を含む核酸領域を選択的に単離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の配列、又は目的ではない配列を選択的に枯渇させることによって捕捉された目的の配列について濃縮される。核酸領域の単離は、場合によっては、下流の用途に適した方法で目的の核酸領域を選択的に変更することによって達成され得る。例えば、単離された核酸は、核酸の５’及び３’末端に連結したアダプタを選択的に有するものであり得る。
「次世代シークエンシング」という用語は、いわゆる並列化された合成によるシークエンシング又は連結によるシークエンシングプラットフォームを指し、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及びＲｏｃｈｅ等で現在採用されているプラットフォームである。次世代シークエンシング方法は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術等のナノポアシークエンシング法又は電子検出ベースの方法も含み得る。
サンプル
あらゆる種類のサンプルから単離又は誘導された核酸は、本開示の方法の範囲内であると見なされる。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、サンプルは、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルである。臨床及び法医学のサンプルには、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿組織、及び生検サンプルが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、サンプルはメタゲノムサンプル（複数の生物種を含有するサンプル）である。いくつかの実施形態では、メタゲノムサンプルは、他の非宿主生物（例えば、１つ又は複数のウイルス、細菌、真菌又は真核生物の寄生生物を有する哺乳動物）に対して宿主である生物から単離又は誘導されたサンプルを含む。いくつかの実施形態では、メタゲノムサンプルは、微生物群集のサンプル（例えば、バイオフィルム）を含む。
いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は断片化されている。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸は断片化される。
いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、長さ約２０～約５０００塩基対（ｂｐ）、長さ約２０～約１０００ｂｐ、長さ約２０～約５００ｂｐ、長さ約２０～約４００ｂｐ、長さ約２０～約３００ｂｐ、長さ約２０～約２００ｂｐ、長さ約２０～１００ｂｐ、長さ約５０～約５０００ｂｐ、長さ約５０～約１０００ｂｐ、長さ約５０～約５００ｂｐ、長さ約５０～約４００ｂｐ、長さ約５０～約３００ｂｐ、長さ約５０～約２００ｂｐ、長さ約５０～１００ｂｐ、長さ約１００～約５０００ｂｐ、長さ約１００～約１０００ｂｐ、長さ約１００～約５００ｂｐ、長さ約１００～約４００ｂｐ、長さ約１００～約３００ｂｐ、長さ約１００～約２００ｂｐである。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、長さが約５０～約１０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、長さが約５０～約５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、長さが約１００～約５００ｂｐである。
目的の核酸
本明細書で提供されるのは、サンプル中の核酸の増幅、クローニング、ハイスループットシークエンシング、検出及び定量化を含むがこれらに限定されない様々な用途のためにサンプル中の目的の核酸を濃縮するために使用できる方法である。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、少なくとも第１の修飾感受性制限酵素のための少なくとも１つの認識部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、少なくとも第１の修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、第１及び第２の修飾感受性制限酵素のそれぞれについての複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の修飾感受性制限酵素の活性は、その同種の制限部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の修飾感受性制限酵素は、認識内又は認識に隣接する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、認識部位内又は認識部位に隣接する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位では活性ではない。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸ではなく、目的の核酸のみが、少なくとも１つの第１の修飾感受性制限酵素のための１つ又は複数の制限部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、第１の、及び場合により第２の修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含むが、認識部位が、認識部位に隣接する、又は認識部位内の修飾ヌクレオチドを含む頻度が異なる。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、２つを超える（すなわち、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０）修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸はそれぞれ、２つを超える（すなわち、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０）修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含む。
いくつかの例示的な実施形態において、目的の核酸は、ＣｐＧメチル化を欠くか、又は低レベルのＣｐＧメチル化を有する種（例えば、ウイルス、真菌又は細菌等の非宿主種）に由来する。逆に、そのような実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）等のより高レベルのＣｐＧメチル化を有する種に由来する。当業者は、１つ又は複数のＣＧ二量体を含み、ＣｐＧメチル化の存在によってその活性が遮断される認識部位を有する修飾感受性制限酵素を選択し、本開示の方法を使用して核酸を目的の核酸を濃縮することができる。
いくつかの例示的な実施形態において、目的の核酸は、ＣｐＧメチル化を欠くか、又は低レベルのＣｐＧメチル化を有する種（例えば、ウイルス、真菌又は細菌等の非宿主種）に由来する。逆に、そのような実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）等のより高レベルのＣｐＧメチル化を有する種に由来する。当業者は、１つ又は複数のＣＧ二量体を含み、その活性が認識部位内又は認識部位の近くでＣｐＧメチル化の存在に特異的である認識部位を有する修飾感受性制限酵素を選択し、本開示の方法を使用して目的の核酸を濃縮することができる。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、ゲノム配列（ゲノムＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、哺乳動物のゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、真核生物のゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、原核生物のゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の配列は、ウイルスゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、細菌ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、植物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、微生物のゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の配列は、寄生生物、例えば真核生物の寄生生物からのゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、病原体、例えば、細菌、ウイルス又は真菌からのゲノム配列である。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、複数の細菌、ウイルス又は真菌種からのゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、又はゲノム全体であり得る。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、反復配列を含む。例示的であるが非限定的な反復配列には、ミトコンドリア配列、リボソーム配列、セントロメア配列、Ａｌｕ配列、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）及び短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、真核生物又は原核生物から、哺乳動物生物又は非哺乳動物生物から、動物又は植物から、細菌又はウイルスから、動物の寄生生物から、病原体からのものである。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、細菌の種に由来する。一実施形態では、細菌は結核を引き起こす細菌である。
いくつかの実施形態では、目的の核酸はウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、真菌の種に由来する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、藻類の種に由来する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物に由来する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物はマラリアを引き起こす寄生虫である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生虫である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、病原体に由来する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、長さ約２０～約５０００ｂｐ、長さ約２０～約１０００ｂｐ、長さ約２０～約５００ｂｐ、長さ約２０～約４００ｂｐ、長さ約２０～約３００ｂｐ、長さ約２０～約２００ｂｐ、長さ約２０～約１００ｂｐ、長さ約５０～約５０００ｂｐ、長さ約５０～約１０００ｂｐ、長さ約５０～約５００ｂｐ、長さ約５０～約４００ｂｐ、長さ約５０～約３００ｂｐ、長さ約５０～約２００ｂｐ、長さ約５０～約１００ｂｐ、長さ約１００～約５０００ｂｐ、長さ約１００～約１０００ｂｐ、長さ約１００～約５００ｂｐ、長さ約１００～約４００ｂｐ、長さ約１００～約３００ｂｐ、長さ約１００～約２００ｂｐである。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、長さが約５０～約１０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、長さが約５０～約５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、長さが約１００～約５００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、サンプル中の全核酸の７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を構成する。
いくつかの例示的な実施形態において、目的の核酸は、サンプル中の全核酸の５０％未満を構成する。
いくつかの例示的な実施形態において、目的の核酸は、サンプル中の全核酸の３０％未満を構成する。
いくつかの例示的な実施形態において、目的の核酸は、サンプル中の全核酸の５％未満を構成する。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、サンプル中の全核酸の少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％を構成する。
枯渇の標的とされる核酸
本明細書で提供されるのは、サンプルから核酸を枯渇させ、増幅、クローニング、ハイスループットシークエンシング、サンプル中の核酸の検出と定量化を含むがこれらに限定されない様々な用途に使用できる目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成するために使用できる方法である。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、少なくとも１つの第１の修飾感受性制限酵素のための少なくとも１つの認識部位を含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、少なくとも１つの第１の修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、第１及び第２の修飾感受性制限酵素のそれぞれについての複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の修飾感受性制限酵素の活性は、その同種の制限部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の修飾感受性制限酵素は、認識内又は認識に隣接する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、認識部位内又は認識部位の近くに少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位では活性ではない。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸のみが、目的の核酸を含まず、少なくとも第１の修飾感受性制限酵素のための１つ又は複数の制限部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、第１の、及び場合により第２の修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含むが、認識部位が、認識部位に隣接する、又は認識部位内の修飾ヌクレオチドを含む頻度が異なる。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、２つを超える（すなわち、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０）修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸はそれぞれ、２つを超える（すなわち、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０）修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含む。
いくつかの例示的な実施形態において、枯渇の標的とされる核酸は、ヒトＲＮＡ又はＤＮＡを含む。場合によっては、全てヒト核酸が枯渇の標的とされる。
いくつかの例示的な実施形態において、枯渇の標的とされる核酸は、目的の核酸と比較して高いレベルのＣｐＧメチル化を有する哺乳動物（例えば、ヒト）等の宿主種に由来する。当業者は、１つ又は複数のＣＧ二量体を含み、ＣｐＧメチル化の存在によってその活性が遮断される認識部位を有する修飾感受性制限酵素を選択することができ、本開示の方法を使用して枯渇の標的とされる核酸を枯渇させ、目的の核酸が濃縮されたサンプルを得ることができるであろう。
いくつかの例示的な実施形態において、枯渇の標的とされる核酸は、目的の核酸と比較して高いレベルのＣｐＧメチル化を有する哺乳動物（例えば、ヒト）等の宿主種に由来する。当業者は、１つ又は複数のＣＧ二量体を含み、その活性が認識部位内又は認識部位の近くでＣｐＧメチル化の存在に特異的である認識部位を有する修飾感受性制限酵素を選択することができ、本開示の方法を使用して、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させ、目的の核酸が濃縮されたサンプルを得ることができるであろう。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、サンプル中の最も豊富な種の１つ又は複数のゲノムからの配列等の豊富なゲノム配列である。いくつかの実施形態では、サンプル中の最も豊富な種はヒトである。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、又はゲノム全体とすることができる。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、任意の哺乳動物生物に由来する。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、家畜動物、例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、又はロバである。別の実施形態では、哺乳動物生物は、飼いならされたペット、例えば、ネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物は一種のサルである。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、任意の鳥又は鳥類の生物に由来する。鳥類の生物には、鶏、七面鳥、アヒル、及びガチョウが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、昆虫に由来する。昆虫には、ミツバチ、単生ミツバチ、アリ、ハエ、スズメバチ、又は蚊が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、植物に由来する。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、小麦、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモ、又は綿である。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、反復ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、豊富なＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、ミトコンドリアＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、リボソームＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、セントロメアＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、Ａｌｕ配列を含むＤＮＡ（Ａｌｕ ＤＮＡ）を含むいくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、豊富なＤＮＡは、リボソームＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、癌遺伝子、挿入物、欠失、構造変異、エクソン、遺伝子突然変異、又は調節領域を含む。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、転写活性配列を含む。例えば、転写活性配列は、プロモータ及び転写活性遺伝子の配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ゲノムの転写活性領域は、ゲノムの転写サイレント領域よりも高レベルのヌクレオチド修飾を有する。いくつかの例示的な実施形態によれば、ゲノムは哺乳動物ゲノムであり、ヌクレオチド修飾はＣｐＧメチル化を含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、ゲノムはヒトゲノムであり、ヌクレオチド修飾はＣｐＧメチル化を含む。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、対象において一般的又は普及している核酸を含む。例えば、枯渇した核酸は、全て細胞型に共通の核酸、又は典型的又は健康な細胞により豊富な核酸を含み得る。枯渇に続いて、分析される残りの核酸は、次いで、細胞型特異的核酸等の、あまり一般的でないか、又はあまり普及していない核酸を含むことができる。これらのあまり一般的でない核酸は、１つ又は複数の特定の細胞型の細胞死を含む細胞死のシグナルである可能性がある。このようなシグナルは、感染症、癌、及びその他の疾患を示している可能性がある。場合によっては、シグナルは特定の組織における癌関連アポトーシスのシグナルである。細胞の混合集団から単離又は誘導されたサンプル中の核酸は、細胞型と本開示の方法との間のヌクレオチド修飾の違いを使用して、特定の細胞型からの核酸について濃縮することができる。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、長さ約２０～約５０００ｂｐ、長さ約２０～約１０００ｂｐ、長さ約２０～約５００ｂｐ、長さ約２０～約４００ｂｐ、長さ約２０～約３００ｂｐ、長さ約２０～約２００ｂｐ、長さ約２０～約１００ｂｐ、長さ約５０～約５０００ｂｐ、長さ約５０～約１０００ｂｐ、長さ約５０～約５００ｂｐ、長さ約５０～約４００ｂｐ、長さ約５０～約３００ｂｐ、長さ約５０～約２００ｂｐ、長さ約５０～約１００ｂｐ、長さ約１００～約５０００ｂｐ、長さ約１００～約１０００ｂｐ、長さ約１００～約５００ｂｐ、長さ約１００～約４００ｂｐ、長さ約１００～約３００ｂｐ、又は長さ約１００～約２００ｂｐである。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、長さが約５０～約１０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、長さが約５０～約５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、長さが約１００～約５００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、枯渇の標的とされる核酸は、サンプル中の全核酸の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を構成する。
宿主／非宿主核酸
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、非宿主核酸を含み、枯渇の標的とされる核酸は、宿主核酸を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、宿主は脊椎動物であり、非宿主はウイルス、細菌又は真菌である。いくつかの実施形態では、脊椎動物はヒトである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾は、ＣｐＧ、ＣｐＣ、ＣｐＡ又はＣｐＴメチル化を含み、これは、非宿主ゲノムよりも宿主ゲノムにおいてより頻繁に起こる。当業者は、１つ又は複数のＣＧ、ＣＣ、ＣＡ又はＣＴ二量体を含み、メチル化の存在によってその活性が遮断される認識部位を有する修飾感受性制限酵素を選択することができ、本開示の方法を使用して枯渇の標的とされる宿主核酸を枯渇させ、非宿主核酸が濃縮されたサンプルを得ることができるであろう。いくつかの実施形態では、宿主は真核生物である。いくつかの実施形態では、宿主は、哺乳動物、鳥、爬虫類、又は昆虫である。いくつかの実施形態では、宿主は植物である。例示的な哺乳動物には、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、又はスナネズミが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主は植物である。例示的な植物には、トウモロコシ、小麦、イネ、タバコ、トマト、オレンジ、リンゴ及びアーモンド等の農業用植物が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主はヒトである。
いくつかの実施形態では、非宿主は、複数の種の生物を含む。いくつかの実施形態では、非宿主は単一種の生物である。いくつかの実施形態では、非宿主は、細菌、真菌、ウイルス又は真核生物の寄生生物を含む。いくつかの実施形態では、非宿主は病原体である。
ヌクレオチド修飾
本明細書で提供されるのは、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の差を使用することを含む、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供する。本開示の範囲内であるとして、任意のタイプのヌクレオチド修飾が想定される。本開示のヌクレオチド修飾の例示的であるが非限定的な例を以下に記載する。
本開示の方法によって使用されるヌクレオチド修飾は、任意のヌクレオチド（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル）で起こり得る。これらのヌクレオチド修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）で発生する可能性がある。これらのヌクレオチド修飾は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ分子、あるいは二本鎖又は一本鎖ＲＮＡ分子で発生する可能性がある。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾は、アデニン修飾又はシトシン修飾を含む。
いくつかの実施形態では、アデニン修飾は、アデニンメチル化を含む。いくつかの実施形態では、アデニンメチル化は、Ｎ6－メチルアデニン（６ｍＡ）を含む。Ｎ6－メチルアデニン（６ｍＡ）は、原核生物及び真核生物の両方のゲノムに存在する。ゲノム内の６ｍＡメチル化の量は、種によって異なる。例えば、６ｍＡの存在量は、一般に、原核生物のゲノムよりも哺乳動物及び植物のゲノムの方が低くなっている。場合によっては、６ｍＡの存在量は、哺乳動物又は植物のゲノムと比較した場合、原核生物のゲノムでは少なくとも１，０００倍高くなる。いくつかの実施形態では、ゲノムにおける６ｍＡメチル化の位置は、種に基づいて変化する。例えば、６ｍＡのメチル化ヌクレオチドの位置（例えば、特定の制限酵素認識部位内）は、メチルトランスフェラーゼの活性に依存し、その発現と活性は種によって異なる。したがって、６ｍＡメチル化を使用して、複数のゲノムを含むサンプル中の真核生物と原核生物とのゲノムを区別し、本開示の方法を使用して、一方のゲノムから他方のゲノムまでの配列を選択的に濃縮することができる。
いくつかの実施形態では、アデニンメチル化は、Ｄａｍメチル化を含む。Ｄａｍメチル化は、デオキシアデノシンメチラーゼによって実行されるＤＮＡヌクレオチド修飾の一種である。デオキシアデノシンメチラーゼ（ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ又はダムメチラーゼとも呼ばれる）は、メチル基をＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から配列５’－ＧＡＴＣ－３のアデニン残基のＮ６位置に転移して６ｍＡを生成する酵素である。Ｄａｍメチル化及びＤａｍメチラーゼは、原核生物及びバクテリオファージに見られる。
いくつかの実施形態では、アデニンメチル化は、ＥｃｏＫＩメチル化を含む。ＥｃｏＫＩメチル化は、ＥｃｏＫＩメチラーゼによって実行されるＤＮＡヌクレオチド修飾の一種である。ＥｃｏＫＩメチラーゼは、配列ＡＡＣ（Ｎ6）ＧＴＧＣ（配列番号１）及びＧＣＡＣ（Ｎ6）ＧＴＴ（配列番号２）のアデニン残基を修飾する。ＥｃｏＫＩメチラーゼ及びＥｃｏＫＩメチル化は、原核生物に見られる。
いくつかの実施形態では、アデニン修飾は、グリシンによってＮ6で修飾されたアデニン（モミレーション（ｍｏｍｙｌａｔｉｏｎ））を含む。モミレーションの変化Ｎ６－（１－アセトアミド）－アデニンのアデニン。モミレーションは、バクテリオファージ等のウイルスで発生する。
いくつかの実施形態では、修飾は、シトシン修飾を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムにおけるシトシン修飾の存在量及びタイプは、種に基づいて変化する。いくつかの実施形態では、ゲノムにおけるシトシン修飾の位置（例えば、特定の制限酵素認識部位内）は、種に基づいて変化する。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン（５ｇｈｍＣ）又は３－メチルシトシン（３ｍＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、シトシンメチル化を含む。いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又はＮ４－メチルシトシン（４ｍＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、４ｍＣのシトシンメチル化が細菌に見られる。いくつかの実施形態では、細菌は、好熱性細菌、例えば、好熱性真正細菌又は好熱性古細菌である。
いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、Ｄｃｍメチル化を含む。Ｄｃｍメチル化は、Ｄｃｍメチラーゼによって実行されるメチル化の一種である。Ｄｃｍメチル化では、Ｄｃｍメチラーゼ（ＤＮＡ－シトシンメチルトランスフェラーゼ又はｄｃｍ遺伝子によってコードされる）がＣ５位置（５ｍＣ）で配列ＣＣＡＧＧ及びＣＣＴＧＧの内部（２番目の）シトシン残基をメチル化する。Ｄｃｍメチラーゼ及びＤｃｍメチル化は、Ｅ．コリ等の細菌に見られる。
いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、ＤＮＭＴ１メチル化、ＤＮＭＴ３Ａメチル化又はＤＮＭＴ３Ｂメチル化を含む。ＤＮＭＴ１（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ）、及びＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ベータ）は、ＣｐＧ、ＣｐＡ、ＣｐＴ、及びＣｐＣシトシンのメチル化を仲介する哺乳動物のメチルトランスフェラーゼである。
いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣメチル化又はそれらの組合せを含む。ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣは哺乳動物に見られる。メチル化されたシトシンは哺乳動物のＣｐＧ部位で頻繁に見られるが、ＣｐＡ、ＣｐＴ、ＣｐＣ等の非ＣｐＧ部位もメチル化される可能性がある。いくつかの実施形態では、非ＣｐＧメチル化は、多能性幹細胞、卵母細胞、及び神経系の細胞を含むがこれらに限定されない特定の細胞型に制限される。いくつかの実施形態では、非ＣｐＧシトシンメチル化は、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＴＭ３Ｂメチルトランスフェラーゼによって媒介される。いくつかの実施形態では、シトシンは、Ｃ５位置（５ｍＣ）でメチル化されている。したがって、ＣｐＡ、ＣｐＴ、及びＣｐＣのメチル化を使用して、混合細胞型のサンプルで異なる細胞型から単離又は誘導された核酸を区別することができる。
いくつかの実施形態では、シトシンメチル化は、ＣｐＧメチル化を含む。哺乳動物のＣｐＧメチル化は、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＤＮＭＴ３Ｂ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって媒介される。ＤＮＭＴ１は、主にＣｐＧ部位でヘミメチル化されたＤＮＡに結合する。ＤＮＡ複製後、新しく合成された鎖はメチル化を欠くが、親株はメチル化されたヌクレオチドを保持する。ＤＮＭＴ１は、ＤＮＡ複製によって生成されたヘミメチル化ＣｐＧ部位に結合し、新しく合成された鎖のシトシンをメチル化する。ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂは、結合するためにヘミメチル化ＤＮＡを必要とせず、ヘミメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の両方に対して同等の親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂは、５ｍＣメチル化を媒介する。哺乳動物では、ＣｐＧメチル化は、活性遺伝子のプロモータ等、ゲノムの転写活性部位でより頻繁に発生する。したがって、ＣｐＧメチル化を使用して、哺乳動物ゲノムの活性領域と不活性領域とを選択的に区別することができる。例えば、ＣｐＧメチル化は、本開示の方法を使用して、枯渇のために哺乳動物ゲノムの活性領域を選択的に標的化するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む。５ｈｍＣは５ｍＣの酸化誘導体である。５ｈｍＣは、ウイルス（バクテリオファージ等）及び一部の哺乳動物組織（脳等）に見られる。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む。５－ホルミルシトシンは５ｍＣの酸化誘導体である。５ｍＣは５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に酸化され、次に５ｆＣに酸化される。いくつかの実施形態では、これらの酸化工程のそれぞれは、１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素によって実行される。いくつかの実施形態では、５ｆＣは哺乳動物のゲノムに見られる。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）を含む。５ｃａＣは５ｍＣの最終酸化誘導体である。５ｍＣは５ｈｍＣに酸化され、次にＴＥＴファミリの酵素によって５ｆＣ、次に５ｃａＣに酸化される。いくつかの実施形態では、５ｃａＣは、哺乳動物のゲノムに見出される。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの実施形態では、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシンはウイルスに見られる。いくつかの実施形態では、ウイルスはバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、ウイルスは非宿主の種であり、ウイルス核酸はサンプル中の目的の核酸である。
いくつかの実施形態では、シトシン修飾は、３－メチルシトシンを含む。
修飾感受性制限酵素
本明細書で提供されるのは、１つ又は複数の修飾感受性制限酵素によって認識される、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の差を使用することを含む、枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を提供する。本明細書に記載のヌクレオチド修飾のいずれかに感受性のある任意のタイプの制限酵素は、本開示の範囲内にある。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、少なくとも第１の修飾感受性制限酵素及び第２の修飾感受性制限酵素を使用する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の修飾感受性制限酵素は同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の修飾感受性制限酵素は同じではない。いくつかの実施形態では、第１又は第２の修飾感受性制限酵素は、単一種の制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ又はＭｃｒＢＣであるが、両方ではない）である。いくつかの実施形態では、第１又は第２の修飾感受性制限酵素は、２つ以上の種の修飾感受性制限酵素の混合物（例えば、ＦｓｐＥＩ及びＡｂａＳＩの混合物）である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、第１又は第２の修飾感受性制限酵素は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０又はそれを超える修飾感受性制限酵素の混合物を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、３つ以上の異なる方法が組み合わされ、それぞれが、異なる修飾感受性制限酵素又は修飾感受性制限酵素のカクテルを使用する。
本明細書で使用される「修飾感受性制限酵素」という用語は、制限酵素に対する認識部位内又は認識部位に隣接する修飾ヌクレオチドの存在に感受性がある制限酵素を指す。修飾感受性制限酵素は、認識部位自体内の修飾ヌクレオチドに感受性である可能性がある。修飾感受性制限酵素は、認識部位に隣接する修飾ヌクレオチド、例えば、認識部位の５’又は３’内の１～５０ヌクレオチドに感受性であり得る。修飾感受性制限酵素は、認識部位内の修飾ヌクレオチド及び認識部位に隣接する修飾ヌクレオチドの両方に感受性であり得る。本明細書で使用される「認識部位」という用語は、制限酵素によって認識される特定の配列を含むポリヌクレオチド内の部位を指す。制限酵素は、ポリヌクレオチドの認識部位内、又は認識部位の近くで切断する。いくつかの実施形態では、制限酵素は、認識部位の１～１０５ヌクレオチド内で切断する。いくつかの実施形態では、制限酵素は、ポリヌクレオチドにおいて３キロベース以上離れている可能性がある一対の認識ハーフ部位を認識する。いくつかの実施形態では、制限酵素は、ポリヌクレオチド中の特定の配列（認識部位）を認識する。いくつかの実施形態では、認識部位は、３～２０ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、認識部位はパリンドロームである。
本開示のヌクレオチド修飾は、認識部位自体内にあるか、又は認識部位に隣接するヌクレオチドを含むことができる（例えば、認識部位の１～５０ヌクレオチド、５’又は３’、又はその両方内）。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する単一の修飾ヌクレオチドに対して感受性である。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する複数の修飾ヌクレオチドに対して感受性である。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する１つ又は複数のヌクレオチド上の特定の１つ又は複数のタイプの修飾（例えば、メチル化、ヒドロキシメチル化又はカルボキシル化）に対して感受性である。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する特定のヌクレオチド又は複数のヌクレオチドの修飾に対して感受性である。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する修飾ヌクレオチドの特定の空間的配置に感受性がある。例えば、修飾感受性制限酵素は、ＤＮＡポリヌクレオチドの認識部位内で、１又は２ヌクレオチド離れた、反対側の鎖上で、一対の修飾に対して感受性であり得る。
いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、認識部位内又は認識部位に隣接する１つ又は複数の修飾ヌクレオチドの存在によって遮断される。修飾ヌクレオチドの存在によって遮断される修飾感受性制限酵素は、修飾ヌクレオチドを含有しない認識部位で切断し、修飾ヌクレオチドを含有する認識部位においては、切断しないか、又は低レベルで切断する。
修飾ヌクレオチドによって活性が遮断される修飾感受性制限酵素には、認識部位内又は認識部位に隣接する部位で、任意の種類の修飾ヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドの任意の組合せによってその活性が遮断又は低減される酵素が含まれる。修飾感受性制限酵素の活性を遮断又は低減することができる例示的な修飾には、Ｎ6－メチルアデニン、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン、３－メチルシトシン（３ｍＣ）、Ｎ４－メチルシトシン（４ｍＣ）又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。修飾感受性制限酵素を遮断することができる例示的な修飾には、Ｄａｍ、Ｄｃｍ、ＥｃｏＫＩ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＴＥＴ酵素によって媒介される修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾は、Ｄａｍメチル化を含む。Ｄａｍメチル化によってブロックされる制限酵素には、以下の表１の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾は、Ｄｃｍメチル化を含む。Ｄｃｍメチル化によってブロックされる制限酵素には、以下の表２の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾は、ＣｐＧメチル化を含む。ＣｐＧメチル化によってブロックされる制限酵素には、以下の表３の酵素が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位では活性ではない。例えば、修飾感受性制限酵素は、１つ又は修飾されたヌクレオチドを含む認識部位で開裂するが、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を開裂しない。
１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む認識部位で開裂する修飾感受性制限酵素によって認識される例示的な修飾には、Ｎ6－メチルアデニン、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン、３－メチルシトシン（３ｍＣ）、Ｎ４－メチルシトシン（４ｍＣ）又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む認識部位を特異的に開裂する認識された修飾感受性制限酵素の例示的な修飾には、Ｄａｍ、Ｄｃｍ、ＥｃｏＫＩ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＴＥＴ酵素によって媒介される修飾が含まれる。
認識部位内又は認識部位に隣接する１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む認識部位で開裂する、例示的であるが非限定的な修飾感受性制限酵素を、以下の表４に列挙する。
いくつかの実施形態では、修飾は、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含み、修飾感受性制限酵素は、ＡｂａＳＩを含む。ＡｂａＳＩは、グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含むＡｂａＳＩ認識部位を開裂し、グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含まないＡｂａＳＩ認識部位を開裂しない。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾は、５－ヒドロキシメチルシトシンを含み、修飾感受性制限酵素は、ＡｂａＳＩ及びＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼを含む。Ｔ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼは、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ－Ｇｌｃ）のグルコース部分を二本鎖ＤＮＡの５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）残基に、例えばＡｂａＳＩ認識部位内で特異的に転移し、グルコシルヒドロキシメチルシトシン修飾ＡｂａＳＩ認識部位を作製する。ＡｂａＳＩは、グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含むＡｂａＳＩ認識部位を開裂し、グルコシルヒドロキシメチルシトシンを含まないＡｂａＳＩ認識部位を開裂しない。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾はメチルシトシンを含み、修飾感受性制限酵素はＭｃｒＢＣを含む。ＭｃｒＢＣは、メチルシトシンを含むＭｃｒＢＣ部位を開裂し、メチルシトシンを含まないＭｃｒＢＣ部位を開裂しない。ＭｃｒＢＣ部位は、一方又は両方のＤＮＡ鎖でメチルシトシンで修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＭｃｒＢＣはまた、一方又は両方のＤＮＡ鎖上のヒドロキシメチルシトシンを含むＭｃｒＢＣ部位を開裂する。いくつかの実施形態では、ＭｃｒＢＣハーフ部位は、最大３０００ヌクレオチドによって分離されている。いくつかの実施形態では、ＭｃｒＢＣハーフ部位は、５５～１０３ヌクレオチドによって分離されている。
いくつかの実施形態では、修飾はアデニンメチル化を含み、方法はＤｐｎＩによる消化を含む。ＧＡＴＣ認識の両方の鎖のアデニンがメチル化されると、ＤｐｎＩはＧＡＴＣ認識部位を開裂する。いくつかの実施形態では、アデニンメチル化及びシトシン修飾の両方を含むＤｐｎＩ ＧＡＴＣ認識部位は、細菌ＤＮＡでは発生するが、哺乳動物ＤＮＡでは発生しない。メチル化アデニン及び修飾シトシンの両方を含むこれらの認識部位は、サンプル（例えば細菌及び哺乳動物の混合ＤＮＡ等）でＤｐｎＩによって選択的に開裂され、次いでＴ４ポリメラーゼで処理されて、メチル化アデニン及び修飾シトシンが、切断された末端において、未修飾アデニン及びシトシン非修飾アデニンに置き換わる。Ｔ４ポリメラーゼは、鋳型、プライマー、ヌクレオチドの存在下で、５’から３’方向のＤＮＡ合成を触媒する。Ｔ４ポリメラーゼは、未修飾のヌクレオチドを新しく合成されたＤＮＡに組み込む。これにより、目的の核酸に未修飾のシトシンが含まれ、枯渇の標的とされる核酸に修飾されたシトシンが含まれるサンプルが生成される。修飾シトシンのこれらの違いは、本開示の方法を使用して目的の核酸を濃縮するために使用することができる。
ホスファターゼ
本開示の方法のいくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は末端脱リン酸化されて、サンプル中の核酸を修飾感受性制限酵素と接触することによって、末端リン酸が露出した、目的の核酸又は枯渇の標的とされる核酸のいずれかを生成し、目的の核酸についてサンプルを濃縮するために本開示の方法で使用することができる。例えば、これらの露出した末端リン酸は、エキソヌクレアーゼによる分解のための枯渇のための核酸（図２）又はアダプタ連結のための目的の核酸（図１）を標的とするために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「末端脱リン酸化」という用語は、核酸分子の５’及び３’末端から末端リン酸基が除去された核酸を指す。
いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、ホスファターゼを使用して末端脱リン酸化される。ホスファターゼは、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の５’及び３’末端の脱リン酸化を非特異的に触媒する酵素である。いくつかの実施形態では、ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。
本開示の例示的なホスファターゼには、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）、組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）及び南極ホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。
エキソヌクレアーゼ
本明細書で使用される場合、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子の３’又は５’末端からヌクレオチドを連続的に除去する酵素のクラスを指す。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖とすることができる。例示的なエキソヌクレアーゼには、ラムダヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びＢＡＬ－３１が含まれるが、これらに限定されない。エキソヌクレアーゼは、本開示の方法を使用して、枯渇の標的とされる核酸を選択的に分解するために使用することができる（例えば図２）。
いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、枯渇の標的とされる開裂されたＤＮＡを分解する一方で、目的の切断されていないＤＮＡを無傷のままにするために使用される。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、末端リン酸を有する平滑末端又は５’オーバーハングを使用することにより、１つのＤＮＡ鎖の一方向の３’＞５’分解を開始し、一本鎖ＤＮＡ及びヌクレオチドを生成する。一本鎖ＤＮＡ又は末端リン酸を欠くＤＮＡに対しては活性がないため、Ｙ字型アダプタ末端等の３’オーバーハングは分解に耐性がある。その結果、修飾感受性制限酵素によって切断されず、末端リン酸を欠く目的の無傷な二本鎖ＤＮＡ断片は、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって消化されないが、修飾感受性制限酵素によって開裂された枯渇の標的とされるＤＮＡ分子はエキソヌクレアーゼＩＩＩによって分解される。
いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼＩは、枯渇の標的とされる開裂されたＤＮＡを分解する一方で、目的の切断されていないＤＮＡを無傷のままにするために使用される。いくつかの実施形態では、核酸断片のサンプル（例えば、一本鎖ＤＮＡ）は、脱リン酸化され、そして枯渇の標的とされる核酸を切断するが目的の核酸を切断しない修飾感受性制限酵素で切断される。エキソヌクレアーゼＩは一本鎖ＤＮＡを３’から５’の方向に分解する。
いくつかの実施形態では、ラムダヌクレアーゼ（ラムダエキソヌクレアーゼ）は、枯渇の標的とされる開裂されたＤＮＡを分解する一方で、目的の切断されていないＤＮＡを無傷のままにするために使用される。いくつかの実施形態では、核酸断片のサンプル（例えばＤＮＡ）は、脱リン酸化され、そして枯渇の標的とされる核酸を切断するが目的の核酸を切断しない修飾感受性制限酵素で切断される。ラムダヌクレアーゼは、非常に前進型５’から３’のエキソヌクレアーゼである。その好ましい基質は５’リン酸化二本鎖ＤＮＡであり、リン酸化されていないＤＮＡを大幅に低下した速度で分解する。したがって、目的の無傷の脱リン酸化された核酸はラムダヌクレアーゼから保護され、一方、５’リン酸を曝露した枯渇の標的とされる切断された核酸は分解される。
いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼＢＡＬ－３１は、枯渇の標的とされる開裂されたＤＮＡを分解するために使用されるが、一方目的の切断されていないＤＮＡを無傷のまま残す。いくつかの実施形態では、核酸断片のサンプル（例えばＤＮＡ）は、脱リン酸化され、そして枯渇の標的とされる核酸を切断するが目的の核酸を切断しない修飾感受性制限酵素で切断される。サンプルは、修飾感受性制限酵素と接触し、枯渇の標的とされる核酸を切断し、目的の核酸を無傷のままにする。得られた生成物をエキソヌクレアーゼＢＡＬ－３１と接触させる。エキソヌクレアーゼＢＡＬ－３１には、二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性及び一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性の２つの活性がある。二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性により、ＢＡＬ－３１は両方の鎖の開放端からＤＮＡを分解し、二本鎖ＤＮＡのサイズを小さくすることができる。培養が長ければ長いほど、二本鎖ＤＮＡのサイズが大きく減少し、中程度から大きなＤＮＡ断片（＞２００ｂｐ）を枯渇させるのを助ける。いくつかの実施形態では、核酸の３’末端は、末端トランスフェラーゼを使用して、ポリｄＧで尾部に付けられている。ＢＡＬ－３１の一本鎖エンドヌクレアーゼ活性により、ポリ－Ａ、－Ｃ、又は－Ｔを非常に迅速に消化できるが、ポリ－Ｇの消化は非常に低いことが注目された。この性質のため、ライブラリの３’末端に一本鎖ポリ－ｄＧを追加すると、ＢＡＬ－３１による分解からの保護として機能する。その結果、修飾感受性制限酵素によってポリｄＧテール化及び開裂されたＤＮＡ分子は、ＢＡＬ－３１によって分解される可能性があり、一方、無傷なＤＮＡライブラリは、３’末端のポリ－ｄＧ保護及び／又は末端リン酸の欠如により、ＢＡＬ－３１によって消化されない。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、核酸のリン酸化末端からのヌクレオチドの連続的な除去を可能にする条件下で、サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、末端脱リン酸化される。いくつかの実施形態では、サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることは、サンプル中の核酸を、サンプル中の切断された核酸の末端の末端リン酸を露出させる修飾感受性制限酵素で切断した後、サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、露出された末端リン酸を有するサンプル中の核酸は、枯渇の標的とされる核酸を含む。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは、サンプルからの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。
アダプタ
本開示は、サンプル中の核酸又は目的の核酸の５’及び３’末端に連結されたアダプタを提供する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、アダプタは、サンプル中の全て核酸に連結し、次いで、ヌクレオチド修飾の違いを使用して、枯渇の標的とされる核酸を選択的に開裂し、アダプタが両端に連結した目的の核酸及び一方の端にアダプタが連結されている枯渇の標的とされる核酸を生成する（図３、図４）。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾の違いを使用して、枯渇の標的とされる核酸を選択的に枯渇させ、次にアダプタを目的の核酸に連結させる（図２）。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド修飾の違いを使用して、露出した末端リン酸を有する目的の核酸を生成し、アダプタを目的の核酸に連結するために使用される（図１）。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、アダプタは、サンプル中の核酸の５’及び３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、アダプタは、５’末端及び／又は３’末端の間に介在する配列を更に含む。例えば、アダプタは、バーコード配列を更に含むことができる。
いくつかの実施形態では、アダプタは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖に連結可能である核酸である。
いくつかの実施形態では、アダプタは、枯渇／濃縮の前に連結される。他の実施形態では、アダプタは後の工程で連結される。
いくつかの実施形態では、アダプタは線形である。いくつかの実施形態では、アダプタは線形のＹ字型である。いくつかの実施形態では、アダプタは線形円形である。いくつかの実施形態では、アダプタはヘアピンアダプタである。いくつかの実施形態では、アダプタは、ポリＧ配列を含む。
様々な実施形態において、アダプタは、ヘアピンアダプタ、すなわち、それ自体と塩基対が、分子の３’及び５’末端が５’が断片の二本鎖ＤＮＡ分子の５’及び３’末端連結する、二本鎖ステム及びループを有する構造を形成する１つの分子であり得る。
あるいは、アダプタは、断片の一端又は両端に連結されたＹアダプタであり、ユニバーサルアダプタとも呼ばれる。あるいは、アダプタ自体は、互いに塩基対である２つの別個のオリゴヌクレオチド分子から構成され得る。更に、アダプタの連結可能な末端は、制限酵素による開裂によって作られたオーバーハングと互換性があるように設計されているか、又は平滑末端又は５’Ｔオーバーハングを有し得る。いくつかの実施形態では、制限酵素は、修飾感受性制限酵素である。
アダプタは、二本鎖及び一本鎖分子を含み得る。したがって、アダプタはＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその２つの混合物であり得る。ＲＮＡを含むアダプタは、ＲＮａｓｅ処理又はアルカリ加水分解によって開裂され得る。
この範囲外のアダプタは、本開示から逸脱することなく使用可能であるが、アダプタは、１０～１００ｂｐの長さであり得る。特定の実施形態では、アダプタは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも８５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、又は少なくとも９５ｂｐの長さである。
いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸アダプタ連結は、長さ約２０～約５０００ｂｐ、長さ約２０～約１０００ｂｐ、長さ約２０～約５００ｂｐ、約２０～約４００ｂｐ、長さ約２０～約３００ｂｐ、長さ約２０～約２００ｂｐ、長さ約２０～１００ｂｐ、長さ約５０～約５０００ｂｐ、長さ約５０～約１０００ｂｐ、長さ約５０～約５００ｂｐ、長さ約５０～約４００ｂｐ、長さ約５０～約３００ｂｐ、長さ約５０～約２００ｂｐ、長さ約５０～１００ｂｐ、長さ約１００～約５０００ｂｐ、長さ約１００～約１０００ｂｐ、長さ約１００～約５００ｂｐ、長さ約１００～約４００ｂｐ、長さ約１００～約３００ｂｐ、長さ約１００～約２００ｂｐである。いくつかの実施形態では、アダプタ連結された、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸は、長さが約５０～約１０００ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、アダプタ連結された、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸は、長さが約５０～約５００ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、アダプタ連結された、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸は、長さが約１００～約５００ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、アダプタ連結された、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸は、長さが約５０～約３００ｂｐの範囲である。
いくつかの実施形態では、アダプタは、宿主ゲノムの特定の領域、例えば、その配列がＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース又は他のデータベースに寄託されている染色体領域のヌクレオチド配列に一致するように設計されたオリゴヌクレオチドを含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含むサンプルを使用するアッセイで使用することができ、試験ゲノムは、オリゴヌクレオチドの結合部位を含む。更なる例において、断片化された核酸配列は、１つ又は複数のＤＮＡシークエンシングライブラリに由来し得る。アダプタは、例えばＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームで使用するため、又はＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔｓプラットフォームで使用するため、又はナノポア技術で使用するために、次世代シークエンシングプラットフォーム用に構成することができる。
いくつかの実施形態では、アダプタは、シークエンシングアダプタ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプタ）を含む。いくつかの実施形態では、アダプタは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩ配列は、各元の核酸分子に固有の配列（例えば、ランダム配列）を含む。これにより、シークエンシングの偏りがなく、核酸量の定量化が可能になる。いくつかの実施形態では、アダプタは「バーコード」配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、特定の供給源（対象、患者、環境サンプル、パーティション（例えば、液滴、ウェル、ビーズ）等）からの核酸分子間で共有されるバーコード配列を含む。これにより、その後の分析のためにシークエンシング情報をプールすることができ、検出及び相互汚染の排除が可能になる。いくつかの実施形態では、アダプタは、各核酸分子に固有のＵＭＩ、特定の供給源からの核酸分子間で共有されるバーコード、及びシークエンシングアダプタ等の複数の別個の配列を含む。
枯渇
枯渇の標的とされる核酸は、様々な手法によって枯渇させることができる。
枯渇の標的とされる核酸は、異なるアダプタの付着によって枯渇され得る。いくつかの実施形態では、アダプタは、サンプルの核酸に付着し、その後、１つ又は複数のアダプタが、それらの修飾状態に基づいて、枯渇の標的とされる核酸から除去される。例えば、両端にアダプタが付着した枯渇の標的とされる核酸は、修飾感受性制限酵素によって開裂され、それにより、一端のみにアダプタが付着した枯渇の標的とされる核酸が生成される。後続の工程（例えば、増幅）を使用して、両端にアダプタが取り付けられた核酸のみを標的とし、それにより、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させることができる。別の例では、サンプルの核酸は、開裂された核酸のみがアダプタを付着させることができるように（例えば、脱リン酸化によって）処理され、続いて、目的の核酸を修飾感受性制限酵素によって切断することができ（例えば、それによってリン酸基を露出させる）、アダプタを付着させることができる。後続の工程（例えば、増幅）を使用して、アダプタが付着した核酸のみを標的とし、それにより、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させることができる。
枯渇の標的とされる核酸は、消化によって枯渇する可能性がある。例えば、サンプルの核酸は、開裂された核酸のみが消化され得るように（例えば、エキソヌクレアーゼによって）処理される（例えば、脱リン酸化によって）。枯渇の標的とされる核酸は、修飾感受性制限酵素によって開裂され、それによって消化可能になる。次に、エキソヌクレアーゼ等によるその後の消化を使用して、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させることができる。
枯渇の標的とされる核酸は、サイズ選択によって枯渇させることができる。例えば、修飾感受性制限酵素を使用して、目的の核酸又は枯渇の標的とされる核酸のいずれかを開裂することができ、その後、目的の核酸を、開裂によるサイズの違いに基づいて、枯渇の標的とされる核酸から分離することができる。
場合によっては、サイズ選択を使用せずに、枯渇の標的とされる核酸が枯渇する。
枯渇の標的とされる核酸は、標的となる結合によって枯渇され得る。例えば、修飾感受性結合ドメイン（例えば、メチル化感受性抗体又はＤＮＡ結合ドメイン）を使用して、それらの修飾状態に基づいて、枯渇の標的とされる核酸又は目的の核酸のいずれかに結合及び分離することができる。本明細書で使用される場合、「修飾感受性結合ドメイン」は、修飾感受性様式で核酸に結合するが、本明細書に開示される修飾感受性制限酵素とは異なり、核酸を切断しないタンパク質、タンパク質断片、又は融合タンパク質を指す。「修飾感受性標的結合」は、修飾感受性結合ドメインによる核酸の結合を指す。いくつかの例示的な実施形態において、修飾感受性結合ドメインの核酸への結合は、枯渇の標的とされる核酸又は目的の核酸のいずれかの選択的結合、それに続く精製、例えば、共免疫沈降、又は修飾感受性結合ドメインのビーズ又はカラムへの結合を可能にするのに十分に安定である。
場合によっては、枯渇の標的とされる核酸は、修飾感受性標的結合を使用せずに枯渇される。場合によっては、枯渇の標的とされる核酸は、ＣｐＧ感受性標的結合を使用せずに枯渇する。
方法
プロトコル１：本明細書に記載の用途の例示的な方法を図１に示す。目的の核酸（１０１）及び枯渇の標的とされる核酸（１０２）を含む核酸のサンプルは、末端脱リン酸化されて（１０５）、リン酸化されていない目的の核酸（１０６）及び枯渇の標的とされる核酸（１０７）を生成する。いくつかの実施形態では、核酸は、脱リン酸化の前に断片化される。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、ホスファターゼ、例えば組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）で末端脱リン酸化される。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、修飾化感受性制限酵素に対する１つ又は複数の認識部位（それぞれ１０３、１０４）を含む。目的の核酸において、修飾感受性制限酵素に対する認識部位は、修飾ヌクレオチドを含まない（１０３）か、あるいは、枯渇の標的とされる核酸の対応する認識部位よりも頻度が低い修飾ヌクレオチドを含む。枯渇の標的とされる核酸において、修飾感受性制限酵素の認識部位は、制限部位内（１０４）又は制限部位に隣接する修飾ヌクレオチドを含むか、あるいは、目的の核酸の対応する認識部位よりも頻繁に修飾ヌクレオチドを含む。修飾感受性制限酵素（１０９）の活性は、その同種の認識部位（１０８）内又はそれに隣接する修飾ヌクレオチドの存在によって遮断され、それにより、修飾感受性制限酵素の活性を目的の核酸に標的化する（１１０及び１１１の比較）。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素（１０９）は、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｌｕＩ又はＳａｕ３ＡＩを含む。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素（１０９）は、ＡｌｕＩ又はＳａｕ３ＡＩを含む。サンプルを修飾感受性制限酵素（１１３）で消化すると、末端リン酸（１１４）の５’及び３’末端に末端リン酸を持つ目的の核酸が生成される。これらの末端リン酸は、アダプタ（１１５、連結工程、１１６、アダプタ）を目的の核酸の末端に連結するために使用され、両端でアダプタ連結される目的の核酸を生成する（１１７）。対照的に、枯渇の標的とされる核酸はアダプタ連結されていない（１１１）。これらのアダプタは、下流の用途、例えばアダプタを介したＰＣＲ増幅、シークエンシング（例えばハイスループットシークエンシング）、サンプル中の目的の核酸の定量化、及び／又はクローニングに使用できる。これは、目的の核酸にアダプタを選択的に連結することにより、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。この枯渇は、サイズ選択を使用せずに実行できる。あるいは、目的のアダプタ連結核酸は、本明細書に記載の１つ又は複数の追加の濃縮方法に使用される。例えば、アダプタ連結された核酸は、本開示の追加の修飾依存濃縮方法（例えば、図３に示される方法）に使用される。あるいは、又は更に、アダプタ連結された核酸は、本開示の核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法（例えば、図４に示される方法）に使用される。
プロトコル２：本明細書に記載の用途の例示的な方法を図２に示す。目的の核酸（２０１）及び枯渇の標的とされる核酸（２０２）を含む核酸のサンプルは、末端脱リン酸化されて（２０５）、リン酸化されていない目的の核酸（２０６）及び枯渇の標的とされる核酸（２０７）を生成する。いくつかの実施形態では、核酸は、脱リン酸化の前に断片化される。いくつかの実施形態では、サンプル中の核酸は、ホスファターゼ、例えば組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）で末端脱リン酸化される。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、修飾化感受性制限酵素に対する１つ又は複数の認識部位（それぞれ２０３、２０４）を含む。目的の核酸において、修飾感受性制限酵素に対する認識部位は、修飾ヌクレオチドを含まない（２０３）か、あるいは、枯渇の標的とされる核酸の対応する認識部位よりも頻度が低い修飾ヌクレオチドを含む。枯渇の標的とされる核酸において、修飾感受性制限酵素の認識部位は、制限部位内（２０４）又は制限部位に隣接する修飾ヌクレオチドを含むか、あるいは、目的の核酸の対応する認識部位よりも頻繁に修飾ヌクレオチドを含む。修飾感受性制限酵素（２０９）は、認識部位（２０８）内又はそれに隣接して１つ又は複数の修飾ヌクレオチドが存在する場合、その同種の認識部位を切断し、認識部位が１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（２０８）を含まない場合、その同種の認識部位を切断せず、それにより、修飾感受性制限酵素の活性を、枯渇の標的とされる核酸に標的化する（２１０及び２１１を比較）。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣを含む。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素はＦｓｐＥＩである。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、ＭｓｐＪＩである。修飾化感受性制限酵素（２１２）を有するサンプルの消化は、核酸（２１４）の一端（２１３）又は５’及び３’末端の両方に末端リン酸を有する、枯渇の標的とされる核酸を生成する。対照的に、修飾感受性制限酵素によって切断されなかった目的の核酸は、核酸の５’及び／又は３’末端に露出した末端リン酸を持たない（２１０を２１３～２１４と比較）。次に、サンプルをエキソヌクレアーゼ（２１５、消化工程、２１６、エキソヌクレアーゼ）で消化する。エキソヌクレアーゼは、枯渇の標的とされる核酸の末端リン酸を使用して、核酸分子の末端から連続するヌクレオチドを除去し、したがって枯渇の標的とされる核酸をサンプルから枯渇させる。この枯渇は、サイズ選択を使用せずに実行できる。エキソヌクレアーゼ消化に続いて、アダプタは、末端リン酸を欠き、エキソヌクレアーゼによって消化されていない目的の核酸（２１７）に連結される。これにより、両端でアダプタ連結された目的の核酸が生成される（２１８）。これらのアダプタは、下流の用途、例えばアダプタを介したＰＣＲ増幅、シークエンシング（例えばハイスループットシークエンシング）、サンプル中の目的の核酸の定量化、及び／又はクローニングに使用できる。あるいは、目的のアダプタ連結核酸は、本明細書に記載の１つ又は複数の追加の濃縮方法に使用される。例えば、アダプタ連結された核酸は、本開示の追加の修飾依存濃縮方法（例えば、図３に示される方法）に使用される。あるいは、又は更に、アダプタ連結された核酸は、本開示の核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法（例えば、図４に示される方法）に使用される。
プロトコル３：本明細書に記載の用途の例示的な方法を図３に示す。目的の核酸（３０１）及び枯渇の標的とされる核酸（３０２）を含む核酸のサンプルは、アダプタ連結（３０５）されるか、又は本開示の濃縮方法（３０６）に使用され（例えば、図１又は図２に示される方法）、アダプタ連結された目的の核酸（３０７）及びアダプタ連結された枯渇の標的とされる核酸（３０８）を生成する。いくつかの実施形態では、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方は、修飾化感受性制限酵素に対する１つ又は複数の認識部位（それぞれ３０３、３０４）を含む。目的の核酸において、修飾感受性制限酵素に対する認識部位は、修飾ヌクレオチドを含まない（３０３）か、あるいは、枯渇の標的とされる核酸の対応する認識部位よりも頻度が低い修飾ヌクレオチドを含む。枯渇の標的とされる核酸において、修飾感受性制限酵素の認識部位は、制限部位内（３０４）又は制限部位に隣接する修飾ヌクレオチドを含むか、あるいは、目的の核酸の対応する認識部位よりも頻繁に修飾ヌクレオチドを含む。修飾感受性制限酵素（３０９）は、認識部位（３０８）内又はそれに隣接して１つ又は複数の修飾ヌクレオチドが存在する場合、その同種の認識部位を切断し、認識部位が１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（３０８）を含まない場合、その同種の認識部位を切断せず、それにより、修飾感受性制限酵素の活性を、枯渇の標的とされる核酸に標的化する（３１０及び３１１を比較）。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣを含む。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素はＦｓｐＥＩである。いくつかの実施形態では、修飾感受性制限酵素は、ＭｓｐＪＩである。サンプルは修飾感受性制限酵素（３１１）で消化され、アダプタ連結されていない（３１２）、又は一端のみがアダプタ連結されている（３１３）、枯渇の標的とされる核酸を生成する。これは、枯渇の標的とされる核酸からアダプタを選択的に除去することにより、枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる。この枯渇は、サイズ選択を使用せずに実行できる。対照的に、修飾感受性制限酵素によって切断されなかった目的の核酸は、両端でアダプタ連結される（３１０と３１２－３１３の対照）。これらのアダプタは、下流の用途、例えばアダプタを介したＰＣＲ増幅、シークエンシング（例えばハイスループットシークエンシング）、サンプル中の目的の核酸の定量化、及び／又はクローニングに使用できる。
プロトコル４：本明細書に記載の用途の例示的な方法を図４に示す。複数のｇＮＡ（４０１）を使用して、アダプタ連結核酸のサンプル中の枯渇の標的とされる核酸（４０３）に対して核酸誘導型ヌクレアーゼ（４０２）を標的化する。アダプタ連結された核酸は、最初のアダプタ連結の前又は後のいずれかに、修飾感受性制限酵素を使用してサンプルからの枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる、本明細書に記載の濃縮方法のいずれかによって生成される。この方法では、ｇＮＡは、枯渇の標的とされる核酸（４０３）を特異的に標的とし、目的の核酸（４０４）は標的としないため、核酸誘導型ヌクレアーゼ（４０２）によって切断されない。核酸誘導型ヌクレアーゼによる開裂は、一端でアダプタ連結された枯渇の標的とされる核酸（４０５）、及び両端でアダプタ連結された目的の核酸（４０３）をもたらす。これらのアダプタは、下流の用途、例えばアダプタを介したＰＣＲ増幅、シークエンシング（例えばハイスループットシークエンシング）、サンプル中の目的の核酸の定量化、及びクローニングに使用できる。
プロトコル５：いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導ニッカーゼである。複数のｇＮＡを使用して、アダプタ連結核酸のサンプル中の枯渇の標的とされる核酸に対して核酸誘導ニッカーゼを標的化する。アダプタ連結された核酸は、最初のアダプタ連結の前又は後のいずれかに、修飾感受性制限酵素を使用してサンプルからの枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる、本明細書に記載の濃縮方法のいずれかによって生成される。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、枯渇の標的とされる全て核酸が、枯渇の標的とされる二本鎖ＤＮＡの反対のＤＮＡ鎖上に近接して（例えば、１５塩基未満離れて）２つのｇＮＡ結合部位を有するように設計される。この実施形態では、核酸誘導ニッカーゼは、除去されるＤＮＡ上のその標的部位を認識し、１本の鎖のみを切断することができる。ＤＮＡを枯渇させるために、２つの別々の核酸誘導ニッカーゼがＤＮＡの両方の鎖を切断して、近接して枯渇させることができる。枯渇するＤＮＡのみが、２放鎖破壊を作り出す、２本の核酸誘導ニッカーゼ部位を近接して有する。核酸誘導ニッカーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質ニッカーゼが目的のＤＮＡ上の部位を非特異的又は低親和性で認識する場合、１本の鎖しか切断できず、その後のＰＣＲ増幅又はＤＮＡ分子の下流のプロセスを妨げることはない。本実施形態では、密接に十分に近接して非特異的に２つの部位を認識する２つのｇＮＡの可能性は無視できる（＜ｌｘｌ０-14）。この実施形態は、通常のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質媒介性開裂が目的のＤＮＡの過剰を切断する場合に特に有用であろう。
プロトコル６：いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは触媒的に死んでおり、この方法は、サンプル中で、枯渇の標的とされる核酸及び目的の核酸を分割することを含む。複数のｇＮＡを使用して、触媒的不活性（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９又はｄＣｐｆ１）を、アダプタ結合核酸のサンプル中で、枯渇の標的とされる核酸又は目的の核酸のいずれかに対して標的化する。アダプタ連結された核酸は、最初のアダプタ連結の前又は後のいずれかに、修飾感受性制限酵素を使用してサンプルからの枯渇の標的とされる核酸を枯渇させる、本明細書に記載の濃縮方法のいずれかによって生成される。触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸に結合することができるが、核酸をニッキング又は切断することはできない。いくつかの実施形態では、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼは、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼ及びそれが結合する任意の分子を単離するために使用され得るビオチンタグ等のタグを含む。これらの実施形態において、目的の核酸又は枯渇の標的とされる核酸のいずれかにハイブリダイズするが、両方にハイブリダイズしない複数のｇＮＡが開発される。この複数のｇＮＡ及び触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼはサンプルと接触し、ｇＮＡの設計に応じて、触媒的不活性核酸ヌクレアーゼが、目的の核酸又は枯渇の標的とされる核酸のいずれかに結合することを可能にする。標的配列を切断する代わりに、この方法を使用して、断片化された核酸サンプルを、それぞれ別々に処理できる２つの画分に分割する。したがって、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼは、混合物を非結合断片（例えば、目的の核酸）及び結合断片（例えば、ｇＮＡが標的とされる枯渇の標的とされる核酸）に分割する。標的核酸サンプルの結合部分は、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質に以前に付着した親和性タグ（例えば、ビオチン）の結合によって除去される。結合した核酸配列は、変性条件によってタンパク質／ｇＮＡ複合体から溶出され、増幅及びシークエンシングされる。同様に、結合していない核酸配列を増幅し、シークエンシングすることができる。
本明細書に記載の方法のいずれも、サンプルからの枯渇の標的とされる核酸を枯渇させるための独立した方法として使用することができ、それにより、目的の核酸を濃縮することができる。
あるいは、本明細書に記載の方法を組み合わせて、単独での任意の個々の方法よりも高度な濃縮を達成することができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、最初にプロコトル１を使用して濃縮され、続いてプロトコル２を使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、最初にプロコトル１を使用して濃縮され、続いてプロトコル３を使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、最初にプロコトル１を使用して濃縮され、続いてプロトコル２及び３を使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、最初にプロコトル１を使用して濃縮され、続いてプロトコル４～６のいずれか１つを使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、サンプルは、最初にプロコトル１を使用して濃縮され、続いてプロトコル２及び／又は３、並びにプロトコル４～６のいずれか１つを使用して濃縮される。
方法の特定の組合せ、及び方法の組合せの順序が本明細書に記載されているが、これらは、本開示の方法を組み合わせることができる方法を制限することを決して意図するものではない。方法の産物として目的のアダプタ連結核酸を生成する本開示の目的の核酸についてサンプルを濃縮する任意の方法は、その開始基質としてアダプタ連結核酸を使用する本開示の任意の追加の方法と組み合わせることができる。
核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の修飾ベースの濃縮方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法と組み合わされる。核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して、目的の配列についてサンプルを濃縮する方法である。核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法は、ＷＯ／２０１６／１００９５５、ＷＯ／２０１７／０３１３６０、ＷＯ／２０１７／１００３４３、ＷＯ／２０１７／１４７３４５及びＷＯ／２０１８／２２７０２５に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の修飾ベースの濃縮方法及び核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法は、サンプル中の異なる核酸を枯渇させ、それにより、いずれかの手法単独よりも目的の核酸のより高度な濃縮を達成する。例えば、サンプルは、哺乳動物宿主ゲノムからの枯渇の標的とされる核酸、及び１つ又は複数の非宿主ゲノム（例えば、細菌、ウイルス、又は寄生生物）からの目的の核酸を含む。本開示の方法を使用して、このサンプル中の目的の核酸を濃縮し、宿主核酸と非宿主核酸との間のＣｐＧメチル化の違いを利用する修飾ベース濃縮方法を選択して、哺乳動物の活発に転写された領域を含む核酸を枯渇させ、一方で、ホストゲノム、核酸誘導型ヌクレアーゼベースの濃縮方法は、それらの領域を標的とするガイド核酸（ｇＮＡ）のライブラリを使用して、哺乳動物宿主ゲノムの反復配列の領域を効果的に標的にする。
「核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体」という用語は、核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質及びガイド核酸（ｇＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。例えば、「Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む複合体を指す。核酸誘導型ヌクレアーゼは、野生型核酸誘導型ヌクレアーゼ、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼ、又は核酸誘導型ヌクレアーゼ－ニッカーゼを含むがこれらに限定されない、任意の型の核酸誘導型ヌクレアーゼであり得る。
複数のｇＮＡ
本明細書で提供されるのは、複数のガイド核酸（ｇＮＡ）（交換可能にライブラリ又はコレクションと呼ばれる）である。
「ガイド核酸」という用語は、核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び任意選択で追加の核酸（複数可）と複合体を形成することができるガイド核酸（ｇＮＡ）を指す。ｇＮＡは、単離された核酸として、又は核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の一部として存在し得る。
本明細書で使用される場合、複数のｇＮＡは、少なくとも１０2個の固有のｇＮＡを含むｇＮＡの混合物を示す。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、少なくとも１０2個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０3個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０4個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０5個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０6個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０7個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０8個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０9個の固有のｇＮＡ、又は少なくとも１０10個の固有のｇＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡのコレクションは、合計で少なくとも１０2個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０3個の固有のｇＮＡ、少なくとも１０4個の固有のｇＮＡ、又は少なくとも１０5個の固有のｇＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡのコレクションは、配列の標的を含む第１のＮＡセグメント、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質－結合配列を含む第２のＮＡセグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントは、５’から３’への順序である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントは、３’から５’への順序である。
いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは、複数のｇＮＡにわたって、１２～２５０ｂｐ、又は１２～１００ｂｐ、又は１２～７５ｂｐ、又は１２～５０ｂｐ、又は１２～３０ｂｐ、又は１２～２５ｂｐ、又は１２～２２ｂｐ、又は１２～２０ｂｐ、又は１２～１８ｂｐ、又は１２～１６ｂｐ、又は１４～２５０ｂｐ、又は１４～１００ｂｐ、又は１４～７５ｂｐ、又は１４～５０ｂｐ、又は１４～３０ｂｐ、又は１４～２５ｂｐ、又は１４～２２ｂｐ、又は１４～２０ｂｐ、又は１４～１８ｂｐ、又は１４～１７ｂｐ、又は１４～１６ｂｐ、又は１５～２５０ｂｐ、又は１５～１００ｂｐ、又は１５～７５ｂｐ、又は１５～５０ｂｐ、又は１５～３０ｂｐ、又は１５～２５ｂｐ、又は１５～２２ｂｐ、又は１５～２０ｂｐ、又は１５～１８ｂｐ、又は１５～１７ｂｐ、又は１５～１６ｂｐ、又は１６～２５０ｂｐ、又は１６～１００ｂｐ、又は１６～７５ｂｐ、又は１６～５０ｂｐ、又は１６～３０ｂｐ、又は１６～２５ｂｐ、又は１６～２２ｂｐ、又は１６～２０ｂｐ、又は１６～１８ｂｐ、又は１６～１７ｂｐ、又は１７～２５０ｂｐ、又は１７～１００ｂｐ、又は１７～７５ｂｐ、又は１７～５０ｂｐ、又は１７～３０ｂｐ、又は１７～２５ｂｐ、又は１７～２２ｂｐ、又は１７～２０ｂｐ、又は１７～１８ｂｐ、又は１８～２５０ｂｐ、又は１８～１００ｂｐ、又は１８～７５ｂｐ、又は１８～５０ｂｐ、又は１８～３０ｂｐ、又は１８～２５ｂｐ、又は１８～２２ｂｐ、又は１８～２０ｂｐ、又は１９～２５０ｂｐ、又は１９～１００ｂｐ、又は１９～７５ｂｐ、又は１９～５０ｂｐ、又は１９～３０ｂｐ、又は１９～２５ｂｐ、又は１９～２２ｂｐである。いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは、複数のｇＮＡにわたって、１５～２５０ｂｐ、又は３０～１００ｂｐ、又は２０～３０ｂｐ、又は２２～３０ｂｐ、又は１５～５０ｂｐ、又は１５～７５ｂｐ、又は１５～１００ｂｐ、又は１５～１２５ｂｐ、又は１５～１５０ｂｐ、又は１５～１７５ｂｐ、又は１５～２００ｂｐ、又は１５～２２５ｂｐ、又は１５－２５０ｂｐ、又は２２～５０ｂｐ、又は２２～７５ｂｐ、又は２２～１００ｂｐ、又は２２～１２５ｂｐ、又は２２～１５０ｂｐ、又は２２～１７５ｂｐ、又は２２～２００ｂｐ、又は２２～２２５ｂｐ、又は２２～２５０ｂｐである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％の複数の第１のセグメントは、１５～５０ｂｐである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％のコレクションの第１のセグメントは、１５～２０ｂｐである。
いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは１５ｂｐである。いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは１６ｂｐである。いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは１７ｂｐである。いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは１８ｂｐである。いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは１９ｂｐである。いくつかの特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは２０ｂｐである。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ及び／又は複数のｇＲＮＡにおけるｇＮＡの標的配列は、固有の５’末端を含む。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、複数のメンバにわたって、標的配列の５’末端の配列において変動性を示す。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、複数のメンバにわたって、標的配列の５’末端の配列において、少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％の変動性を示す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端は、任意のプリン又はピリミジン（及び／又はその改変バージョン）であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はアデニンである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はグアニンである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はシトシンである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はウラシルである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はチミンである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ標的配列の３’末端はシトシンではない。
いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、枯渇の標的とされる核酸中の標的配列と塩基対を形成することができる標的配列を含み、枯渇の標的とされる核酸中の標的配列は、サンプルの枯渇の標的とされるゲノム又はトランスクリプトーム全体で、少なくとも１ｂｐ毎、少なくとも２ｂｐ毎、少なくとも３ｂｐ毎、少なくとも４ｂｐ毎、少なくとも５ｂｐ毎、少なくとも６ｂｐ毎、少なくとも７ｂｐ毎、少なくとも８ｂｐ毎、少なくとも９ｂｐ毎、少なくとも１０ｂｐ毎、少なくとも１１ｂｐ毎、少なくとも１２ｂｐ毎、少なくとも１３ｂｐ毎、少なくとも１４ｂｐ毎、少なくとも１５ｂｐ毎、少なくとも１６ｂｐ毎、少なくとも１７ｂｐ毎、少なくとも１８ｂｐ毎、少なくとも１９ｂｐ毎、少なくとも２０ｂｐ毎、少なくとも２５ｂｐ毎、少なくとも３０ｂｐ毎、少なくとも４０ｂｐ毎、少なくとも５０ｂｐ毎、少なくとも１００ｂｐ毎、少なくとも２００ｂｐ毎、少なくとも３００ｂｐ毎、少なくとも４００ｂｐ毎、少なくとも５００ｂｐ毎、少なくとも６００ｂｐ毎、少なくとも７００ｂｐ毎、少なくとも８００ｂｐ毎、少なくとも９００ｂｐ毎、少なくとも１０００ｂｐ毎、少なくとも２５００ｂｐ毎、少なくとも５０００ｂｐ毎、少なくとも１０，０００ｂｐ毎、少なくとも１５，０００ｂｐ毎、少なくとも２０，０００ｂｐ毎、少なくとも２５，０００ｂｐ毎、少なくとも５０，０００ｂｐ毎、少なくとも１００，０００ｂｐ毎、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎、少なくとも５００，０００ｂｐ毎、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎、又は少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎間隔があけられる。
いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡは、標的配列を含む第１のＮＡセグメント及び核酸誘導型ヌクレアーゼシステムを含む第２のＮＡセグメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質結合配列を含み、複数のｇＮＡが、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）のタンパク質メンバに対して様々な特異性を有する様々な第２のＮＡセグメントを有することができる。例えば、本明細書で提供されるｇＮＡのコレクションは、第２のセグメントが、第１の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質結合配列を含むメンバを含み得、また第２のセグメントが、第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質結合配列を含むメンバを含み、第１及び第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＮＡのコレクションは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質に対する特異性を示すメンバを含む。特定の一実施形態では、本明細書で提供される複数のｇＮＡは、Ｃａｓ９、並びにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、及びＣｍ５からなる群から選択される他のタンパク質に対する特異性を示すメンバを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質結合配列は両方とも、標的配列を含む第１のＮＡセグメントの５’である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質結合配列は両方とも、標的配列を含む第１のＮＡセグメントの３’である。いくつかの実施形態では、第１の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質結合配列は、標的配列を含む第１のＮＡセグメントの５’であり、第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質に特異的な第２の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質結合配列は、標的配列を含む第１のＮＡセグメントの３’である。標的配列を含む第１のＮＡセグメント及び核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントの順序は、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質に依存するであろう。第１及び第２のＮＡセグメントの適切な５’から３’の配置並びに核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質の選択は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡはＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からなる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡはＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡはｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする２つのサブセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的配列に加えて、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる追加の配列を含まない。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる追加の配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのサブセグメントは独立して転写される。いくつかの実施形態では、２つのサブセグメントは、単一のユニットとして転写される。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧ（配列番号２６）の５’の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２７）を含む。
標的配列
本明細書で使用される標的配列は、ｇＮＡを、サンプル中の枯渇の標的とされる核酸中の標的配列に向ける配列である。例えば、標的配列は特定の配列を標的とし、例えば、標的配列は、サンプルの枯渇の標的とされるゲノム内の反復配列を標的とする。
本明細書で提供されるのは、標的配列を含むセグメントを構成するｇＮＡ及び複数のｇＮＡである。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡを含むか、又はＤＮＡからなる。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡを含むか、又はＲＮＡからなる。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡを含み、チミンの代わりにウラシルを含むＲＮＡを除いて、目的の配列のＰＡＭ配列の５’に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡを含み、チミンの代わりにウラシルを含むＲＮＡを除いて、目的の配列のＰＡＭ配列の３’に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ又はＮＡＧである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮ又はＴＧＮである。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡを含み、目的の配列のＰＡＭ配列の５’に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡを含み、目的の配列のＰＡＭ配列の３’に対して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡを含み、ＰＡＭ配列のヌクレオチド５’の配列の反対側の鎖に相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ配列のヌクレオチド５’の配列の反対側の鎖に対して、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡを含み、ＰＡＭ配列のヌクレオチド３’の配列の反対側の鎖に相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ配列のヌクレオチド３’の配列の反対側の鎖に対して、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ又はＮＡＧである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮ又はＴＧＮである。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡを含み、ＰＡＭ配列のヌクレオチド５’の配列の反対側の鎖に相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ配列のヌクレオチド５’の配列の反対側の鎖に対して、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡを含み、ＰＡＭ配列のヌクレオチド３’の配列の反対側の鎖に相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ配列のヌクレオチド３’の配列の反対側の鎖に対して、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ又はＮＡＧである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮ又はＴＧＮである。
異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は異なるＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、標的配列の５’又は３’に配置できる。例えば、Ｃａｓ９は、標的配列の３’末端にあるＮＧＧ ＰＡＭを認識できる。Ｃｐｆ１は、標的配列の５’末端にあるＴＴＮ ＰＡＭを認識できる。全てＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質によって認識される全てＰＡＭ配列は、本開示の範囲内にあると想定される。いずれのＰＡＭ配列が特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質と互換性があるかは、当業者には容易に明らかになるであろう。
核酸誘導型ヌクレアーゼ
本明細書で提供されるのは、核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質－結合配列を含むセグメントを含むｇＮＡ及び複数のｇＮＡである。核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とすることができる。核酸誘導型ヌクレアーゼシステムは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼシステムであり得る。核酸誘導型ヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ誘導ヌクレアーゼシステムであり得る。
本開示の方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼを利用することができる。本明細書で使用される場合、「核酸誘導型ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを開裂し、１つ又は複数のガイド核酸（ｇＮＡ）を使用して特異性を付与する任意のヌクレアーゼである。核酸誘導型ヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質及び非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質が含まれる。
本明細書で提供される核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＤＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導ＲＮＡヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼ、又はＲＮＡ誘導ＲＮＡヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼであり得る。一実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。
核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質結合配列は、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの任意のタンパク質メンバに結合する核酸配列である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの任意のタンパク質メンバに結合する核酸配列である。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＩＩ、ＣＡＳクラスＩタイプＩＶ、ＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩ、及びＣＡＳクラスＩＩタイプＶからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステム、及びＣＲＩＳＰＲタイプＩＩＩシステムからのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４及びＮｇＡｇｏからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質）は、任意の細菌又は古細菌種に由来し得る。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スピロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、フルヴィコラ・タフェンシス（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・コプロフィルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ステレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、コリネバクター・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）からの核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質）からの又はこれらに由来する。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質の例は、天然に存在する又は操作されたバージョンであり得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在する核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、及びＣｍ５を含む。そのようなタンパク質の操作されたバージョンも使用することができる。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質の操作された例はまた、核酸誘導ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓニッカーゼ）を含む。核酸誘導ニッカーゼは、単一の不活性な触媒ドメインを含む、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質の修飾バージョンを指す。一実施形態では、核酸誘導ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、単一の不活性な触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメインのいずれかを含み得る。活性ヌクレアーゼドメインが１つしかない場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。使用する変異体に応じて、誘導ＮＡハイブリダイゼーション鎖又は非ハイブリダイゼーション鎖は開裂され得る。反対側の鎖を標的とする２ｇＮＡに結合した核酸誘導ニッカーゼは、標的の二本鎖ＤＮＡに二本鎖破壊を作成する。この「デュアルニッカーゼ」戦略は、二本鎖切断が形成される前に、両方の核酸誘導型ヌクレアーゼ／ｇＮＡ（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）複合体が部位で特異的に結合する必要があるため、切断の特異性を高めることができる。天然に存在するニッカーゼ核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質も使用することができる。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質の操作された例はまた、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム融合タンパク質を含む。例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質は、別のタンパク質、例えば、アクチベータ、リプレッサ、ヌクレアーゼ、蛍光分子、放射性タグ、又はトランスポザーゼに融合され得る。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質－結合配列は、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列を含む。
様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質が様々核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質－結合配列と適合する。どのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質が、どの核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質－結合配列と適合するかについては、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、１本鎖上の以下のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２８））、及び他方の鎖上の逆の相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号２９））を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、以下のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号２９））を含み、ここで一本鎖ＤＮＡは転写鋳型として機能する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３０））を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、一本鎖上の以下のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号３１））、及び他方の鎖上の逆の相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号３２））を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、以下のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号３２））を含み、ここで一本鎖ＤＮＡは転写鋳型として機能する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号３３））を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）種又はアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種から単離又は誘導される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－結合配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３４））を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）種又はアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種から単離又は誘導される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－結合配列をコードするＤＮＡ配列は、以下のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴ（配列番号３５））を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは二本鎖である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、標的配列を含む第１のＮＡセグメント及び核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質－結合配列を含む第２のＮＡセグメントを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ又は２０ｂｐである。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステム－ループ配列を含む単一のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３０））を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号３３））を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、２つのサブセグメントを含む。第２のＲＮＡサブセグメント（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリッドを形成する第１のＲＮＡサブセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、一緒になって核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質結合を管理する。いくつかの実施形態では、第２のサブセグメントの配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡセグメント及び第２のＲＮＡセグメントは、一緒に、ｃｒＲＮＡ配列を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡセグメントとハイブリッドを形成する他のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’＞３’の配列、ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号３７）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、標的配列を含む第１のＮＡセグメント及び核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質－結合配列を含む第２のＮＡセグメントを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質がＣｐｆ１システムタンパク質である実施形態において、第２のセグメントは、第１のセグメントの５’である。いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは２０ｂｐである。いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは２０ｂｐより大きい。いくつかの実施形態では、第１のセグメントのサイズは３０ｂｐより大きい。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステム－ループ配列を含む単一のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３４））を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸誘導型ヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、本明細書で提供される実施形態で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステム、及びＣＲＩＳＰＲタイプＩＩＩシステムからのタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、任意の細菌又は古細菌種に由来し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、単離され、組換えにより産生され、又は合成される。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スピロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、フルヴィコラ・タフェンシス（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・コプロフィルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ステレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、コリネバクター・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質から、又はこれらに由来する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の例は、天然に存在する又は操作されたバージョンであり得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ、あるいはＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩ又はＶに属することができ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２、及びＣｐｆ１を含むことができる。
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃｐｆ１を含む。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－ｇＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質及び誘導ＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは、２つの分子、すなわち、標的にハイブリダイズして配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）と、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と、とから構成され得る。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であり得る。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列を含む単一分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質に対して、少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の全ての機能、又は結合活性、ヌクレアーゼ活性、及びヌクレアーゼ活性を含む機能の１つ又は一部のみを有し得る。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質関連誘導ＮＡ」という用語は、誘導ＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質関連誘導ＮＡは、単離されたＮＡとして、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－ｇＮＡ複合体の一部として存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＲＮＡ誘導ＲＮＡヌクレアーゼである（すなわち、ＲＮＡを切断する）。ＲＮＡを切断する例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質には、Ｃ２ｃ２が含まれるが、これだけに限定されない。Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとも呼ばれる）はクラス２タイプＶＩのＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼは、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）から単離又は誘導される。いくつかの実施形態では、Ｃ２ｃ２は、相補的プロトスペーサを運ぶｓｓＲＮＡを開裂する単一のｃｒＲＮＡによって誘導される。適切なＣ２ｃ２ ｃｒＲＮＡ配列は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＤＮＡ誘導ＲＮＡヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質によって開裂されたＤＮＡは二本鎖である。二本鎖ＤＮＡを切断する例示的なＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼには、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ及びＣａｓＹが含まれるが、これらに限定されない。更なる例示的なＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼには、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５は、ｇＲＮＡとリボ核タンパク質複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼはＣａｓＸである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、デュアルガイドされる（すなわち、ｇＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸは、標的配列に相補的な配列のすぐ５’に位置するＴＴＣＮ ＰＡＭを認識する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）又はプランクトミケス門から単離又は誘導される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸ１、ＣａｓＸ２又はＣａｓＸ３タンパク質である。ＣａｓＸタンパク質はＷＯ／２０１８／０６４３７１に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣａｓＸタンパク質のための適切なｇＮＡ配列は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼはＣａｓＹである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＹタンパク質は、デュアルガイドされる（すなわち、ｇＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＹは、標的配列の５’に位置するＴＡ ＰＡＭを認識する。ＣａｓＹタンパク質はＷＯ／２０１８／０６４３５２に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣａｓＹタンパク質のための適切なｇＮＡ配列は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質によって開裂されたＤＮＡは一本鎖である。一本鎖ＤＮＡを切断する例示的なＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質には、Ｃａｓ３及びＣａｓ１４が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１４タンパク質は、ＰＡＭ部位を必要としない。
Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるか、又はＣａｓ９を含む。本開示のＣａｓ９は、単離、組換え生産、又は合成され得る。
本明細書の実施形態で使用できるＣａｓ９タンパク質の例は、Ｆ．Ａ．Ｒａｎ，Ｌ．Ｃｏｎｇ，Ｗ．Ｘ．Ｙａｎ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．Ｋｒｉｚ，Ｂ．Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｏ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｘ．Ｗｕ，Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｅ．Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ，Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，ａｎｄ Ｆ．Ｚｈａｎｇ；’’Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，’’Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（０９ Ａｐｒｉｌ ２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９に見出され、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スピロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、フルヴィコラ・タフェンシス（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・コプロフィルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ステレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、又はコリネバクター・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）に由来するタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムである。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ピオゲネスに由来するタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムであり、ＰＡＭ配列は、標的特異的誘導配列のすぐ３’末端に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種からのタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列には、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＮＧＧ）、スタフィ・アウレウス（Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ）（ＮＮＧＲＲＴ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ）、及びトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＮＡＡＡＡＣ）も含まれ、全て本開示から逸脱することなく使用可能である。
１つの例示的な実施形態において、Ｃａｓ９配列は、例えば、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得られ、ＰＣＲによって再増幅され、次いで、ｐＥＴ３０（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）にクローン化されて、細菌で発現し、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製することができる。
「Ｃａｓ９－ｇＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質及び誘導ＮＡを含む複合体を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一）であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の全ての機能、又は結合活性、ヌクレアーゼ活性、及びヌクレアーゼ活性を含む機能の１つ又はいくつかのみを有し得る。
「Ｃａｓ９関連誘導ＮＡ」という用語は、上記の誘導ＮＡを指す。Ｃａｓ９関連誘導ＮＡは、孤立して存在する場合もあれば、Ｃａｓ９－ｇＮＡ複合体の一部として存在する場合もある。
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸誘導型ヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
いくつかの実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、任意の細菌又は古細菌種に由来し得る。
いくつかの実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、単離され、組換えにより産生され、又は合成される。
いくつかの実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スピロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、フルヴィコラ・タフェンシス（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス・コプロフィルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ステレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、ナトロバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）、又はコリネバクター・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）から、又はこれらに由来する。
いくつかの実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、天然に存在するか、又は操作されたバージョンであり得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在する非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＮｇＡｇｏ（ナトロバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ））である。
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－ｇＮＡ複合体」は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質及び誘導ＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは、２つの分子、すなわち、標的にハイブリダイズして配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）と、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と、とから構成され得る。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であり得る。
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質に対して、少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一）であり得る。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の全ての機能、又は結合活性、ヌクレアーゼ活性、及びヌクレアーゼ活性を含む機能の１つ又は一部のみを有し得る。
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質関連誘導ＮＡ」という用語は、誘導ＮＡを指す。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質関連誘導ＮＡは、単離されたＮＡとして、又は非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質－ｇＮＡ複合体の一部として存在し得る。
Ｃｐｆ１
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１システムタンパク質であるか、又はそれを含む。本開示のＣｐｆ１システムタンパク質は、単離、組換え生産、又は合成され得る。
Ｃｐｆ１システムタンパク質はクラスＩＩ、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）から単離又は誘導される。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクノスピラ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）から単離されるか、又は由来する。
Ｃｐｆ１システムタンパク質は、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質－結合配列（例、ステム－ループ）及び標的配列を含む単一の誘導ＲＮＡに結合する。Ｃｐｆ１標的配列は、標的核酸中のＣｐｆ１ ＰＡＭ配列のすぐ３’に位置する配列を含む。Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質－結合配列は、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの標的配列の５’に位置している。Ｃｐｆ１は、標的核酸にブラントエンド切断ではなくねじれ型の切断を生成することもできる。Ｃｐｆ１タンパク質－ｇＲＮＡタンパク質複合体を標的核酸に標的した後、フランシセラ由来Ｃｐｆ１は、例えば標的核酸をねじれ型で切断し、標的配列の３’末端でＰＡＭから１８～２３塩基離れた約５ヌクレオチドの５’オーバーハングを作成する。対照的に、野生型Ｃａｓ９による切断は、Ｃａｓ９ＰＡＭの３ヌクレオチド上流にブラントエンドを生成する。
例示的Ｃｐｆ１では、ｇＲＮＡステム－ループ配列は、以下のＲＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３４））を含む。
「Ｃｐｆ１タンパク質－ｇＮＡ複合体」は、Ｃｐｆ１タンパク質及び誘導ＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは、単一の分子、すなわち、標的にハイブリダイズして配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）から構成され得る。
Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質に対して、少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一）であり得る。Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の全ての機能、又は結合活性及びヌクレアーゼ活性を含む機能の１つ又はいくつかのみを有し得る。
Ｃｐｆ１システムタンパク質は様々ＰＡＭ配列を認識する。Ｃｐｆ１システムタンパク質によって認識される例示的なＰＡＭ配列には、ＴＴＮ、ＴＣＮ及びＴＧＮが含まれるが、これらに限定されない。追加のＣｐｆ１ ＰＡＭ配列には、ＴＴＴＮが含まれるが、これに限定されない。Ｃｐｆ１ ＰＡＭ配列の１つの特徴は、Ｃａｓ９タンパク質で使用されるＮＧＧ又はＮＡＧ ＰＡＭ配列よりもＡ／Ｔ含有量が高いことである。標的核酸、例えば、異なるゲノムは、それらのパーセントＧ／Ｃ含有量が異なる。例えば、ヒトのマラリア寄生生物であるプラスモジウム・パルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のゲノムは、Ａ／Ｔが豊富であることが知られている。あるいは、ゲノム内のタンパク質コード配列は、ゲノム全体よりも高いＧ／Ｃ含量を有することがよくある。標的ゲノム内のＡ／ＴとＧ／Ｃヌクレオチドとの比率は、そのゲノム内の所与のＰＡＭ配列の分布及び頻度に影響を与える。例えば、Ａ／ＴリッチゲノムのＮＧＧ又はＮＡＧ配列は少ない場合があるが、Ｇ／ＣリッチゲノムのＴＴＮ配列は少ない場合がある。Ｃｐｆ１システムタンパク質は、当業者が利用できるＰＡＭ配列のレパートリーを拡大し、ｇＲＮＡライブラリの優れた柔軟性と機能をもたらす。
触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）タンパク質の操作された例は、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質を含む。「触媒的不活性」という用語は、一般に、不活性化されたヌクレアーゼ（例えば、ＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼ）を有する核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質を指す。このようなタンパク質は、任意の核酸の標的部位に結合できるが（標的部位は誘導ＮＡによって決定される）、タンパク質は標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を開裂又はニックすることができない。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの触媒的不活性タンパク質は、触媒的不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）等の触媒的不活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。したがって、ｄＣａｓ９は、混合物を非結合核酸及びｄＣａｓ９結合断片に分離することを可能にする。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。ｄＣａｓ９結合は、他の操作が進行している間、Ｃａｓ９による切断を防ぐことができる。別の実施形態では、ｄＣａｓ９をトランスポザーゼ等の別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特定の部位に標的化することができる。天然に存在する触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼシステムタンパク質も使用することができる。
別の実施形態において、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼは、トランスポザーゼ等の別の酵素に融合されて、その酵素の活性を特定の部位に標的化することができる。
いくつかの実施形態では、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ－ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２、ｄＣａｓＸ、ｄＣａｓＹ、ｄＣａｓ１３、ｄＣａｓ１４又はｄＮｇＡｇｏである。
例示的な一実施形態において、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
例示的な一実施形態において、触媒的不活性核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣｐｆ１である。
核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼ
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼの操作された例は、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼ（交換可能にニッカーゼ核酸誘導型ヌクレアーゼと呼ばれる）を含む。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼの操作された例は、単一の不活性な触媒ドメインを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムニッカーゼ又は非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムニッカーゼを含む。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ－ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼ、ＣａｓＸニッカーゼ、ＣａｓＹニッカーゼ、Ｃａｓ１３ニッカーゼ、Ｃａｓ１４ニッカーゼ、又はＮｇＡｇｏニッカーゼである。
一実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
一実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは、Ｃｐｆ１ニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは、標的配列に結合するために使用され得る。活性ヌクレアーゼドメインが１つしかない場合、核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。使用する変異体に応じて、誘導ＮＡハイブリダイゼーション鎖又は非ハイブリダイゼーション鎖が開裂される場合がある。反対側の鎖を標的とする２ｇＮＡに結合した核酸誘導型ヌクレアーゼニッカーゼは、核酸に二本鎖切断を引き起こす可能性がある。この「デュアルニッカーゼ」戦略は、二本鎖切断が形成される前に、両方の核酸誘導型ヌクレアーゼ／ｇＮＡ複合体が部位で特異的に結合する必要があるため、切断の特異性を高める。
例示的な実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用され得る。「Ｃａｓ９ニッカーゼ」という用語は、単一の不活性な触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメインのいずれかを含む、Ｃａｓ９タンパク質の修飾バージョンを指す。活性ヌクレアーゼドメインが１つしかない場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。使用する変異体に応じて、ガイドＲＮＡハイブリダイゼーション鎖又は非ハイブリダイゼーション鎖は開裂され得る。反対側の鎖を標的とする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡに二本鎖切断を作成する。この「デュアルニッカーゼ」戦略は、二本鎖切断が形成される前に両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が部位で特異的に結合する必要があるため、切断の特異性を高めることができる。
解離性で熱安定性の核酸誘導型ヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、本明細書で提供される方法で使用される（熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸誘導型ヌクレアーゼ又は熱安定性非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸誘導型ヌクレアーゼ）。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘発する。反応温度が低下すると、追加の開裂された標的配列の生成が可能になる。いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分間維持された場合、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性、又は１００％の活性を維持する。いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９１℃、少なくとも９２℃、少なくとも９３℃、少なくとも９４℃、少なくとも９５℃、９６℃、少なくとも９７℃、少なくとも９８℃、少なくとも９９℃、又は少なくとも１００℃で少なくとも１分間維持される場合、少なくとも５０％維持する。いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分、２分、３分、４分、又は５分間維持される場合、少なくとも５０％の活性を維持する。いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、温度が上昇し、２５℃～５０℃に低下した場合に、少なくとも５０％の活性を維持する。いくつかの実施形態では、温度は、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、又は５０℃に低下する。例示的な一実施形態では、熱安定性酵素は、９５℃で１分後に少なくとも９０％の活性を保持する。
いくつかの実施形態では、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、熱安定性Ｃａｓ９、熱安定性Ｃｐｆ１、熱安定性Ｃａｓ３、熱安定性Ｃａｓ８ａ－ｃ、熱安定性Ｃａｓ１０、熱安定性Ｃｓｅ１、熱安定性Ｃｓｙ１、熱安定性Ｃｓｎ２、熱安定性Ｃａｓ４、熱安定性Ｃｓｍ２、熱安定性Ｃｍ５、熱安定性Ｃｓｆ１、耐熱性Ｃ２Ｃ２、又は耐熱性ＮｇＡｇｏである。
いくつかの実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、熱安定性Ｃａｓ９である。
熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、例えば、好熱性細菌ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。次に、核酸誘導型ヌクレアーゼ遺伝子を発現ベクターにクローン化することができる。例示的な一実施形態では、熱安定性Ｃａｓ９タンパク質が単離される。
別の実施形態において、熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼは、非熱安定性核酸誘導型ヌクレアーゼのインビトロ進化によって得ることができる。核酸誘導型ヌクレアーゼの配列は、その熱安定性を改善するために突然変異誘発され得る。
キット及び製造品
本開示は、アダプタ、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡ）、ｇＮＡコレクション（例えば、ｇＲＮＡ又はｇＤＮＡの複数）、修飾感受性制限酵素、対照等であるがこれだけに限定されない、本明細書に記載の組成物のうち任意の１つ又は複数を含むキットを提供する。
例示的な一実施形態では、キットは、ｇＲＮＡがヒトゲノム又は他のＤＮＡ配列の供給源を標的とするｇＲＮＡを含む。
本開示はまた、本明細書に記載されるように、ヌクレオチド修飾の違いを使用して、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法を実行するための全て必須試薬及び指示を提供する。
また、本明細書で提供される方法を使用してサンプルを濃縮する前後の情報をモニタリングするコンピュータソフトウェアも本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、ソフトウェアは、本明細書に記載の方法を適用する前後のサンプル中の枯渇の標的とされる核酸の配列の存在量を計算及び報告して、標的外の枯渇のレベルを評価することができ、ソフトウェアは、本明細書で提供される濃縮の方法を使用してサンプルを処理する前後の目的の配列の存在量を比較することによる、標的－枯渇／濃縮／捕捉／分割／標識／調節／編集の有効性を検査することができる。
上記の明細書に記載されている全て刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の記載された製品、システム、使用、プロセス、及び方法の様々な修正及び変形は、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、請求された開示は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかである、開示を実施するための記載されたモードの様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
列挙された実施形態
本発明は、以下に列挙された例示的な実施形態を参照することによって定義することができる。
１．枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法であって、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用することを含む方法。
２．枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法であって、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用することを含み、サイズ選択又は修飾感受性標的結合を含まない方法。
３．枯渇の標的とされる核酸と比較して目的の核酸のサンプルを少なくとも約２倍濃縮する方法であって、目的の核酸と枯渇の標的とされる核酸との間のヌクレオチド修飾の違いを使用して、標的の核酸をアダプタに連結させ、枯渇の標的とされる核酸には連結させないことを含む方法。
４．目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、少なくとも目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含むことと、
ｂ．サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
ｄ．複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法。
５．（ａ）の前に、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が断片化される、実施形態４に記載の方法。
６．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方が、それぞれ、第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含む、実施形態４又は５に記載の方法。
７．複数の第１の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチド修飾の頻度は、目的の核酸において、枯渇の標的とされる核酸と同じではない、実施形態６に記載の方法。
８．第１の修飾感受性制限酵素の活性が、その同種の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される、実施形態４～７のいずれか１つに記載の方法。
９．枯渇の標的とされる核酸中の複数の第１の認識部位が、目的の核酸中の複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態８に記載の方法。
１０．第１の修飾感受性制限酵素が、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｌｕＩ、及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態８又は９に記載の方法。
１１．第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｌｕＩ及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態８又は９に記載の方法。
１２．第１の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位では活性ではない、実施形態４～７に記載の方法。
１３．枯渇の標的とされる核酸中の複数の第１の認識部位が、目的の核酸中の複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態１２に記載の方法。
１４．第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態１２又は１３に記載の方法。
１５．修飾が５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態１２～１３のいずれか１つに記載の方法。
１６．第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、方法が、工程（ｃ）の前にサンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、実施形態１５に記載の方法。
１７．修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の方法。
１８．第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．修飾がメチルシトシンを含む、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の方法。
２０．第１の修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、実施形態１９に記載の方法。
２１．目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、方法が、工程（ｃ）の前に、サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させることを更に含む、実施形態１２～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．Ｔ４ポリメラーゼが、メチル化されたＡ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化されたＡ及びＣヌクレオチドで置き換える、実施形態２１に記載の方法。
２３．工程（ｄ）の前に、核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含む、実施形態１２～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．エキソヌクレアーゼがラムダヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ又はＢＡＬ－３１を含む、実施形態２３に記載の方法。
２５．工程（ｂ）においてサンプル中の核酸を末端脱リン酸化することがホスファターゼを含む、実施形態４～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、実施形態２５に記載の方法。
２７．アルカリホスファターゼがエビアルカリホスファターゼである、実施形態２６に記載の方法。
２８．
ｅ．第２の修飾感受性制限酵素が第２の認識部位を切断することを可能にする条件下で、（ｄ）からのアダプタ連結核酸を第２の修飾感受性制限酵素と接触させることを更に含み、
枯渇の標的とされる核酸の少なくとも少なくとも１つのサブセットが、第２の修飾感受性制限酵素のための複数の第２の認識部位を含み、
第２の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位を標的とし、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を標的とせず、
これにより、一方の端でアダプタが連結された枯渇の標的とされる核酸のコレクションと、両端でアダプタが連結された目的の核酸のコレクションと、が生成される、実施形態４～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸がそれぞれ、第２の修飾感受性制限酵素に対する複数の第２の認識部位を含む、実施形態２８に記載の方法。
３０．枯渇の標的とされる核酸中の複数の第２の認識部位が、目的の核酸中の複数の第２の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態２９に記載の方法。
３１．工程（ｄ）後にサンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ｇＮＡが、枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、実施形態４～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．方法が、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルとを接触させることを含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．核酸誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４又はＣｍ５である、実施形態３１又は３２に記載の方法。
３４．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである、実施形態３１又は３２に記載の方法。
３５．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１ニッカーゼである、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．核酸誘導型ヌクレアーゼが熱安定性である、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．ｇＮＡがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態３１～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．アダプタを使用して、核酸の５’及び３’末端でアダプタ連結される目的の核酸を増幅、シークエンシング、又はクローニングすることを更に含む、実施形態４～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．ヌクレオチド修飾がアデニン修飾又はシトシン修飾を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．アデニン修飾がアデニンメチル化を含む、実施形態３９に記載の方法。
４１．アデニンメチル化がＤａｍメチル化又はＥｃｏＫＩメチル化を含む、実施形態４０に記載の方法。
４２．シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、実施形態３９に記載の方法。
４３．シトシン修飾がシトシンメチル化を含む、実施形態３９に記載の方法。
４４．シトシンメチル化が、ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣメチル化又はそれらの組合せを含む、実施形態４３に記載の方法。
４５．シトシンメチル化が、Ｄｃｍメチル化、ＤＮＭＴ１メチル化、ＤＮＭＴ３Ａメチル化又はＤＮＭＴ３Ｂメチル化を含む、実施形態４３に記載の方法。
４６．第２の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態２８～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．修飾が５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載の方法。
４８．第２の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、方法が、工程（ｅ）の前にサンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、実施形態４７に記載の方法。
４９．修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載の方法。
５０．第２の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．修飾がメチルシトシンを含む、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載の方法。
５２．第２の修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、方法が、工程（ｅ）の前に、サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させることを更に含む、実施形態２８～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．Ｔ４ポリメラーゼが、ｕメチル化されたＡ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換える、実施形態５３に記載の方法。
５５．枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、目的の核酸が非宿主核酸を含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、実施形態５５に記載の方法。
５７．非宿主が複数の種の生物を含む、実施形態５５に記載の方法。
５８．宿主が哺乳動物、鳥類、爬虫類又は昆虫である、実施形態５５に記載の方法。
５９．哺乳動物がヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス又はスナネズミである、実施形態５８に記載の方法。
６０．枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、目的の核酸が反復配列を含む、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．目的のアダプタ連結核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、実施形態４～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５０％未満を構成する、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の３０％未満を構成する、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
６４．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５％未満を構成する、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
６５．サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．サンプルが全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、及び生検から選択される、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６７．目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、
ｂ．サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．サンプル中の核酸中の修飾感受性制限部位の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させ、それにより、露出した末端リン酸を有する核酸を生成することと、
ｄ．核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下で、サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法。
６８．工程（ａ）の前に、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が断片化される、実施形態６７に記載の方法。
６９．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸がそれぞれ、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含む、実施形態６７又は６８の方法。
７０．枯渇の標的とされる核酸中の複数の認識部位が、目的の核酸中の複数の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態６９に記載の方法。
７１．目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、方法が、工程（ｃ）の前に、サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させることを更に含む、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．Ｔ４ポリメラーゼが、メチル化されたＡ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換える、実施形態７１に記載の方法。
７３．修飾がアデニン修飾又はシトシン修飾を含む、実施形態６７～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．アデニン修飾がアデニンメチル化を含む、実施形態７３に記載の方法。
７５アデニンメチル化がＤａｍメチル化又はＥｃｏＫＩメチル化を含む、実施形態７３に記載の方法。
７６．シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシンを含む、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、実施形態７３に記載の方法。
７７．シトシン修飾がシトシンメチル化を含む、実施形態７３に記載の方法。
７８．シトシンメチル化が、ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣメチル化又はそれらの組合せを含む、実施形態７７に記載の方法。
７９．シトシンメチル化が、Ｄｃｍメチル化、ＤＮＭＴ１メチル化、ＤＮＭＴ３Ａメチル化又はＤＮＭＴ３Ｂメチル化を含む、実施形態７３に記載の方法。
８０．修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態６７～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．修飾が５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態６７～７２のいずれか１つに記載の方法。
８２．修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、方法が、工程（ｃ）の前にサンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態６７～７２のいずれか１つに記載の方法。
８４．修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、実施形態８３に記載の方法。
８５．修飾がメチルシトシンを含む、実施形態６７～７２のいずれか１つに記載の方法。
８６．修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、実施形態８５に記載の方法。
８７．エキソヌクレアーゼがラムダヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ又はＢＡＬ－３１である、実施形態６７～８６の方法。
８８．工程（ｂ）においてサンプル中の核酸を末端脱リン酸化することがホスファターゼを含む、実施形態６７～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、実施形態８８に記載の方法。
９０．アルカリホスファターゼがエビアルカリホスファターゼである、実施形態７４に記載の方法。
９１．ｅ．（ｄ）からのサンプルを、複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下でアダプタと接触させ、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することを含む、実施形態６７～９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．工程（ｄ）後にサンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ｇＮＡが、枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、実施形態６７～９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．方法が、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルとを接触させることを含む、実施形態９２に記載の方法。
９４．核酸誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４又はＣｍ５である、実施形態９２又は９３に記載の方法。
９５．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである、実施形態９２又は９３に記載の方法。
９６．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１ニッカーゼである、実施形態９２～９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．核酸誘導型ヌクレアーゼが熱安定性である、実施形態９２～９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．ｇＮＡがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態９２～９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．アダプタを使用して、核酸の５’及び３’末端でアダプタ連結される目的の核酸を増幅、シークエンシング、又はクローニングすることを更に含む、実施形態６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、目的の核酸が非宿主核酸を含む、実施形態６７～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、実施形態１００に記載の方法。
１０２．非宿主が複数の種の生物を含む、実施形態１００に記載の方法。
１０３．宿主が哺乳動物、鳥類、爬虫類又は昆虫である、実施形態１００に記載の方法。
１０４．哺乳動物がヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス又はスナネズミである、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、目的の核酸が反復配列を含む、実施形態６７～１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．目的のアダプタ連結核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、実施形態６７～１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５０％未満を構成する、実施形態６７～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の３０％未満を構成する、実施形態６７～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０９．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５％未満を構成する、実施形態６７～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１１０．サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、実施形態６７～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１１１．サンプルが全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、及び生検から選択される、実施形態６７～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１１２．目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、
ｂ．サンプル中の複数の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、サンプルをアダプタと接触させることと、
ｃ．サンプル中の核酸中の修飾感受性制限部位の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを修飾感受性制限酵素と接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法。
１１３．工程（ａ）の前に、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が断片化される、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方がそれぞれ、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含む、実施形態１１２又は１１３に記載の方法。
１１５．枯渇の標的とされる核酸中の複数の認識部位が、目的の核酸中の複数の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態１１２～１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、方法が、工程（ｃ）の前に、サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させることを更に含む、実施形態１１２～１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．Ｔ４ポリメラーゼが、メチル化されたＡ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換える、実施形態１１６に記載の方法。
１１８．修飾がアデニン修飾又はシトシン修飾を含む、実施形態１１２～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．アデニン修飾がアデニンメチル化を含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２０．アデニンメチル化がＤａｍメチル化又はＥｃｏＫＩメチル化を含む、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシンを含む、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２２．シトシン修飾がシトシンメチル化を含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２３．シトシンメチル化が、ＣｐＧメチル化、ＣｐＡメチル化、ＣｐＴメチル化、ＣｐＣメチル化又はそれらの組合せを含む、実施形態１２２に記載の方法。
１２４．シトシンメチル化が、Ｄｃｍメチル化、ＤＮＭＴ１メチル化、ＤＮＭＴ３Ａメチル化又はＤＮＭＴ３Ｂメチル化を含む、実施形態１２２に記載の方法。
１２５．修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣを含む、実施形態１１２～１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．修飾が５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態１１２～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１２７．修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、方法が、（ｃ）の前にサンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、実施形態１２６に記載の方法。
１２８．修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含む、実施形態１１２～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．修飾がメチルシトシンを含む、実施形態１１２～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１３１．修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、実施形態１３０に記載の方法。
１３２．工程（ｃ）後にサンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、ｇＮＡが、枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、実施形態１１２～１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．方法が、少なくとも１０2の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、少なくとも１０3の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体、１０4の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体又は１０5の特異的核酸誘導型ヌクレアーゼ－ｇＮＡ複合体とサンプルとを接触させることを含む、実施形態１３２に記載の方法。
１３４．核酸誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４又はＣｍ５である、実施形態１３２又は１３３に記載の方法。
１３５．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１又はそれらの組合せである、実施形態１３２又は１３３に記載の方法。
１３６．核酸誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１ニッカーゼである、実施形態１３２～１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３７．核酸誘導型ヌクレアーゼが熱安定性である、実施形態１３２～１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．ｇＮＡがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態１１２～１３７のいずれか１つに記載の方法。
１３９．アダプタを使用して、核酸の５’及び３’末端でアダプタ連結される目的の核酸を増幅、シークエンシング、又はクローニングすることを更に含む、実施形態１１２～１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、目的の核酸が非宿主核酸を含む、実施形態１１２～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、実施形態１４０に記載の方法。
１４２．非宿主が複数の種の生物を含む、実施形態１４０に記載の方法。
１４３．宿主が哺乳動物、鳥類、爬虫類又は昆虫である、実施形態１４０に記載の方法。
１４４．哺乳動物がヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス又はスナネズミである、実施形態１４３に記載の方法。
１４５．枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、目的の核酸が反復配列を含む、実施形態１１２～１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．目的のアダプタ連結核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、実施形態１１２～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５０％未満を構成する、実施形態１１２～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の３０％未満を構成する、実施形態１１２～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４９．目的の核酸が、サンプル中の全核酸の５％未満を構成する、実施形態１１２～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１５０．サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、実施形態１１２～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．サンプルが全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、及び生検から選択される、実施形態１１２～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５２．目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、
目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットは、第１の修飾感受性制限酵素のための複数の第１の認識部位を含み、
第１の修飾感受性制限酵素の活性が、その同種の認識部位内又はその隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断されることと、
ｂ．サンプル中の複数の核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．サンプル中の核酸中の第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からのサンプルを第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
ｄ．複数の目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からのサンプルをアダプタと接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法。
１５３．（ａ）の前に、目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が断片化される、実施形態１５２に記載の方法。
１５４．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸の両方が、それぞれ、第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含む、実施形態１５２又は１５３に記載の方法。
１５５．複数の第１の認識部位内又はそれに隣接するヌクレオチド修飾の頻度は、目的の核酸において、枯渇の標的とされる核酸と同じではない、実施形態１５４に記載の方法。
１５６．枯渇の標的とされる核酸中の複数の第１の認識部位が、目的の核酸中の複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．第１の修飾感受性制限酵素が、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｌｕＩ、及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態１５５又は１５６に記載の方法。
１５８．第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｌｕＩ及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、実施形態１５５又は１５６に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、前記目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は前記枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含むことと、
ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．前記サンプル中の前記核酸中の前記第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
ｄ．複数の前記目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルを前記アダプタと接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、前記方法。
〔２〕前記目的の核酸及び前記枯渇の標的とされる核酸の両方が、前記第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記複数の第１の認識部位内又は前記複数の第１の認識部位に隣接するヌクレオチド修飾の頻度が、目的の核酸において、前記枯渇の標的とされる核酸と同じではない、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記第１の修飾感受性制限酵素の活性が、その同種の認識部位内又はその同種の認識部位に隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記枯渇の標的とされる核酸中の前記複数の第１の認識部位が、前記目的の核酸中の前記複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記第１の修飾感受性制限酵素が、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｌｕＩ及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｌｕＩ及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔８〕前記第１の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位で活性ではない、前記〔１〕～〔３〕に記載の方法。
〔９〕前記枯渇の標的とされる核酸中の前記複数の第１の認識部位が、前記目的の核酸中の前記複数の第１の認識部位よりも頻繁に修飾される、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、前記〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記修飾が、５－ヒドロキシメチルシトシンを含み、
前記第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に前記サンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、前記〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１２〕前記修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含み、前記第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、前記〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１３〕前記修飾がメチルシトシンを含み、前記第１の修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、前記〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１４〕前記目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に、前記サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させ、それによりメチル化Ａ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換えることを更に含む、前記〔８〕～〔１３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕工程（ｄ）の前に、核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含む、前記〔８〕～〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕ｅ．第２の修飾感受性制限酵素が第２の認識部位を切断することを可能にする条件下で、（ｄ）からの前記アダプタ連結核酸を前記第２の修飾感受性制限酵素と接触させることを更に含み、
前記枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、第２の修飾感受性制限酵素のための複数の第２の認識部位を含み、
前記第２の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位を標的とし、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を標的とせず、
これにより、一方の端でアダプタが連結された枯渇の標的とされる核酸のコレクションと、両端でアダプタが連結された目的の核酸のコレクションとが生成される、前記〔１〕～〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕工程（ｄ）後に前記サンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、前記ｇＮＡが、前記枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、前記〔１〕～〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕前記アダプタを使用して、５’及び３’末端でアダプタ連結される前記目的の核酸を増幅、シークエンシング又はクローニングすることを更に含む、前記〔１〕～〔１７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１９〕前記ヌクレオチド修飾がアデニン修飾又はシトシン修飾を含む、前記〔１〕～〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２０〕前記アデニン修飾又はシトシン修飾がメチル化を含む、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２２〕前記第２の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、前記〔１６〕～〔２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２３〕前記枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、前記目的の核酸が非宿主核酸を含む、前記〔１〕～〔２２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２４〕前記非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕前記非宿主が複数の種の生物を含む、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２６〕前記宿主が哺乳動物、鳥類、爬虫類又は昆虫である、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２７〕前記哺乳動物がヒトである、前記〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕前記枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、前記目的の核酸が反復配列を含む、前記〔１〕～〔２７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２９〕前記アダプタが連結された目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、前記〔１〕～〔２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３０〕前記サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、前記〔１〕～〔２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３１〕目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、前記枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、
ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．前記サンプル中の前記核酸の前記修飾感受性制限部位の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記修飾感受性制限酵素と接触させ、それにより、露出した末端リン酸を有する核酸を生成することと、
ｄ．核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下で、前記サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、前記方法。
〔３２〕前記目的の核酸及び前記枯渇の標的とされる核酸の両方が、前記修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕前記枯渇の標的とされる核酸中の前記複数の認識部位が、前記目的の核酸中の前記複数の認識部位よりも頻繁に修飾される、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に、前記サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させ、それによりメチル化Ａ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換えることを更に含む、前記〔３１〕～〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３５〕前記修飾が、アデニン修飾又はシトシン修飾を含む、前記〔３１〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕前記アデニン修飾又はシトシン修飾が、メチル化を含む、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３８〕前記修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、前記〔３１〕～〔３７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３９〕前記修飾が、５－ヒドロキシメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に、前記サンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、前記〔３１〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４０〕前記修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、前記〔３１〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４１〕前記修飾がメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、前記〔３１〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４２〕ｅ．複数の前記目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｄ）からの前記サンプルを前記アダプタと接触させ、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することを更に含む、前記〔３１〕～〔４１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４３〕工程（ｄ）後に前記サンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、前記ｇＮＡが、前記枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、前記〔３１〕～〔４２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４４〕前記アダプタを使用して、５’及び３’末端でアダプタ連結される前記目的の核酸を増幅、シークエンシング又はクローニングすることを更に含む、前記〔３１〕～〔４３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４５〕前記枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、前記目的の核酸が非宿主核酸を含む、前記〔３１〕～〔４４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４６〕前記非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、前記〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕前記宿主がヒトである、前記〔４５〕に記載の方法。
〔４８〕前記枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、前記目的の核酸が反復配列を含む、前記〔３１〕～〔４７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕前記アダプタが連結された目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、前記〔３１〕～〔４８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５０〕前記サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、前記〔３１〕～〔４９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５１〕目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、前記枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットが、修飾感受性制限酵素に対する複数の認識部位を含むことと、
ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、前記サンプルを前記アダプタと接触させることと、
ｃ．前記サンプル中の前記核酸の前記修飾感受性制限部位の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記修飾感受性制限酵素と接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、前記方法。
〔５２〕前記目的の核酸及び前記枯渇の標的とされる核酸の両方が、前記修飾感受性制限酵素のための複数の認識部位を含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記枯渇の標的とされる核酸中の前記複数の認識部位が、前記目的の核酸中の前記複数の認識部位よりも頻繁に修飾される、前記〔５１〕又は〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕前記目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に、前記サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させ、それによりメチル化Ａ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換えることを更に含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５５〕前記修飾が、アデニン修飾又はシトシン修飾を含む、前記〔５１〕～〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５６〕前記アデニン修飾又はシトシン修飾が、メチル化を含む、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕前記シトシン修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン又は３－メチルシトシンを含む、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５８〕前記修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣを含む、前記〔５１〕～〔５７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５９〕前記修飾が、５－ヒドロキシメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、前記方法が、（ｃ）の前に、前記サンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６０〕前記修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６１〕前記修飾がメチルシトシンを含み、前記修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６２〕工程（ｃ）後に前記サンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、前記ｇＮＡが、前記枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結される枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結される目的の核酸を生成する、前記〔５１〕～〔６１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６３〕前記アダプタを使用して、５’及び３’末端でアダプタ連結される前記目的の核酸を増幅、シークエンシング又はクローニングすることを更に含む、前記〔５１〕～〔６２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６４〕前記枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、前記目的の核酸が非宿主核酸を含む、前記〔５１〕～〔６３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６５〕前記非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕前記宿主がヒトである、前記〔６５〕に記載の方法。
〔６７〕前記枯渇の標的とされる核酸が転写活性部位を含み、前記目的の核酸が反復配列を含む、前記〔５１〕～〔６６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６８〕前記アダプタが連結された目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸が５０～１０００ｂｐの範囲である、前記〔５１〕～〔６７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６９〕前記サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、前記〔５１〕～〔６８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７０〕目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、
前記目的の核酸の少なくとも１つのサブセット又は前記枯渇の標的とされる核酸の少なくとも１つのサブセットは、第１の修飾感受性制限酵素のための複数の第１の認識部位を含み、
前記第１の修飾感受性制限酵素の活性が、その同種の認識部位内又はその同種の認識部位に隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断されることと、
ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸を末端脱リン酸化することと、
ｃ．前記サンプル中の前記核酸の前記第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
ｄ．複数の前記目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルを前記アダプタと接触させることと、
これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、を含む、前記方法。

Claims (20)

  1. 目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
    ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、少なくとも前記目的の核酸のサブセット又は前記枯渇の標的とされる核酸のサブセットが、第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含む、該提供することと、
    ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸を末端脱リン酸化することと、
    ｃ．前記サンプル中の前記核酸中の前記第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
    ｄ．複数の前記目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルを前記アダプタと接触させることと、
    これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、
    ｅ．前記５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸を、前記アダプタを用いて増幅することと、
    ｆ．第２の修飾感受性制限酵素が第２の認識部位を切断することを可能にする条件下で、（ｄ）からの、かつ工程（ｅ）の前の前記アダプタ連結された核酸を前記第２の修飾感受性制限酵素と接触させることを含み、
    少なくとも前記枯渇の標的とされる核酸のサブセットが、第２の修飾感受性制限酵素のための複数の第２の認識部位を含み、
    前記第２の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位を標的とし、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を標的とせず、
    これにより、一方の端でアダプタが連結された枯渇の標的とされる核酸のコレクションと、両端でアダプタが連結された目的の核酸のコレクションとが生成されることを含む、前記方法。
  2. 前記目的の核酸及び前記枯渇の標的とされる核酸の両方が、前記第１の修飾感受性制限酵素に対する複数の第１の認識部位を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数の第１の認識部位内又は前記複数の第１の認識部位に隣接するヌクレオチド修飾の頻度が、目的の核酸において、前記枯渇の標的とされる核酸と同じではない、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１の修飾感受性制限酵素の活性が、前記第１の認識部位内又は前記第１の認識部位に隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１の修飾感受性制限酵素が、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＡｌｕＩ及びＳａｕ３ＡＩからなる群から選択される制限酵素を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位で活性であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位で活性ではない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記修飾が、５－ヒドロキシメチルシトシンを含み、
    前記第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に前記サンプルをＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼと接触させることを更に含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記修飾がグルコシルヒドロキシメチルシトシンを含み、前記第１の修飾感受性制限酵素がＡｂａＳＩを含むか、又は前記修飾がメチルシトシンを含み、前記第１の修飾感受性制限酵素がＭｃｒＢＣを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記目的の核酸が少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位を含み、前記方法が、工程（ｃ）の前に、前記サンプルをＤｐｎＩ及びＴ４ポリメラーゼと接触させ、それによりメチル化Ａ及びＣヌクレオチドを、少なくとも１つのＤｐｎＩ認識部位内又はその近隣において、非メチル化Ａ及びＣヌクレオチドで置き換えることを更に含む、請求項６に記載の方法。
  11. 工程（ｄ）の前に、核酸のリン酸化末端からヌクレオチドを連続的に除去することを可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルをエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含む、請求項６に記載の方法。
  12. 工程（ｄ）後、かつ工程（ｅ）の前に前記サンプルを、複数の核酸誘導型ヌクレアーゼ－ガイド核酸（ｇＮＡ）複合体と接触させることを更に含み、前記ｇＮＡが、前記枯渇の標的とされる核酸の標的部位に相補的であり、それにより、一方の端でアダプタ連結された枯渇の標的とされる切断された核酸、並びに５’及び３’末端の両方でアダプタ連結された目的の核酸を生成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  13. 工程（ｅ）後、前記アダプタを使用して、前記５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸をシークエンシング又はクローニングすることを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ヌクレオチド修飾がアデニン又はシトシンのメチル化を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第２の修飾感受性制限酵素が、ＡｂａＳＩ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩ又はＭｃｒＢＣからなる群から選択される制限酵素を含む、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記枯渇の標的とされる核酸が宿主核酸を含み、前記目的の核酸が非宿主核酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記非宿主が細菌、真菌又はウイルスを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記宿主が哺乳動物、鳥類、爬虫類又は昆虫である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記サンプルが、生物学的サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、又は環境サンプルのいずれか１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  20. 目的の核酸についてサンプルを濃縮する方法であって、
    ａ．目的の核酸及び枯渇の標的とされる核酸を含むサンプルを提供することであって、
    少なくとも前記目的の核酸のサブセット又は前記枯渇の標的とされる核酸のサブセットは、第１の修飾感受性制限酵素のための複数の第１の認識部位を含み、
    前記第１の修飾感受性制限酵素の活性が、前記第１の認識部位内又は前記第１の認識部位に隣接するヌクレオチドの修飾によって遮断される、
    該提供することと、
    ｂ．前記サンプル中の複数の前記核酸を末端脱リン酸化することと、
    ｃ．前記サンプル中の前記核酸の前記第１の修飾感受性制限部位の少なくとも一部の開裂を可能にする条件下で、（ｂ）からの前記サンプルを前記第１の修飾感受性制限酵素と接触させることと、
    ｄ．複数の前記目的の核酸の５’及び３’末端へのアダプタの連結を可能にする条件下で、（ｃ）からの前記サンプルを前記アダプタと接触させることと、
    これにより、５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸が濃縮されたサンプルを生成することと、
    ｅ．前記５’及び３’末端でアダプタ連結された目的の核酸を、前記アダプタを用いて増幅することと、
    第２の修飾感受性制限酵素が第２の認識部位を切断することを可能にする条件下で、（ｄ）からの、かつ工程（ｅ）の前の前記アダプタ連結された核酸を前記第２の修飾感受性制限酵素と接触させることを含み、
    少なくとも前記枯渇の標的とされる核酸のサブセットが、第２の修飾感受性制限酵素のための複数の第２の認識部位を含み、
    前記第２の修飾感受性制限酵素が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む認識部位を標的とし、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含まない認識部位を標的とせず、
    これにより、一方の端でアダプタが連結された枯渇の標的とされる核酸のコレクションと、両端でアダプタが連結された目的の核酸のコレクションとが生成されることを含む、前記方法。
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